ES2273043T3 - Composiciones de pirazol utiles como inhibidores de gsk-3. - Google Patents

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Abstract

Un compuesto de fórmula I: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: W es nitrógeno; R1 se selecciona de hidrógeno o flúor; y Ry es un grupo alifático C1-4, en donde dicho grupo alifático es una cadena hidrocarbonada C1-C4 de cadena lineal o ramificada que está completamente saturada o que contiene una o más unidades de insaturación, o un hidrocarbu- ro C3-C4 monocíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático, que tiene un solo punto de ligazón al resto de la molécula.

Description

Composiciones de pirazol útiles como inhibidores de GSK-3.
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a inhibidores de proteína quinasas, especialmente glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3), una serina/treonina proteína quinasa. La invención también proporciona composiciones que comprenden los inhibidores de la invención y métodos que utilizan estas composiciones en el tratamiento de diversos trastornos, tales como diabetes, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple (MS), apoplejía, trastornos neurológicos y neurodegenerativos y trastornos psiquiátricos.
Antecedentes de la invención
La búsqueda de nuevos agentes terapéuticos ha sido muy apoyada en los últimos años por una mejor comprensión de la estructura de las enzimas y otras biomoléculas asociadas con enfermedades elegidas como objetivo. Una clase importante de enzimas que ha sido el objeto de estudio intensivo es la de las proteína quinasas.
Las proteína quinasas median en la transducción de señales intracelulares. Hacen esto efectuando una transferencia de fosforilo desde un trifosfato de nucleósido hasta un aceptor proteínico que está implicado en una ruta de señalización. Existe un número de quinasas y rutas a través de las cuales los estímulos extracelulares y otros hacen que se produzca dentro de la célula una variedad de respuestas celulares. Ejemplos de tales estímulos incluyen señales de estrés medioambiental y químico (por ejemplo, choque osmótico, choque térmico, radiación ultravioleta, endotoxina bacteriana y H_{2}O_{2}), citoquinas (por ejemplo, interleuquina-1 (IL-1) y factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha)) y factores de crecimiento (por ejemplo, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)). Un estímulo extracelular puede afectar a una o más respuestas celulares relacionadas con el crecimiento, la migración, la diferenciación celulares, la secreción de hormonas, la activación de factores de transcripción, la contracción muscular, el metabolismo de la glucosa, el control de la síntesis de proteínas y la regulación del ciclo celular.
Muchas enfermedades se asocian con respuestas celulares anormales activadas por episodios mediados por proteína quinasas. Estas enfermedades incluyen enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades óseas, enfermedades metabólicas, enfermedades neurológicas y neurodegenerativas, cáncer, enfermedades cardiovasculares, alergias y asma, enfermedad de Alzheimer y enfermedades relacionadas con hormonas. De acuerdo con esto, se ha hecho un esfuerzo substancial en la química médica para encontrar inhibidores de proteína quinasas que sean eficaces como agentes terapéuticos.
La glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3) es una serina/treonina proteína quinasa comprendida por isoformas \alpha y \beta que son codificadas cada una por genes distintos [Coghlan y otros, Chemistry & Biology, 7, 793-803 (2000); Kim y Kimmel, Curr. Opinion Genetics Dev., 10, 508-514 (2000)]. La GSK-3 se ha relacionado con diversas enfermedades, incluyendo la diabetes, enfermedad de Alzheimer, trastornos del CNS tales como trastorno maníaco-depresivo y enfermedades neurodegenerativas, e hipertrofia de cardiomiocitos [véanse, por ejemplo, WO 99/65897; WO 00/38675; Kaytor y Orr, Curr. Opin. Neurobiol., 12, 275-8 (2000); Haq y otros, J. Cell Biol., 151, 117-30 (2000); Eldar-Finkelman, Trends Mol. Med., 8, 126-32 (2002)]. Estas enfermedades se asocian con el funcionamiento anormal de ciertas rutas de señalización celulares en las que representa un papel la GSK-3.
Se ha encontrado que la GSK-3 fosforila y modula la actividad de un número de proteínas reguladoras. Estas incluyen glucógeno sintasa, que es la enzima limitativa de la velocidad requerida para la síntesis de glucógeno, la proteína asociada con microtúbulos Tau, el factor de transcripción génica \beta-catenina, el factor de iniciación de la traducción e1F-2B, así como ATP citrato liasa, axina, factor del choque térmico 1, c-Jun, c-myc, c-myb, CREB y CEPB\alpha. Estas diversas dianas implican a la GSK-3 en muchos aspectos del metabolismo, la proliferación, la diferenciación y el desarrollo celulares.
En una ruta mediada por GSK-3 que es pertinente para el tratamiento de la diabetes tipo II, la señalización inducida por insulina conduce a captación de glucosa y síntesis de glucógeno celular. La GSK-3 es un regulador negativo de la señal inducida por insulina en esta ruta. Normalmente, la presencia de insulina provoca la inhibición de la fosforilación y la desactivación de glucógeno sintasa mediadas por GSK-3. La inhibición de GSK-3 conduce a síntesis de glucógeno y captación de glucosa incrementadas [Klein y otros, PNAS, 93, 8455-9 (1996); Cross y otros, Biochem. J., 303,21-26 (1994); Cohen, Biochem. Soc. Trans., 21, 555-567 (1993) y Massillon y otros, Biochem J. 299, 123-128 (1994); Cohen y Frame, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2, 769-76 (2001)]. Sin embargo, cuando la respuesta a la insulina está deteriorada en un paciente diabético, la síntesis de glucógeno y la captación de glucosa no se incrementan a pesar de la presencia de niveles de insulina en sangre relativamente altos. Esto conduce a niveles de glucosa en sangre anormalmente altos con efectos agudos y crónicos que finalmente pueden dar como resultado enfermedad cardiovascular, fallo renal y ceguera. En tales pacientes, no se produce la inhibición normal inducida por insulina de GSK-3. También se ha presentado que la GSK-3 se sobreexpresa en pacientes con diabetes tipo II [WO 00/38675]. Por lo tanto, los inhibidores terapéuticos de GSK-3 son útiles para tratar a pacientes diabéticos que sufren una respuesta deteriorada a
insulina.
La apoptosis se ha relacionado con la patología del daño cerebral isquémico (Li y otros, 1997; Choi y otros, 1996; Charriaut-Marlangue y otros, 1998; Grahm y Chen, 2001; Murphy y otros, 1999; Nicotera y otros, 1999). Publicaciones recientes indican que la activación de GSK-3\beta puede estar implicada en los mecanismos apoptóticos (Kaytor y Orr, 2002; Culbert y otros, 2001). Estudios en modelos de rata de apoplejía isquémica inducida por oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) mostraban que la expresión incrementada de GSK-3\beta es posterior a la isquemia (Wang y otros, Brain Res, 859, 381-5, 2000; Sasaki y otros, Neurol Res, 23, 588-92, 2001). El factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) reducía la lesión cerebral isquémica después de oclusión de la arteria cerebral media (MCO) permanente en ratas (Fisher y otros, 1995; Song y otros, 2002). En efecto, los efectos neuroprotectores de FGF demostrados en modelos de isquemia en ratas pueden ser mediados por una inactivación de GSK-3\beta dependiente de PI-3 quinasa/AKT (Hashimoto y otros, 2002). Así, la inhibición de GSK-3\beta después de un episodio isquémico cerebral puede mejorar el daño cerebral isquémico.
La GSK-3 también está implicada en el infarto de miocardio. Véanse, Jonassen y otros, Circ Res, 89:1191, 2001 (La reducción en el infarto de miocardio mediante la administración de insulina en la reperfusión está mediada a través de una ruta de señalización dependiente de Akt); Matsui y otros, Circulation, 104:330, 2001 (La activación de Akt conserva la función cardíaca y evita la lesión de los cardiomiocitos después de isquemia cardíaca transitoria in vivo); Miao y otros, J Mol Cell Cardiol, 32:2397, 2000 (El aporte de gen Akt intracoronario mediado por adenovirus en el corazón reducía el tamaño de infartos voluminosos después de lesión por isquemia-reperfusión in vivo); y Fujio y otros, Circulation y otros, 101:660, 2000 (La señalización de Akt inhibe la apoptosis de miocitos cardíacos in vitro y protege contra la lesión por isquemia-reperfusión en el corazón del ratón).
La actividad de GSK-3 representa un papel en el trauma de cabeza. Véanse Noshita y otros, Neurobiol Dis, 9:294, 2002 (La regulación al alza de la ruta de Akt/PI3-quinasa puede ser crucial para la supervivencia celular después de una lesión cerebral traumática) y Dietrich y otros, J Neurotrauma, 13:309, 1996 (La administración postraumática de bFGF reducía significativamente neuronas corticales dañadas y el volumen de contusión total en un modelo de rata de lesión cerebral traumática).
También se sabe que la GSK-3 representa un papel en trastornos psiquiátricos. Véanse Eldar-Finkelman, Trends Mol Med, 8:126, 2002; Li y otros, Bipolar Disord, 4:137, 2002 (Los fármacos antipsicóticos estabilizantes del estado de ánimo LiCl y ácido valproico disminuyen las actividades de GSK-3 e incrementan la beta-catenina) y Lijam y otros, Cell, 90:895, 1997 (Ratones KO "dishevelled" mostraban comportamiento social anormal y conmutación sensoriomotriz defectuosa. Dishevelled, una proteína citoplásmica implicada en la ruta WNT, inhibe actividades de GSK3beta).
Se ha observado que la inhibición de GSK3 por litio y ácido valproico induce una remodelación axonal y un cambio en la conectividad sináptica. Véanse Kaytor y Orr, Curr Opin Neurobiol, 12:275, 2002 (La regulación a la baja de GSK3 provoca cambios en proteínas asociadas con microtúbulos: tau, MAP1 y 2) y Hall y otros, Mol Cell Neurosci, 20:257, 2002 (El litio y el ácido valproico inducen la formación de estructuras similares a conos crecientes a lo largo de los axones).
La actividad de GSK-3 también se ha asociado con la enfermedad de Alzheimer. Esta enfermedad se caracteriza por la presencia del bien conocido péptido \beta-amiloide y la formación de nudos neurofibrilares intracelulares. Los nudos neurofibrilares contienen proteína Tau hiperfosforilada, en la que Tau está fosforilada en sitios anormales. Se ha observado que GSK-3 fosforila estos sitios anormales en modelos celulares y animales. Por otra parte, se ha observado que la inhibición de GSK-3 previene la hiperfosforilación de Tau en células [Lovestone y otros, Curr. Biol. 4, 1077-86 (1994) y Brownlees y otros, Neuroreport 8, 3251-55 (1997); Kaytor y Orr, Curr. Opin. Neurobiol., 12, 275-8 (2000)]. En ratones transgénicos que sobreexpresan GSK3, se observaron hiperfosforilación de Tau incrementada significativa y morfología normal de neuronas [Lucas y otros, EMBO J, 20:27-39 (2001)]. La GSK3 activa se acumula en el citoplasma de neuronas preanudadas, lo que puede conducir a nudos neurofibrilares en cerebros de pacientes con AD [Pei y otros, J Neuropathol Exp Neurol, 58, 1010-19 (1999)]. Por lo tanto, la inhibición de GSK-3 frena o detiene la generación de nudos neurofibrilares y así trata o reduce la gravedad de la enfermedad de Alzheimer.
La evidencia del papel que la GSK-3 representa en la enfermedad de Alzheimer se ha mostrado in vitro. Véanse Aplin y otros (1996), J Neurochem 67:699; Sun y otros (2002), Neurosci Lett 321:61 (La GSK3b fosforila el dominio citoplásmico de proteína precursora de amiloide (APP) y la inhibición de GSK3b reduce la secreción de Ab40 y Ab42 en células transfectadas con APP); Takashima y otros (1998), PNAS 95:9637; Kirschenbaum y otros (2001), J Biol Chem 276:7366 (La GSK3b se compleja con y fosforila presenilina-1, que está asociada con actividad de gamma-secretasa en la síntesis de A\beta a partir de APP), Takashima y otros (1998), Neurosci Res 31:317 (La activación de GSK3b por AbB(25-35) potencia la fosforilación de tau en neuronas hipocampales. Esta observación proporciona una conexión entre A\beta y nudos neurofibrilares compuestos por tau hiperfosforilada, otro sello patológico de la AD); Takashima y otros (1993), PNAS 90:7789 (El bloqueo de la expresión o la actividad de GSK3b evita la neurodegeneración inducida por Ab de cultivos primarios corticales e hipocampales); Suhara y otros (2003), Neurobiol Aging. 24:437 (Ab42 intracelular es tóxica para células endoteliales interfiriendo con la activación del mecanismo dependiente de la señalización de Akt/GSK-3b); De Ferrari y otros (2003) Mol Psychiatry 8:195 (El litio protege células N2A y neuronas hipocampales primarias de citotoxicidad inducida por fibrillas de A\beta y reducía la translocación nuclear/desestabilización de b-catenina); y Pigino y otros, J Neurosci, 23:4499, 2003 (Las mutaciones en presenilina 1 del Alzheimer pueden desregular e incrementar la actividad de GSK-3, lo que a su vez deteriora el transporte axonal en las neuronas. Las reduccio-
nes consiguientes en el transporte axonal en neuronas afectadas pueden conducir finalmente a neurodegeneración).
La evidencia del papel que la GSK-3 representa en la enfermedad de Alzheimer se ha mostrado in vivo. Véanse Yamaguchi y otros (1996), Acta Neuropathol 92:232; Pei y otros (1999), J Neuropath Exp Neurol 58:1010 (La inmunorreactividad de GSK3b se eleva en regiones susceptibles de cerebros con AD); Hernández y otros (2002), J Neurochem 83:1529 (Ratones transgénicos con sobreexpresión de GSK3b condicional exhiben déficits cognitivos similares a los de modelos de AD de ratón APP transgénico); De Ferrari y otros (2003) Mol Psychiatry 8:195 (El tratamiento crónico con litio libraba de la neurodegeneración y deterioros de comportamiento (laberinto de agua de Morris) provocados por inyección intrahipocampal de fibrillas de A\beta); McLaurin y otros, Nature Med, 8:1263, 2002 (La inmunización con A\beta en un modelo transgénico de AD reduce tanto la neuropatología similar a AD como los deterioros de la memoria espacial); y Phiel y otros (2003) Nature 423:435 (La GSK3 regula la producción de péptido amieloide-beta a través de inhibición directa de gamma-secretasa en ratones tg con AD).
La presenilina-1 y la quinesina-1 también son substratos para GSK-3 y se relacionan con otro mecanismo para el papel que la GSK-3 representa en la enfermedad de Alzheimer, según fue descrito recientemente por Pigino, G. y otros, Journal of Neuroscience (23:4499, 2003). Se encontró que la GSK3beta fosforila la cadena ligera de quinesina-I, lo que da como resultado una liberación de quinesina-I de orgánulos unidos a la membrana, conduciendo a una reducción en el transporte axonal anterógrado rápido (Morfini y otros, 2002). Los autores sugieren que las mutaciones en PS1 pueden desregular e incrementar la actividad de GSK-3 que, a su vez, deteriora el transporte axonal en neuronas. Las reducciones consiguientes en el transporte axonal en neuronas afectadas conducen finalmente a neurodegeneración.
La GSK-3 también está asociada con la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). Véanse Williamson y Cleveland, 1999 (El transporte axonal se retarda en una fase muy temprana de ALS en ratones mSOD1); Morfini y otros, 2002 (La GSK3 fosforila cadenas ligeras de quinesina e inhibe el transporte axonal anterógrado); Warita y otros, Apoptosis, 6:345, 2001 (La mayoría de las neuronas motrices espinales perdía las inmunorreactividades tanto para PI3-K como para Akt en la fase temprana y presintomática que precedía a la pérdida significativa de las neuronas en este modelo animal SOD1 tg de ALS); y Sánchez y otros, 2001 (La inhibición de PI-3K induce la retracción de neuritas mediada por activación de GSK3).
La actividad de GSK-3 también está conectada con lesiones en la médula espinal y los nervios periféricos. Se ha observado que la inhibición de GSK3 por litio y ácido valproico puede inducir la remodelación axonal y cambiar la conectividad sináptica. Véanse Kaytor y Orr, Curr Opin Neurobiol, 12:275, 2002 (La regulación a la baja de GSK3 provoca cambios en proteínas asociadas con microtúbulos: tau, MAP1 y 2) y Hall y otros, Mol Cell Neurosci, 20:257, 2002 (El litio y el ácido valproico inducen la formación de estructuras similares a conos crecientes a lo largo de los axones). Véanse además Grothe y otros, Brain Res, 885:172, 2000 (FGF-2 estimula la proliferación de células de Schwann e inhibe la mielinización durante el crecimiento axonal); Grothe y Nikkhah, 2001 (FGF-2 es regulado al alza en los muñones nerviosos proximales y distales en 5 horas después del aplastamiento del nervio); y Sánchez y otros, 2001 (La inhibición de PI-3K induce la retracción de neuritas mediada por activación de GSK3).
Otro substrato de GSK-3 es la \beta-catenina, que se degrada después de la fosforilación por GSK-3. Se han presentado niveles reducidos de \beta-catenina en pacientes esquizofrénicos y también se han asociado con otras enfermedades relacionadas con el incremento en la muerte celular neuronal [Zhong y otros, Nature, 395, 698-702 (1998); Takashima y otros, PNAS, 90, 7789-93 (1993); Pei y otros, J. Neuropathol. Exp, 56, 70-78 (1997) y Smith y otros, Bio-org. Med. Chem. 11, 635-639 (2001)]. Por otra parte, la \beta-catenina y Tcf-4 representan un doble papel en la remodelación vascular inhibiendo la apoptosis de células del músculo liso vascular y promoviendo la proliferación (Wang y otros, Circ Res, 90:340, 2002). De acuerdo con esto, la GSK-3 está asociada con trastornos angiogénicos. Véanse además Liu y otros, FASEB J, 16:950, 2002 (La activación de GSK3 reduce el factor de crecimiento de hepatocitos, conduciendo a una función de la barrera celular endotelial alterada y una integridad vascular disminuida) y Kim y otros, J Biol Chem, 277:41888, 2002 (La activación de GSK3beta inhibe la angiogénesis in vivo usando el ensayo del bloque de Matrigel: la inhibición de la señalización de GSK3beta potencia la formación de capilares).
Se ha mostrado la asociación entre GSK-3 y la enfermedad de Huntington (véase Carmichael y otros, J Biol Chem., 277:33791, 2002 (La inhibición de GSK3beta protege a las células de muerte celular neuronal y no neuronal inducida por poliglutamina a través de incrementos en b-catenina y su ruta transcripcional asociada). La sobreexpresión de GSK3 reducía la activación de factor de transcripción de choque térmico 1 y proteína de choque térmico HSP70 (Bijur y otros, J Biol Chem, 275:7583, 2000) que se muestra que disminuyen tanto agregados de poli-(Q) como la muerte celular en un modelo de HD in vitro (Wyttenbach y otros, Hum Mol Genet, 11:1137,2002).
La GSK-3 afecta a los niveles FGF-2 y sus receptores se incrementan durante la remielinización de cultivos de agregado cerebral que remielinizan cerebros de rata. Véase Copelman y otros, 2000, Messersmith y otros, 2000 y Hinks y Franklin, 2000. También se encontró que FGF-2 induce la extensión del proceso mediante oligodendrocitos que implican una relación de FGF en la remielinización (Oh y Yong, 1996; Gogate y otros, 1994) y que se ha mostrado que la terapia con el de gen FGF-2 mejora la recuperación de ratones con encefalomielitis alérgica experimental (EAE) (Ruffini y otros, 2001).
La GSK-3 también se ha asociado con el crecimiento del cabello debido a que se muestra que la señalización de Wnt/beta-catenina representa un papel principal en la morfogénesis y la diferenciación de los folículos pilosos (Kishimotot y otros, Genes Dev, 14:1181, 2000; Millar, J Invest Dermatol, 118:216, 2002). Se ha encontrado que los ratones con sobreexpresión constitutiva de los inhibidores de la señalización de Wnt en la piel no desarrollaban folículos pilosos. Se requerían señales de Wnt para el desarrollo inicial de folículos pilosos y la GSK3 regula constitutivamente rutas de Wnt inhibiendo beta-catenina (Andl y otros, Dev Cell 2:643, 2002). Una señal de Wnt transitoria proporciona el estímulo inicial crucial para el inicio de un nuevo ciclo de crecimiento capilar, activando la transcripción génica regulada por beta-catenina y TCF en precursores de folículos pilosos epiteliales (Van Mater y otros, Genes Dev, 17:1219, 2003).
Debido a que la actividad de GSK-3 está asociada con la movilidad del esperma, la inhibición de GSK-3 es útil como un anticonceptivo masculino. Se observó que una disminución en la actividad de GSK3 del esperma está asociada con desarrollo de la movilidad del esperma en la epididimis bovina y de mono (Vijayaraghavan y otros, Biol Reprod, 54: 709, 1996; Smith y otros, J Androl, 20:47, 1999). Por otra parte, la fosforilación en tirosina y serina/treonina de GSK3 es alta en esperma móvil comparado con inmóvil en toros (Vijayaraghavan y otros, Biol Reprod, 62:1647, 2000). Este efecto también se demostró con esperma humano (Luconi y otros, Human Reprod, 16:1931, 2001).
WO 02/22601 se refiere a compuestos de pirazol que son útiles como inhibidores de proteína quinasas, especialmente inhibidores de proteína quinasas GSK-3 y Aurora-2.
Considerando la falta de opciones de tratamiento actualmente disponibles para la mayoría de las condiciones asociadas con la proteína quinasa GSK-3, todavía existe mucha necesidad de nuevos agentes terapéuticos que inhiban esta diana proteínica.
Sumario de la invención
La presente invención se dirige a esta necesidad proporcionando compuestos de fórmula I:
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o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde W, R^{1} y R^{y} son como se describen posteriormente.
Los compuestos de esta invención son capaces de inhibir la actividad de GSK-3. De acuerdo con la invención, estos compuestos también se utilizan en composiciones y métodos para inhibir la actividad de GSK-3 y métodos para tratar o disminuir la gravedad de enfermedades o condiciones asociadas con GSK-3 en pacientes.
Las enfermedades o condiciones susceptibles de los métodos de esta invención incluyen, por ejemplo, trastornos neurológicos y neurodegenerativas, diabetes, trastornos psiquiátricos, esclerosis múltiple (MS), infarto de miocardio, reperfusión/isquemia, calvicie y apoplejía.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa efectos de tratamiento con un compuesto de fórmula I en comparación con vehículo de control, administrado 6 horas después del modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO), como una disminución en el volumen de infarto total, el volumen de infarto cortical, el daño isquémico en el cuerpo estriado y la formación de edema.
La Figura 2 representa la función neurológica de ratas, a lo largo del transcurso del tiempo del experimento, tratadas con un compuesto de fórmula I en comparación con el grupo del vehículo de control.
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Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un compuesto de fórmula I:
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
W es nitrógeno;
R^{1} se selecciona de hidrógeno o flúor; y
R^{y} es un grupo alifático C_{1-4}, en donde dicho grupo alifático es una cadena hidrocarbonada C_{1}-C_{4} de cadena lineal o ramificada que está completamente saturada o que contiene una o más unidades de insaturación, o un hidrocarburo C_{3}-C_{4} monocíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático, que tiene un solo punto de ligazón al resto de la molécula.
El término "alifático" o "grupo alifático", según se usa aquí, significa una cadena hidrocarbonada C_{1}-C_{4} de cadena lineal o ramificada que está completamente saturada o que contiene una o más unidades de insaturación, o un hidrocarburo C_{3}-C_{4} monocíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático (también denominado aquí "carbociclo" o "cicloalquilo"), que tiene un solo punto de ligazón al resto de la molécula. Por ejemplo, grupos alifáticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, grupos alquilo, alquenilo o alquinilo lineales o ramificados e híbridos de los mismos tales como (cicloalquil)alquilo, (cicloalquenil)alquilo o (cicloalquil)alquenilo.
Los términos "alquilo", "alquenilo" y "alquinilo", usados solos o como parte de un resto mayor, incluirán cadenas tanto lineales como ramificadas que contienen de uno a cuatro átomos de carbono y al menos dos átomos de carbono y un doble enlace en el caso del alquenilo y al menos dos átomos de carbono y un triple enlace en el caso del alquinilo.
Los compuestos utilizados en esta invención se limitan a los que son químicamente factibles y estables. Por lo tanto, una combinación de substituyentes o variables en los compuestos descritos anteriormente solo es permisible si tal combinación da como resultado un compuesto estable o químicamente factible. Un compuesto estable o un compuesto químicamente factible es uno en el que la estructura química no se altera substancialmente cuando se mantiene a una temperatura de 40ºC o menos, en ausencia de humedad u otras condiciones químicamente reactivas, durante al menos una semana.
Será evidente para un experto en la técnica que ciertos compuestos de esta invención pueden existir en formas tautómeras, estando todas estas formas tautómeras dentro del alcance de la invención.
A no ser que se indique otra cosa, se entiende también que las estructuras representadas aquí incluyen todas las formas estereoquímicas de la estructura; es decir, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico. Por lo tanto, isómeros estereoquímicos simples así como mezclas enantiómeras y diastereoisómeras de los presentes compuestos están dentro del alcance de la invención. A no ser que se indique otra cosa, se entiende también que las estructuras representadas aquí incluyen compuestos que difieren solo en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras excepto por la substitución de un hidrógeno por un deuterio o un tritio, o la substitución de un carbono por un carbono enriquecido en ^{13}C o ^{14}C, están dentro del alcance de esta invención.
Los compuestos de la presente invención están dentro del género de compuestos descritos en la publicación PCT WO 02/22607. Sin embargo, los solicitantes han descubierto que los presentes compuestos tienen una potencia sorprendente e inesperadamente incrementada en la protección de células neuronales contra una lesión isquémica y en el tratamiento de la apoplejía.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en la que R^{y} es un grupo alifático C_{1-4} no substituido. Grupos alifáticos preferidos de compuestos de fórmula I son grupos alquilo. Tales grupos alquilo son preferiblemente metilo, etilo, ciclopropilo, terc-butilo o isopropilo. Grupos alquilo más preferidos de fórmula I son metilo, ciclopropilo y terc-butilo.
De acuerdo con una modalidad, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en la que W es nitrógeno.
De acuerdo con otra modalidad más, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en la que R^{1} es hidrógeno.
De acuerdo con otra modalidad, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I en la que R^{1} es flúor.
Se entiende que todas las combinaciones y subcombinaciones de modalidades, según se describen aquí, están dentro del alcance de la presente invención.
Ejemplos representativos de compuestos de fórmula I se indican en la Tabla 1 posteriormente.
TABLA 1 Compuestos de Fórmula I
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Los compuestos de esta invención pueden prepararse según se ilustra mediante los Esquemas I-II siguientes y mediante métodos generales conocidos por los expertos en la técnica.
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Esquema I
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Reactivos y condiciones: (a) cloruro de oxalilo, dicloroetano, 70ºC; (b) dimetilamina, pentano, TiCl_{4}; (c) NH_{4}OAc, HOAc, THF, reflujo; (d) POCl_{3}, n-Pr_{3}N, reflujo; (e) 160ºC, puro.
El Esquema I anterior muestra un método general para preparar compuestos de la presente invención. En la etapa (a), la arilamida 1 se trata con cloruro de oxalilo para formar el isocianato de acilo 2. Según se muestra en la etapa (c), un isocianato de acilo 2 puede condensarse con una enamina 3 para proporcionar una pirimidinona 4 (J. Org. Chem (1993), 58, 414-418; J. Med. Chem., (1992), 35, 1515-1520; J. Org. Chem., 91967, 32, 313-214). El producto intermedio 4 se trata con POCl_{3} para formar el compuesto clorado 5 que a continuación se combina con el derivado de aminoindazol 6 para proporcionar un compuesto de fórmula I. Métodos para preparar los derivados de aminoindazol 6 se conocen en la técnica. Específicamente, la síntesis de estos derivados se indica en WO 02/22607.
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Esquema II
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Reactivos y condiciones: (a) i LiN(TMS)_{2}, éter, THF, ii HCl; (b) NaOEt, EtOH, reflujo.
El Esquema II anterior muestra un método alternativo para preparar el producto intermedio de pirimidinona 5, que puede utilizarse en la preparación de compuestos de fórmula I según se representa en el Esquema I en la etapa (e) anteriormente. En la etapa (a), el arilnitrilo 7 se convierte en el producto intermedio de benzamidina 8 que se trata a continuación con el beta-cetoéster 9 para formar el compuesto de pirimidinona 5 que puede utilizarse como se describe anteriormente.
Un experto normal en la técnica puede sintetizar otros compuestos de esta invención siguiendo las enseñanzas de la memoria descriptiva usando reactivos que se sintetizan fácilmente o están disponibles comercialmente.
La actividad de un compuesto utilizado en esta invención como un inhibidor de GSK-3 puede ensayarse in vitro, in vivo o en una línea celular. Ensayos in vitro incluyen ensayos que determinan la inhibición de la actividad de fosforilación o la actividad de ATPasa de GSK3 activada. Ensayos in vitro alternativos cuantifican la capacidad del inhibidor para unirse a GSK-3. La unión del inhibidor puede medirse radioetiquetando el inhibidor antes de la unión, aislando el complejo inhibidor/GSK-3 y determinando la cantidad de radioetiqueta unida. Alternativamente, la unión del inhibidor puede determinarse efectuando un experimento de competición en el que nuevos inhibidores se incuban con GSK-3 unida a radioligandos conocidos.
De acuerdo con otra modalidad, la invención proporciona una composición que comprende un compuesto de esta invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. La cantidad de compuesto en las composiciones de esta invención es tal que es eficaz para inhibir detectablemente una proteína quinasa, particularmente GSK-3, en una muestra biológica o en un paciente. Preferiblemente, la composición de esta invención se formula para la administración a un paciente que necesite tal composición. Lo más preferiblemente, la composición de esta invención se formula para administración oral a un paciente.
El término "paciente", según se usa aquí, significa un animal, preferiblemente un mamífero, y lo más preferiblemente un ser humano.
El término "portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador, adyuvante o vehículo atóxico que no destruye la actividad farmacólogica del compuesto con el que se formula. Portadores, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones de esta invención incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina de suero humano, substancias tamponadoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato magnésico, polivinilpirrolidona, substancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, copolímeros de bloques de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.
El término "inhibir detectablemente", según se usa aquí, significa un cambio medible en la actividad de GSK-3 entre una muestra que comprende dicha composición y la quinasa GSK-3 y una muestra equivalente que comprende la quinasa GSK-3 en ausencia de dicha composición.
Una "sal farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sal, éster, sal de un éster u otro derivado atóxico de un compuesto de esta invención que, al administrarlo a un receptor, sea capaz de proporcionar, directamente o indirectamente, un compuesto de esta invención o un metabolito o residuo del mismo inhibidoramente activo.
Según se usa aquí, el término "metabolito o residuo del mismo inhibidoramente activo" significa que un metabolito o un compuesto de la presente invención, o un residuo del mismo, también es un inhibidor de la quinasa GSK-3.
Sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen las derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de sales ácidas adecuadas incluyen acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Otros ácidos, tales como el oxálico, aunque no son por sí mismos farmacéuticamente aceptables, pueden emplearse en la preparación de sales útiles como productos intermedios para obtener los compuestos de la invención y sus sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables.
Sales derivadas de bases adecuadas incluyen sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio y potasio), metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), amonio y N^{+}(alquilo C_{1-4})_{4}. Esta invención también prevé la cuaternización de cualesquiera grupos que contienen nitrógenos básicos de los compuestos descritos aquí. Pueden obtenerse mediante tal cuaternización productos solubles o dispersables en agua o aceite.
Las composiciones de la presente invención pueden administrarse oralmente, parenteralmente, mediante un aerosol de inhalación, tópicamente, rectalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente o a través de un depósito implantando. El término "parenteral", según se usa aquí, incluye técnicas de inyección o infusión subcutáneas, intravenosas, intramusculares, intraarticulares, intrasinoviales, intraesternales, intratecales, intrahepáticas, intralesionales e intracraneales. Preferiblemente, las composiciones se administran oralmente, intraperitonealmente o intravenosamente. Formas inyectables estériles de las composiciones de esta invención pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la especialidad usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente atóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro sódico. Además, se emplean convencionalmente aceites fijos estériles como un medio disolvente o de suspensión.
Para este propósito, puede emplearse cualquier aceite fijo blando, incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados de glicérido, son útiles en la preparación de productos inyectables, como lo son los aceites farmacéuticamente aceptables naturales, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa, o agentes dispersantes similares que se usan comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptable incluyendo emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos comúnmente usados, tales como Tween, Spans y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan comúnmente en la fabricación de formas de dosificación sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables, también pueden usarse con propósitos de formulación.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención pueden administrarse oralmente en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable incluyendo, pero no limitada a, cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de tabletas para uso oral, portadores comúnmente usados incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden típicamente agentes lubricantes, tales como estearato magnésico. Para la administración oral en forma de cápsula, diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz deshidratado. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también pueden añadirse ciertos agentes edulcorantes, saboreantes o colorantes.
Alternativamente, las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención pueden administrarse en forma de supositorios para administración rectal. Estos pueden prepararse mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen mantequilla de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención también pueden administrarse tópicamente, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles mediante aplicación tópica, incluyendo enfermedades del ojo, la piel o el tracto intestinal inferior. Formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos.
La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior puede efectuarse en una formulación de supositorio rectal (véase anteriormente) o en una formulación de enema adecuada. También pueden usarse parches tópicamente transdérmicos.
Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una pomada adecuada que contiene el componente activo suspendido o disuelto en uno o más portadores. Portadores para la administración tópica de los compuestos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, un compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una loción o crema adecuada que contiene los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Portadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, ésteres cetílicos, cera, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
Para uso oftálmico, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse como suspensiones micronizadas en solución salina estéril isotónica de pH ajustado o, preferiblemente, como soluciones en solución salina estéril isotónica de pH ajustado, con o sin un conservante tal como cloruro de benzalconio. Alternativamente, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una pomada tal como vaselina.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención también pueden administrarse mediante aerosol nasal o inhalación. Tales composiciones se preparan de acuerdo con técnicas bien conocidas en la especialidad de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.
Lo más preferiblemente, las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención se formulan para administración oral.
La cantidad de los compuestos de la presente invención que puede combinarse con los materiales portadores para producir una composición en una forma de dosificación simple variará dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración. Preferiblemente, las composiciones deben formularse a fin de que una dosificación de entre 0,01-100 mg/kg de peso corporal/día del inhibidor pueda administrarse a un paciente que reciba estas composiciones.
También debe entenderse que una dosificación y un régimen de tratamiento específicos para cualquier paciente particular dependerán de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos y el juicio del médico tratante y la gravedad de la enfermedad particular que se trata. La cantidad de un compuesto de la presente invención en la composición también dependerá del compuesto particular de la composición.
Dependiendo de la condición o la enfermedad particular que ha de tratarse o prevenirse, agentes terapéuticos adicionales, que normalmente se administran para tratar o prevenir esa condición, también pueden estar presentes en las composiciones de esta invención.
Por ejemplo, factores neurotróficos u otros agentes para tratar trastornos neurológicos o neurodegenerativos pueden combinarse con los compuestos de esta invención para tratar trastornos neurológicos y neurodegenerativos. Ejemplos de factores neurotróficos conocidos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de acetilcolinesterasa, inhibidores de MAO, interferones, anticonvulsivos, bloqueadores de canales iónicos, riluzol y agentes antiparkinsonianos.
Ejemplos de tratamientos conocidos para la apoplejía incluyen Activase®, un activador del plasminógeno tisular recombinante o genéticamente manipulado (rt-PA), heparina, antagonistas de glutamato, antagonistas del calcio, antagonistas de opiáceos, antagonistas de GABA y antioxidantes.
Otros ejemplos de agentes con los que también pueden combinarse los compuestos de esta invención incluyen, sin limitación, agentes antidepresivos, tales como Zoloft®, Prozac®, Paxil® y Buspar®; agentes antiinflamatorios tales como corticosteriodes, bloqueadores de TNF, IL-1 RA, azatioprina, ciclofosfamida y sulfasalazina; agentes inmunomoduladores e inmosupresores tales como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina, micofenolato de mofetilo, interferones, cortiscosteroides, ciclofosfamida, azatioprina y sulfasalazina; factores neurotróficos tales como inhibidores de acetilcolinesterasa, inhibidores de MAO, interferones, anticonvulsivos, bloqueadores de canales iónicos, riluzol y agentes antiparkinsonianos; agentes para tratar una enfermedad cardiovascular tales como beta-bloqueadores, inhibidores de ACE, diuréticos, nitratos, bloqueadores de los canales del calcio y estatinas; agentes para tratar la diabetes tales como insulina, análogos de insulina, inhibidores de alfa-glucosidasa, biguanidas y sensibilizadores frente a la insulina; y agentes para tratar trastornos de inmunodeficiencia tales como gammaglobulina.
La cantidad de agente terapéutico adicional presente en las composiciones de esta invención no será mayor que la cantidad que normalmente se administraría en una composición que comprendiera el agente terapéutico como el único agente activo. Preferiblemente, la cantidad de agente terapéutico adicional en las composiciones actualmente descritas variará de aproximadamente 50% a 100% de la cantidad normalmente presente en una composición que comprende ese agente como el único agente terapéuticamente activo.
De acuerdo con otra modalidad, la presente invención se refiere a administrar a un paciente un agente terapéutico adicional seleccionado de un tratamiento para la enfermedad de Alzheimer (AD), un tratamiento para la enfermedad de Parkinson, un agente para tratar la esclerosis múltiple (MS), un tratamiento para el asma, un agente antiinflamatorio, un agente inmunomodulador o inmunosupresor, un factor neurotrófico, un agente para tratar la apoplejía, un agente para tratar una enfermedad cardiovascular, un antidepresivo, un agente antipsicótico, un agente para tratar la diabetes, en donde:
dicho agente terapéutico adicional es apropiado para la enfermedad que se trata; y
dicho agente terapéutico adicional se administra junto con dicha composición como una forma de dosificación simple o separadamente de dicha composición como parte de una forma de dosificación múltiple.
De acuerdo con otra modalidad, la invención se refiere a un método para inhibir la actividad de quinasa GSK-3 en una muestra biológica, que comprende la etapa de poner en contacto dicha muestra biológica con un compuesto de esta invención o una composición que comprende dicho compuesto.
El término "muestra biológica", según se usa aquí, incluye, sin limitación, cultivos celulares o extractos de los mismos; material de biopsia obtenido de un mamífero o extractos del mismo; y sangre, saliva, orina, heces, semen, lágrimas u otros fluidos corporales o extractos de los mismos.
La inhibición de la actividad de quinasa GSK-3 en una muestra biológica es útil para una variedad de propósitos que son conocidos por el experto en la especialidad. Ejemplos de tales propósitos incluyen, pero no se limitan a, trasfusión de sangre, trasplante de órganos, almacenamiento de especímenes biológicos y ensayos biológicos.
De acuerdo con otra modalidad, la invención se refiere a un método para inhibir la actividad de quinasa GSK-3 en un paciente, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente un compuesto de esta invención o una composición que comprende dicho compuesto.
De acuerdo con otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad o condición mediada por GSK-3 en un paciente, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente una composición de acuerdo con la presente invención.
El término "enfermedad mediada por GSK-3", según se usa aquí, significa cualquier enfermedad u otra condición o enfermedad perjudicial en la que se sabe que la GSK-3 representa un papel. Tales enfermedades o condiciones incluyen, sin limitación, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, un trastorno metabólico, un trastorno psiquiátrico, diabetes, un trastorno angiogénico, tauopotía, un trastorno neurológico o neurodegenerativo, una lesión de la médula espinal, glaucoma, calvicie o una enfermedad cardiovascular.
De acuerdo con otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad, un trastorno o una condición seleccionados de una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, un trastorno metabólico, un trastorno psiquiátrico, diabetes, un trastorno angiogénico, tauopotía, un trastorno neurológico o neurodegenerativo, una lesión de la médula espinal, glaucoma, calvicie o una enfermedad cardiovascular, en un paciente que lo necesite, que comprende administrar a dicho paciente un compuesto de la presente invención o una composición del mismo.
De acuerdo con otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad o condición seleccionada de alergia, asma, diabetes, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, demencia asociada con el SIDA, esclerosis lateral amiotrófica (ALS, enfermedad de Lou Gehrig), esclerosis múltiple (MS), una lesión debida a un trauma de cabeza, esquizofrenia, ansiedad, trastorno bipolar, tauopotía, una lesión en la médula espinal o los nervios periféricos, infarto de miocardio, hipertrofia de cardiomiocitos, glaucoma, trastorno de déficit de atención (ADD), depresión, un trastorno del sueño, reperfusión/isquemia, apoplejía, un trastorno angiogénico o calvicie, en donde dicho método comprende administrar a un paciente que lo necesite un compuesto de la presente invención o una composición del mismo.
De acuerdo con una modalidad preferida, el método de la presente invención se refiere a tratar o disminuir la gravedad de la apoplejía.
De acuerdo con otra modalidad preferida, el método de la presente invención se refiere a tratar o disminuir la gravedad de un trastorno neurodegenerativo o neurológico.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para disminuir la movilidad del esperma en un paciente varón, que comprende administrar a dicho paciente un compuesto de la presente invención o una composición del mismo.
En una modalidad alternativa, los métodos de esta invención que utilizan composiciones que no contienen un agente terapéutico adicional comprenden la etapa adicional de administrar separadamente a dicho paciente un agente terapéutico adicional. Cuando estos agentes terapéuticos adicionales se administran separadamente, pueden administrarse al paciente antes de, secuencialmente con o después de la administración de las composiciones de esta invención.
Para que la invención descrita aquí pueda entenderse más a fondo, se indican los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos tienen solamente propósitos ilustrativos y no debe considerarse que limiten esta invención de ningún modo.
Ejemplos
Según se usa aquí, el método de HPLC denominado "Método A" es como sigue:
Columna: C18, 3 \mum, 2,1 x 50 mm, "Lighting" de Jones Chromatography.
Gradiente: agua al 100% (que contiene acetonitrilo al 1%, TFA al 0,1%) hasta acetonitrilo al 100% (que contiene TFA al 0,1%) durante 4,0 minutos, manténgase a 100% de acetonitrilo durante 1-4 minutos y vuélvase a las condiciones iniciales.
Tiempo total del experimento 7,0 minutos.
Caudal: 0,8 ml/minuto.
Según se usa aquí, el término "R_{f}" se refiere al tiempo de retención, en minutos, obtenido para el compuesto usando el método de HPLC indicado. Los números de compuestos citados en los Ejemplos posteriormente corresponden a los números de compuestos citados en la Tabla 1, anteriormente. Los tres compuestos nombrados posteriormente bajo los Ejemplos 3, 9 y 15 no son ejemplos de esta invención.
Ejemplo 1 6-Metil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona
Una mezcla de 2-trifluorometilbenzamidina (2,13 g, 4 mmol) y etóxido sódico (0,38 g, 12 mmol) en etanol (20 ml) se trató con acetoacetato de metilo (0,44 ml, 4 mmol) y se calentó durante 24 horas. La reacción se enfrió, se concentró, se diluyó con agua y se acidificó con ácido clorhídrico 2N. La solución resultante se extrajo con acetato de etilo, se secó sobre sulfato sódico y se concentró. La purificación mediante cromatografía de desarrollo rápido [SiO_{2}, metanol:diclorometano (3:97)] proporcionaba el compuesto del título (0,51 g, 50% de rendimiento) como un sólido amarillo. ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 12,7 (s ancho, 1H), 7,9 (m, 1H), 7,8 (m, 2H), 7,7 (m, 1H), 6,3 (s, 1H), 2,21 (s, 3H) ppm; MS (FIA) 255,0 (M+H); R_{t} (Método A) 2,578 minutos.
Ejemplo 2 4-Cloro-6-metil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidina
Una solución de 6-metil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona (10,7 g, 41,9 mmol) en oxicloruro de fósforo (39 ml, 419 mmol) se trató con tri-n-propilamina (16 ml, 83,9 mmol) y se sometió a reflujo a 110-120ºC durante 1 hora. El disolvente se evaporó, se azeotropizó tres veces con tolueno y a continuación se secó a vacío. El residuo se recogió en acetato de etilo, se lavó secuencialmente con hidróxido sódico 1N, agua y salmuera, a continuación se secó sobre sulfato sódico y se concentró. La purificación mediante cromatografía de desarrollo rápido [SiO_{2}, acetato de etilo:hexanos (1:9)] proporcionaba el compuesto del título (9,61 g, 84% de rendimiento) como un aceite naranja. ^{1}H NMR (CDCl_{3}, DMSO-d_{6}) \delta 2,63 (3H, s), 7,26 (s, 1H), 7,61 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,67 (t, J=7,5Hz, 1H), 7,76 (d, J=7,6Hz, 1H), 7,82 (d, J=7,8Hz, 1H) ppm; MS (FIA) 273,0 (M+H); R_{t} (Método A) 3,499 min.
Ejemplo 3 (5-Fluoro-1H-indazol-3-il)-[6-metil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidin-4-il]amina
Una mezcla de 4-cloro-6-metil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidina (0,10 g, 0,37 mmol) y 5-fluoro-1H-indazol-3-ilamina (0,072 g, 0,48 mmol) se calentó a 160-170ºC durante 8 horas. El residuo resultante se enfrió hasta temperatura ambiente y a continuación se disolvió en N-metilpirrolidinona (2 ml). Esta mezcla se vertió en agua (20 ml) y se añadió dicarbonato sódico (5 ml) y la mezcla resultante se filtró, lavando con agua. La purificación mediante HPLC preparativa proporcionaba el compuesto del título (0,081 g, 43% de rendimiento) como un sólido de color canela. ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 12,8 (s ancho, 1H), 10,6 (s ancho, 1H), 7,86 (d, J=8,0Hz, 1H), 7,77 (m, 4H), 7,62 (s ancho, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,29 (m, 1H), 2,44 (s, 3H) ppm; LC-MS 388,05 (M+H); R_{t} (Método A) 2,900 minutos.
Ejemplo 4 6-terc-Butil-1-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona
Una mezcla de 2-trifluoremetilbenzamidina (1,12 g, 5 mmol), etóxido sódico (1,02 g, 15 mmol) y éster metílico de ácido 4,4-dimetil-3-oxopentanoico (0,80 ml, 5 mmol) en etanol (50 mL) se calentó a reflujo durante 16 horas. La reacción se enfrió, se concentró, se diluyó con agua y se acidificó con ácido clorhídrico 2N. Esta solución se extrajo con acetato de etilo, se secó sobre sulfato sódico y se concentró. La purificación mediante cromatografía de desarrollo rápido [SiO_{2}, metanol:diclorometano (2:98)] proporcionaba el compuesto del título (0,48 g, 32% de rendimiento) como un sólido amarillo; ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 12,8 (s ancho, 1H), 7,89 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,78 (m, 2H), 7,71 (d, J=7,4Hz, 1H), 6,24 (s, 1H), 1,20 (s, 9H) ppm; LC-MS 297,03 (M+H); R_{t} (Método A) 3,30 minutos.
Ejemplo 5 6-terc-Butil-6-cloro-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidina
Una solución de 6-terc-butil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona (0,47 g, 1,59 mmol) en oxicloruro de fósforo (1,65 ml, 15,9 mmol) se trató con tri-n-propilamina (0,61 ml, 3,17 mmol) y se calentó a 110-120ºC durante 1 hora. El disolvente se retiró mediante evaporación y a continuación se azeotropizó tres veces con tolueno. El residuo se recogió en acetato de etilo, se lavó secuencialmente con hidróxido sódico 1N, agua y salmuera, a continuación se secó sobre sulfato sódico y se concentró. La purificación mediante cromatografía de desarrollo rápido [SiO_{2}, acetato de etilo:hexanos (1:9)] proporcionaba el compuesto del título (0,33 g, 66% de rendimiento) como un aceite amarillo. ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 1,31 (9H, s), 7,25 (s, 1H), 7,51 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,58 (t, J=7,5Hz, 1H), 7,74 (t, J=8,5Hz, 2H) ppm; MS (FIA) 314,9 (M+H); R_{t} (Método A) 4,156 minutos.
Ejemplo 6 [6-terc-Butil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina (I-3)
Una mezcla de 4-cloro-6-terc-butil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidina (0,10 g, 0,32 mmol) y 1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-ilamina (0,064 g, 0,48 mmol) se calentó a 160-170ºC durante 16 horas. La mezcla resultante se enfrió, se disolvió en N-metilpirrolidinona (2 ml), a continuación se vertió en agua (20 ml) y bicarbonato sódico (5 ml) y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron cuatro veces con agua, una vez con salmuera, a continuación se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron. El producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar el compuesto del título (0,007 g, 4% de rendimiento) como un sólido amarillo. ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s ancho, 1H), 10,6 (s ancho, 1H), 8,49 (m, 2H), 7,84 (d, J=7,8Hz, 2H), 7,76 (m, 2H), 7,68 (m, 1H), 7,12 (m, 1H), 1,32 (s, 9H) ppm; LC-MS 413,08 (M+H); R_{t} (Método A) 3,112 minutos.
Ejemplo 7 6-Ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona \bullet (1-Ciclopropilvinil)-dimetilamina
A una solución de ciclopropilmetilcetona (19,8 ml, 200 mmol) en pentano (600 ml) a 0ºC bajo nitrógeno se añadió dimetilamina/tetrahidrofurano (2M, 500 ml, 1000 mmol) y a continuación se añadió gota a gota una solución de cloruro de titanio(IV) (12,1 ml, 110 mmol) en pentano (60 ml). La reacción se agitó 0,5 horas a 0ºC y a continuación durante 5 horas a temperatura ambiente. La reacción se filtró a través de Celite, lavando con pentano y éter, se concentró a vacío con una temperatura del baño de 15-20ºC y a continuación se almacenó durante la noche como un aceite naranja a -4ºC.
\bullet Isocianato de 2-trifluorometilbenzoílo
Una solución de 2-trifluorometilbenzamida (34,9 g, 185 mmol) en 1,2-dicloroetano (600 ml), a temperatura ambiente bajo nitrógeno, se trató con cloruro de oxalilo (20,2 ml, 230 mmol) en gotas rápidas y la reacción se agitó a 70-80ºC durante la noche. El disolvente se retiró mediante evaporación y el residuo se azeotropizó dos veces con tolueno.
\bullet 6-Ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona
A una solución de (1-ciclopropilvinil)dimetilamina en tetrahidrofurano (400 ml) a 0ºC bajo nitrógeno se añadió una solución de isocianato de 2-trifluorometilbenzoílo en tetrahidrofurano (50 ml), gota a gota. La reacción se agitó durante 0,5 horas y a continuación se añadieron acetato amónico (78 g, 1000 mmol) y ácido acético (400 ml). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 3 horas con retirada continua de tetrahidrofurano, a continuación se enfrió y se vertió en agua (1,2 l). El precipitado resultante se recogió mediante filtración, lavando con agua y éter para proporcionar 6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona (28,79 g, 56% de rendimiento) como un sólido blanco que es una mezcla del compuesto del título y (2-trifluorometilbenzoil)-urea (91:9 mediante HPLC), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 12,7 (s ancho, 1H), 7,87 (d, J=7,6Hz, 1H), 7,79 (m, 2H), 7,73 (d, J=7,5Hz, 1H), 6,32 (s, 1H), 1,93 (m, 1H), 0,90 (m, 4H), [urea: 10,8 (s ancho, 1H), 7,45 (s ancho, 1H)] ppm; LC-MS 280,96 (M+H); R_{t} (Método A) 2,961 minutos (compuesto del título), 2,313 minutos (impureza de urea).
Ejemplo 8 4-Cloro-6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidina
6-Ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona (12,0 g, 42,8 mmol) en oxicloruro de fósforo (40 ml, 428 mmol) se calentó a 75-80ºC durante 1 hora. El disolvente se retiró mediante evaporación y azeotropizando tres veces con tolueno. El residuo se enfrió hasta 0ºC. Se recogió en acetato de etilo, se trató con trozos de hielo y agua. La mezcla se lavó a continuación secuencialmente con bicarbonato sódico, agua y salmuera, se secó sobre sulfato sódico y se concentró. La purificación mediante cromatografía de desarrollo rápido (SiO_{2}, acetato de etilo:hexanos 5:95) proporcionaba el compuesto del título (9,71 g, 76% de rendimiento) como un aceite incoloro. 1H NMR (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 1,12 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 2,02 (m, 1H), 7,24 (s, 1H), 7,56 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,64 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,79 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 299,1/300,9 (M+H); R_{t} (Método A) 3,882 minutos.
Ejemplo 9 [6-Ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidin-4-il]-(1H-indazol-3-il)-amina
Una mezcla de 4-cloro-6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidina (0,08 g, 0,27 mmol) y 1H-indazol-3-ilamina (0,036 g, 0,41 mmol) se calentó a 160-170ºC durante 6 horas. El residuo se enfrió y se disolvió en N-metilpirrolidinona (2 ml), se vertió en agua (30 ml) y bicarbonato sódico (5 ml) y a continuación se filtró, lavando con agua y éter. El precipitado recogido y el lavado etéreo se combinaron y se concentraron. La purificación mediante cromatografía de desarrollo rápido [SiO_{2}, metanol:diclorometano (2:98)] proporcionaba el compuesto del título (0,017 g, 15% de rendimiento) como un sólido amarillo claro. ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 12,6 (s ancho, 1H), 10,2 (s ancho, 1H), 8,00 (d, J=8,1Hz, 2H), 7,81 (d, J=7,9Hz, 1H), 7,71 (m, 3H), 7,65 (t, J=7,3Hz, 1H), 7,45 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,36 (t, J=7,5Hz, 1H), 7,06 (t, J=7,5Hz, 1H), 2,04 (m, 1H), 1,01 (m, 2H), 0,96 (m, 2H) ppm; LC-MS 396,10 (M+H); R_{t} (Método A) 3,122 minutos.
Ejemplo 10 [6-Ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina (I-1)
Una mezcla de 4-cloro-6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidina (7,00 g, 23,4 mmol, preparada como se describe anteriormente en el Ejemplo 8) y 1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-ilamina (9,43 g, 70,3 mmol) en N-metilpirrolidinona (50 ml) se calentó a 130ºC durante 1 horas. El residuo se recogió, se disolvió en N-metilpirrolidinona (2 ml), se vertió en agua (500 ml) y bicarbonato sódico (15 ml) y a continuación se filtró, lavando con agua. La purificación mediante cromatografía de desarrollo rápido [SiO_{2}, acetato de etilo:hexanos (35:65)] proporcionaba el compuesto del título (5,25 g, 57% de rendimiento) como un sólido blanco. ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,1 (s ancho, 1H), 10,5 (s ancho, 1H), 8,50 (m, 2H), 7,82 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,73 (m, 3H), 7,66 (t, J=7,7Hz, 1H), 7,12 (m, 1H), 2,07 (m, 1H), 1,02 (m, 2H), 0,97 (m, 2H) ppm; LC-MS 397,22 (M+H); R_{t} (Método A) 3,412 minutos.
Ejemplo 11 Sal de hidrocloruro de [6-ciclopropil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina
La sal de HCl se preparó disolviendo el compuesto I-1 (8,42 g, 21,4 mmol) en ácido clorhídrico 6N y liofilizando para proporcionar el compuesto del título (9,242 g, 99%) como un sólido amarillo. ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,3 (s ancho, 1H), 10,9 (s ancho, 1H), 8,53 (dd, J=4,4, 1,4Hz, 1H), 8,48 (d ancho, J=7,4Hz, 1H), 7,87 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,79 (m, 2H), 7,72 (t, J=6,8Hz, 2H), 7,15 (m, 1H), 2,14 (m, 1H), 1,07 (m, 4H) ppm; MS (FIA) 397,3 (M+H), 395,2 (M-H), 431,2 (M-H+HCl); R_{t} (Método A) 2,798 minutos.
Ejemplo 12 6-But-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona
Se preparó 6-but-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona como se describe anteriormente en el Ejemplo 1, excepto que usando éster etílico de ácido 3-oxohept-6-enoico. La reacción proporcionaba el compuesto del título ((2,545 g, 49% de rendimiento) como un sólido de color crema. ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 12,8 (s, 1H), 7,88 (d, 1H), 7,79 (t, 1H), 7,75 (t, 1H), 7,68 (d, 1H), 6,22 (s, 1H), 5,80 (m, 1H), 5,03 (dd, 1H), 4,98 (dd, 1H), 2,56 (t, 2H), 2,36 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 295,1(M+H); R_{t} (Método A) 3,160 minutos.
Ejemplo 13 4-But-3-enil-6-cloro-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidina
El compuesto del título se preparó como se describe en el Ejemplo 2, excepto que usando 6-but-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)-3H-pirimidin-4-ona para proporcionar un aceite amarillo (0,49 g, 99% de rendimiento). ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 7,72 (d, 1H), 7,67 (d, 1H), 7,57 (t, 1H), 7,51 (t, 1H), 7,13 (s, 1H), 5,77 (m, 1H), 4,98 (m, 2H), 2,84 (t, 2H), 2,49 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 313,0(M+H); R_{t} (Método A) 4,220 minutos.
Ejemplo 14 [6-But-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)amina (I-7)
El compuesto del título se preparó como se describe en el Ejemplo 6, excepto que usando 4-but-3-enil-6-cloro-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidina para proporcionar un sólido de color crema (2,712 g, 62% de rendimiento). ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,1 (s, 1H), 10,56 (s, 1H), 8,50 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,84 (d, 1H), 7,76 (t, 1H), 7,69 (m, 3H), 7,13 (m, 1H), 5,86 (m, 1H), 5,06 (dd, 1H), 4,98 (dd, 1H), 2,76 (t, 2H), 2,46 (m, 2H) ppm; MS (FIA) 411,2(M+H); R_{t} (Método A) 3,019 minutos.
Ejemplo 15 [6-(3-Morfolin-4-il-propil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina
Una solución de [6-but-3-enil-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina (0,10 g, 0,25 mmol) en metanol (5 ml) y tetrahidrofurano (5 ml) a -78ºC se burbujeó con ozono durante 5 minutos. Se añadió a esta mezcla morfolina (0,05 ml, 0,56 mmol) y triacetoxiborohidruro sódico (0,39 g, 1,85 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, cuando se añadían morfolina (0,10 ml, 1,28 mmol) y triacetoxiborohidruro sódico (0,39 g, 1,85 mmol) adicionales y a continuación la agitación continuaba otras dos horas. La reacción se extinguió con bicarbonato sódico y se evaporó. La purificación mediante cromatografía de desarrollo rápido (SiO_{2}, eluida con metanol:diclorometano 1:9) seguida por HPLC preparativa proporcionaba el compuesto del título como un liofilizado amarillo brillante (0,068 g, 38% de rendimiento). ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 9,60 (s ancho, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,86 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,97 (m ancho, 2H), 3,61 (m ancho, 2H), 3,44 (m ancho, 2H), 3,18 (m ancho, 2H), 3,05 (m ancho, 2H), 2,78 (t, 2H), 2,08 (m, 2H) ppm.
Ejemplo 16
Los siguientes compuestos se prepararon mediante métodos substancialmente similares a los descritos aquí en los Ejemplos 1-15, los Esquemas Generales y mediante métodos conocidos por un experto normal en la técnica.
[6-(3-Piperidin-1-il-propil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina (I-9):
482,2(M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (S, 1H), 9,04 (s ancho, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,78 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,42 (m, 2H), 3,10 (m, 2H), 2,85 (m, 2H), 2,77 (t, 2H), 2,09 (m, 2H), 1,79 (m, 2H), 1,61 (m, 3H), 1,35 (m, 1H) ppm.
[6-(3-Dietilaminopropil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina (I-10):
470 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 9,07 (s, 1H), 8,50 (m, 1H), 7,85 (m, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,76 (m, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,11 (m, 6H), 2,80 (t, 2H), 2,05 (m, 2H), 1,15 (t, 6H) ppm.
[6-(3-(4-Metilpiperazin-1-il)-propil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina (I-11): 497,2 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (m, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,72 (m, 3H), 7,14 (m, 1H), 3,0-3,7 (ancho, 10H), 2,83 (s, 3H), 2,77 (t, 2H), 2,05 (m, 2H) ppm.
[6-(3-Piperazin-1-il-propil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina (I-12): 483,3 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 9,06 (s ancho, 2H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,34 (m ancho, 8H), 3,15 (m ancho, 2H), 2,77 (t, 2H), 2,06 (m, 2H) ppm.
[6-(3-Dimetilaminopropil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina (I-13): 442,1 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 9,40 (s ancho, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,78 (m, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,12 (m, 2H), 2,77 (m, 8H), 2,06 (m, 2H) ppm.
N,N-Dimetil-N'-{3-[6-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-ilamino)-2-(2-trifluorometliilfenil)-pirimidin-4-il]-propil}-etano-1,2-diamina (I-14): 485,3 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 9,7 (ancho, 1H), 8,8 (s ancho, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,48 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,71 (m, 2H) 7,14 (m, 1H), 3,32 (s, 4H), 3,07 (m ancho, 2H), 2,84 (s, 6H), 2,80 (m, 2H), 2,04 (m, 2H) ppm.
[6-(3-Metilaminopropil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina (I-15):
428,1 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 8,51 (m, 1H), 8,48 (d, 1H), 8,37 (s ancho, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 2,97 (m, 2H), 2,78 (t, 2H), 2,55 (m, 3H), 2,01 (m, 2H) ppm.
2-{3-[6-(1H-Pirazolo[3,4-b]piridin-3-ilamino)-2-(2-trifluorometilfenil)-pirimidin-il]propilamino}-etanol (I-16):
458,2 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (m, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,77 (m, 1H), 7,69 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,62 (t, 2H), 2,99 (m, 4H), 2,78 (t, 2H), 2,04 (m, 2H) ppm.
[6-(3-(2-Morfolin-4-il-etilamino)-propil)-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina (I-17): 527,2 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 8,76 (s ancho, 2H), 8,52 (m, 1H), 8,48 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,78 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,81 (s ancho, 4H), 3,1-3,3 (m ancho, 8H), 3,06 (t, 2H), 2,80 (t, 2H), 2,05 (t, 2H) ppm.
[6-{3-[Metil-(2-morfolin-4-il-etil)-amino]-propil}-2-(2-trifluorometilfenil)pirimidin-4-il]-(1H-pirazolo[3,4-b]piridin-3-il)-amina (I-18): 541,2 (M+H), ^{1}H-NMR (500 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,2 (s, 1H), 10,7 (s, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,47 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,78 (m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,14 (m, 1H), 3,73 (s ancho, 4H), 3,39 (m, 2H), 3,21 (m, 2H), 2,8-3,3 (m ancho, 6H) 2,81 (s, 3H), 2,78 (t, 2H), 2,09 (m, 2H) ppm.
Ejemplo 17 Determinación de K_{i} para la Inhibición de GSK-3
Los compuestos se rastrearon con respecto a su capacidad para inhibir la actividad de GSK-3\beta (AA 1-420) usando un sistema de enzimas acopladas estándar (Fox y otros (1998) Protein Sci. 7, 2249). Las reacciones se llevaron a cabo en una solución que contenía HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 10 mM, NaCl 25 mM, NADH 300 \muM, DTT 1 mM y DMSO al 1,5%. Las concentraciones de substrato finales en el ensayo eran ATP 20 \mum (Sigma Chemicals, St Louis, MO) y péptido (HSSPHQS(PO_{3}H_{2})EDEEE American Peptide, Sunnyvale, CA) 300 \muM. Las reacciones se llevaron a cabo a 30ºC y GSK-3b 20 nM. Las concentraciones finales de los componentes del sistema de enzimas acopladas eran fosfoenolpiruvato 2,5 mM, NADH 300 \muM, 30 \mug/ml de piruvato quinasa y 10 \mug/ml de lactato deshidrogenasa.
Se preparó una solución tamponadora de reserva de ensayo que contenía todos los reactivos listados anteriormente con la excepción de ATP y el compuesto de prueba de interés. La solución tamponadora de reserva de ensayo (175 \mul) se incubó en una placa de 96 pocillos con 5 \mul del compuesto de prueba de interés a concentraciones finales que variaban de 0,002 \muM a 30 \muM a 30ºC durante 10 minutos. Típicamente, se efectuó una valoración de 12 puntos preparando diluciones en serie (a partir de reservas de compuesto 10 mM) con DMSO del compuesto de prueba en placas descendientes. La reacción se inició mediante la adición de 20 \mul de ATP (concentración final 20 \muM). Las velocidades de reacción se obtuvieron usando un lector de placas Spectramax de Molecular Devices (Sunnyvale, CA) durante 10 minutos a 30ºC. Los valores de K_{i} se determinaron a partir de los datos de velocidad como una función de la concentración de inhibidor.
Se encontró que los compuestos de la presente invención tenían un valor de K_{i} de menos de 100 nM usando el ensayo descrito anteriormente.
Ejemplo 18 Determinación del Porcentaje de Neuroprotección
Según se usa aquí, el término "porcentaje de protección" representa el porcentaje de células neuronales protegidas contra lesión isquémica (OGD) y se calcula como:
% de protección = (prueba-OGD)/(normal-OGD)* 100
Este protocolo describe el procedimiento usado para inducir isquemia experimental mediante anoxia-reoxigenación en células neuronales hipocampales cultivadas. El efecto neuroprotector de los compuestos de prueba se evalúa contra lesión celular y muerte celular neuronales inducidas por isquemia.
Las siguientes etapas se realizaron antes del día de ensayo.
El LoG-Neurobasal [LoG-Neurobasal contiene medio NoG-Neurobasal (Invitrogen Corp, encargado por el cliente) más glucosa 0,5 mM, L-glutamina 0,5 mM y 0,25 x penicilina/estreptomicina] se preequilibró en la cámara hipóxica durante la noche.
El LoG-Neurobasal se preequilibró en la incubadora normal (CO_{2} al 5%) durante la noche.
En la incubadora normal (CO_{2} al 5%), Neurobasal/B27AO [Neurobasal/B27AO contiene medio Neurobasal (Invitrogen Corp Nº Cat 21103-049) con 2 x B27 menos complemento AO (Invitrogen Corp Nº Cat 10889-038), L-glutamina 0,5 mM y 0,25 x penicilina/estreptomicina] se preequilibró durante la noche.
Las siguientes etapas se realizaron el día del ensayo: medio LoG-Neurobasal se retiró de la cámara hipóxica y el medio se burbujeó ligeramente con N_{2} al 100% durante 30 minutos para desoxigenarlo completamente.
El medio de cultivo (Neurobasal/B27m [Neurobasal/B27m contiene medio Neurobasal con 2 x complemento B27 (Invitrogen Corp Nº Cat 17504-044) y L-glutamina 0,5 mM] se aspiró de las células en cada placa de 12 pocillos usando la bomba de vacío con una pipeta Pasteur de vidrio estéril.
La placa se lavó una vez con 2 ml de BSS_{0} libre de glucosa (pH 7,4), preparado a partir de lo siguiente: NaCl 143,6 mM, KCl 5,4 mM, CaCl_{2} 1,8 mM, MgSO_{4} 0,8 mM, NaH_{2}PO_{4} 1 mM, NaHCO_{3} 26,2 mM, 10 mg/l de rojo fenol y 0,25 x P/S.
Las neuronas (10-11 días desde el cultivo inicial) se repusieron con LoG-Neurobasal desoxigenado (1 ml por pocillo para cada pocillo de una placa de 12 pocillos). Estas células neuronales se prepararon de acuerdo con Park LC, Calingasan NY, Uchida K, Zhang H, Gibson GE. (2000) "Metabolic impairment elicits brain cell type-selective changes in oxidative stress and cell death in culture". J Neurochem 74(1):114-124.
Los compuestos de prueba se añadieron directamente a cada pocillo (3 concentraciones del compuesto más control positivo, cada una por triplicado). Los compuestos se disolvieron en DMSO al 100%, cuando la concentración de DMSO nunca superaba 0,5%, entonces las placas se ponían en la cámara hipóxica durante 5 horas con las tapas de la placa entreabiertas.
Para controles de normoxia, se añadió medio LoG-Neurobasal normóxico preequilibrado a cada pocillo y la placa se volvió a colocar en la incubadora de cultivo normal durante 4 horas.
Después de 4 horas de hipoxia, el medio existente se eliminó por aspiración cuidadosamente y 2 ml de nuevo Neurobasal-B27AO oxigenado (preequilibrado) se añadieron a cada pocillo. Se alcanzó medio reoxigenado colocando el medio durante la noche en la incubadora de cultivo (CO_{2} al 5%/O_{2} al 95%) antes del uso.
Los mismos compuestos de prueba con las mismas concentraciones se añadieron de nuevo a los pocillos correspondientes y las placas se pusieron en la incubadora de cultivo celular (CO_{2} al 5%/O_{2} al 95%) y se reoxigenaron durante 20-24 horas). Después de la reoxigenación durante 20-24 horas, el número de neuronas vivas se contó usando el método de fluorescencia Cell Tracker Green descrito posteriormente.
El medio de cultivo existente se aspiró de cada pocillo de las placas de 12 pocillos y las neuronas se lavaron una vez con 2 ml de HBSS (pH 7,4, Invitrogen Corp. Nº Cat 14170-112) precalentado hasta 30-37ºC.
A cada pocillo de la placa se añadió 1 ml de Cell Tracker Green ((Molecular Probes Nº Cat 2925) 2,5 \muM y colorantes fluorescentes Hoechst 33342 5 \muM disueltos en HBSS. Las placas se pusieron a continuación a la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y a continuación las neuronas se lavaron una vez con 2 ml de HBSS. Se añadió 1 ml de HBSS a cada pocillo y los números de células fluorescentes vivas y muertas se contaron usando un sistema de formación de imágenes automatizado Cellomics®.
Se encontró que los compuestos de la presente invención tenían un % de valor de protección de \geq30%.
Ejemplo 19 Modelo de Oclusión de la Arteria Cerebral Media (MCAO)
Los animales usados en este estudio eran ratas Sprague-Dawley macho que pesaban entre 270 y 333 g (Charles River, NC). Se dejó que las ratas se aclimataran a las instalaciones de los animales durante al menos una semana con un ciclo diurno de luz/oscuridad de 12 horas. Se les dejó acceso libre a alimento y agua.
Los oclusores arteriales intraluminales usados para bloquear el origen de la arteria cerebral media (MCA) estaban hechos de sutura monofilamentosa de nailon 4-0 cortada en segmentos de 25 mm de largo. La punta de la sutura se redondeó mediante exposición a calor. Para incrementar la eficacia del oclusor para bloquear la luz de la arteria, se revistieron con una suspensión de poli-L-lisina al 1% y se secaron durante 1 hora en un horno fijado a 60ºC. Las suturas se adquirieron de Ethelon, Somerville, NJ. Chemical y los reactivos se utilizaron como sigue:
1.
Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio o TTC, Nº Cat T8877, Nº Lot 50K1435, y PEG400, Nº Cat P-3265, se adquirieron de Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri.
2.
La formalina tamponada con fosfato, Nº Cat 245-685, se adquirió de Fisher Scientific Co., Middletown, VA.
3.
El agua destilada se produjo en las propias instalaciones.
4.
El etanol, Nº Cat E702-3, se adquirió de Aldridge, Milwaukee, WI.
El modelo de sutura intraluminal de isquemia cerebral focal se usó substancialmente como se describe por Longa, y otros, Stroke, 20:84-91 (1989). La vena yugular externa izquierda se canuló para la administración de vehículo o compuesto.
Para ayudar a que las ratas mantuvieran la hidratación durante el estudio, se inyectaron subcutáneamente dextrosa al 5% en agua y solución de Ringer lactatada (5 ml cada una) en cada flanco a las 10, 24 y 48 horas después de la MCAO.
Las ratas que cumplían los criterios de inclusión iniciales (puntuación neurológica de 2 y temperatura corporal >38,5ºC) se aleatorizaron mediante asignación secuencial a los grupos de tratamiento con vehículo o compuesto. La asignación diaria inicial de las ratas a un grupo particular se alternaba cada día.
El tratamiento con compuesto o vehículo se inició mediante inyección en bolo i.v. 6 horas después de la MCAO y continuaba durante las 18 horas siguientes mediante infusión constante usando la bomba Infu Disk. Las ratas se anestesiaron brevemente y el catéter yugular se expuso a través de la incisión dorsal en el cuello. La dosis en bolo de compuesto o vehículo se administró y la bomba de infusión se activó 5 minutos más tarde. Las bombas de infusión se unieron al lomo de las ratas mediante un vendaje.
Se prepararon soluciones de compuestos recientemente cada día usando un vehículo de agua:PEG400:etanol en el volumen 5:4:1. Los grupos y las dosis utilizados en este modelo se indican en la Tabla 2 posteriormente.
TABLA 2 Dosificación de Compuesto para el Modelo de t-MCAO
8
El volumen de infarto se determinó mediante análisis de imágenes de 7 secciones consecutivas teñidas con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) usando una modificación del procedimiento descrito por Bederson y otros (1986). Tres días después de la MCAO, las ratas fueron sacrificadas mediante asfixia con CO_{2} y decapitación. Los cerebros se extirparon rápidamente de la calavera y se pusieron en vasos de precipitados individuales que contenían PBS en un baño de hielo durante 30 minutos. Las secciones cerebrales coronales, 2 mm de grosor, se obtuvieron usando un rebanador matricial cerebral. Las secciones de cerebro se pusieron en cápsulas de Petri marcadas que contenían TTC al 2% en PBS durante 20 minutos a 37ºC. El TTC tiñe de rojo el tejido cerebral viable, dejando el área isquémica blanca. Las secciones de cerebro se sumergieron a continuación en formalina tamponada neutra al 10% durante al menos 24 horas a 4ºC. Todas las secciones se sometieron a obtención de imágenes antes de tres días después del sacrificio.
Las secciones cerebrales teñidas con TTC fijadas con formalina (7 secciones consecutivas) se capturaron digitalmente usando el software Adobe Photoshop y una cámara digital. Las imágenes se importaron al programa de análisis de imágenes IPLab. El área de infarto cortical (área blanca) se bosquejó y se midió. El volumen de infarto se calculó usando la siguiente fórmula:
Volumen de infarto = \Sigma área de infarto x 2 (la distancia entre cada sección)
Los volúmenes hemisféricos ipsilateral y contralateral totales se determinaron de forma similar.
El volumen de edema e calculó substrayendo el volumen hemisférico contralateral del volumen hemisférico ipsilateral. Un científico que ignoraba el tratamiento de las ratas realizaba el análisis.
La función neurológica de las ratas se evaluó a las 2, 24, 48 y 72 horas después de la MCAO usando un sistema de puntuación descrito por Bederson y otros (1986b). La puntuación variaba de 0 a 3 con 0 como normal y 3 indica déficit grave.
La puntuación neurológica a las 2 horas de la isquemia se usó como criterio de inclusión en el estudio. Si la rata no tenía una puntuación neurológica de al menos 2 o si tenía una puntuación de 3, se eliminaba del estudio. Un investigador, que ignoraba el grupo de tratamiento de la rata, realizaba las evaluaciones neurológicas.
Se obtuvieron muestras de sangre (\sim0,5 ml) de las ratas para análisis farmacocinéticos a los 5 minutos y a las 4, 22, 46 y 70 horas después de la inyección en bolo. Las ratas fueron anestesiadas ligeramente con isoflurano. La sangre se recogió en tubos de recogida de sangre heparinizados (0,6 ml de capacidad) de una vena lateral de la cola usando un instrumento de infusión de mariposa de calibre 23. Las muestras de sangre se centrifugaron durante 4 minutos (graduación 10) en una microcentrífuga. El plasma se retiró, se puso en viales etiquetados y se almacenó a -20ºC en un congelador.
Setenta y dos horas después de la MCAO, las ratas fueron anestesiadas profundamente mediante inhalación de CO_{2} y se obtuvo tanta sangre como fuera posible mediante punción cardíaca. La sangre se puso en tubos de recogida de sangre heparinizados (6 ml de capacidad). El plasma se separó de la sangre mediante centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos (Allegra R_{6}). El plasma se recogió, se puso en tubos de plástico etiquetados y se almacenó a -20ºC en un congelador.
El análisis estadístico para el tamaño del infarto, la glucosa en plasma, la temperatura corporal y el peso corporal entre los grupos de vehículo y tratamiento se realizó mediante prueba t de Student de dos colas. El análisis estadístico de la puntuación neurológica se realizó mediante análisis no paramétrico. Los datos se presentan como media \pm MEE.
El tratamiento con un compuesto de fórmula I, administrado 6 horas después de la MCAO, era muy eficaz para reducir el volumen de infarto en este modelo de apoplejía local transitoria (Figura 1). Las ratas del grupo tratado con compuesto (88 \pm 21 mm^{3}) tenían una reducción de 79% altamente significativa en el volumen de infarto total en comparación con el control de vehículo (418 \pm 31 mm^{3}, p<0,0001). El daño isquémico cortical en el grupo tratado con compuesto (32 \pm 20 mm^{3}) también estaba significativamente reducido en 88% en comparación con el control de vehículo (272 \pm 22 mm^{3}, p<0,0001). El tratamiento con un compuesto de fórmula I (55 \pm 12 mm^{3}) podía reducir significativamente el daño isquémico al cuerpo estriado en 62% en comparación con el control de vehículo (146 \pm 13 mm^{3}, p<0,0001). Finalmente, el tratamiento con un compuesto de fórmula I (21 \pm 10 mm^{3}) reducía la cantidad de formación de edema en 79% en comparación con el grupo de control de vehículo (97 \pm 10 mm^{3}, p<0,0001).
Las ratas tratadas con un compuesto de fórmula I demostraban una mejora notable en la función neurológica a lo largo del transcurso de tiempo del experimento (Figura 2). Tan pronto como 18 horas después de la iniciación de la dosificación, se observaba una mejora significativa en la función neurológica en el grupo tratado con compuesto en comparación con el grupo de control de vehículo (1,3 \pm 0,3 frente a 2 \pm 0 unidades, respectivamente, p<0,0001). La puntuación neurológica de las ratas tratadas con compuesto continuaba mejorando, de modo que a las 72 horas después de la MCAO, estas ratas eran capaces de actuar con poco déficit o sin déficit notable. En contraste, las ratas tratadas con vehículo no mostraban mejora en la función neurológica a lo largo del transcurso del tiempo del experimento.
Ejemplo 20 Modelo Animal para Agente Antidepresivo
Los compuestos de la presente invención se ensayaron con respecto a la actividad antidepresiva en ratas mediante métodos substancialmente similares a los descritos por Porsolt, R.D., y otros, 1977; 229: 327-336: Bourin M. Fundam Clin Pharmacol 1990; 4: 49-64.
Prueba de Natación en Ratas (Prueba de Depresión)
Las ratas se pusieron dentro de un cilindro transparente lleno de agua. La duración de la inmovilidad (= tiempo de inmovilidad), definida como el tiempo durante el cual la rata solo hace los movimientos corporales mínimos para mantener su cabeza sobre el agua, se registra manualmente. En una segunda experiencia, el día 4 las ratas se ponen de nuevo en el cilindro, esta vez durante 5 minutos. El tiempo de inmovilidad se registra manualmente a lo largo de toda la experiencia.
Experiencia I (experiencia inicial):
El día 1, ratas Wistar (raza RA239; 160-180 g) macho se pusieron durante 15 minutos dentro de un cilindro. La duración de la inmovilidad (= tiempo de inmovilidad), definida como el tiempo durante el cual la rata hacía solo los movimientos corporales mínimos para mantener su cabeza sobre el agua, se registra manualmente. Para probar un número razonable de animales en un día, los registros se restringen a los siguientes tres subperíodos dentro de los 15 minutos. Experiencia: 0-2,5 min (es decir, al comienzo de la experiencia), 6,25-8,75 minutos (exactamente en medio de la experiencia) y 12,5-15 minutos (totalmente al final de la experiencia). Se ha encontrado previamente que este procedimiento representa la "conducta" del animal que se presenta a lo largo de toda la experiencia.
Experiencia II (segunda experiencia):
El día 4 la ratas se ponen de nuevo dentro del cilindro, esta vez durante 5 minutos. El tiempo de inmovilidad se registra manualmente a lo largo de toda la experiencia.
Los tratamientos con compuestos se suspendieron en metilcelulosa (Methocel) al 0,5% y se administraron oralmente (5 ml/kg). Las administraciones de fármaco son por la tarde (alrededor de las 16:00) del día 1 (el día de la experiencia I), por la mañana (alrededor de las 08:00) y por la tarde de los días 2 y 3 exactamente 1 hora antes de la experiencia II (el día 4). Los tratamientos para las dos ratas dentro de una díada eran similares o diferentes, dependiendo de la aleatorización para la conducta en la experiencia I. Los grupos de ratas tratadas con Methocel o 15 mg/kg por vía oral de Despiramine (DMI) sirven como grupo de control y patrón positivo, respectivamente.
Se encontró que los compuestos de la presente invención mostraban actividad antidepresiva en el modelo anterior.
Ejemplo 21 Modelo Animal de Esquizofrenia: Inhibición Prepulsatoria de la Alarma (PPI)
El resultado de la conmutación sensoriomotriz relacionada con interrupciones en la atención y la cognición es común entre pacientes esquizofrénicos. La inhibición prepulsatoria de la alarma (PPI) está deteriorada en pacientes esquizofrénicos. La inhibición prepulsatoria se produce cuando un sonido débil precedente a un estímulo acústico fuerte inhibe el reflejo de alarma. La PPI se considera una prueba con buena validez predictiva, nominal y constructiva para la esquizofrenia.
Un control positivo, la clozapina, es un fármaco antipiscótico atípico disponible comercialmente (Clozaril®). La clozapina tiene una alta afinidad para receptores de dopamina D5 y 5-HT2 y potencia eficazmente la respuesta de PPI en modelos animales.
El ensayo de PPI se realizó, de la siguiente manera, mediante métodos substancialmente similares al descrito por Spooren y otros. Anxiolytic-like effects of the prototypical metabotropic glutamate receptor 5 antagonist 2-methyl-6-(phenylethynyl) pyridine in rodents. J Pharmacol Exp Ther. 295: 1267-1275 (2000).
C57BL/6 (20-30 g) macho se alojaron en grupos de cuatro en jaulas de Macrolon (42 x 26 x 15 cm) durante al menos 3 días antes de la experiencia. La instalación de alojamiento estaba controlada en temperatura y humedad y equipada con iluminación artificial (luces encendidas de 6:00 AM a 6:00 PM). Los animales tenían acceso a agua y alimento a voluntad. Todos los animales eran experimentalmente ingenuos.
Los animales del procedimiento se pretrataron con compuesto de prueba (30, 60, 100 mg/kg), clozapina (30 mg/kg), un control positivo o vehículo (metilcelulosa al 0,5%). Después de 45 minutos, los ratones se pusieron individualmente en la cámara de alerta con un ruido blanco uniforme de 70 dB, y se dejaron sin alterar durante 10 minutos. A continuación, había una sesión de 15 minutos que consistía en 56 experiencias. El estímulo de alerta es un sonido de ruido blanco de 120 dB de 40 ms, los preimpulsos son sonido de ruido blanco de 20 ms de 72, 74 y 78 dB precedente a la alerta en 100 ms.
Se dieron ocho tipos de experiencias: preimpulso más alerta (7 experiencias por intensidad de preimpulso), preimpulso solo (7 experiencias por intensidad de preimpulso), alerta sola (7 experiencia estímulo (7 experiencias). El intervalo variable entre experiencias tiene de promedio 15 ms (entre 10 y 20 ms). En las experiencias sin estimulación, se tomaron medidas de la línea de base. En las pruebas con alerta sola, se midió la amplitud de alerta auditiva básica (g) y en las pruebas de preimpulso más alerta, se midió la cantidad de inhibición de la alerta normal y se expresó como porcentaje de la alerta básica. En las experiencias de preimpulso solo, la respuesta normal a un ruido débil se midió como un control. La inhibición prepulsatoria se computó de acuerdo con la fórmula %PPI = 100-100 x [(PA2 PPP)/PA2]. Se encontró que los compuestos de la presente invención potenciaban la PPI de reflejo de alerta acústica en ratones.
Ejemplo 22 Modelos Animales para Agente Ansiolítico
El ensayo ansiolítico se realizó, de la siguiente manera, mediante métodos substancialmente similares al descrito por Spooren y otros. Anxiolytic-like effects of the prototypical metabotropic glutamate receptor 5 antagonist 2-metil-6-(feniletinil)piridina in rodents. J Pharmacol Exp Ther. 295: 1267-1275 (2000) y Lecci A, Borsini F, Volterra G y Meli A, Pharmacological validation of a novel animal model of anticipatory anxiety in mice. Psychopharmacology 101: 255-261 (1990).
I. Hipertermia Inducida por Estrés
El procedimiento de prueba para la hipertermia inducida por estrés (SHI) se adoptó con una modificación pequeña de la descripción original de Lecci y otros (1990). La temperatura rectal se midió hasta los 0,1ºC más cercanos mediante un termómetro (ELLAB instruments, Copenhague, Dinamarca) a través de una sonda termistora lubricada (2 mm de diámetro) insertada 20 mm en el recto mientras el ratón se mantenía a mano cerca de la base de la cola. La sonda se dejó en el lugar hasta que es obtenían lecturas estables (en menos de 15 s).
Quince animales se alojaron por jaula de Macrolon (42 x 26 x 15 cm). Al menos 24 horas antes del experimento los animales de una jaula se marcaron sobre su pelo con color para una identificación posterior. Sesenta minutos antes de tomar la temperatura rectal todos los individuos dentro de una jaula dada se trataron consecutivamente a intervalos de 1 minuto con compuesto de prueba (dosis:1,3, 10 ó 30 mg/kg, por vía oral; volumen de inyección: 10 ml/kg), clordiazepóxido-HCl (10 mg/kg, por vía oral; Research Biochemicals Interational), es decir, los controles positivos, o vehículo (metilcelulosa al 0,5%; Animed). Exactamente 30 minutos después de que los ratones se retiraran consecutivamente de la jaula (de nuevo a intervalos de 1 minuto) la temperatura rectal se determinó y se anotó. Una vez que la temperatura se hubo registrado, los animales se pusieron en una jaula diferente (adyacente). La variable dependiente, es decir la hipertermia inducida por estrés, se definió como la delta de la temperatura rectal mediana dentro de los seis ratones retirados inicialmente y la temperatura rectal mediana dentro de los seis ratones retirados finalmente dentro de una jaula. Esta delta se calculó para de seis a ocho jaulas dependiendo del grupo de tratamiento específico, mientras que en la representación final se usó la media de estos seis a ocho valores. La temperatura rectal del primer animal se usó, además, para evaluar el efecto potencial del compuesto sobre la temperatura corporal basal, de por sí.
II. Prueba de Exploración Social en Ratas
Se usaron ratas Sprague-Dawley macho adultas (= ratas "residentes"; 350-400 g) y ratas de Lister Hooded jóvenes (= ratas "intrusas"; 100-120 g). Las ratas intrusas se alojaron por pares y las ratas residentes se alojaron individualmente en jaulas de Macrolon (42 x 26 x 15 cm) durante 2 semanas antes de la prueba. Todos los animales se alojaron en la misma habitación. La instalación de alojamiento estaba controlada en temperatura y humedad y equipada con iluminación artificial (luces encendidas de 6:00 AM a 6:00 PM). Los animales tenían acceso a agua y alimento a voluntad. Todas las ratas eran experimentalmente ingenuas.
Los animales recibían compuesto de prueba (dosis: 0,3, 3, 10 ó 30 mg/kg), clordiazepóxido-HCl (5 mg/kg, por vía oral; CDZ, Research Biochemicals International, Natick, MA), LiCl (10, 30 mg/kg) como los compuestos de referencia/positivos, o vehículo (metilcelulosa al 0,5%). El volumen de inyección era 2 ml/kg. El tratamiento oral se administró a la rata intrusa solamente y la prueba se realizó 1 hora después de la administración del compuesto. Todas las observaciones se realizaron durante la fase de luz (de 8:00 AM a 1:00 PM) en la jaula de alojamiento de la rata residente (véase anteriormente). El suelo de jaula se cubrió con serrín. Pares que consistían en una rata intrusa y una rata residente se asignaron aleatoriamente a uno de los grupos experimentales o de control. La duración de comportamientos de aproximación activa (= tiempo empleado en la actividad social) de la rata intrusa (inhalación, exploración anogenital, olfateo, acicalamiento, lamedura, juego) hacia la residente se puntuó manualmente y se registró acumulativamente a lo largo de un período de 5 minutos.
III. Pruebas de Laberinto en Forma de Signo Más Elevado
Ratas Sprague-Dawley adultas macho (180-220 g) se alojaron en grupos de cuatro en jaulas de Macrolon (42 x 26 x 15 cm) durante al menos 3 días antes del experimento. La instalación de alojamiento estaba controlada en temperatura y humedad y equipada con iluminación artificial (luces encendidas de 6:00 AM a 6:00 PM). Los animales tenían acceso a agua y alimento a voluntad. Todos los animales eran experimentalmente ingenuos.
El laberinto en forma de signo más elevado consiste en dos brazos abiertos (40 x 12 cm) y dos brazos cerrados (40 x 12 x 20 cm) que se extienden todos desde una plataforma central común (12 x 12 cm). La configuración forma la figura de un signo más, con brazos similares dispuestos opuestos entre sí, y el aparato se eleva 60 cm por encima del suelo sobre un pedestal central. El laberinto está hecho de Plexiglas gris. El agarre en los brazos abiertos está facilitado por la inclusión de un pequeño borde elevado (0,25 cm) alrededor de su perímetro.
El método se realizó de la siguiente manera, mediante métodos substancialmente similares a los descritos por Handley, S.L. y Mithani, S, Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze exploration model of "fear"-motivated behaviour. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 327: 1-5 (1984). Las ratas fueron asignadas aleatoriamente a uno de los diversos tratamientos. Los animales se transportaron desde la sala de alojamiento al laboratorio al menos 1 hora antes de la prueba. Después de la administración oral de compuesto, las ratas se alojaron individualmente en jaulas de Macrolon (22 x 16 x 14 cm) y después de 60 minutos se pusieron sobre la plataforma central de cara a un brazo cerrado. Se realizó una experiencia de 8 minutos y el laberinto se limpió a fondo entre sujetos. Los registros directos se realizaron mediante un observador sentado cerca del laberinto y se usaron los siguientes parámetros convencionales: número de entradas en los brazos abiertos y cerrados (una entrada en un brazo se define como las cuatro patas que entran en un brazo) y tiempo transcurrido en los brazos abiertos (excluyendo la plataforma central). Los animales de los diferentes grupos de tratamiento se probaron alternativamente y las experiencias se realizaron entre las 8:30 AM y las 12:30 PM, es decir, dentro de la primera mitad de la fase de luz. Se registraron los siguientes parámetros que reflejan ansiedad: relación de tiempo (abierto/total) empleado sobre brazos abiertos, latencia para dejar el primer brazo y número total de entradas en los brazos.
Los compuestos de la presente invención muestran un efecto similar a un ansiolítico en los modelos animales anteriores.
Ejemplo 23 Ensayo Celular para la Enfermedad de Alzheimer - Supervivencia Neuronal
El siguiente ensayo se realiza mediante métodos substancialmente similares al descrito por Kienlen-Campard y otros, J Biol Chem 277:15666 (2002). Se prepararon cultivos primarios de neuronas hipocampales a partir de embriones de rata E18 (Park y otros, J Neurochem, 74:114, 2000). Las células se cultivan en placa en cápsulas de cultivo de 6 a 96 pocillos (4 x 10^{5} células/cm^{2}) o cubreobjetos de vidrio (1,25 x 10^{5} células/cm^{2}) pretratados con poli(D-lisina) y cultivados durante 6 días in vitro en medio NEUROBASAL™ complementado con B-27 al 2% y L-glutamina 0,5 mM antes de la infección con adenovirus recombinantes. Bajo estas condiciones, los cultivos neuronales (hasta 98% de neuronas) presentan altos grados de diferenciación y supervivencia.
Adenovirus Recombinante e Infección Neuronal - Se realizan la producción, propagación y purificación de adenovirus que codifican forma mutante de APP695. Después de 6 días in vitro, los cultivos neuronales se infectan con una multiplicidad de infección de 100 durante 4 horas en un volumen mínimo de medio de cultivo. El medio de infección se repone a continuación mediante medio de cultivo reciente durante 3-5 días. Bajo estas condiciones, al menos 75% de las neuronas expresan las proteínas codificadas por retrovirus recombinante.
Supervivencia Celular - La supervivencia neuronal se mide mediante el ensayo de MTT colorimétrico o ensayo de viabilidad de células fluorescentes CellTracker usando un sistema de formación de imagen automatizado Cellomics. Para la tinción nuclear, las células se fijan (formaldehído al 0,37%/glutaraldehído al 0,2% en solución salina tamponada con fosfato) y se incuban durante 30 minutos en el colorante Hoechst 33342 (1 \mug/ml).
Cuantificación de la producción de Abeta - El medio de cultivo se recoge, se trata con inhibidores de proteasa (1 \mug/ml de pepstatina, 10 \mug/ml de leupeptina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM) y se clarifica mediante centrifugación (16.000 x g, 5 min, 4ºC). Se usan 100 \mul del sobrenadante para la cuantificación de amiloide beta usando el método de ELISA descrito posteriormente.
Ejemplo 24 Inhibición de la producción de Amiloide Beta (1-40)
La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la presencia de placas extracelulares y nudos neurofibrilares intercelulares en el cerebro. El componente proteínico principal de estas placas es el péptido amiloide beta ("A\beta") que se segmenta de la proteína precursora de amiloide ("APP").
Línea celular y tratamiento con compuesto
Una línea celular estable capaz de secreción de A\beta se construyó en células de neuroglioma H4 humanas mediante transducción con un vector retroviral que expresa tanto APP695 que contiene las mutaciones Swedish (K595N, M596L) como YFP como un marcador de selección. Tansductantes estables que expresan APP695 se seleccionaron clasificando células que expresan altos niveles de YFP.
Las células se cultivaron en placas a 80.000 células por ml en un placa de 96 pocillos en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen, Nº de catálogo 11965-092) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% y penicilina/estreptomicina. Después de 24 horas, los medios se reemplazaron por medio reciente que contenía el compuesto de interés, donde las concentraciones de compuesto que variaban de 20 \muM a 10 nM se probaron en valoraciones de 7 puntos por duplicado. Después de la incubación con compuesto de prueba durante 18-24 horas a 37ºC, la concentración de hA\beta (1-40) en el sobrenadante se determinó usando el ELISA para hA\beta40.
Ensayo de ELISA para A\beta secretado
Se usó Biosource International, Inc. Signal Select™ Human \beta Amyloid (hA\beta40) ELISA (Nº de catálogo KHB3482) par la determinación cuantitativa in vitro de hA\beta40 en el sobrenadante de cultivo de muestras. Un anticuerpo monoclonal específico para el extremo NH_{2} de hA\beta se revistió sobre los pocillos de las placas de microvaloración. Las muestras, incluyendo patrones de contenido de hA\beta conocido, se pipetearon en estos pocillos, seguido por la adición de un anticuerpo de conejo específico para la secuencia 1-40 de hA\beta. Se detectó a continuación anticuerpo de conejo unido mediante el uso de un anti-anticuerpo de conejo etiquetado con peroxidasa de rábano picante. Despés de la retirada de anti-anticuerpo de conejo en exceso, se añadió una solución de substrato, que se segmentó mediante la enzima unida para producir color. La intensidad de este producto coloreado es directamente proporcional a la concentración de hA\beta (1-40) presente en la muestra.
El ensayo de ELISA se realizó como sigue
Muestras y patrones que contienen una concentración conocida de péptido hA\beta (1-40) se diluyeron en diluyente de patrón/muestra (reactivo de Biosource). Los inhibidores de proteasa AEBSF, aprotinina, bestatina, E-64, leupeptina y pepstatina A (Calbiochem, Protease Inhibitor Cocktail Set III, Nº de catálogo 539134) se añadieron a todas las muestras para evitar la proteolisis de los péptidos A\beta. 100 \mul de muestras y patrones se añadieron a pocillos de las placas de ELISA de 96 pocillos y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC. Los pocillos se lavaron cuatro veces con 100 \mul de tampón de lavado (Biosource Reagent) y a continuación se añadieron 100 \mul de anticuerpo de detección y las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo de detección reconoce la secuencia de hA\beta (1-40).
Los pocillos se lavaron 4 veces con 100 \mul de tampón de lavado y a continuación se añadieron 100 \mul de anti-anticuerpo secundario de conejo etiquetado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron a continuación 5 veces con 100 \mul de tampón de lavado y a continuación se añadieron 100 \mul de cromógeno estabilizado. Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. El cromógeno estabilizado es una solución de substrato que cuando se segmentaba mediante HRP unida se volvía azul y por lo tanto puede verificarse en un lector de placas de microvaloración estándar. Se añadieron a continuación 100 \mul de solución de parada y la intensidad del color en los pocillos se midió a 450 nm usando un lector de placas SpectraMAX 340 de Molecular Devices. Típicamente, los compuestos se analizaron en una respuesta a la dosis de 7 puntos realizada por duplicado con una concentración de compuesto que varía de 20 \muM a 10 nM. Las concentraciones de A\beta (1-40) en las muestras se calcularon a partir de curvas estándar generadas de patrones que contenían una concentración conocida de péptido A\beta.
Los compuestos de la presente invención se probaron a lo largo de un período de 3 días. Cada día, la gamma-secretasa de Calbiochem "Inhibidor X" se incluía como un control. Este es un isóstero dipeptídico de hidroxietileno permeable para las células con una IC50 presentada de 50 nM (Nº de catálogo 565771).
Ejemplo 25 Ensayos en Animales Transgénicos para la Enfermedad de Alzheimer (AD) I. Animales transgénicos AD
Ratones transgénicos que sobreexpresan la isoforma de 659 aminoácidos de proteína precursora de beta-amiloide (Abeta) de Alzheimer humano que contiene una mutación Lys670 --> Asn, Met671 --> Leu (los ratones Tg2576 están disponibles comercialmente de Taconic, N.Y.) tenían aprendizaje y memoria normales en la referencia espacial y tareas de alternación a los tres meses de edad pero mostraban un deterioro en de 9 a 10 meses de edad. Un incremento de 5 veces en Abeta (1-40) y un incremento de 14 veces en Abeta (1-42/43) acompañaba a la aparición de estos déficits de comportamiento. Numerosas placas de Abeta que se teñían con colorante rojo Congo están presentes en estructuras corticales y límbicas de ratones con cantidades elevadas de Abeta. La aparición correlativa de anormalidades de comportamiento, bioquímicas y patológicas reminiscentes de la enfermedad de Alzheimer en estos ratones transgénicos sugiere nuevas oportunidades para explorar la patofisiología y la neurobiología de esta enfermedad. Véase Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science 4 de octubre de 1996; 274(5284):99-102.
Aunque los ratones Tg2576 se especifican en los modelos descritos aquí, debe entenderse que otros ratones transgénicos, disponibles tanto comercialmente como privadamente, son propensos a ser usados en dichos modelos.
II. Protocolo de ELISA para Beta-Amiloide
The Relationship between Ab and Memory in the Tg2576 Mouse Model of Alzheimer's Disease. The Journal of Neuroscience, 1 de marzo de 2002, 22(5): 1858-1867.
Hemicerebros congelados se extraen secuencialmente en una extracción en dos etapas [sonicación en (1) SDS al 2% y (2) ácido fórmico (FA) al 70%]. La última fracción se denomina Abnsol. Después de la sonicación las muestras se centrifugan a 100.000 x g durante 1 hora a 4ºC. El sobrenadante se retira y el nódulo se somete a sonicación con la siguiente solución. Extractos de cerebro se miden mediante ELISA tipo sándwich según se especifica previamente (Suzuki y otros, 1994; Gravina y otros, 1995). Se usan los siguientes sistemas: (1) captura con BAN-50 y detección con BA-27 o BC-05 o (2) captura con 3160 y detección con BA-27 o BC-05, ambos de los cuales detectan A\beta 1-40 y A\beta 1-42, respectivamente. La comparación directa de muchos cerebros de Tg2576 de ratones de todas las edades mostraba que las cantidades de A\beta40 y A\beta42 detectadas con ELISAs de captura con 3160 son esencialmente las mismas que cuando se usa BAN-50 para la captura. Los extractos de SDS al 10% se diluyen al menos 1:40 de modo que el ensayo podía realizarse en SDS al 0,05%. Diluciones mayores se corrigen para SDS de modo que también se ensayan en SDS al 0,5%. El extracto de FA se neutraliza mediante una dilución 1:20 en tampón de Tris-fosfato 1M, pH 8,0. El programa Softmax se usa para calcular fentomoles por mililitro comparando la absorbancia de la muestra con la absorbancia de concentraciones conocidas de A\beta1-40 y A\beta1-42 sintéticos en solución idéntica como las muestras, y estos valores se corrigen con el peso en húmedo del homogenado original que ha de expresarse finalmente como picomoles por gramo de peso en húmedo. En todos los casos, los tejidos no transgénicos se procesan de forma idéntica en paralelo con los tejidos transgénicos.
III. Prueba de Comportamiento de Ratones Transgénicos: Laberinto de Agua de Morris
El laberinto de agua se adapta a ratones Tg2576 en los antecedentes de la raza B6/SJL de una manera que permitía detectar y distinguir todas las fases de la pérdida de memoria. Este protocolo proporcionaba la sensibilidad, la especificidad y el intervalo dinámico necesarios para medir cambios que son sutiles en las primeras fases de la vida y notables en las últimas fases de la vida. La interpolación de sondas durante el entrenamiento proporcionaba sensibilidad. La adopción de criterios de inclusión para déficits de conducta daba especificidad. El entrenamiento daba extensivamente el intervalo dinámico. La asignación de puntuaciones de sondeo medias (MPSs), que es el porcentaje de tiempo medio empleado por un ratón en el cuadrante de la diana durante las experiencias de tres sondas, mejoraba la cuantificación del comportamiento cognitivo de ratones individuales para correlaciones con marcadores moleculares y proporcionaba una sola medida con un amplio intervalo dinámico. Los procedimientos para ratones Tg2576 en otros antecedentes de raza pueden necesitar ajustarse para diferencias específicas para la raza en los grados de déficits de aprendizaje y conducta. Véase The Relationship between Ab and Memory in the Tg2576 Mouse Model of Alzheimer's Disease. The Journal of Neuroscience, 1 de marzo de 2002, 22(5):1858-1867.
El laberinto de agua es un estanque circular de 1 ó 1,2 m lleno de agua a 25-27ºC y hecho opaco mediante la adición de pintura blanca atóxica. El estanque se pone en medio de entradas espaciales fijas que consisten en cortinas vistosamente decoradas y estanterías que contienen distintos objetos. Los ratones se ponen en un vaso de precipitados y suavemente se introducen en el agua de cara a la pared del estanque. Los ratones experimentan en primer lugar el entrenamiento de la plataforma visible durante 3 días consecutivos (ocho experiencias al día), nadando hasta una plataforma elevada (una superficie cuadrada de 12 x 12 cm^{2}) marcada con una meta de rallas blancas y negras. Los días de la plataforma visible se dividen en dos bloques de entrenamiento de cuatro experiencias para análisis estadísticos. Durante el entrenamiento de la plataforma visible, tanto la localización de la plataforma (NE, SE, SW o NW) como la posición de inicio (N, NE, E, SE, S, SW, W o NW, excluyendo las posiciones inmediatamente adyacentes a la plataforma) se varían pseudoaleatoriamente en cada experiencia. La pseudoaleatorización aseguraba que todas las posiciones se muestrearan antes de que se repitiera una posición dada. El entrenamiento de plataforma oculta se efectúa a lo largo de 9 días consecutivos (cuatro experiencias al día), en donde se deja que los ratones alcancen una plataforma sumergida 1,5 cm por debajo de la superficie del agua. Los ratones que no alcanzan la plataforma en 60 segundos se llevan a la plataforma con una paleta de salvamento metálica. Durante las experiencias en plataforma oculta, la localización de la plataforma permanecía constante (NE, SE, SW o NW) y los ratones entraban en el estanque en una de las siete posiciones seleccionadas pseudoaleatoriamente (N, NE, E, SE, S, SW, W o NW, excluyendo la posición inmediatamente adyacente a la plataforma). Después de cada experiencia con plataforma oculta, los ratones permanecían sobre la plataforma durante 30 segundos y se retiran de la plataforma y se devuelven a su jaula de alojamiento con la paleta de salvamento. Los ratones aprendían rápidamente a asociar la paleta con escaparse del estanque y por consiguiente se orientaban hacia o seguían la aparición de la paleta. La capacidad de los ratones para orientarse hacia o seguir la paleta de salvamento representaba medidas independientes de visión y atención. Al principio del día 4º, 7º y 10º del entrenamiento con plataforma oculta, se efectuó una experiencia de sondeo en la que la plataforma se retira del estanque y se deja que los ratones busquen la plataforma durante 60 segundos. Todas las experiencias se verificaron mediante una cámara montada directamente por encima del estanque y se registran y analizan usando un sistema de seguimiento computarizado.
La MPS se calcula para cada ratón y se usa para determinar la retención de la información espacial en el laberinto de agua de Morris. Integrando la información a partir de los sondeos intercalados, la MPS representa una medida de aprendizaje similar en concepto al índice de aprendizaje descrito previamente (Gallagher y otros, 1993), que muestrea la memoria en diferentes estadios de aprendizaje. Resultados estadísticos similares se encuentran con MPS, el índice de aprendizaje y la puntuación de aprendizaje (la suma ponderada del porcentaje de tiempo empleado en el cuadrante diana durante experiencias de sondeo) y se eligió representar los presentes datos usando MPS debido a la facilidad de representación.
Después de la prueba, un subconjunto de cada grupo de ratones es sometido a eutanasia y el hemicerebro derecho se congela en nitrógeno líquido para medidas de A\beta. Todos los cerebros se analizaron de una manera codificada.
IV. Prueba de Comportamiento de Ratones Transgénicos: Actividad Exploratoria, Ansiedad y Coordinación Motriz
Véase Transgenic mice expressing the betaAPP695SWE mutation: effects on exploratory activity, anxiety, and motor coordination. Brain Res, 4 de julio de 2003; 977(1):38-45.
La alternación espontánea se prueba en un laberinto en forma de T hecho de compuesto acrílico blanco. El laberinto consistía en un tronco central (longitud: 30 cm) flanqueado en cada lado por dos brazos (longitud: 30 cm). La anchura del laberinto es 9 cm y cada pared tiene 20 cm de altura. En la experiencia inicial, los ratones se pusieron en el tronco del laberinto en forma de T con el brazo derecho bloqueado por una barrera de plástico (elección forzada). Después de entrar en el brazo disponible, los ratones se mantienen en él durante 60 segundos cerrando la barrera detrás de ellos. Los ratones se retienen a continuación y después de retirar la barrera se ponen inmediatamente de nuevo en el tronco para una experiencia de elección libre, en la que los ratones podían explorar el brazo opuesto o el mismo (criterio de las cuatro patas). En los 9 días siguientes, se repite el mismo procedimiento de dos experiencias, excepto que el brazo bloqueado en la primera experiencia se cambia de la derecha los días impares a la izquierda los días pares. El número de alternaciones y las latencias antes de responder durante la experiencia de elección se mide, con un período de corte de 1 minuto por experiencia. Si los ratones no habían respondido en 1 minuto y están lejos del punto de elección, se empujan brevemente desde detrás, habitualmente no más de una vez, de modo que pudiera registrarse una respuesta en cada experiencia.
La actividad motriz se mide en la zona abierta, hecha de material acrílico blanco con una superficie de 50 x 50 cm y paredes de 38 cm de alto. La actividad en las zonas central y periférica se registra mediante una cámara de video elevada y se analiza. La zona central tiene conformación cuadrada y empieza a una distancia de 25 cm desde cada pared. Los ratones se ponen en una esquina de la zona abierta durante tres sesiones de 5 minutos al día. Se miden la distancia recorrida y el tiempo transcurrido en reposo (<2 cm/s), moviéndose lentamente (2-5 cm/s) o moviéndose rápidamente (>5 cm/s), en cada zona, así como el tiempo transcurrido en la periferia y el centro del aparato.
El laberinto en forma de signo más elevado consistía en cuatro brazos (longitud: 70 cm, anchura: 10 cm; altura desde el suelo: 40 cm) en una forma de cruz y una región central (10 cm^{2}). Dos de los brazos están encerrados en tres lados por paredes (altura: 10 cm) mientras que los otros dos están abiertos, excepto por un reborde mínimo (altura: 0,5 cm) usado para minimizar las caídas. Los dos brazos encerrados o abiertos están frente a frente entre sí. Los ratones se ponen en la región central y el número de entradas y duraciones en brazos cerrados y abiertos se miden durante dos sesiones diarias de 5 minutos con el mismo equipo de seguimiento de video usado en la prueba anterior. Las entradas en los brazos abiertos/totales y las relaciones de duración se calculan a continuación. En las raras ocasiones en las que los ratones caían de un brazo abierto, el tiempo registrado se detiene y los ratones se ponían de nuevo en la posición exacta de la que caían. Después de cada sesión de alternación espontánea, zona abierta y prueba en laberinto en forma de signo más, el aparato se limpia frotando con un paño húmedo y se seca antes del inicio de la siguiente experiencia para reducir los posibles efectos de entradas debidas al olor.
La viga estacionaria se construye de plástico, con un diámetro de 2,5 cm y una longitud de 110 cm. La viga se cubre mediante una capa de cinta de protección blanca para asegurar un agarre firme y se divide en 11 segmentos mediante trazos lineales. La viga se pone a una altura de 45 cm de un suelo cubierto de estera, que servía para amortiguar las caídas y de ese modo prevenir lesiones en los ratones. Una pared de cartulina se inserta en el extremo de la viga para evitar que los ratones escapen. Una experiencia comenzaba poniendo los ratones en el segmento medio. El número de segmentos cruzados (criterio de las cuatro patas), las latencias antes de la caída y el número de caídas se miden en una sola sesión de cuatro experiencias. El período de corte es 1 minuto por experiencia y el intervalo entre experiencias 15 minutos.
Se construye el Rotorod (Modelo 7650, Stoelting, Wood Dale, IL, EE.UU. de A.) acelerador de plástico estriado (diámetro: 3 cm). La viga se pone a una altura de 13,5 cm del nivel del suelo y se separa en cinco secciones (anchura: 5,5 cm) mediante una barrera de plástico. Dando la espalda al experimentador, los ratones se ponen sobre la parte superior del rodillo que ya da vueltas (4 rpm) en la orientación opuesta a su movimiento, de modo que las caídas podían evitarse mediante locomoción hacia delante. El Rotorod se aceleraba gradualmente y uniformemente desde 4 a 40 rpm durante cada experiencia de 5 minutos. Las latencias antes de la caída se miden para tres sesiones diarias de cuatro experiencias, con un intervalo entre experiencias de 15 minutos. Siempre que los ratones se aferren al rodillo sin moverse (rotación pasiva) durante dos revoluciones completas sucesivas, se considera que han caído. Puesto que ningún ratón parecía saltar deliberadamente, podía obtenerse una estimación válida de la habilidad motriz. Después del entrenamiento, se evalúa la presencia de diversos reflejos normales y patológicos.
V. Determinación de la Acumulación de beta-Amiloide Cerebral Mediante Inmunohistoquímica
Véase Accelerated plaque accumulation, associative learning deficits, and upregulation of alpha 7 nicotinic receptor protein in transgenic mice co-expressing mutant human presenilin 1 and amyloid precursor proteins. J Biol Chem. 21 de junio de 2002; 277(25):22768-80.
Los ratones se someten a perfusión cardíaca con solución salina taponada con fosfato (NaHPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) y se fijan con paraformaldehído al 4%. Secciones cerebrales congeladas se seccionan coronalmente con un grosor de 12 \mum usando un criostato, montado sobre portaobjetos de microscopio ProbeOn Plus (Fisher Scientific) y se seca al aire. Inmediatamente antes de teñir, las secciones cerebrales se fijan con acetona. Las secciones de tejido se incuban durante 30 minutos en H_{2}O_{2} al 0,3% y suero caprino normal al 0,3%, se lavan en solución salina tamponada con fosfato y se incuban con suero caprino normal al 1,5% en solución salina tamponada con fosfato durante 30 minutos. Las secciones de cerebro se incuban a continuación con anti-anticuerpo A\beta 6E10 (1:1000, Senetik) teñido con anti-IgG de ratón biotinilada (1:200, Vector Laboratories) y se inmunodetectan con Vectastain ABC Reagent (1:100, Vector Laboratories). Las secciones se contratiñen con hematoxilina.
Aunque un número de modalidades de esta invención se describe anteriormente aquí, es evidente que los ejemplos básicos pueden alterarse para proporcionar otras modalidades que utilizan los compuestos y los métodos de esta invención. Por lo tanto, será apreciado que el alcance de esta invención ha de estar definido por las reivindicaciones adjuntas en lugar de por las modalidades específicas que se han representado a modo de ejemplo.

Claims (15)

1. Un compuesto de fórmula I:
9
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
W es nitrógeno;
R^{1} se selecciona de hidrógeno o flúor; y
R^{y} es un grupo alifático C_{1-4}, en donde dicho grupo alifático es una cadena hidrocarbonada C_{1}-C_{4} de cadena lineal o ramificada que está completamente saturada o que contiene una o más unidades de insaturación, o un hidrocarburo C_{3}-C_{4} monocíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático, que tiene un solo punto de ligazón al resto de la molécula.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R^{y} se selecciona de metilo, etilo, ciclopropilo, terc-butilo o isopropilo, preferiblemente se selecciona de metilo, ciclopropilo y terc-butilo.
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que R^{1} es hidrógeno o flúor.
4. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
10 
\vskip1.000000\baselineskip
11
12
5. Una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende adicionalmente un agente terapéutico adicional seleccionado de un tratamiento para la enfermedad de Alzheimer (AD), un tratamiento para la enfermedad de Parkinson, un agente para tratar la esclerosis múltiple (MS), un tratamiento para el asma, un agente antiinflamatorio, un agente inmunomodulador o inmunosupresor, un factor neurotrófico, un agente para tratar la apoplejía, un agente para tratar una enfermedad cardiovascular, un antidepresivo, un agente antipsicótico o un agente para tratar la diabetes.
7. Un método para inhibir actividad de quinasa GSK3 en una muestra biológica, que comprende las etapas de poner en contacto dicha muestra biológica con:
a) una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6; o
b) un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 o un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso terapéutico, especialmente para el uso en la inhibición de la actividad de quinasa GSK3 en un paciente.
9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5, para el uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, un trastorno metabólico, un trastorno psiquiátrico, diabetes, un trastorno angiogénico, tauopotía, un trastorno neurológico o neurodegenerativo, una lesión de la médula espinal, glaucoma, calvicie o una enfermedad cardiovascular.
10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicha enfermedad, trastorno o condición se selecciona de alergia, asma, diabetes, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, demencia asociada con el SIDA, esclerosis lateral amiotrófica (ALS, enfermedad de Lou Gehrig), esclerosis múltiple (MS), una lesión debida a un trauma de cabeza, esquizofrenia, ansiedad, trastorno bipolar, tauopotía, una lesión en la médula espinal o los nervios periféricos, infarto de miocardio, hipertrofia de cardiomiocitos, glaucoma, trastorno de déficit de atención (ADD), depresión, un trastorno del sueño, reperfusión/isquemia, apoplejía, un trastorno angiogénico o calvicie.
11. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicha enfermedad, trastorno o condición es apoplejía.
12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicha enfermedad, trastorno o condición es enfermedad de Alzheimer.
13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicho trastorno es un trastorno neurológico o neurodegenerativo.
14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, para usar en la disminución de la movilidad del esperma.
15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 9, para usar con un agente terapéutico adicional seleccionado de un agente para tratar la enfermedad de Alzheimer (AD), un agente para tratar la enfermedad de Parkinson, un agente para tratar la esclerosis múltiple (MS), un agente para tratar el asma, un agente antiinflamatorio, un agente inmunomodulador o inmunosupresor, un factor neurotrófico, un agente para tratar la apoplejía, un agente para tratar una enfermedad cardiovascular, un antidepresivo, un agente antipsicótico o un agente para tratar la diabetes.
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