JPH10507193A - Ｋｇｆを用いた糖尿病の治療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳類における糖尿病を治療するための角化細胞成長因子の使用法および医薬組成物について述べる。

Description

【発明の詳細な説明】 ＫＧＦを用いた糖尿病の治療法 発明の分野 本発明は、糖尿病の発症を治療または予防するための角化細胞成長因子の適用 に関する。 発明の背景 角化細胞成長因子（ＫＧＦ）は、ヒト胎芽肺線維芽細胞系の調整培地で最初に 同定された上皮細胞に特異的な成長因子である。Rubin等，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 86:802-806(1989)。ＫＧＦのメッセンジャーＲＮＡの発現が、種々の発 育段階で上皮組織から得たいくつかの間質線維芽細胞系で検出された。ＫＧＦの ための転写は、正常な成人の腎臓および胃腸管の器官から抽出したＲＮＡでも明 白であった。Finch等，Science 245:752-755(1989)。ＫＧＦが、培養物中の線維 芽細胞から分泌され、インビボで表皮ではなく真皮で発現されるという証拠は、 ＫＧＦが、角化細胞増殖の重要な正常なパラクリンエフェクターであるかもしれ ないことを示す。研究は、ＫＧＦが、組織培養における一次または二次のヒト角 化細胞の増殖を刺激するのにＥＧＦと同じくらい効能があることを示してきた。 Marchese 等，J．Cell．Phys．144: 326-332(1990)。 正常な成熟動物におけるエクスビボおよびインビボ研究は、ＫＧＦが、毛包形 態形成、肝細胞増殖、および肺、胸部、膵臓、胃、小腸および大脳の上皮細胞増 殖に変化をもたらすことを示してきた。Panos等,J.Clin.Invest.92: 969-977(19 93);Ulich等，Am．J．Path．144: 862-868(1994); Yi等，Am．J．Path．145: 80 -85(1994); およびUlich等，J．Clin．Invest．93:1298-1306(1994)。胎芽また は新生児期の発育におけるＫＧＦの役割は、詳細には研究されていないが、しか しながら、ＫＧＦは、新生マウスにおける精嚢発育の重要なメディエイターであ ることが記録されている。Alarid等，P.N.A.S．91: 1074-1078(1994)。 公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ ９０／０８７７１は、ヒト胎芽線維芽細胞系 の調整培地から得たＫＧＦの精製、精製したＫＧＦの部分的アミノ酸配列、遺伝 子のクローニング、および生物学的に活性な組換えＫＧＦを得るための細菌細胞 における遺伝子の発現について述べている。前述の公開公報は、ＫＧＦまたはＫ ＧＦ−様ポリペプチドが、熱傷創用または移植した角膜組織を刺激するための創 傷治癒剤として用いることができる ことを開示している。事実、ＫＧＦは、再上皮形成を増加させることが示されて おり、ラビットの耳またはブタの皮膚に外科的に生じた損傷に組換えＫＧＦを局 所的に供した場合、上皮の厚さを増加させた。Pierce等,J.Exp.Med.179:831-840 (1994);およびStaiano-Coico等，J．Exp．Med．178: 865-878(1993)。 発明の概要 ＫＧＦが、糖尿病として知られる医学的疾患を治療するのに有用であるという 発見を為した。 図１は、体重キログラム当たり５ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の投与量で７日に わたる毎日の皮下的投与後のラットにおけるＫＧＦの作用を示す棒グラフである 。ＫＧＦ治療開始２日後にストレプトゾトシン（５５ｍｇ／ｋｇ）を１回静脈に より投与した。糖尿病ラットのＫＧＦ−治療群を、説明文“Ｓｔｒｅｐ ＋ＫＧ Ｆ”の上の図の右半分に示す。対照群を、その右および左に示す：糖尿病非誘導 で塩化ナトリウム溶液で７日にわたる処置（“ＮａＣｌ”）、ストレプトゾトシ ン誘導糖尿病前後の塩化ナトリウム溶液での７日にわたる処置（“Ｓｔｒｅｐ” ）、および糖尿病非誘導でＫＧＦで７日にわたる処置(“ＫＧＦ”)。糖尿病誘導 の５日後（即ち、ＫＧＦまたは塩化ナトリウム処置 を開始した７日後）に測定した非空腹時血糖値を、デシリットル当たりのミリグ ラム（ｍｇ／ｄｌ）で縦軸に示す。１群当たり４匹のラットがいた。 図２は、糖尿病に関する他の生理学的測定に基づく同じラットモデルにおける ＫＧＦの作用を示す棒グラフである。ＫＧＦまたは塩化ナトリウム処置の７日目 の２４時間中に排泄した空腹時尿糖値をｍｇ／ｄｌでおよび空腹時排尿量をミリ リットル（ｍｌ）で縦軸に、それぞれ左半分および右半分に示す。説明文（“Ｎ ａＣｌ”、“Ｓｔｒｅｐ”、“Ｓｔｒｅｐ ＋ ＫＧＦ”、および“ＫＧＦ”）は 、図１と同じ意味を有する。１群当たり４匹のラットがいた。 図３は、糖尿病誘導後８日間にわたる糖尿病の同じラットモデルにおける毎日 の非空腹時血糖値をｍｇ／ｄｌで示す。何匹かの動物は、病気誘導後１日目から 開始する毎日の皮下的投与量（３ｍｇ／ｋｇ）のＫＧＦで処置し（“Ｓｔｒｅｐ ＋ ＫＧＦ”）、一方、その他は、対照として塩化ナトリウム溶液で前および後 処置した（“Ｓｔｒｅｐ ＋ ＮａＣｌ”）。塩化ナトリウムで処置した非糖尿病 群の動物（“ＮａＣｌ”）を更なる対照として再度使った。１群当たり６匹のラ ットがいた。 図４は、糖尿病誘導後６日間にわたる同じラットモデルの空腹時尿糖値をｍｇ ／ｄｌで示しており、この場合、病気誘導後２日目に開始した。ＫＧＦ処置は、 糖尿病誘導１日後に開始した。グラフの記号は、図３と同じ３種の調査群を示す 。１群当たり６匹のラットがいた。 図５は、糖尿病誘導後２、５、２０および８日目に測定した、図３および４と 同じ調査群の排尿量を２４時間当たりのミリリットルとして示す。グラフの記号 は、図３および４と同じである。１群当たり６匹のラットがいた。 図６は、実験における各群のラットの平均水摂取量を示す。ラットは、自由に 水を与えられており、摂取量を、２４時間中に摂取した容量としてミリリットル で測定した。１群当たり６匹のラットがいた。 図７は、Sprague-Dawleyラットにおけるストレプトゾトシン糖尿病に対するＫ ＧＦ類似体の作用を示す。 図８は、本来のＫＧＦのヌクレオチド（配列番号：１）およびアミノ酸（配列 番号：２）配列を示す（本来のＫＧＦの成熟型をコードするヌクレオチドを、配 列番号：１の２０１番目から６８４番目の塩基により示し、ＫＧＦの成熟型を、 配列番号： ２の３２番目から１９４番目のアミノ酸残基により示す）。 発明の詳細な説明 本発明の方法は、天然に存在するポリペプチドのいくつか又は全ての生物学的 特性を有する角化細胞成長因子のいずれかの型を用いて実施することができる。 このような型としては、生物学的体液、細胞および組織から分離し精製したもの 、または化学合成により、またはコードするＤＮＡもしくはＲＮＡで形質転換し た異種宿主細胞での発現を介した組換え手段により誘導されるものが挙げられる 。角化細胞成長因子の産生のための組換え方法は、既に述べたＷＯ ９０／０８ ７７１に述べられている。当業者等に公知の他の手法を、同じ目的に用いること ができる。 具体的な説明として、ＫＧＦ蛋白質をコードするヌクレオチド配列又はその一 部を、適切な発現ベクター、即ち、挿入した蛋白質をコードする配列の転写およ び翻訳に必要な要素を含有するベクター内に挿入することができる。必要な転写 および翻訳シグナルは、本来のＫＧＦ遺伝子および／またはその両側の領域によ っても供給することができる。種々の宿主−ベクター系を用いて蛋白質をコード する配列を発現することができる。 これらとしては、ウィルス（例えば、ワクシニアウィルス(vaccinia virus)、ア デノウイルス(adenovirus)等）に感染した哺乳類細胞系；ウィルス（例えば、バ キュロウィルス（baculovirus））に感染した昆虫細胞系、酵母ベクターを含有 する酵母またはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミ ドＤＮＡで形質転換した細菌のような微生物が挙げられるが、これらに限定され るわけではない。これらのベクターの発現要素は、その強さおよび特異性におい てさまざまである。用いる宿主−ベクター系に依存して、多数の適切な転写およ び翻訳要素のいずれか１つを用いることができる。 ヌクレオチド断片のベクター内への挿入のために前述した方法のいずれかを用 いて適切な転写／翻訳調節シグナルおよび蛋白質をコードする配列から成るキメ ラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、イ ンビトロ組換えＤＮＡおよび合成技法ならびにインビボ組換え（遺伝組換え）を 含んでもよい。ＫＧＦ蛋白質またはペプチドが、組換えＤＮＡ分子で形質転換し た宿主内で発現するように、ＫＧＦ蛋白質またはペプチド断片をコードする核酸 配列の発現を、二番目の核酸配列により制御することができる。例えば、ＫＧＦ の発現を、業界で公知のいずれかのプロモーター／エンハンサー要素により調節 することができる。ＫＧＦ発現を制御するために用いることのできるプロモータ ーとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ラウス肉腫ウィルスの３′長末端 反復配列にあるプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロ チオネイン遺伝子の調節配列、β−ラクタマーゼプロモーター、もしくはｔａｃ プロモーターのような原核生物の発現ベクター、ノパリンシンテターゼプロモー ター領域Herrera-Estrella等もしくはカリフラワーモザイクウィルス３５ＳＲＮ Ａプロモーター、および光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキラーゼの プロモーターから成る植物発現ベクター、Ｇａｌ ４プロモーターのような酵母 もしくは他のカビ由来のプロモーター要素、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナー ゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アル カリホスファターゼプロモーターならびに組織特異性を示しトランスジェニック 動物に用いられてきた以下の動物転写調節領域：膵臓の腺房細胞で活性であるエ ラスターゼＩ遺伝子調節領域、膵臓ベータ細胞で活性であるインスリン遺伝子調 節領域、リンパ系細胞で活性であるイムノグロブリン遺伝子 調節領域Grosschedl等、精巣、胸部、リンパ系および肥満細胞で活性であるマウ ス乳腺腫瘍ウィルス調節領域Leder等、肝臓で活性であるアルブミン遺伝子調節 領域、肝臓で活性であるアルファフェトプロテイン遺伝子調節領域、肝臓で活性 であるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子調節領域、骨髄細胞で活性であるベ ーターグロブリン遺伝子調節領域、脳の希突起膠細胞で活性であるミエリン塩基 性蛋白質遺伝子調節領域、骨格筋で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域 、および視床下部で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域が 挙げられるがこれらに限定されるわけではない。 ＫＧＦ遺伝子インサートを有する発現ベクターは、当業者等に明白であり馴染 みがあるように、゛マーカー゛遺伝子機能の存在下または非存在下でのＤＮＡ− ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび挿入した配列の発現により確認することが できる。 業界で公知のいくつかの方法を用いてＫＧＦ遺伝子を増やすことができる。適 切な宿主系および生育条件が一旦確立されたなら、組換え発現ベクターを増やし 多量に調製することができる。 更に、挿入した配列の発現を調整するか又は所望の特別な様 式に遺伝子産生物を改変およびプロセッシングする宿主細胞菌株を選ぶことがで きる。特定のプロモーター由来の発現は、特定のインデューサーの存在下で高め ることができる。従って、遺伝的に設計したＫＧＦ蛋白質の発現を制御すること ができる。更に、異なる宿主細胞は、蛋白質の翻訳および翻訳後のプロセッシン グおよび改変（例えば、グリコシル化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル 化、蛋白分解的切断）のための特徴的特異的メカニズムを有する。適切な細胞系 または宿主系を選択して、発現した異種蛋白質の所望の改変およびプロセッシン グを保証することができる。 この説明で用いた用語“角化細胞成長因子”および“ＫＧＦ”には、特に断ら ない限り、本来のＫＧＦならびに本来のＫＧＦのペプチド配列と実質的に同じペ プチド配列および本来のＫＧＦの生物学的活性のいくつか又は全て、特に非線維 芽上皮細胞増殖（例えば、Ｈ−チミジン取り込みにより測定したように、ＮＩＨ ／３Ｔ３線維芽細胞のそれに比較し少なくとも約５００倍強いＢＡＬＢ／ＭＫ角 化細胞の刺激およびＢＳ／５８９上皮細胞もしくはＣＣ１２０８上皮細胞に比較 し少なくとも約５０倍強いＢＡＬＢ／ＭＫ角化細胞の刺激を示す）を保 持することにより特徴づけられるＫＧＦ類似蛋白質(または“ムテイン”)が含ま れ、同じ意味を有することは当然のことである。“本来のＫＧＦのペプチド配列 と実質的に同じペプチド配列により特徴づけられる”とは、好ましくは厳重な(s tringent)ハイブリダイゼーション条件下、配列番号：１の２０１番目から６８ ４番目のヌクレオチドをハイブリダイズすることのできるＤＮＡ配列によりコー ドされるペプチド配列を意味する。 ２つのアミノ酸配列間の対応するアミノ酸の位置の決定は、アミノおよび／ま たはカルボキシル末端を移動させることを含め残基のマッチを最大限にするよう に２つの配列を配置し、必要であればギャップを導入しおよび／または候補内に インサートとして存在する残基を欠失することにより決定することができる。デ ータベース調査、配列分析および操作は、周知かつ日常的に用いられる配列相同 性／同一性スキャニング演算方式プログラム(例えば、PearsonおよびLipman(198 8),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,2444-2448;Altschul等(1990),J.Mol.Biol.， 215: 403-410; LipmanおよびPearson(1985)，Science，222: 1435またはDevereu x等(1984)，Nuc．Acids Res.，12:387-395)の１つを用いて行うことができる。 ハイブリダイゼーションにおける厳重な条件は、塩、温度、有機溶媒および、 ハイブリダイゼーション反応で典型的に制御される他のパラメーターの厳重な条 件の組み合わせである。例示的な厳重なハイブリダイゼーション条件は、６２− ６７℃で４ ｘ ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、続いて約１時間６２−６ ７℃で０．１ ｘ ＳＳＣ中での洗浄である。あるいは、例示的な厳重なハイブリ ダイゼーション条件は、４０−４５℃で４５−５５％ホルムアミド、４ ｘ ＳＳ Ｃ中でのハイブリダイゼーションである。[T．Maniatis等，Molecular Cloning( A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory(1982),387から389ペー ジ参照]。 従って、これらの蛋白質は、本来のＫＧＦの断片、キメラもしくはハイブリッ ド分子を含む、対立遺伝子的変形またはアミノ酸の欠失、置換もしくは挿入を含 む。ＫＧＦの１例としては、置換または欠失した、配列番号：２のＣｙｓ¹およ びＣｙｓ¹⁵に相当する残基を有し、その結果できた分子が親分子と比較して改良 された安定性を有する（１９９５年７月７日に出願された同一人に所有されるＵ ．Ｓ．Ｓ．Ｎ. ０８／４８７，８２５に教示されるように）蛋白質が挙げられ る。ＫＧＦの別の例と しては、本来のＫＧＦの４１−１５４番目のアミノ酸残基（好ましくはＡｒｇ⁴¹ 、Ｇｌｎ⁴³、Ｌｙｓ⁵⁵、Ｌｙｓ⁹⁵、Ｌｙｓ¹²⁸、Ａｓｎ¹³⁷、Ｇｌｎ¹³⁸、Ｌｙｓ^{1 39} 、Ａｒｇ¹⁴⁴、Ｌｙｓ¹⁴⁷、Ｇｌｎ¹⁵²、Ｌｙｓ¹⁵³またはＴｈｒ¹⁵⁴残基）の１ つ以上が、欠失した、又は中性残基もしくは減少した正の電荷を有する蛋白質を 達成するように選ばれた負に電荷した残基で置換した電荷変化ポリペプチド（１ ９９４年１０月１３日に出願された同一人に所有されるＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ. ０８ ／３２３，３３７に教示されるように）が挙げられる。ＫＧＦの更なる例として は、本来のＫＧＦのＡｓｎ¹¹⁵−Ｈｉｓ¹¹⁶−Ｔｙｒ¹¹⁷−Ａｓｎ¹¹⁸−Ｔｈｒ¹¹⁹ のループ形成領域内の少なくとも１個のアミノ酸にとってより高いループ形成可 能性を有する少なくとも１個のアミノ酸を置換することにより生じた蛋白質（１ ９９４年１０月１３日に出願された同一人に所有されるＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ. ０８ ／３２３，４７３に教示されるように）が挙げられる。なお更なる例としては、 本来のＫＧＦの１２３−１３３（配列番号：２の１５４−１６５番目のアミノ酸 ）の領域内に１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有する蛋白質が挙げ られ、これらの蛋白質は、作 動または拮抗活性を有すことができる。 特に開示された蛋白質としては、以下のＫＧＦ分子が挙げられる（配列番号： ２に示した成熟蛋白質（マイナスシグナル配列）内のその位置で見い出された残 基、続いてかっこ内にそのアミノ酸の位置、次いで置換残基または欠失を表す“ −”のいずれかにより示す）：Ｃ（１，１５）Ｓ、△Ｎ１５−△Ｎ２４、△Ｎ３ ／Ｃ（１５）Ｓ、△Ｎ３／Ｃ（１５）−、△Ｎ８／Ｃ（１５）Ｓ、△Ｎ８／Ｃ（ １５）−、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４ ）Ｑ、△Ｎ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５，４０）Ｓ、Ｃ（１，１５，１ ０２）Ｓ、Ｃ（１，１５，１０２，１０６）Ｓ、△Ｎ２３／Ｎ（１３７）Ｅ、△ Ｎ２３／Ｋ（１３９）Ｅ、△Ｎ２３／Ｋ（１３９）Ｑ、△Ｎ２３／Ｒ（１４４） Ａ、△Ｎ２３／Ｒ（１４４）Ｅ、△Ｎ２３／Ｒ（１４４）Ｌ、△Ｎ２３／Ｋ（１ ４７）Ｅ、△Ｎ２３／Ｋ（１４７）Ｑ、△Ｎ２３／Ｋ（１５３）Ｅ、△Ｎ２３／ Ｋ（１５３）Ｑ、△Ｎ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ；Ｒ（１４４）Ｑ およびＨ（１６６）Ｇ。 治療的処置における実際の適用には、ＫＧＦは、これらに限 定されるわけではないが、皮下、静脈または筋肉内注射のような非経口供給を含 むいずれかの従来の方法により投与に好適な医薬組成物に処方することができる 。これらの標準処方物は、液体処方物用には適切な緩衝塩類、保存料および安定 化剤、又は凍結乾燥処方物用には適切な緩衝塩類、安定化剤、保存料および代表 的なバルキング剤を最も含み得る。また、ＫＧＦを、皮内、皮下または腹腔内デ ポーによる徐放形態で投与することも可能である。これらの徐放形態のＫＧＦは 、当業者等内部の標準法を用いて処方することができる。最も実際的なＫＧＦ投 与計画は、皮下注射もしくは皮内供給を用い家庭で患者により、または皮下的に もしくは腹膜腔内に移植した長期徐放処方物を用い医師により利用することがで きる。 ＫＧＦ投与計画は、熟練した医師により経験的に決定することができる。通常 、ＫＧＦは、１日当たり（患者の）体重１キログラム当たり約０．００１から約 １０ミリグラム、好ましくは約０．０５から約５ｍｇ／ｋｇ／日の量で効果的で あると考えられる。治療計画には、各患者における疾患の型および重症度に依存 して、１回もしくは反復注射、または継続的に徐放する低投与量のＫＧＦを含め ることができる。ＫＧＦを用いた処 置の治療コースは、代謝要求を変化させる間の血糖値を正常化し更に頻繁な又は ひどい低血糖症を避けるために十分な膵臓ベータ細胞機能を与える必要がある。 狙いは、定常的外因性インスリン要求の必要性を避けるべくＩ型糖尿病と診断さ れた患者のランゲルハンス島細胞機能を補充することである。いくらかランゲル ハンス島細胞機能が残っていて新たにＩ型糖尿病と診断された患者は、ＫＧＦ治 療の候補である。ＫＧＦは、疾患の永続的顕在化を改善、遅延または回避するよ うにこのような患者のランゲルハンス島機能を維持するのに用いることができる 。Ｉ型糖尿病は、自己免疫疾患であると考えられており、その治療には免疫抑制 剤療法を用いる。本発明によるＫＧＦ治療は、ランゲルハンス島細胞移植を行う 際のアジャンクツとしてを含み、この疾患の治療用免疫抑制剤と連結して又は組 み合わせて用いることができる。以下の応用に関して本発明を更に具体的に説明 する。材 料 以下のインビボ研究に用いた試験材料は、特に示した本来のＫＧＦ（天然に存 在する）配列、部位特異的突然変異の標準技法を用い本来のアミノ酸配列の１番 目および１５番目の位置の システイン残基をセリンで置換したＫＧＦ類似体（即ち、Ｃ（１，５）Ｓ）およ び標準技法を用い本来のＫＧＦのＮ−末端の初めの２３個のアミノ酸を欠失させ たＫＧＦ類似体(即ち、△Ｎ２３)である。全ての蛋白質を、大腸菌中で組換え発 現により産生し、均一になるまで精製したが、これらは、それぞれ、Ｎ−末端に メチオニン残基（Ｍｅｔ^-1）を有した。各蛋白質を皮下処方物として投与した。 以前の実験は、これらの蛋白質が、全身的に適用した場合、成熟ラットにおいて 同じような活性を有することを示した。本来のＫＧＦ配列および類似体は、それ ぞれ、以下の研究に用いた糖尿病および非糖尿病ラットにおいて同じような活性 を有した。糖尿病のインビボモデル 種々の動物種に化学的に誘導した糖尿病を、古典的に用いて疾患及びその治療 法を研究してきた。ラットおよびマウスにおける研究が最も用いられるが、スト レプトゾトシンは、マウス、ラット、ハムスター、イヌおよびサルに糖尿病を誘 導する。Junod等，Proc．Soc．Exp．Pio．Med．126: 210-205(1967); Rerup,Pha rm．Rev．22: 485-518(1970); Rossini等，P.N.A.S．74:2485-2489(1977); なら びにAr′RajabおよびAhren，Pancreas 8: 50-57(1993)。ラットにおいて、１回の静脈投与量としての４５から７０ｍｇ ／ｋｇのストレプトゾトシンの投与量は、安定な疾患を誘導する。４５ｍｇ／ｋ ｇ未満の投与量は、可逆的である一時的な疾病状態を誘導する。ストレプトゾト シン注射の１日以内に高血糖状態を誘導する。血中インスリン値は、正常なラッ トと比較して実質的に変化しないままであるが、しかしながら、膵臓のインスリ ンおよびＣ−ペプチドの全含量は、激しく減少する。ラットは、ヒトにおける糖 尿病の古典的兆候および症状：増加した血糖値（高血糖症）、尿中のブドウ糖（ 尿糖症）、増加した渇き（多飲症）、増加した排尿（多尿症）、増加した食欲（ 過食症）を顕わす。 この明細書で述べた研究は、Sprague-Dawleyラットにおけるストレプトゾトシ ン糖尿病モデルを用いて行った。研究開始時に２００から２６０グラムの重さが あった雄性ラットを用いた。体重１ｋｇにつきクエン酸ナトリウム緩衝液中のス トレプトゾトシン５０ｍｇで１回のストレプトゾトシンの静脈注射により糖尿病 を誘導した。非糖尿病の対照のラットは、対照目的のためにクエン酸ナトリウム 緩衝液の１回の静脈注射を受けた。ＫＧＦを、皮下注射として毎日投与した。Ｋ ＧＦ投与量は、実 験に依存して３または５ｍｇ／ｋｇ／日であった。糖尿病の２日前にＫＧＦ治療 を開始した始めの実験において、糖尿病の誘導後も合計８回の注射で誘導し続け た。２回目および３回目の実験では、皮下的に適用したＫＧＦ治療を、ストレプ トゾトシンを用いた糖尿病の誘導の１日後に開始した。４回目の実験では、ＫＧ Ｆ治療の７日のコースを、ストレプトゾトシン処置の７日後に開始し、次いで、 動物を更に１２週間追った。４回目の実験を除く全ての実験で、血糖値、尿糖値 および尿量を、分析の終点として用いた。更に、水摂取量、尿Ｃ−ペプチド水準 、または全膵臓インスリンおよびＣ−ペプチド含量を、いくつかの実験で測定し た。４回目の実験で、唯一評価した終点は、血糖であった。 肝臓による循環から大部分のインスリンが除去されることから、末梢インスリ ン濃度の測定は、膵臓からのインスリン分泌よりもむしろ肝臓代謝後の事象を反 映している。従って、Ｃ−ペプチドの測定を頻繁に行い、インスリン分泌の末梢 マーカーとして用いた。Ｃ−ペプチドは、プロインスリンからインスリンへのプ ロセッシングから生じる。インスリンおよびＣ−ペプチドは、ベータ細胞から同 モル量で分泌され、ほんのわずかな 量のＣ−ペプチドが肝臓により抽出される。ＫＧＦのインビボ適用 初めの研究：説明した糖尿病モデルを用い、糖尿病治療に対するＫＧＦの有効 性を、まず、以下の４つの群の試験ラットを用いて評価した： １． ストレプトゾトシンを含まない皮下的に投与する塩化ナトリウム溶液で 前および後処置した対照（非糖尿病）ラット； ２． 静脈により投与する５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンで糖尿病にし 、皮下的に投与する塩化ナトリウム溶液で前および後処置したラット； ３． 静脈投与する５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンで糖尿病にし、皮下 的に投与する本来(native)のＫＧＦで前および後処置したラット；および ４． ストレプトゾトシンを含まない皮下的に投与する本来のＫＧＦで処置し た対照のラット。 ４つの群全ての処置したラットに、１日当たり５ｍｇ／ｋｇの投与量の本来の ＫＧＦまたは同容量の塩化ナトリウム溶液のいすれかを７日間にわたって投与し た。ＫＧＦまたは塩化ナトリウム投与開始の２日後、２および３群のラットに静 脈的に投 与する１回量の５５ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを与えた。この投与量は、 ラットに中程度の糖尿病を引き起こすことが公知である。全てのラットは、非空 腹時血糖値、体重、空腹時尿糖値および排尿量を監視された。２および３群への ストレプトゾトシン投与の７日後（即ち、研究開始の９日後）、全群のラットを 一晩断食させ、屠殺し、次いで、検死した。それぞれのケースで、膵臓を、亜鉛 ホルマリンで保存し、包埋し、次いで、決まった組織検査用に処理した。 ストレプトゾトシン投与の５日後の非空腹時血糖値は、図１に見られるように 、非糖尿病の対照ラット（１群）と比較して糖尿病対照ラット（２群）において 顕著に上昇した。ストレプトゾトシン投与前にＫＧＦで前処置しＫＧＦで後処理 した糖尿病ラット（３群）は、ＫＧＦで処置しなかった糖尿病の対照(２群)より 著しく低い非空腹時血糖値であったが、それでも非糖尿病の対照（１群）と比較 して上昇した；図１参照。２群の糖尿病の対照ラットの空腹時尿糖値および尿容 量は、図２に見られるように、研究の７日目（即ち、ストレプトゾトシン注射の ５日後）に著しく上昇した。この症状は、インスリンを産生する膵島のベータ細 胞の破壊および、尿中のブドウ糖の排泄に帰 するブドウ糖代謝の深刻な調節異常による。これと対照的に、ＫＧＦで前および 後処置した糖尿病ラット（３群）は、糖尿病の対照（２群）に比較し空腹時尿糖 の著しく少ない上昇を示した。また、ＫＧＦ処置群の尿排泄量も、糖尿病対照群 に比し顕著に少ない；図２参照。 これらの結果は、誘導薬としてストレプトゾトシンを用いたラットにおける中 程度の糖尿病の誘導と一致する。糖尿病誘導以前にＫＧＦで処置し、誘導後もや はりＫＧＦを継続したこれらの糖尿病ラットは、より穏やかな糖尿病を暗示する 症状を示した。従って、ＫＧＦ治療は、部分的にこの疾患の誘導を妨げるか又は ストレプトゾトシンが誘導したベータ細胞破壊後のインスリンを産生する島細胞 を回復させるかのいずれかであると結論づけることができる。これらの可能性を 区別するために、疾患誘導後に開始するＫＧＦ治療を、次に研究した。 二番目の研究：前述の同じ糖尿病モデルを用い、糖尿病治療に対するＫＧＦの 有効性を、更に、以下の３つの群の試験ラットを用いて評価した： １． ストレプトゾトシンを含まない皮下的に投与する塩化ナトリウム溶液で 処置した対照ラット； ２． 静脈により投与するストレプトゾトシンで糖尿病にし、皮下的に投与す る塩化ナトリウム溶液で後処置したラット；および ３． 静脈投与するストレプトゾトシンで糖尿病にし、次いで、皮下的に投与 するＣ（１，１５）Ｓで後処置したラット。 糖尿病誘導の１日後に開始して１３日にわたり、１日当たり３ｍｇ／ｋｇの投 与量で、又は塩化ナトリウム溶液を試験用ラットに投与した。それぞれ空腹時お よび非空腹時条件下の血糖値、尿糖値、排尿量および摂取した水を、試験期間を 通じて監視した。ストレプトゾトシン投与の１日以内に２および３群のラットが 糖尿病になった（図３）。ストレプトゾトシンの２４時間後に３群におけるＫＧ Ｆ治療を開始し、以後毎日継続した。非空腹時血糖を、１、２、４、５および８ 日目に測定した。図３が示すように、３群におけるＫＧＦ治療は、循環血糖値を ４日目までに対照ラット（１群）のそれ近くに減少させることができ、これは８ 日目まで続いた。また、ブドウ糖の非空腹時尿排泄を、２、５および８日目に測 定した。図４は、ＫＧＦ治療が、尿糖値を1/8以下に減少させたことを示す。同 様に、ＫＧＦで治療した糖尿病ラットにおける排尿量も、５日目およ び８日目に測定した場合、正常化した（図５）。２４時間当たりのミリリットル で示す水摂取量は、対照として塩化ナトリウム溶液を受けた糖尿病ラットで増加 したほどには、ＫＧＦ処置した糖尿病ラットでは増加しなかった（図６）。ラッ トを８日目に一晩断食させた、９日目の空腹時血糖値は、これら３つの群で相違 がなかった。空腹時水摂取量および排尿量は、９日目の糖尿病ラットと比較した 場合、ＫＧＦ処置糖尿病ラットでは著しく少なく、これは更に疾病症状の改善を 暗示した。 三番目の研究：三番目の研究は、二番目の研究の反復であり、図３−６に示し たデータを確認した。更に、この実験では、ラットを検死した際、膵臓全体を各 ラットから取り出し、インスリンおよびＣ−ペプチドを抽出し、定量した。下記 の表１は、３つの各群において膵臓から抽出できるインスリンおよびＣ−ペプチ ドの平均の量を示す。ＫＧＦ治療は、塩化ナトリウム溶液で処置した糖尿病ラッ トと比較した場合、糖尿病ラットの膵臓のインスリンおよびＣ−ペプチドの合計 含量を増加させることができる。 四番目の研究は、Sprague-Dawleyラットにおけるストレプトゾトシン誘導糖尿 病に対するＫＧＦの効果を調査した。０日に、ラット群を、４５または５０ｍｇ ／ｋｇストレプトゾトシン（ＳＴＺ）のいずれかに露出した。これらの処置後、 非空腹時血糖値を、毎日監視して島損傷の重症度を評価した。５日目、ＳＴＺ処 置動物を、高血糖症の重症度に依存して２つの群（２０／群）の１つに入れた。 分岐点は、３００ｍｇ／ｄｌの血糖値にした。非ＳＴＺ処置動物群を、対照とし て用いた。７日目、各高血糖群の１０匹の動物に、△Ｎ２３（３ｍｇ／ｋｇ／日 ）またはＰＢＳを皮下注射により７日間与えた。次いで、 血糖値を毎日、１日おき、または毎週監視し、図７に示した。ＫＧＦを受けた両 方の群のＳＴＺ処置動物は、ＫＧＦ投与期間中血糖の顕著な減少があったことに 注目する。重要なことには、開始血糖＜３００ｍｇ／ｄｌ群のＳＴＺ処置動物に より経験された平均血糖の低下は、約１５０ｍｇ／ｄｌで安定化し、一方、開始 血糖＞３００ｍｇ／ｄｌ群で見られた血糖低下は、ほんの一時的なものであった 。日数の目盛は、非直線的であることを記す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／４８７，８２５ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ピアス，グレン・フランシス アメリカ合衆国、カリフオルニア・92067、 ランチヨ・サンタ・フエ、ミル・アルボル ス・14413

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 糖尿病治療法であって、その症状がある哺乳類に治療に効果的な量の角化 細胞成長因子またはその類似体を投与して成ることを特徴とする前記方法。 ２． 哺乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。 ３． 角化細胞成長因子がＣ（１，１５）Ｓおよび△Ｎ２３から選ばれる、請求 項１に記載の方法。 ４． 角化細胞成長因子または類似体を、薬学的に許容される担体を含有する医 薬組成物の形態で投与する、請求項１に記載の方法。 ５． 医薬組成物を非経口注入により投与する、請求項４に記載の方法。 ６． 角化細胞成長因子または類似体を、１日当たり体重キログラム当たり約０ ．００１から約１０ミリグラムの量で投与する、請求項１に記載の方法。 ７． 量が、１日当たり１キログラム当たり約０．０５から約５ミリグラムであ る、請求項６に記載の方法。