ES2272286T3 - Un procedimiento para la preparacion de derivados de glicosidos esteroides ruscus aculeatus mediante hidrolisis enzimatica. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la preparación de desglucodesramnoruscina, que comprende la hidrólisis enzimática parcial de ruscina, desglucoruscina o ruscósido (ruscosaponinas) por medio de preparaciones brutas basadas en hidrolasas extraídas de Aspergillus niger, presentando dichas preparaciones de enzima al mismo tiempo actividades de a-glucopiranosidasa y a- ramnopiranosidasa y proporcionando la eliminación secuencial del residuo a- glucósido seguido de la eliminación del residuo a-ramnosidasa.
Description
Un procedimiento para la preparación de
derivados de glicósidos esteroides Ruscus aculeatus mediante
hidrólisis enzimática.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de derivados de glicósidos
esteroides Ruscus aculeatus (ruscosaponina).
De forma más particular, la invención se refiere
a un procedimiento para la preparación de desglucodesramnoruscina
mediante hidrólisis enzimática parcial de ruscina, desglucoruscina o
ruscósido.
En el documento DE2202393 se obtiene
desglucodesramnoruscina de la desglucoruscina mediante calentamiento
en ácido acético.
Perepelitsa y col. (1975) PRIKLADNAYA BIOKHIMIYA
I MIKROBIOLOGIYA, 11, 901 a 905 usan hidrolasas de A. niger
para obtener dioscina y trilina y protodioscina mediante escisión de
enlaces glucosa-ramnosa.
La hidrólisis enzimática de acuerdo con la
invención se lleva a cabo por medio de preparaciones de enzima
brutas basadas en hidrolasas extraídas de Aspergillus niger.
Dichas preparaciones se encuentran comercialmente disponibles y se
usan en las industrias del vino y alimentación. Se prefiere de forma
particular el uso de la preparación comercialmente disponible de
Gist Brocades con el nombre comercial Cytolase PCL5.
Dichas preparaciones de enzimas tienen al mismo
tiempo actividades de \beta-glucopiranosidasa y
\alpha-ramnopiranosidasa y por tanto proporcionan
la eliminación secuencial del residuo
\beta-glucósido seguido de eliminación del
residuo \alpha-ramnosida hasta el producto
deseado.
La hidrólisis enzimática se lleva a cabo en
solución acuosa tamponada a pH 5 o en agua que contiene hasta
aproximadamente el 30% en volumen de etanol. Se ha observado que en
la práctica la presencia de etanol no afecta de forma adversa la
actividad enzimática: la actividad de la
\beta-glucopiranosidasa aumenta en presencia de
etanol mientras que, por otro lado, la actividad de
\alpha-ramnopiranosidasa disminuye ligeramente,
pero en un grado que no afecta en modo alguno a la reacción de la
invención. Aproximadamente es necesario un 30% en relación v/v de
porcentaje de etanol para la solubilización completa de
desglucoruscina, mientras que se requieren porcentajes inferiores,
de aproximadamente el 17% en relación v/v, para el ruscósido. Por
tanto, el uso de esta última puede ser preferido a veces también
porque no requiere pre-tratamientos específicos y
debido a que sus propiedades tensioactivas solubilizan la
desglucoruscina resultante de la primera etapa de la hidrólisis
enzimática, que se puede transformar luego en
\alpha-ramnopiranosidasa de forma más
eficiente.
La concentración de ruscosaponina puede variar
de aproximadamente 5 a aproximadamente 40% en relación p/v, y la
hidrólisis se lleva a cabo a temperaturas que varían de 20 a 25ºC
durante periodos que varían de 3 a 7 días.
Al final del procedimiento de bioconversión, el
producto de desglucodesramnoruscina final, insoluble en el sistema
de reacción, se puede recuperar fácilmente mediante centrifugación y
subsiguiente lavado con metanol. Además, el procedimiento de la
invención se puede llevar a cabo de forma continua, eliminando el
producto hidrolizado en momentos de tiempo fijados y añadiendo de
forma continua sustrato fresco, gracias a la estabilidad de los
enzimas usados. Para este fin se usará preferiblemente un
biorreactor equipado con una membrana de ultrafiltración, para
evitar la acumulación de inhibidores y moléculas de
desnaturalización.
El siguiente ejemplo ilustra la invención con
mayor detalle.
La preparación enzimática Cytolase PCL5 (Gist
Brocades) se diafiltró antes de uso junto a tampón
citrato-fosfato 0,1 M pH 5 en equipo Amicon
equipado con una membrana XM (corte a 50 kDa) con el fin de eliminar
los agentes de desnaturalización e inhibidores.
La mezcla de incubación se preparó mediante
adición en el siguiente orden de: sustrato (desglucoruscina o
ruscósido), tampón citrato-fosfato 0,1 M pH 5,0,
Cytolase PCL5 y lentamente, con agitación, etanol. La concentración
de sustrato varió de 5 a 40% (en relación p/v) y la concentración de
etanol de 0 a 30% (en relación v/p). La reacción fue seguida por
TLC (cromatografía en capa fina) sobre placas de gel de sílice (60
F250 Merck) con acetato de etilo/metanol/agua 100:15:10 como
eluyente. La activación de la preparación enzimática fue de 38
unidades de \beta-glucopiranosidasa y de 2,3
unidades de \alpha-ramnopiranosidasa por ml de
mezcla de incubación.
La bioconversión se llevó a cabo a una
temperatura de 25ºC. La transformación en desglucodesramnoruscina
fue completada en aproximadamente 72 horas partiendo de
desglucoruscina y en aproximadamente 96 horas partiendo de
ruscósido.
La mezcla de incubación se centrifugó luego a
12.100 g durante 30 minutos a 4ºC. Se lavó el precipitado con
metanol y se centrifugó de nuevo en las mismas condiciones que
anteriormente. Esta etapa se repitió cinco veces y se reunieron los
sobrenadantes. Se evaporó luego la solución de metanol a vacío y se
trituró el producto resultante para obtener un polvo amarillo
oscuro fino, que contiene el 20% de desglucodesramnoruscina (ensayo
por HPLC, cromatografía líquida de alta resolución).
Claims (5)
1. Un procedimiento para la preparación
de desglucodesramnoruscina, que comprende la hidrólisis enzimática
parcial de ruscina, desglucoruscina o ruscósido (ruscosaponinas) por
medio de preparaciones brutas basadas en hidrolasas extraídas de
Aspergillus niger, presentando dichas preparaciones de enzima
al mismo tiempo actividades de
\beta-glucopiranosidasa y
\alpha-ramnopiranosidasa y proporcionando la
eliminación secuencial del residuo
\beta-glucósido seguido de la eliminación del
residuo \alpha-ramnosidasa.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la hidrólisis se lleva a cabo en
solución acuosa a pH 5 o en mezcla de agua-etanol
que contiene hasta el 30% del volumen de etanol.
3. Un procedimiento como se reivindica
en las reivindicaciones 1 a 2, en el que la concentración de
ruscosaponinas varía de 5 a 40% en relación p/v.
4. Un procedimiento como se reivindica
en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la
hidrólisis se lleva a cabo a temperaturas de 20 a 40ºC durante
periodos de tiempo de 3 a 7 días.
5. Un procedimiento como se reivindica
en una cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que el
producto final se recupera mediante centrifugación y lavado con
metanol.
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