ES2272065T3 - Epitopos en proteinas de cubierta viricas y anticuerpos especificos dirigidos contra estos epitopos: uso para la deteccion de antigeno virico de hcv en tejido de hospedantes. - Google Patents

Abstract

Uso de un anticuerpo que es segregado por la estirpe celular de hibridoma del depósito de ECACC con número de acceso 98031214, o por la estirpe celular de hibridoma del depósito de ECACC que tiene un número de acceso 98031215, o una variante o fragmento funcionalmen- te equivalente de cualquiera de dichos anticuerpos, para la preparación de un kit para la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales.

Description

Epítopos en proteínas de cubierta víricas y anticuerpos específicos dirigidos contra estos epítopos: uso para la detección de antígeno vírico de HCV en tejido de hospedantes.

Campo de la invención

La presente invención se basa en el hallazgo de que los anticuerpos dirigidos contra epítopos específicos de la proteína E1 y E2 de HCV se pueden usar para detectar antígenos víricos en tejidos de hospedantes.

Antecedentes de la invención

La infección por el virus de la hepatitis C (HCV) es un problema sanitario importante tanto en países desarrollados como en países en desarrollo. Se estima que alrededor del 1 a 5% de la población mundial está afectada por el virus. Parece que la infección mediante HCV es la causa más importante de la hepatitis asociada con transfusiones, y frecuentemente progresa hasta el daño hepático crónico. Además, existen signos que implican al HCV en la inducción de carcinoma hepatocelular. En consecuencia, la demanda de métodos de diagnóstico fiables y de agentes terapéuticos eficaces es elevada. También, se necesitan métodos de identificación sensibles y específicos de productos sanguíneos contaminados con HCV, y métodos mejorados para cultivar HCV.

El HCV es un virus de ARN de cadena positiva, de aproximadamente 9.400 bases, que codifica al menos tres proteínas estructurales y seis proteínas no estructurales. Basándose en la homología de secuencias, las proteínas estructurales se han asignado funcionalmente como una única proteína de núcleo y dos proteínas de cubierta: E1 y E2. La proteína E1 consta de 192 aminoácidos, y contiene 5 a 6 sitios de N-glicosilación, dependiendo del genotipo de HCV. La proteína E2 consta de 363 a 370 aminoácidos, que contienen 9 a 11 sitios de N-glicosilación, dependiendo del genotipo de HCV (para un repaso, véase Major y Feinstone, 1997; Maertens y Stuyver, 1997). La proteína E1 contiene diversos dominios variables, mientras que la proteína E2 contiene dos dominios hipervariables, de los cuales el dominio principal está localizado en el término N de la proteína (Maertens y Stuyver, 1997). Las proteínas de cubierta se han producido mediante técnicas recombinantes en Escherichia coli, células de insectos, células de levadura y células de mamíferos. El uso de un sistema de expresión en eucariotas superiores, y especialmente en cultivo de células de mamíferos, conduce a proteínas de cubierta de calidad superior, es decir son reconocidas eficazmente por anticuerpos en muestras de pacientes, como se describe en el documento PCT/EP 95/03031 de Maertens et al.

En los documentos WO 92/13892, DE 4209215 y WO 96/40764 se han descrito otros antígenos de péptidos E1 y E2 de HCV, y su uso en inmunoensayos.

Actualmente, la detección de HCV en células o tejidos reside principalmente en la demostración de ARN vírico. Sin embargo, la detección de ARN en células o tejidos en una técnica incómoda que implica la extracción de ARN seguido de la transcripción inversa y de PCR anidada, o incluye RT-PCR in situ y la hibridación. Puesto que estas técnicas también tienen tendencia a una reactividad con falsos positivos, la detección de ARN vírico se realiza exclusivamente en muestras de suero. Aún se carece de métodos fiables para la detección de antígenos de proteínas víricas en muestras de suero y de tejido.

Los sitios de replicación de HCV no se han elucidado aún de forma completa. Generalmente se acepta que el virus se replica en hepatocitos, pero aún se debate mucho la replicación en otros tejidos, tales como tejidos linfoides. Por tanto, un método fiable para la detección de proteínas víricas o del propio virus en las células puede resolver esta cuestión.

La detección de proteínas víricas en células ha estado impedida por la falta de anticuerpos que se unen específicamente a proteínas víricas, y que son capaces de reconocer específicamente los antígenos de proteínas de HCV naturales (es decir, antígenos según se expresan mediante el hospedante tras la infección con HCV). Como consecuencia, hasta la fecha sólo unos pocos estudios se refieren a la demostración de la presencia de proteínas víricas de HCV en células hospedantes (para un repaso, véase Guido y Thung, 1996). Además, los anticuerpos derivados de hospedantes se han usado en muchos de estos estudios. Sin embargo, las preparaciones que contienen anticuerpos derivados de hospedantes no se pueden reproducir fácilmente, y estas preparaciones pueden estar contaminadas mediante anticuerpos autoinmunitarios así como mediante anticuerpos frente a otros agentes conocidos o incluso desconocidos. Por el contrario, se sabe que los anticuerpos producidos en animales mediante inmunización con antígenos recombinantes producirán anticuerpos con la especificidad deseada. A fin de tener una cualidad reproducible, se prefieren igualmente anticuerpos monoclonales. Además, las proteínas de cubierta de HCV necesitan ser producidas mediante un sistema de expresión de mamífero, para producir antígenos de buena calidad. Actualmente, esta condición de expresión va asociada con problemas incomprensibles. Por lo tanto, sólo se han descrito unos pocos anticuerpos monoclonales que se podrían usar para detectar antígenos de cubierta de HCV en muestras de tejidos de pacientes. Estos anticuerpos se dirigieron contra la región N-terminal de E1, aminoácidos (aa) 192-226, (Hiramatsu et al., 1992, Kaito et al., 1994), o el dominio C-terminal de E2, aa 451-715 (Sansonno et al., 1997a, 1997b). Sin embargo, a partir de estas publicaciones y de las revisiones de Guido y Thung (1996), y Liang (1996), es evidente que existe aún una necesidad de anticuerpos bien caracterizados que permitan una detección eficaz y habitual de antígenos de proteínas de HCV naturales en muestras de suero y de tejidos. Esta necesidad se confirmó recientemente mediante un estudio de Dries y colaboradores (1999). El grupo de Dries demostró que el 61% de los individuos positivos al anticuerpo de HCV y negativos a ARN sérico eran portadores de HCV, puesto que el ARN de HCV se pudo detectar en muestras de biopsia hepática, pero sólo un tercio de estos casos se pudo detectar mediante inmunohistoquímica usando un panel de anticuerpos. De este modo, la detección normal de antígeno de HCV en biopsias hepáticas aún carece de sensibilidad. También, la detección de antígenos víricos en fluidos corporales, tales como suero o plasma, está impedida por el mismo problema. Hasta la fecha, sólo se ha descrito una única técnica que permite la detección de un antígeno de núcleo en estos fluidos. Sin embargo, a fin de detectar la proteína de núcleo, la técnica requiere una desnaturalización completa de la proteína del núcleo presente en la muestra, usando hidróxido de sodio (Kashiwakuma et al., 1996).

Por lo tanto, en conjunto, es necesaria urgentemente la identificación de nuevos epítopos de HCV específicos que sean accesibles para los anticuerpos y que permitan la detección del antígeno en muestras de tejidos o de fluidos corporales. Las proteínas de cubierta del HCV son dianas candidatas putativas para encontrar tales epítopos, puesto que estas proteínas deben de estar presentes en todas las muestras biológicas: en fluidos, en la membrana de los virus, y en las células desde el comienzo mismo de la infección (es decir, la entrada vírica) a lo largo del ciclo completo de replicación. Sin embargo, estas proteínas de cubierta son muy variables, de forma que son necesarios anticuerpos con una elevada reactividad cruzada con respecto a los diferentes genotipos de HCV. De este modo, se está llevando a cabo el reto de identificar tales epítopos y de buscar anticuerpos con una elevada reactividad cruzada con respecto a la variación de secuencias de HCV.

La presente Solicitud se refiere a anticuerpos monoclonales específicos, dirigidos contra epítopos particulares en las proteínas de cubierta de HCV, que son capaces de detectar el antígeno de HCV en muestras de tejidos de pacientes. En total, se encontraron dos de tales epítopos, y los anticuerpos correspondientes: uno en la región C-terminal (aa 227-383) de la proteína de cubierta E1, y uno en la región hipervariable N-terminal (HVR) de E2 (aa 384-450). Aunque esta última región, y más específicamente la región 395-415, se considera que es hipervariable, se caracterizó, con sorpresa, un anticuerpo que reacciona con diversas secuencias conocidas de la HVR de E2.

Objetivos de la invención

A partir de la bibliografía, está claro que existe una necesidad urgente de desarrollar métodos de diagnóstico fiables, vacunas fiables y agentes terapéuticos eficaces para HCV. También son necesarios métodos de identificación sensibles y específicos de productos sanguíneos contaminados con HCV, y métodos mejorados para cultivar HCV. Los nuevos anticuerpos capaces de detectar el virus en modelos de animales o in vitro, o en su hospedante natural, pueden ayudar a diseñar herramientas de diagnóstico eficaces y agentes terapéuticos. A este respecto, la presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de anticuerpos monoclonales dirigidos contra E1 o HVR de E2, que se pueden usar para la detección de antígenos de HCV en diversos tejidos o células. Estos tejidos incluyen el hígado, pero también células derivadas de muestras de sangre. Por lo tanto, la presente invención tiene como objeto proporcionar y usar un anticuerpo que se une específicamente a la región aa 227-450 de la proteína de cubierta de HCV, que cubre la parte principal (C-terminal) de la proteína E1, y la región N-terminal de la proteína E2. Estos anticuerpos permiten la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales, y se pueden usar para la preparación de un kit de detección de antígenos de proteínas de HCV naturales. De forma notable, la proteína E1 completa corresponde a aa 192-383, mientras que la proteína E2 completa corresponde a aa 384-747 (véase: Major y Feinstone, 1997, Maertens y Stuyver, 1997).

Más específicamente, la presente invención tiene como objeto proporcionar y usar un anticuerpo como se define anteriormente que se une específicamente a al menos uno de los siguientes epítopos:

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aa 307-326 de la proteína E1 de HCV (SEQ ID 30)

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aa 395-415 de la proteína E2 de HCV (SEQ ID 31).

Además, la presente invención tiene como objeto proporcionar y usar un anticuerpo según se define anteriormente que es un anticuerpo monoclonal. A este respecto, la presente invención tiene como objeto proporcionar y usar un anticuerpo monoclonal segregado por la estirpe de hibridoma con el depósito de ECACC que tiene un número de acceso 98031215 ó 98031214.

Debería de estar claro que la presente invención también tiene como objeto proporcionar y usar cualquier variante o fragmento funcionalmente equivalente de cualquier anticuerpo según se define anteriormente, así como sus formas mutantes, o moléculas que muestran reactividades de unión funcionales similares con SEQ ID 30 y 31, tales como las secuencias obtenidas a partir de librerías de fagos o de otras librerías.

Además, la presente invención tiene como objeto proporcionar y usar una estirpe celular de hibridoma que segrega un anticuerpo monoclonal que se una específicamente a la proteína E1 de HCV (aa 227-383) o a la región hipervariable N-terminal de E2 de HCV (aa 384-450), y que permite la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales, y que se puede usar para la preparación de un kit de detección de antígenos de proteínas de HCV naturales. Más específicamente, la presente invención tiene como objeto proporcionar y usar la estirpe celular de hibridoma que corresponde al depósito de ECACC que tiene el número de acceso 98031215 ó 98031214.

Además, la presente invención también tiene como objeto proporcionar un método para la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales, que comprende:

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poner en contacto una muestra de ensayo que puede contener antígenos de la proteína de HCV con un anticuerpo según se define anteriormente, o con una variante o fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo, para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, y

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determinar dicho complejo de antígeno-anticuerpo con un marcador apropiado.

Más específicamente, la presente invención tiene como objeto proporcionar un método según se define anteriormente en el que dicha muestra de ensayo comprende células humanas, tales como células de sangre periférica, o tejidos humanos, tales como tejido hepático.

Finalmente, la presente invención tiene como objeto proporcionar un kit de ensayo para la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales, que comprende:

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un anticuerpo según se define anteriormente, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo, y

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marcadores apropiados que permitan determinar los complejos formados entre los antígenos de la proteína de HCV en una muestra de ensayo con dicho anticuerpo o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo.

Todos los objetivos de la presente invención se considera que se han satisfecho mediante las realizaciones explicadas a continuación.

Breve descripción de las tablas y de los dibujos

La Tabla 1 proporciona las secuencias peptídicas de todos los péptidos mencionados en esta Solicitud.

La Tabla 2 muestra la reactividad cruzada de IGH 222 con respecto a diversas secuencias del dominio hipervariable en E2. Todos los péptidos se biotinilaron, se unieron a placas de microtitulación revestidas con estreptavidina, y se dejaron reaccionar con IGH 222.

La Figura 1 muestra la tinción del antígeno de E2, revelado mediante el anticuerpo monoclonal IGH 222, en una biopsia hepática de un paciente con HCV. La inmunohistoquímica se realizó sobre secciones crioestatizadas de 4 \mum de espesor de materiales congelados recientes (la biopsia hepática se congeló instantáneamente en isopentano enfriado en nitrógeno líquido, y se almacenó a -70ºC hasta el uso), usando un procedimiento indirecto con inmunoperoxidasa de tres etapas. Las secciones se incubaron toda la noche a 4ºC con el anticuerpo monoclonal IGH 222 (IgG_{1} purificada: 10 ng/\mul). Los anticuerpos secundario y terciario consistieron en IgG anticonejo de cerdo conjugada con peroxidasa y anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa, respectivamente (ambos obtenidos de Dakopatts, Copenhague, Dinamarca; dilución de trabajo 1/50 y 1/100, respectivamente). Cada incubación se realizó 30 minutos a temperatura ambiente, y estuvo seguida de un lavado en tres cambios de disolución salina tamponada con fosfato, pH 7,2. El producto de reacción se desarrolló mediante incubación durante 15 minutos, en tampón de acetato 100 mM (pH 5,2), que contiene 0,05% de 3-amino-9-etilcarbazol y 0,01% de H_{2}O_{2}, dando como resultado una tinción roja brillante de los sitios inmunorreactivos. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Los controles (no mostrados) consistieron en anticuerpos monoclonales irrelevantes, de isotipo similar al del anticuerpo primario, o de cromógeno solo: estos controles fueron consistentemente negativos. La fotografía muestra un aumento de 25X. La tinción más oscura revela la presencia de antígeno de HCV en hepatocitos sólo (véase las flechas).

La Figura 2A muestra la tinción del antígeno de E1, revelado mediante el anticuerpo monoclonal IGH 207, en una biopsia hepática de un paciente con HCV. El procedimiento seguido es idéntico al descrito en la figura 1, excepto para la concentración del anticuerpo monoclonal, la cual fue 30 ng/\mul. La fotografía muestra un aumento de 10X, en la que domina la tinción de las células en los infiltrados linfocíticos. La tinción más oscura revela la presencia de antígeno de HCV en hepatocitos (véase flecha) y en linfocitos infiltrantes (véase doble flecha).

La Figura 2B muestra la tinción del antígeno de E1, revelado mediante el anticuerpo monoclonal IGH 210, en una biopsia hepática de un paciente con HCV. La biopsia hepática se fijó con formaldehído, y se sumergió en parafina. Las secciones se pretrataron con calor (método de microondas), y mediante digestión con proteasa. La concentración del anticuerpo fue 6 ng/\mul. La fotografía muestra una célula mononuclear aislada claramente teñida (flecha) en un campo de hepatocitos, que no se tiñe con este anticuerpo monoclonal.

La Figura 3 muestra la tinción, revelada mediante el anticuerpo monoclonal IGH 207, del antígeno de E1 intracelular en células mononucleares de sangre periférica. Los glóbulos blancos de sangre periférica (0,5 x 10^{6}) se suspendieron en 200 \mul de PBS-0,1% de saponina, se añadieron 2 \mug de IGH 207, y se dejó reaccionar durante 25 minutos a 4ºC. Las células se lavaron tres veces con 3 ml de PBS-0,1% de saponina, y tres veces con PBS-0,2% de NaN_{3}. Finalmente, las células se resuspendieron en 250 \mul de PBS-0,2% de NaN_{3}, y se analizaron mediante citometría de flujo. Después de centrarse en la fracción de células mononucleares (columna derecha), se representó gráficamente la fluorescencia (columna izquierda). Las muestras 1-5 derivan de portadores crónicos de HCV, mientras que la muestra 6 deriva de un portador con sangre sana. La columna de la izquierda muestra dos ejemplos centrándose en la fracción de células mononucleares (muestras 2 y 6), mientras que la columna de la derecha muestra la fluorescencia encontrada en estas células mononucleares. Aunque la muestra de control no muestra tinción en absoluto con este anticuerpo monoclonal, existe una señal positiva notable en todos los pacientes con HCV, excepto para el paciente 4 para el cual se obtuvo una señal más débil.

La Figura 4 muestra la tinción, revelada mediante el anticuerpo monoclonal IGH 201, del antígeno de E1 intracelular en células mononucleares de sangre periférica. La técnica fue similar como se describe para la Figura 3. Las muestras 7-11 derivan de portadores crónicos de HCV, mientras que la muestra 12 deriva de un portador con sangre sana. La columna de la izquierda muestra dos ejemplos centrándose en la fracción de células mononucleares (muestras 7 y 12), mientras que la columna de la derecha muestra la fluorescencia encontrada en estas células mononucleares. Aunque la muestra de control revela una tinción de fondo más elevada, la reacción en las muestras de pacientes se puede discriminar fácilmente basándose en las dos poblaciones que se pueden detectar: una población con una tinción similar como en el control, y una segunda población con una tinción con intensidad elevada, no observada en el control.

Está claro que la detección de proteínas víricas ha estado impedida por la falta de anticuerpos que se unen específicamente a proteínas víricas, y que son capaces de reconocer los antígenos de proteínas de HCV naturales (es decir, antígenos proteínicos según se expresan mediante el hospedante tras la infección con HCV). La presente invención se basa en el hallazgo de dos nuevos epítopos sobre las proteínas de cubierta de HCV, que permiten la detección normal de antígenos de proteínas de HCV naturales, por medio de anticuerpos dirigidos contra estos epítopos, en muestras biológicas derivadas del hospedante. De este modo, la presente invención se refiere al uso de anticuerpos que se unen específicamente a la región C-terminal de la proteína E1 de HCV (aa 227-383), o a la región N-terminal de la proteína E2 de HCV (aa 384-450), para la preparación de un kit de detección de antígenos de proteínas de HCV naturales. La expresión "anticuerpos que se unen específicamente a la región C-terminal de la proteína E1 de HCV (aa 227-383), o a la región N-terminal de la proteína E2 de HCV (aa 384-450)" se refiere a cualquier anticuerpo policlonal o monoclonal que se une a una partícula vírica de la hepatitis C, o a cualquier molécula derivada de dicha partícula vírica, más particularmente a la región C-terminal de la proteína E1 y a la región N-terminal de la proteína E2. La "región de cubierta" de los virus de HCV, y de este modo "la región C-terminal de la proteína E1 de HCV (aa 227-383), o la región N-terminal de la proteína E2 de HCV (aa 384-450)", son regiones bien conocidas por la persona experta en la técnica (Wengler, 1991; Major y Feinstone, 1997; Maertens y Stuyver, 1997).

El término "unión" indica que los anticuerpos de la presente invención están conectados físicamente a las proteínas de HCV. En particular, que los anticuerpos se unen específicamente a las proteínas de cubierta del HCV, implicando que no hay sustancialmente reacción cruzada con otros componentes de HCV o con otras proteínas. La unión del anticuerpo a las proteínas de HCV se puede demostrar mediante cualquier método o ensayo conocido en la técnica, tal como el tipo de ensayo de unión, de ELISA, y de RIA, o ensayos de competición (por ejemplo, véase Current protocols in immunology). Debería de estar claro que la región de una proteína de cubierta de HCV, que se une a un anticuerpo, no necesita estar compuesta de una secuencia contigua.

La expresión "anticuerpo monoclonal", usada aquí, se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población homogénea de anticuerpos. La expresión no es limitante con respecto a la especie o fuente del anticuerpo, ni pretende estar limitada por la manera en la que se obtiene. Además, el término "anticuerpo" también se refiere a anticuerpos humanizados en los que al menos una porción de las regiones de armazón de una inmunoglobulina derivan de secuencias inmunoglobulínicas humanas y anticuerpos de una sola cadena, como se describe en la patente U.S. nº 4.946.778, y a fragmentos de anticuerpos tales como F_{ab}, F_{'(ab)2}, F_{V}, y otros fragmentos que retienen la función de unión a antígeno y la especificidad del anticuerpo progenitor. También se incluyen en el término "anticuerpo" los dianticuerpos, los trianticuerpos y los anticuerpos tetravalentes, como se describen en la Solicitud EP nº 97870092.0 de Lorré et al., que retienen la función de unión a antígeno y la especificidad del anticuerpo progenitor. Debería estar claro que los anticuerpos según se describen en la presente invención se podrían usar en un método para la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales.

La expresión "muestra de ensayo" se refiere a cualquier muestra obtenida a partir de un hospedante, tal como suero, plasma, saliva, moco, fluido de la médula espinal, o biopsias. A este respecto, las expresiones "muestra de ensayo" y "muestra biológica" se usan aquí de forma intercambiable. El término "biopsia" se refiere particularmente a una muestra que comprende células, en particular células humanas. Además, este último término se refiere también a una muestra derivada de un tejido líquido, tal como células de sangre periférica, o de un tejido sólido, tal como un tejido hepático. En el caso en el que la detección del antígeno se realice en una biopsia, se usa la expresión "detección in situ".

La expresión "kit de detección de antígenos de proteínas de HCV naturales" se refiere a un kit para la detección de cualquier antígeno de la proteína de HCV, preferentemente a la detección de la región C-terminal de la proteína E1 de HCV (aa 227-383), o de la región N-terminal de la proteína E2 de HCV (aa 384-450) en su posición natural u original, preferentemente los antígenos como se presentan en una muestra de ensayo, mediante cualquier método conocido por la persona experta en la técnica. En otras palabras, esta última expresión se refiere a la visualización de la presencia de la región C-terminal de la proteína E1 de HCV (aa 227-383), o de la región N-terminal de la proteína E2 de HCV (aa 384-450), en, o sobre, su célula o tejido del hospedante natural mediante la unión de los anticuerpos de la presente invención. El kit de detección comprende los siguientes componentes:

(i)

cuando sea apropiado, un medio para aislar una muestra de ensayo,

(ii)

posiblemente, una disolución para permeabilizar las células,

(iii)

un anticuerpo como se describe aquí, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente del mismo,

(iv)

posiblemente, anticuerpos secundarios y, posiblemente, anticuerpos terciarios,

(v)

posiblemente, tampones de incubación y/o de lavado,

(vi)

posiblemente, una disolución de tinción.

Preferentemente, dicho kit se usa para la detección in situ de las proteínas de cubierta de HCV.

La célula o tejido del hospedante natural puede ser cualquier célula o tejido del hospedante derivado de cualquier especie de hospedante. En particular, la célula del hospedante natural se refiere a células de sangre periférica, y el tejido natural se refiere a tejido hepático (véase también la sección de Ejemplos de la presente Solicitud). El hospedante natural se refiere, en particular, a seres humanos, pero también se puede referir a primates no humanos u otros mamíferos.

Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos, que se unen específicamente a al menos uno de los siguientes epítopos: aa 307-326 de la proteína E1 de HCV, y aa 395-415 de la proteína E2 de HCV. Estos últimos anticuerpos son segregados por hibridomas depositados en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, U.K. (Tel.: +44 1980 612512; fax: +44 1980 611315), el 13 de marzo de 1998, a los que se les ha asignado los siguientes números de acceso: 98031215 para el hibridoma 17H10F4D10 que segrega mAb IGH 222, que se une al epítopo aa 395-415 (SEQ ID 31), y, 98031214 para el hibridoma 14H11B2 que segrega mAb IGH 207, que se une al epítopo aa 307-326 (SEQ ID 30). A este respecto, debería de estar claro que los anticuerpos que se unen a partes de dichos epítopos también son parte de la presente invención. Por ejemplo, también se incluyen aquí los anticuerpos que se unen a los siguientes epítopos:
aa307-311, aa308-312, aa309-313, aa310-314, aa311-315, aa312-316, aa312-317, aa313-318, aa314-319, aa315-320, aa316-321, aa317-322, aa318-323, aa319-324, aa320-325, aa321-326, aa307-312, aa308-313, aa309-314, aa310-315, aa311-316, aa312-317, aa313-318, aa314-319, aa315-320, aa316-321, aa317-322, aa318-323, aa319-324, aa320-325, aa321-326, aa307-313, aa308-314, aa309-315, aa310-316, aa311-317, aa312-318, aa313-319, aa314-320, aa315-321, aa316-322, aa317-323, aa318-324, aa319-325, aa320-326, aa307-314, aa308-315, aa309-316, aa310-317, aa311-318, aa312-319, aa313-320, aa314-321, aa315-322, aa316-323, aa317-324, aa318-325, aa319-326, aa307-315, aa308-316, aa309-317, aa310-318, aa311-319, aa312-320, aa313-321, aa314-322, aa315-323, aa316-324, aa317-325, aa318-326, aa307-316, aa308-317, aa309-318, aa310-319, aa311-320, aa312-321, aa313-322, aa314-323, aa315-324, aa316-325, aa317-326, aa307-317, aa308-318, aa309-319, aa310-320, aa311-321, aa312-322, aa313-323, aa314-324, aa315-325, aa316-326, aa307-318, aa308-319, aa309-320, aa310-321, aa311-322, aa312-323, aa313-324, aa314-325, aa315-326, aa307-319, aa308-320, aa309-321, aa310-322, aa311-323, aa312-324, aa313-325, aa314-326, aa307-320, aa308-321, aa309-322, aa310-323, aa311-324, aa312-325, aa313-326, aa307-321, aa308-322, aa309-323, aa310-324, aa311-325, aa312-326, aa307-322, aa308-323, aa309-324, aa310-325, aa311-326, aa307-323, aa308-324, aa309-325, aa310-326,
aa307-324, aa308-325, aa309-326, aa307-325, aa308-326, y, aa395-399, aa396-400, aa397-401, aa398-402,
aa399-403, aa400-404, aa401-405, aa402-406, aa403-407, aa404-408, aa405-409, aa406-410, aa407-411, aa408-412, aa409-413, aa410-414, aa411-415, aa395-400, aa396-401, aa397-402, aa398-403, aa399-404, aa400-405, aa401-406, aa402-407, aa403-408, aa404-409, aa405-410, aa406-411, aa407-412, aa408-413, aa409-414, aa410-415, aa395-401, aa396-402, aa397-403, aa398-404, aa399-405, aa400-406, aa401-407, aa402-408, aa403-409, aa404-410, aa405-411, aa406-412, aa407-413, aa408-414, aa409-415, aa395-402, aa396-403, aa397-404, aa398-405, aa399-406, aa400-407, aa401-408, aa402-409, aa403-410, aa404-411, aa405-412, aa406-413, aa407-414, aa408-415, aa395-403, aa396-404, aa397-405, aa398-406, aa399-407, aa400-408, aa401-409, aa402-410, aa403-411, aa404-412, aa405-413, aa406-414, aa407-415, aa395-403, aa396-404, aa397-405, aa398-406, aa399-407, aa400-408, aa401-409, aa402-410, aa403-411, aa404-412, aa405-413, aa406-414, aa407-415, aa395-404, aa396-405, aa397-406, aa398-407, aa399-408, aa400-409, aa401-410, aa402-411, aa403-412, aa404-413, aa405-414, aa406-415, aa395-405, aa396-406, aa397-407, aa398-408, aa399-409, aa400-410, aa401-411, aa402-412, aa403-413, aa404-414, aa405-415, aa395-406, aa396-407, aa397-408, aa398-409, aa399-410, aa400-411, aa401-412, aa402-413, aa403-414, aa404-415, aa395-407, aa396-408, aa397-409, aa398-410, aa399-411, aa400-412, aa401-413, aa402-414, aa403-415, aa395-408, aa396-409, aa397-410, aa398-411, aa399-412, aa400-413, aa401-414, aa402-415, aa395-409, aa396-410, aa397-411, aa398-412, aa399-413, aa400-414, aa401-415, aa395-410, aa396-411, aa397-412, aa398-413, aa399-414, aa400-415, aa395-411, aa396-412, aa397-413, aa398-414, aa399-415, aa395-412, aa396-413, aa397-414, aa398-415, aa395-413, aa396-414, aa397-415, aa395-414 y 396-415.

La presente invención también se refiere a variantes o fragmentos funcionalmente equivalentes de los anticuerpos indicados anteriormente. La expresión "variantes o fragmentos funcionalmente equivalentes" se refiere a cualquier variante o fragmento conocido en la técnica de dichos anticuerpos que retienen la función de unión al antígeno y la especificidad del anticuerpo progenitor.

Más específicamente, esta última expresión se refiere a anticuerpos humanizados y a anticuerpos de una sola cadena como se define anteriormente, y a fragmentos de anticuerpos tales como F_{ab}, F_{'(ab)2}, F_{V}, y similares. También se incluyen los dianticuerpos, trianticuerpos y anticuerpos tetravalentes, como se describe anteriormente, así como formas mutantes de los mismos, o moléculas que muestran reactividades de unión funcional similares con SEQ ID 30 y 31, tales como las secuencias obtenidas a partir de librerías de fagos o de otras librerías según se describe por Ladner, 1995; Maclennan, 1995 y Cannon et al., 1996. De hecho, cualquier péptido descrito por estos autores, restringido o no, que permita la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales, es parte de la presente invención.

La presente invención también se refiere a estirpes celulares de hibridomas que segregan anticuerpos según se define anteriormente. A este respecto, debería de estar claro que la tecnología de hibridomas para obtener mAb es bien conocida por la persona experta en la técnica, por ejemplo esencialmente según Kohler y Milstein (1975). Debería de estar claro que la cartografía de los epítopos a los que se unen específicamente los mAb se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica, tales como aquellos descritos en el documento PCT/EP 97/07268 de Depla et al.

La presente invención también se refiere a un método para la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales, que comprende:

-

poner en contacto una muestra de ensayo, que puede contener antígenos de la proteína de HCV, con un anticuerpo como se define anteriormente, o con una variante o fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo, para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, y

-

determinar dicho complejo de antígeno-anticuerpo con un marcador apropiado.

Preferentemente, dicho método se usa para la detección in situ de las proteínas de cubierta de HCV.

La expresión "determinar dicho complejo de antígeno-anticuerpo con un marcador apropiado" se refiere a cualquier método conocido en la técnica que detecta, o visualiza, los complejos de antígeno-anticuerpo indicados anteriormente, tal como citometría de flujo mediante fluorescencia, ensayos de tipo unión, ELISA y RIA, o ensayos de competición (véase la sección Ejemplos, Hertogs et al., 1993, y el documento WO 93/04084 de Mehta et al.). De forma similar, la expresión "marcador apropiado" se refiere a cualquier marcador conocido en la técnica, tal como los descritos en el documento WO 93/04084 de Mehta et al. y Coligan et al., 1992, que visualiza los complejos de antígeno-anticuerpo indicados anteriormente.

A este respecto, la presente invención también se refiere a un kit de ensayo para la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales, que comprende: un anticuerpo como se define anteriormente, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo, y marcadores apropiados que permiten determinar los complejos formados entre los antígenos de la proteína de HCV en la muestra de ensayo con dicho anticuerpo o un fragmento o variante funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo.

La presente invención se ilustrará ahora con referencia a los siguientes ejemplos que presentan realizaciones particularmente ventajosas. Sin embargo, se debe observar que estas realizaciones son meramente ilustrativas, y no se deben de interpretar como restricciones de la invención, de ninguna manera.

Ejemplos Ejemplo 1 Generación de anticuerpos monoclonales contra E1 y E2

Se inmunizaron ratones con versiones truncadas de E1 (aa 192-326) y E2 (384-673), expresadas mediante el virus de la vacuna recombinante, como se describe en el documento PCT/EP 95/03031 de Maertens et al. Después de la inmunización, los esplenocitos de los ratones se fusionaron con la estirpe celular de mieloma. Los hibridomas resultantes, que segregan anticuerpos específicos para E1 o E2, se seleccionaron por medio de ELISA.

Ejemplo 2 Selección de anticuerpos monoclonales

Se evaluó una gran serie (25 en total, de los cuales 14 se evaluaron en detalle; estos últimos se pueden obtener de Innogenetics NV, Gante, Bélgica) de anticuerpos monoclonales dirigidos contra E1 o E2, para la tinción de antígeno de HCV natural en biopsias hepáticas de pacientes con HCV y de controles (véase más abajo). La tinción se realizó en criosecciones o en biopsias fijadas con formaldehído (para los protocolos, véanse las leyendas de la figura). Sólo tres anticuerpos monoclonales revelaron una tinción clara y específica. Todos los otros anticuerpos monoclonales no dieron ninguna tinción, o la dieron muy débil, o mostraron una tinción no específica. De forma notable, se observaron dos patrones diferentes de tinción de antígeno. El anticuerpo monoclonal IGH 222, dirigido contra E2, tiñó claramente los hepatocitos (Figura 1), mientras que IGH 207 e IGH 210, dirigidos contra E1, tiñeron los linfocitos que se infiltran en el hígado (Figuras 2a y 2b). IGH 207 también tiñó los hepatocitos, pero en un grado más débil que IGH 222 (compárense las Figuras 1 y 2a). Este patrón de tinción fue confirmado en una serie de biopsias de cinco pacientes diferentes.

\newpage

Monoclonal	cubierta	Patrón de tinción
IGH 200	E1	negativo
IGH 201	E1	débil
IGH 202	E1	negativo
IGH 204	E1	débil
IGH 207	E1	\begin{minipage}[t]{57mm}fuerte positividad para linfocitos, positividad más débil para hepatocitos \end{minipage}
IGH 209	E1	negativo
IGH 210	E1	\begin{minipage}[t]{57mm} positivo en linfocitos (solo observada después de la fijación con formaldehído) \end{minipage}
IGH 212	E2	débil
IGH 214	E2	negativo
IGH 215	E2	negativo
IGH 216	E2	negativo
IGH 219	E2	negativo
IGH 221	E2	negativo
IGH 222	E2	fuerte positividad de hepatocitos

Ejemplo 3 Identificación de anticuerpos monoclonales que permite la detección del antígeno de cubierta vírico en células de sangre periférica

El hallazgo de que los infiltrados linfocíticos en el hígado se pueden teñir para antígenos de cubierta de HCV impulsó también a comprobarlo con las células mononucleares de sangre periférica. A fin de permitir la tinción intracelular, las células de sangre periférica se permeabilizaron con saponina, se dejaron después reaccionar con los anticuerpos monoclonales IGH 201 ó 207 (dirigidos contra E1, y que muestran una positividad débil y fuerte sobre las biopsias hepáticas, respectivamente). Finalmente, se comprobó la reactividad en un clasificador de células fluorescente, usando anticuerpos secundarios marcados con FITC. IGH 207, que ya tiñó los infiltrados linfocíticos en el hígado, mostró una especificidad elevada. Con este anticuerpo monoclonal, casi no se detectó tinción de fondo, y 4 de 5 pacientes dieron una tinción claramente positiva (Figura 3). El segundo anticuerpo monoclonal, IGH 201 (que se une a SEQ ID 29; número de acceso de ECACC: 98031216), que también está dirigido contra E1, da un fondo mayor, pero se detectó E1 intracelular en 5 de 5 pacientes, como se puede deducir a partir de los histogramas presentados en la Figura 4, que muestra una clara subpoblación de células con un grado de fluorescencia mayor según se compara con la muestra de control.

Ejemplo 4 Cartografía de los anticuerpos monoclonales reactivos contra E1 o E2

Los 14 anticuerpos monoclonales se cartografiaron para sus respectivos epítopos, usando péptidos que escanean la proteína E1 y E2 contra la cual se producen los anticuerpos. Estos péptidos se biotinilaron, se unieron a placas de microtitulación sensibilizadas con estreptavidina, y se dejaron reaccionar con los anticuerpos monoclonales. Como control positivo, se comprobaron las proteínas de cubierta recombinantes.

Para cada anticuerpo monoclonal, la reactividad se pudo asignar a una región de epítopo específica definida por dos péptidos que solapan (para detalles sobre las secuencias, véase la Tabla 1).

péptidos	Región aa	Monoclonales reactivos
V1V2	192-226	IGH 201, 204, 202, 200
V2V3	212-244	IGH 201, 204, 202, 200
V3V4	230-263
HR	261-290
V5C4	288-327	IGH 207, 210, 209
C4V6	307-340	IGH 207, 210, 209
recombinante	192-326	IGH 201, 207, 210, 204, 202, 200, 209
HVR I	384-415	IGH 222, 215
HVR1/C1a	395-428	IGH 222, 215
C1a	413-447
C1b	430-467
HVRII	460-487	IGH 212, 214, 221
C2a	480-513	IGH 219, 216
C2b	500-530
V3-C3	523-566
V4	561-590
C4a	578-627
C4b	621-648
C4c	641-673
recombinante	384-673	IGH 222, 215, 212, 214, 221, 219, 216

El epítopo para IGH 201 se puede definir como la región 212-226 (SEQ ID 29), para IGH 207 e IGH 210 ésta es 307-326 (SEQ ID 30), y para IGH 222 ésta es 395-415 (SEQ ID 31). La región de aminoácidos de IGH 201 es una región más bien variable de la proteína E1 de HCV, y ya se ha dado a conocer previamente con relación a la detección in situ de HCV (Hiramatsu et al., 1992, Kaito et al., 1994). Sin embargo, a partir de los estudios, está claro que los anticuerpos dirigidos contra este epítopo son menos adecuados para la detección in situ de HCV puesto que la biopsia hepática que se tiñe con este anticuerpo fue negativa, y la tinción sobre linfocitos de sangre periférica mostró un fondo considerable. Por el contrario, IGH 207 e IGH 210 reconocen una región completamente conservada de E1 (Maertens y Stuyver, 1997). El anticuerpo monoclonal IGH 222 reconoce una región de E2, que es parte del dominio hipervariable N-terminal de E2, y demostró ser muy adecuado para la detección eficaz in situ de HCV.

Ejemplo 5 Determinación de reactividad cruzada sobre epítopos variables

Usando una serie extensa de péptidos derivados de diversas secuencias del epítopo hipervariable N-terminal de E2, se caracterizó adicionalmente IGH 222. La Tabla 2 muestra un resumen de estos experimentos. A partir de esta tabla, se puede concluir que este anticuerpo monoclonal reacciona con varias secuencias, pero fracasa a la hora de reaccionar con algunas otras. Conociendo este epítopo, es suficiente para la persona experta en la técnica producir anticuerpos adicionales contra este epítopo, con una mejor reactividad con relación a otras secuencias que no son reconocidas por IGH 222. Tales secuencias son, a título de ejemplo, los péptidos con números 490, 940, 884, 484 y 494, pero se pueden encontrar otras secuencias en la región entre aa 395-415 contra las cuales puede no reaccionar IGH 222.

A partir de estos ejemplos, está claro que los epítopos reconocidos por los anticuerpos monoclonales IGH 201, 207, 210 y 222, son fácilmente accesibles para unir a anticuerpos, y permite la detección del antígeno en biopsias hepáticas y en células de sangre periférica. Las propiedades de los anticuerpos monoclonales IGH 201, 207, 210 y 222, son más bien únicas, puesto que otros anticuerpos monoclonales dirigidos contra los mismos epítopos dieron como resultado una elevada tinción de fondo y una ausencia de tinción específica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales IGH 207, 209 y 210 reconocen todos el mismo epítopo, sin embargo IGH 209 no es capaz de teñir el antígeno de E1 en ningún tipo celular, mientras que IGH 210 sólo tiñe los linfocitos, e IGH 207 tiñe tanto los linfocitos como los hepatocitos. Con la actual invención, debería de ser factible para la persona experta en la técnica producir una gran serie de anticuerpos (ya sea de naturaleza policlonal o monoclonal, en diversas especies), que se pueden usar para la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales.

La necesidad de producir una serie de anticuerpos contra un epítopo dado refleja el hecho de que el comportamiento de un anticuerpo no está determinado exclusivamente por el epítopo reconocido, sino también por propiedades secundarias tales como afinidad y avidez por el epítopo, solubilidad, isotipo, y especie en la que se genera. Para cada aplicación, se puede requerir un anticuerpo con propiedades secundarias diferentes. De este modo, la producción de tal serie grande de anticuerpos permitirá identificar algunos de ellos que tengan propiedades similares a IGH 201, 207, 210 y 222, es decir que sean capaces de revelar la presencia de la proteína de cubierta de HCV en muestras biológicas del hospedante. De hecho, el conocimiento de que estos epítopos son claramente accesibles sobre las proteínas de cubierta de HCV, según se expresan en el hospedante, proporciona la información necesaria para desarrollar ensayos para detectar estos antígenos no sólo in situ, como se presenta aquí, sino también en disolución (por ejemplo, en plasma o suero). Los anticuerpos monoclonales IGH 201, 207, 210 ó 222, u otros desarrollados contra el mismo epítopo pero con características óptimas para la detección de antígeno soluble, posiblemente en combinación con otros, también se podría usar para desarrollar tal ensayo.

Listado de referencias

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1

2

3

4

Claims (9)

1. Uso de un anticuerpo que es segregado por la estirpe celular de hibridoma del depósito de ECACC con número de acceso 98031214, o por la estirpe celular de hibridoma del depósito de ECACC que tiene un número de acceso 98031215, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de cualquiera de dichos anticuerpos, para la preparación de un kit para la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales.

2. Un anticuerpo monoclonal segregado por una estirpe celular de hibridoma del depósito de ECACC, que tiene el número de acceso 98031214 ó 98031215.

3. Una variante o fragmento funcionalmente equivalente del anticuerpo según la reivindicación 2.

4. Una estirpe celular de hibridoma del depósito de ECACC que tiene un número de acceso 98031214 ó 98031215.

5. Método para la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales, que comprende:

-

poner en contacto una muestra de ensayo, que puede contener antígenos de la proteína de HCV, con un anticuerpo según la reivindicación 2 ó 3, para formar un complejo de anticuerpo-antígeno, y

-

determinar dicho complejo de antígeno-anticuerpo con un marcador apropiado.

6. El método según la reivindicación 5, en el que dicha muestra de ensayo comprende células o tejidos humanos.

7. El método según la reivindicación 6, en el que dichas células humanas son células de sangre periférica.

8. El método según la reivindicación 6, en el que dicho tejido humano es tejido hepático.

9. Un kit de ensayo para la detección de antígenos de proteínas de HCV naturales, que comprende:

-

un anticuerpo según la reivindicación 2 ó 3, y, opcionalmente,

-

marcadores apropiados que permitan determinar los complejos formados entre los antígenos de la proteína de HCV en una muestra de ensayo, con dicho anticuerpo.