PL182888B1

PL182888B1 - Analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu-KGF, cząsteczka rekombinacyjnego kwasu nukleinowego, kodującego analog KGF, biologicznie funkcjonalny wektor zawierający rekombinacyjny kwas nukleinowy kodujący analog KGF, komórka gospodarza zawierająca rekombinacyjny kwas nukleinowy, kodujący analog KGF lub biologicznie funkcjonalny wektor zawierający taki kwas nukleinowy oraz sposób wytwarzania analoga KGF

Info

Publication number: PL182888B1
Application number: PL95319784A
Authority: PL
Inventors: Charles F. Morris; William C. Kenney; Bao-Lu Chen; Eric W. Hsu
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 2002-03-29
Also published as: JP4426646B2; HUT78058A; NZ335109A; WO1996011949A3; PT785948E; ES2273338T3; CZ297328B6; HUT78050A; AU3707795A; PL320484A1; SI0804479T1; FI971420L; ATE342278T1; NO971566D0; DE69530403D1; CA2201940C; BR9509329A; BG63167B1; SK45597A3; AU3708395A

Abstract

. 1. Analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, okreslonego przez sekwen- cje aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencja sygnalna lub bez tej sekwencji, okreslony przez sekwencje aminokwasów wlasciwa KGF, obejmujaca modyfikacje jednego lub wiecej aminok- wasów 32-55 w sekwencji SEQ IDNO:2, w którym kazda z reszt cysternowych; w pozycji aminokwa- su 32 w SEQ IDNO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ IDNO:2 (odpowiednio Cys oraz Cys1 5 ), jest albo usunieta albo podstawiona innym aminokwasem. 21. Kompozycja farmaceutyczna, zawierajaca substancje aktywna oraz farmaceutycznie akce- ptowalny nosnik, znamienna tym, ze substancje aktywna stanowi terapeutycznie skuteczna ilosc ana- loga rodzinnego keratynocytowego czynnika wzrostu (o sekwencji aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencja sygnalna lub bez tej sekwencji) - KGF, okreslonego przez sekwencje aminokwa- sów wlasciwa KGF, obejmujaca modyfikacje jednego lub wiecej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym kazda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO.2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys1 oraz Cys1 5 ), jest albo usunieta, albo podstawiona innym aminokwasem. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, cząsteczka rekombinacyjnego kwasu nukleinowego, kodującego analog KGF, biologicznie funkcjonalny wektor zawierający rekombinacyjny kwas nukleinowy, kodujący analog KGF, komórka-gospodarza zawierająca rekombinacyjny kwas nukleinowy, kodujący analog KGF lub biologicznie funkcjonalny wektor zawierający taki kwas nukleinowy oraz sposób wytwarzania analoga KGF.

Obecny wynalazek odnosi się zatem do technologii opartych na rekombinacyjnym DNA oraz inżynierii białkowej.

Keratynocytowy czynnik wzrostu - KGF, jest silnym mitogenem w niefibroblastowym wzroście komórek nabłonkowych, a polipeptydowe analogi KGF według wynalazku posiadają podwyższoną stabilność w porównaniu ze stabilnością macierzystego KGF.

W skomplikowanym procesie generowania i regenerowania tkanek pośredniczy szereg czynników proteinowych, czasem nazywanych czynnikami wzrostu tkanki miękkiej. Cząsteczki tego rodzaju są zwykle wytwarzane przez jeden rodzaj komórek i wpływają na rozmnażanie się komórek innych rodzajów. (Rubin i współpracownicy (1989), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86:802-806). Niektóre czynniki wzrostu tkanek miękkich są wydzielane przez poszczególne rodzaje komórek i wpływają na rozmnażanie, różnicowanie się i/lub dojrzewanie odnośnych komórek podczas rozwoju organizmów międzykomórkowych (Finch i współpracownicy (1989), Science 245:752-755). Poza roląjakąpełniąw rozwoju organizmów, niektóre z nich maja istotne znaczenie w ciągłym zdrowiu i utrzymywaniu bardziej dojrzałych systemów. Na przykład, w przypadku ssaków, istnieje wiele systemów, w których występuje szybki przerób komórkowy. Do takich systemów należy skóra oraz układ gastryczno-wchłanialny, oba obejmujące komórki nabłonkowe. Do omawianej grupy czynników wzrostu tkanek miękkich należy rodzina protein znanych jako czynniki wzrostu fibroblastów (FGF).

182 888

Obecnie znanych jest osiem protein należących do rodziny FGF, posiadających wspólną strukturę w swej zasadniczej budowie: podstawowy fibroblastowy czynnik wzrostu - bFGF (Abraham i współpracownicy (1986), EMBO1, 5:2523-2528); kwasowy fibroblastowy czynnik wzrostu -aFGF (Jaye i współpracownicy (1986), Science, 233:541-545); int-2 produkt genowy, int-2 (Dickson & Peters (1987), Naturę, 326;833); hst/kFGF (Dell-Bovi i współpracownicy (1987), Celi, 50:729-737 oraz Yoshida i współpracownicy (1987), Proc Natl Acad. Sci. USA, 84:7305-7309); FGF-5 (Zhan i współpracownicy (1988), Mol. Celi. Biol., 8:3487-3495); FGF-6 (Marics i współpracownicy (1989), Oncogene, 4:335-340); keratynocytowy czynnik wzrostu - KGF (Finch i współpracownicy (1989), Science, 24:752-755); oraz hisaktofilina (hisactophilin) (Habazzettl i współpracownicy, (1992), Naturę, 359:855-858).

W rodzinie protein FGF, keratynocytowy czynnik wzrostu („KGF”) jest wyjątkowym efektorem dla niefibroblastowego (szczególnie ketarynocytowego) rozmnażania komórek nabłonkowych, pochodzących z tkanek krężkowych. Termin,,rodzimy KGF” odnosi się do naturalnego ludzkiego (hKGF) lub rekombinacyjnego (rKGF) polipeptydu (z sekwencją sygnałową lub bez takiej sekwencji), określonego przez sekwencję aminokwasów SEQ ID NO:2 lub jego wariantu alleilowego. [Jeżeli nie jest to w jakiś inny sposób określone, numeracja aminokwasów w cząsteczkach opisywanych w niniej szym tekście powinna odpowiadać numeracji aminokwasów w doj rzałej formie cząsteczki rodzimej (to znaczy z pominięciem sekwencji sygnałowej), określonej jajo aminokwasy 32 do 194 w sekwencji SEQ ID NO:2],

Rodzimy KGF może być wyodrębniony z naturalnych ludzkich źródeł (hKGF) lub być wytworzony przez rekombinacyjne techniki DNA (rKGF) (Finch i współpracownicy (1989) jak wyżej; Rubin i współpracownicy (1989), jak wyżej; Ron i współpracownicy (1993), The Journal of Biological Chemistry, 268(4):2984-2988; oraz Yan i współpracownicy (1991), In Vitro Celi. Dev Biol., 27A:437-438).

Ogólnie wiadomo, iż rodzimy KGF jest stosunkowo niestabilny w stanie uwodnionym oraz, że podczas przetwarzania i przechowywania podlega on chemicznej i fizycznej degradacji prowadzącej do utraty aktywności biologicznej (Chen i współpracownicy (1994), Pharmaceutical Research, 11:1582-1589). Rodzimy KGF jest podatny także na agregację w podwyższonej temperaturze i ulega dezaktywacji w środowisku kwaśnym (Rubin i współpracownicy (1989), Proc, Natl. Acad. Sci USA, 86:802-806).Agregacja rodzimego KGF w roztworach wodnych również prowadzi do dezaktywacji proteiny. Jest to niekorzystne, ponieważ taka strata aktywności powoduje, że niepraktyczne staje się przechowywanie wodnych roztworów rodzimych protein KGF przez dłuższy okres czasu bądź podawanie tej proteiny przez wydłużone okresy. Co więcej, jest to szczególnie kłopotliwe przy przygotowywaniu kompozycji farmaceutycznych, ponieważ znany jest fakt, iż zagregowane proteiny stają się immunogenne (Cleland i współpracownicy (1993), Crit, Rev. TherapeuticDrug Carrier Systems,10:301-371; Robbins i współpracownicy (1987), Diabetes, 36:838-845; oraz Pinckard i współpracownicy (1967), Clin. Exp Immunol., 2:331-340).

Rodzimy KGF zawiera pięć reszt cysternowych, a mianowicie aminokwasy w pozycj ach 1, 15,40,102 oraz 106 (Finchi współpracownicy (1989), Science, 24:752-755). Chociaż opublikowano juz informacje o zawartości cysteiny w rodzimym KGF, nie wyjaśniono jednak dotychczas roli, jaką reszty cysteinowe odgrywają z punktu widzenia aktywności (przykładowo ich doniosłości dla aktywności biologicznej) oraz trzeciorzędowej struktury (przykładowo ich tendencji do tworzenia niekorzystnych wewnątrzcząsteczkowych lub między cząsteczkowych wiązań dwusulfidowych). A zatem, dotychczasowy stan techniki nie zawiera informacji, które reszty cysteinowe - jeśli jakiekolwiek - są istotne dla lub zaangażowane w tworzeniu niektórych wiązań dwusulfidowych, powodujących, że proteina staje się podatna na agregację i/lub niestabilna.

W celu polepszenia lub w inny sposób zmienienia jednej lub większej ilości charakterystyk rodzimego KGF, wykorzystać można inżynierię proteinową. Technologia rekombinacyjna DNA była wykorzystywana do zmodyfikowania sekwencji w rodzimym KGF.

Ron i współpracownicy (1993), J. Biol. Chem., 268(4):2984-2988, donieśli o zmodyfikowanych polipeptydach KGF mających na N-końcu usunięte aminokwasy w pozycjach 3, 8,27,

182 888 lub 49. Jedynie polipeptydy z brakującymi resztami w pozycjach 3, 8 lub 27 na N-końcu zachowały zdolność do wiązania heparyny; pozostałe zaś tej zdolności nie zachowały. Jednocześnie doniesiono, że polipeptydy niezawierające reszt 3 i 8 były całkowicie aktywne, podczas gdy postać niezawierająca reszty 27 była 10 do 20 razy mniej mitogenna, a z kolei formy niezawierające aminokwasów 38 lub 49 nie wykazywały aktywności mitogennej. Stabilność tak zmodyfikowanych polipeptydów KGF nie była dyskutowana, ani w inny sposób omówiona.

Publikacja nr 90/08771 zgłoszenia PCT, supra, również ujawnia wytwarzanie chimerycznej proteiny, w której pierwsze około 40 N-końcowych aminokwasów z dojrzałej formy rodzimego KGF połączono z C-końcową częścią (około 140 aminokwasów) aFGF. Stwierdzono, że tak otrzymany związek chimeryczny rozpoznaje keratynocyty podobnie do KGF, ale brakuje mu podatności na oddziaływanie w heparyną, co jest charakterystyczne dla aFGF, ale nie dla KGF. Nie dyskutowano, ani nie podawano żadnej informacji na temat stabilności tego chimerycznego związku.

A zatem, w literaturze nie opublikowano informacji o zmodyfikowanej cząsteczce KGF, która charakteryzowałaby się podwyższoną stabilnością w porównaniu w rodzimym KGF. Co więcej, dane zawarte w literaturze nie dostarczają dostatecznego wyjaśnienia lub wiązań, uzasadniających przewidywania jak skutecznie wytworzyć cząsteczki KGF, o takich pożądanych właściwościach.

Ogólnie rzecz biorąc, wpływ jak i zmiana aminokwasu wywiera na aktywność biologicznąproteiny jest zmienny i zależy od szeregu czynników, w tym od trójwymiarowej struktury proteiny oraz od tego czy modyfikacje dotyczą czy też nie dotyczą obszaru wiążącego receptor w pierwszorzędowej sekwencji proteiny. Ponieważ nie opublikowano dotychczas ani trójwymiarowej struktury proteiny ani obszaru wiążącego receptor pierwotnej struktury rodzimego KGF, wiedza zawarta w stanie techniki nie pozwala na ogólne stwierdzenia odnośnie wypływu, jaki wywrą modyfikacje aminokwasów w rodzimym KGF, w oparciu o efekty wywoływane przez modyfikację aminokwasu w ogólnie znanych proteinach.

Jest zatem celem niniejszego wynalazku dostarczenie cząsteczek polipeptydowych kodujących takie analogi KGF, które wykazywać będą podwyższoną stabilność (przykładowo, przy poddaniu typowym warunkom pH, temperatury i/lub innych parametrów podczas przechowywania) w porównaniu z rodzimym KGF.

Według wynalazku analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu-KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony jest przez sekwencję aminokwasów właściwąKGF, obejmującąmodyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, przy czym każda z reszt cysternowych; w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem.

Korzystnie, w analogu KGF według wynalazku reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz reszta cysternowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 są usunięte.

Korzystnie, w analogu KGF według wynalazku aminokwasy 32-55 w SEQ ID NO:2 są odcięte.

- Korzystnie, w analogu KGF według wynalazku reszta cysternowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 jest usunięta, a reszta cysternowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 jest podstawiona innym aminokwasem.

Korzystnie, w analogu KGF według wynalazku pierwsze - do czternastu, N-końcowe aminokwasy są odcięte, a reszta cysternowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 jest podstawiona innym aminokwasem.

Korzystnie, w analogu KGF według wynalazku reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 sąpodstawione innym aminokwasem.

Korzystnie, w analogu KGF według wynalazku z resztami cysternowymi podstawionymi innymi resztami aminokwasowymi, za resztę cysteinowąjest podstawiona reszta aminokwa

182 888 sowa wybrana z grupy obejmującej reszty alaniny, leucyny i seryny, a najkorzystniej reszta serynowa.

Korzystnie, w analogu KGF według wynalazku występuje dodatkowo podstawienie zmieniające ładunek w pozycji aminokwasu wybranego spośród: reszty argininowej w pozycji aminokwasu 72 w SEQ ID NO:2, reszty kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasu 74 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 86 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 126 w SEQ ID NO:2, reszty asparginowej w pozycji aminokwasu 168 w SEQ ID NO:2, reszty kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasu 169 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 170 w SEQ ID NO:2, reszty argininowej w pozycji aminowkasu 175 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 178 w SEQ ID NO:2, reszty glutaminowej w pozycji aminokwasu 183 w SEQ ID NO :2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 184 w SEQ ID NO:2 lub reszty treoninowej w pozycji aminokwasu 185 w SEQ ID NO:2.

Korzystnie, analog KGF według wynalazku dodatkowo obejmuje modyfikację polegającą na tym, że co najmniej jeden aminokwas w pętlotwórczej sekwencji reszt aminokwasowych w pozycjach Asn¹⁴⁶-Thr¹⁵⁰ w SEQ ID NO:2 - zastąpiony jest resztą innego aminokwasu posiadającą wyzszy potencjał tworzenia pętli.

Korzystnie, w analogu KGF według wynalazku, w którym występują wskazane wyżej dodatkowe modyfikacje, reszty aminokwasowe w pozycjach 32-54 w SEQ ID NO:2 są usunięte.

Korzystnie, analog KGF według wynalazku wybrany jest z grupy analogów obejmującej C(1,15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:32, wktórej początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15,40)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:78, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C( 1,15,102) S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:80, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C( 1,15,102,106)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:82, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ15 (SEQ ID NO:42, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ17 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:46, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ18 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:48, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ19 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 50, wktórej początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ20 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:52, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ21 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:54, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ22 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:56, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23 (odpowiadaj ący sekwencji SEQ ID NO:58, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ24 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:60, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN3/C(15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:34, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ3/Ο(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:36, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN8/C(15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:38, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ8/0(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:40, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15)S/R(144)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:62, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C( 1,15)S/R( 144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:64, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/H(116)G (odpowiadający sekwencji aminokwasów 54-194 w SEQ ID NO:2, w resztąhistydynową w pozycji aminokwasu 147 podstawioną glicyną ΔΝ23/Ν(137)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:84, w której

182 888 początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ( 139)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:86, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(139)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:88, w której początkowa metionina j est uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R( 144)A (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:90, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:92, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R( 144)L (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:94, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ(147)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:96, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(147)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:98, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Ν(153)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:100, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/ΝΚ(153)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:102, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/Q(152)E/K(153)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 104, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie) i AN23/R(144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:66, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).

Korzystnym analogiem KGF według wynalazku jest analog ΔΝ16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).

Analog KGF według wynalazku ma sekwencję sygnalną lub amino-końcową resztę metionino wą. Korzystnie, sekwencję sygnalną stanowią aminokwasy 1-31 w SEQ ID NO:2.

Korzystnie, analog KGF według wynalazku połączony jest kowalencyjnie z ugrupowaniem chemicznym, korzystnie z glikolem polietylenowym.

Korzystnym analogiem rodzimego keratynowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, jest ΔΝ23 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:58, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), połączony kowalencyjnie z ugrupowaniem chemicznym, korzystnie glikolem polietylenowym.

Korzystnie, analog KGF według wynalazku występuje w postaci liofilizowanej.

Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik, według wynalazku cechuje się tym, że substancję aktywną stanowi terapeutycznie skuteczna ilość wyżej zdefiniowanego analoga rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu (o sekwencji aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji) - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów właściwą K.GF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta, albo podstawiona innym aminokwasem.

Wynalazek obejmuję,także cząsteczkę rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego wyżej określony analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminowkasów 32-194 w SEQ ID NO:2. z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencje aminokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem

Korzystną rekombinacyjną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego analog KGF, w którym reszta cysternowa w pozycj i aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz reszta cysternowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 są usunięte.

182 888

Korzystną rekombinacyjną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego analog KGF, w którym aminokwasy 32-55 w SEQ ID NO:2 są odcięte.

Korzystną rekombinacyjną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego analog KGF, w którym reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 jest usunięta, a reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 jest podstawiona innym aminokwasem.

Korzystną rekombinacyjną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego analog KGF w którym pierwsze - do czternastu, N-końcowe aminokwasy są odcięte, a reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 jest podstawiona innym aminokwasem.

Korzystną rekombinacyjną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego koduj ącego analog KGF, w którym reszta cysteinowa w pozycj i aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 są podstawione innym aminokwasem.

Korzystną rekombinacyjną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego analog KGF, w którym za resztę cysternową jest podstawiona reszta aminokwasowa wybrana z grupy obejmującej reszty alaniny, leucyny i seryny, korzystnie reszta serynowa.

Korzystną rekombinacyjną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego analog KGF, w którym występuje dodatkowo podstawienie zmieniające ładunek w pozycji aminokwasu wybranego spośród: reszty argininowej w pozycji aminokwasu 72 w SEQ IDN0:2, reszty kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasu 74 w ŚEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 86 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycj i aminokwasu 126 wSEQ IDN0:2,reszty asparginowej w pozycji aminokwasu 168 w SEQ ID NO:2, reszty kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasu 169 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 170 w SEQ ID NO:2, reszty argininowej wpozycji aminokwasu 175 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 178 w SEQ ID NO :2, reszty glutaminowej w pozycji aminokwasu 183 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 184 w SEQ ID NO:2 lub reszty treoninowej w pozycji aminokwasu 185 w SEQ ID NO:2.

Korzystną rekombinacyjną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego analog KGF, który dodatkowo obejmuje modyfikację polegającą na tym, że co najmniej jeden aminokwas w pętlotwórczej sekwencji reszt aminokwasowych w pozycjach Asn¹⁴⁶-Thr¹⁵⁰ w SEQ ID NO:2 - zastąpiony jest resztą innego aminokwasu posiadającą wyższy potencjał tworzenia pętli.

Korzystną rekombinacyjną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego analog KGF, zawierający powyżej określone dodatkowe modyfikacje, w którym reszty aminokwasowe w pozycjach 32-54 w SEQ ID NO :2 są usunięte.

Korzystną rekombinacyjną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego analog KGF, wybrany z grupy analogów obejmującej C(1,15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:32, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(l,15,40)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:78, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C (1,15,102) S (odpowiadaj ący sekwencj i SEQ ID NO: 80, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15,102,106)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:82, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ15 (SEQ ID NO:42, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ17 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:46, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ 18 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:48, w której początkowa metioninajest uznana za resztę

182 888 „O” i występuje ewentualnie), ΔΝ19 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:50, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ20 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:52, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ21 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:54, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ22 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:56, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:58, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ24 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:60, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN3/C(15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:34, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN3/C(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:36, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN8/C(15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:38, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN8/C(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:40, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15)S/R(144)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:62, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15)S/R(144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:64, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Η(116)G (odpowiadający sekwencji aminokwasów 54-194 w SEQ ID NO:2, z resztąhisty dyno wą w pozycji aminokwasu 147 podstawioną glicyną ΔΝ23/Ν(137)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:84, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ(139)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:86, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(139)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:88, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)A (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:90, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R( 144)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:92, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)L (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:94, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ(147)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:96, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(147)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:98, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Ν(153)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 100, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/ΝΚ(153)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 102, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/Q(152)E/K(153)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 104, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie) i AN23/R(144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:66, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).

Korzystną rekombinacyjną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego analog KGF, którym jest ΔΝ16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).

Korzystną rekombinacyjną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego analog KGF mający sekwencję sygnalną lub amino-końcową resztę metioninową, przy czym sekwencję sygnalną stanowią aminokwasy 1 -31 w SEQ ID NO:2.

Jednocześnie, obecnym wynalazkiem objęty jest biologicznie funkcjonalny wektor, zawierający cząsteczkę rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego wyżej określony analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony

182 888 przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem.

Wynalazek obejmuje również prokariotyczną lub eukariotyczną komórkę gospodarza zawierającą cząsteczkę rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych, w pozycji aminokwasu 32 w SEQ IDNO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem, albo też - biologicznie funkcjonalny wektor zawierający cząsteczkę takiego rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ IDNO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem.

Korzystną prokariotyczną komórką-gospodarza według wynalazku jest E. coli.

Korzystną eukariotyczną komórką-gospodarza według wynalazku jest komórka ssaka, korzystnie komórka jajnika chomika chińskiego.

Sposób wytwarzania analoga KGF, obejmujący prowadzenie namnazania w odpowiednich warunkach odżywczych prokariotycznej lub eukariotycznej komórki-gospodarza trwale transformowanej określoną cząsteczką kwasu nukleinowego, według wynalazku polega na tym, że stosuje się komórkę-gospodarza zawierającą cząsteczkę rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem, albo biologicznie funkcjonalny wektor zawierający cząsteczkę takiego rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję amionokwasó w właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem i prowadzi się hodowlę w sposób pozwalający na ekspresję kodowanego analoga KGF, po czym wyodrębnia się tak wytworzony analog KGF.

Obecny wynalazek zapewnia zatem nowe, biologicznie aktywne polipeptydowe analogi KGF. Dla celów niniejszego wynalazku termin „KGF” obejmuje rodzimy KGF oraz proteiny charakteryzuje się sekwencją peptydową zasadniczo takąsamąjak sekwencja peptydowa rodzimego KGF, która zachowuje reszty cysternowe odpowiadające Cys¹ oraz Cys¹⁵ rodzimego KGF (Cys³² oraz Cys⁴⁶ w SEQ ID NO:2) oraz która zachowuje niektóre lub wszystkie z biologicznych aktywności rodzimego KGF, w szczególności zdolność niefibroblastowej proliferacji komórek nabłonkowych. [Przy odnoszeniu się rysunków fig. 4, 7-24 oraz 37-50 oraz przy wskazywaniu pozycji poszczególnych aminokwasów, początkowa reszta metioninowa powinna być uważana za grupę o numerze „0”]. Termin „charakteryzuje się sekwencją peptydową zasadniczo taką samą jak sekwencja peptydowa rodzimego KGF” oznacza sekwencję peptydową kodowaną

182 888 przez sekwencję DNA zdolną do hybrydyzacji do nukleotydów 201 do 684 w sekwencji SEQ ID NO:1, korzystnie w ścisłych warunkach hybrydyzacji.

Określenie odpowiadających sobie pozycji aminokwasów pomiędzy dwoma sekwencjami aminokwasów można zrealizować przez ułożenie obu sekwencji obok siebie i zmaksymalizowanie dopasowania do siebie reszt, włącznie z przesuwaniem aminowych i/lub karboksylowych końców, wprowadzaniem przerwy gdy jest to konieczne i/lub usuwaniem reszt obecnych jako inserty w cząsteczce-kandydacie. Można przeprowadzić poszukiwania w bazach danych, analizę sekwencyjną oraz manipulacje, z wykorzystaniem dobrze znanych i rutynowo stosowanych programów algorytmowych do skanowania homologii/identyczności porównywanych sekwencji (na przykład, Pearson i Lipman (1988), Proc. Natl. Acad Sci. USA., 85:2444-2448; Altschul i współpracownicy (1990), J. Mol. Biol, 215:403-410;LipaniPearsaon (1985), Science, 222:1435 lub Devereux i współpracownicy (1984), Nuc. Acids Res. 12:387-395.

Termin „ściśle określone warunki”, w kontekście hybrydyzacji, dotyczy określonej kombinacji warunków soli, temperatury, rozpuszczalników organicznych oraz innych parametrów typowo kontrolowanych w reakcjach hybrydyzacji. Przykładowymi ściśle określonymi warunkami hybrydyzacji są warunki hybrydyzacji w 4 X SSC w temperaturze 62-67°C, a następnie przemywanie w 0,1 X SSC w temperaturze 62-67°C przez około godzinę. Alternatywnie, przykładowe określone warunki hybrydyzacji dotyczą hybrydyzacji w 45-55% formamidzie, 4 X SSC w temperaturze 40-45°C. [Patrz T.Maniatis i współpracownicy, Molecular Cloning (Podręcznik Laboratoryjny A Laboratory Manuał); wydany przez Cold Spring Harbor Laboratory (1982), strona 387 do 389].

Zatem, proteiny według wynalazku obejmują alleliowe wariacje, lub usunięcie (usunięcia), podstawienie (podstawienia) lub wstawienie (wstawienia) aminokwasów, w tym fragmenty, chimeryczne lub hybrydowe cząsteczki rodzimego KGF. Jeden przykład KGF obejmuje polipeptydy ze zmienionym ładunkiem, w którym jedna lub więcej reszt aminokwasowych 41-154 rodzimego KGF (korzystnie reszty Arg⁴¹, Gin⁴³, Lys⁵⁵· Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵², Lys¹⁵³ lub Thr¹⁵⁴) zostały usunięte lub podstawione przez obojętną resztę lub przez resztę naładowaną ładunkiem ujemnym, wybraną w celu uzyskania proteiny o zmniejszonym ładunku dodatnim (jak podanowzgłoszeniunrU.S. S.N. 08/323,337, złożonym 13paździemika 1994 dokonanym także na rzecz obecnego uprawnionego), zwłaszcza R(144)Q, czyli KGF mającego podstawienie glutaminy za argininę w pozycji 144 rodzimego KGF. Inny przykład KGF obejmuje proteiny wytworzone przez zastąpienie co najmniej jednym aminokwasem mającym wyższy potencjał do tworzenia pętli co najmniej jednego aminokwasu wewnątrz obszaru tworzącego pętle: Asn^,15-His^1I6-Tyr^,17-Asn¹¹⁸-Thr^,19 rodzimego KGF (jak podano w zgłoszeniu nr U.S. S.N. 08/323,473, złożonym 13 października 1994 dokonanym także na rzecz obecnego uprawnionego), zwłaszcza H( 116)G, czyli KGF mający podstawienie glicyny za histydynę w pozycji 116 rodzimego KGF. Wciąż dalszy przykład obejmuje proteiny mające jeden lub więcej aminokwasowych podstawień, usunięć lub wstawień w zakresie 123-133 (aminokwasy 154-164 w SEQ ID NO :2) rodzimego KGF; te proteiny mogą wykazy wać aktywność agonistyczną lub antagonistyczną.

Nieoczekiwanie okazało się, że gdy cząsteczka KGF (to znaczy macierzysta cząsteczka) mająca reszty cysteinowe odpowiadające (jak zostało to określone za pomocą technik opisanych 'wyżej) Cys¹ oraz Cys¹⁵ rodzimego KGF (reszty cysteinowe 32 oraz 46 w SEQ ID NO:2) została zmodyfikowana przez zastąpienie odpowiednich cystein, otrzymany analog KGF wykazuje polepszoną stabilność w porównaniu z wyj ściową cząsteczką macierzystą. Korzystnie, dodatkowo poza związkami o podwyższonej stabilności, wynalazek jest ukierunkowany na te analogi, które wykazują równocześnie pełną aktywność biologiczną (to znaczy co najmniej zasadniczo podobną zdolność wiązania receptora lub zasadniczo podobne powinowactwa do receptora) w porównaniu z rodzimym KGF.

W innym aspekcie tego wynalazku opisane zostały, oczyszczone i wyizolowane cząsteczki kwasów nukleinowych kodujących różne biologicznie aktywne polipeptydowe analogi KGF.

182 888

Zgodnie z jednym przykładem realizacji wynalazku, takie nukleinowe kwasy zawieraja cząsteczki DNA sklonowane do biologicznie aktywnego wektora plazmidowego lub wirusowego. W innym przykładzie realizacji, konstrukty kwasów nukleinowych mogą być wykorzystane do trwałego transformowania prokariotycznej lub eukariotycznej komórki-gospodarza. W kolejnym przykładzie realizacji, wynalazek obejmuje sposób, w którym prokariotyczną (korzystnie E. coli) lub eukariotyczną komórkę gospodarza trwale transformowaną cząsteczką kwasu nukleinowego hoduje się w odpowiednich warunkach żywienia w sposób pozwalający na ekspresję analoga KGF. Po ekspresji, zgodnie z wynalazkiem wytworzony rekombinacyjny polipeptyd może być wyizolowany i oczyszczony.

Dalszy aspekt niniejszego wynalazku dotyczy kompozycji farmaceutycznych zawierających terapeutycznie skuteczną ilość analoga KGF oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik. Kompozycje tego rodzaju będą przydatne w leczeniu pacjentów dotkniętych chorobami nabłonka lub zranieniami.

Wynalazek jest dodatkowo zilustrowany na załączonych rysunkach, na których:

Figura lAi lBprzedstawiająnukleotydową(SEQIDNO:l)orazaminokwasową(SEQID NO:2) sekwencję rodzimego KGF (nukleotyd kodujący dojrzałą formę rodzimego KGF jest przedstawiony przez zasady 201 do 684 w SEQ ID NO: 1, a dojrzała forma KGF jest określona przez reszty aminokwasowe 32 do 194 w SEQ ID NO:2).

Figura 2A, 2B oraz 2C przedstawiają odpowiednio mapy plazmidowe pCFM1156, pCFM1656 oraz pCFM3102.

Figura 3 przedstawia sekwencje: nukleotydową(SEQ ID NO:3) i aminokwasową(SEQ ID NO:4) dla konstruktu RSH-KGF.

Figura 4 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:5) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:6) dla konstruktu zawartego w plazmidzie KGF.

Figura 5 przedstawia chemicznie zsyntetyzowane związki typu OLIGO (OLIGO#6 do OLIGO#11; odpowiednio SEQ ID NO: 12-17) stosowane do zastąpienia sekwencji DNA pomiędzy miejscem kpnl a miejscem EcoRI (od pozycji aminokwasów 46 do 85 w SEQ ID NO:6) w konstrukcie zawartym w plazmidzie KGF do wytworzenia konstruktu w plazmidzie KGF (dsd).

Figura 6 przedstawia chemicznie zsyntetyzowane związki typu OLIGO (OLIGO#12 do OLIGO#24; odpowiednio SEQ ID NO: 18-30) stosowane do skonstruowania KGF (zoptymalizowany kodon).

Figura 7 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:31) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:32) dla związku C( 1,15)S - analoga KGF mającego podstawienie seryny za cysteinę w pozycjach aminokwasów 1 oraz 15 rodzimego KGF.

Figura 8 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:33) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:34) dla związku AN3/C(15)S - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze trzy aminokwasy zN-końca oraz podstawiono serynę za cysteinę wpozycji aminokwasu 15 rodzimego KGF.

Figura 9 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:35) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:36) dla związku ńN3/C(l 5)- - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze trzy aminokwasy z N-końca oraz usunięto cysteinę w pozycji aminokwasu 15 rodzimego KGF.

Figura 10 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:37) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:38) dla związku AN8/C(15)S - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze osiem aminokwasów z N-końca oraz podstawiono serynę za cysteinę w pozycji aminokwasu 15 rodzimego KGF.

Figura 11 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:39) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:40) dla związku AN8/C(15)- - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze osiem aminokwasów z N-końca oraz usunięto cysteinę w pozycji aminokwasu 15 rodzimego KGF.

Figura 12 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:41) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:42) dla związku ΔΝ15 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 15 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

182 888

Figura 13 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:43) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:44) dla związku ΔΝ16 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 16 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 14 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:45) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:46) dla związku ΔΝ17 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 17 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 15 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:47) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:48) dla związku ΔΝ 18 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 18 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 16 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:49) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:50) dla związku ΔΝ 19 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 19 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 17 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:51) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:52) dla związku ΔΝ20 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 20 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 18 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:53) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:54) dla związku ΔΝ21 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 21 aminokwasów z N-końca rodzimego KGF.

Figura 19 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:55) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:56) dla związku ΔΝ22 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 22 aminokwasy z N-końca rodzimego KGF.

Figura 20 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:57) oraz aminokwasową (SEQ ID NO: 58) dla związku ΔΝ23 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca rodzimego KGF.

Figura 21 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:59) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:60) dla związku ΔΝ24 - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 24 aminokwasy z N-końca rodzimego KGF.

Figura 22 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:61) oraz aminokwasową (SEQ ID NO :62) dla związku C( 1,15)S/R( 144)E - analoga KGF, mającego podstawienia seryny za cysteinę w pozycjach aminokwasu 1 i 15 oraz podstawienie kwasu glutamowego za argininę w pozycji aminokwasu 144 rodzimego KGF.

Figura 23 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:63) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:64) dla związku C(1,15)S/R( 144)Q - analoga KGF mającego podstawienia seryny za cysteinę w pozycjach aminokwasu 1 i 15 oraz podstawienie glutaminy za argininę w pozycji aminokwasu 144 rodzimego KGF.

Figura 24 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:65) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:66) dla związku AN23/R(144)Q - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono glutaminę za argininę w pozycji aminokwasu 144 rodzimego KGF.

Figura 25 przedstawia ilość pozostałej rozpuszczalnej proteiny, gdy rodzimy KGF oraz C(l,l 5)S przetrzymywano w roztworze 20 mM fosforanu sodu, 0,15 M NaCl, pH=7,0 w temperaturze 37°C przez 27 godzin.

Figura 26 NaCl przedstawia ilość pozostałej rozpuszczalnej proteiny, gdy rodzimy KGF i C(1,15)S przetrzymywano w PBS i w roztworze 50 mM NaPO₄,0,15 M NaCl, pH-7,0 w temperaturze 37°C przez 27 godzin.

Figura 27 przedstawia ilość rozpuszczalnej proteiny rodzimego KGF, C(1,15)S, C (1,15)S/R( 144) i C( 1,15)S/R( 144)Q - oznaczoną metodą HPLC z wykluczaniem ze względu na wielkość cząstek, jako funkcję czasu inkubacji w temperaturze 37°C.

Figura 28 przedstawia szacunkową temperaturę topnienia (T_m) jako funkcję pH dla rodzimego KGF, (C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)Q i C(1,15)S/R(144)E.

182 888

Figura 29 przedstawia typowy profil mitogenicznej aktywności C(1,15)S oznaczonej przez pomiar przyłączania [³H]-tymidyny podczas syntezy DNA i porównanie wyników ze standartową krzywą rodzimego KGF.

Figura 30 przedstawia typowy profil mitogenicznej aktywności ΔΝ15 oznaczonej przez pomiar przyłączania [³H]-tymidyny podczas syntezy DNA i porównanie wyników ze standartową krzywą rodzimego KGF.

Figura 31 przedstawia typowy profil mitogenicznej aktywności ΔΝ23 oznaczonej przez pomiar przyłączania [³H]-tymidyny podczas syntezy DNA i porównanie wyników ze standartową krzywą rodzimego KGF.

Figura 32 przedstawia typowy profil mitogenicznej aktywności AN23/R(144)Q oznaczonej przez pomiar przyłączania [³H]-tymidyny podczas syntezy DNA i porównanie wyników ze standartową krzywą rodzimego KGF.

Figura 33 przedstawia typowy profil mitogenicznej aktywności C(1,15)S/R(144)Q oznaczonej przez pomiar przyłączania [³H]-tymidyny podczas syntezy DNA i porównanie wyników ze standartową krzywą rodzimego KGF.

Figura 34 przedstawia typowy profil mitogenicznej aktywności C(1,15)S/R(144)E oznaczonej przez pomiar przyłączania [³H]-tymidyny podczas syntezy DNA i porównanie wyników ze standartową krzywą rodzimego KGF.

Figura 35 przedstawia wpływ rodzimego KGF, KGF-a, ΔΝ15, C(1,15)S i ΔΝ23 na chemię surowicy.

Figura 36 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:77) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:78) dla związku C(1,15,40)S - analoga KGF, w którym podstawiono serynę za cysteinę w pozycjach aminokwasów 1,15 i 40 rodzimego KGF.

Figura 37 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:79) oraz aminokwasową (SEQ ID NO: 80) dla związku C(1,15,102)S - analoga KGF, w którym podstawiono serynę za cysteinę w pozycjach aminokwasów 1,15 i 102 rodzimego KGF.

Figura 38 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:81) oraz aminokwasową (SEQ ID NO: 82) dla związku C(1,15,102,106)S - analoga KGF, w którym podstawiono serynę za cysteinę w pozycjach aminokwasów 1,15,102 i 106 rodzimego KGF.

Figura 39 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:83) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:84) dla związku ΔΝ23/Ν(137)Ε - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono kwas glutaminowy za asparaginę w pozycji aminokwasu 137 rodzimego KGF.

Figura 40 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:85) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:86) dla związku ΔΝ23/Κ(139)Ε - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono kwas glutaminowy za lizynę w pozycji aminokwasu 139 rodzimego KGF.

Figura 41 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:87) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:88) dla związku AN23/K(139)Q - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono glutaminę za lizynę w pozycji aminokwasu 139 rodzimego KGF.

Figura 42 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:89) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:90) dla związku AN23/R(144)A - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono alaninę za argininę w pozycji aminokwasu 144 rodzimego KGF.

Figura 43 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:91) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:92) dla związku AN23/R(144)E - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono kwas glutamino wy t za argininę w pozycji aminokwasu 144 rodzimego KGF.

Figura 44 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:93) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:94) dla związku AN23/R(144)L - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23

182 888 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono leucynę za argininę w pozycj i aminokwasu 144 rodzimego KGF.

Figura 45 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:95) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:96) dla związku ΔΝ23/Κ(147)Ε - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono kwas glutaminowy za lizynę w pozycji aminokwasu 147 rodzimego KGF.

Figura 46 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:97) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:98) dla związku AN23/K(147)Q - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono glutaminę za lizynę w pozycji aminokwasu 147 rodzimego KGF.

Figura 47 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:99) oraz aminokwasową (SEQ ID NO: 100) dla związku ΔΝ23/Κ(153)Ε - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono kwas glutaminowy za lizynę w pozycji aminokwasu 153 rodzimego KGF.

Figura 48 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO:101) oraz aminokwasową (SEQ ID NO:102) dla związku AN23/K(153)Q - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono glutaminę za lizynę w pozycji aminokwasu 153 rodzimego KGF.

Figura 49 przedstawia sekwencje: nukleotydową (SEQ ID NO: 103) oraz aminokwasową (SEQ ID NO: 104) dla związku AN23/Q(152)E/K(153)E - analoga KGF, w którym usunięto pierwsze 23 aminokwasy z N-końca oraz podstawiono kwas glutaminowy za glutaminę w pozycji aminokwasu 152 i kwas glutaminowy za lizynę w pozycji 153 rodzimego KGF.

Figura 50 przedstawia wpływ ΔΝ23 na cukrzycę wywołaną streptozotocyną u szczurów Sprague-Dawley.

Zgodnie z wynalazkiem opracowano nowe analogi KGF. Dokonano ustalenia, że cztery reszty cysteinowe znajdujące się wrodzimym KGF (Cys¹ i Cys¹⁵, i Cys¹⁰² i Cys¹⁰⁶) mająudział w tworzeniu dwóch mostków dwusulfidowych. Cys⁴⁰ nie bierze udziału w tworzeniu wewnątrzcząsteczkowego wiązania dwusulfidowego. A zatem, KGF zawiera dwie małe pętle dwusulfidowe rozdzielone przez prawie 90 aminokwasów. W oparciu o pierwsze ustalenia, określenie, które reszty cysteinowe są zaangażowane w tworzenie mostków dwusulfidowych wskazuje, które cysteiny mogą swobodnie tworzyć niekorzystne międzycząsteczkowe wiązania sieciujące lub wiązania wewnątrzcząsteczkowe, które mogą spowodować, że proteina przyjmie niekorzystną strukturę trzeciorzędową, (przykładowo konformację, która zmniejsza aktywność proteiny).

Niespodziewanie okazało się, ze modyfikując KGF przez usunięcie lub podstawienie reszt aminokwasowych za reszty cysteinowe znajdujące się w pozycjach 1 i 15 KGF (pozycje 32 i 46 w SEQ ID NO:2) prowadzi do otrzymania analoga KGF mającego w istotny sposób polepszoną stabilność (przykładowo zmniejszone problemy wywołane przez nieodpowiednie sfałdowanie, tworzenie międzycząsteczkowego wiązania dwusulfidowego i/lub agregację protein). Przykładowo analogi KGF mogą w zasadzie być oczyszczane z większą wydajnością rozpuszczalnych, w odpowiedni sposób składowanych protein. Co więcej, materiał, który raz był oczyszczony, będzie bardziej odporny wobec pH, temperatury i tak dalej w porównaniu do stabilności wyjściowej molekuły. Chociaż nie chcąc być ograniczony przez teorię, uważa się, ze Cys¹ i Cys¹⁵w KGF poza tworzeniem miedzy cząsteczkowego mosty dwusulfidowego oraz N-końcowej pętli dwusulfidowej, w pewnych warunkach występują również jako wolne cysteiny, które są zdolne do tworzenia międzycząsteczkowych mostków dwusulfidowych, prowadzących do niestabilności i agregacji protein. Co więcej, zostało odkryte, że usunięcie N-końcowej pętli dwusulfidowej nie jest ważne do wiązania receptora lub aktywności mitogennej.

Jak przyjęto w niniejszym wynalazku, „analog KGF” lub „polipeptydowy analog KGF” będzie oznaczać każdy z opisanych naturalnych lub nie występujących w stanie naturalnym polipeptydów różniących się w strukturze od KGF przez posiadanie modyfikacji w sekwencji peptydowej odpowiadającej 24 aminokwasowemuN-końcowi KGF (aminokwasy 32 do 55

182 888 w SEQ ID N0:2), podczas gdy Cys¹ oraz Cys¹⁵ z KGF (aminokwasy 32 do 46 w SEQ ID NO:2) zostały zastąpione lub usunięte. Sposób, za pomocą którego cysteiny zostały zastąpione lub usunięte nie posiada zasadniczego znaczenia i wynalazek obejmuje, przykładowo, analogi polipeptydowe zawierające jedno lub więcej usunięć aminokwasów i/lub podstawień. Zatem, wynalazek dostarcza rodzinę nowych protein keratynocytowego czynnika wzrostu. Ta rodzina zawiera kilka grup protein.

Jedna z grup analogów KGF obejmuje cząsteczki, w których cysteiny w pozycji 1 i 15 KGF są zastąpione przez aminokwasy, włącznie z tymi, które nie występują w sposób naturalny w proteinach. Strategie wytwarzania takich analogów podstawieniowych obejmują ukierunkowaną-na-miejsce mutagenezę (Ho i współpracownicy (1989), Gene, 77:51-59; Innis i współpracownicy „PRC Protocols”, Academic Press, Inc. San Diego, CA). [Analogi KGF zawierające podstawienie aminokwasu są określane przez wskazanie reszty znajdującej się wpozycji podstawienia w dojrzałej cząsteczce proteiny (odejmując sekwencję sygnałową) opisanej sekwencją SEQ ID NO:2, następnie w nawiasie podana jest ta właśnie pozycja aminokwasu, a po nawiasie nowy aminokwas. Przykładowo, analog zawierający cysteinę podstawioną przez serynę w pozycji 15 w KGF (pozycja 46 w SEQ IDN0:2) opisywany jest jako „C(15)S”.]. Korzystne jest przekształcenie cysteiny w obojętny aminokwas taki jak glicyna, walina, alanina, leucyna, izoleucyna, tyrozyna, fenyloalanina, histydyna, tryptofan, seryna, treonina i metionina, z których najkorzystniejszymi aminokwasami - ze względu na ich największe podobieństwo do cysteiny, są seryna, treonina oraz alanina. Przykład I szczegółowo omawia wytwarzanie C(1,15)S z wykorzystaniem częściowej syntezy genowej (w sprzężeniu z innymi technikami rekombinacyjnymi), po którym następuje rekombinacyjna ekspresja w stabilnie transformowanym gospodarzu bakteryjnym.

Inna grupa analogów KGF obejmuje cząsteczki w których nastąpiło usunięcie cysteiny w pozycjach 1 i 15 KGF. Różne strategie mogą być wykorzystane do uzyskania takich analogów KGF, jak N-końcowe odcięcia lub specyficzne miejscowo usunięcia lub połączenie obu tych metod.

Termin „N-końcowe odcięcie” odnosi się do modyfikacji KGF, gdzie 1 do 24 N-końcowych reszt aminokwasowych KGF (aminokwasy 32 do 55 w SEQ ID NO:2), w tym z Cys¹ i Cys¹⁵- zostało usuniętych. [Analogi KGF zawierające odcięcie aminokwasów będą określane przez wskazanie reszty usuniętej w danej pozycji dojrzałej proteiny (bez sekwencji sygnalnej) podstawionej w SEQ ID NO:2, rozpoczynając się od miejsca usunięcia i przez wskazanie liczby usuniętych reszt. Przykładowo, analog KGF posiadający N-końcowe odcięcie 24 reszt z KGF (reszty 1 -55 w SEQ NO:2) będzie określany jako analog „ΔΝ24”]. W szczególności w tej grupie znajdą się analogi ΔΝ23 rodzimego KGF, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych 41-154 (aminokwasy 72-185 w SEQ IDN0:2), w tym zwłaszcza reszty aminokwasowe 123-133 (aminokwasy 154-164 w SEQ NO:2), są usunięte lub podstawione przez reszty obojętne lub reszty obdarzone ładunkiem ujemnym, wybrane tak, aby w rezultacie otrzymać proteinę ze zmniejszonym ładunkiem dodatnim. Resztami korzystnymi do modyfikacji są reszty Arg⁴¹, Gin⁴³, Lys⁵⁵, Lys⁹⁵, Asn¹³⁷, Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵², Lys¹⁵³ lub Thr¹⁵⁴, a zwłaszcza Gin¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gin¹⁵² lub Lys¹⁵³, wśród których Arg¹⁴⁴ jest najkorzystniejsza. Również w tej grupie znajdują się analogi ΔΝ32 rodzimego KGF mające modyfikacje tworzące pętle w obszarze pętlotwórczym: Asn¹¹⁵-His¹¹⁶-Tyr¹¹⁷-Asn¹¹⁸-Thr¹¹⁹(aminokwasy 146-150 w SEQ IDNO:2), korzystnie obejmujące modyfikację zmieniającą ładunek reszty aminokwasowej 116, a zwłaszcza podstawienie Gly w pozycji 116. Ponadto, objęte tą grupą są analogi ΔΝ23 rodzimego KGF mające jedno lub więcej podstawień aminokwasów, usunięć lub dodań w zakresie regionu 123-133 (aminokwasy o kolejności 154-164 SEQ ID NO:2) rodzimego KGF.

Przykład I podaje szczegóły syntetycznego generowania N-końcowych obcięć wykonanych za pomocą częściowej syntezy genowej, w połączeniu z innymi technikami rekombinacyjnymi, po której następuje rekombinacyjna ekspresja w trwale transformowanym bakteryjnym gospodarzu. Takimi przykładowymi N-końcowymi obcięciami będą ΔΝ 15 do ΔΝ24. Co więcej, przykład III szczegółowo objaśnia ekspresję - w kulturze komórek ssaków, DNA kodującego

182 888 rodzimy KGF i heterogeniczne N-końcowe glikozylowane izoformy, oczyszczanie korzystnie glikozylowanej izoformy mającej N-końcowe obcięcie aminokwasów 1-23 dojrzałej formy rodzimego KGF.

Dla kontrastu, usunięcie specyficzne dla miejsca odnosi się do modyfikacji KGF, w której jedną lub więcej reszt aminokwasowych (przykładowo Cys¹ lub Cys¹⁵) usunięto. Gdy Cys¹ lub Cys¹⁵ KGF są specyficznie usunięte, to powstały analog jest o jeden aminokwas krótszy niż KGF. [Analogi KGF zawierające usunięcie aminokwasu są określane przez wskazanie reszty znajdującej się w określonej pozycji w dojrzałej proteinie (bez sekwencji sygnalnej) przedstawionej w SEQ ID NO:2, po której w nawiasie podana jest pozycja aminokwasu, a po nawiasie występuje znak minus. Przykładowo,, analog z tej grupy obejmujący usunięcie cysteiny w pozycji 15 KGF (pozycja 36 w SEQ ID NO:2) określany jest jako „C(l 5)-”]. Usunięcia specyficzne co do miejsca mogą być otrzymywane za pomocą ukierunkowanej na miej sce mutagenezy, co opisano powyżej.

Grupą tą objęte są również analogi, w których przez wycięcie i usunięcie pozbyto się Cys¹i Cys¹⁵ z KGF. Na przykład, reprezentatywni przedstawiciele takich analogów KGF zawierają obcięcie pierwszych trzech reszt aminokwasowych (Cys-Asn-Asp) KGF lub obcięcie pierwszych ośmiu aminokwasów (Cys-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln) KGF sprzężone z usunięciem cysteiny w pozycji 15 KGF (te analogi są oznaczone odpowiednio jako ,,AN3/C(15)-” i ,,AN8/C(15)-”). Jako, że reszta metioninowa w naturalny sposób występuje jako czwarty i dziewiąty aminokwas w rodzimym KGF, nie jest potrzebny dodatkowy kodon Met, aby umożliwić prawidłowe rozpoczęcie translacji.

Wciąż dalsza grupa obejmuje cząsteczki, w których cysteiny w pozycji 1 i 15 KGF są zastąpione przez obcięcie i podstawienie. Przykładowo, przedstawicielem takich analogów KGF są AN3/C(15)S oraz AN8/C(15)S. Te analogi zawierają obcięcie pierwszych trzech amino-końcowych reszt aminokwasowych w KGF lub usunięcie pierwszych ośmiu amino-końcowy ch reszt aminokwasowych, sprzężone z podstawieniem cysteiny w pozycji 15 przez inny aminokwas, przykładowo serynę.

Gdy analogi KGF są wytwarzane w sposób biologiczny, na przykład są produktem ekspresji komórkowej w przeciwieństwie do syntezy w stanie stałym, do proteolitycznej lub enzymatycznej derywatyzacji naturalnie występujących produktów itp., kwasy nukleinowe kodujące takie polipeptydy będą różnić się jednym lub większą ilością nukleotydów w porównaniu z sekwencjąnukleotydową rodzimego KGF. Takie polinukleotydy mogą być poddawane ekspresji, a otrzymane polipeptydy - oczyszczane jedną z wielu, znanych biegłym w sztuce, technologicznych metod rekombinacyjnych.

Sekwencje DNA kodujące wszystkie lub część analogów KGF mogą zawierać między innymi inkorporowane kodony „preferowane” ze względu na ekspresję w wybranych komórkach gospodarza (przykładowo kodony ekspresji w E. coli), dostarczać miejsca do rozerwania przez enzymy restrykcyjne; oraz dostarczeć dodatkowe początkowe, końcowe lub pośrednie sekwencje nukleotydowe (przykładowo początkową metioninową resztę aminokwasową do ekspresji w komórkach E. coli), dla ułatwienia konstrukcji wektorów łatwo ulegających ekspresji.

Obecny wynalazek zapewnia również rekombinacyj ne cząsteczki lub wektory do stosowania w metodzie ekspresj i obecnych polipeptydów. Wektory tego rodzaj u mogązawierać DN A lub RNA i mogąbyć kołowe, liniowe, lub mieć budowę jednoniciową lub dwuniciowąi mogą występować wnaturze lub stanowić zestaw wielu składników, zarówno występujących naturalnie, jak i syntetycznych.

Znanych jest wiele przykładów takich jak wektorów ekspresji. Składniki tych wektorów, przykładowo replikony, geny selekcyjne, wzmacniacze, promotory oraz tym podobne, mogąbyć otrzymane ze źródeł naturalnych lub syntetycznych znanymi metodami. W każdym przypadku, wektory ekspresji mające zastosowanie w obecnym wynalazku będą zawierały co najmniej jeden element kontroli ekspresji funkcjonalnie związany z wstawioną cząsteczką kwasu nukeinowego kodującego peptydowy analog KGF. Ten element kontrolny jest odpowiedzialny za regulowanie ekspresji polipeptydu z cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku. Przydatne elementy kontrolne obejmują, przykładowo, lac. system, trp system, operatory i promotory z fagu λ,

182 888 glikolityczny promotor drożdżowy, promotor z drożdżowego genu kwasowej fosfatazy, drożdżowy czynnik alfa-kojarzący oraz promotory wyprowadzone z adenowirusa, wirusa Epstein-Barr’a, poliomy, małpiego wirusa, jak również różne inne pochodzące z retrowirusów. Jednakże, w stanie techniki znane są liczne inne wektory oraz elementy kontrolne odpowiednie do prokariotycznej lub eukariotycznej ekspresji i mogą zostać zastosowane w praktycznym wykorzystaniu obecnego wynalazku.

Przykłady odpowiednich prokariotycznych wektorów do klonowania mogą obejmować plazmidy z E. coli (przykładowo pBR322, col El, pUC oraz czynnik F), przy czym korzystnymi plazmidami sąpCFMl 156 (ATCC 69702), pCFM1656 (ATCC6976) oraz pCFM3102 (opisany poniżej w części dotyczącej przykładów). Inne odpowiednie wektory ekspresji, z których liczne typy są znane w stanie techniki jako przydatne do ekspresji w komórkach ssaków, owadów, drożdży, grzybów i bakterii, mogą również być obecnie zastosowane w tym celu. Transfekcja tych wektorów do odpowiednich komórek gospodarzy może prowadzić do ekspresji polipeptydowych analogów KGF według wynalazku.

Mikroorganizmy-gospodarze przydatne w obecnym wynalazku mogą być zarówno prokariotyczne jak i eukariotyczne. Odpowiednimi gospodarzami prokariotycznymi są różne szczepy E coli (przykładowo FM5, HB 101, DH5alfa, DH10 oraz MC 1061), Pseudomonas, Bacillus oraz Streptomyces, przy czym korzystnym gospodarzem prokariotycznym jest E. coli. Odpowiednie eukariotyczne komórki gospodarza obejmują komórki drożdży i innych grzybów, komórki owadów, komórki roślinne i zwierzęce, takie jak COS (przykładowo COS-1 oraz COS-7) oraz małpie linie komórkowe CV-1, linie komórkowe 3T3 pochodzące od myszy Swiss, Balb-c oraz NIH, mysie komórki HeLa i L-929 oraz komórki chomika: CHO, BHK lub HaK. W zależności od wybranego gospodarza, rekombinacyjne polipeptydy produkowane zgodnie z obecnym wynalazkiem będąglikozylowane przez pochodzące od ssaków lub inne eukariotyczne węglowodany lub tez mogą być nie-glikozylowane.

Korzystny sposób wytwarzania będzie zmieniał się i zależał od wielu czynników i uwarunkowań; optymalna procedura produkcyjna w danej sytuacji będzie jasno zrozumiała dla biegłych w sztuce, po niewielkiej dozie doświadczeń. Otrzymany produkt ekspresji może być następnie oczyszczony do stanu prawie homogenicznego znanymi sposobami. Typowa metoda oczyszczania w produkcji przy użyciu komórek prokariotycznych polega na rozerwaniu ścian komórkowych za pomocą wysokiego ciśnienia lub innych środków, odwirowaniu lub filtracji, w celu usunięcia pozostałości komórkowych i następnie chromatografii jonowymiennej płynu znad osadu lub filtratu, a w końcu - hydrofobowej chromatografii interakcyjnej. Jeżeli analog powstaje w formie nierozpuszczalnej, inna metoda oczyszczania polega najpierw na rozpuszczeniu ciał inkluzyjnych zawierających wytworzone analogi, a następnie chromatografii jonowymiennej oraz ponownym zfałdowaniu proteiny, a w końcu - interakcyjnej chromatografii hydrofobowej. Przykładowe metody oczyszczania są przedstawione w zgłoszeniu nr U.S. S.N. 08/323,339 złożonym 13 października 1994, dokonanym na rzecz tego samego uprawnionego. Generalnie zgłoszenie nr U.S. S.N. 08/323,339 ujawnia sposób oczyszczania keratynocytowego czynnika wzrostu obejmujący: a) otrzymanie roztworu zawierającego pożądany KGF; b) związanie KGF z roztworu z etapu a) z zywicąj ono wymienną: c) wypłukanie KGF w roztworze eluenta z żywicy jonowymiennej; d) albo przepuszczenie roztworu eluatu z etapu c) przez odpowiednią molekularną matrycę rozdzielającą pod względem wagi, albo poddanie eluatu z etapu c) hydrofobowej interakcyjnej chromatografii; oraz e) wyodrębnienie pożądanego KGF z matrycy rozdzielającej według masy z hydrofobowej chromatografii interakcyjnej.

Oczywiście, obecne analogi mogą być poddane szybkiemu skriningowi, aby określić ich własności fizyczne. Poniższa część opisu obejmująca przykłady zawiera omówienie różnych dobrze znanych prób do badania stabilności, chociaż wybór określonej próby do badania obecnego analoga nie ma decydującego znaczenia. Co więcej, poziom biologicznej aktywności (przykładowo zdolność do wiązania receptora i/lub powinowactwo do receptora, mitogeneza, proliferacja komórek i/lub aktywność in vivo) mogą być również testowane za pomocą przeróżnych prób, a niektóre z nich są przedstawione w poniższej części doświadczalnej. Liczne próby

182 888 są dobrze znane i mogą zostać zastosowane do szybkiego zbadania obecnych analogów KGF w celu określenia, czy posiadająone ekceptowalny poziom aktywności biologicznej, czy też go nie posiadają. Jedna z takich prób specjalnie sprawdza analogi KGF na ich zdolność wiązania się z receptorem KGF (KGFR) przez konkurencję wiązania ¹²⁵I-KGF (Bottaro i współpracownicy, (1990), J. Biol.Chem 2626, 12767-12770; Ron i współpracownicy (1993), J.Biol Chem. 268, 2984-2988). Alternatywny sposób sprawdzenia interakcji KGFR i analoga KGF oparty jest na wykorzystaniu takich technik jak analiza oddziaływań biospecyficznych (BIA) w czasie rzeczywistym (Felder i współpracownicy (1993), Molecular & Cellular Biology, 13:1449-1455). Dodatkowo próba mitogeniczna może być wykorzystana do sprawdzenia zdolności analogów KGF do stymulacji syntezy DNA (Rubin i współpracownicy (1989), cytowana powyżej). Ostatecznie, próby na proliferację komórek mogąbyć zastosowane do oceny zdolności analogów KGF do stymulowania proliferacji komórek (Falco i współpracownicy, Oncogene 2;273-578). Stosując jakąkolwiek omówioną powyżej próbę, analogi KGF mogąbyć błyskawicznie sprawdzone pod kątem ich aktywności biologicznej.

W korzystnym przykładzie realizacji, obecny wynalazek nakierowany jest na analogi KGF, które zachowują całkowitą (to znaczy co najmniej istotnie podobną) aktywnośćciach zbadanych za pomocą jednej lub większej ilości powyższych prób, są: C(1,15)S, AN3/C(15)S, AN3/C(15)-, AN8/C(15)S, AN8/C(15)-, ΔΝ15, ΔΝ16, ΔΝ17, ΔΝ18, ΔΒΝ19, ΔΝ20, ΔΝ21, ΔΝ22, ΔΝ23, ΔΝ24 lub AN23/R(144)Q.

Analogi KGF mogąbyć dalej modyfikowane tak, aby zawierały dodatkowe ugrupowania chemiczne, które normalnie nie są częścią peptydu. Takie zderywatyzowane cząsteczki mogą polepszyć rozpuszczalność, absorpcję, biologiczny czas półtrwania oraz inne własności obecnego analoga KGF. Takie reszty mogą również alternatywnie eliminować albo osłabiać dowolne niepożądane efekty uboczne proteiny i jej podobnych. Ugrupowania zdolne do pośredniczenia w osiągnięciu takich efektów są opisane, przykładowo w REMINGTON 'S PHARMACE UTICAL SCIENCES, wydanie 18, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Kowalencyjne modyfikacje można wprowadzić do cząsteczki w wyniku reakcji wybranej reszty aminokwasowej w cząsteczce peptydu z ograniczonym związkiem derywatuzującym, który jest zdolny do reakcji z wybranymi łańcuchami bocznymi lub resztami końcowymi (T.E. Creighton (1983), PROTEINS: STRUCTUREAND MOLECULE PROPERTIES, W.H. Freeman & Co., San Francisco, str. 79-86). Glikol polietylenowy („PEG”) jest jednym z takich chemicznych ugrupowań, które jest szeroko stosowane do przygotowania terapeutycznych produktów proteinowych. Dla niektórych protein wykazano, że przyłączenie glikolu polietylenowego zabezpiecza przed proteolizą, Sada i współpracownicy, (1991), J Fermentation Bioengineering, 71:137-139. Jednocześnie, dostępne są sposoby przyłączenia pewnych reszt glikoli polietylenowych. Patrz patent USA nr 4 179 337, Davis i współpracownicy, „Nowe Immunologiczne Polipeptydy” wydany 18 grudnia 1979 oraz patent USA nr 4 002 531, Royer „Modyfikacja enzymów przez glikole polietylenowe i otrzymane tak produkty” wydany 11 stycznia 1977. Przegląd można znaleźć w: Abuchowski i współpracownicy, w Enzymy jako środki lecznicze (Enzymes as Drugs). Holcerberg i Roberts (redaktorzy), str. 367-383 (1981). Dla glikolu polietylenowego liczne środki były wykorzystywane do przyłączenia cząsteczki glikolu polietylenowego do proteiny. Ogólnie rzecz biorąc, cząsteczki glikolu polietylenowego są przyczepione do proteiny poprzez reaktywną grupę znajdującą się w proteinie. Grupy aminowe, takie jak grupa aminowa reszcie lizynowej lub naN-końcu, są wygodne do takiego przyłączenia. Na przykład Royer (patent USA nr 4 002 531, opisany powyżej) podaje, że redukcyjne alkilowanie było zastosowane do połączenia cząsteczki glikolu polietylenowego do enzymu. Patent europejski nr EP 0 539 167 opublikowany 28 kwietnia 1993, Wright „Imidany PEG i ich pochodne proteinowe” )”Peg Imidates and Protein Derivates Thereof ’) podaje się, że peptydy i organiczne związki z wolną (wolnymi) grupą (grupami) aminową (aminowymi) są modyfikowane przez pochodne imidowe PEG lub pokrewnych polimerów rozpuszczalnych w wodzie. Patent USA nr 4 904 584, Shaw, wydany 27 lutego 1990, odnosi się do modyfikacji licznych reszt lizyno wy ch w proteinach w celu dołączenia cząsteczek glikolu polietylenowego poprzez reaktywne grupy aminowe.

182 888

W innym przykładzie realizacji, obecny wynalazek jest ukierunkowany na kompozycje farmaceutyczne w dawkach jednostkowych, które mogą być wykorzystane do podawania pozajelitowego lub doustnie podczas leczenia zwierząt ciepłokrwistych (takich jak ludzie). Środki farmaceutyczne tego rodzaju mogą być w formie liofilizowanej lub w innej formie odwodnionej środka terapeutycznego lub diagnostycznego, którą można zrekonstruować przez dodanie fizjologicznie akceptowalnego rozpuszczalnika. Rozpuszczalnikiem takim może być dowolne medium takie, jak sterylna woda, roztwór fizjologiczny solanki, roztwór glukozy lub inny wodny roztwór węglowodanu (przykładowo poliolu takiego, jak mannitol, ksylitol lub gliceryna), zdolny do rozpuszczenia suchej kompozycji, kompatybilny z wybraną drogą podawania i który nie oddziaływuje w sposób negatywny z substancją aktywną oraz z zastosowanymi stabilizatorami rekonstrukcyjnymi. W szczególnym przykładzie realizacji, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zestaw do sporządzania jednostkowej dawki do określonego podawania. Taki zestaw zawiera zarówno pierwszy pojemnik zawierający wysuszoną proteinę oraz drugi pojemnik zawierający wodną kompozycję zawierającą rekonstrukcyjny stabilizator. Odnośnie stężenia proteiny w roztworze, objętości roztworów, które są wprowadzone do każdego z pojemników oraz pojemności pojemników (parametry związane ze sobą, które mogą być w odpowiedni sposób modyfikowane w zależności od wymaganego stężenia aktywnego składnika w finalnej dawce jednostkowej), stwierdzić należy, że wielkości'te można zmieniać w szerokim zakresie, dobrze znanym biegłym w sztuce.

Analogi KGF według obecnego wynalazku mogą być przydatne jako środki terapeutyczne i diagnostyczne oraz jako środki badawcze. A zatem analogi KGF mogą być stosowane w próbach in vitro i/lub in vivo do ilościowego określania KGF w tkance lub w próbce organu lub do określenia i/lub wyizolowania komórek, które ekspresjonująKGFR (Bottaro i współpracownicy, (1990), J. Biol. Chem.,265-\2161-\2110', Ron i współpracownicy (1993), J Biol. Chem., 268:2984-2988). W próbach dotyczących tkanek lub organów będzie mniej radioaktywności od analoga ¹²⁵I-KGF wiążącego KGFR, w porównaniu do standaryzowanej (wzorcowej) krzywej wiązania analoga ^I2SI-KGF, na skutek wiązania nieznakowanego rodzimego KGF do KGFR. Podobnie analog ^12SI-KGF można wykorzystać do wykrywania obecności KGFR w komórkach różnego rodzaju.

Obecny wynalazek rozważa również zastosowanie analoga KGF do generowania przeciwciał wytwarzanych przeciwko peptydowi, które to przeciwciała łączą się również z rodzimym KGF. W tym aspekcie realizacji wynalazku, przeciwciała są przeciwciałami monoklonami lub poliklonami z pochodzenia i są wytwarzane przy użyciu analoga KGF. Otrzymane przeciwciała wiążąsię przede wszystkim do rodzimego KGF, zwłaszcza gdy proteina ta znajduje się w swojej naturalnej (biologicznie aktywnej) konformacji. Takie przeciwciała mogą być zastosowane do detekcji lub oczyszczania rodzimego KGF.

Co więcej, obecny wynalazek dotyczy również zastosowania analogów KGF do odkrywania wysoce pokrewnych lub małopokrewnych cząsteczek wiążących KGF, mających zastosowanie terapeutyczne, przykładowo, jako środek do skutecznego dostarczania KGF lub jako inhibitor aktywności KGF. Termiczna stabilność analogów KGF jest ważna do zidentyfikowania takich molekuł wiążących w warunkach fizjologicznych (przykładowo w temperaturze 37°C) skoro ich zdolność do wiązania się z KGF może być silnie zależna od temperatury i może być nieprzewidywalnie odmienna od zdolności do wiązania się przejawianej w temperaturze 4°C.

Dla zastosowań in vivo, analogi KGF mogą być formułowane w kompozycje z różnymi dodatkami. Dodatki tego rodzaju obejmują bufory, nośniki, stabilizatory, obojętne środki dodatkowe (wypełniacze farmaceutyczne), środki konserwujące, środki regulujące toniczność, antyutleniacze i tym podobne (przykładowo związki regulujące lepkość lub rozcieńczalniki). Wybór tych specyficznych dodatków zalezeć będzie od formy przechowywania (to znaczy postać ciekła lub liofilizowana) oraz od dróg podawania analogów KGF. Odpowiednie kompozycje, znane w stanie techniki, można znaleźć w REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (ostatnie wydanie), Mack Publishing Company, Easton, PA.

182 888

Analogi KGF mogą być stosowane w terapeutycznie skutecznych ilościach do tkanek specyficznie cechujących się uszkodzeniem lub - klinicznie niewystarczającą ilością nie-fibroblastowych komórek nabłonkowych. Obszary, w których analogi KGF mogą być z powodzeniem podawane obejmują, lecz nie wyłącznie: stymulację, proliferację i różnicowanie struktur przydatkowych takich, jak torebki włosowe, gruczoły potowe, oraz gruczoły łojowe u pacjentów z poparzeniami oraz innymi częściowymi lub na całej grubości uszkodzeniami; przyspieszone odtwarzanie nabłonka podczas obrażeń spowodowanych przez epidemię naskórka bullosa, co jest defektem w przyleganiu naskórka do lezącej poniżej skóry, prowadzące do często otwartych, bolesnych pęcherzy, które mogą spowodować znaczną chorobliwość; zapobieganie wywołanemu przez chemoterapię łysieniu oraz leczenie typowej dla męzczyzn łysiny lub postępującej utraty włosów u mężczyzn i u kobiet, leczenie wrzodów żołądka oraz dwunastnicy; leczenie zapalnych chorób jelit takich jak choroba Crohna (wpływająca zasadniczo na jelito cienkie) oraz wrzodowy nieżyt kiszek (wpływający zasadniczo na jelito grube); zapobieganie lub zmniejszanie zatruć kiszek podczas reżimu kuracji radiacyjnej lub chemoterapii do kuracji (przykładowo wstępna kuracja i/lub kuracja końcowa) w celu wywołania efektu chroniącego komórki (cytoochrona) lub ich regenerację lub oba efekty naraz; wywoływanie produkcji śluzu przez cały przewód gastryczno-wchłanialny; wywoływanie proliferacji oraz różnicowania rodzaju II komórek płucnych (pneumocyty), co może okazać się być pomocne w leczeniu lub zapobieganiu chorobom takim jak choroba membran ciała szklistego (przykładowo syndrom niemowlęcej choroby oddechowej oraz oskrzelowo-płucna duszność (dysplazja) występująca u wcześniaków; przyspieszenie proliferacji i różnicowania nabłonka oskrzelowego i/lub pęcherzyków płucnych w ostrym lub chronicznym uszkodzeniu płuc lub jego niedoborem wywołanym przez uszkodzenia podczas inhalacji (włącznie z zbyt wysokim stężeniem tlenu), rozedma płuc, stosowanie środków leczniczych chemicznych uszkadzających płuca, uszkodzenia układu oddechowego lub inne uwarunkowania uszkadzające płuca; podwyższenie funkcja wątroby w celu leczenia lub zapobieganiu marskości żółtaczkowej, wybuchowego uszkodzenia wątroby, uszkodzenia wywołanego przez ostrą wirusową żółtaczkę i/lub toksyczne obrażenia wątroby; wywołanie regeneracji komórek rogówki, przykładowo podczas leczenia uszkodzeń rogówki; wywołanie regeneracji komórek nabłonkowych w celu leczenia postępującej choroby dziąseł; wywołanie regeneracji bębenkowych komórek nabłonkowych podczas leczenia uszkodzenia bębenka usznego oraz leczenie lub zapobieganie rozpoczęciu cukrzycy jako środka pomocniczego przy przeprowadzaniu przeszczepu komórek wyspowatych.

Pacjent, któremu potrzebna jest proliferacja niefibroblastowych komórek nabłonkowych będzie otrzymywać dawki skutecznych ilości analogaKGF. Jako „skuteczna ilość” należy rozumieć taką ilość analoga KGF jaka jest wymagana do uzyskania pożądanej odpowiedzi leczonego pacj enta i będzie zatem generalnie określona przez lekarza prowadzącego. Czynniki wpływaj ące na ilość podawanego analoga KGF będą uwzględniały wiek i ogólny stan pacjenta, rodzaj leczonej choroby i tak dalej. Typowe dawki będą zawierać się w zakresie od 0,001 mg/kg masy ciała do 500 mg/kg masy ciała.

Analog KGF może być w bezpieczny sposób dozowany parenteralnie (przykładowo dożylnie - IV, dotkankowo - IT, domięśniowo -IM, podskórnie - SC lub dootrzewnowo - IO), doustnie lub zewnętrznie miejscowo ciepłokrwistym zwierzętom (takim jak ludzie). Analog KGF może być stosowany jednokrotnie lub może być podawanych w dawce wielokrotnej, zależnie od choroby i stanu pacjenta. W niektórych przypadkach analog KGF może być dawkowany jako środek pomocniczy przy innych terapiach oraz także wraz z innymi kompozycj ami farmaceutycznymi.

Poniższe przykłady zamieszczono w celu pełniejszego zilustrowania obecnego wynalazku. Zrozumiałe jest, że mogą być poczynione modyfikacje w przedstawionych procedurach, bez odchodzenia od ducha niniejszego wynalazku.

Standardowe metody występujące w wielu opisanych procedurach w poniższych przykładach, lub odpowiednie alternatywne procedury, są dostępne w szeroko znanych podręcznikach biologii molekularnej takich jak, przykładowo, Molecular Cloning (Klonowanie Molekularne), Second Edition, Sambrook i współpracownicy, Cold Spring Harbor Labboratory Press

182 888 (1987) oraz Current Protocols in Molecular Biology (Obecne Metody w Molekularnej Biologii), Ausabel i współpracownicy, Green Publishing Associates/Wiley Interscience, New York (1990).

Przykład I. Przygotowanie DNA kodującego KGF oraz analogi KGF

Klonowanie genu ludzkiego KGF o pełnej długości (kodowanie polipeptydu o sekwencji z rodzimego KGF) przeprowadzono zarówno na drodze łańcuchowej reakcji polimeryzacji (PCR) RNA z komórek zwierzęcych Jak i na drodze PCR chemicznie zsyntetyzowanych (kodon zoptymalizowany dla£. coli) oligonukleotydów (związków „OLIGO”). Obie procedury zostały opisane poniżej:

MetodąPCR przeporowadzono powielanie (amlifikacja PCR) RNA wyizolowanego z komórek znanych z wytwarzania polipeptydu KGF. Na początku, komórki z ludzkiej linii komórek fibroblastowych AG 1523A (otrzymanych z Humań Genetic Mutant Celi Culture Repository Institute For Medical Research, Camden, New Jersey - Instytutu Badań Medycznych w Składnicy Ludzkich Genetycznie Zmienionych Mutantów Kultur Komórkowych) zostały rozerwane za pomocą tiocyjanianu guanidyny, a następnie poddano je ekstrakcji (zgodnie z metodą Chomyzinskiego i współpracowników (1987), Anal. Biochem. 172:156). Stosując standardowy protokół odwróconej transkryptazy dla całego RNA, wytworzono cDNA czynnika KGF. Amplifikację PCR (PCR#1) genu KGF przeprowadzono stosując cDNA czynnika KGF jako matrycę oraz primery OLIGO# 1 i OLIGO#2, kodujące sekwencje DNA w bezpośrednim sąsiedztwie końców 5' oraz 3' genu KGF [Model 9600 termocyklera (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT); 28 cykli; każdy cykl składał się z jednej minuty w 94°C w celu denaturacji (rozdzielenia nici), dwie minuty w 60°C dla splatania (annealingu) i następnie 3 minuty w 72°C dla syntezy (wydłużania - elongacji)]. Niewielkie próbki produkty z reakcji PCR#1 stosowano następnie jako matrycę do drugiej amplifikacji PCR (PCR#2) KGF, identycznej pod względem warunków poszczególnych cykli, z opisaną powyżej, z tym jedynie wyjątkiem, ze temperatura splatania wynosiła 50°C. Dla ekspresyjnego klonowania genu KGF, zastosowano zagnieżdżone primery PCR do wytworzenia dogodnych miej sc restrykcyj nych na obu końcach genu KGF. Zastosowano związki OLIGO#3 oraz OLIGO#4 do zmodyfikowania produktu KGF DNA z reakcji PCR#2 tak, aby obejmował miejsca restrykcyjne Mluloraz BamHIodpowiednio na końcach 5' oraz 3' genu [PCR#3; 30 cykli; każdy cykl składający się z jednej minuty w 94°C w celu denaturacji, dwie minuty w 60°C dla splatania oraz trzy minuty w 72°C dla elongacji].To DNA było następnie rozcięte za pomocą Mlul oraz BamHI, ekstrahowane fenolem i wytrącone etanolem. Następnie ponownie przeprowadzono je w zawiesinę oraz ligowano (stosując T4 ligazę) do plazmidu pCFMl 156 (fig. 2A), który zawierał sekwencję sygnalną „RSH” aby wytworzyć konstrukt RSH-KGF (fig. 3).

Produkty ligacji transformowano (metodąHanahan’a (1983), J. Mol. Biol., 166:557) do £ coli szczepu FM5 (ATCC: 53911) oraz naniesiono na płytki LB+kanamycyna w temperaturze 28°C. Wybrano kilka transformantów i hodowano je w małych ciekłych kulturach zawierających 20 pg/mL kanamycyny. Wyizolowano plazmid RSH-KGF z komórek każdej z hodowli i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA. Z powodu wewnętrznego miejsca We/ w genie KGF, nie było możliwe bezpośrednie klonowanie naturalnej sekwencji genu do pożądanego wektora ekspresji ze skrajnymi miejscami restrykcyjnymi Ndel oraz BamHI. Osiągnięto to w trzystopniowej ligacji. Plazmid RSH-KGF został rozcięty w swych unikalnych miejscach restrykcyjnych Bsmloraz Sstl i po zastosowaniu elektroforezy na 1% żelu agarozowym wyizolowano fragment DNA (obejmujący koniec 3' genu KGF) o ok. 3 kilopar zasad (kbp). Amplifikację PCR (PCR#4) przeprowadzono tak, jak to opisano dla PCR#3 z tą jedynie różnicą, że podstawiono OLIGO#5 zamiast OLIGO#3. Otrzymany w wyniku PCR produkt DNA został następnie rozcięty za pomocą Ndel oraz Bsmli fragment DNA o 311 parach zasad (bp) został wyizolowany w wyniku elektroforezy na 4% żelu agarozowym. Trzecim elementem ligacji jest fragment DNA o 1.8 kbp, z plazmidu pCFM 1156 rozciętego za pomocąNdel oraz Sstl i wyizolowany w wyniku elektroforezy na 1 % żelu agarozowym. Po ligacji (T4 ligaza), transformacji, selekcji przy użyciu kanamycyny i sekwencjonowaniu DNA, jak to zostało opisane powyżej, otrzymano klon zawierający konstrukt przedstawiony na rysunku fig. 4 oraz plazmid oznaczony KGF. Z powodu wewnętrznego rybozomowego miejsca wiążącego, które wytwarza obcięte produkty, sekwencja DNA czynnika KGF

182 888 pomiędzy unikalnymi miejscami KpnI oraz EcoRI została zastąpiona przez chemicznie syntetyzowane związki OLIGO (OLIGO#6 do OLIGO#11) w celu zminimalizowania wykorzystania tego wewnętrznego miejsca startowego (fig.5).

OLIGO# 1 (SEQIDNO:7): 5’-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3’

OLIGO#2 (SEQ ID NO:8): 5’-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3’

OLIGO#3 (SEQIDNO:9): 5’-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3’

OLIGO#4 (SEQ ID NO: 10):

’-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3 ’

OLIGO#5 (SEQ ID NO:11):

5’-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3’

OLIGO#6 (SEQ ID NO: 12):

’-CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3 ’

OLIGO#7 (SEQ ID NO: 13):

’AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3 ’

OLIGO#8 (SEQ ID NO: 14):

’-GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3 ’

OLIGO#9 (SEQ ID NO: 15):

’-TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3 ’

OLIGO#10 (SEQ ID NO: 16):

’-ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTC ATC-3 ’

OLIGO# 11(SEQ ID NO: 17):

’-AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3 ’

Związki OLIGO były fosforylowane za pomocą polinukleotydowej kinazy T4 i następnie denaturowane przez ogrzewanie. Jednoniciowe (ss) związki OLIGO były następnie pozostawione do utworzenia dwuniciowego (ds) fragmentu DNA przez pozwolenie temperaturze na powolne opadanie do temperatury pokojowej. Następnie zastosowano ligazę T4 do kowalentnego związania obu wewnętrznych lepkich końców związków OLIGO oraz całego dwuniciowego (ds) fragmentu OLIGO do plazmidu KGF rozciętego za pomocąKpnIoraz EcoRI. Nowy plazmid oznaczono jako KGF (dsd).

Kompletny gen KGF z kodonem zoptymalizowanym dla E. coli został skonstruowany za pomocą amplifikacj i PCR chemicznie zsyntetyzowanych związków OLIGO od #12 do #24.

OLIGO#12 (SEQ ID NO: 18): 5’AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3’

OLIGO# 13 (SEQ ID NO: 19): 5’-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3’

OLIGO# 14(SEQ ID NO:20):

5’-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3’

182 888

OLIGO# 15 (SEQ ID NO:21):

5’-CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGTGTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3’

OLIGO# 16 (SEQ ID NO:22):

5’-CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA-3’

OLIGO# 17 (SEQ ID NO:23):

5’-GGTGTTGAATCTGAATTTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3’

OLIGO# 18 (SEQ ID NO:24):

5’-CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3’

OLIGO# 19 (SEQ ID NO:25):

5’-ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3’

OLIGO#20 (SEQ ID NO:26):

OLIGO#21 (SEQ ID NO:27):

OLIGO#22 (SEQ ID NO:28):

OLIGO#23 (SEQ ID NO:29):

OLIGO#24 (SEQ ID NO:30):

’-TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3 ’-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3 ’ ’-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3 ’ ’-CC AGGATCAGTTCTTTGAAG-3 ’ ’-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3

Związki OLIGO #12 do 24 zostały zaprojektowane w taki sposób, że całkowita sekwencja DNA kodującego rodzimy KGF została przedstawiona przez związki OLIGO albo z nici „Watson” albo z nici „Craig”, a po amplifikacji PCR były zdolne do wytworzenia pożądanej dwuniciowej sekwencji DNA (fig. 6) [PCR#5, Model 9600 termocykler, Perkin-Elmer Cetus]; 21 cykli, każdy cykl składający się z 31 sekund w 94°C do denaturacji, 31 sekund w 50°C do splatania oraz 31 sekund w 73°C do wydłużania; po 21 cyklach łańcuchową reakcję polimeryzacji zakończono prowadząc ostatni etap wydłużania przez 7 minut]. Po amplifikacji PCR, wytworzony fragment DNA został rozcięty za pomocą A7?cz7 oraz BamHI i fragment o 521 bp ligowano do ekspresyj nego plazmidu pCFMl 156 rozciętego za pomocą tych samych enzymów. W PCR#5 wykorzystano zewnętrzne primery (100 pmoli/100 μΐ rxn) OLIGO#2 oraz OLIGO#13 oraz 1 μΐ/ΐ 00 μΐ rxn matrycy KGF uzyskanej przez ligację (za pomocą ligazy T4) związków OLIGO#14 do OLIGO#19 (OLIGO# 15 do OLIGO# 18 były fosforylowane za pomocą kinazy polinekleotydowej T4) stosując związki OLIGO#20 do OLIGO#234jako pasmo-wspomagające związki oligo (Jayaraman i współpracownicy (1992), Biotechniques, 12:392) do ligacji. Ostateczny konstrukt oznaczono jako KGF (kodon zoptymalizowany).

Wszystkie analogi KGF opisane tutaj składają się częściowo z sekwencji DNA znalezionych w KGF (dsd) lub w KGF (kodon zoptymalizowany), lub z ich kombinacji. Sekwencje te są dalej modyfikowane poprzez wstawienie do odpowiednich miejsc restrykcyjnych sekwencji DNA kodujących aminokwasy szczególnego analoga KGF, zrealizowane przy wykorzystaniu jednej lub kilku wyżej opisanych technik syntezy fragmentów DNA. Dowolny z tych analogów może być w całości wytworzony wyżej wymienionymi technikami. Jednakże, zastosowano kodony zoptymalizowane dla E. coli, gdzie było to właściwe - jako część ogólnego projektu OLIGO,

182 888 chociaż obecność kodonów zoptymalizowanych dla E coli w części lub we wszystkich genach, gdzie było to badane nie spowodowała istotnego wzrostu wydajności protein, które mogły być otrzymane z wyhodowanych komórek bakterii. Na rysunkach fig. 7 do 24 oraz fig. 36 do 49 przedstawiono dogodne przykłady konstrukcji sekwencji nukleotydów i sekwencji aminokwasów poszczególnych analogów KGF:

C(1,15)S fig. 7); AN3/C(15)S (fig. 8); AN3/C(15) - (fig. 9); AN8/C(15)S (fig. 10); AN8/C(15)-(fig. ll);AN15(fig. 12);AN16(fig. 13);AN17(fig. 14);ΔΝ18 (fig. 15);AN19(fig. 16); AN20(fig. 17);ΔΝ21 (fig. 18);AN22(fig. 19);AN23(fig.20);AN24(fig.21);C(l,15)S/R(144)E (fig. 22); C(1,15)S/R(144)Q (fig. 23); AN23/R(144)Q (fig. 24); C(l,15,40)S (fig. 36); C(l,15,102)S (fig. 37); C(l,15,102,106)S (fig. 38); ΔΝ23/Ν(137)Ε (fig. 39); ΔΝ23/Κ(139)Ε (fig. 40); AN23/K(139)Q (fig. 41); AN23/R(144)A (fig. 42); AN23/R(144)E (fig. 43); AN23/R(144)L (fig. 44); AN23/K(147)E (fig. 45); AN23/K(147)Q (fig. 46); AN23/K(153)E (fig. 47); AN23/K(153)Q (fig. 48); oraz AN23/Q(152)E/K(153)E (fig. 49). Wszystkie opisane tu konstrukcje analogów KGF miały potwierdzoną sekwencję DNA.

Przykład II. Wytwarzanie w E. coli

A. Ekspresja analogów KGF

Trzy różne plazmidy ekspresji wykorzystano do klonowania genów analogów KGF. Były to: pCFMl 156 (ATCC# 69702), pCFM1656 (ATCC# 69576) i pCFM3102 (odpowiednio rysunki: fig. 2A, 2B i 2C). Plazmid p3102 można uzyskać z plazmidu pCFMl 656 przez wykonanie serii zmian zasad w określonych miejscach metodąmutagenicznej amplifikacji PRC zachodzących na siebie związków oligo. Wychodząc z miejsca 5g/// (odpowiednio pCFM1656 -bp# 180) bezpośrednio 5' względem promotora replikacji plazmidu, P_copB, i postępując w kierunku genów replikacji plazmidu zmiany par zasad są następujące:

# pary zasad	para zasad	zmieniona para zasad
w pCFMl 656	w pCFMl 656	wpCFM3102
#204	T/A	C/G
#428	A/T	G/C
#509	G/C	A/T
#617	—	insert dwóch G/C bp
#677	G/C	T/A
#978	T/A	C/G
#992	G/C	A/T
# 1002	A/T	C/G
# 1005	C/G	T/A
# 1026	A/T	T/A
# 1045	C/G	T/A
# 1176	G/C	T/A
# 1464	G/C	T/A
#2026	G/C	usunięcie pary zasad
#2186	C/G	T/A
#2479	A/T	T/A
# 2498-2501	AGTG	GTCA
	TCAC	CAGT
#2641-2647	TCCGAGC	usunięcie pary zasad
	AGGCTCG
#3441	G/C	A/T
#3452	G/C	A/T
#3649	A/T	T/A
#4556	—	insert par zasad

(SEQ ID NO:67) 5'- GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3' (SEQ ID NO:68) 3'- CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-5'

182 888

Jak widać z powyższego, pCFMl 156, pCFM1656 oraz pCFM3102 są do siebie bardzo podobne i zawierają wiele takich samych miejsc restrykcyjnych. Plazmidy te zostały wybrane dla wygody, a składniki wektora DNA można łatwo wymienić dla celów nowych konstruktów. Gospodarzem stosowanym do wszystkich klonowań był szczep E. coli FM5 (ATCC: 53911) i transformacje prowadzono metodą Hanahan’a (1983), (supra), bądź też metodą elektrowymywania z wykorzystaniem urządzenia do transfekcji Gene Pulser™ (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA), zgodnie z fabryczną instrukcją obsługi.

Na wstępie zapoczątkowano niewielką świeżą hodowlę materiału inokulacyjnego pożądanego klonu rekombinantu E. coli przechowującego pożądany konstrukt na jednym z trzech wektorów pCFM, poprzez przeniesienie 0,1 mL zamrożonej gliceryny z wyj ściowym odpowiednim szczepem bakteryjnym do naczynia o pojemności 2 L, zawierającego 500 ml brzeczki Luria. Hodowlę wytrząsano przez 16 godzin w temperaturze 30°C, po czym hodowlę przeniesiono do naczynia fermentacyjnego o pojemności 15 L zawierającego 8 L wyjałowionej pożywki (Tsai, et al. (1987), J. Industrial Microbiol., 2: 181-187).

Fermentację szarżowąwsadu rozpoczęto wprowadzając pożywkę Feed #1 (Tsai, et al (1987), supra). Kiedy wskaźnik OD600 osiągnął 35, indukowano ekspresję pożądanego analogu KGF poprzez szybkie podniesienie temperatury hodowli do 37°C na dwie godziny, a następnie do temperatury 42°C powodując denaturację represora Cl. Zaprzestano dodawania Feed 1 i rozpoczęto dodawanie pożywki Feed 2, z początkową szybkością dodawania 300 mL/godzinę. Pożywka Feed 2 składała się ze 175 g/L peptonu tryptykazy, 87,5 g/L ekstraktu drożdży oraz 260 g/L glukozy. Po upływie jednej godziny w temperaturze 42°C, temperaturę hodowli obniżono do 36°C i tę temperaturę utrzymywano przez następne 6 godzin.

Następnie fermentację zatrzymano i komórki zebrano przez odwirowanie do plastikowych toreb umieszczonych w 1 -litrowych butelkach wirówkowych. Komórki pastylkowano przez odwirowanie z szybkością400 obrotów na minutę w ciągu 60 minut, po czym ciecz znad osadu usuwano, a pastę komórkową oziębiono do temperatury -90°C.

Po ekspresji różnych różnych analogów KGF w E. coli, rodzimy KGF i proteiny C( 1,15)S, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, ΔΝ15, ΔΝ23 oraz AN23/R(144)Q oczyszczano stosując następującą procedurę. Pastę komórkową z fermentacji, o wysokiej gęstości komórkowej, rozpraszano w temperaturze 4°C w 10-20% roztworze (masa na objętość) zawierającym 0,2 M NaCl i 20 mMNaPO₄, o pH=7,5, stosując odpowiedni wysokotnący mikser. Następnie, komórki w stanie zawiesiny poddawano lizie przepuszczając roztwór trzykrotnie przez homogenizator (APV Gaulin, Inc., Everett, MA). Wypływający homogenat schładzano do temperatury 4-8°C stosując odpowiedni wymiennik ciepła. Odpady płuczkowe (Debris) usuwano przez odwirowanie lizatu w wirówce typu J-6B™ (Beckman Instruments, Inc., Brea, CA) wyposażonej w wirnik JS 4.2, stosując prędkość 4200 obrotów na minutę przez 30-60 minut, w temperaturze 4°C. Następnie roztwór znad osadu ostrożnie dekantowano i wprowadzano na uprzednio przy gotowaną kolumnę o objętości 450 mL (5 cm x 23 cm), wypełnionązywicąS-Sepharose Fast Flow™ (Pharmacia, Piscataway, NJ) doprowadzoną do stanu równowagi przy użyciu roztworu 0,2 M NaCl, 20 mM NaPO₄, o pH=7,5 w temperaturze 4°C. Następnie kolumnę przemywano roztworem 0,4 M NaCl, 20 mM NaPO₄ o pH=7,5 w temperaturze 4°C, o objętości równej pięciu objętościom kolumny (2250 mL). Pożądaną proteinę wymywano przemywając kolumnę 5 litrami roztworu zawierającego 0,5 M NaCl, i 20 mL NaPO₄ o pH=7,5. Zbierano frakcje po 50 mL i kontrolowano w sposób ciągły wartość A₂₈₀ w eluacie. Frakcje, zidentyfikowane dzięki A₂₈₀ jako zawierające wymywaną substancję były następnie analizowane metodą SPD-PAGE na 14% żelu w celu potwierdzenia obecności pożądanego polipeptydu.

Następnie frakcje zawierające oczekiwane proteiny połączono, a następnie dodano taką samą objętość wody destylowanej. Rozcieńczoną próbkę umieszczono następnie na uprzednio przygotowanej kolumnie S-Sepharose Fast Flow o objętości 450 mL (5 cm x 23 cm) zrównoważonej roztworem 0,4 M NaCl i 20 mM NaPO₄, o pH=6,8 w temperaturze 4°C. Kolumnę przemywano 2250 mL roztworu zawierającego 0,4 m NaCl, 20 mM NaPO₄ o pH=6,8 i żądaną proteinę wymywano z kolumny przemywając jąużywając objętości roztworu równej 20 objętości kolumny

182 888 o liniowym gradiencie stężenia od 0,4 M NaCl i 20 mM NaPO₄ i pH=6,8 do 0,6 mM NaCl i 20 mM NaPO₄ i pH=6,8. Ponownie zbierano frakcje po 50 mL monitorując w sposób ciągły wielkość A₂₈₀ ^w płynie wypływającym z kolumny. Frakcje zawierające proteinę (oznaczonąmetodą 14% SPD-PAGE) połączono, a następnie zatężano przepuszczając przez membranę YM-10 (odcinającą cząsteczki o ciężarze cząsteczkowym 10.000) w naczyniach do odwirowania o objętości 350 cm³ (Amicon, Inc. Mayberry, MA) do objętości 30-40 mL

Koncentrat następnie wprowadzono na uprzednio przygotowaną kolumnę o objętości 1300 mL (4,4 cm x 85 cm) wypełnioną żywicą Superdex-75™ (Pharmacia) i zrównoważoną buforem kolumnowym zawierającym IX PBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Salinę, „D-PBS”, wolny od wapnia i magnezu) lub roztworem 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄ o pH=7,0. Po umożliwieniu próbce wniknięcia do kolumny, proteinę wymywano z matrycy żelu filtracyjnego stosując bufor kolumnowy. Następnie odzyskiwano frakcje po 10 mL i frakcje zawierające analog (oznaczony metodą 14% SPD-PAGE) połączono. Typowo, stężenie wynosiło około 5-10 mg/mL w połączonych frakcjach. Wszystkie powyższe operacje prowadzono w temperaturze 4-8°C, o ile nie zostało to inaczej zaznaczone.

Alternatywny sposób oczyszczania zastosowano do oczyszczania rodzimego KGF, C( 1,15)S oraz ΔΝ23. Procedura ta obejmuje następujące etapy i - o ile zostało to inaczej zaznaczone, wszystkie procedury, roztwory i substancje były realizowane w temperaturze 23 ± 5°C.

Po zakończeniu etapu wytwarzania w procesie fermentacji bakteryjnej, hodowlę komórkową ochłodzono do temperatury 4-8°C i komórki zebrano przez odwirowanie lub innąpodobną metodą. Na podstawie spodziewanej wydajności proteiny w przeliczeniu na jednostkę masy pasty komórkowej oraz potrzebnej ilości oczyszczonej proteiny, odpowiedniąilość pasty komórkowej, określoną wagowo, przeprowadzono w stan zawiesiny w roztworze buforowym zawierającym 20 mM NaPO₄,0,2 M NaCl o pH=7,5, w ilości wagowo około pięciokrotnie większej niż masa pasty komórkowej przewidzianej do przeprowadzenia w stan zawiesiny. Komórki zdyspergowano do uzyskania homogennego roztworu, przy użyciu wysokotnącego miksera. Podczas homogenizacji temperaturę pasty komórkowej utrzymywano w przedziale 4-8°C.

Następnie komórki poddano lizie przez działanie ciśnienia, przykładowo przez dwukrotne przepuszczenie pasty komórkowej przez naczynie homogenizujące o odpowiednich wymiarach. Homogent przechowywano w postaci schłodzonej do temperatury 5±3°Ć. W celu sklarowania lizatu komórkowego zastosowano uprzednio przygotowaną obudowę filtru głębokościowego (depth filter housing - Cuno, Inc., Meriden, CT) wyposażoną w filtr posiadający odpowiednią wielkość powierzchni filtrującej, doprowadzony do stanu równowagi przy zastosowaniu odpowiedniej objętości roztworu 0,2 MNaCl, 20 mMNaPO₄, o pH=7,5. Tak równoważenie, jak i klarowanie prowadzono w temperaturze 5±3°C. Przed procesem klarowania stosowano odpowiednią ilość pomocniczego materiału filtrującego do wstępnego pokrycia filtru i dokładnego wymieszania z lizatem komórkowym, po czym lizat klarowano przez przepuszczenie roztworu przez urządzenie filtrujące. Filtr przemywano roztworem 0,2 M NaCl i 20 mM NaPO₄ o pH=7,5. Przesącz oraz późniejszy roztwór pochodzący z przemycia zebrano w chłodzonym zbiorniku o odpowiedniej objętości i wszystkie operacje przeprowadzono w temperaturze poniżej 10°C.

Po sklarowaniu lizat przepuszczono przez uprzednio przygotowaną kolumnę S-Sepharose Fast Flow zawierającą przynajmniej 1 mL żywicy na 2 g pasty komórkowej. Kolumnę S-Sepharose Fast Flow zrównoważono zimnym (5±3°C) roztworem 0,2 MNaCl, 20 mMNaP0₄, o pH=7,5. Kolumnę utrzymywano w temperaturze poniżej 10°C. Skarowany lizat (5±3°C) wprowadzono następnie na kolumnę jonowymienną i w sposób ciągły monitorowano absorbancję eluatu przy 280 nm (A₂₈₀). Po załadowaniu próbki, kolumnę przemywano zimnym roztworem 0,2 M NaCl, 20 mM NaPO₄ o pH=7,5, a następnie przemywano roztworem 0,3 M NaCl, 20 mM NaPO₄o pH=7,5 w temperaturze 23±5°C.

W celu wymywania pożądanej proteiny stosowano roztwory o liniowym gradiencie stężeń w granicach od 0,2 do 1 M NaCl, 20 mM NaPO₄ o pH=7,5. Produkt zbierano w kilku frakcjach na podstawie wielkości A_2g0 eluatu. Frakcje te po zebraniu połączono i zanotowano objętość.

182 888

W celu utlenienie wolnych grup sulfhydrylowych przeprowadzono operację utleniania. W przypadku protein ze zmienionym układem reszt cysternowych - w porównaniu z rodzimym KGF, środek utleniający (przykładowo dwuchlorowodorek cystaminy lub inny odpowiedni środek utleniający, przykładowo cystynę, utleniony glutation lub dwuwartościowąmiedź) dodawano w takiej ilości, aby końcowe stężenie wynosiło 1-20 mM, a pH doprowadzono do wartości 7-9,5, przy czym w przypadku zastosowania dwuchlorowodorku cysteiny korzystna wartość pH wynosiła 9,0±0,3. Utlenianie prowadzono wtemperaturze 10-30°Ć przez odpowiedni okres czasu. W przypadku rodzimej proteiny KGF utlenianie realizowano przez dodanie odpowiedniej ilości (NH₄)₂SO₄, przykładowo 1 -2 M (NH₄)₂SO₄, doprowadzając pH roztworu do wartości 7,5±0,5 i utrzymując temperaturę w przedziale 23±5°C przez odpowiedni okres czasu.

Po utlenieniu pH roztworu doprowadzono do wartości 6,5-9,5. Jeśli to było konieczne dodawano do roztworu stały (NH₄)₂SO₄, aż do osiągnięcia końcowego stężenia równego 2 M. W celu usunięcia nierozpuszczalnych części stałych roztwór przepuszczono przez odpowiednie filtry klarujące.

Następnie przesączony, utleniony produkt poddawano chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC). Matrycą HIC była żywica o nazwie Butyl-650M Toyopearl™ (Tosohaas, Inc., Montgomeryville, PA). Zawierający proteinę roztwór wprowadzono na kolumnę chromatograficzną którą uprzednio zrównoważono przy użyciu roztworu 2 M (NH₄)₂SO₄,0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄ o pH=7,0. Po umieszczeniu próbki kolumnę przemywano roztworem 2 M (NH^SO^ 0,15 NaCl i 20 mM NaPO₄ o pH=7,0. Następnie pożądaną proteinę eluowano przy użyciu roztworu o zmniejszającym się liniowo gradiencie stężenia (NH₄)₂SO₄, w przedziale od 2 do 0 M, rozwiniętym w roztworze 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄, o pH=7,0. Kiedy rozpoczęło się wymywanie pożądanej proteiny, na co wskazywał wzrost A₂₈₀ eluatu, frakcje zbierano. Próbkę każdej frakcji poddano następnie analizie metodą SDS-PAGE. Frakcje zawierające pożądaną proteinę połączono, dokładnie wymieszano i oznaczono objętości połączonych frakcji oraz stężenie proteiny.

Następnie połączony, zawierający proteinę, eluat z chromatografii HIC zatężono i wymieniono bufor wymywający. Typowo, proteiny zatężono do stężenia 5,0-10,0 mg/mL. Ultrafiltrację przeprowadzano przy użyciu urządzenia do ultrafiltracji wyposażonego w system kaset PTGC Pellicon™ (Millipore, Inc., Bedford, MA), z odpowiednio dobraną membraną odcinającą.

Po zatężeniu próbkę poddawano diafiltracji względem odpowiedniego buforu. Zatężony roztwór z etapu zatężania poddawano diafiltracji względem roztworu 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄, o pH=7,0 do momentu, gdy przewodnictwo diafiltrowanego roztworu mieściło się w zakresie do 5% od wartości przewodnictwa roztworu 0,15 M NaCl, 20 mM NaPO₄, o pH=7,0.

Dodatkowo, w celu usunięcia osadów oraz endotoksyn pochodzenia bakteryjnego, które mogą być obecne, zatęzoną i diafiltrowaną próbkę zawierającą pożądaną proteinę przepuszczono przez filtr 0,1 pm Posidyne™ (Pall, Inc., Cortland, NY). Po określeniu stężenia proteiny w roztworze i na podstawie pożądanego stężenia końcowego produktu, oczyszczony jak wyżej roztwór rozcieńczono roztworem zawierającym 0,15 M NaCl, 20 mM fosforanu sodu, o pH=7,0 do pożądanego stężenia końcowego. Następnie przeprowadzono końcowe, aseptyczne sączenie przez filtr 0,22 um, przy przenoszeniu produktu końcowego do pojemników wolnych od pyrogenów w celu przechowywania (w temperaturze około 5°C) do późniejszego wykorzystania przy wytwarzaniu różnych form galenicznych.

B. Analiza

Analizie poddano rodzimy KGF; C(1,15)S; C(1,15)S/R(144)Q; ΔΝ15; ΔΝ23 oraz AN23/R(144)Q, wytworzone w komórkach E. coli.

Stabilność konformacyjna

Polipeptydy były porównywane pod względem ich trwałości w czasie przechowywania, temperatury przejścia do formy rozdzielonej (rozplecionej) (Τ,η) oraz trwałości w szerokim zakresie pH.

Trwałość w czasie przechowywania

Na rysunku fig. 25 przedstawiono porównanie rodzimego KGF i C(1,15)S po przechowywaniu w roztworze 20 mM NaPO₄,015 M NaCl o pH=7,0, wtemperaturze 37°C przez 27 godzin. C( 1,15)S wykazuje znacząco większą ilość rozpuszczalnej proteiny w porównaniu z rodzimym KGF.

182 888

Na rysunku fig. 26 przedstawiono porównanie trwałości rodzimego KGF, ΔΝ15 (dane nieuwidocznione) i C(1,15)S w PBS oraz z roztworze 50 mM NaPO₄, 0,15 M NaCl o pH=7,0 po przechowywaniu w temperaturze 37°C przez 18 godzin. Odzyskiwanie rozpuszczonej proteiny jest znacząco większe w stężonym roztworze fosforanu aniżeli w PBS. ΔΝ15, jak również C(1,15)S - wykazują znaczący wzrost trwałości w porównaniu z rodzimym KGF. AN15oraz C(1,15)S również wykazują około struprocentowe odzyskania w stężonym roztworze zawierającym fosforany, tak jak tego oczekiwano na podstawie wyników dla rodzimego KGF.

Jednakże, pojedyncze wstępne badanie porównawcze trwałości przy przechowywaniu pomiędzy C(1,15,40)S i C(40)S (który jest kodowany zasadami od 201 do 684 w SEQ ID NO: 1, z tym jedynie wyjątkiem, że Ser⁴⁰ jest kodowana przez AGA), oraz pomiędzy C(1,15,102) i C(102)S (który jest kodowany zasadami od 201 do 684 w SEQ ID NO:1, z tym jedynie wyjątkiem, że Ser¹⁰² jest kodowana przez AGG). Rezultaty (nie pokazane) wskazująna obniżoną trwałość (to znaczy: mniej rozpuszczalnej proteiny po przechowywaniu w temperaturze 37°C). Jednakże, ilość rozpuszczalnej, prawidłowo sfałdowanej proteiny C(l,15,40)S, która została oczyszczona z pożywki hodowlanej była większa niż ilość proteiny C(40)S, co sugeruje, że analog C(1,15,40)S może być w rzeczywistości bardziej trwały, a także wyniki powyższego badania porównawczego nie są rozstrzygające. Niniejszy wynalazek korzystnie obejmuje analog KGF zawierający inne podstawienia niż przy Cys⁴⁰, Cys¹⁰², Cys¹⁰⁶ i bardziej korzystnie nie obejmuje C(l,15,40)S, C(1,15,102)S oraz C(l,15,40,102,106)S.

Przebadano również zdolność rodzimego KGF, C(1,51)S, ΔΝ23, C(1,15)S/R(144)E, C(l,l 5)S/R(144)Q i AN23/R(144)Q do zapobiegania agregacji w podwyższonych temperaturach. Przygotowano próbki zawierające 0,5 mg/mL proteiny wD-PBS. Po 0,5 mL z każdej próbki pobrano do szklanych fiolek o objętości 3 cm³ typu 1. Fiolki zamknięto gumowymi korkami i dodatkowo nałożono 13 mm zaciski aluminiowe. Następnie fiolki te umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37°C. W uprzednio ustalonych odstępach czasu fiolki otwierano i analizowano pod kątem ubytku rozpuszczalnej proteiny. Zauważalne osady usuwano przez odwirowanie 250 μΐ każdej próbki wjednostce filtrującej 0,22 pm Spin-X™ (Costar, Cambridge, MA). Rozpuszczalną proteinę zawartą w przesączu poddawano następnie analizie metodą wykluczającej pod względem wymiarów wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Ilość rozpuszczalnej proteiny określano przez całkowanie powierzchni pod pikiem chromatograficznym (HPLC), a wyniki dla KGF, C( 1,15)S, C( 1,15)S/R( 144)E i C(1,15)S/R( 144)Q przedstawiono jako wykres w funkcji czasu inkubacji w temperaturze 37°C (danych ΔΝ23 i AN23/R(144)Q nieuwidoczniono). Wyniki przedstawiono na rysunku fig. 27.

Następnie wyznaczono półokres zaniku rozpuszczalnej monomerycznej proteiny z tych krzywych kinetycznych. W tabeli 1 przedstawiono czas połowicznego zaniku pozostałego w roztworze rozpuszczalnego KGF podczas przechowywania powyższych w temperaturze 37°C.

Tabela 1

Czas połowicznego zaniku rozpuszczalnej monomerycznej proteiny

Proteina	11/2 (dni)
rodzimy KGF	0,6
ΔΝ23	U
C(1,15)S	1,2
C(1,15)S/R(144)Q	13,3
AN23/R(144)Q	22,3
C(1,15)S/R(144)E	38,0

Jak widać z powyższej tabeli 1 oraz z rysunku fig. 27 najszybciej ulega agregacji rodzimy KGF, z okresem półtrwania rozpuszczalnej formy równym 0,6 doby. C(1,15)S/R(144)Q,

182 888

AN23/R(144)Q oraz C(1,15)S/R(144)Q wykazują znaczący wzrost okresu półtrwania rozpuszczalnych monomerów odpowiednio do 13,3, 22,3 oraz 38 dni.

Rozdzielanie (rozplatanie) termiczne

Rozdzielanie (rozpaltanie) termiczne monitorowano metodą dichroizmu kołowego (CD) przy 230 nm stosując spektropolarymetr J-720™ (Jasco, Inc., Easton, MD), wyposażony w system kontroli temperatury typu PTC-343 Peltier. Dla potrzeb analizy CD przygotowano odrębne próbki zawierające 0,1 mg/mL polipeptydu przeznaczonego do analizy w D-PBS (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). Około 2,5 mL każdej próbki umieszczano w prostokątnym, wykonanym z kwarcu Suprasil™ (Heraeus Quarzschmelze, Gmbh, Hanau, Germany), naczynku fluorescencyjnym (Heima Cells, Inc., Jamaica, NY), o długości drogi optycznej równej 10 mm. Naczynko umieszczono następnie w układzie kontroli temperatury typu Peltier, w spektropolarymetrze. Rozdzielanie (rozplatanie) termiczne prowadzono przy szybkości zmian temperatury 50°C/godzinę. Zmiany w eliptyczności monitorowano przy 230 nm w celu wykrycia rozdzielania (rozplatania). Temperaturę T_m dla każdej próbki wyznaczano na podstawie określenia temperatury, przy której 50% cząsteczek proteiny zawartej w roztworze było w postaci rozdzielonej (rozplecionej) (Biophysical Chemistry, Cantor and Schimmel (eds), W.H. Freeman and Co. San Francisco (1980). W tabeli 2 zestawiono szacunkowe temperatury T_m dla każdej z trzech protein.

Tabela 2

Szacunkowe temperatury „topnienia”

Proteina	T_m(°C)
Rodzimy KGF	54,0
ΔΝ15	55,0
C(1,15)S	55,0
ΔΝ23	56,0
C(1,15)S/R(144)Q	62,5
AN23/R(144)Q	63,0
C(1,15)S/R(144)E	63,5

Jak wynika z powyższych rezultatów C(1,15)S i ΔΝ15 wykazują wzrost temperatury T_m, o 1°C w porównaniu z naturalnym KGF. Dla ΔΝ23 temperatura T_m wzrasta o dodatkowy jeden stopień. Jednakże podstawienie R144Q do C( 1,15)S/R( 144)Q lub ΔΝ23 zwiększa o więcej niż 6°C temperaturę T_m i więcej niz o 7°C w porównaniu z rodzimym KGF. Ponadto, C(1,15)S/R(144)E jest o więcej niż 9°Ć bardziej trwały w porównaniu z rodzimym KGF.

Kwasowość, pH

Porównywano także stabilność kwasowąC( 1,15)S/R( 144)Q oraz C( 1,15)S/R( 144)E w porównaniu z rodzimym KGF, doprowadzając D-PBS do różnych wartości pH przez dodawanie stężonego HC1 lub NaOH. W kwarcowym naczynku mieszano około 2,35 mL D-PBS o różnych wartościach pH ze 100 μΐ roztworu proteiny KGF o stężeniu 2,45 mg/mL. Próbki te termicznie rozfałdowywano z szybkością 50°Ć/godzinę i monitorowano techniką dichroizmu kołowego (CD) przy 230 nm. Na rysunku fig. 28 przedstawiono zależność temperatury T_m, od pH dla rodzimego KGF, C(1,15)S/R(144)Q oraz C(1,15)S/R(144)E. W badanym obszarze pH C(1,15)S/R(144)Q oraz C(l,l5)S/R(144)E zawsze wykazywały wyzszątemperaturę T_m niż KGF.

Aktywność biologiczna in vitro

Aktywność mitogenicznążM vitro protein C( 1,15)S, ΔΝ15, AN23/R( 144)Q, C( 1,15)S/R( 144)Q oraz C(1,15)S/R( 144)S oznaczono także w funkcji stężenia proteiny oraz stężeń półmaksymalnych przez pomiar wychwytu [³H]-tymidyny przez komórki Balb/MK (według metod Rubin et al. (1989), supra). Zastosowano stężenia każdego z analogów KGF w porównaniu ze znanym standardowym rodzimym KGF oznaczano stosując próbę biologiczną in vitro. Następnie, każdy

182 888 analog KGF rozcieńczano i badano na aktywność biologiczną stosując próbę mitogeniczną Balb/MK. Próbki na wstępie rozcieńczono w pożywce do bioprób składającej się z 50% Eagle’s MEM (przyrządzonej przez użytkownika), 50% FI2 (przyrządzonej przez użytkownika), 5 pg/mL transferryny, 5 ng/mL seleninu sodu, 0,0005% HSA i 0,005% Tween 20. Następnie, próbki KGF naniesiono na płytki Falcon Primeria p 96 zagłębieniach, na których zaszczepiono komórki Balb/MK. Mierzono przyłączanie [³H]-tymidyny podczas syntezy DNA i przeliczono na wejściowe stężenie rodzimego KGF przez porównanie z krzywą standardową rodzimego KGF. Wyniki zaprezentowano na rysunkach fig. 29-34. Jak widać z tych rysunków badane analogi KGF opisane na rysunkach fig. 28-33 mają aktywność porównywalną z rodzimym KGF.

Przykład III. Wytwarzanie w hodowli komórkowej przy użyciu komórek z organizmu ssaka

Przykład niniejszy opisuje ekspresję, wyodrębnienie i charakteryzowanie dwóch aktywnych biologicznie form rekombinacyjnych KGF (rKGF) wytworzonych w układzie ekspresji pochodzącym z organizmu ssaków.

Gen ludzkiego KGF wyodrębniono prze amplifikację PCR cDNA otrzymanego z normalnych komórek fibroblastowych pochodzących z ludzkiej skóry (Clonetec, Inc., San Diego, CA). Po otrzymaniu cDNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy zastosowano metodę PCR do amplifikacji genu KGF. Związków OLIGO#25 i OLIGO#26 użyto do amplifikacji genu z cDNA, a OL IGO #2 7 oraz OLIGO#28 użyto do umieszczenia miejsc restrykcyjnych HindlW i 5g7II na końcach tego fragmentu przez drugą amplifikację PCR, jak podano na rysunku fig. lAi IB.

OLIGO#25 (SEQ ID NO:69): 5'-CAATCTACAATTCACAGA-3'

OLIGO#26 (SEQ ID NO:70): 5'-TTAAGTTATTGCCATAGG-3'

OLIGO#27 (SEQ ID NO:71): 5'-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3'

OLIGO#28 (SEQ ID NO:72): 5'-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3'

Po klonowaniu i potwierdzeniu sekwencji DNA, użyto następnie DNA genu KGF. Amplifikację zrealizowano stosując związki OLIGO#29 oraz OLIGO#30.

OLIGO#29 (SEQ ID NO:73):5'-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGG-3'

OLIGO#30 (SEQ IDNO:74): 5'-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3'

Primer sensowny, OLIGO#29, obejmował miejsce Xbal i konsensusową sekwencję translacji Kozaka (5-CCACC-3') w górę względem kodonu startowego - ATG. Primer antysensowny - OLIGO#30, obejmował miejsce klonowania Sali i dodatkowy stop-kodon. Po 18 cyklach amplifikacji PCR (denaturacja przez 30 sekund w temperaturze 94°C, splatanie - annealing, przez 40 sekund w temperaturze 55°C oraz wydłużanie przez 40 sekund w temperaturze 72°C) produkt wytrawiono Xbal oraz SaB i poddano ligacji z podobnie wytrawionym DNA z pDSRot2 (zgodnie z metodą: Bourdrel i wsp.al. (1993), Protein Exp. & Purif., 4:130-140 oraz Lu i wsp. (1992). Arch. Biochem.Biophys.. 298:150-158). Otrzymano plazmid KGF/pDSRo2, w którym ten ludzki gen KGF znajdował się między sekwencjami wczesnego promotora SV40 i poliadenylacji α-FSH. Wybrano dwa klony i analiza sekwencyjna DNA potwierdziła skonstruowanie pożądanego wektora.

Następnie dwa mikrogramy DNA KGF/pDSRa2 poddano linearyzacji przy użyciu Pvu1. Komórki jajnikowe chomika chińskiego (CHO) zaszczepione dzień wcześniej w ilości 0,8 x 10⁶komórek/60 mm płaskie naczynie do hodowli, transfekowano poddanym takiej obróbce DNA stosując standardowy sposób wytrącania osadu fosforanu wapnia (Bourdrel et al., supra). Dwa tygodnie później wybrano pojedyncze kolonie i przeniesiono je na płytki z 24 zagłębieniami. Kondycjonowane pożywki uznano za pozbawione surowicy, kiedy komórki uzyskały płynność i pobrane z nich próbki analizowano metodą ‘Western blotting’ stosując poliklonalną surowicę odpornościową z królika, reaktywną względem ludzkiego KGF uzyskanego metodą ekspresji w E coli.

Próby typu Western blotting wykonano przez przepuszczenie próbek przez 12,5% (wagowo/objętościowe) żele poliakrylamidowe SDS, a następnie elektroblotting w ciągu 1 godziny

182 888 przy 400 mA na membranach nitrocelulozowych przy użyciu przyrządu do półsuchego przenoszenia (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA). Roztwór 20 mM Tris, 150 mM glicyny oraz 20% metanolu służył jako bufor przenoszenia. Arkusze nitrocelulozy zablokowano przez inkubację przy użyciu 10% normalnej surowicy kozy w PBS. Króliczą surowicę odpornościową reaktywną wobec KGF uzyskanego metodą ekspresji w E. coli użyto jako pierwotne przeciwciało. W celu zastosowania rozcieńczono ją w stosunku 1/10.000 w 1% normalnej surowicy koziej w PBS i inkubowano z zablokowanymi arkuszami nitrocelulozowymi przez 12 godzin w temperaturze pokojowej, po czym nadmiar przeciwciała usunięto w wyniku trzykrotnego, po 30 minut, przemywania w PBS. Nitrocelulozowe membrany następnie inkubowano w 100 mL roztworu 1% normalnej surowicy koziej w PBS z dodatkiem Vectastain™-biotynylowaną koziąlgG przeciwkróliczą(przeciwciało wtórne, Vector Labs, Burlingame, CA) w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym, 10-minutowym przemywaniu w PBS przeprowadzono 3 0 minutowąinkubacj ę w temperaturze pokoj owej w 100 mL roztworu 1 % normalnej surowicy koziej, zawierającym streptawidynę i biotynylowaną peroksydazę, przygotowaną zgodnie z zaleceniami producenta (Vector Labs). Następnie przemyto trzykrotnie w PBS i materiał krzyzowo-reakty wnego KGF wizualizowano przez inkubowanie w mieszaninie 60 μΐ 30% (wagowo/objętościowych) H₂O₂ w 100 mL PBS i 50 mg 4-chloronaftolu w 20 mL metanolu. Reakcję przerwano po upływie 10 minut przez płukanie w wodzie.

Analiza biotów ujawniła, KGF-specyficzne przeciwciało uległo zasocjowaniu z trzema oddzielnymi pasmami protein - z których dwa były ściśle pokrewne, o ciężarach cząsteczkowych około 25-29 kDa, a jedno miało szacunkowy ciężar cząsteczkowy około 17 kDa - w porównaniu ze spodziewanym ciężarem cząsteczkowym około 18,8 dla dojrzałej proteiny o 163 aminokwasach. Dodatkowo wybrano kilka wysoko-ekspresyjnych klonów wydzielających więcej niz 2,0 mg rKGF na litr, jak to oceniono na podstawie analizy Western, wybrano i namnożono do butelek w kształcie walca (zgodnie z metodą podaną przez Lu i wsp., supra), by wytworzyć duże objętości wolnej od surowicy kondycjonowanej pożywki do oczyszczania KGF metodą chromatografii kationo wymiennej i przez filtracją żelową jak podano niżej.

KGF z 3 litrów wolnego od surowicy kondycjonowanego medium oczyszczono wprowadzając pożywkę bezpośrednio na kolumnę kationowymienną (5 x 24 cm) wypełnioną 450 mL sulfoetylu kolumnę S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) uprzednio kondycj ono waną roztworem 20 mM fosforanu sodu o pH=7,5. Po przemyciu pięcioma objętościami kolumny roztworu 20 mM fosforanu sodu, 0,2 MNaCl o pH=7,5, rKGF eluowano stosując 20-krotnąobjętość kolumny roztworu o zmieniającym się liniowo gradiencie stężeniaNaCl od 0,2 do 1,0 M z 20 mM fosforanu sodu, o pH=7,5. Zbierano 50 mL frakcje przy ciągłym monitorowaniu A₂₈₀. Obecność proteiny KGF stwierdzono poddając próbkę z każdej frakcji analizie metodą SDS-PAGE. Analizę SDS-PAGE prowadzono metodą elektroforezy (Novex, San Diego, CA) przy użyciu wstępnie przygotowanego żelu 14% trójglicyny (zgodnie z metodąLaemmli (1970) Naturę,227:680-685). Próbki mieszano z nieredukującym buforem SDS bez ogrzewania przed załadowaniem. Obecność protein stwierdzono przez barwienie błękitem Coomassie lub srebrem. Obserwowano dwa późno wymywane piki zawierające pasma proteinowe odpowiadające pasmom 25-29 kDs i 17 kDa wykrytym w próbach Western biot. Frakcje zawierające każdy z tych pików oddzielnie zatężono do objętości mniejszej niż 1,0 mL i poddano filtracji żelowej.

Przy filtracji żelowej wykorzystywano kolumny wypełnione żywicą Superdex-75™ (HR 10/30, Pharmacia) wstępnie równoważone za pomocą PBS o pH=7,2 i kalibrowane następującymi znanymi standardami ciężaru cząsteczkowego (BioRad, San Francisco, CA): tyroglobulina (670 kDa), g-globulina (158 kDa), owalbumina (44 kDa), mioglobina (17 kDa) oraz witamina Β-12 (1,4 kDa). Powyższe etapy oczyszczania dały w efekcie około 2000-krotnie oczyszczenie rKGF, zawierający w szczególności materiał o 17 kDa oraz 30 kDa, jak to oceniono przez barwienie srebrem.

W przypadku materiału o wyższym ciężarze cząsteczkowym, rKGF eluowano jako główny symetryczny pik (wykrywany przez A_2g0), który nazwano KGF-a. Na podstawie analizy SDS-PAGE mniejszej ilości tego materiału - 3 pg/pasek wobec 6 pg/pasek, rozdzielono dwa pas

182 888 ma o różnicy ciężaru cząsteczkowego mniejszej niż 1 -2 kDa. W przypadku substancji o nizszym ciężarze cząsteczkowym, zwanej KGF-b, filtracja żelowa dała preparat proteinowy o spodziewanej ruchliwości. Dla obu materiałów (KGF-a i KGF-b) całkowita wydajność po oczyszczaniu wynosiła około 30-40%.

Analizowano również sekwencje aminokwasów KGF-a i KGF-b. Analizy te przeprowadzono na przyrządzie do automatycznego sekwencj ono wania (Model 477A lub 470A, Applied Biosystem, Inc, Foster City, CA) wyposażonym w analizator aminokwasów PTH Model 120A do analizy on-line oraz układ zbierania danych Model 900A (zgodnie ze sposobem podanym przezLui wsp. (1991), JBiol. Chem., 266:8102-8107). AnalizasekwencjiKGF-ametodąEdmana ujawniła główną sekwencję N-końcowąX_rN-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-X₂-X₃-S- [SEQ ID NO:75]. Mniejsza sekwencja rozpoczynająca się od trzeciego N-końcowego aminokwasu, kwasu asparaginowego, była również obecna w 1,6% całości proteiny poddanej sekwencjonowaniu. X] X₂ oraz X₃ nie zostały zidenytyfikowane wskutek braku sygnałów aminokwasu fenylotiohydantoinylu (PHT) podczas analizy sekwencyjnej. N-końcowa sekwencja aminokwasowa KGF przewidziana na podstawie sekwencji cDNA wskazuje, że X₁ oraz X₃ sąresztami Cys a X₂ jest asparaginą. Nieobecność X| oraz X₃ wskazuje, że te dwie cysteiny mogątworzyć mostki dwusiarczkowe. Na podstawie N-przyłączonej konsesusowej sekwencji glikolizowania Asn-XSer nieobecność przewidzianej reszty Asn odpowiadającej X₂ wskazuje, że jest to potencjalne miejsca N-glikozylowania.

Ciekawe, że analiza sekwencyjna N-końca KGF-b ujawniła N-końcową sekwencję aminokwasów S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V-(SEQ ID NO:76) co wskazuje, że jest toN-końcowo obcięta forma KGF proteolitycznie odcięta przy wiązaniu peptydowym Arg²³-Ser²⁴.

W celu dalszego charakteryzowania oczyszczonego KGF-a oraz KGF-b proteinę poddano działaniu glikozydaz (neuramidazy, O-glikanaza, i/lub N-glikanaza) stosując znane techniki (Sasaki i wsp. (1987), J Biol. Chem., 262:12059-12076); Takeuchi i wsp. (1988), J. Biol. Chem, 263:3657-3663; Zsebo i wsp. (1990), Celi, 63:195-201). Tak uzyskane dane wskazują, że KGF-a zawiera węglowodany związane przez azot N- lub tlen O-, chociaż forma KGF-a o niższej masie cząsteczkowej prawdopodobnie zawiera tylko N-połączony cukier. Poddanie działaniu glikozydaz nie spowodowało zmniejszenia ciężaru cząsteczkowego KGF-b wskazując, że jego cząsteczka nie jest glikozylowana.

Schemat glikozylowania KGF-a badano dalej metodą spektroskopii masowej peptydów wytworzonych przez endoproteinazę Glu-C, jak to opisano powyżej. Wyjaśnione struktury węglowodanowej glikopeptydów metodą stopniowego ujścia masowej analizy spektrometrycznej okazało się skuteczne w stosunku do innych protein (Huddleston i wsp. (1993), Anal Chem., 65:877-884; Carr i wsp. (1993), Prot. Sci, 2:183-196). Jak to potwierdzono przez wyodrębnienie nieglikozylowanego peptydu, reszta Thr²² zdaje się być częściowo glikozylowana. Podobna analiza metodą spektrometrii masowej Asn¹⁴ zasugerowała mikroheterogeniczność w glikozylowaniu strukturami dwu-, trzy- i cztero- „czułkowymi” o zmiennych stopniach sialilowania.

W tabeli 3A przedstawiono stężenia KGF do stymulowania włączenia [³H]-tymidyny przez keratynocyty w półmaksymalnym stopniu (zgodnie z metodą podaną przez Rubin i wsp. (1989), Supra). Oddziaływanie z receptorem KGF badano stosując preparaty błony receptora KGF przygotowane z naskórkowych keratynocytów myszy Balb/MK (zgodnie z procedurą opisaną przez Massague (1983), J.Biol.Chem., 258:13614-13620).Bar dziej szczegółowo, różne postaci KGF rozcieńczono buforem 50 mM Tris-HCl, pH=7,5, zawierającym 0,2% albuminy z surowicy bydlęcej, uzyskując stężenia w zakresie od 0,8 ng do 100 ng w 50 μΕ. Były one osobno inkubowane z preparatem błonowym (75 ng/mL) i KGF znaczonym ^I25J otrzymanym w drodze ekspresji w E coli (1,5 ng). Doświadczenia w zakresie wiązania receptora i badania konkurencji prowadzono w temperaturze 4°C przez 16 godzin, po czym próbki odwirowano i przemyto dwukrotnie powyższym buforem użytym do rozcieńczeń, by usunąć niezwiązany i niespecyficznie związany znakowany KGF. Zliczono resztkową radioaktywność próbek. Krzywe konstrukcji wiązania receptora między próbkami KGF i znaczonym KGF skonstruowano przez wykreślenie procentu niekonkurencj i względem stężeń każdej próbki KGF. W tabeli 3B podano stężenia KGF

182 888 potrzebne do osiągnięcia 60% niekonkurencji względem znaczonego KGF pochodzącego z E. coli, wyrażone w ng/mL.

Tabela 3A

Stężenie KGF użytego do stymulowania włączania [³H]-tymidyny do keratynocytów w półmaksymalnym stopniu

Formy	ng/mL
KGF z E coli	10
KGF-a	30
KGF-b	30

Tabela 3B

Stężenie KGF użytego do konkurencyjnego wiązania receptora przy KGF znaczonym jodem ^l25J przy 60% stopniu niekonkurencji

Formy	ng/mL
KGF z E. coli	65,8
KGF-a	93,5
KGF-b	89,1

Jak podano w tabeli 3 A, KGF-a i KGF-b stymulująporówny walne włączanie [³H]-tymidyny, przy czym półmaksymalny stopień włączenia jest stymulowany przez około 30 ng/mL każdego z analogów. Zatem, obcięcie nie zmniejsza biologicznej aktywności cząsteczki. Jednakie dwa analogi mąjąokoło trzykrotnie niższą aktywność niż KGF o pełnej długości, uzyskany przy E. coli. Jak podano w tabeli 3B, badania niekonkurencji za pomocą próby radioreceptorowej wskazały, ze KGF uzyskany przy użyciu E. coli, KGF-a i KGF-b mają podobną aktywność wiązania receptora.

Przykład IV. Próba biologiczna in vivo zastosowana do polipeptydów KGF wytworzonych w E. coli i hodowli komórkowej komórek z organizmu ssaka

Stwierdzono, ze pojedyncza podskórna dawka KGF powodowała u myszy zależny od dawki wzrost poziomu cholesterolu w surowicy w ciągu 24 godzin. Oceniono zdolność rodzimego KGF, KGF-a, C( 1,15)S, ΔΝ15 i ΔΝ23 do podwyższania poziomu cholesterolu w surowicy w sposób zależny od dawki.

Każda badana grupa obejmowała pięć samic myszy Balb/c (18-20 gramów) otrzymanych z CRL. Proteinę rozcieńczono 0,9% roztworem soli uzyskując końcową objętość iniekcji 100 pg/mysz. Każdej myszy wykonano pojedynczą podskórną iniekcję w następujących dawkach:

Grupa	Podawany składnik	Dawka (mg/kg)
1	rodzimy KGF	0,f
	rodzimy KGF	0,25
	rodzimy KGF	0,5
	rodzimy KGF	1
	rodzimy KGF	5
2	C(1,15)S	0,1
	C(1,15)S
0,25
	C(1,15)S	0,5
	C(1,15)S	1
	C(1,15)S	5

182 «88

3	ΔΝ15	0,25
	ΔΝ15	0,5
	ΔΝ15	1
	ΔΝ15	5
4	ΔΝ23	0,1
	ΔΝ23	0,5
	ΔΝ23	1
	ΔΝ23	5
5	KGF-a	0,01
	KGF-a	0,05
	KGF-a	0,1
	KGF-a	0,5
6	roztwór soli (kontrola)

Po upływie 24 godzin po iniekcji myszy uśmiercono i wykrwawiono przez przebicie serca. Próbki krwi poddano obróbce w celu oznaczenia cholesterolu w surowicy.

Jak podano na rysunku fig. 35 okazało się, że każdy badany analog KGF podwyższa poziom cholesterolu w surowicy w sposób zależny od dawki. Nie było również widocznej różnicy bioaktywności między badanymi analogami KGF.

Model cukrzycy in vivo

Modele chemiczne wywołanej cukrzycy u różnych gatunków zwierząt użyto klasycznie do badania choroby i jej leczenia. Streptozotocyna wywołuje cukrzycę u myszy, szczura, chomika, psa i małpy chociaż badania na szczurach i myszach są stosowane najczęściej. Junod i wsp., Proc. Soc Exp. Pio.Med. 126:210-205 (1967); Rerup, Pharm. Rev. 22:485-518 (1970); Rossini i wsp., P.N.A.S. 74:2485-2489 (1977); \ Ar Raj ab andAhren, Pancreas 8:50-57 (1993). U szczurów dawki streptozotocyny od 45 do 70 mg/kg, podane dożylnie w pojedynczej dawce, wywołują trwałą chorobę. Dawki poniżej 45 mg/kg indukują przejściowy stan chorobowy, który jest odwracalny. W ciągu jednego dnia po iniekcji streptozotocyny, wywoływany jest stan hiperglikemii. Poziomy insuliny we krwi pozostają zasadniczo niezmienione w porównaniu z normalnymi szczurami; jednakże, całkowita zawartość insuliny i C-peptydu w trzustce jest silnie obniżona. Szczury objawiająklasyczne oznaki i symptomy cukrzycy u ludzi: zwiększone poziomy glukozy we krwi (hiperglikemia), glukoza w moczu (cukromocz), wzmożone pragnienie (polidipsja), zwiększone wydalanie moczu (poliuria), wzmożony apetyt (hiperfagia).

Badania opisane w tym opisie przeprowadzono stosując model cukrzycy indukowanej streptozotocynąu szczurów Sprague-Dawley. Użyto szczury (samce) ważące 200-260 gramów w momencie rozpoczęcia badania. Cukrzycę wywołano prze pojedynczą dożylną iniekcję streptozotocyny w dawce 50 mg streptozotocyny w buforze cytrynianu sodu na 1 kilogram masy ciała. Niediabetyczne szczury kontrolne otrzymały pojedynczą iniekcję doży Iną buforu cytrynianu sodu dla celów kontrolnych. KGF podawano codziennie metodą iniekcji podskórnej. Dawka KGF wynosiła 3 lub 5 mg/kg/dzień, w zależności do eksperymentu. W pierwszym eksperymencie terapię KGF zapoczątkowano dwa dni przed wywołaniem cukrzycy i kontynuowano ją po wywołaniu cukrzycy aż do ogółem ośmiu iniekcji. W eksperymenie drugim i trzecim terapię KGF podawanego podskórnie zapoczątkowano jeden dzień po wywołaniu cukrzycy streptozotocyną. W czwartym eksperymencie, 7-dniową terapię KGF zapoczątkowano 7 dni po działaniu streptozotocynąi zwierzęta były kontrolowane przez dalsze 12 tygodni. We wszystkich eksperymentach, oprócz eksperymentu czwartego, poziomy glukozy we krwi, poziomy glukozy w moczu i objętość moczu użyto jako punkty końcowe analizy. Dodatkowo, w niektórych eksperymentach mierzono spożycie wody, poziomy C-peptydu w moczu lub całkowitą zawartość w trzustce insuliny i C-peptydu. W czwartym eksperymencie jedynym ocenionym punktem końcowym był poziom glukozy we krwi

182 888

Ponieważ duża część insuliny jest usuwana z obiegu przez wątrobę, pomiar stężeń insuliny obwodowej jest odbiciem raczej zjawisk metabolizmu post-hepatycznego niż wydzielania insuliny przez trzustkę. Dlatego pomiary C-peptydu są często wykonywane i stosowane jako obwodowy marker wydzielania insuliny. C-peptyd jest wytwarzany w wyniku przetwarzania proinsuliny w insulinę. Insulina i C-peptyd są wydzielane z komórek beta w ilościach równomolowych i jedynie mała ilość C-peptydu jest ekstrahowana przez wątrobę.

Poniższe badanie dotyczyło wpływu rKGF na cukrzycę indukowanąprzez streptozotocynę u szczurów Sprague-Dawley. Dnia „zerowego” grupy szczurów poddano działaniu 45 lub 50 mg/kg streptozotocyny (STZ). Następnie, poziomy nie „na czczo” glukozy we krwi monitorowano codziennie, by ocenić nasilenie uszkodzenia komórek wyspowych. W piątym dniu zwierzęta, na które oddziaływano STZ podzielono na dwie grupy po 20 osobników w grupie, zależnie od stopnia hiperglikemii. Punktem granicznym był poziom glukozy we krwi równy 300 mg/dl. Grupa zwierząt, na które nie działano STZ służyła jako grupa kontrolna. Od siódmego dnia dziesięciu zwierzętom z każdej grupy hiperglikemicznej podawano ΔΝ23 (3 mg/kg/dzień) lub PBS przez iniekcję podskórną przez 7 dni. Następnie poziom glukozy we krwi monitorowano codziennie, co drugi dzień lub co tydzień, jak pokazano na rysunku fig. 50. Należy zauważyć, że zwierzęta poddane działaniu STZ z dwóch grup otrzymujących ΔΝ23 wykazywały znaczące spadki poziomu glukozy we krwi podczas okresu podawania ΔΝ23. Istotne jest, ze średni spadek poziomu glukozy we krwi w przypadku zwierząt poddanych działaniu STZ w grupie o początkowym poziomie glukozy we krwi <300 mg/dl - stabilizował się przy około 150 mg/dl, zaś w przypadku grupy o początkowym poziomie glukozy we krwi> 300 mg/dl spadek ten był jedynie przejściowy. Należy pamiętać, że skala dni na rysunku jest nieliniowa.

O ile niniejszy wynalazek opisano powyżej zarówno ogólnie jak i w kategoriach korzystnych wykonań, należy rozumieć, że w świetle powyższego opisu specjalista z tej dziedziny techniki dostrzeże inne odmiany i modyfikacje.

182 888

FIG.1A ludzki KGF (+ sekwencja sygnałowa) |—OLIGO#25-----1 |-------OLIGO#1---------1

5'-CAATCTACAATTCACAGA-3 ' 5'-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3'

5' -CAATCTACAATTCACAGATAGGAAGAGGTCAATGACCTAGGAGTAACAATCAACTCAAGA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------_{+ 60}

-TTCATTTTCATTATGTTATTCATGAACACCCGGAGCACTACACTATAATGCACAAATGGA|-----------1-----------1-----------1--------------------4. 120

Μ Η K W I

-TACTGACATGGATCCTGCCAACTTTGCTCTACAGATCATGCTTTCACATTATCTGTCTAG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ i8Q

LTWILPTLLYRSCFHIICLV

-TGGGTACTATATCTTTAGCTTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGA---------4.---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 240 GTISLACNDMTPEQMATNVN

-ACTGTTCCAGCCCTGAGCGACACACAAGAAGTTATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 3QQ CSSPERHTRSYDYMEGGDIR*

-GAGTGAGAAGACTCTTCTGTCGAACACAGTGGTACCTGAGGATCGATAAAAGAGGCAAAG---------₊---------₊---------₊---------4----------+

VRRLFCRTQWYLRIDKRGKV

-TAAAAGGGACCCAAGAGATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGACAGTGGCAG---------₊---------₊---------₊---------+---------++ 420

KGTQEMKNNYNIMEIRTVAV

- TTGGAATTGTGGC AATC AAAGGGGTGGAAAGTGAATTCTATCTTGCAATGAAC AAGGAAG ---------₊---------+---------₊---------+---------₊

GIVAIKGVESEFYLAMNKEG

-GAAAACTCTATGCAAAGAAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 540 KLYAKKECNEDCNFKELILE

-AAAACCATTACAACACATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTTTG----------1-----------1-----------4----------1----------4-----------4 600

NHYNTYASAKWTHNGGEMFV

- TTGCCTT AAATC AAAAGGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACG AAGAAAG AAC AAAAAA ---------4----------4.---------4.---------4----------4----------4. 66Q

ALNQKGIPVRGKKTKKEQKT

182 888

FIG. 1 B (ciąg dalszy)

-CAGCCCACTTTCTTCCTATGGCAATAACTTAATTGCATATGGTATATAAAGAACCCAGTT ---------₊---------+---------₊---------+---------+

AHFLPMAIT*

3'-GGATACCGTTATTGAATT-5' |----OLIGO#26----CCAGCAGGGAGATTTCTTTAAGTGGACTGTTTTCTTTCTTCTCAAAATTTTCTTTCCTTT ---------₊---------₊---------₊---------+---------++ 780

-TATTTTTTAGTAATCAAGAAAGGCTGGAAAAACTACTGAAAAACTGATCAAGCTGGACTT ---------₊---------+---------+---------₊---------+

3'-ACCTGAA-GTGCATTTATGTTTGTTTTAAG-3'

---------₊---------+-- 862

-CACGTAAATACAAACAAAA-5' —OLIGO#2--------1

182 888

FIG.2A

BamHI

2500

182 888 (ciąg dalszy)

FIG.2B

BomHI

2500

182 888

FIG.2C

182 888

FIG.3A

RSH-KGF sekwencja plazmidu DNA Ciał Xbał Ndeł

5' -ATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGAAAAAG- 40

Μ K K sekwencja sygnałowa rsH Mlul

-CGCGCACGTGCTATCGCCATTGCTGTGGCTCTGGCAGGTTTCGCAACTAGTGCACA-3'

RARAIAIAVALAGFATSAHA-96

Mlul

5' -CGCGTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGAACTGTTCCAGCCCTGA----------1----------4.----------1----------4-----------1----------4- 456

- C N D Μ T P E Q Μ A T N V N C S S P E

-GCGACACACAAGAAGTTATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAAGAGTGAGAAGACTCTT----------1-----------1----------4-----------]-----------(-----------1_ 216

RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

Kpnł Ciał

-CTGTCGAACACAGTGGTACCTGAGGATCGATAAAAGAGGCAAAGTAAAAGGGACCCAAGA----------1----------4.---------4-----------1-----------1-----------(. 276

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-GATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGACAGTGGCAGTTGGAATTGTGGCAAT---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 336

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

EcoRI

-CAAAGGGGTGGAAAGTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAA---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 396

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

Bsmł

-GAAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACAC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 456

KECNEDCNFKELILENHYNT

Ndeł

-ATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTTTGTTGCCTTAAATCAAAA---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 516

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

- GGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAAAACAGCCCACTTTCTTCC ----------1-----------1-----------1--------— — 4-----------1-----------h 576

G I PVRGKKTKKEQKTAHFLP

182 888

FIG.3B

BamHI

-TATGGCAATAACTTAATAG-3' ---------₊---------+— 595

Μ A I T * * sekwencja plazmidu DNA

182 888

FIG.4

KGF

Ndel

5' -TATGTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGAACTGTTCCAGCCCTGA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------* gQ

MCNDMTPEQMATNVNCSSPE

-GCGACACACAAGAAGTTATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAAGAGTGAGAAGACTCTT---------₊---------₊---------₊---------+---------₊ rhtrsydymeggdirvrrlf

KpnI Ciał

-CTGTCGAACACAGTGGTACCTGAGGATCGATAAAAGAGGCAAAGTAAAAGGGACCCAAGA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-GATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGACAGIGGCAGTTGGAATTGTGGCAAT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

EcoRI

-CAAAGGGGTGGAAAGTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

Bsml

-GAAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACAC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------4- 350

KECNEDCNFKELILENHYNT

Ndel

-ATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTTTGTTGCCTTAAATCAAAA----------4---------4.----------4----------1-----------1----------4. 420

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAAAACAGCCCACTTTCTTCC---------4.---------4.---------₊---------4.---------4.---------4. 480

GIPVRGKKTKKEQKTAHFLP

BamHI

-TATGGCAATAACTTAATAG-3'

--------4.---M A I T *

503

182 888

FIG. 5

KpnI |-----------0LIG0#6-----------------1 |------0LIG0#7--------5 ’ -CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAAT3' -CATGGACGCATAGCTGTTTGCGCCGTTTCAGTTCCCGTGGGTTCTCTACTTTTTGTTGATGTTA|---------------0LIG0#9---------------------1 | — OLIGO#10--------LRIDKRGKVKGTOEMKNNYNEcoRI

--------------------| |---------0LIG0#8-------------------|

5' -ATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3'

3' -TAATACCTTTAGGCATGACAACGACAACCATAGCAACGTTAGTTTCCACAACTTAGACTTAA-5'

-------------------------1 |----OLIGO#11----------------------1

IMEIRTVAVGIVAIKGVESE182 888

FIG.6

KGF (kodon zoptymalizowany)

Xbal |-----OLIGO#12-----1

5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3' |---------------------------OLIGO#14------------------------5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGACTCCGGAACAGATGGCT----------------------------- |--------------OLIGO#15--------ACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGTCACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTG3'-GGGCCTTGCAGTGTGGGCAT-5' |-----OLIGO#20-----|

----------------------0LIG0#15----------------------------| | -GTGACATCCGTGTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACG3'-ATAGCTGTTTGC|-OLIGO#21-----------------------OLIGO#16-------------------------------TGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACT-ACCATTTC-5'

--------------------------| |-------------OLIGO#17------------GTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACA3'-ACGTTAGTTTCCACAACTTA-5' |-----OLIGO#22-----|

------------------OLIGO#17-----------------------------1 |----AAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGAT3'-GAAGTTTCTTGACTA| — OLIGO#23 —

----------------------OLIGO#18-------------------------------CCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATG-GGACC-5'

-----------------------1[-------------------OLIGO#19---------TTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGA3'-GGTCTTTCCATAGGGCCAAG-5'

I-----OLIGO#241

-------QLIG0#19|

-AAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3'

3'-AATTATCCTAGGTCAAAACT-5' |----OLIGO#13|

BamHl

182 888

FIG.7

KGF C(1,15)S

5' -ATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCCTCCTCCCCGGAA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ go MSNDMTPEQMATNVNSSSPE

-CGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTC----------1--------------------4-----------p---------4----------j- 2 0 RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

-TGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------4- Igo

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-ATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATC---------₊---------₊---------₊---------4.---------4.---------4. 240

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

-AAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAA---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 300

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

-AAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 350

KECNEDCNFKELILENHYNT

-TACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAA---------4----------4----------4.----------1----------4-----------f. 420

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCG---------4.---------4.---------4.---------4----------+---------+ 480

GIPVRGKKTKKEQKTAHFLP

-ATGGCAATCACTTAA-3' ---------₊-----495 Μ A I T *

182 888 fig.a

KGF AN3/C(15)S

5' -ATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCCTCCTCCCCGGAACGTCACACGCGT---------₊---------+---------+---------+---------₊---------₊ θ₀MTPEQMATNVNSSSPERHTR

-TCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

SYDYMEGGDIRVRRLFCRTQ

-TGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAAC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

WYLRIDKRGKVKGTQEMKNN

-TACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

YNIMEIRTVAVGIVAIKGVE

-TCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAAC---------₊---------₊---------+---------+---------+

SEFYLAMNKEGKLYAKKECN

-GAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCT---------φ----------1----------+----------1-----------1μ 360

EDCNFKELILENHYNTYASA

-AAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTT---------₊---------₊---------+---------+---------₊

KWTHNGGEMFVALNQKGI P V

-CGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

RGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

-TAA-3’ — 483

182 888

FIG.9

KGF AN3/C(15)5' -ATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCTTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 6θ MTPEQMATNVNSSPERHTRS

-TACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 220

YDYMEGGDIRVRRLFCRTQW

-TACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTAC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ |gQ

YLRIDKRGKVKGTQEMKNNY

-AATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCT---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---------₊ 240

NIMEIRTVAVGIVAIKGVES

-GAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAA---------₊---------₊---------4.---------4.---------4.---------4. 300 EFYLAMNKEGKLYAKKECNE

-GACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAA---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 35Q DCNFKELILENHYNTYASAK

-TGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGT---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 420

WTHNGGEMFVALNQKGIPVR

-GGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3 ' ---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 480

GKKTKKEQKTAHFLPMAIT*

182 888

FIG.10

KGF AN8/C(15)S

5' -ATGGCTACTAATGTTAACTCCTCTTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ gQ

MATNVNSSSPERHTRSYDYM

-GAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATC---------₊---------4----------₊---------₊---------₊---------₊ |20 EGGDIRVRRLFCRTQWYLRI

-GACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAA---------₊---------₊---------₊---------+---------+---------₊ igQ

DKRGKVKGTQEMKNNYNIME

-ATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTG---------₊---------₊---------₊---------₊---------+---------+ 240 IRTVAVGIVAIKGVESEFYL

-GCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTC---------₊---------₊---------₊---------+---------₊---------₊ 300 AMNKEGKLYAKKECNEDCNF

-AAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAAC---------₊---------₊---------₊---------+---------+---------+ 360 KELILENHYNTYASAKWTHN

-GGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACC---------4---------4.---------4.---------4----------4.---------4. 420 GGEMFVALNQKGIPVRGKKT

-AAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3' ---------4---------4----------4----------4---------468 KKEQKTAHFLPMAIT*

182 888

FIG.II

KGF AN8/C155' -ATGGCTACTAATGTTAACTCTTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ θθ MATNVNSSPERHTRSYDYME

-GGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGAC----------1-----------1-----------μ---------4-----------1-----------μ J20 GGDIRVRRLFCRTQWYLRID

-AAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 480 KRGKVKGTQEMKNNYNIMEI

-CGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCA---------₊---------₊---------₊---------₊---------+---------₊ 240 RTVAVGIVAIKGVESEFYLA

-ATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAA---------₊---------₊---------+---------+---------+---------+ 300 MNKEGKLYAKKECNEDCNFK

-GAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGT---------₊---------₊---------+---------₊---------+---------+ 350 ELILENHYNTYASAKWTHNG

-GGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAA---------₊---------+---------+---------+---------+---------₊ 420 GEMFVALNQKGIPVRGKKTK

-AAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3' ---------₊---------+---------₊---------₊-----465 KEQKTAHFLPMAIT*

182 888

FIG.12

KGF ΔΝ15

5-ATGTCTTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGC---------+---------₊---------+---------₊---------₊---------_{+ 60}MSSPERHTRSYDYMEGGDIR

-GTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTC---------₊---------+---------₊---------+---------₊---------_{+ 12}ο VRRLFCRTQWYLRIDKRGKV

-AAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ igQ KGTQEMKNNYNIMEIRTVAV

-GGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 240 GIVAIKGVESEFYLAMNKEG

-AAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAA---------₊---------4---------4---------4.---------4.---------+ 300 KLYAKKECNEDCNFKELILE

-AACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTT---------4---------4.---------4---------4---------4---------₊ 350 NHYNTYASAKWTHNGGEMFV

-GCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACC---------4---------4---------₊---------₊---------4---------4 420

ALNQKGIPVRGKKTKKEQKT

-GCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------+---------4---------₊ 450

AHFLPMAIT*

182 888

FIG.13

KGF ΔΝ16

5' -ATGTCTCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTA----------1-----------1----------4-----------1-----------1----------4. gQ MSPERHTRSYDYMEGGDIRV

-CGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAG----------1.----------1----------4-----------1-----------1----------4 120 RRLFCRTQWYLRIDKRGKVK

-GGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGT---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 18Q

GTQEMKNNYNIMEIRTVAVG

-ATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAA---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 240 IVAIKGVESEFYLAMNKEGK

-CTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAAC---------4.---------4.------—4.---------4.---------4.---------4. 300 LYAKKECNEDCNFKELILEN

-CACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCT---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 360

HYNTYASAKWTHNGGEMFVA

-CTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCT---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 420

LNQKGIPVRGKKTKKEQKTA

-CACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3' ---------4.---------+-------447 HFLPMAIT*

182 888

F1GJ4

KGF ΔΝ17

5'-ATGCCTGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ gg

MPERHTRSYDYMEGGDIRVR

-CGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

RLFCRTQWYLRIDKRGKVKG

-ACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATC---------₊---------₊---------₊---------+---------₊

TQEMKNNYNIMEIRTVAVGI

-GTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

VAIKGVESEFYLAMNKEGKL

-TACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCAC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 300 YAKKECNEDCNFKELILENH

-TACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTG---------₊---------+---------+---------₊---------₊

YNTYASAKWTHNGGEMFVAL

-AACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCAC---------₊---------₊---------₊---------₊---------++ 420

N Q K G I PVRGKKTKKEQKTAH

-TTCCTGCCGATGGCAATCACTTAA-3' ---------₊---------+ 444

F L P M A I T *

182 888

FIG.15

KGF ΔΝ18 ’ -ATGGAACGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ go MERHTRSYDYMEGGDIRVRR

-CTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

LFCRTQWYLRIDKRGKVKGT

-CAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

QEMKNNYNIMEIRTVAVGIV

-GCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTAC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

AIKGVESEFYLAMNKEGKLY

-GCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTAC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 3qq AKKECNEDCNFKELILENHY

-AACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAAC---------₊---------₊---------₊---------4.---------4.---------4. 360 NTYASAKWTHNGGEMFVALN

-CAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 420

QKGIPVRGKKTKKEQKTAHF

-CTGCCGATGGCAATCACTTAA-3' ---------₊---------₊_ 44i L P M A I T *

182 888

FI G.I6

KGF ΔΝ19

5'-ATGCGTCATACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ θο

MRHTRSYDYMEGGDIRVRRL

-TTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAA---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---------₊ 120

FCRTQWYLRIDKRGKVKGTQ

-GAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ i8Q EMKNNYNIMEIRTVAVGIVA

-ATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 240 IKGVESEFYLAMNKEGKLYA

-AAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAAC---------₊---------₊---------₊---------+---------₊---------₊ 30Q KKECNEDCNFKELILENHYN

-ACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊+ 350

TYASAKWTHNGGEMFVALNQ

-AAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTG---------₊---------₊---------₊---------₊---------+

KGIPVRGKKTKKEQKTAHFL

-CCGATGGCAATCACTTAA-3'

---------₊438

P M A I T *

182 888

FIG.17

KGF ΔΝ20

5' -ATGCATACTCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 6q

MHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

-TGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 220 CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-ATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 180 MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

-AAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAA---------4.---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 240

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

-AAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACC---------4----------₊---------4.---------₊---------₊---------4. 300 KECNEDCNFKELILENHYNT

-TACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAA---------4.---------4.---------4----------4.---------4.---------4. 360

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCG---------4----------4----------4----------4----------4----------4- 420

G I PVRGKKTKKEQKTAHFLP

-ATGGCAATCACTTAA-3'

---------4.-----435

M A I T *

182 888

FIG.18

KGF ΔΝ21 ¹ -ATGACTCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGC---------₊---------+---------₊---------+---------₊---------₊ θθ MTRSYDYMEGGDIRVRRLFC

-CGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------_{+ 12}ο RTQWYLRIDKRGKVKGTQEM

-AAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------4. 180 KNNYNIMEIRTVAVGIVAIK

-GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAA---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 240 GVESEFYLAMNKEGKLYAKK

-GAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTAC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 300 ECNEDCNFKELILENHYNTY

- GC ATCTGCT AAATGGACCC ACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACC AGAAAGGT ---------4-----------1-----------1--------— — H------—----1-----------1 360 ASAKWTHNGGEMFVALNQKG

-ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATG---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 420

IPVRGKKTKKEQKTAHFLPM

-GCAATCACTTAA-3 ’

---------4— 432

A I T *

182 888

FIG.19

KGF ΔΝ22

5' -ATGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

MRSYDYMEGGDIRVRRLFCR

-ACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAA---------4-----------[.---------4-----------1-----------1----------4. Χ2Ο TQWYLRIDKRGKVKGTQEMK

-AACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGT---------4.---------4.---------4.---------4.---------₊---------4. χ8Ο NNYNIMEIRTVAVGIVAIKG

-GTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAA---------4.---------4.---------4.-------·—4.---------4.---------4. 240

VESEFYLAMNKEGKLYAKKE

-TGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCA---------4.---------4.---------4.---------4.---------+---------4. 300 CNEDCNFKELILENHYNTYA

-TCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 350

SAKWTHNGGEMFVALNQKGI

-CCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCA---------4.---------4.---------4.---------4.---------+---------4. 420 PVRGKKTKKEQKTAHFLPMA

-ATCACTTAA-3’ ---------429

182 888

FIG.20

KGF ΔΝ23

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------_{+ 60}MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT

-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------_{+ 12}o QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN

-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ Igo

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV

-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 240 ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC

-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT---------₊---------+---------₊---------₊---------₊---------₊ 3oo

NEDCNFKELILENHYNTYAS

-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCG ---------4.---------4.----------1-----------1----------4.----------(. 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP

-GTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 420

VRGKKTKKEQKTAHFLPMAI

-ACTTAA-3'

------ 426

182 888

FIG.21

KGF ΔΝ24

5' -ATGTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAG---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ $0 MYDYMEGGDIRVRRLFCRTQ

-TGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAAC----------1-----------1-----------μ---------4-----------μ----------μ ^20

WYLRIDKRGKVKGTQEMKNN

-TACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAA----------1-----------1-----------μ----------1-----------1-----------μ £gQ YNIMEIRTVAVGIVAIKGVE

-TCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAAC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 240 SEFYLAMNKEGKLYAKKECN

-GAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCT---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 3Q0 EDCNFKELILENHYNTYASA

-AAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTT---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 360

KWTHNGGEMFVALNQKGI P V

-CGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACT---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 420

RGKKTKKEQKTAHFLPMAIT

-TAA-3' — 423

182 888

FIG.22

KGF C(1,15)S/R(144)E

5' -ATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTCCTCCTCCCCGGAA----------μ---------4----------4-----------h---------4----------4 5Q MSNDMTPEQMATNVNSSSPE

-CGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 220 RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

-TGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAG---------4---------4.---------4.---------4.-------'--4----------4- 180 CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-ATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATC---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 240

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

-AAAGGTGTTGAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAAG---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 300

KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

-AAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACACA---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 350

KECNEDCNFKELILENHYNT

-TATGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAA---------4.---------4---------4---------₊---------₊---------4 420

YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGTATCCCTGTTGAAGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCG---------4---------4---------4---------4---------4---------4 480

GIPVEGKKTKKEQKTAHFLP

-ATGGCAATCACTTAA-3' ---------+-----495 M A I T *

182 888

FIG.23

KGF C(l, 15)S/R(144)Q

- CGTC AC ACGCGTTCCT ACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTC ----------1----------f---------φ---------4--------------------120 RHTRSYDYMEGGDIRVRRLF

- TGCCGT ACCCAGTGGTACCTGCGTATCGAC AAACGCGGC AAAGTC AAGGGC ACCC AAGAG ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ igo

CRTQWYLRIDKRGKVKGTQE

-ATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATC---------4.---------4.----------4----------1-----------1----------4. 240

MKNNYNIMEIRTVAVGIVAI

-AAAGGTGTTGAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAAG---------₊---------₊---------₊---------+---------+---------₊ 300 KGVESEFYLAMNKEGKLYAK

-AAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACACA---------₊---------+---------₊---------₊---------₊---------₊ 35Q

KECNEDCNFKELILENHYNT

-TATGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAA---------₊---------₊---------+---------+---------+---------₊ 420 YASAKWTHNGGEMFVALNQK

-GGTATCCCTGTTCAAGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCG---------₊---------₊---------4.---------+---------+---------₊ 480 GIPVQGKKTKKEQKTAHFLP

-ATGGCAATCACTTAA-3' ---------₊-----495

M A I T *

182 888

FIG.24

KGF AN23/R(144)Q

5'-ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC---------₊---------₊---------₊---------+---------₊---------_{+ 60}

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT

-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC---------₊---------₊---------+---------₊---------+---------₊ 220 QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN

-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 280 NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV

-GAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAAGAAAGAATGC---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 240 ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACACATATGCATCT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 3oq NEDCNFKELILENHYNTYAS

-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGI P

-GTTCAAGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC---------₊---------+---------₊---------+--------->---------₊ 420

VQGKKTKKEQKTAHFLPMAI

-ACTTAA-3' ------426 t *

182 888

FIG.25

182 888

FIG. 26

182 888

FIG. 27 pozostałego rozpuszczalnego KGF

Czas inkubacji w 37°C (dni)

182 888

FIG .28 pozorne (°C)

KGF C(1,15)S/R(144)E ^A KGF C(1,15)S/R(144)Q OKGFC(1,15)S ArhKGF

182 888

FIG.29

CPM

log ng/zagłębienie —— rhKGF a— KGFC(1,15)S

182 888

CPM

FIG. 30

-3.00 -2.00 -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 log ng/zagłębienie rhKGF o— KGFAN15

182 888

FIG.31

CPM

log ng/zagłębienie rhKGF o— KGF ΔΝ23

182 888

FIG.32

CPM

-3.00 -2.00 -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 log ng/zagłębienie «— rhKGF o— KGF AN23/R(144)Q

182 888

CPM

FIG. 33

-3.00 -2.00 -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 log ng/zagłębienie «— rhKGF a— KGF C(1,15)S/R(144)Q

182 888

FIG.34

CPM

-2 -1 _₅₀₀θφ 12 3 4 log ng/zagłębienie —— rhKGF o— KGF 0(1,15)S/R(144)E

182 888

F1G.36

KGF 0(1,15,40)5

5' -CTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGT ---------₊---------₊---------4---------₊---------₊

MSNDMTPEQMATNV

TAACTCCTCCTCCCCGGAACGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACAT

---------+---------₊---------+---------₊---------₊---------₊₁₂

NSSSPERHTRSYDYMEGGDI

CCGCGTACGCCGTTTGTTCTCTCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAA ---------+---------₊---------₊---------₊---------₊

RVRRLFSRTQWYLRIDKRGK

AGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGC ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------4.240

VKGTQEMKNNYNIMEIRTVA

TGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGA ---------4---------4---------4---------4---------4---------4300

VGIVAIKGVESEFYLAMNKE

AGGAAAACTCTATGCAAAGAAAGAATGCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCT ---------4----------4---------4----------(.---------4---------4360

GKLYAKKECNEDCNFKELIL

GGAAAACCATTACAACACATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTT ---------4---------4---------4---------4---------4---------4420

ENHYNTYASAKWTHNGGEMF

TGTTGCCTTAAATCAAAAGGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAA ---------4---------4---------4---------4---------4---------4480

VALNQKGIPVRGKKTKKEQK

AACAGCCCACTTTCTTCCTATGGCAATAACTTAATAG-3'

---------4---------+---------+---------+- 521

TAHFLPMAIT**

182 888

FIG.37

KGF φ 15,102)5 ' -CTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGT ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

MSNDMTPEQMATNV

TAACTCCTCCTCCCCGGAACGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACAT ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊420

NSSSPERHTRSYDYMEGGDI

CCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAA ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊48Q

RVRRLFCRTQWYLRIDKRGK

AGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGC ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊240

VKGTQEMKNNYNIMEIRTVA

TGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCTATGAACAAAGA ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

VGIVAIKGVESEFYLAMNKE

AGGTAAACTGTACGCTAAAAAAGAATCCAATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCT ---------4----------4-----------1-----------1-----------1----------4.360

GKLYAKKESNEDCNFKELIL

GGAAAACCATTACAACACATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTT ---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.420

ENHYNTYASAKWTHNGGEMF

TGTTGCCTTAAATCAAAAGGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAA ---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.480

VALNQKGIPVRGKKTKKEQK

AACAGCCCACTTTCTTCCTATGGCAATAACTTAATAG-3 ¹

---------4.---------4.---------4.---------₊_ 521

TAHFLPMAIT* *

182 888

FIG.38

KGF C^, 15/102,10^S

5' -CTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTAATGATATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGT ---------+---------₊---------+---------₊---------₊---------_{+ 60}

MSNDMTPEQMATNV

TAACTCCTCCTCCCCGGAACGTCACACGCGTTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACAT ---------4---------4---------4---------4---------4---------₊ 120

NSSSPERHTRSYDYMEGGDI

CCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAA ---------4---------4---------4---------+---------4---------4 1QQ

RVRRLFCRTQWYLRIDKRGK

AGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGC ---------4---------4---------4---------4---------4---------4240

VKGTQEMKNNYNIMEIRTVA

TGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCTATGAACAAAGA ---------4---------4---------4---------4---------4---------+300

VGIVAIKGVESEFYLAMNKE

AGGTAAACTGTACGCTAAAAAAGAATCCAATGAAGATTCTAACTTCAAAGAACTAATTCT ---------4---------4---------4---------4---------4---------436Q

GKLYAKKESNEDSNFKELIL

GGAAAACCATTACAACACATATGCATCAGCTAAATGGACACACAACGGAGGGGAAATGTT ---------4---------4---------₊---------4---------₊---------4420

ENHYNTYASAKWTHNGGEMF

TGTTGCCTTAAATCAAAAGGGGATTCCTGTAAGAGGAAAAAAAACGAAGAAAGAACAAAA ---------4---------4---------4---------₊---------₊---------443Q

VALNQKGI PVRGKKTKKEQK

AACAGCCCACTTTCTTCCTATGGCAATAACTTAATAG-3'

---------4---------+---------+---------₊_ 521

TAHFLPMAIT* *

182 888

FIG.39

ΔΝ23/Ν(137)Ε

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ go

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------₊---------+---------+---------₊---------₊ 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------₊---------+---------₊---------₊---------₊ 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT₊---------₊---------+---------₊---------₊---------₊ 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGGAACAGAAAGGTATCCCT₊---------₊---------₊---------+---------+---------+ 360

AKWTHNGGEMFVALEQKGIP-GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC+---------₊---------₊---------₊---------₊---------+ 420

VRGKKTKKEQKTAHFLPMAI -ACTTAA-3’ +----- 426 τ *

182 888

FjG 40

ΔΝ23/Κ(139)Ε

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC₊---------₊---------+---------₊---------₊---------₊ go

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC ₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 120

Q W Y L R I DKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------₊---------₊---------+---------+---------₊ 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC+---------₊---------+---------₊---------+---------₊ 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT ₊---------₊---------₊---------+---------+---------+ 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGGAAGGTATCCCT+---------₊---------+---------₊---------₊---------+ 360

AKWTHNGGEMFVALNQEGIP-

- GTTCGTGGTAAGAAAACC AAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGC AATC ₊---------+---------+---------+---------+---------₊ 420

VRGKKTKKEQKTAHFLPMAI-ACTTAA-3' + 426 t *

182 888

FIG.41

ΔΝ23/Κ(139)Ο

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊--------- go

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------+---------+---------+---------₊---------₊--------- 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT₊---------₊---------₊---------₊---------4.---------4.--------- lgQ

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT-

4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 3Q0

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGCAAGGTATCCCT₊---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 360

AKWTHNGGEMFVALNQQGIP-GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4----------4----------4----------4----------4----------4- 420

VRGKKTKKEQKTAHFLPMAI-ACTTAA-3¹ +----- 426

T *

182 888

FIG.42

AN23/R(144)A

5'-ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------+---------+---------₊---------₊---------₊ 60

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 120

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ igo

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT+---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.--------- 3QQ

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT+---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.--------- Igo

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTGCTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGAIGGCAATC4.---------4.---------₊---------4.---------4.---------4.--------- 420

VAGKKTKKEQKTAHFLPMAI-ACTTAA-3' +----- 426 τ *

182 888

FIG.43

AN23/R(144)E

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊--------- θθ MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC₊---------₊---------₊---------₊---------+---------₊ 220

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN -AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------₊---------+---------₊---------₊---------+ 280

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTATCTTGCAATGAACAAGGAAGGAAAACTCTATGCAAAGAAAGAATGC+---------₊---------₊---------+---------₊---------+ 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AATGAAGATTGTAACTTCAAAGAACTAATTCTGGAAAACCATTACAACACATATGCATCT+---------+---------₊---------+---------+---------+ 30Q

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT+---------₊---------₊---------₊---------+---------₊ 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGI P -GTTGAAGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC+---------ί-----------1-----—————j--------—+----------1-------— 420

VEGKKTKKEQKTAHFLPMAI -ACTTAA-3' +----- 426

T *

182 888

FIG.44

ΔΝ23/R(144)L

5'-ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 6θ

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ j-20

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTi-----------1----------+----------1-----------1-----------1 180

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC+---------4----------₊---------+---------+---------+ 240

4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCIGAACCAGAAAGGTATCCCT-

4.---------4.---------4.---------4.---------4----------4. 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP -GTTCTGGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 420

VLGKKTKKEQKTAHFLPMAI -ACTTAA-3' +----- 426 τ *

182 888

FIG.45

ΔΝ23/Κ(147)Ε

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC₊---------₊---------₊---------₊---------+---------₊--------- ₆₀MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC+---------₊---------+---------₊---------₊---------₊ 220

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 180

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC -AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------+ 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATTCCT+---------₊---------+---------₊---------₊---------+ 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGI P -GTTCGTGGTAAGGAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC+---------₊---------₊---------₊---------₊---------+ 420

VRGKETKKEQKTAHFLPMAI -ACTTAA-3' +----- 426

T *

182 888

FIG.46 ńN23/K(147)Q ’ -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------+---------+---------₊---------₊---------₊

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------+---------₊---------₊---------+---------₊ lgo

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC+---------₊---------₊---------₊---------+---------+ 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT+---------₊---------+---------+---------+---------+--------- 3QQ

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCTi-----------1-----------1-----------1——-------1----------1---------- 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCGTGGTAAGCAAACCAAGAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC+---------₊---------4----------₊---------₊---------+--------- 420

VRGKQTKKEQKTAHFLPMAI-ACTTAA-3' +----- 426 τ *

182 888

FIG. 47

ΔΝ23/Κ(153)Ε

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 5q

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 220

QWYLR IDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT4----------1-----------1-----------1----------4-----------1 280

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC4----------4----------4----------1----------4-----------1 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT4---------4---------4---------4---------4---------4 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGIGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT4---------4---------₊---------4---------4---------4 350

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGGAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC₊---------4---------4---------4---------4---------4 420

VRGKKTKKEQETAHFLPMAI -ACTTAA-3' +----- 426 τ *

182 888

FIG.48 ńN23/K(153)Q

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC+---------+---------₊---------₊---------₊---------₊

MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-

- CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC +---------₊---------₊---------₊---------+---------₊ 220

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT+---------₊---------₊---------₊---------+---------+ 280

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC -AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT+---------₊---------+---------₊---------+---------+ 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT+---------₊---------+---------+---------+---------₊ 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCGTGGTAAGAAAACCAAGAAAGAACAGCAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC₊---------₊---------+---------₊---------+---------+ 420

VRGKKTKKEQQTAHFLPMAI -ACTTAA-3' +----- 426 t * _

182 888

FIG.49

AN23/Q(152)E/K(153)E

5' -ATGTCCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGCGTACGTCGTCTGTTCTGCCGTACC₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊--------MSYDYMEGGDIRVRRLFCRT-CAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCCAAGAGATGAAAAAC4---------4---------+---------4---------4---------4 220

QWYLRIDKRGKVKGTQEMKN-AACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTT4---------+---------4---------4---------+---------4 280

NYNIMEIRTVAVGIVAIKGV-GAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGC4---------+---------₊---------+---------4---------4 240

ESEFYLAMNKEGKLYAKKEC-AACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCT4---------4---------4---------₊---------₊---------₊ 300

NEDCNFKELILENHYNTYAS-GCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCT4---------₊---------₊---------4---------₊---------₊ 360

AKWTHNGGEMFVALNQKGIP-GTTCGIGGTAAGAAAACCAAGAAAGAAGAGGAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATC4---------4---------4---------4---------4---------4 420

VRGKKTKKEEETAHFLPMAI-ACTTAA-3' +----- 426 t *

182 888

(ΤΡ/βιπ) τΜΐχ θμ Λζοχηχβ χποτζο^

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych; w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem.
2. Analog KGF według zastrz. 1, w którym reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 są usunięte.
3. Analog KGF według zastrz. 1, w którym aminokwasy 32-55 w SEQ ID NO:2 sąodcięte.
4. Analog KGF według zastrz. 1, w którym reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 jest usunięta, a reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 jest podstawiona innym aminokwasem.
5. Analog KGF według zastrz. 1, w którym pierwsze - do czternastu, N-końcowe aminokwasy sąodcięte, a reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO :2 jest podstawiona innym aminokwasem.
6. Analog KGF według zastrz. 1, w którym reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO: 2 oraz reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 sąpodstawione innym aminokwasem.
7. Analog KGF według zastrz. 4 albo 5, albo 6, w którym za resztę cysteinowąjest podstawiona reszta aminokwasowa wybrana z grupy obejmującej reszty alaniny leucyny i seryny.
8. Analog KGF według zastrz. 7, w którym reszta serynowa jest podstawiona za resztę cysternową.
9. Analog KGF według zastrz. 1, w którym występuje dodatkowo podstawienie zmieniające ładunek w pozycji aminokwasu wybranego spośród: reszty argininowej w pozycji aminokwasu 72 w SEQ ID NO:2, reszty kwasu glutaminowego wpozycji aminokwasu 74 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 86 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 126 w SEQ ID NO:2, reszty asparginowej w pozycji aminokwasu 168 w SEQ ID NO:2, reszty kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasu 169 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 170 w SEQ ID NO:2, reszty argininowej w pozycji aminokwasu 175 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 178 w SEQ ID NO:2, reszty glutaminowej w pozycji aminokwasu 183 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 184 w SEQ ID NO:2 lub reszty treoninowej w pozycji aminokwasu 185 w SEQ ID NO:2.
10. Analog KGF według zastrz. 1, który dodatkowo obejmuje modyfikację polegającą na tym, że co najmniej jeden aminokwas w pętlotwórczej sekwencji reszt aminokwasowych w pozycjach Asn^l46-Thr¹⁵⁰ w SEQ ID NO:2 - zastąpiony jest resztą innego aminokwasu posiadającą wyższy potencjał tworzenia pętli.
11. Analog KGF według zastrz. 9 albo 10, w którym reszty aminokwasowe w pozycjach 32-54 w SEQ ID NO:2 są usunięte.

182 888
12. Analog KGF według zastrz. 1, wybrany z grupy analogów obejmującej C(1,15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:32, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(l,15,40)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:78, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(l,15,102)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:80, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15,102,106)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:82, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ15 (SEQ ID NO :42, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ17 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:46, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ 18 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:48, w której początkowa metionina jewst uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ19 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:50, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ20 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:52, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ21 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:54, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ22 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:56, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:58, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ24 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:60, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN3/C(15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:34, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN3/C(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:36, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN8/C(15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:38, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ8/0(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:40, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15)S/R(144)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:62, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15)S/R(144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ IDNO:64, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/H(116)G (odpowiadający sekwencji aminokwasów 54-194 w SEQ ID NO:2, w resztąhistydynową w pozycji aminokwasu 147 podstawioną glicyną ΔΝ23/Ν( 13 7)E (odpowiadający sekwencji SEQ IDNO:84, wktórej początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ(139)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:86, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(139)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:88, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ(144)Α (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:90, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ(144)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:92, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)L (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:94, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ(147)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:96, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(147)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:98, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Ν(153)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 100, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/ΝΚ(153)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 102, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/Q(152)E/K(153)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:104, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie) i AN23/R(144)Q

182 888 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:66, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).
13. Analog KGF według zastrz. 12, którym jest analog ΔΝ16 (odpowiadający sekwencji SEQ IDNO:44, wktórej początkowametioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).
14. Analog KGF według zastrz. 1, mający sekwencję sygnalną lub amino-końcową resztę metioninową.
15. Analog KGF według zastrz. 14, w którym sekwencję sygnalną stanowią aminokwasy 1-31 w SEQ IDNO:2.
16. Analog KGF według zastrz. 1, połączony kowalencyjnie z ugrupowaniem chemicznym.
17. Analog KGF według zastrz. 16, w którym ugrupowaniem chemicznym jest glikol polietylenowy.
18. Analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, według zastrz. 1, w którym jest ΔΝ23 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:58, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), połączony kowalencyjnie z ugrupowaniem chemicznym.
19. Analog KGF według zastrz. 18, w którym ugrupowaniem chemicznym jest glikol polietylenowy.
20. Analog KGF według zastrz. 1, w postaci liofilizowanej.
21. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że substancję aktywną stanowi terapeutycznie skuteczna ilość analoga rodzinnego keratynocytowego czynnika wzrostu (o sekwencji aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji) - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz wpozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta, albo podstawiona innym aminokwasem.
22. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że w zastosowanym analogu KGF reszta cysternowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 są usunięte.
23. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, ze w zastosowanym analogu KGF aminokwasy 32-55 w SEQ ID NO:2 są odcięte.
24. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, ze w zastosowanym analogu KGF reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 jest usunięta, a reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 jest podstawiona innym aminokwasem.
25. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że w zastosowanym analogu KGF pierwsze - do czternastu, N-końcowe aminokwasy sąodcięte, a reszta cysteinowa w pozycj i aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 jest podstawiona innym aminokwasem.
26. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że w zastosowanym analogu KGF reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 są podstawione innym aminokwasem.
27. Kompozycja według zastrz. 24 albo 25, albo 26, znamienna tym, że w zastosowanym analogu KGF za resztę cysteinowąjest podstawiona reszta aminokwasowa wybrana z grupy obejmującej reszty alaniny, leucyny i seryny.
28. Kompozycja według zastrz. 27, znamienna tym, że w zastosowanym analogu KGF reszta serynowa jest podstawiona za resztę cysternową.
29. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że w zastosowanym analogu KGF występuje dodatkowo podstawienie zmieniające ładunek w pozycji aminokwasu wybranego spośród: reszty argininowej w pozycji aminokwasu 72 w SEQ ID NO:2, reszty kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasu 74 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 86 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 126 w SEQ ID NO:2, reszty asparginowej w pozycji aminokwasu 168 w SEQ ID NO:2, reszty kwasu glutaminowego w pozycji amino

182 888 kwasu 169 w SEQ ID N0:2, reszty lizynowej wpozycji aminokwasu 170 w SEQ ID NO:2, reszty argininowej w pozycji aminokwasu 175 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 178 w SEQ ID NO:2, reszty glutaminowej w pozycji aminokwasu 183 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 184 w SEQ ID NO:2 lub reszty treoninowej w pozycji aminokwasu 185 w SEQ ID NO:2.
30. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że dodatkowo zastosowany analog KGF obejmuje modyfikację polegającąna tym, że co najmniej jeden aminokwas w pętlotwórczej sekwencji reszt aminokwasowych w pozycjach Asn¹⁴⁶-Thr¹⁵⁰ w SEQ ID NO:2 - zastąpiony jest resztą innego aminokwasu posiadającą wyższy potencjał tworzenia pętli.
31. Kompozycja według zastrz. 29 albo 30, znamienna tym, że w zastosowanym analogu KGF reszty aminokwasowe w pozycjach 32-54 w SEQ ID NO:2 są usunięte.
32. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że zastosowanym analogiem KGF jest analog wybrany z grupy analogów obejmującej C( 1,15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:32, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15,40)S (odpowiadający sekwencji SEQ IDNO:78, wktórej początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15,102)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:80, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15,102,106)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:82, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ15 (SEQ ID NO:42, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ17 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:46, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ18 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:48, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ 19 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:50, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ20 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:52, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ21 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:54, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ22 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:56, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 5 8, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ24 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:60, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN3/C(15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:34, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ3/Ο(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:36, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN8/C(15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:38, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN8/C(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:40, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C( 1,15)S/R( 144)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:62, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15)S/R(144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:64, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Η(116)Ο (odpowiadający sekwencji aminokwasów 54-194 w SEQ ID NO:2, w resztą histy dyno wą w pozycji aminokwasu 147 podstawioną glicyną ΔΝ23/Ν(137)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:84, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ(139)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:86, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ(139)9 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:88, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)A (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:90, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:92, w której początkowa metioninajest

182 888 uznana za resztę „O” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)L (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:94, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ(147)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:96, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(147)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:98, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Ν(153)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 100, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/NK(153)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 102, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/Q(152)E/K( 153)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 104, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie) i AN23/R(144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:66, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).
33. Kompozycja według zastrz. 32, znamienna tym, że zastosowanym analogiem KGF jest analog ΔΝ16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).
34. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że zastosowany analog KGF ma sekwencję sygnalną lub amino-końcową resztę metioninową.
35. Kompozycja według zastrz. 34, znamienna tym, że w zastosowanym analogu KGF sekwencję sygnalną stanowią aminokwasy 1-31 w SEQ ID NO:2.
36. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że zastosowany analog KGF jest połączony kowalencyjnie z ugrupowaniem chemicznym.
37. Kompozycja według zastrz. 36, znamienna tym, że zastosowany analog KGF jest połączony kowalencyjnie z glikolem polietylenowym.
38. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, którym jest analog ΔΝ23 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:58, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), połączony kowalencyjnie z ugrupowaniem chemicznym.
39. Kompozycja według zastrz. 38, znamienna tym, ze zastosowany analog KGF jest połączony kowalencyjnie z glikolem polietylenowym.
40. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera analog KGF w postaci liofilizowanej.
41. Cząsteczka rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ IDNO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję aminokwasów właściwąKGF, obejmującąmodyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta, albo podstawiona innym aminokwasem.
42. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 41, kodującego analog KGF, w którym reszta cysternowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz reszta cysternowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 są usunięte.
43. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 41, koduj ącego analog KGF, w którym aminokwasy 32-55 w SEQ ID NO:2 są odcięte.
44. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 41, kodującego analog KGF, w którym reszta cysternowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 jest usunięta, a reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 jest podstawiona innym aminokwasem.
45. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 41, koduj ącego analog KGF, w którym pierwsze - do czternastu, N-końcowe aminokwasy są odcięte, a reszta cysteinowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 jest podstawiona innym aminokwasem.

182 888
46. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 41, kodującego analog KGF, w którym reszta cysternowa w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz reszta cysternowa w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 są podstawione innym aminokwasem.
47. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 44 albo 45, albo 46, kodującego analog KGF, w którym za resztę cysteinowąjest podstawiona reszta aminokwasowa wybrana z grupy obejmującej reszty alaniny, leucyny i seryny.
48. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 47, kodującego analog KGF, w którym reszta serynowa jest podstawiona za resztę cysteinową.
49. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 41, kodującego analog KGF, w którym występuje dodatkowo podstawienie zmieniające ładunek w pozycji aminokwasu wybranego spośród: reszty argininowej w pozycji aminokwasu 72 w SEQ ID NO:2, reszty kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasu 74 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 86 w SEQ IDN0:2, reszty lizynowej wpozycji aminokwasu 126 w SEQ ID NO:2, reszty asparginowej w pozycji aminokwasu 168 w SEQ ID NO:2, reszty kwasu glutaminowego w pozycji aminokwasu 169 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej wpozycji aminokwasu 170 w SEQ ID NO:2, reszty argininowej w pozycji aminokwasu 175 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej w pozycji aminokwasu 178 w SEQ ID NO:2, reszty glutaminowej w pozycji aminokwasu 183 w SEQ ID NO:2, reszty lizynowej wpozycji aminokwasu 184 w SEQ ID NO:2 lub reszty treoninowej w pozycji aminokwasu 185 w SEQ ID NO:2.
50. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 41, kodującego analog KGF, który dodatkowo obejmuje modyfikację polegającą na tym, że co najmniej jeden aminokwas w pętlotwórczej sekwencji reszt aminokwasowych w pozycjach Asn¹⁴⁶-Thr^IS0 w SEQ ID NO:2 - zastąpiony jest resztą innego aminokwasu posiadającą wyższy potencjał tworzenia pętli.
51. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 49 albo 50, kodującego analog KGF, w którym reszty aminokwasowe w pozycjach 32-54 w SEQ ID NO:2 są usunięte.
52. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 41, kodującego analog KGF, wybrany z grupy analogów obejmującej C(1,15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:32, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(l,15,40)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:78, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15,102)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:80, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C( 1,15,102,106) S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:82, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ15 (SEQ ID NO:42, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ 17 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:46, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ 18 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:48, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ19 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:50, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ20 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:52, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ21 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:54, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ22 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:56, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:58, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ24 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:60, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN3/C( 15 )S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:34, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN3/C(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:36, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN8/C(15)S (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:38, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN8/C(15)- (odpowiadający sekwencji SEQ ID

182 888

NO:40, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15)S/R(144)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:62, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), C(1,15)S/R(144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:64, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/H(116)G (odpowiadający sekwencji aminokwasów 54-194 w SEQ ID NO:2, z resztąhistydynowąw pozycji aminokwasu 147 podstawionąglicynąAN23/N(137)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:84, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ(139)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:86, w której początkowa metionina jest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(139)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:88, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)A (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:90, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:92, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/R(144)L (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:94, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Κ(147)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO :96, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/K(147)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:98, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), ΔΝ23/Ν(153)Ε (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 100, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/NK(153)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:102, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie), AN23/Q(152)E/K(153)E (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO: 104, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie) i AN23/R( 144)Q (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:66, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).
53. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 52, kodującego analog KGF, którym jest analog ΔΝ16 (odpowiadający sekwencji SEQ ID NO:44, w której początkowa metioninajest uznana za resztę „0” i występuje ewentualnie).
54. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 41, kodującego analog KGF mający sekwencję sygnalną lub amino-końcową resztę metioninową.
5 5. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 54, koduj ącego analog KGF, w którym sekwencję sygnalną stanowią aminokwasy 1-31 w SEQ ID NO:2.
56. Biologicznie funkcjonalny wektor, zawierający cząsteczkę rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: wpozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem.
57. Priokariotyczna lub eukariotyczna komórka-gospodarza zawierająca cząsteczkę rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem, albo biologicznie funkcjonalny wektor zawierający cząsteczkę takiego rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję amionokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji

182 888

SEQ ID N0:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem.
58. Prokariotyczna komórka-gospodarz według zastrz. 57, będąca E coli.
59. Eukariotyczna komórka-gospodarz według zastrz. 57,. będąca komórką ssaka, korzystnie komórką jajnika chomika chińskiego.
60. Sposób wytwarzania polipeptydowego analoga KGF, obejmujący prowadzenie namnazania w odpowiednich warunkach odżywczych prokariotycznej lub eukariotycznej komórki-gospodarza trwale transformowanej określoną cząsteczką kwasu nukleinowego, znamienny tym, że stosuje się komórkę-gospodarza zawierającą cząsteczkę rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję aminokwasów właściwą KGF, obejmującą modyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem, albo biologicznie funkcjonalny wektor zawierający cząsteczkę takiego rekombinacyjnego kwasu nukleinowego kodującego analog rodzimego keratynocytowego czynnika wzrostu - KGF, określonego przez sekwencję aminokwasów 32-194 w SEQ ID NO:2, z sekwencją sygnalną lub bez tej sekwencji, określony przez sekwencję amionokwasów właściwąKGF, obejmującąmodyfikację jednego lub więcej aminokwasów 32-55 w sekwencji SEQ ID NO:2, w którym każda z reszt cysternowych: w pozycji aminokwasu 32 w SEQ ID NO:2 oraz w pozycji aminokwasu 46 w SEQ ID NO:2 (odpowiednio Cys¹ oraz Cys¹⁵), jest albo usunięta albo podstawiona innym aminokwasem i prowadzi się hodowlę w sposób pozwalający na ekspresję kodowanego analoga KGF, po czym wyodrębnia się tak wytworzony analog KGF.

* * *