ES2273338T3 - Metodo para el tratamiento de la diabetes mellitus usando kfg. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBEN UN METODO Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS PARA EL USO DEL FACTOR DE CRECIMIENTO QUERATINOCITO PARA EL TRATAMIENTO DE LA DIABETES DE MAMIFEROS.
Description
Método para tratar la diabetes mellitus usando
KFG.
La presente invención se refiere a la aplicación
del factor de crecimiento de queratinocitos para preparar un
medicamento para tratar o prevenir la aparición de diabetes
mellitus.
El factor de crecimiento de queratinocitos (KGF)
es un factor de crecimiento específico para células epiteliales que
se identificó por primera vez en medio condicionado de una línea
celular de fibroblastos de pulmón embrionarios humanos. Rubin et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:802-806
(1989). Se ha detectado la expresión de ARN mensajero para KGF en
diversas líneas celulares de fibroblastos estromales de tejidos
epiteliales en diversas fases de desarrollo. El transcripto de KGF
era también evidente en ARN extraído del riñón de adultos normales y
órganos del tracto gastrointestinal. Finch et al., Science
245:752-755 (1989). La prueba de que KGF se secreta
de fibroblastos en cultivo y se expresa in vivo en la dermis
pero no en la epidermis indica que KGF puede ser un efector
paracrino normal importante de la proliferación de queratinocitos.
Los estudios han mostrado que KGF es tan potente como EGF en la
estimulación de la proliferación de queratinocitos humanos primarios
o secundarios en cultivos de tejidos. Marchese et al., J.
Cell. Phys. 144:326-332 (1990).
Los estudios ex vivo e in vivo en
animales adultos normales han mostrado que KGF produce cambios en la
morfogénesis del folículo piloso, en la proliferación de hepatocitos
y en la proliferación de células epiteliales en el pulmón, corazón,
páncreas, estómago, intestino delgado e intestino grueso. Panos
et al., J. Clin. Invest. 92:969-977
(1993); Ulich et al., Am J. Path.
144:862-868 (1994); Yi et al., Am. J.
Path. 145:80-85 (1994); y Ulich et
al., J. Clin. Invest. 93:1298-1306 (1994). El
papel de KGF en el desarrollo embrionario o neonatal no se ha
estudiado con detalle; sin embargo, se ha documentado que KGF es un
importante mediador del desarrollo de la vesícula seminal en el
ratón recién nacido. Alarid et al., P.N.A.S.
91:1074-1078 (1994).
La solicitud de patente PCT publicada WO
90/08771 describe la purificación de KGF a partir de medio
condicionado de una línea celular de fibroblastos embrionarios
humanos, la secuencia de aminoácidos parcial de KGF purificado, la
clonación del gen y la expresión del gen en células bacterianas para
producir KHG recombinante biológicamente activo. La publicación
mencionada anteriormente describe que puede usarse KGF o
polipéptidos similares a KGF como agentes de curación de heridas
para heridas de quemaduras o para estimular tejido de córnea
transplantado. De hecho, se ha demostrado que KGF aumenta la
re-epitelización y aumenta el grosor del epitelio
cuando se aplica KGF recombinante de forma tópica a heridas
inducidas quirúrgicamente en la oreja del conejo o en la piel
porcina. Pierce et al., J. Exp. Med.
179:831-840 (1994); y
Staino-Coico et al., J. Exp. Med. 178:
865-878 (1993).
El documento EP 0303233 describe la proteína reg
humana que es capaz de regenerar las células de los islotes B del
páncreas que producen insulina. El documento British Med. Bull.,
Vol. 45, (1989), p. 438-452 es un análisis sobre
factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) que entre otros
describe el papel de FGF en la diabetes.
Se ha hecho ahora el descubrimiento de que KGF
es útil para tratar el trastorno médico conocido como diabetes.
La Figura 1 es un gráfico de barras que describe
los efectos de KGF en ratas posteriores a la administración
subcutánea diaria a una dosis de 5 miligramos por kilogramo de peso
corporal (mg/kg) durante siete días. Se administró estreptozotocina
(55 mg/kg) una vez de forma intravenosa dos días después del inicio
del tratamiento con KGF. El grupo de ratas diabéticas tratadas con
KGF se muestra en la mitad derecha de la figura, por encima de la
leyenda "Estrep + KGF". Los grupos de control se representan a
la izquierda y derecha de ese: tratamiento durante siete días con
solución de cloruro sódico y sin inducción de diabetes (``NaCl''),
tratamiento durante siete días con solución de cloruro sódico antes
y después de la diabetes inducida por estreptozotocina
("Estrep"), y tratamiento durante siete días con KGF y sin
inducción de diabetes ("KGF"). Se muestran los niveles de
glucosa sanguínea sin ayuno en miligramos por decilitro (mg/dl) en
el eje vertical, como se mide en el quinto día después de la
inducción de la diabetes (es decir, el séptimo día después de que
comenzase el tratamiento con KGF o cloruro sódico). Había cuatro
ratas por grupo.
La Figura 2 es un gráfico de barras que describe
el efecto de KGF en el mismo modelo de rata sobre otras medidas
fisiológicas que se relacionan con la diabetes. Se muestran sobre el
eje vertical, la mitad izquierda y la mitad derecha,
respectivamente, los niveles de glucosa en la orina en ayunas en
mg/dl y la producción de orina en ayunas en mililitros excretados en
veinticuatro horas en el séptimo día del tratamiento con KGF o
cloruro sódico. Las leyendas ("NaCl"), "Estrep", "Estrep
+ KGF" y "KGF") tienen los mismos significados que en la
Figura 1. Había cuatro ratas por grupo.
La Figura 3 describe los niveles de glucosa
sanguínea sin ayuno en mg/dl en el mismo modelo de rata de diabetes
durante un periodo de ocho días posteriores a la inducción de la
diabetes. Algunos animales se trataron con una dosis subcutánea
diaria (3 mg/kg) de KGF comenzando en el día uno después de la
inducción de la enfermedad ("Estrep + KGF"), mientras que otros
se pre- y post-trataron con solución de cloruro
sódico como un control ("Estrep + NACL"). Un grupo de animales
no diabéticos tratados con cloruro sódico ("NaCl") otra vez
sirvió como un control adicional. Había seis ratas por grupo.
La Figura 4 describe los niveles de glucosa en
orina en ayuno en mg/dl para el mismo modelo de rata durante un
periodo de seis días después de la inducción de la diabetes, en este
caso comenzando en el segundo día después de la inducción de la
enfermedad. El tratamiento de KGF comenzó un día después de la
inducción de la diabetes. Los símbolos del gráfico designan los
mismos tres grupos de ensayo que en la Figura 3. Había seis ratas
por grupo.
La Figura 5 muestra la producción de orina, como
milímetros por periodo de veinticuatro horas, de los mismos grupos
de ensayo que en las Figuras 3 y 4, medida en los días 2, 5, 20 y 8
posteriores a la inducción de la diabetes. Los símbolos del gráfico
son los mismos que en las Figuras 3 y 4. Había seis ratas por
grupo.
La Figura 6 muestra el consumo de agua medio
para cada grupo de ratas del experimento. Se dio agua a las ratas a
voluntad y se midió el consumo como el volumen bebido en milímetros
en veinticuatro horas. Había seis ratas por grupo.
La Figura 7 muestra el efecto de un análogo de
KGF sobre la diabetes inducida por estreptozotocina en ratas
Sprague-Dawley.
La Figura 8 muestra las secuencias de
nucleótidos (SEC ID Nº: 1) y aminoácidos (SEC ID Nº: 2) del KGF
nativo (los nucleótidos que codifican la forma madura de KGF nativo
se representan por las bases 201 a 684 de la SEC ID Nº: 1 y la forma
madura de KGF se representa por los restos de aminoácidos 32 a 194
de la SEC ID Nº:2.
La presente invención se refiere al uso de KGF
nativo o una muteína del mismo que difiere por deleción, sustitución
y/o inserción de al menos un aminoácido del KGF nativo y que tiene
sustancialmente la capacidad del KGF nativo de estimular la
proliferación de células epiteliales que no son fibroblastos para
preparar un medicamento para el tratamiento de la diabetes
mellitus.
El uso de la invención puede practicarse usando
cualquier forma del factor de crecimiento de queratinocitos como se
ha definido anteriormente que tenga alguna o todas de las
propiedades biológicas del polipéptido que se encuentra de forma
natural como se ha definido anteriormente. Tales formas incluyen las
que se aíslan y se purifican a partir de fluidos biológicos, células
y tejidos, o que derivan por síntesis química o por medios
recombinantes por expresión en células hospedadoras heterólogas que
se han transformado con el ADN o ARN codificante. Se describe un
proceso recombinante para la producción del factor de crecimiento de
queratinocitos en el documento previamente mencionado WO 90/08771.
Pueden adaptarse otros procedimientos conocidos por los
especialistas en la técnica para el mismo propósito.
A modo de ilustración, la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína KGF, o una porción de la misma,
puede insertarse dentro de un vector de expresión apropiado, es
decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la
transcripción y traducción de la secuencia que codifica la proteína
insertada. Pueden suministrarse también las señales de transcripción
y traducción necesarias con el gen de KGF nativo y/o sus regiones
flanqueantes. Pueden utilizarse una diversidad de sistemas
hospedador-vector para expresar la secuencia
codificante de la proteína. Estos incluyen pero sin limitación
sistemas de células de mamíferos infectadas con virus (por ejemplo,
virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insectos
infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus), microorganismos
tales como levaduras que contienen vectores de levaduras, o
bacterias transformadas con ADN de bacteriófagos, ADN de plásmidos o
ADN de cósmidos. Los elementos de expresión de estos vectores varían
en sus resistencias y especificidades. Dependiendo del sistema
hospedador-vector utilizado, puede usarse uno
cualquiera de una variedad de elementos de transcripción y
traducción adecuados.
Puede usarse cualquiera de los métodos descritos
previamente para la inserción de fragmentos nucleotídicos dentro de
un vector para construir vectores de expresión que contengan un gen
quimérico compuesto por señales de control
transcripcional/traduccional apropiadas y las secuencias que
codifican la proteína. Estos métodos pueden incluir técnicas de ADN
recombinante in vitro y sintéticas y recombinaciones in
vivo (recombinación genética). La expresión de una secuencia de
ácidos nucleicos que codifica la proteína KGF o un fragmento
peptídico puede regularse con una segunda secuencia de ácidos
nucleicos de forma que la proteína KGF o el péptido se expresen en
un hospedador transformado con la molécula de ADN recombinante. Por
ejemplo, puede controlarse la expresión de KGF por cualquier
elemento promotor/potenciador conocido en la técnica. Los promotores
que pueden usarse para controlar la expresión de KGF incluyen, pero
sin limitación, la región promotora temprana de SV40, el promotor
contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma
de Rous, el promotor de la timidina quinasa del herpes, las
secuencias reguladoras del gene de la metalotienina, vectores de
expresión procarióticos tales como el promotor de la
\beta-lactamasa, o el promotor tac, vectores de
expresión de plantas que comprenden la región promotora de la
nopalina sintetasa Herrera-Estrella et al., o
el promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor, y el
promotor para la enzima fotosintética ribulosa bifosfato
carboxilasa, elementos promotores de levaduras y otros hongos tales
como el promotor de Gal 4, el promotor de ADC (alcohol
deshidrogenasa), el promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), el
promotor de la fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de
control transcripcional animal, que muestran especificidad de tejido
y que se han utilizado en animales transgénicos: región de control
del gen de la elastasa I que es activo en células acinares
pancreáticas, región de control del gen de la insulina que es activo
en células pancreáticas beta, región de control del gen de la
inmunoglobulina que es activo en células linfoides Grosschedl et
al., región de control del virus del tumor mamario de ratón que
es activo en testículos, mamas, células linfoides y mastocitos Leder
et al., región de control del gen de la albúmina que es
activo en hígado, región de control del gen de la fetoproteína alfa
que es activo en el hígado, región de control del gen de la
1-antitripsina alfa que es activo en el hígado,
región de control del gen de la beta-globina que es
activo en células mieloides, región de control del gen de la
proteína básica de la mielina que es activo en células
oligodendrocíticas del cerebro, región de control del gen de la
cadena-2 ligera de la miosina que es activo en el
músculo esquelético, y región de control del gen de la hormona
liberadora gonadotrópica que es activo en el hipotálamo.
Los vectores de expresión que contienen insertos
del gen de KGF pueden identificarse por hibridación
ADN-ADN, presencia o ausencia de funciones del gen
"marcador", y expresión de las secuencias insertadas, como será
evidente y será familiar para los especialistas en la técnica.
Pueden usarse varios métodos conocidos en la
técnica para propagar el gen KGF. Una vez que se establece un
sistema de hospedador adecuado y condiciones de crecimiento
adecuadas, pueden propagarse y prepararse en cantidad los vectores
de expresión recombinantes.
Además, puede elegirse una cepa de célula
hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o
modifique y procese el producto génico de la manera específica
deseada. Puede elevarse la expresión de ciertos promotores en
presencia de ciertos inductores. Por lo tanto, puede controlarse la
expresión de la proteína KGF modificada genéticamente. Además, las
células hospedadoras diferentes tienen mecanismos característicos y
específicos para el procesamiento traduccional y postraduccional y
para la modificación de proteínas (por ejemplo, glicosilación, gamma
carboxilación de restos de ácido glutámico, escisión proteolítica).
Pueden elegirse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados
para asegurar la modificación y el procesamiento deseados de las
proteínas extrañas expresadas.
Debe entenderse que las expresiones "factor de
crecimiento de queratinocitos" y "KGF" como se emplean en
esta descripción pretenden incluir y significar de manera
intercambiable, a menos que se indique otra cosa, proteínas de KGF
nativas y análogas a KGF (o "muteínas") caracterizadas por una
secuencia peptídica sustancialmente igual que la secuencia peptídica
del KGF nativo y porque mantienen la misma o toda la actividad
biológica del KGF nativo, particularmente la proliferación de
células epiteliales que no son fibroblastos (por ejemplo, mostrando
al menos aproximadamente estimulación 500 veces mayor de células de
queratinocitos BALB/MK que la de células de fibroblastos NIH/3T3, y
estimulación al menos aproximadamente 50 veces mayor de células de
queratinocitos BALB/MK que para células epiteliales BS/589 o para
células epiteliales CC1208, como se determina por incorporación de
H-timidina). Por "caracterizado por una secuencia
peptídica sustancialmente igual que la secuencia peptídica de KGF
nativa" se quiere decir una secuencia peptídica que está
codificada por una secuencia de ADN capaz de hibridar con los
nucleótidos 201 a 684 de la SEC ID Nº: 1, preferiblemente en
condiciones de hibridación rigurosas.
La determinación de una posición de un
aminoácido correspondiente entre dos secuencias de aminoácidos puede
determinarse alineando las dos secuencias para maximizar los
emparejamientos de restos, incluyendo cambio de los extremos amino
y/o carboxilo, introducción de huecos como se requiera y/o deleción
de restos presentes como insertos en el candidato. Pueden realizarse
búsquedas en bases de datos, análisis de secuencias y manipulaciones
usando uno de los programas de algoritmos de detección de la
homología/identidad de secuencia bien conocidos y usados de manera
rutinaria (por ejemplo, Pearson y Lipman (1988), Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 85:2444-2448; Altschul
et al. (1990), J. Mol. Biol.,
215:403-410; Lipman y Pearson (1985),
Science, 222:1435 o Devereux et al. (1984), Nuc.
Acids Res., 12:387-395).
Las condiciones rigurosas, en el contexto de
hibridación, serán condiciones combinadas rigurosas de sal,
temperatura, disolventes orgánicos y otros parámetros típicamente
controlados en reacciones de hibridación. Son condiciones de
hibridación rigurosas ejemplares hibridación en SSC 4x a
62-67ºC., seguido por lavado en SSC 0,1x a
62-67ºC. durante aproximadamente una hora. Como
alternativa, son condiciones de hibridación rigurosas ejemplares
hibridación en formamida al 45-55%, SSC 4x a
40-45ºC [Véase, el documento de T. Maniatis et
al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring
Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a 389].
Por lo tanto, las proteínas incluyen variaciones
alélicas, o deleción o deleciones, sustitución o sustituciones o
inserción o inserciones de aminoácidos, incluyendo fragmentos,
moléculas quiméricas o híbridas de KGF nativo. Un ejemplo de KGF
incluye proteínas que tienen restos correspondientes a Cys^{1} y
Cys^{15} como se denominan en la reivindicación 5 reemplazados o
delecionados, teniendo la molécula resultante estabilidad mejorada
comparada con la molécula de origen. Otro ejemplo de KGF incluye
polipéptidos de cambio de carga en los que uno o más de los restos
de aminoácidos 41-154 del KGF nativo
(preferiblemente los restos Arg^{41}, Gln^{43}, Lys^{55},
Lys^{95}, Lys^{128}, Asn^{137}, Gln^{138}, Lys^{139},
Arg^{144}, Lys^{147}, Gln^{152}, Lys^{153} o Thr^{154})
están delecionados o sustituidos con un resto neutro o un resto
cargado de forma negativa para lograr una proteína con una carga
positiva reducida. Un ejemplo adicional más de KGF incluye proteínas
generadas sustituyendo al menos un aminoácido que tiene un potencial
de formación de bucles más alto por al menos un aminoácido dentro de
una región que forma bucles de
Asn^{115}-His^{116}-Tyr^{117}-Asn^{118}-Thr^{119}
del KGF nativo. Un ejemplo adicional más incluye proteínas que
tienen una o más sustituciones, deleciones o adiciones de
aminoácidos dentro de una región de 123-133
(aminoácidos 154-164 de la SEC ID Nº: 2) del KGF
nativo; estas proteínas tienen una actividad agonística o
antagonística.
Las proteínas específicamente descritas incluyen
las siguientes moléculas de KGF (denominadas por el resto encontrado
en esa posición en la proteína madura (secuencia de señal negativa)
expuesta en la SEC ID Nº 2, seguido por esa posición de aminoácido
en paréntesis y después el resto sustituido o "-" para designar
una deleción): C(1, 15)S,
\DeltaN15-\DeltaN24,
\DeltaN3/C(15)S, \DeltaN3/C(15)-,
\DeltaN8/C(15)S, \DeltaN8/C(15)-,
C(1,15)S/R(144)E, C(1,
15)S/R(144)Q,
\DeltaN23/R(144)Q, C(1, 15, 40)S,
C(1, 15, 102)S, C(1, 15, 102, 106)S,
\DeltaN23/N(137)E,
\DeltaN23/K(139)E,
\DeltaN23/K(139)Q,
\DeltaN23/R(144)A,
\DeltaN23/R(144)E,
\DeltaN23/R(144)L, \Delta23/K(147)E,
\DeltaN23/K(147)Q,
\DeltaN23/K(153)E,
\DeltaN23/K(153)Q,
\DeltaN23/Q(152)E/K(153)E;
R(144)Q y H(116)G.
Para aplicación práctica en tratamiento
terapéutico, puede formularse KGF en composiciones farmacéuticas
para administración por cualquier medio convencional, incluyendo
pero sin limitación administración parenteral, tal como inyección
subcutánea, intravenosa o intramuscular. Estas formulaciones
convencionales incluirían más probablemente sales tampón adecuadas,
agentes conservantes y estabilizantes para una formulación líquida o
sales tampón adecuadas, agentes estabilizantes, agentes conservantes
y de masa típicos para una formulación liofilizada. Es también
posible que KGF pueda administrarse en una forma de liberación
lenta, por depósito intradérmico, subcutáneo o
intra-abdominal. Estas formas de liberación lenta de
KGF pueden formularse usando métodos convencionales dentro de la
habilidad de los entendidos en la técnica. Los regímenes de
administración más prácticos para KGF puede utilizarlos el paciente
en casa usando inyección subcutánea o administración intradérmica, o
el médico usando una formulación de liberación lenta a largo plazo
implantada de manera subcutánea o en la cavidad peritoneal.
El régimen de dosificación para KGF puede
determinarse empíricamente por el practicante especialista. En
general, se anticipa que KGF será efectivo en cantidades de
aproximadamente 0,001 a aproximadamente 10 miligramos por kilogramo
de peso corporal (del paciente) por día, y preferiblemente de
aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5 mg/kg/día. El régimen
terapéutico puede incluir inyecciones únicas o repetidas, o una
dosis baja de KGF liberada lentamente de forma continua, dependiendo
del tipo y gravedad de la enfermedad de cada paciente. El curso
terapéutico del tratamiento con KGF debe producir suficiente función
de la célula beta pancreática para normalizar los niveles de glucosa
sanguínea durante las demandas metabólicas variables, evitando
además la hipoglucemia frecuente o
profunda.
profunda.
El objetivo es reponer la función de las células
de los islotes de pacientes de diabetes Tipo I diagnosticada para
evitar la necesidad de requerimientos de insulina exógena
constantes. Los pacientes con diabetes Tipo I recién diagnosticada,
en los cuales se mantiene la función de las células de los islotes,
serían candidatos para la terapia con KGF. Puede usarse KGF para
mantener la función de los islotes de tales pacientes para mejorar,
retrasar o evitar la manifestación permanente de la enfermedad. Se
cree que la diabetes Tipo I es una enfermedad autoinmune y se usa
terapia inmunosupresora para su tratamiento. Puede usarse la terapia
con KGF de acuerdo con esta invención junto o en combinación con
inmunosupresores para el tratamiento de la enfermedad, incluyendo
como un accesorio en el marco de transplante de células de los
islotes. La invención se ilustra además con referencia a la
siguiente
solicitud.
solicitud.
Los materiales de ensayo usados en los
siguientes estudios in vivo fueron, como se ha indicado
específicamente para KGF de secuencia nativa (que se encuentra de
manera natural), un análogo de KGF en el que los restos de cisteína
en las posiciones 1-15 de la secuencia de
aminoácidos nativa se habían reemplazado por serina usando técnicas
convencionales de mutagénesis dirigida al sitio (es decir,
C(1, 15)S) y un análogo de KGF que tiene una deleción
de los primeros 23 aminoácidos del N-terminal de KGF
nativo usando técnicas convencionales (es decir, \DeltaN23).
Todas las proteínas se produjeron por expresión recombinante en
E. coli y se purificaron hasta la homogeneidad, y cada una de
ellas contenía un resto de metionina (Met^{-1}) en el
N-terminal. Cada proteína se administró como una
formulación subcutánea. Los experimentos previos demostraron que
estas proteínas tenían actividades comparables en ratas adultas
cuando se administraban sistemáticamente. El KGF de secuencia nativa
y los análogos tenían cada uno actividades comparables en las ratas
diabéticas y no diabéticas usadas en los siguientes estudios.
Se han usado clásicamente modelos de diabetes
mellitus inducida químicamente en diversas especies animales para
estudiar la enfermedad y su tratamiento. La estreptozotocina induce
la diabetes en el ratón, rata, hámster, perro y mono aunque se han
utilizado más los estudios en ratas y ratones. Junod et al.,
Proc. Soc. Exp. Pio. Med 126:210.205 (1967); Rerup,
Pharm. Rev. 22:485-518 (1970); Rossini
et al., P.N.A.S. 74:2485-2489 (19977);
y Ar'Rajab y Ahren, Pancreas 8:50-57
(1993). En ratas, dosis de estreptozotocina de 45 a 70 mg/kg como
una dosis intravenosa única inducen la enfermedad estacionaria. Las
dosis por debajo de 45 mg/kg inducen un estado de enfermedad
transitorio que es reversible. Dentro de un día de la inyección de
estreptozotocina, se induce el estado hiperglucémico. Los niveles de
insulina sanguínea se mantienen esencialmente sin cambios comparados
con ratas normales; sin embargo, el contenido total de insulina y
péptido C en el páncreas disminuye seriamente. Las ratas manifiestan
los signos y síntomas clásicos de diabetes en humanos: niveles de
glucosa sanguínea aumentados (hiperglucemia), glucosa en orina
(glucosuria), sed aumentada (polidipsia), micción aumentada
(poliuria), apetito aumentado (hiperfagia).
Los estudios descritos en esta descripción se
realizaron con el modelo de diabetes inducida por estreptozotocina
en ratas Sprague-Dawley. Se usaron ratas macho que
pesaban 200-260 gramos en el inicio del estudio. Se
indujo la diabetes con una inyección intravenosa única de
estreptozotocina a 50 mg de estreptozotocina en tampón de citrato
sódico por kg de peso corporal. Las ratas de control no diabéticas
recibieron una inyección intravenosa única de tampón de citrato
sódico para propósitos de control. Se administró KGF diariamente
como una inyección subcutánea. La dosis de KGF era de 3 ó 5
mg/kg/día, dependiendo del experimento. En el primer experimento, la
terapia con KGF se inició dos días antes de que se indujera la
diabetes y continuó después de la inducción de la diabetes durante
un total de ocho inyecciones. En el segundo y tercer experimento, se
inició la terapia con KGF administrado de forma subcutánea un día
después de la inducción de la diabetes con estreptozotocina. En el
cuarto experimento se inició un curso de 7 días de terapia con KGF 7
días después del tratamiento con estreptozotocina y se siguió a los
animales después durante 12 semanas adicionales. En todos los
experimentos, excepto para el cuarto experimento, se usaron los
niveles de glucosa sanguínea, los niveles de glucosa en la orina y
el volumen de orina como criterios de valoración para el análisis.
Adicionalmente, se midieron el consumo de agua, los niveles de
péptido C en la orina o el contenido en insulina y en péptido C
pancreático total en algunos experimentos. En el cuarto experimento,
el único criterio de valoración valorado fue la glucosa
sanguínea.
Debido a que una gran fracción de insulina la
retira el hígado de la circulación, la medida de las concentraciones
de insulina periféricas reflejan los acontecimientos del metabolismo
post-hepático en lugar de la secreción de insulina
por el páncreas. Por lo tanto, se hacen a menudo medidas del péptido
C y se usan como un marcador periférico de la secreción de insulina.
El péptido C se produce por el procesamiento de
pro-insulina a insulina. La insulina y el péptido C
se secretan desde las células beta en cantidades equimolares, y sólo
una pequeña cantidad de péptido C la extrae el hígado.
Primer estudio: usando el modelo de diabetes
descrito, se evaluó la eficacia de KGF para tratar la diabetes
usando los siguientes cuatro grupos de ratas de ensayo:
1. Ratas de control (no diabéticas) pre- y
post-tratadas con solución de cloruro sódico
administrada de manera subcutánea, sin estreptozotocina;
2. Ratas convertidas en diabéticas con 50 mg/kg
de estreptozotocina administrados de manera intravenosa, pre- y
post-tratadas con solución de cloruro sódico
administrada de manera subcutánea;
3. Ratas convertidas en diabéticas con 50 mg/kg
de estreptozotocina administrados de manera intravenosa,
pre-y post-tratadas con KGF nativo
administrado de manera subcutánea; y
4. Ratas de control tratadas con KGF
administrado de manera subcutánea, sin estreptozotocina.
Se administró a las ratas tratadas en todos los
cuatro grupos KGF nativo a una dosis de 5 mg/kg por día o un volumen
igual de solución de cloruro sódico durante un periodo de siete
días. Dos días después del comienzo de la administración de KGF o
cloruro sódico, se les dio a las ratas de los grupos 2 y 3 una dosis
única de 55 mg/kg de estreptozotocina, administrada de manera
intravenosa. Se sabe que esta dosis causa diabetes moderada en
ratas. Se controló en todas las ratas el nivel de glucosa sanguíneo
sin ayuno, el peso corporal, el nivel de glucosa en la orina en
ayuno y la producción de orina. Siete días después de la
administración de estreptozotocina a los grupos 2 y 3 (es decir,
nueve días después del comienzo del estudio), las ratas de todos los
grupos se dejaron en ayunas durante toda la noche, se sacrificaron y
después se les hizo la necropsia. En cada caso, se preservó el
páncreas en formalina de cinc, se embebió y después se procesó para
histopatología de rutina.
El nivel de glucosa sanguínea sin ayuno en el
quinto día después de la administración de estreptozotocina aumentó
de forma significativa en las ratas de control diabéticas (grupo 2)
en comparación con las ratas de control no diabéticas (grupo 1),
como se ve en la Figura 1. Las ratas diabéticas que se habían
pre-tratado con KGF antes de la administración de
estreptozotocina y que se post-trataron con KGF
(grupo 3) tenían un nivel de glucosa sanguínea sin ayuno más bajo de
forma significativa que los controles diabéticos no tratados con KGF
(grupo 2), pero todavía elevado en relación al control no diabético
(grupo 1); véase la Figura 1. El nivel de glucosa en orina en ayuno
y el volumen de orina de las ratas de control diabéticas del grupo 2
se elevó de forma significativa en el séptimo día del estudio (es
decir, cinco días después de la inyección con estreptozotocina),
como se ve en la Figura 2. Este estado se debe a la destrucción de
las células beta productoras de insulina de los islotes pancreáticos
y a la desregulación grave del metabolismo de la glucosa que produce
excreción de glucosa en la orina. Al contrario que esto, las ratas
diabéticas del grupo 3, que se pre- y post-trataron
con KGF, mostraron una elevación menor de forma significativa en la
glucosa en orina en ayuno que el control diabético (grupo 2). La
producción de orina para el grupo tratado con KGF era también menor
de forma significativa que para el grupo de control diabético, véase
la Figura 2.
Estos resultados son consistentes con la
inducción de un estado moderado de diabetes en la rata usando
estreptozotocina como el agente inductor. Las ratas diabéticas que
se trataron con KGF previamente a la inducción de la diabetes, y
para las que se continuó también administrando KGF después de la
inducción, mostraron síntomas indicativos de una forma más moderada
de diabetes. Por lo tanto, puede concluirse que la terapia con KGF
previno parcialmente la inducción de la enfermedad o restauró las
células de los islotes productoras de insulina después de la
destrucción de las células beta inducida por estreptozotocina. Para
distinguir entre estas posibilidades, se estudio a continuación la
terapia con KGF que comienza después de la inducción de la
enfermedad.
Segundo estudio: Usando el mismo modelo de
diabetes previamente descrito, se evaluó además la eficacia de KGF
para tratar la diabetes utilizando los siguientes tres grupos de
ratas de ensayo:
1. Ratas de control tratadas con solución de
cloruro sódico administrada de forma subcutánea, sin
estreptozotocina;
2. Ratas convertidas en diabéticas con
estreptozotocina administrada de manera intravenosa, y
post-tratadas con solución de cloruro sódico
administrada de forma subcutánea; y
3. Ratas convertidas en diabéticas con
estreptozotocina administrada de forma subcutánea, después
post-tratadas con C(1, 15)S
administrado de forma subcutánea.
Se administró a las ratas de ensayo una dosis de
3 mg/kg por día o una solución de cloruro sódico durante un periodo
de trece días comenzando en el día uno después de la inducción de la
diabetes. Se controlaron el nivel de glucosa sanguínea, el nivel de
glucosa en la orina, el volumen de producción de orina y el agua
bebida cada uno en condiciones de ayuno y sin ayuno durante todo el
periodo de ensayo. Las ratas se convirtieron en diabéticas en los
grupos 2 y 3 dentro de un día de administración de estreptozotocina
(Figura 3). La terapia con KGF comenzó en el grupo 3 a las
veinticuatro horas después de la estreptozotocina y se continuó
diariamente a partir de entonces. Se midió la glucosa sanguínea sin
ayuno en los días 1, 2, 4, 5 y 8. Como demuestra la Figura 3, la
terapia con KGF en el grupo 3 fue capaz de disminuir el nivel de
glucosa sanguínea circulante a casi el de las ratas de control
(grupo 1) en el día 4, y esto continuó hasta el día 8. Se midió
también la excreción urinaria de glucosa sin ayuno en los días 2, 5
y 8. La Figura 4 demuestra que la terapia con KGF disminuyó los
niveles de glucosa urinaria por encima de 8 veces. De forma similar,
la producción de orina en las ratas diabéticas tratadas con KGF
estaba también normalizada cuando se midió en el día 5 y el día 8
(Figura 5). El consumo de agua, en milímetros por periodo de
veinticuatro horas, no aumentó en las ratas diabéticas tratadas con
KGF como hizo en las ratas diabéticas que recibieron solución de
cloruro sódico como un control (Figura 6). Las ratas se dejaron en
ayuno durante toda la noche en el día 8 y los niveles de glucosa
sanguínea en ayuno en el día 9 no eran diferentes entre estos tres
grupos. El consumo de agua en ayunas y la producción de orina eran
menores de forma significativa en las ratas diabéticas tratadas con
KGF cuando se compararon con las ratas diabéticas en el día 9, lo
que es además indicativo del mejoramiento del estado de la
enfermedad.
Tercer estudio: El tercer estudio fue una
repetición del segundo estudio y confirmó los datos presentados en
las Figuras 3-6. Adicionalmente, en este
experimento, cuando se realizó la necropsia a las ratas, se retiró
el páncreas completo de cada rata y se extrajo y se cuantificó la
insulina y el péptido C. La Tabla 1, a continuación, muestra la
cantidad media de insulina o péptido C extraíble del páncreas en
cada uno de los tres grupos. La terapia con KGF fue capaz de
aumentar el contenido total de insulina y péptido C en el páncreas
de ratas diabéticas cuando se comparó con ratas diabéticas tratadas
con solución de cloruro sódico.
\vskip1.000000\baselineskip
| Contenido pancreático total de | ||
| Grupo | Insulina (\mug) | Péptido C (\mumol) |
| Control | 83,7 \pm 6,7 | 3,5 \pm 0,1 |
| Diabéticas más terapia con NaCl | 6,4 \pm 3,3 | 0,4 \pm 0,1 |
| Diabéticas más terapia con KGF | 18,9 \pm 7,4 | 1,0 \pm 0,3 |
| 1 n=3-4 ratas por grupo | ||
| 2 Media \pm S.E. |
El cuarto estudio investigó el efecto de KGF
sobre la diabetes inducida por estreptozotocina en ratas
Sprague-Dawley. En el día 0, se expusieron los
grupos de ratas a 45 o 50 mg/kg de estreptozotocina (STZ).
Posteriormente a estos tratamientos, se controlaron diariamente los
niveles de glucosa sanguínea sin ayuno para valorar la gravedad de
la lesión de los islotes. En el día 5, los animales tratados con STZ
se colocaron en uno de los dos grupos (20/grupo) dependiendo de la
magnitud de la hiperglucemia. El punto de división se estableció a
un nivel de glucosa sanguínea de 300 mg/dl. Un grupo de animales no
tratados con STZ sirvió como control. En el día 7, se dio a 10
animales de cada grupo hiperglucémico \DeltaN23 (3 mg/kg/día) o
PBS por inyección subcutánea durante 7 días. Se controlaron después
diariamente los niveles de glucosa sanguínea, todos los días o
semanalmente y se exponen en la Figura 7. Se apunta que los animales
tratados con STZ de ambos grupos que recibieron KGF tenían
disminuciones significativas en la glucosa sanguínea durante el
periodo de dosificación de KGF. De forma importante, la bajada de la
media de la glucosa sanguínea experimentada por los animales
tratados con STZ del grupo de glucosa sanguínea que comienza por
<300 mg/dl se estabilizó a aproximadamente 150 mg/dl mientras que
la bajada en la glucosa sanguínea vista en el grupo de
glucosa sanguínea que comienza por >300 mg/dl fue sólo transitoria. Se apunta que la escala diaria no es lineal.
glucosa sanguínea que comienza por >300 mg/dl fue sólo transitoria. Se apunta que la escala diaria no es lineal.
1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Amgen Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método para tratar la Diabetes Mellitus usando KGF
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Amgen Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1840 DeHavilland Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Thousand Oaks
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 91320-1789
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US PCT/IB 95/00992
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 12-OCT-1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 862 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 194 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
Claims (14)
1. Uso de KGF nativo o una muteína del mismo que
difiere por deleción, sustitución y/o inserción de al menos un
aminoácido del KGF nativo y que tiene sustancialmente la capacidad
del KGF nativo de estimular la proliferación de células epiteliales
que no son fibroblastos para preparar un medicamento para el
tratamiento de la diabetes mellitus.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el KGF nativo o la muteína del mismo es un factor de
crecimiento de queratinocitos producido de manera recombinante.
3. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que el KGF nativo o la muteína del
mismo está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que
comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto
por:
- (i)
- la secuencia de ADN como se representa por las bases 201 a 684 de la SEC ID Nº: 1 o una porción codificante de la misma;
- (ii)
- una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el pólipéptido KGF de SEC ID Nº: 2; y
- (iii)
- una secuencia que hibrida con una secuencia complementaria de (i) o (ii).
4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que el KGF nativo o la muteína del
mismo comprende una secuencia de aminoácidos del factor de
crecimiento de queratinocitos maduro (como se representa por los
restos de aminoácidos 32-194 de la SEC ID Nº 2) o un
fragmento del mismo, o un análogo del mismo.
5. El uso de acuerdo a la reivindicación 4, en
el que el KGF nativo o la muteína del mismo se selecciona entre los
siguientes: C(1, 15)S, \DeltaN15, \DeltaN16,
\DeltaN17, \DeltaN18, \DeltaN19, \DeltaN20, \DeltaN21,
\DeltaN22, \DeltaN23, \DeltaN24,
\DeltaN3/C(15)S, \DeltaN3/C(15)-,
\DeltaN8/C(15)S, \DeltaN8/C(15)-,
C(1,15)S/R(144)E, C(1,
15)S/R(144)Q,
\DeltaN23/R(144)Q, C(1, 15, 40)S,
C(1, 15, 102)S, C(1, 15, 102, 106)S,
\DeltaN23/N(137)E,
\DeltaN23/K(139)E,
\DeltaN23/K(139)Q,
\DeltaN23/R(144)A,
\DeltaN23/R(144)E,
\DeltaN23/R(144)L, \Delta23/K(147)E,
\DeltaN23/K(147)Q,
\DeltaN23/K(153)E,
\DeltaN23/K(153)Q,
\DeltaN23/Q(152)E/K(153)E;
R(144)Q o H(116)G, estando cada molécula
designada como referencia al residuo encontrado en esa posición en
el factor de crecimiento de queratinocitos maduro, como se describe
por los restos de aminoácidos 32-194 de la SEQ ID
Nº: 2.
6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, en el que el KGF nativo o la muteína del
mismo se produce de manera recombinante en células bacterianas.
7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, en el que dicho KGF nativo o muteína del
mismo tiene una metionina amino-terminal.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en
el que el KGF nativo o muteína del mismo se produce en E.
coli.
9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el KGF nativo o muteína del mismo
se formula con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que el vehículo farmacéuticamente aceptable es una formulación
de liberación a largo plazo, lenta.
11. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el KGF nativo o la muteína del
mismo se administra por inyección parenteral, tal como inyección
subcutánea, intravenosa o intramuscular.
12. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el KGF nativo o muteína del mismo
se administra en una cantidad de 0,001 miligramos a 10 miligramos
por kilogramo de peso corporal por día.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12,
en el que la cantidad de KGF nativo o muteína del mismo es de 0,05
miligramos a 5 miligramos por kilogramo por día.
14. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que el paciente es un ser humano.
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