ES2273340T3 - Suministro de moleculas de acido nucleico al tejido de las mucosas. - Google Patents

Suministro de moleculas de acido nucleico al tejido de las mucosas. Download PDF

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Abstract

SE PROPONEN METODOS PARA INTRODUCIR MATERIAL GENETICO EN LAS CELULAS DE UNA PERSONA. SE PROPONEN TAMBIEN METODOS PARA INDUCIR LA INMUNIDAD DE LAS MUCOSAS CONTRA PROTEINAS Y PEPTIDOS. ESTOS METODOS INCLUYEN UNA ETAPA DE ADMINISTRACION TOPICA O MEDIANTE LAVADO DEL TEJIDO DE MUCOSA, YA SEA ESTE RECTAL, VAGINAL, URETRAL, SUBLINGUAL O BUCAL, DE UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO CON UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA LA PROTEINA O PEPTIDO DEL EPITOPE CONTRA EL QUE SE DESEA CONSEGUIR LA INMUNIDAD DE LA MUCOSA. ESTOS METODOS PUEDEN UTILIZARSE PARA INMUNIZAR A UNA PERSONA CONTRA ENFERMEDADES INFECCIOSAS, HIPERPROLIFERATIVAS O AUTOINMUNITARIAS UTILIZANDO MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN PROTEINAS Y PEPTIDOS QUE COMPARTEN UN EPITOPE CON EL ANTIGENO DE UN AGENTE PATOGENO O UNA PROTEINA ASOCIADOS A LAS CELULAS IMPLICADAS EN LAS ENFERMEDADES HIPERPROLIFERATIVAS Y AUTOINMUNITARIAS, RESPECTIVAMENTE. SE PROPONEN METODOS DE TRATAMIENTO QUE INCLUYEN UNA ETAPA DE ADMINISTRACION TOPICA O MEDIANTE LAVADO DEL TEJIDO DE LA MUCOSA, YA SEA ESTE RECTAL, VAGINAL, URETRAL, SUBLINGUAL O BUCAL, DE UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO CON LA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICA UNA PROTEINA TERAPEUTICA.

Description

Suministro de moléculas de ácido nucleico al tejido de las mucosas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones para introducir material genético en las células de un individuo. Las composiciones de la invención pueden utilizarse para suministrar material genético que codifica proteínas diana para inmunización. Las composiciones de la presente invención inducen inmunidad de las mucosas.
Antecedentes de la invención
La introducción directa de un gen normal, funcional, en un animal vivo se ha estudiado como un medio para reemplazar la información genética defectuosa. En algunos estudios, el ADN se introduce directamente en las células de un animal viviente sin utilizar una partícula vírica u otro vector infeccioso. Nabel E.G. et al., (1990), Science 249:1285-1288, da a conocer una expresión génica sitio-específica in vivo de un gen de la beta-galactosidasa que se transfirió directamente a la pared arterial en ratones. Wolfe, J.A. et al., (1990), Science 247: 1465-1468, da a conocer la expresión de varios genes informadores que se transfirieron directamente al músculo del ratón in vivo. Acsadi G., et al., (1991), Nature 352:815-818, da a conocer la expresión del gen humano de la distrofina en ratones, después de la inyección intramuscular de constructos de ADN. Wolfe, J.A., et al., 1991 BioTechniques 11 (4): 474-485, se refiere a condiciones que afectan a la transferencia génica directa en el músculo de roedor in vivo. Felgner, P.L. y G. Rhodes, (1991) Nature 349: 351-352, da a conocer el suministro directo in vivo, como medicamentos, de genes purificados, sin utilizar retrovirus.
Se ha sugerido la utilización de la transferencia directa del gen como un procedimiento de vacunación antipatógena alternativa. La utilización de la transferencia génica directa mediante inyección única se sugiere como una posible estrategia de vacunación contra el HIV. Se informa de que se ha observado en las células una respuesta inmune celular a la gp120 del VIH resultante de la introducción del ADN plasmídico que codifica a la misma.
La patente WO 90/011092 da a conocer procedimientos para inmunizar a un individuo contra la infección por patógenos inyectando directamente polinucleótidos desnudos en las células del individuo en un procedimiento de una sola Etapa . La utilización de agentes transfectantes distintos a las lipofectinas, se excluye específicamente de los procedimientos que se dan a conocer. La estimulación de las células inoculadas no se expone ni se sugiere. Se da a conocer una vacuna para el VIH que consiste en la introducción de polinucleótidos que codifican la proteína vírica gp120. No se ha evidenciado la funcionalidad de esta vacuna.
Fynan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1993), vol. 90, pág. 11478-11482, da a conocer la administración de un ADN plasmídico purificado sólo a través de las fosas nasales y la tráquea.
El documento 94/17792 da a conocer procedimientos para suministrar agentes farmacéuticos basados en nucleótidos a través de las membranas, tales como la dermis o la capa de la piel de un paciente que utilizaba iontoforesis. Staats, H.F., et al (1994) Current Opinion in Immunology, 6 572-583, se refiere a vacunas y sistemas de suministro para establecer una inmunidad efectiva de las mucosas. El documento WO 95/30019 se refiere a vacunas que contienen tanto secuencias de ADN que codifican la envuelta vírica, como las proteínas gag del virus de la inmunodeficiencia felina, y procedimientos para utilizar vacunas basadas en estas secuencias codificadas del ADN.
Sumario de la invención
Según la presente invención, se proporciona una composición de crema, pomada, bálsamo, lavado, enema o supositorio para el suministro mediante administración tópica o por lavado, a tejido de las mucosas, formado por tejido rectal, vaginal, uretral, sublingual o bucal, comprendiendo la composición bupivacaína una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína patogénica o un péptido libre de partículas víricas, en la que la secuencia del ácido nucleico se une a una secuencia reguladora que controla la expresión, y en la que la molécula de ácido nucleico induce inmunidad de las mucosas contra dicho patógeno.
Preferentemente, dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína que comprende por lo menos un epítopo que es idéntico a un epítopo de un antígeno contra el cual se desea una respuesta inmune, estando unida funcionalmente dicha secuencia nucleótida a una secuencia reguladora.
Preferentemente, dicha composición está en forma de crema.
Alternativamente, dicha composición está en forma de una pomada.
Alternativamente, dicha composición está en forma de un bálsamo.
Alternativamente, dicha composición está en forma de irrigación vaginal.
Alternativamente, dicha composición está en forma de una lavativa.
Alternativamente, dicha composición está en forma de un supositorio.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un patógeno.
Preferentemente, dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína que comprende por lo menos un epítopo que es idéntico al epítopo de un antígeno contra el que se desea una respuesta inmune.
Las composiciones de la presente invención pueden utilizarse para suministrar material genético a un individuo, inducir la inmunidad de las mucosas contra proteínas y péptidos en un individuo, inmunizar a un individuo contra los patógenos, inmunizar a un individuo contra una enfermedad hiperproliferativa o una autoinmune, y tratar a un individuo que padezca dicha enfermedad.
La presente invención se describirá a continuación haciendo referencia a las figuras adjuntas.
Respecto a esto, el alcance de la protección es tal como se da a entender en las reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra cuatro esqueletos, A, B, C y D, que se utilizan para preparar el constructo genético.
La figura 2 muestra cuatro inserciones, 1, 2, 3 y 4, que se insertan en los esqueletos para producir constructos genéticos.
La figura 3A muestra la actividad de la \beta-galactosidasa para los tejidos relacionados con la mucosa del tracto GU (génito urinario) en ratones expuestos intravaginalmente al plásmido pCMV\beta, que tiene una secuencia codificante de la \beta-galactosidasa bajo el control regulador del promotor CMV.
La figura 3B muestra la actividad de la \beta-galactosidasa para los tejidos relacionados con la mucosa del tracto GI (gastrointestinal) en ratones expuestos intravaginalmente al plásmido pCMV\beta, que tiene una secuencia codificante de la \beta-galactosidasa bajo el control regulador del promotor CMV.
La figura 3C muestra la actividad de la \beta-galactosidasa para los tejidos no mucosos en ratones expuestos intravaginalmente al plásmido pCMV\beta, que tiene una secuencia codificante de la \beta-galactosidasa bajo el control regulador del promotor CMV.
La figura 4A muestra las respuestas IgG contra la proteína (gp120) externa de la envuelta del VIH-1 en ratones expuestos intravaginalmente al plásmido pcMN160 que posee la secuencia codificante para la proteína de la envuelta del VIH bajo el control regulador del promotor CMV.
La figura 4B muestra las respuestas IgG contra la proteína (gp41) transmembranosa de la envuelta del VIH-1 en ratones expuestos intravaginalmente al plásmido pcMN160 que posee la secuencia codificante para la proteína de la envuelta del VIH bajo el control regulador del promotor CMV.
La figura 4C muestra las respuestas IgA contra la proteína (gp120) externa de la envuelta del VIH-1 en ratones expuestos intravaginalmente al plásmido pcMN160 que posee la secuencia codificante para la proteína de la envuelta del VIH bajo el control regulador del promotor CMV.
La figura 4D muestra las respuestas IgA contra la proteína (gp41) transmembranosa de la envuelta del VIH-1 en ratones expuestos intravaginalmente al plásmido pcMN160 que posee la secuencia codificante para la proteína de la envuelta del VIH bajo el control regulador del promotor CMV.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a composiciones para introducir material genético en las células de un individuo, para inducir la inmunidad de las mucosas contra proteínas y péptidos que están codificados por el material genéti-
co.
Las composiciones son para administrar mediante administración tópica o mediante lavado, al tejido de las mucosas de dichas células individuales, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida que codifica un péptido deseado o una proteína. Las moléculas de ácido nucleico son absorbidas por las células en el tejido de las mucosas y se expresa una proteína codificada por una secuencia nucleótida de la molécula. Además, el material genético es transportado a otros tejidos y órganos donde también es absorbido por las células y se expresa. Si la proteína es inmunogénica para el individuo, la expresión de la proteína en las células del tejido de las mucosas da lugar a la inducción de una respuesta inmune de la mucosa. La expresión de la proteína en las células de otros tejidos da lugar asimismo a la inducción de una respuesta inmune.
Se describen asimismo procedimientos para suministrar moléculas de ácido nucleico a células de un individuo, sin utilizar los agentes infecciosos. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico están libres de las partículas víricas tales como las partículas retrovíricas.
La molécula de ácido nucleico puede suministrarse a las células conjuntamente con la administración de un potenciador de la función polinucleótida o de un agente facilitador de una vacuna genética. Los potenciadores de la función polinucleótida se describen en las patentes WO 94/016737 y US nº 5.593.972.
Los agentes facilitantes de las vacunas genéticas se describen en la patente US nº 5.739.118. Los coagentes que pueden administrarse conjuntamente con las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse como una mezcla con la molécula de ácido nucleico, o administrarse separadamente de modo simultáneo, antes o después de la administración de moléculas de ácido nucleico. Además, otros agentes que pueden funcionar como agentes transfectantes y/o agentes de replicación, y/o agentes inflamatorios y que pueden ser coadministrados con un GVF, incluyen factores de crecimiento, citoquinas y linfoquinas tales como \alpha-, gamma- interferón, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, Il-8, IL-10 e IL-12, así como el factor de crecimiento fibroblástico, agentes activos superficiales tales como los complejos inmuno-estimulantes (ISCOMS), el adyuvante incompleto de Freund, el análogo LPS incluyendo el Lípido A monofosforilo (MPL), péptidos muramilo, análogos quinona y vesículas tales como escualeno y escualano, pudiéndose también administrar el ácido hialurónico conjuntamente con el constructo genético.
Las moléculas de ácido nucleico que son suministradas a las células del tejido de las mucosas, y que en algunos casos son transportadas a y absorbidas por las células del tejido, pueden servir como: 1) matrices genéticas para proteínas que funcionan como agentes inmunizantes profilácticos y/o terapéuticos; 2) copias de reemplazamiento de genes defectuosos, que se han perdido o que no funcionan; 3) matrices genéticas para proteínas terapéuticas; 4) matrices genéticas para moléculas antisentido; o 5) matrices genéticas para ribozimas. En el caso de moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas, las moléculas de ácido nucleico pueden comprender las necesarias secuencias reguladoras para la transcripción y traducción en las células del animal. En el caso de moléculas de ácido nucleico que sirven como matrices para moléculas antisentido y ribozimas, dichas moléculas de ácido nucleico pueden unirse a elementos reguladores necesarios para la producción de copias suficientes de las moléculas antisentido y de ribozima codificadas, por tanto, respectivamente. Las moléculas de ácido nucleico están libres de partículas retrovirales y pueden proporcionarse como ADN en forma de plásmidos.
Según algunos ejemplos, se describen composiciones y procedimientos que inmunizan profiláctica y/o terapéuticamente a un individuo contra un patógeno o contra una células anormal, patógeno-relacionada. El material genético codifica un péptido o proteína que comparte por lo menos un epítopo con una proteína inmunogénica encontrada en el patógeno o en las células diana. El material genético se expresa por las células del individuo y sirve como una diana inmunogénica, contra la cual se provoca una respuesta inmune. La respuesta inmunitaria resultante está ampliamente basada: además de una respuesta inmune humoral, ambas vías de la respuesta inmune celular son activados, incluyendo la inmunidad de la mucosa. Los procedimientos son útiles para conferir una inmunidad profiláctica o terapéutica. De este modo, un procedimiento para inmunizar incluye tanto procedimientos para proteger a un individuo del ataque de los patógenos, como de que tenga lugar la proliferación de células específicas, así como también procedimientos para tratar a un individuo que padezca la infección por el patógeno, la enfermedad hiperproliferativa, o la enfermedad autoinmune.
La presente invención es útil para provocar amplias respuestas inmunes contra una proteína diana, es decir, proteínas específicamente asociadas con patógenos o con las propias células anormales'' individuales. La presente invención es útil para inmunizar a los individuos contra agentes patogénicos y organismos, de forma que una respuesta inmune contra una proteína patógena proporciona inmunidad protectora contra el patógeno. La presente invención es útil para combatir enfermedades hiperproliferativas y trastornos tales como cáncer, provocando una respuesta inmune contra una proteína diana que está asociada específicamente con las células hiperproliferativas. La presente invención es útil para combatir las enfermedades y trastornos autoinmunes, provocando una respuesta inmune contra una proteína diana que está asociada específicamente con células implicadas en la condición autoinmune.
Asimismo, se describen composiciones y procedimientos para introducir moléculas de ácido nucleico en las células de un individuo, copias exógenas de genes que corresponden a genes defectuosos, que se perdieron, o que no funcionan o lo hacen parcialmente en el individuo, o que codifican proteínas terapéuticas, es decir, proteínas cuya presencia en el individuo eliminará una deficiencia en éste y/o cuya presencia proporcionará un efecto terapéutico en el individuo, proporcionando de esta manera unos medios para suministrar la proteína por un medio alternativo a la administración proteica.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "proteína deseada" se refiere a péptidos y proteínas codificados por constructos génicos que actúan como proteínas dianas para una respuesta inmune. El ADN o el ARN que codifica una proteína deseada puede introducirse en las células del tejido de las mucosas del individuo, en las que se expresan, produciendo de este modo la proteína deseada. El ADN o el ARN que codifica la proteína deseada se une a elementos reguladores necesarios para la expresión en las células del individuo. Los elementos reguladores para la expresión del ADN incluyen un promotor y una señal de poliadenilación. Además, otros elementos, tales como una región Kozak, pueden incluirse asimismo en el constructo genético.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "constructo genético" se refiere a la molécula de ADN o ARN que comprende una secuencia nucleótida que codifica la proteína deseada y que incluye las señales de iniciación y finalización unidas funcionalmente a elementos reguladores que incluyen un promotor y la señal de poliadenilación, capaz de dirigir la expresión en las células del individuo vacunado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "forma expresable" se refiere a constructos genéticos que contienen los elementos reguladores necesarios unidos funcionalmente a una secuencia codificadora que codifica una proteína diana, de forma que cuando se encuentra presente en la célula del individuo, la secuencia codificante será expresada.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "vacuna genética" se refiere a una preparación farmacéutica que comprende un constructo genético que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína diana, que incluye preparaciones farmacéuticas que son útiles para invocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "terapéutica genética" se refiere a una preparación farmacéutica que comprende un constructo genético que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína terapéutica o compensatoria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "proteína diana" se refiere a una proteína contra la cual puede provocarse una respuesta inmune. La proteína diana es una proteína inmunogénica que comparte por lo menos un epítopo con una proteína del patógeno o del tipo de célula indeseable, tal como una célula cancerosa o una célula implicada en la enfermedad autoinmune, contra la cual es necesaria la inmunización. La respuesta inmune dirigida contra la proteína diana protegerá al individuo contra y tratará al individuo la infección específica o la enfermedad con la que está asociada la proteína diana.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "compartir un epítopo" se refiere a proteínas que comprenden por lo menos un epítopo que es idéntico a o sustancialmente similar a un epítopo de otra proteína.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "epítopo sustancialmente similar" se refiere a un epítopo que posee una estructura que no es idéntica a un epítopo de una proteína, pero que sin embargo invoca una respuesta inmune celular o humoral que exhibe una reacción cruzada con aquella proteína.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "proteína terapéutica" se refiere a proteínas cuya presencia confiere un beneficio terapéutico a un individuo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "proteína compensatoria" se refiere a proteínas cuya presencia compensa la ausencia de una proteína producida endógenamente que funciona complementariamente, debido a un gen endógeno ausente, defectuoso, que no funciona o funciona parcialmente.
Los constructos genéticos comprenden una secuencia nucleótida que codifica una proteína que se desea, unida funcionalmente a elementos reguladores que son necesarios para la expresión génica. De acuerdo con esto, la incorporación de la molécula del ADN o del ARN a una célula viviente da lugar a la expresión del ADN o ARN que codifican la proteína deseada y por tanto, la producción de la proteína deseada.
Cuando es absorbido por una célula, el constructo genético que incluye la secuencia nucleótida que codifica la proteína deseada, unida funcionalmente a los elementos reguladores, puede permanecer presente en la célula como una molécula extracromosómica funcionante, o puede integrarse en el ADN cromosómico de la célula. El ADN puede ser introducido en las células en las que permanece como un material genético separado en forma de plásmido. Alternativamente, el ADN lineal que puede integrarse en el cromosoma, puede introducirse en el interior celular. Cuando el ADN se introduce en la célula, pueden añadirse los reactivos que promueven la integración del ADN en los cromosomas. Las secuencias del ADN que son útiles para promover la integración, pueden incluirse asimismo en la molécula de ADN. Alternativamente, el ARN puede ser administrado a la célula. Se considera asimismo proporcionar el constructo genético como un minicromosoma lineal que incluye un centrómero, telómeros y un origen de replicación.
La molécula que codifica una proteína deseada puede ser ADN o ARN, que comprende una secuencia nucleótida que codifica la proteína deseada. Estas moléculas pueden ser ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado o un híbrido suyo, o una molécula de ARN, tal como ARNm. De acuerdo con esto, tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "constructo de ADN", "constructo genético" y "secuencia nucleótida" se refieren tanto a las moléculas de ADN como a las de ARN.
Los elementos reguladores necesarios para la expresión génica de una molécula de ADN incluyen: un promotor, un codón de iniciación, un codón de detención, y una señal de poliadenilación. Además, son necesarios a menudo potenciadores para la expresión génica. Es necesario que estos elementos estén unidos funcionalmente a la secuencia que codifica las proteínas deseadas y que los elementos reguladores sean funcionales en el individuo al que se administran.
Los codones de iniciación y de detención se consideran generalmente parte de una secuencia nucleótida que codifica la proteína deseada. Sin embargo, es necesario que estos elementos sean funcionales en el individuo al que se administra el constructo genético. Los codones de iniciación y finalización deben formar parte del marco con la secuencia codificante.
Los promotores y las señales de poliadenilación que se utilizan, deben ser funcionales en el interior de las células del individuo.
Ejemplos de promotores útiles especialmente en la producción de una vacuna genética para el hombre, incluyen pero no se limitan a los promotores del Virus Simiano 40 (SV40), Virus Tumoral Mamario del Ratón (MMTV), Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) tal como el promotor de Larga Repetición Terminal (LTR) del VIH, Virus Maloney, ALV, Citomegalovirus (CMV) tal como el promotor temprano inmediato CMV, Virus Epstein Barr (EBV), Virus del sarcoma de Rous (RSV), así como promotores de genes humanos tales como el de la actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina del músculo humano y metalotioneína humana.
Ejemplos de señales de poliadenilación útiles especialmente en la producción de una vacuna genética para el hombre, incluyen, pero no se limitan a: señales de poliadenilación SV40 y señales de poliadenilación LTR. En particular, se utiliza la señal de poliadenilación SV40 que se encuentra en el plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA).
Además de los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN, pueden incluirse asimismo otros elementos en la molécula de ADN. Dichos elementos adicionales incluyen potenciadores. El potenciador puede ser seleccionado de entre el grupo constituido pero que no se limita a: actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y potenciadores víricos, tales como los de CMV, RSV y EBV.
Los constructos genéticos pueden proporcionarse con los orígenes de replicación de los mamíferos para conservar extracromosómicamente el constructo y producir múltiples copias del constructo en la célula. Los plásmidos pCEP4 y pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA), contienen el origen de replicación del virus Epstein Barr y el antígeno nuclear EBNA-1 que codifica la región que produce una alta replicación de copias episómicas, sin integración.
En algunos ejemplos, el vector utilizado se selecciona de entre los descritos en el Ejemplo 11.
En aplicaciones de inmunización, el constructo genético contiene secuencias nucleótidas que codifican una proteína diana e incluye además genes para las proteínas que potencian la respuesta inmune contra dichas proteínas diana. Ejemplos de dichos genes son los que codifican citoquinas y linfoquinas tales como citoquinas y linfoquinas tales como \alpha-interferón, gamma-interferón, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, Il-8, IL-10 e IL-12.
El gen para GM-CSF puede incluirse en constructos genéticos que se utilizan en composiciones para inmunización.
Si se desea, por alguna razón, eliminar células que reciben el constructo genético, puede añadirse un elemento adicional, que sirve como diana para la destrucción celular. Un gen herpes timidina quinasa (tk) en una forma expresable, puede incluirse en el constructo genético. El medicamento gangcyclovir puede administrarse al individuo y que provoque la eliminación selectiva de cualquier célula que produzca tk, procurando, de este modo, el medio para la destrucción selectiva de las células con el constructo genético.
Para maximizar la producción proteica, pueden seleccionarse secuencias reguladoras que encajen bien en la expresión genética en las células a las que se administra el constructo. Además, pueden seleccionarse los codones que son más eficientemente transcritos en la célula. Un experto en la materia puede producir constructos de ADN que sean funcionales en las células.
Los constructos genéticos no se incorporan al interior de las partículas retrovirales. Los constructos genéticos son absorbidos por las células sin una inserción mediada por partículas retrovíricas, de forma que tiene lugar cuando las partículas retrovíricas con ARN retrovírico que se incorpora a ellas, infecta una célula. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "libre de partículas retrovíricas" se refiere a constructos genéticos que no se incorporan al interior de las partículas retrovíricas. Tal como se utiliza en la presente memoria, "disociado de un agente infeccioso" se refiere a material genético que no forma parte de un vector vírico, bacteriano o eucariótico, activo, inactivado, vivo o muerto, que es capaz de infectar a una célula.
Los constructos genéticos pueden constituir menos que un genoma vírico completo y capaz de replicarse, puesto que después de la introducción en la célula, el constructo genético posee una información genética insuficiente para dirigir la producción de partículas víricas infecciosas. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "genoma vírico incompleto" se refiere a un constructo genético que contiene menos que un genoma completo, de forma que la incorporación de dicho constructo genético a una célula no constituye la introducción de suficiente información genética para la producción de virus infecciosos.
En algunos ejemplos, moléculas de ADN se suministran libres del agente precipitante CaPO_{4}.
Una vacuna vírica atenuada puede suministrarse como un constructo genético que contiene bastante material genético como para permitir la producción de partículas víricas. El suministro de la vacuna atenuada como un constructo genético permite una manera más fácil de producir grandes cantidades de producto inmunizante activo, puro y seguro.
Los constructos genéticos pueden suministrarse a las células de un individuo, libres de partículas sólidas o irritantes.
La presente invención puede utilizarse para inmunizar a un individuo contra todos los patógenos tales como virus, organismos procarióticos y eucarióticos patogénos: tales como organismos patogénicos unicelulares y parásitos multicelulares. La presente invención es particularmente útil para inmunizar a un individuo contra los patógenos que infectan células y que no están encapsulados, tales como virus, y procariotas, tales como Gonorrhoea, Listeria y Shigella. Además, la presente invención es útil asimismo para inmunizar a un individuo contra patógenos protozoarios, que incluyen una Etapa en el ciclo vital donde existen patógenos intracelulares. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "patógeno intracelular" se refiere a un virus o a un organismo patogénico que, por lo menos parte de su ciclo vital o reproductor, lo transfiere dentro de una célula huésped y produce allí o provoca que se produzcan proteínas patógenas. La Tabla 1 proporciona una lista de algunas de las familias de virus o géneros para los cuales pueden prepararse las vacunas. Los constructos de ADN que comprenden secuencias de ADN que codifican los péptidos que comprenden por lo menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo que se ha mostrado en un antígeno de un patógeno, tales como los antígenos que se listan en las tablas, son útiles en las vacunas. Además, la presente invención es asimismo útil para inmunizar a un individuo contra otros patógenos que incluyen patógenos protozoarios eucarióticos y procarióticos, así como parásitos multicelulares tales como los que se listan en la Tabla 2.
Para producir una vacuna genética con el fin de proteger contra la infección por patógenos, el material genético que codifica proteínas inmunogénicas contra las que puede organizarse una respuesta inmune protectora, debe incluirse en el constructo genético. Si el patógeno infecta intracelularmente, para lo que la presente invención es particularmente útil, o extracelularmente, es improbable que todos los antígenos del patógeno provoquen una respuesta protectora. A causa de que el ADN y el ARN son ambos relativamente pequeños y pueden ser producidos de modo relativamente fácil, la presente invención proporciona la ventaja adicional de poder llevar a cabo la vacunación con múltiples antígenos patogénicos. El constructo genético utilizado en la vacuna genética puede incluir material genético que codifica muchos antígenos patógenos. Además, múltiples inoculantes que pueden suministrarse a distintas células en un individuo, pueden prepararse para incluir colectivamente, en algunos casos, un conjunto completo o más preferentemente, uno incompleto, de forma que sea casi completo, de genes, en la vacuna. Por ejemplo, puede administrarse un conjunto completo de genes víricos utilizando dos constructos, cada uno de los cuales contiene una mitad distinta del genoma, que se administran en sitios diferentes. Así, puede invocarse una respuesta inmune contra cada antígeno, sin el riesgo de que un virus infeccioso se ensamble. Esto permite la introducción de más de una única diana antigénica y puede eliminar la necesidad de que antígenos protectores sean identificados.
La facilidad de manejo y el carácter barato del ADN y del ARN permiten además medios más eficientes de rastreo de los antígenos protectores. Los genes pueden clasificarse y ensayarse sistemáticamente mucho más fácilmente que las proteínas. Los agentes patógenos y los organismos para protegerse de los cuales se produce la vacuna, son seleccionados, identificándose una proteína inmunogénica. Las tablas 1 y 2 incluyen listas de algunos de los agentes patogénicos y organismos para los que pueden prepararse vacunas genéticas, para proteger al individuo de la infección por ellos provocada. Los procedimientos de inmunizar a un individuo contra un patógeno pueden dirigirse contra VIH, HTLV o HBV.
Otro ejemplo describe un procedimiento para conferir una respuesta inmune protectora ampliamente basada contra las células hiperproliferativas y a un procedimiento para tratar a los individuos que padecen enfermedades hiperproliferativas. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "enfermedades hiperproliferativas" se refiere a las enfermedades y los trastornos caracterizados por la hiperproliferación celular. Ejemplos de enfermedades hiperproliferativas incluyen todas las formas de cáncer y la psoriasis.
Se ha descubierto que la introducción de un constructo genético que incluye una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunogénica asociada a una "célula hiperproliferativa" en las células de un individuo, da lugar a la producción de las proteínas en las células vacunadas de un individuo. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "proteína asociada hiperproliferativa" se refiere a proteínas que se asocian con una enfermedad hiperproliferativa. Para inmunizar contra las enfermedades hiperproliferativas, un constructo genético que incluye una secuencia nucleótida que codifica una proteína que se asocia con una enfermedad hiperproliferativa, se administra a un individuo.
Para que la proteína asociada hiperproliferativa constituya una diana inmunogénica efectiva, debe ser una proteína que se produzca exclusivamente o a niveles más altos en las células hiperproliferativas que en las células normales. Los antígenos diana incluyen dichas proteínas, sus fragmentos y los péptidos que comprenden por lo menos un epítopo que se encuentra en dichas proteínas. En algunos casos, una proteína asociada hiperproliferativa es el producto de una mutación de un gen que codifica una proteína. El gen mutado codifica un proteína que es casi idéntica a la proteína normal, excepto porque posee una secuencia aminoácida ligeramente distinta que da lugar a un epítopo diferente que no se encuentra en la proteína normal. Dichas proteínas diana incluyen las que son proteínas codificadas por oncogenes tales como myb, myc, fyn, y los genes de translocación bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk, y EGRF. Además de los productos oncogénicos como antígenos diana, las proteínas diana para los tratamientos anticáncer y los regímenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos sintetizados por los linfomas de células B y las regiones variables de los receptores de las células T de los linfomas de células T que, en algunos ejemplos, han utilizado asimismo antígenos diana para las enfermedades autoinmunes. Otras proteínas asociadas a tumores pueden utilizarse como proteínas diana, como proteínas que se encuentran a niveles más altos en las células tumorales incluyendo la proteína reconocida por el anticuerpo monoclonal 17-1A y las proteínas que se unen al folato.
Aunque la presente invención puede utilizarse para inmunizar a un individuo contra una o más de las distintas formas de cáncer, la presente invención es particularmente útil para inmunizar profilácticamente a un individuo que esté predispuesto a desarrollar un cáncer particular o que ha tenido cáncer y es por tanto susceptible a una recaída. Los desarrollos en genética y en la tecnología, así como en la epidemiología, permiten la determinación de la probabilidad y de la evaluación del riesgo para el desarrollo del cáncer en un individuo. Utilizando rastreo genético y/ o historias de la salud familiar, es posible predecir la probabilidad que un individuo particular tiene para desarrollar cualquier de los distintos tipos de cáncer.
De modo similar, los individuos que ya han desarrollado cáncer y que han sido tratados para eliminarlo, o que están por lo demás en remisión, son particularmente susceptibles a la recaída y a la reaparición. Como parte de un régimen de tratamiento, dichos individuos pueden inmunizarse contra el cáncer que se les ha diagnosticado "con la orden" de combatir una recaída. De este modo, una vez se sabe que un individuo presenta un tipo de cáncer y existe el riesgo de una recaída, pueden ser inmunizados para preparar su sistema inmunológico para combatir cualquier futura aparición del cáncer.
Asimismo, se describe un procedimiento para tratar individuos que padecen enfermedades hiperproliferativas. En dichos procedimientos, la introducción de constructos genéticos sirve como una inmunoterapéutica, dirigiendo y promoviendo al sistema inmune del individuo para combatir a las células hiperproliferativas que producen la proteína diana.
Se describe asimismo un procedimiento para tratar a los individuos que padecen enfermedades y trastornos autoinmunes, confiriendo una respuesta inmune protectora de base amplia contra dianas que están asociadas con la autoinmunidad, incluyendo receptores celulares y células que producen anticuerpos "auto" dirigidos.
Las enfermedades autoinmunes mediadas por las células T incluyen la artritis reumatoide (RA), la esclerosis múltiple (MS), el síndrome de Sjogren, sarcoidosis, diabetes mellitus dependiente de la insulina, (IDDM), tiroiditis autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por receptores de las células T que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada con las enfermedades autoinmunes. La vacunación contra la región variable de las células T provocará una respuesta inmune que incluye CTL para eliminar las células T.
En RA, varias regiones variables específicas de los receptores de las células T (TCR) que están implicadas en la enfermedad, se han caracterizado. Estas TCR incluyen V\beta-3, V\beta-14, V\beta-17 y V\alpha-17. Así, la vacunación con un constructo de ADN que codifica por lo menos una de estas proteínas, provocará una respuesta inmune que seleccionará el objetivo de las células T implicadas en la RA. Véase: Howell, M.D., et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10921-10925; Paliard, X., et al., 1991 Science 253: 325-329; Williams, W.V., et al., 1992 J. Clin. Invest. 90:326-
333.
En MS, varias regiones variables específicas de TCR que están implicadas en la enfermedad, se han caracterizado. Estas TCR incluyen V\beta-7 y V\alpha-10. Así, la vacunación con un constructo de ADN que codifica por lo menos una de estas proteínas, provocará una respuesta inmune que seleccionará el objetivo de las células T implicado en MS. Véase: Wucherpfennig, K.W., et al., 1990: Science 248: 1016-1019; Oksenberg, J.R., et al., 1990 Nature 345: 344-346.
En el escleroderma, se han caracterizado varias regiones específicas variables de TCR que están implicadas en la enfermedad. Estas TCR incluyen V\beta-6, V\beta-8, V\beta-14 y V\alpha-16, V\alpha-3C, V\alpha-7, V\alpha-14, V\alpha-15, V\alpha-16, V\alpha-28, V\alpha-12. Así, la vacunación con un constructo de ADN que codifica por lo menos una de estas proteínas provocará una respuesta inmune que seleccionará el objetivo de las células T implicadas en el escleroderma.
Para tratar pacientes que padezcan una enfermedad autoinmune mediada por las células T, particularmente los pacientes en los que todavía no se haya caracterizado la región variable de la TCR, puede llevarse a cabo una biopsia sinovial. Muestras de las células T presentes, pueden tomarse, identificando la región variable de las TCR mediante técnicas estándar. Las vacunas genéticas pueden prepararse utilizando esta información.
Las enfermedades autoinmunes mediadas por las células B incluyen el Lupus (SLE), la enfermedad de Grave, la miastenia gravis, la anemia hemolítica autoinmune, la trombocitopenia autoinmune, asma, crioglobulinemia, esclerosis biliar primaria y anemia perniciosa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por anticuerpos que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada con las enfermedades autoinmunes. La vacunación contra la región variable de los anticuerpos provocará una respuesta inmune incluyendo CTL para eliminar las células B que producen el anticuerpo.
Para tratar pacientes que padezcan una enfermedad autoinmune mediada por las células B, la región variable de los anticuerpos implicados en la actividad autoinmune debe identificarse. Puede llevarse a cabo una biopsia y pueden tomarse muestras de los anticuerpos presentes en el sitio de la inflamación. La región variable de estos anticuerpos puede identificarse utilizando técnicas estándar. Las vacunas genéticas pueden prepararse utilizando esta informa-
ción.
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En el caso de SLE, se cree que un antígeno es ADN. Así, en pacientes que van a ser inmunizados contra SLE, puede rastrearse su suero respecto a anticuerpos antiADN y puede prepararse una vacuna que incluya constructos de ADN que codifiquen la región variable de dichos anticuerpos antiADN encontrados en el suero.
Son bien conocidas características estructurales comunes entre las regiones variables de ambas TCR y los anticuerpos. La secuencia de ADN que codifica una TCR particular o anticuerpos puede encontrarse generalmente siguiendo procedimientos bien conocidos tales como los descritos en Kabat, et al. 1987, Sequence of proteins of Inmunological interest US, Department of Health and Human Services, Bethesda MD. Además, un procedimiento general para clonar las regiones variables funcionales a partir de los anticuerpos, puede encontrarse en Chaudhary, V.K., et al, 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066.
En alguno de los ejemplos que se refieren a la terapia génica, los constructos génicos contienen genes compensadores o genes que codifican proteínas terapéuticas. Ejemplos de genes compensadores incluyen un gen que codifica distrofina o un fragmento funcional, un gen para compensar el gen defectuoso en los pacientes que padecen fibrosis quística, una insulina, un gen para compensar el gen defectuoso en pacientes que padezcan ADA, y un gen que codifica el Factor VIII. Ejemplos de genes que codifican proteínas terapéuticas, incluyen genes que codifican eritropoyetina, interferon, receptor LDL, GM-CSF, IL-2, IL-4 y TNF. Adicionalmente, pueden administrarse constructos genéticos que codifican componentes de anticuerpos de cadena única que se unen específicamente a sustancias tóxicas.
El gen de la distrofina puede proporcionarse como parte de un minigen y utilizarse para tratar a los individuos que padecen distrofia muscular.
Puede proporcionarse asimismo un minigén que contiene la secuencia codificante de una proteína parcial de la distrofina.
Las anormalidades de la distrofina son responsables de tanto la Distrofia Muscular de Becker (BMD) más leve y de la grave Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). En BMD, la distrofina se sintetiza, pero es anormal en su tamaño y/o en su cantidad. El paciente está de leve a moderadamente débil. En DMD no se sintetiza la proteína y el paciente está condenado al sillón a los 13 años y muere generalmente a los 20 años de edad. En algunos pacientes, particularmente en los que padecen BMD, una proteína parcial de distrofina producida por la expresión de un minigen, puede proporcionar una mejoría en la función muscular.
Los genes que codifican IL-2, IL-4 interferon o TNF pueden suministrarse a células tumorales que se encuentran presentes o que se eliminan y se reintroducen entonces en el individuo. En algunos ejemplos, un gen que codifica el gamma interferon se administra a un individuo que padece esclerosis múltiple.
Las moléculas antisentido y los ribozimas pueden asimismo suministrarse a las células de un individuo introduciendo material genético, que actúa como una matriz para llevar a cabo copias de dichos agentes activos. Estos agentes inactivan o interfieren de algún modo con la expresión de los genes que codifican proteínas cuya presencia no es deseable. Los constructos que contienen secuencias que codifican moléculas antisentido pueden utilizarse para inhibir o evitar la producción de proteínas en el interior celular. Así, la producción de proteínas tales como productos oncogénicos puede ser eliminada o reducida. De modo similar, los ribozimas pueden interrumpir la expresión genética destruyendo selectivamente al ARN mensajero, antes de que se traduzca en una proteína. Las células pueden ser tratadas utilizando constructos que codifican moléculas antisentido o ribozimas como parte de un régimen terapéutico que implica la administración de otros procedimientos y sustancias terapéuticas. Los constructos genéticos que codifican moléculas antisentido y ribozimas utilizan vectores similares a los que se utilizan cuando se desea la producción proteica, excepto en que la secuencia codificante no contiene un codón de iniciación para iniciar la traducción del ARN en la proteína. Ejemplos incluyen vectores, particularmente aquéllos que contienen un origen de replicación y una forma expresable del antígeno nuclear apropiado.
Los ribozimas son ARN catalíticos que son capaces de autofragmentarse o de fragmentar a otra molécula de ARN. Se conocen en la técnica varios tipos distintos de ribozimas, tales como Hammerhead, Hairpin, el intron del grupo Tetrahymena I, Axhead, y RNasa P. (S. Edgington, Biotechnology 1992 10, 256-262). Los ribozimas Hammerhead tienen un sitio catalítico del que se ha llevado a cabo un mapa con un núcleo que posee menos de 40 nucleótidos. Varios ribozimas en los viroides de plantas y en los ARN satélites comparten una estructura secundaria común y ciertos nucleótidos conservados. Aunque estos ribozimas sirven naturalmente como su propio substrato, el domino de la enzima puede dirigirse a otros ARN substrato mediante el emparejamiento de bases con secuencias que franquean el sitio conservado de fragmentación. Esta capacidad para diseñar ribozimas a la medida ha permitido que se utilizaran para la fragmentación de ARN de secuencias específicas (G. Paolella et al., EMBO 1992, 1913-1919). Se encontrará, por tanto, dentro del alcance del experto en la materia utilizar distintas secuencias catalíticas de varios tipos de ribozimas, tales como la secuencia catalítica de Hammerhead y diseñarlas de la forma que se ha dado a conocer en la presente memoria. Los ribozimas pueden diseñarse contra distintas dianas, que incluyen secuencias nucleótidas de patógenos y secuencias oncogénicas. Ciertos ejemplos incluyen suficiente complementariedad para hacer blanco en el transcrito de fusión abl-bcr, mientras se conserva la eficiencia de la reacción de fragmentación.
Según la presente invención, la composición es para la administrarla al tejido de las mucosas de un individuo tópicamente o mediante lavado. Para la administración intravaginal, pueden formularse los constructos genéticos como crema, pomada, bálsamo, lavativa o supositorio.
El lavado con y la administración tópica de composiciones farmacéuticas es bien conocido. Un experto en la técnica puede, siguiendo las instrucciones de la presente memoria, utilizar protocolos de administración tópica o de lavado para suministrar material genético a células de la mucosa de un individuo e inducir la inmunidad de la mucosa en éste. Las composiciones de la presente invención son útiles para suministrar intravaginalmente material genético.
Se ha descubierto que el material genético que se introduce en el tejido de las mucosas es transportado al tejido a sitios distantes en el organismo. El material genético transportado es absorbido por las células en los sitios distantes y expresado. De acuerdo con esto, el material genético puede suministrarse y expresarse en células por todo el organismo, como las células del corazón o del hígado, administrando el material genético en los sitios de la mucosa.
Las vacunas genéticas comprenden entre aproximadamente 1 nanogramo y 1.000 microgramos de ADN. Las vacunas y las composiciones terapéuticas pueden contener entre aproximadamente 10 nanogramos y aproximadamente 800 microgramos de ADN, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500 microgramos de ADN, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 350 microgramos de ADN, entre aproximadamente 25 y aproximadamente 250 microgramos de ADN, o aproximadamente 100 microgramos de ADN.
Las vacunas genéticas se formulan utilizando componentes estándar para la administración tópica o de lavado. Remington's Pharmaceutical Sciences 18ª Edición 1990, Alfonso R. Gennaro, Ed. Mack Publishing Co. Easton PA 18042, da a conocer la formulación de composiciones adaptadas para la administración tópica, la administración de supositorios o la administración de lavados. Un experto en la materia puede formular fácilmente una composición farmacéutica que comprenda un constructo genético. Generalmente, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se utilizan soluciones isotónicas tales como soluciones salinas tamponadas de fosfato. Los estabilizantes incluyen gelatina y albúmina. En algunos ejemplos, se añade un agente vasoconstrictor se añade a la formulación. Las composiciones según la invención se suministran preferentemente estériles y libres de pirógenos.
Un experto en la materia de las formulaciones farmacéuticas, por ejemplo, con una titulación avanzada en Farmacia o Ciencias Farmacéuticas, puede preparar diversas formas apropiadas de dosificación y formulaciones para las composiciones de la invención, sin más que la experimentación rutinaria. Diversos textos en el campo, por ejemplo, las últimas ediciones de Remington's Pharmaceutical Sciences y The US Pharmacopoeia/National Formulary, proporcionan una guía importante a este respecto.
Una formulación farmacéuticamente aceptable proporcionará el principio activo o principios activos en la forma física apropiada, conjuntamente con dichos excipientes, diluyentes, estabilizantes, conservantes y otros ingredientes que sean apropiados para la naturaleza y composición de la forma de dosificación y de las propiedades del ingrediente o ingredientes del medicamento, en el entorno de la formulación y del sistema de suministro del medicamen-
to.
Además de las consideraciones habituales de estabilidad y biodisponibilidad, para alcanzar una inmunidad adecuada de las mucosas, la forma de dosificación proporcionará un contacto temporal y físico adecuado con la mucosa seleccionada. Los principios activos pueden formularse como un sistema de una única Etapa o de dos fases, y en una forma de dosificación líquida, sólida o semisólida, por ejemplo, crema, gel, emulsión, suspensión, pomada, supositorio, comprimido. El vehículo de la formulación puede ser acuoso, oleaginoso, o una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite, preferentemente agua/aceite. Aunque los principios activos pueden formularse en agua estéril o en solución salina, una formulación líquida tendrá la viscosidad adecuada para que pueda ser retenida en contacto con las superficies mucosas seleccionadas durante minutos a horas, para permitir la penetración adecuada del medicamento y su absorción celular.
Una forma de dosificación preferida para la aplicación de las composiciones de la invención a la mucosa vaginal, es el supositorio. Los supositorios son formas de dosificación sólidas de varias formas, tamaños y composiciones, que se diseñan para la introducirlos en orificios del organismo humano. Se ablandan, se derriten o se disuelven a temperatura corporal. Las bases habituales de los supositorios incluyen aceite de Theobroma (nombre de género de plantas) (manteca de cacao), gelatina glicerinada, aceites vegetales hidrogenados, mezclas de polietilenglicoles de varios pesos moleculares, y ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol. La manteca de cacao es un diluyente apropiado o vehículo para supositorios porque se funde rápidamente a la temperatura corporal y permite que la forma ionizada de los medicamentos de la invención, se difunda a la mucosa; sin embargo, los vehículos oleaginosos no son preferidos habitualmente para los supositorios vaginales, debido al residuo no absorbible que se forma. Por otra parte, la gelatina glicerinada raramente se utiliza por vía rectal, debido a su lenta disolución.
Los geles constituyen formulación farmacéuticas útiles para la administración de las composiciones de la invención, solos o mezclados con un facilitador de la expresión absorbente de polinucleótidos, a los tejidos de la mucosa vaginal de la mujer o del cuerpo de los animales.
Pueden prepararse formulaciones útiles de geles utilizando Carbopol® 934 o Carbopol^{R} 940 (polímero de poliacrilato) a una concentración final de 0,5% peso/vol (BF Goodrich); polivinilalcohol de peso molecular 72.000 o 49.000 a una concentración final de 4% peso/vol; o Povidone® K30; o Povidone® K60; o Povidone® K90 (polivinilpirrolidona) a una concentración final de 1,5 a 3% peso/vol, en una solución tamponada acuosa de 2 mM EDTA, 40 mM Tris, pH 7,5. La composición se encontrará a una concentración que permitirá utilizar un volumen conveniente de gel, apropiado para la superficie mucosa seleccionada, por ejemplo, una concentración en la que entre 0,5 y 5 ml aproximadamente de gel puedan utilizarse para suministrar entre 0,1 mcg y 1 mg aproximadamente de ADN, preferentemente entre 1 y 500 mcg aproximadamente de ADN, más preferentemente entre 25 y 250 mcg aproximadamente de ADN. Por ejemplo, con un gel que tenga una concentración de 100 mcg de ADN por ml, puede utilizarse una dosis de entre 1 y 5 ml, para suministrar una dosis de 100 mcg a 500 mcg a la mucosa vaginal. Un facilitador de la expresión/absorbente de polinucleótidos tal como la bupivacaína puede encontrarse en la composición del gel a una concentración efectiva, preferentemente entre 0,1 y 0,5%.
Formas útiles de dosificación farmacéutica para la administración de las composiciones de la invención a los tejidos de la mucosa vaginal femenina o del cuerpo de los animales, puede ilustrarse de la forma siguiente:
Una composición apropiada para la administración en forma de supositorio vaginal, se prepara pesando 2 mg de una sustancia medicinal polinucleótida finamente dividida en un contenedor tarado, añadiendo 10 ml de cloruro de bupivacaína HCl al 0,5% en agua purificada, para obtener un total de 10 g, y disolviendo o mezclando, dependiendo de la solubilidad de la sustancia medicinal; añadiéndose y mezclándose 70 g de glicerina; se añaden entonces 20 g de gelatina granular, calentándose cuidadosamente la composición en un baño de vapor, hasta que la gelatina se disuelva. La mezcla fundida se vierte en moldes enfriados para obtener 20 supositorios vaginales de 6 gramos cada uno, que contienen 100 mcg de sustancia medicinal polinucleótida mezclada con 2,5 mg de bupivacaína.
Un comprimido vaginal o composición de inserción se prepara conteniendo 250 mcg de sustancia medicinal polinucleótida finamente dividida en una composición de comprimido que comprende lactosa, celulosa microcristalina, ácido láctico, maizena, crospovidona, lactato cálcico, estearato de magnesio, dióxido de silicona, e hidroxipropilmetilcelulosa.
Un gramo (1 g) de Carbopol® 934 (polímero de poliacrilato) (BF Goodrich) se añade a 100 ml de agua purificada, utilizando un embudo de adición de polvo y se mezcla, utilizando un mezclador cortador mecánico de alta velocidad para formar un gel homogéneo rígido con una concentración de Carbopol del 1% (peso/vol). Se añaden 20 mg de ADN a 100 ml de una solución tamponada acuosa (pH 7,6) que contiene 2 mM EDTA y 40 mM Tris. El tampón que contiene ADN y el gel de Carbopol se mezclan, cortándolos, para obtener un gel homogéneo que contiene 100 mcg de ADN por ml. Un facilitador de la expresión/absorbente de polinucleótidos tal como el cloruro de bupivacaína se añade a una concentración de aproximadamente 0,1% a 0,5% (peso/vol). El gen puede aplicarse tópicamente a las superficies mucosas vaginales.
En algunos ejemplos, el individuo se somete a una administración única para producir una respuesta inmune amplia y completa. En algunos ejemplos, el individuo se somete a una serie de vacunaciones para producir una respuesta inmune amplia y completa.
Por lo menos dos, y preferentemente de cuatro a cinco administraciones pueden llevarse a cabo durante un tiempo. El período de tiempo entre las administraciones puede incluir 24 horas separadas en dos semanas, o en uno más largo entre las administraciones, separadas preferentemente una semana.
Las composiciones de la presente invención son útiles en los campos, tanto de la medicina humana, como de la veterinaria.
Los Ejemplos que se exponen a continuación incluyen ejemplos representativos de aspectos de la presente invención. Los ejemplos no están destinados a limitar el alcance de la invención, sino que se proporcionan con propósitos ejemplificativos.
Ejemplos Ejemplo 1
Lo que sigue es una lista de constructos, descrito cada uno de ellos en el Número de Serie U.S 08/008.342 clasificado el 26 de enero de 1993, Número de Serie US 08/029.336 clasificado el 11 de marzo de 1993, Número de Serie U.S 08/125.012 clasificado el 21 de septiembre de 1993, el Número de Serie PCT/US94/00899 de Solicitud Internacional, clasificado el 26 de enero de 1994, y/o el Número de Serie US 08/221.579 clasificado el 1 de abril de 1994.
El vector pBabe.puro, que se utiliza como un material de iniciación para producir muchos de los constructos que se listan a continuación, se construyó y fue informado originariamente por Morgenstern, J.P. y H. Land, 1990 Nucl. Acids. Res. 18(12):3587-3596.
El plásmido pBabe.puro es particularmente útil para la expresión de genes exógenos en las células de mamíferos. Las secuencias de ADN que van a expresarse se insertan en sitios de clonación bajo el control del promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus Maloney de la leucemia murina (Mo MuLV). El plásmido contiene el marcador seleccionable para la resistencia a la puromicina.
El plásmido pBa.V\alpha3 es un plásmido de 7,8 kb que contiene un fragmento genómico EcoRI de 2,7 kb que codifica la región Va3 del receptor de las células T que contiene los segmentos L, V y J clonados en el sitio EcoRI del pBabe.puro. La proteína diana derivada del receptor de las células T es útil en la inmunización contra y en el tratamiento de la enfermedad autoinmune mediada por las células T y del linfoma y de la leucemia de células T clonotípi-
cas.
El plásmido pBa.gagpol-vpr es un plásmido de 9,88 kb que contiene los genes gag/pol y vif del VIH/MN clonado en pBabe.puro. El gen vpr está suprimido. El plásmido que contiene estos genes virales VIH, que codifica proteínas diana del VIH, es útil en la inmunización contra y en el tratamiento de la infección por el VIH y en el SIDA.
El plásmido pM160 es un plásmido de 11,0 kb que contiene el fragmento PCR de 2,3 kb que codifica la proteína de la envuelta VIH-I/3B y los genes rev/tat clonados en pMAMneoBlue. La región nef está suprimida. El plásmido que contiene estos genes virales VIH, que codifica las proteínas diana del VIH, es útil en la inmunización contra y en el tratamiento de la infección por el VIH y el SIDA.
El plásmido pBa.VL es un plásmido de 5,4 kb que contiene el fragmento PCR que codifica la región VL de un anticuerpo antiADN clonado en pBabe.puro en los sitios XbaI y EcoRI. La proteína diana que se deriva del anticuerpo es un ejemplo de una proteína diana útil en la inmunización contra y en el tratamiento de una enfermedad autoinmune mediada por las células B y de los linfomas y la leucemia de las células clonotípicas B.
El plásmido pOspA.B es un plásmido de 6,84 kb que contiene las regiones codificantes que codifican los antígenos OspA y OspB de Borrelia burgdorferi, la espiroqueta responsable de la enfermedad de Lyme, clonadas en pBabe.puro en los sitios BamHI y SalI. El plásmido que contiene estos genes patógenos, que codifican proteínas diana, es útil en la inmunización contra la enfermedad de Lyme.
El plásmido pBa.Rb-G es un plásmido de 7,10 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que codifica la proteína G de la rabia clonado en pBabe.puro en el sitio BamHI. El plásmido que contiene el gen patógeno, que codifica la proteína G de la rabia, es útil en la inmunización contra la rabia.
El plásmido pBa.HPV-L1 es un plásmido de 6,80 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que codifica la proteína L1 de la cápsida del papilomavirus humano (HPV) que incluye las cepas HPV 16, 18, 31 y 33 clonadas en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido es útil en la inmunización contra la infección por HPV y en el cáncer causado de esta forma.
El plásmido pBa.HPV-L2 es un plásmido de 6,80 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que codifica la proteína L2 de la cápsida del papilomavirus humano (HPV) incluyendo las cepas HPV 16, 18, 31 y 33 clonadas en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido es útil en la inmunización contra la infección por HPV y en el cáncer causada de esta forma.
El plásmido pBa.MNp7 es un plásmido de 5,24 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que codifica la región codificante p7 que incluye la secuencia gag VIH MN (proteína nuclear) clonada en pBabe.puro en el sitio BamHI. El plásmido que contiene estos genes virales VIH, que codifica las proteínas diana del VIH, es útil en la inmunización contra y en el tratamiento de la infección por VIH y en el SIDA.
El plásmido pGA733-2 es un plásmido de 6,3 kb que contiene el antígeno superficial tumoral GA733-2 clonado a partir de la progenie celular SW948 del carcinoma colorectal en el vector pCDM8 (Seed, B. y A. Aruffo, 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365) en el sitio BstXI. La proteína diana asociada al tumor es un ejemplo de una proteína diana útil en la inmunización contra y en el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa tal como el cáncer. El antígeno GA733-2 es un antígeno diana útil contra el cáncer de colon.
El plásmido pT4-pMV7 es un plásmido de 11,15 kb que contiene ADNc que codifica el receptor CD4 humano clonado en el vector pMV7 en el sitio EcoRI. La proteína diana CD4 es útil en la inmunización contra y en el tratamiento del linfoma de células T.
El plásmido pDJGA733 es un plásmido de 5,1 kb que contiene el antígeno superficial tumoral GA733 clonado en pBabe.puro en el sitio BamHI. La proteína diana asociada al tumor es un ejemplo de una proteína diana que es útil en la inmunización contra y en el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa como el cáncer. El antígeno GA733 es un antígeno diana útil contra el cáncer de colon.
El plásmido pBa.RAS es un plásmido de 6,8 kb que contiene la región codificante ras que se subclonó primero a partir de pZIPneoRAS y se clonó en pBabe.puro en el sitio BamHI. La proteína diana ras es un ejemplo de un molécula citoplasmática de señalización.
El plásmido pBa.MNp55 es un plásmido de 6,38 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que codifica la región codificante de p55 que incluye la secuencia del precursor gag VIH MN (proteína nuclear) clonada en pBAbe.puro en el sitio BamHI. El plásmido que contiene estos genes virales VIH, que codifican las proteínas diana del VIH, es útil en la inmunización contra y en el tratamiento de la infección por VIH y el SIDA.
El plásmido pBa.MNp24 es un plásmido de 5,78 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR a partir de la matriz pMN-SF1 que codifica la región codificante de p24 que incluye la región codificante completa VIH MN gag clonada en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido que contiene estos genes virales VIH que codifican las proteínas diana del VIH, es útil en la inmunización contra y en el tratamiento de la infección por VIH y el SIDA.
El plásmido pBA.MNp17 es un plásmido de 5,5 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que codifica la región codificante de p17 que incluye la secuencia gag VIH MN (proteína nuclear) clonada en pBAbe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido que contiene estos genes virales VIH. que codifican las proteínas diana del VIH. es útil en la inmunización contra y en el tratamiento de la infección por VIH y en el SIDA.
El plásmido pBa.SIVenv es un plásmido de 7,8 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR de 2,71 kb amplificado a partir de un constructo que contiene SIV 239 en pBR322 clonado en pBAbe.puro en los sitios BamHI y EcoRI.
El plásmido pcTSP/ATK.env es un plásmido de 8,92 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que contiene la región codificante completa de la envuelta de HTLV de los aislamientos HTLV-1/TSP y /ATK subclonados en el vector pADNc1/neo. La proteína diana env de HTLV es útil en la inmunización contra y en el tratamiento de la infección por HTLV y en el linfoma de las células T.
El plásmido pBa.MNgp160 es un plásmido de 7,9 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR de 2,8 kb amplificado a partir de un constructo que contiene MNenv en pSP72 y clonado en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido que contiene estos genes virales del VIH, que codifican proteínas diana del VIH, es útil en la inmunización contra y en el tratamiento de la infección por VIH y en el SIDA.
El plásmido pC.MNp55 es un plásmido de 11,8 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR de 1,4 kb amplificado a partir de la región gag del aislamiento MN y clonado y clonado en el vector pCEP4. El plásmido que contiene estos genes virales VIH, que codifican las proteínas diana del VIH, es útil en la inmunización contra y en el tratamiento de la infección por VIH y en el SIDA.
El plásmido pC.Neu es un plásmido de 14,2 kb que contiene un fragmento de ADN de 3,8 kb que contiene el oncogén humano neu que codifica la región que se extirpó del constructo LTR-2/erbB-2 y se subclonó en el vector pCEP4. La proteína diana del oncogén neu es un ejemplo de un receptor de factor de crecimiento útil como una proteína diana para la inmunización contra y en el tratamiento de la enfermedad hiperproliferativa como el cáncer; en particular, en el cáncer de colon, de mama, de pulmón y de cerebro.
El plásmido pC.RAS es un plásmido de 11,7 kb que contiene un fragmento de ADN de 1,4 kb que contiene el oncogén ras que codifica la región que se subclonó primero a partir de pZIPneoRAS y se subclonó en pCEP4 en el sitio BamHI. La proteína diana ras es un ejemplo de una molécula citoplásmica de señalización. Los plásmidos que codifican ras son útiles para la inmunización contra y el tratamiento de la enfermedad hiperproliferativa tal como cáncer, en particular, ras se ha relacionado con el cáncer de vejiga, músculo, pulmón, cerebro y óseo.
El plásmido pNLpuro es un plásmido de 15 kb que contiene una inserción VIH gag/pol y SV40-puro. El plásmido que contiene estos genes virales del VIH que codifican las proteínas diana del VIH, es útil en la inmunización contra y en el tratamiento de la infección por VIH y en el SIDA.
Ejemplo 2
Vacuna del VIH que utiliza la inmunización genética directa. Se proporcionan constructos genéticos que, cuando se suministran a las células de un individuo, se expresan para producir proteínas del VIH. Según algunos ejemplos, la producción de todas las proteínas estructurales víricas en las células del individuo, provocan una respuesta inmune protectora que protege contra la infección por el VIH.
La vacuna del VIH puede utilizarse para inmunizar a individuos no infectados de la infección por el VIH, o servir como un inmunoterapéutico para los individuos que ya están infectados.
La vacuna del VIH procura una respuesta inmune que incluye a CTL que reconocen y atacan a las células infectadas por el VIH y reconocen al contingente más amplio de las proteínas del VIH. Así, los individuos no infectados están protegidos de la infección por el VIH.
No se proporciona un constructo genético con un complemento completo de los genes del VIH. Uno o más genes esenciales pueden suprimirse o alterarse intencionadamente para asegurar que no puede formarse una partícula vírica infecciosa.
El constructo de ADN está formado por un promotor, un potenciador y una señal de poliadenilación. El promotor puede seleccionarse de entre el grupo constituido por: VIH LTR, actina humana, miosina humana, CMV, RSV, Moloney, MMTV, hemoglobina humana, creatina muscular humana, y EBV. El potenciador puede seleccionarse de entre el grupo constituido por actina humana, miosina humana, CMV, RSV, hemoglobina humana, creatina muscular humana y EBV. La señal de poliadenilación puede seleccionarse de entre el grupo constituido por: señal LTR de poliadenilación, y señal SV40 de poliadenilación, particularmente la señal SV40 menor de poliadenilación entre otras.
En algunos ejemplos, se administran aproximadamente 0,1 a 1.000 microgramos, preferentemente entre 1 y 500 microgramos, más preferentemente entre 25 y 250 microgramos, muy preferentemente aproximadamente 100 microgramos de ADN.
En algunos ejemplos, las composiciones que van a administrarse incluyen por lo menos uno de los constructos genéticos siguientes.
Plásmidos y estrategias de clonación: Se construyeron dos plásmidos: uno que contiene VIH gag/ pol y el otro que contiene VIH env.
El clon genómico de VIH-1, pNL43, se obtuvo mediante el NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (ARRRP), Division of AIDS, NIAID, NIH, del Dr. Malcom Martin, y puede utilizarse como material de partida para los genes víricos del VIH-1 para constructos genéticos. Alternativamente, cualquier clon molecular del VIH de la célula infectada puede, utilizando la tecnología de la creacción en cadena de la polimerasa, modificarse suficientemente para la construcción, incluyendo el clon HXB2, el clon MN, así como el clon SF o BAL-1. El clon pNL43 es un constructo que está formado por ADN provírico del VIH-1 más 3 kb de la secuencia del huésped del sitio de integración clonado en pUC18.
Construcción del plásmido pNL-puro-env
Este plásmido se construyó para la expresión de gag pol. El sitio StuI en el interior del ADN humano que no franquea el extremo 5' del VIH, de pNL43, se destruyó mediante digestión parcial con StuI, seguido por la digestión de los extremos libres con la polimerasa 1 de E.coli. El plásmido lineal se rellenó y entonces se autounió, dejando un único sitio StuI en el interior del genoma de VIH. Este plásmido, pNLDstu, se digirió entonces con las enzimas StuI y BsaBI de redondeamiento, que eliminaron un gran segmento de la secuencia codificante para gp120. El promotor SV40 y la región codificante de la resistencia a la puromicina (puromicin acetil transferasa (PAC)) se aislaron de pBABE-puro (Morgenstern y Land, 1990 Nucl. Acids Res. 18 (12):3587-3596, proporcionado amablemente por el Dr. Hartmut Land del Imperial Cancer Research (Fund), utilizando EcoRI y ClaI. este fragmento se redondeó, se clonó entonces en pNLDstu digerido por StuI/BsaBI. Se seleccionó un clon con el fragmento SV40-puro en la orientación correcta, de forma que el LTR del extremo 3' del VIH pudiera proporcionar funciones poly A para el mensaje PAC. Este plásmido se denominó pNLpuro.
Estrategia de clonación para la deleción del gen regulador vpr del vector VIH gag pol
Una región desde justamente por encima del único sitio PflMI a justo después del codón de finalización de vif, se amplificó mediante PCR, utilizando cebadores que introdujeron un cambio aminoácido no conservador (glu\rightarrowval) en el aminoácido 22 de vpr, un codón de detención en el marco de lectura de vpr inmediatamente del aminoácido 22, y un sitio EcoRI inmediatamente después del nuevo codón de detención. Este fragmento PCR fue sustituido por el fragmento PflMI- EcoRI de pNLpuro o pNL43. Esta sustitución llevó a la deleción de 122 nucleótidos del marco abierto de lectura de vpr, eliminando por tanto la posibilidad de reversión que una estrategia puntual de mutación supone. Los plásmidos resultantes, pNLpuro\Deltavpr, codifican los primeros 21 aminoácidos naturales de vpr más una valina, más todos los demás genes restantes del VIH-1 y ensamblan uniones en su forma nativa. Dicha estrategia de deleción se aplicaría asimismo a nef, vif, y vpu, y permitiría la expresión del gen estructural, pero protegería de la generación de un virus recombinante vivo.
Construcción del plásmido para la expresión de la envuelta
El segmento de ADN que codifica el gen de la envuelta del VIH-1-HXB2 se clonó mediante la técnica de amplificación de la reacción en cadena de la isomerasa (PCR) utilizando el ADN clonado lambda obtenido del AIDS Research and reference Reagent Program. Las secuencias de los cebadores 5' y 3' son
5'-AGGCGTCTCGAGACAGAGGAGAGCAAGAAATG-3'(SEC. ID. nº: 1)
con incorporación del sitio XhoI y
5'-TTTCCCTCTAGATAAGCCATCCAATCACAC-3'(SEC. ID. nº: 2)
con incorporación del sitio XbaI, respectivamente, que abarca la región codificante de gp160, tat y rev. La amplificación génica específica se llevó a cabo utilizando la Taq ADN polimerasa según las instrucciones del fabricante (Perkin-Elmer Cetus Corp). Los productos de la reacción PCR se trataron con 0,5 \mug/ml de proteinasa K a 37ºC durante treinta minutos, seguido por una extracción fenol/cloroformo y una precipitación etanólica. El ADN recuperado se digirió entonces con XhoI y XbaI durante 2 horas a 37ºC y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa. El fragmento PCR XhoI-XbaI aislado y purificado se clonó en el plásmido Bluescript (Stratagene Inc., La Jolla, CA), subclonándose entonces en el vector de expresión eucariótico pMAMneoBlue (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA). El constructo resultante se denominó como pM160. El ADN plasmídico se purificó con ultracentrifugación en gradiente de CsCl. El constructo de ADN pM160 codifica la glicoproteína gp160 unida a la membrana de VIH-1/HXB2 (Fisher, A.G., et al., (1985) Nature (316:262-265), bajo control de un elemento potenciador RSV con el MMTV LTR como un promotor.
Construcción plasmídica alternativa de expresión de la envuelta, denominada plásmido VIH-1 env-rev
La región que codifica los dos exones de rev y de vpu y los marcos abiertos de lectura de la envuelta del VIH-1 HXB2, se amplificó mediante PCR y se clonó en el vector de dexpresión pCNDA/neo (Invitrogen). El plásmido gobierna la producción de la envuelta a través del promotor CMV.
Producción y Purificación
El plásmido en E. coli (DH5 alfa) se hace crecer de la forma siguiente: Se formaron vetas en una placa de agar LB más ampicilina con el deseado cultivo plasmídico, a partir de una fuente congelada. La placa se incubó durante la noche (14-15 horas) a 37ºC. Se tomó una única colonia de la placa y se inoculó en 15 ml de un medio LB con una preparación de peptona y 50 \mug/ml de ampicilina. Este cultivo se hizo crecer a 37ºC mientras se agitaba (aproximadamente 175 rpm) durante 8 a 10 horas. Las lecturas de OD_{600} debían ser por lo menos de 1,0. Se inoculó, con 1,0 OD de cultivo, 1 litro de medio LB con peptona y 50 \mug/ml de ampicilina. Estos cultivos de 1-2 litros se hicieron crecer durante la noche a 37ºC mientras se agitaban (175 rpm).
Los plásmidos que crecieron en E.coli (cepa DH5 alfa), se recuperaron y purificaron mediante los procedimientos siguientes. Los procedimientos generales para la lisis de las células y la purificación de los plásmidos, pueden encontrarse en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Edition, J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989. Las células se concentran y se lavan con un tampón glucosa-tris- EDTA, pH 8,0. Las células concentradas se lisan mediante tratamiento con lisozima y se tratan brevemente con 0,2 N KOH, ajustándose entonces el pH a 5,5 con tampón acetato potásico/ácido acético. El material insoluble se elimina mediante centrifugación. Al sobrenadante se añade 2-propanol para precipitar el plásmido. El plásmido se vuelve a disolver en tampón tris-EDTA y se purifica ulteriormente mediante extracción fenol/cloroformo y una precipitación adicional con 2-propanol.
Las endotoxinas pueden eliminarse opcionalmente mediante distintos procedimientos que incluyen los siguientes: adsorción específica mediante materiales inmovilizados tales como la polimixina (Tani et al., Biomater. Artif. Cells Immobilization Biotechnol. 20 (2-4):457-62 (1992); Issekutz, J.Immunol. Methods 61(3):275-81 (1983)); anticuerpos monoclonales antiendotoxinas, tales como 8A1 y HA-1A^{TM} (Centocor, Malvern, PA; Bogard et al. J. Immunol. 150 (10): 4438-4449 (1993); Rietschel et al., Infect. Immunity, página 3863 (1993)); filtros profundos cargados positivamente (Hou et al., J. Parenter. Sci.Technol. 44 (4): 204-9 (Jul-Aug 1990); poly(gamma-metil L-glutamato), Hirayama et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 40 (8):2106-9 (1992)); histidina (Matsumae et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 12: (2):129-40 (1990); columnas y membranas de interacción hidrofóbica (Aida et al., J.Immunol Methods 132 (2):191-5 (1990); Umeda et al., Biomater Artif Cells Artif Organs 18 (4):491-7 (1990); Hou et al., Biochem. Biophys. Acta 1073 (1):149-54 (1991); Sawada et al., J.Hyg (London) 97 (1):103-14 (1986)); resinas hidrofóbicas específicas útiles para la eliminación de endotoxinas, que incluyen resinas hidrofóbicas de poliestireno/divinilbenceno o divinilbenceno, tales como la resina Brownlee Polypore (Applied Biosystems, Palo Alto, CA); XUS 40323.00 (Dow Chemical, Midland, MI); HP20, CHP2OP (Mitsubishi Kasei, U.S); Hamilton PRP-1, PRP-infinity (Hamilton, Reno, NV); DVB Jordi de Etapa inversa, Gel DVB Jordi, Polymer labs PLgel^{TM} (Alltech, Deerfield, IL); Vydac PLx^{TM} (Separations Group, Hesperia, CA); otros materiales que eliminan endotoxinas y procedimientos incluyen Gel de eliminación de endotoxinas Detoxi-Gel^{TM} (Pierche Chemical, Rockford, IL); nota de aplicación 206, (Pharmacia Biotech Inc, Piscataway, NJ). Véase también generalmente, Sharma, Biotech.App. Biochem. 8; 5-22 (1986). Los anticuerpos monoclonales antiendotoxinas preferidos se unen a los dominios conservados de la endotoxina, preferentemente anticuerpos para el lípido A, la parte más conservada estructuralmente de la molécula de la endotoxina. Dichos anticuerpos monoclonales antilípido A incluyen el anticuerpo 8A1 monoclonal IgG murino de alta afinidad, y el anticuerpo humano HA-1A^{TM} monoclonal IgM(k) antilípido A. El HA-1A^{TM} fue derivado a partir de una vacuna de E. coli J5B humana. Se informa de que HA-1A^{TM} es presenta una amplia reacción cruzada con diversas endotoxinas bacterianas (lipopolisacáridos).
Ejemplo 3
En otra construcción para expresar el gen env, aquella región del VIH puede insertarse en el plásmido pCEP4 comercialmente disponible (Invitrogen). El plásmido pCEP4 es particularmente útil ya que contiene el origen de replicación del virus Epstein Barr y la región codificante del antígeno EBNA-1 nuclear que produce una alta replicación episómica de copias sin integración. pCEP4 contiene asimismo el marcador de la higromicina bajo el control regulador del promotor de la timidina quinasa y del sitio de poliadenilación. La región que codifica env del VIH está situada bajo el control regulador del promotor CMV y del sitio de poliadenilación de SV40. La región que codifica env del VIH se obtuvo como una forma VIH/3B del fragmento PCR de 2,3 kb, secuencia Genbank K03455. El plásmido resultante basado en pCEP4, pRA-100, se conserva extracromosómicamente y produce la proteína gp160.
Ejemplo 4
En otra construcción para expresar el gen env, aquella región del VIH puede insertarse en el plásmido pREP4 comercialmente disponible (Invitrogen). El plásmido pREP4 es particularmente útil ya que contiene el origen de replicación del virus Epstein Barr y la región codificante del antígeno EBNA-1 nuclear que produce una alta replicación episómica de copias sin integración. pREP4 contiene asimismo el marcador de la higromicina bajo el control regulador del promotor de la timidina quinasa y del sitio de poliadenilación. La región que codifica env del VIH está situada bajo el control regulador del promotor RSV y del sitio de poliadenilación de SV40. La región que codifica env del VIH se obtuvo como una forma VIH/3B del fragmento PCR de 2,3 kb, secuencia Genbank K03455. El plásmido resultante basado en pCEP4, pRA-101, se conserva extracromosómicamente y produce la proteína gp160.
Ejemplo 5
En otra construcción para expresar los genes gag/pol, aquella región del VIH puede insertarse en el plásmido pCEP4 comercialmente disponible (Invitrogen). El plásmido pCEP4 es particularmente útil ya que contiene el origen de replicación del virus Epstein Barr y la región codificante del antígeno EBNA-1 nuclear que produce una alta replicación episómica de copias sin integración. pCEP4 contiene asimismo el marcador de la higromicina bajo el control regulador del promotor de la timidina quinasa y del sitio de poliadenilación. La región que codifica gag/pol del VIH está situada bajo el control regulador del promotor CMV y del sitio de poliadenilación de SV40. La región que codifica gag/pol del VIH se obtuvo de VIH MN, secuencia Genbank MI7449, e incluye el gen vif. El gen vpr no está incluido. El plásmido resultante basado en pCEP4, pLA-100, se conserva extracromosómicamente y produce GAG55, la transcriptasa inversa, la proteasa y las proteínas de la integrasa.
Ejemplo 6
En otra construcción para expresar los genes gag/pol, aquella región del VIH puede insertarse en el plásmido pREP4 comercialmente disponible (Invitrogen). El plásmido pREP4 es particularmente útil ya que contiene el origen de replicación del virus Epstein Barr y la región codificante del antígeno EBNA-1 nuclear que produce una alta replicación episómica de copias sin integración. pREP4 contiene asimismo el marcador de la higromicina bajo el control regulador del promotor de la timidina quinasa y del sitio de poliadenilación. La región que codifica gag/pol del VIH está situada bajo el control regulador del promotor CMV y del sitio de poliadenilación de SV40. La región que codifica gag/pol del VIH se obtuvo de VIH MN, secuencia Genebank MI7449, e incluye el gen vif. El gen vpr no está incluido. El plásmido resultante basado en pREP4, pLA-101, se conserva extracromosómicamente y produce GAG55, la transcriptasa inversa, la proteasa y las proteínas de la integrasa.
Ejemplo 7
La siguiente construcción, a la que se hace referencia en la presente memoria como pGAGPOL.rev, es útil para expresar los genes gag/pol de VIH.
El plásmido incluye un gen de resistencia a la kanamicina y un origen pBR322 de replicación del ADN. Las secuencias que se proporcionan para la regulación de la transcripción, incluyen: un promotor del citomegalovirus; un potenciador del virus del sarcoma de Rous; y una señal de poliadenilación de SV40. Las secuencias del VIH-1 que se incluyen en pGAGPOL.rev incluyen una secuencia que codifica p17, p24, y p15 del marco abierto de lectura gag; una secuencia que codifica la proteasa, una secuencia que codifica la transcriptasa inversa que contiene una pequeña deleción y una secuencia que codifica el extremo amino inactivo de la integrasa del marco abierto de lectura de pol; y una secuencia que codifica rev. Cada una de las secuencias del VIH se derivan de la cepa HXB2 de VIH-1.
Varias características de seguridad se incluyen en pGAGPOL.rev. Incluyen la utilización del promotor CMV y de un sitio no retrovírico poly(A). Además, la deleción de la secuencia \Psi limita la capacidad para empaquetar al ARN vírico. Además, mutaciones múltiples de la transcriptasa inversa producen un producto enzimáticamente inactivo. Además, una gran deleción de la integrasa produce un producto inactivo y un marcador de la resistencia a la kanamicina se utiliza para estabilizar los transformantes bacterianos.
El plásmido pGAGPOL.rev se construye de la siguiente forma:
Etapa 1. Se utiliza un subclón de parte del genoma de VIH-1 (HXB2) que es clonado en Bluescript (Stratagene). El subclon de VIH-1 contiene el 5'LTR completo y el resto del genoma del VIH-1 hasta el nucleótido 5795 (numeración de Genebank). Las secuencias del VIH-1 se obtienen a partir del plásmido HXB2D (Depósito del SIDA).
Etapa 2. Parte PCR del gag del marco abierto de lectura del plásmido HXB2D (Depósito del SIDA). Se corta el fragmento PCR con NotI y SpeI y se une con el subclón descrito anteriormente limitado con NotI y SpeI.
Etapa 3. Unión gag/pol de PCR y parte de las secuencias codificantes de pol del plásmido HXB2D (Depósito del SIDA) con los cebadores SEC ID nº: 3 y SEC ID nº: 4. Se corta el producto PCR con ClaI y se une conjuntamente. Se cortan los fragmentos unidos con BclI y SalI y se unen con el plásmido de la Etapa 2 digerido con BclI y SalI.
Etapa 4. Se corta el plásmido de la Etapa 3 con BspMI y EcoRI y se vuelve a unir con adaptadores formados hibridizando los engarces SEC ID nº: 5 y SEC ID nº: 6.
Etapa 5. Se corta el plásmido de la Etapa 4 con NotI y SalI y se une con el plásmido de cualquiera de los apartados 4a o 4b en la descripción de la construcción del plásmido pENV (a continuación). Asimismo, se corta con NotI y SalI.
Etapa 6. El plásmido de la Etapa 5 se limita con SalI y MluI y se une con el producto PCR obtenido mediante PCR de rev con los cebadores SEC ID nº: 7 y SEC ID nº: 8.
Etapa 7: Se corta el plásmido de la Etapa 6 con NotI y se une con el producto obtenido mediante PCR del elemento receptivo rev en el plásmido HXB2D (Depósito del SIDA) con los cebadores SEC ID nº: 9 y SEC ID nº: 10.
Las Etapas 6 y 7 son opcionales.
Ejemplo 8
La construcción siguiente, a la que se hace referencia en la presente memoria como pENV, es útil para expresar los genes VIH env.
El plásmido incluye un gen de resistencia a la kanamicina y un origen pBR322 de replicación del ADN. Las secuencias que se proporcionan para la regulación de la transcripción, incluyen: un promotor del citomegalovirus; un potenciador del virus del sarcoma de Rous; y una señal de poliadenilación de SV40. Las secuencias del VIH-1 que se incluyen en pENV incluyen una secuencia que codifica vpu; una secuencia que codifica rev; una secuencia que codifica gp160; una secuencia que codifica el 50% de nef una secuencia que codifica vif; una secuencia que codifica vpr con una deleción del extremo carboxilo de 13 aminoácidos. Las secuencias vpu, rev, gp160 y nef se derivan de la cepa MN del VIH-1. Las secuencias vif y vpr se derivan de la cepa HXB2 del VIH-1.
Varias características de seguridad se incluyen en pGAGPOL.rev. Incluyen la utilización del promotor CMV y de un sitio no retrovírico poly(A). Además, tat se ha suprimido y una deleción del 50% de nef produce un producto nef inactivo. Además, vif y vpr se sitúan fuera de la secuencia normal y una deleción parcial de vpr asegura un producto vpr inactivo.
El plásmido pENV se construye de la siguiente forma:
Etapa 1. Empieza con pUC18 digerido con HindIII y EcoRI. El fragmento resultante que contiene el origen ColE1 de replicación y el gen laci deberá unirse con el fragmento EcoRI /HindIII del pMAMneoBlue que contiene nuestro potenciador del virus del sarcoma. El plásmido resultante o pMAMneo-Blue de Clontech (Palo Alto, CA), puede digerirse entonces con HindIII y BglI. Utilizando técnicas estándar, se une con el fragmento que contiene el gen kan obtenido mediante PCR del plásmido del bloque de genes (Pharmacia).
Etapa 2. Si se utiliza pMAMneoBlue como plásmido inicial, se digiere con MluI y EcoRI, se rellenan los extremos con el fragmento Klenow de la polimerasa I y se vuelve a unir.
Etapa 3. Entonces, cualquiera de los plásmidos derivados de pMAneo-Blue o de pUC18, se digieren con HindIII y se unen con el sitio polyA de SV40, empalmando rápidamente la región obtenida de pCEP4 mediante PCR (Invitrogen, San Diego, CA), con los cebadores SEC ID nº: 11 y SEC ID nº: 12.
Etapa 4a. Se digiere con BamHI y se une con el promotor CMV obtenido mediante PCR de pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA), con los cebadores SEC ID nº: 13 y SEC ID nº: 14.
Etapa 4b. Se digiere con BamHI y se une con el MoMLV LTR obtenido mediante PCR, con los cebadores SEC ID nº: 15 y SEC ID nº: 16.
Etapa 5. Se digiere con NotI y MluI y se une con la región codificante GP160 obtenida mediante PCR de pMN-ST1, con los cebadores SEC ID nº: 17 y SEC ID nº: 18.
Etapa 6. Se digiere con MluI y se une con las secuencias que codifican completamente vif y vpr con una deleción en el extremo carboxilo de 13 aminoácidos mediante PCR del plásmido HXB2D (Depósito del SIDA), con los cebadores SEC ID nº: 19 y SEC ID n: 20.
Ejemplo 9
Se describe un procedimiento para inmunizar a un individuo contra el VIH administrando un único inóculo. Esta inoculación incluye un constructo genético que comprende por lo menos, uno, o preferentemente dos, más preferentemente más que dos, o una pluralidad de genes del virus VIH o la totalidad de los genes estructurales. Sin embargo, el inóculo no contiene un complemento completo de todos los genes del VIH. Si una célula única se provee con un complemento completo de los virus del VIH, es posible que dentro de la célula pueda formarse un virus infeccioso completo. De acuerdo con esto, un constructo genético no se provee con dicho complemento completo de genes. Como precaución de seguridad, uno o más genes esenciales pueden eliminarse o alterarse intencionadamente para asegurarse posteriormente de que no pueda formarse una partícula vírica infecciosa.
Pueden proporcionarse, por lo menos, partes de uno, dos o de todos los genes estructurales del VIH. Los genes estructurales del VIH está formados por gag, pol, y env. Partes de, por lo menos, uno de estos tres genes son proporcionadas a un constructo genético. De acuerdo con esto, en algunos ejemplos, una parte, por lo menos, de cada gag y pol se proporcionan a un constructo genético; en algunos ejemplos, una parte, por lo menos, de env es proporcionada a un constructo genético; en algunos ejemplos, por lo menos, una parte de gag se proporciona a un constructo genético; en algunos ejemplos, por lo menos, una parte de cada uno de los pol y env se proporcionan a un constructo genético; en algunos ejemplos, una parte, por lo menos, de cada gag y env son proporcionados a un constructo genético; en algunos ejemplos, una parte, por lo menos, de pol es proporcionada a un constructo genético. Opcionalmente, se proporciona el gen entero. Opcionalmente, en cualquiera de estos constructos, los genes reguladores del VIH pueden encontrarse asimismo, Los genes reguladores del VIH son: vpr, vif, vpu, nef, tat y rev.
Ejemplo 10
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "unidad de expresión" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor unido funcionalmente a una secuencia codificante unida funcionalmente a una señal de poliadenilación. La secuencia codificante puede codificar un o más proteínas o sus fragmentos.
Una unidad de expresión puede estar en el interior de un plásmido.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "unidad de expresión del VIH" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor a unido funcionalmente a una secuencia codificante unida funcionalmente a una señal de poliadenilación, en la que la secuencia codificante codifica un péptido que comprende un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a un epítopo que se encuentra en una proteína del VIH. "Epítopo sustancialmente similar" se refiere a un epítopo que posee una estructura que no es idéntica a un epítopo de una proteína del VIH, pero que sin embargo da lugar a una respuesta inmune humoral o celular que muestra una reacción cruzada con una proteína del VIH. La unidad de expresión del VIH puede comprender una secuencia codificante que codifica una o más proteínas del VIH o de sus fragmentos.
Una unidad de expresión del VIH puede estar dentro de un plásmido.
En algunos ejemplos, se provee de un constructo genético único que posee una única unidad de expresión del VIH que contiene secuencias de ADN que codifican una o más proteínas del VIH, o sus fragmentos. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "constructo único de una única unidad de expresión del VIH" se refiere a un constructo genético único que contiene una única unidad de expresión del VIH. Un constructo único de de la unidad de expresión del VIH puede estar en forma de un plásmido.
En algunos ejemplos, se provee de un constructo genético único que posee más de una unidad de expresión del VIH, en el que cada una contiene secuencias ADN que codifican una o más proteínas del VIH o de sus fragmentos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "constructo genético" múltiple de la unidad de expresión del VIH, se refiere a un plásmido único que contiene más de una unidad de expresión del VIH.
Un constructo múltiple de la unidad de expresión del VIH puede estar en forma de un plásmido.
En algunos ejemplos, se provee de un constructo genético único que posee dos unidades de expresión del VIH, en el que cada una posee secuencias de ADN que codifican una o más proteínas del VIH o sus fragmentos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "constructo genético de dos unidades de expresión del VIH" se refiere a un único plásmido que contiene dos unidades de expresión del VIH, es decir, un constructo genético múltiple de unidades de expresión del VIH que contiene dos unidades genéticas de expresión de la unidad de expresión del VIH. En un constructo genético de dos unidades de expresión del VIH, es preferible que una unidad de expresión del VIH opere en la dirección opuesta de la otra unidad de expresión del VIH. Un constructo de dos unidades de expresión del VIH puede estar en forma de un plásmido.
En algunos ejemplos, se provee de una vacuna genética del VIH que contiene un único constructo genético. El constructo genético único puede ser un constructo genético de una única unidad de expresión del VIH, un constructo genético de dos unidades de expresión del VIH o un constructo genético de múltiples unidades de expresión del VIH que contiene más de dos unidades de expresión del VIH.
Se prefiere que los constructos genéticos no contengan ciertas secuencias del VIH, particularmente, las que juegan un papel en la integración del genoma del VIH en el material cromosómico de las células en las que se introducen. Se prefiere que los constructos genéticos no contengan LTRs del VIH. De modo similar, se prefiere que los constructos genéticos no contengan un sitio psi del VIH. Además, se prefiere que el gen de la transcriptasa inversa se suprima y que también lo haga el de la integrasa. Las deleciones incluyen la deleción de sólo algunos de los codones, o el reemplazo de algunos de ellos para suprimir esencialmente el gen. Por ejemplo, el codón de iniciación puede suprimirse o cambiarse, o cambiar el marco de lectura, para dar lugar a una secuencia nucleótida que codifica un gen incompleto y que no funciona.
Se prefiere asimismo que los constructos genéticos no contengan un gen tat capaz de transcribirse a partir del VIH. El gen tat, que se solapa con el gen rev, puede suprimirse totalmente sustituyendo los codones que codifican rev con otros codones que codifican los mismos aminoácidos que rev pero que no codifican los aminoácidos requeridos por tat en el marco de lectura en el que tat es codificado. Alternativamente, sólo algunos de los codones se activan para cambiar, es decir, esencialmente suprimir el codón de iniciación para tat, y/o cambiar, es decir, suprimir esencialmente, codones suficientes para dar lugar a una secuencia nucleótida que codifica un tat incompleto y no funcionan-
te.
El constructo genético puede comprender secuencias codificantes que codifican péptidos que tienen, por lo menos, un epítopo idéntico al o sustancialmente similar a un epítopo de las proteínas gag, pol, env, o rev del VIH. El constructo genético puede comprender secuencias codificantes que codifican, por lo menos, una de las proteínas gag, pol, env, o rev del VIH o de sus fragmentos. El constructo genético puede comprender secuencias codificantes que codifican péptidos que tienen más de un epítopo que es idéntico a o sustancialmente similar a un epítopo de las proteínas gag, pol, env, o rev del VIH.
El constructo genético puede comprender secuencias codificantes que codifican más de una de las proteínas gag, pol, env, o rev del VIH o de sus fragmentos.
El constructo genético puede comprender secuencias codificantes que codifiquen péptidos que tengan, por lo menos, un epítopo idéntico a o sustancialmente similar a un epítopo de las proteínas vif, vpr, vpu, o nef del VIH. El constructo genético puede comprender secuencias codificantes que codifican, por lo menos, una de las proteínas vif, vpr, vpu, o nef del VIH o sus fragmentos.
Un constructo genético de una única unidad de expresión del VIH, puede comprender regiones codificantes para uno o más péptidos que comparten por lo menos un epítopo con una proteína del VIH o un fragmento suyo en una unidad única de expresión, bajo el control regulador de una señal de poliadenilación y un único promotor. Los constructos genéticos pueden codificar más de una proteína del VIH o de fragmentos suyos. El promotor puede ser cualquier promotor funcional en una célula humana. El promotor puede ser un promotor SV40 o un promotor CMV, preferentemente un promotor CMV temprano inmediato. La señal de poliadenilación puede ser cualquier señal funcional de poliadenilación en una célula humana. La señal de poliadenilación puede ser una señal de poliadenilación SV40, preferentemente, la señal menor de poliadenilación del SV40. Si se proporciona más de una región codificante en una única unidad de expresión, pueden encontrarse inmediatamente adyacentes entre ellas o separadas por regiones no codificantes. Para poder expresarse apropiadamente, una región codificante debe tener un codón de identificación y un codón de finalización.
Un constructo genético de dos unidades de expresión del VIH puede comprender regiones codificantes para uno o más péptidos que comparten por lo menos un epítopo con una proteína del VIH o un fragmento suyo en cada una de las dos unidades de expresión. Cada unidad de expresión está bajo el control regulador del promotor único y de la señal de poliadenilación.
Los constructos genéticos pueden codificar más de una proteína del VIH o de sus fragmentos. Las secuencias nucleótidas que codifican gag y pol pueden encontrarse en una unidad de expresión y las secuencias nucleótidas que codifican env y rev pueden encontrarse en la otra. El promotor puede ser cualquier promotor funcional en una célula humana. El promotor puede ser un promotor SV40 o un promotor CMV, preferentemente un promotor CMV temprano inmediato. La señal de poliadenilación puede ser cualquier señal funcional de poliadenilación en una célula humana. La señal de poliadenilación puede ser una señal de poliadenilación de SV40, preferentemente de una señal menor de poliadenilación del SV40. Si se proporciona más que una región codificante en una unidad de expresión, pueden encontrarse inmediatamente adyacentes entre ellas o separadas por regiones no codificantes. Para poder expresarse apropiadamente, una región codificante debe tener un codón de identificación y un codón de finalización.
El epítopo MHC de tipo II de reacción cruzada en env puede ser suprimido y reemplazado con la región análoga del VIH II.
Cuando un constructo genético contiene gag y/o pol, es generalmente importante que rev esté asimismo presente. Además de rev, puede proporcionarse un elemento de respuesta de rev con gag y pol para un aumento en la expresión de aquellos genes.
Cuando se producen los constructos genéticos, el gen env que se utiliza en el plásmido 1 puede derivarse de los aislamientos MN o de tipo MN, incluyendo a los aislamientos clínicos que se parezcan a MN, por ejemplo, los aislamientos clínicos que no inducen sincicios, por ejemplo, los aislamientos clínicos que son macrófagos trópicos a partir del estadio temprano.
Pueden producirse proteínas múltiples a partir de una única unidad de expresión mediante corte y empalme alternativo. Las señales de corte y empalme son proporcionadas para permitir el corte y empalme alternativo que produce distintos mensajes que codifican distintas proteínas.
Ejemplo 11
La figura 1 muestra cuatro esqueletos, A, B, C y D. La figura 2 muestra 4 inserciones, 1, 2, 3 y 4. La inserción 1 soporta la expresión de gag y pol; el elemento de respuesta rev se clonó de forma que se conservara el aceptor de corte y empalme del VIH. La inserción 2 es similar a la inserción 1, pues soporta asimismo la expresión de gag y pol, excepto porque el elemento de respuesta rev: se clonó sin conservar el aceptor de corte y empalme del VIH. La inserción 3 soporta la expresión de gag y pol, incluye una deleción del gen de la integrasa y no incluye la presencia del elemento de respuesta rev de actuación cis. La inserción 4 soporta la expresión de rev, vpu y env. El env puede tener el epítopo MHC de tipo II de reacción cruzada alterado para: eliminar la reacción cruzada y el bucle V3 puede alterarse para eliminar la posibilidad de formación de sincicio.
El esqueleto A puede utilizarse con la inserción 1. Dichos constructos contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pA1ori+ es el esqueleto A con la inserción 1 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pA1ori- es el esqueleto A con la inserción 1 sin el origen de replicación del SV40. Además, sea pA1ori+ o pA1ori- pueden incluir integrasa, dando lugar a pA1ori+int+ y a pA1ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pA1ori+, pA1ori-, pA1ori+int+ y pA1ori-int+ pueden modificarse ulteriormente llevando a cabo una deleción funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), dando lugar a pA1ori+RT-, pA1ori-RT-, pA1ori+int+RT- y pA1ori-int+RT-, respectivamente.
El esqueleto A puede utilizarse con la inserción 2. Dichos constructos llevan opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pA2ori+ es el esqueleto A con la inserción 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pA2ori- es el esqueleto A con la inserción 1 sin el origen de replicación de SV40. Además, tanto pA2ori+ como pA2ori- pueden incluir integrasa, dando lugar a pA2ori+int+ y pA2ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pA2ori+, pA2ori-, pA2ori+int+ y pA2ori-int+ pueden modificarse ulteriormente llevando a cabo una deleción funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), dando lugar a pA2ori+RT-, pA2ori-RT-, pA2ori+int+RT- y pA2ori-int+RT-, respectivamente.
El esqueleto B puede utilizarse con la inserción 1. Dichos constructos contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pB1ori+ es el esqueleto B con la inserción 1 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pB1ori- es el esqueleto B con la inserción 1 sin el origen de replicación del SV40. Además, se a pB1ori+ o pB1ori- pueden incluir integrasa, dando lugar a pB1ori+int+ y a pB1ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pB1ori+, pB1ori-, pB1ori+int+ y pB1ori-int+ pueden modificarse ulteriormente llevando a cabo una deleción funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), dando lugar a pB1ori+RT-, pB1ori-RT-, pB1ori+int+RT- y pB1ori-int+RT-, respectivamente.
El esqueleto B puede utilizarse con la inserción 2. Dichos constructos llevan opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pB2ori+ es el esqueleto B con la inserción 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pB2ori- es el esqueleto B con la inserción 1 sin el origen de replicación de SV40. Además, tanto pB2ori+ como pB2ori- pueden incluir integrasa, dando lugar a pB2ori+int+ y pB2ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pB2ori+, pB2ori-, pB2ori+int+ y pB2ori-int+ pueden modificarse ulteriormente llevando a cabo una deleción funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), dando lugar a pB2ori+RT-, pB2ori-RT-, pB2ori+int+RT- y pB2ori-int+RT-, respectivamente.
El esqueleto A menos rev puede utilizarse con la inserción 3. Dichos constructos llevan opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pA/r-3ori+ es el esqueleto A con la inserción 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pA/r-3ori- es el esqueleto A menos rev con la inserción 3 sin el origen de replicación de SV40. Además, tanto pA/r-3ori+ como pA/r-3ori- pueden incluir integrasa, dando lugar a pA/r-3ori+int+ y pA/r-3ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pA/r-3ori+, pA/r-3ori-, pA/r-3ori+int+ y pA/r-3ori-int+ pueden modificarse ulteriormente llevando a cabo una deleción funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), dando lugar a pA/r-3ori+RT-, pA/r-3ori-RT-, pA/r-3ori+int+RT- y pA/r-3ori-int+RT-, respectivamente.
El esqueleto C puede utilizarse con la inserción 1. Dichos constructos contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pC1ori+ es el esqueleto C con la inserción 1 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pC1ori- es el esqueleto C con la inserción 2 sin el origen de replicación del SV40. Además, sean pC1ori+ o pC1ori- pueden incluir integrasa, dando lugar a pC1ori+int+ y a pC1ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pC1ori+, pC1ori-, pC1ori+int+ y pC1ori-int+ pueden modificarse ulteriormente llevando a cabo una deleción funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), dando lugar a pC1ori+RT-, pC1ori-RT-, pC1ori+int+RT- y pC1ori-int+RT-, respectivamente.
El esqueleto C puede utilizarse con la inserción 2. Dichos constructos llevan opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pC2ori+ es el esqueleto C con la inserción 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pC2ori- es el esqueleto C con la inserción 1 sin el origen de replicación de SV40. Además, tanto pC2ori+ como pC2ori- pueden incluir integrasa, dando lugar a pC2ori+int+ y pC2ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pC2ori+, pC2ori-, pC2ori+int+ y pC2ori-int+ pueden modificarse ulteriormente llevando a cabo una deleción funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), dando lugar a pC2ori+RT-, pC2ori-RT-, pC2ori+int+RT- y pC2ori-int+RT-, respectivamente.
El esqueleto C puede utilizarse con la inserción 3. Dichos constructos llevan opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pC3ori+ es el esqueleto C con la inserción 3 sin el origen de replicación de SV40. El plásmido pC3ori- es la estructura C con la inserción 3 sin el origen de replicación SV40. Además, tanto pC3ori+ como pC3ori- pueden incluir integrasa, dando lugar a pC3ori+int+ y pC3ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pC3ori+, pC3ori-, pC3ori+int+ y pC3ori-int+ pueden modificarse ulteriormente llevando a cabo una deleción funcional del gen de la transcriptasa inversa (RT), dando lugar a pC3ori+RT-, pC3ori-RT-, pC3ori+int+RT- y pC3ori-int+RT-, respectivamente.
El esqueleto D puede utilizarse con la inserción 4. Dichos constructos llevan opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pD4ori+ es el esqueleto D con la inserción 4 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pD4ori- es el esqueleto D con la inserción 4 sin el origen de replicación de SV40.
Ejemplo 12
Puede proveerse una sola vacuna genética inoculante única/unidad de expresión, que comprende un constructo genético que incluye una secuencia codificante que codifica un péptido que tiene por lo menos un epítopo que es idéntico a o sustancialmente similar a los epítopos de las proteínas del VIH. La secuencia codificante está bajo el control regulador del promotor temprano inmediato de CMV y de la señal menor de poliadenilación del SV40.
Puede proveerse una sola vacuna genética inoculante única/unidad de expresión, que comprende un constructo genético que incluye, por lo menos, una proteína del VIH o un fragmento suyo. La secuencia codificante está bajo el control regulador del promotor temprano inmediato de CMV y de la señal menor de poliadenilación del SV40. La proteína del VIH es seleccionada de entre el grupo constituido por gag, pol, env y rev.
Puede proveerse la vacuna genética que comprende un constructo genético que incluye una secuencia codificante que codifica, por lo menos, dos proteínas del VIH, o fragmentos suyos, seleccionadas de entre el grupo constituido por gag, pol, env y rev o fragmentos suyos. Puede proveerse la vacuna genética que comprende un constructo genético que incluye una secuencia codificante que codifica, por lo menos, tres proteínas del VIH, o fragmentos suyos, seleccionadas de entre el grupo constituido por gag, pol, env y rev o fragmentos suyos. Puede proveerse la vacuna genética que comprende un constructo genético que incluye una secuencia codificante que codifica gag, pol, env y rev o fragmentos suyos.
Puede proveerse una sola vacuna genética inoculante única/unidad de expresión dual, que comprende un constructo genético que incluye dos unidades de expresión, cada una de las cuales comprende una secuencia codificante que codifica un péptido que tiene por lo menos un epítopo que es idéntico a o sustancialmente similar a los epítopos de las proteínas del VIH. La secuencia codificante está bajo el control regulador del promotor temprano inmediato de CMV y de la señal menor de poliadenilación del SV40. Las dos unidades de expresión están codificadas entre ellas en direcciones opuestas.
Puede proveerse una sola vacuna genética inoculante única/unidad de expresión dual, que comprende un constructo genético que incluye dos unidades de expresión, cada una de las cuales comprende una secuencia codificante que codifica por lo menos una proteína del VIH o uno de sus fragmentos. Cada unidad de expresión comprende una secuencia codificante que está bajo el control regulador del promotor temprano inmediato de CMV y de la señal menor de poliadenilación del SV40. La proteína del VIH es seleccionada de entre el grupo constituido por gag, pol, env, y rev.
Puede proveerse la vacuna genética que comprende un constructo genético que incluye dos unidades de expresión, una de las cuales, por lo menos, comprende una secuencia codificante que codifica por lo menos dos proteínas del VIH o sus fragmentos, seleccionadas de entre el grupo constituido por gag, pol, env, rev o de fragmentos suyos, y la otra comprende, por lo menos una proteína del VIH o fragmentos suyos, seleccionadas de entre el grupo constituido por gag, pol, env, y rev y fragmentos suyos.
Puede proveerse la vacuna genética que comprende un constructo genético que incluye dos unidades de expresión, una de las cuales, por lo menos, comprende una secuencia codificante que codifica por lo menos tres proteínas del VIH o sus fragmentos, seleccionadas de entre el grupo constituido por gag, pol, env, rev o fragmentos suyos, y la otra comprende, por lo menos, una proteína del VIH o fragmentos suyos, seleccionados de entre el grupo constituido por gag, pol, env y rev o fragmentos suyos.
Puede proveerse la vacuna genética que comprende un constructo genético que incluye dos unidades de expresión e incluye una secuencia codificante que codifica gag, pol, env y rev o fragmentos suyos.
Ejemplo 13
Un constructo genético, el plásmido pCMN160\Delta16, se preparó para utilizar en un equipo o composición farmacéutica antiVIH. pCMN160\Delta16 se construyó de la forma siguiente:
Etapa 1: Los cebadores SEC ID nº 23 y SEC ID nº 22 se utilizaron para obtener un fragmento PCR a partir del ADN genómico de VIH/MN.
Etapa 2: Los cebadores SEC ID nº 21 y SEC ID nº 24 se utilizaron para obtener un fragmento PCR a partir del ADN genómico de VIH/MN.
Etapa 3: Los cebadores SEC ID nº 23 y SEC ID nº 24 se combinaron con 2 \mul de material reactivo de las Etapa s 1 y 2.
Etapa 4: El producto de reacción de la Etapa 3 se seccionó con NotI y MluI y se insertó en el esqueleto A que se ha descrito en el Ejemplo 11, seccionado con NotI y MluI.
\newpage
Se forma de este modo el plásmido pCMN160\Delta16, que contiene como inserción en el esqueleto A una región codificante que codifica la proteína ENV de la cepa MN con la región rev y la mitad de nef, teniendo la región HLA-DB cambios al VIH-2.
Ejemplo 14
El plásmido pGAGPOL.rev2 se preparó de la siguiente forma: En primer lugar, se preparó el esqueleto. Entonces, se generó una inserción con gag y pol de VIH, insertándose en el esqueleto.
El esqueleto se preparó de la siguiente manera:
Etapa 1. Digestión de pMAMneo (Clonetech) con Bgl1. Rellenado con el fragmento Klenow de la Polimerasa I. Sección con HindIII. Purificación en gel del fragmento de 1763 pares de bases.
Etapa 2. Amplificar el gen Kan® a partir del plásmido pJ4\Omegakan^{+} (gen de resistencia a la kanamicina obtenido de Pharmacia Inc., clonado en pJ4\Omega obtenido como obsequio del Imperial Cancer Research Fund UK; pJ4\Omega fue construido originariamente e informado por Morgenstern, J.P. y H.Land, Nucleic. Acids. Res. 18 (4):1068, con los oligonucleótidos SEC ID nº:25 y SEC ID nº:26. Se redondean los extremos del producto PCR. Se secciona con HindIII. Se purifica en gel el fragmento PCR.
Etapa 3. Se une el esqueleto del vector generado a partir de pMAMneo y que se describe en la Etapa nº 1, con el producto PCR que codifica el gen Kan® y que se describe en la Etapa nº 2. Se aísla el plásmido que contiene el gen Kan® y el origen de replicación bacteriano.
Etapa 4. Se digiere el plásmido resultante con MluI, y se rellena con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. Se une con el engarce SacII (New England Biolabs).
Etapa 5. Se digiere el plásmido obtenido en la Etapa 4 con AseI y SspI.
Etapa 6. Se separa el fragmento PCR del gen Kan® del plásmido descrito en la Etapa 3, utilizando los cebadores SEC ID nº: 27 y SEC ID nº: 28. Se secciona el producto PCR con AseI y SspI.
Etapa 7. Se une el fragmento más voluminoso obtenido en la Etapa 5 con el producto PCR obtenido en la Etapa 6.
Etapa 8. Se secciona el producto de unión/plásmido obtenido en la Etapa 7 con HindIII. Se redondean los extremos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I.
Etapa 9. Se secciona pCEP4 (Invitrogen) con SalI para liberar un fragmento de ADN que contiene el promotor CMV, poliengarce, y el sitio poly A de SV40. Se purifica este fragmento y se redondean los extremos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I.
Etapa 10. Se une el plásmido obtenido en la Etapa 8 y el fragmento obtenido en la Etapa 9. Se aísla el plásmido que contiene el origen de replicación bacteriano, el gen Kan®, el potenciador RSV, el promotor CMV, el poliengarce, y el sitio poly A del SV40.
Etapa 11. Se secciona el plásmido obtenido en la Etapa 10 con BamHI y NheI.
Etapa 12. Se hibridizan los oligonucleótidos SEC ID nº: 29 con SEC ID nº: 30.
Etapa 13. Se une el plásmido obtenido en la Etapa 10 con los oligonucleótidos hibridizados obtenidos en la Etapa 12. Se aísla el plásmido que contiene el adaptador contenido en la Etapa 12.
Etapa 14. Se digiere el plásmido obtenido en la Etapa 13 con SalI y MluI.
Etapa 15. Se amplifica mediante PCR el marco abierto de lectura rev, utilizando BBG35 (RD Systems Inc. Minneapolis, MN; que contiene la región codificante para rev de la cepa HX3B del VIH en pUC19) como matriz, y los cebadores SEC ID nº: 31 y SEC ID nº 32. Se digiere el producto PCR con SalI y MluI.
Etapa 16. Se une el plásmido obtenido en la Etapa 14 con el producto PCR producido en la Etapa 15. Se aísla el plásmido que contiene la región codificante rev.
Preparación de la inserción gag/pol
Etapa 1. Un subclón de parte del genoma de VIH-1 (HXB2) se clonó en Bluescript (Stratagene). El subclón de VIH-1 contiene el 5'LTR completo y el resto del genoma de VIH-1 hasta el nucleótido 5795 (numeración de Genbank) que se clona en los sitios XbaI y SalI de Bluescript). Las secuencias de VIH-1 se obtienen del plásmido HXB2D (Depósito del SIDA).
Etapa 2. Parte PCR de la región codificante gag del marco abierto de lectura del plásmido descrito en la Etapa 1 (el subclón de parte del genoma del VIH-1 HXB2 que se clona en Bluescript) utilizando los cebadores SEC ID nº: 33 y SEC ID nº: 34.
Etapa 3: Se digiere el plásmido que se describe en la Etapa 1 (el subclón de parte del genoma de VIH-1 HXB2 que se clona en Bluescript), con EcoRI. Se purifica el plásmido que contiene el esqueleto de pBluescript, el LTR del extremo 5' de VIH-1, la región codificante gag y parte de la región codificante pol, y se vuelve a unir.
Etapa 4. Se secciona el plásmido obtenido en la Etapa 3 con NotI y SpeI y se une con el fragmento PCR que se describe en la Etapa 2 después de que se digiere con NotI y SpeI. Se aísla el plásmido que contiene el fragmento PCR en vez del fragmento original NotI / SpeI que contiene el LTR del extremo 5' del VIH-1.
Etapa 5. Se digiere el plásmido obtenido en la Etapa 4 con EcoRI y SalI.
Etapa 6. Se hibridizan los oligonucleótidos SEC ID nº: 35 con SEC ID nº: 36.
Etapa 7. Se une el plásmido obtenido en la Etapa 5 con el adaptador obtenido en la Etapa 6. Se aísla el plásmido que contiene el adaptador clonado en los sitios EcoRI / SalI.
Etapa 8. Se digiere el plásmido obtenido en la Etapa 7 con NdeI y EcoRI.
Etapa 9. Amplificación mediante PCR del Elemento Respuesta Rev (RRE) a partir de un plásmido que contiene la secuencia RRE de la cepa HXB2 del VIH-1, utilizando los cebadores SEC ID nº: 37 y SEC ID nº: 38. Se digiere el producto PCR con NdeI y EcoRI.
Etapa 10. Se une el plásmido obtenido en la Etapa 8 con el producto PCR obtenido en la Etapa 9. Se aísla el plásmido que contiene la inserción con la secuencia RRE.
Etapa 11. Se digiere el plásmido obtenido en la Etapa 10 con NotI y SalI, y se aísla el fragmento que contiene la región codificante gag, la región codificante pol modificada, y la secuencia RRE.
Etapa 12. Se digiere el plásmido obtenido en la Etapa 16 del protocolo para preparar el esqueleto que se describe anteriormente con NotI y SalI.
Etapa 13. Se une el plásmido obtenido en la Etapa 12 con la inserción obtenida en la Etapa 11. Se aíslan plásmidos que contienen la inserción que contiene la región codificante gag, la región codificante pol modificada, y la secuencia RRE.
Etapa 14. Se digiere el plásmido obtenido en la Etapa 13 con XbaI y NheI, redondeando los extremos y volviendo a unir. Se aísla el plásmido al que le falta el sitio KpnI que se encuentra entre los sitios XbaI y NheI en el plásmido obtenido en la Etapa 13.
Etapa 15. Se digiere el plásmido obtenido en la Etapa 14 con KpnI y se aísla el fragmento más voluminoso.
Etapa 16. Se hibridizan los oligonucleótidos SEC ID nº 39 y SEC ID nº: 40.
Etapa 17. Se une el fragmento del plásmido purificado obtenido en la Etapa 15 con el adaptador obtenido en la Etapa 16. Se aísla el plásmido que contiene el adaptador insertado en el sitio KpnI del plásmido obtenido en la Etapa 15.
Ejemplo 15 Inmunización genética con genes de proteínas reguladoras
Parte de la dificultad de combatir el VIH surge de la extraordinaria variabilidad del virus y de su capacidad de mutar rápidamente dando lugar a formas nuevas. No sólo existe variación sustancial de las secuencias de proteínas entre los aislados de VIH que se encuentran en la población humana en global, sino que el virus muta con tanta rapidez que todos los individuos infectados por VIH de hecho transportan varias microvariantes relacionadas del VIH. Estos aislados de VIH muestran diferencias de eficiencia de replicación, tropismo, susceptibilidad a la neutralización y resistencia a fármacos. A medida que aparecen mutantes resistentes a fármacos, van reduciéndose los beneficios de la terapia farmacológica. Con el AZT, la resistencia a fármacos típicamente surge en el primer año de terapia. Esta generación constante de mutantes de escape podría desempeñar un papel en la capacidad del VIH de desbordar finalmente las defensas del huésped tras un periodo prolongado en el que el virus aparentemente se encuentra bajo control.
Se ha informado de esta deriva mutacional en diversas regiones de la glucoproteína de cubierta gp120, incluyendo el dominio neutralizante principal del asa V3, así como las proteínas nucleares del VIH. Las proteínas reguladoras del VIH se encuentran mucho más altamente conservadas que las proteínas estructurales y también muestran menos deriva mutacional a lo largo del tiempo. Por lo tanto, las proteínas reguladoras presentan dianas atractivas para el ataque antivírico.
El VIH muestra una regulación temporal notable de la expresión de las proteínas reguladoras frente a las estructurales. En la Etapa temprana de la replicación vírica, predominan los ARNm codificantes de las proteínas reguladoras Tat, Rev y Nef, mientras que en la Etapa tardía, es mayor la expresión de los ARNm que codifican proteínas estructurales, incluyendo los precursores Gag, Pol y Env, y muchas proteínas accesorias. Este cambio entre las Etapa s temprana y tardía se desencadena cuando la proteína Rev alcanza un nivel particular. La predominancia de Tat, Rev y Nef temprano en el ciclo de replicación vírico también hace que estas proteínas resulten dianas favorables para el ataque antivírico. Esto resulta especialmente cierto para tat y rev, que desempeñan un papel absolutamente esencial en la regulación transcripcional y post-traduccional de la expresión génica del VIH, y predominan temprano en el ciclo de replicación vírica, antes de la transcripción de las proteínas estructurales víricas y la producción de partículas víricas infectivas.
En contraste con tat y rev, que claramente desempeñan papeles esenciales en la replicación del VIH, en ocasiones se hace referencia a otras proteínas reguladoras, tales como nef, vpr, vif y vpu, como proteínas "accesorias". Sus funciones se comprenden menos, y el grado en que la replicación vírica resulta atenuado por la pérdida de una función particular varía considerablemente y puede depender de la célula huésped que resulta infectada. Sin embargo, la elevada conservación de estas funciones entre aislados de VIH ampliamente diversos, así como otros virus de inmunodeficiencia en primates, sugiere que estas funciones "accesorias" son importantes en el proceso natural de infección (ver, en general, Terwilliger, E.F., AIDS Research Reviews 2:3-27, 1992; W.C. Koff, F. Wong-Staal y R.C. Kennedy, editores, New York: Marcel Dekker, Inc.). De hecho, los virus recombinantes de primate con deleciones en vpr, nef o vif no son patogénicos in vivo, demostrando además la importancia de estos genes accesorios en el ciclo vital
vírico.
Hay evidencia de que podrían conseguirse algunas respuestas inmunológicas protectoras de nivel más elevado contra el VIH presentando unas cuantas proteínas reguladoras y/o enzimáticas seleccionadas, y no el complemento entero de genes de VIH. De acuerdo con ello, una estrategia de inmunización focalizada podría implicar deseablemente la inmunización genética con secuencias codificantes de una o más proteínas reguladoras no estructurales del VIH, incluyendo tat, rev, vpr, nef, vpu o vif. Sólo se ha constatado que vpr se encuentre asociado a las partículas víricas, mientras que otras proteínas reguladoras, incluyendo tat, rev, nef, vif y vpu no se encuentra asociadas al
virión.
En la inmunización genética contra VIH con genes reguladores, se insertan uno o más genes de entre tat, rev, nef, vif y vpu en el esqueleto A, que se describe en el Ejemplo 11. Pueden utilizarse tat y/o rev e insertarse en el esqueleto A que se describe en el Ejemplo 11.
A continuación, en orden decreciente de deseabilidad como dianas se encuentran nef, vpr, vif y vpu. Puede utilizarse más de un gen regulador, incluyendo tat y rev; tat, rev y nef; tat, rev, nef y vpr; tat, rev, nef, vpr y vif; tat, rev, nef, vpr, vif y vpu; así como combinaciones de los mismos; y opcionalmente, genes reguladores adicionales como
tev.
La proteína Tat es un transactivador de la expresión génica dirigida por LTR. Resulta absolutamente esencial para la replicación del VIH. Tat se produce temprano en el ciclo de replicación vírica y se requiere Tat funcional para la expresión de Gag, Pol, Env y Vpr. La forma predominante de Tat es una proteína de 86 aminoácidos derivada de dos ARNm de exones. Los 58 aminoácidos aminoterminales resultan suficientes para la transactivación, aunque con actividad reducida. Tat actúa sobre una secuencia que actúa en cis denominada tar, produciendo un incremento drástico de la expresión génica controlada por LTR. Tat puede actuar en parte a través de la síntesis incrementada de ARN y en parte incrementando la cantidad de proteína sintetizada por cada transcrito de ARN. Hasta recientemente, se creía que Tat actuaba únicamente sobre el LTR del VIH-1. Sin embargo, también se ha informado de la expresión activada por Tat a partir del promotor tardío del virus JC. Tat también podría estimular la proliferación celular como factor exógeno, y podría desempeñar un papel contributivo en la estimulación del crecimiento del sarcoma de Kaposi en individuos infectados por VIH. Debido a estos efectos potencialmente perjudiciales en individuos tanto infectados por VIH como no infectados, los constructos tat preferidos utilizados para la inmunización genética se modifican para expresar únicamente Tat no funcional. Las mutaciones capaces de inactivar Tat o Rev además pueden actuar como mutaciones transdominantes, potencialmente inactivando de esta manera cualquier Tat funcional que se esté produciendo en un individuo infectado por VIH.
Rev es una segunda proteína reguladora del VIH que resulta esencial para la replicación vírica. Es una proteína de 19 kD (116 aminoácidos) que se expresa a partir de dos exones codificantes que se encuentran en una diversidad de ARNm múltiplemente procesados. Se han identificado dos dominios diferentes, una región básica implicada en la unión a transcritos que contienen RRE (elemento de respuesta a Rev) y un dominio de "activación" que induce la exportación nuclear de estos transcritos como resultado de la unión. En el curso de la infección vírica natural, Rev resulta necesaria para la expresión de las proteínas estructurales de VIH Gag, Pol y Env, además de Vpr.
Vpr es una proteína de 15 kD (96 aminoácidos) en la mayoría de las cepas de VIH-1, aunque el marco de lectura abierto de Vpr se encuentra extensivamente truncado en muchas cepas víricas transferidas extensivamente en cultivo celular. El marco de lectura abierto de vpr también se encuentra presente en VIH-2 y en la mayoría de aislados del VIS. Vpr es la primera proteína reguladora retrovírica que se ha descubierto que está asociada con las partículas víricas de VIH. Su presencia en el virión de VIH sugiere que puede presentar una función en algún punto temprano en el ciclo de replicación vírico. Vpr acelera la replicación del VIH, especialmente en Etapas tempranas de la infección. Vpr incrementa en aproximadamente tres veces el nivel de expresión de genes informadores ligados al LTR de VIH. Además, Vpr y Tat aparentemente actúan sinérgicamente con respecto a los genes ligados a LTR. Vpr puede aislarse del suero de individuos infectados por VIH y aparentemente incrementa la capacidad del virus de infectar nuevas células. También se ha descubierto que Vpr inhibe la proliferación celular e induce la diferenciación celular (Levy, D.N. et al., Cell 72:1-20, 1993), un resultado que podría resultar significativo en vista de las descripciones de que los monocitos/macrófagos primarios son infectibles in vitro únicamente mientras experimentan diferenciación (Schuitemaker, H. et al., J. Clin. Invest. 89:1154-1160, (1992)). Incluso las células que no pueden soportar la replicación del VIH podrían resultar desreguladas por los efectos de Vpr. Por ejemplo, Vpr podría ser responsable de la pérdida muscular observada con frecuencia en los pacientes de SIDA. Debido a la actividad potencialmente perjudicial de Vpr, la inmunización genética debe preferentemente llevarse a cabo con un constructo de vpr modificado que exprese una proteína Vpr no funcional.
Nef (también denominada orf 3' en la literatura más antigua) es una proteína de 25 a 27 kD. Se ha sugerido que Nef podría encontrarse implicada en la regulación negativa de los linfocitos T CD4+. Además, Nef podría desempeñar un papel en la señalización celular. Nef es aparentemente importante para el establecimiento de la infección por VIH in vivo. Se cree que las CTL específicas para Nef son importantes en el control de la infección por VIH in vivo.
Vif es una proteína citoplasmática de 23 kD denominada "factor de infectividad vírica". Aunque los virus mutantes defectivos para Vif no se encuentran comprometidos con respecto a la transmisión célula a célula, muestran una marcada reducción de su capacidad para infectar muchas líneas celulares de CD4+. Sin Vif, la gemación e infectividad del virus se encuentran reducidas. En estudios con primates, los mutantes por deleción de Vif muestran una capacidad severamente reducida de establecer infección in vivo. Estos estudios apoyan la existencia de un papel clínico para Vif en la replicación del virus en el huésped.
Vpu es una proteína de 15 a 20 kD (81 aminoácidos). Aunque los virus Vpu(+) y Vpu(-) producen la misma cantidad de proteína vírica, éstas últimas muestran una acumulación intracelular incrementada de proteínas víricas concurrentemente a una reducción del virus presente extracelularmente. Esto sugiere que Vpu podría encontrarse implicada en el ensamblaje y/o liberación de las partículas víricas.
Los retrovirus simples, tales como los virus murinos y aviares, carecen de proteínas análogas a las proteínas reguladoras de VIH-1, VIH-2 y VIS. En estos animales, la infección retrovírica tiende a ser autolimitante, con eliminación del virus y patogenicidad reducida. De manera similar, HTLV-1, que incluye únicamente Tax (que actúa de manera muy similar a Tat y también muestra actividad similar a vpr) y Rex (que actúa de manera muy similar a Rev) resulta eliminado en muchos individuos. La inmunización genética con genes reguladores se considera relevante no sólo para VIH, sino también para virus tales como HBV (producto del gen X) y HCV, y HTLV-1 (Tax) y (Rex). En todos estos virus, los genes reguladores se cree que desempeñan un papel crucial en el ciclo vital del virus y en el establecimiento de la infección.
Ejemplo 16 Construcción del plásmido regulador de VIH-1, pREG
El plásmido pREG se construye por Etapas, y cada intermediario puede someterse a ensayo para la expresión de proteínas antes de continuar con la construcción. Un vector de expresión que da soporte a la expresión de tat y de rev se construye en dos Etapas. En primer lugar, se amplifica a partir de un molde sintético un producto de amplificación que contiene un sitio NheI 5', el sitio donador principal de empalme de VIH-1, la mayoría de la región codificante de tat, la región codificante de la región aminoterminal de la proteína rev y un sitio AvaII. El molde sintético se genera utilizando las secuencias publicadas de la cepa HXB2 de VIH-1 obtenidas de la base de datos GenBank, y se altera para mutar los residuos cisteína en las posiciones 22 y 30 de la proteína tat. Estas mutaciones se ha demostrado que hacen que tat sea no funcional (Kuppuswamy et al., Nucleic Acids Research 17(9):3551-3561,
1989).
El producto de PCR se liga en un vector que se digiere con NheI y AvaII y que contiene un gen de resistencia a la canamicina y un origen de replicación de pBR322. Además, este plásmido contiene un promotor de citomegalovirus, un intensificador del virus del sarcoma de Rous, la región codificante de rev y una señal de poliadenilación de SV40. La secuencia rev presente en el plásmido se deriva del clon provírico de VIH-1 III_{B}. Esto genera un vector de expresión que contiene una región codificante de tat completa aunque mutada, y una región codificante completa de
rev.
Se llevó a cabo la Etapa siguiente para generar un producto de PCR que contenía un sitio AvaII en su extremo 5', una mutación en la posición aminoácida 81 de rev, aproximadamente 30% de la región codificante de rev, aproximadamente 30% de la región codificante de nef, y un sitio MluI en el extremo 3'. El cambio de aminoácido en la posición 81 se ha demostrado que elimina la función de rev, y por lo tanto, el plásmido resultante conduce a la producción de proteína rev no funcional (Bogard, H. y Greene, W.C., J. Virol. 67(5):2496-2502, (1993)). Se supone que la deleción mayor de la región codificante de nef resultará en la producción de una proteína nef no funcional. El sitio AvaII 5' y la mutación en la posición aminoácida 81 de la proteína rev se introducen en el cebador 5' de PCR que es complementario a la región codificante de rev que contiene tanto el sitio AvaII como el nucleótido que codifica el aminoácido 81. El cebador de PCR 3' introduce un codón de parada que causa la terminación de Nef en la posición aminoácida 63 y el sitio de clonación codificante 3', MluI. El molde para esta amplificación por PCR es un plásmido o molde sintético que contiene las regiones codificantes de rev y de nef procedentes de la cepa MN de VIH-1. El producto de PCR resultante se digiere con AvaII y MluI y se utiliza para sustituir el fragmento AvaII- MluI de menor tamaño que resulta tras la digestión con AvaII y MluI del plásmido tat-rev descrito en el párrafo anterior.
Opcionalmente, puede añadirse vpr a este plásmido en uno de entre dos sitios. En un enfoque, puede amplificarse vpr utilizando un cebador 5' de PCR que contiene el sitio MluI más arriba de secuencias que comprenden el codón de inicio traduccional de vpr y un cebador 3' de PCR complementario al codón de parada de vpr y a secuencias flanqueantes del mismo, que también contienen un sitio de clonación MluI. Las secuencias más arriba del codón de inicio contienen un aceptor de empalme. Las secuencias más arriba del codón de parada contienen un aceptor de empalme. El producto de PCR puede digerirse con MluI e insertarse en el plásmido tat rev nef descrito anteriormente tras su digestión con MluI.
Alternativamente, la amplificación de vpr puede llevarse a cabo de manera análoga, sin embargo los cebadores de PCR contendrían sitios de restricción compatibles con la clonación en otro vector, de manera que se expresaría bajo el control de un segundo promotor eucariótico. El casete derivado de este plásmido, que contendría el segundo promotor seguido de la región codificante de vpr, seguido de una secuencia poliA, podría liberarse mediante digestión con enzimas de restricción que flanquean el casete, pero que no cortan en el interior del mismo. El fragmento de ADN resultante se clonaría en un único sitio del plásmido tat, rev, vpr localizado fuera de la región necesaria para la expresión de tat rev vpr. De esta manera, se forma un plásmido que presenta dos unidades de expre-
sión.
Ejemplo 17 Construcción de plásmidos de HCV y de HTLV-1
Puede utilizarse un enfoque similar para generar un plásmido que exprese proteínas codificadas por HTLV-1 o por HCV que presentan funciones enzimáticas requeridas para el ciclo vital vírico y/o para las proteínas reguladoras de estos virus. Para HTLV-1, se genera un plásmido que codifica la proteína reguladora, TAX, utilizando un esqueleto de plásmido y una estrategia de clonación similar a las descritas anteriormente. Estos genes de HCV que codifican proteínas enzimáticas incluyen la ARN polimerasa dependiente de ARN, una proteína con función de helicasa/proteasa. Las secuencias necesarias se encuentran publicadas y disponibles a través de GenBank. La organización vírica de HTLV-1 y de HCV se encuentra publicada en Cann, A.J. y Chen, I.S.Y., Virology, 2ª edición, editada por B.N. Fiddr, Raven Press Ltd., New York, 1990, y en Bradley, D.W., Transfusion Medicine Reviews 1(2):93-102, 1992,
respectivamente.
Ejemplo 18 Inmunización genética con genes enzimáticos
La inmunización genética con genes que codifican proteínas con funciones enzimáticas, tales como el gen pol de VIH también pueden ser una estrategia antivírica importante debido a que enzimas como Pol resultan necesarios para la producción de virus vivos. Sin polimerasa o cualquiera de sus funciones componentes, VIH es no patogénico y no infeccioso. De manera similar, los genes enzimáticos de otros virus, tales como la polimerasa de HBV, resultan dianas atractivas para la inmunización genética (ver, por ejemplo, Radziwill et al., Mutational Analysis of the Hepatitis B Virus P Gene Product: Domain Structure and RNase H Activity, J. Virol. 64(2):613-620, 1990).
Un motivo por el que los enzimas víricos resultan atractivos como diana inmunológica es la limitada capacidad de estos enzimas de mutar su secuencia de aminoácidos y mantener todavía sus funciones enzimáticas. Por ejemplo, con VIH-1, Pol muestra un número limitado de mutaciones "de escape" que se encuentran asociadas a resistencia a análogos de nucleótidos, tales como AZT. Sin embargo, la amplia mayoría de dianas inmunológicas dentro de la proteína se encuentran conservadas incluso en los mutantes de escapa de fármacos.
Ejemplo 19 Construcción de plásmido de polimerasa de HBV
Los experimentos descritos en la literatura indican que se ha conseguido la expresión de la polimerasa de HBV en células de cultivo de tejidos cuando se encuentran presentes los marcos de lectura abierta tanto del núcleo como de polimerasa en una sola molécula de ARNm. También se ha demostrado que en esta situación, la mutación del ATG del núcleo no influyó sobre la expresión de la polimerasa.
El genoma de HBV se amplifica a partir de un plásmido que contiene un dímero de estructura cabeza-cola de la cepa ADW de HBV. Debido a que se desea únicamente la expresión de la polimerasa, y no del núcleo, se diseñó el cebador 5' de PCR para mutar los codones de inicio de traducción del prenúcleo y del núcleo. Además, este cebador introduce también una secuencia DR1 mutante para eliminar la posibilidad de generación de un ARN genómico de HBV de replicación competente. Este producto de PCR se introduce en un plásmido que contiene un gen de resistencia a la canamicina y un origen de replicación de pBR322. Además, este plásmido contiene un promotor de citomegalovirus, un intensificador del virus del sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación de SV40. Los codones de inicio de traducción para el antígeno de superficie y el producto de la región codificante de X se mutan para evitar la expresión de los productos génicos HBS y X.
De acuerdo con otro enfoque para conseguir la expresión de la polimerasa de HBV, se amplifica un producto de PCR que codifica la región codificante completa de la polimerasa y se clona en un vector que contiene un gen de resistencia a la canamicina y un origen de replicación de pBR322. Además, este plásmido contiene un promotor de citomegalovirus, un intensificador del virus del sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación de SV40. El cebador 5' de PCR para esta amplificación contiene un sitio de clonación y comprende el codón de iniciación de traducción del gen de la polimerasa. El producto 3' de PCR contiene un sitio de restricción para la clonación de la inserción en el vector de expresión y también es complementario al codón de parada tradicional del gen de la polimerasa de HBV y a las secuencias que flanquean este codón de parada. Tras la ligación de este producto de PCR en un plásmido que contiene el gen de resistencia a la canamicina, un origen de replicación de pBR322, un promotor de citomegalovirus, un intensificador del virus del sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación de SV40, se mutan los codones de iniciación de traducción de los genes del antígeno de superficie de la hepatitis B y de X con el fin de evitar la expresión de estos productos génicos. Se utiliza una estrategia alternativa similar a la descrita anteriormente, sin embargo el cebador 3' de PCR en este caso incluye la señal poliA de HBV y secuencias que flanquean esta señal. Este cebador 3' se utiliza en el caso de que las secuencias que incluyen y/o circundan la señal poliA de HBV sean importantes para la expresión. Un análisis de mutaciones ha demostrado que la función del producto del gen de la polimerasa de HBV puede eliminarse mediante cambios particulares de nucleótidos (Radziwell, G. et al., J. Virol. 64(2):613-620, (1990)). Antes de utilizar un plásmido construido tal como se ha descrito anteriormente, la polimerasa expresada puede mutarse mediante la introducción de una de estas mutaciones u otras que sean análogas.
Ejemplo 20
Se construyen constructos génicos útiles en kits y composiciones farmacéuticos para la vacunación contra HBV y el tratamiento del mismo utilizando vectores descritos como esqueletos en el Ejemplo 11. Los plásmidos contienen genes estructurales de HBV, particularmente genes que codifican antígeno de superficie de HBV y/o antígeno de núcleo de HBV y/o antígeno de prenúcleo de HBV.
Ejemplo 21
Se construyen constructos génicos útiles en kits y composiciones farmacéuticos para la vacunación contra HCV y el tratamiento del mismo utilizando vectores descritos como esqueletos en el Ejemplo 11. Los plásmidos contienen genes estructurales de HCV, particularmente genes que codifican proteína de núcleo de HCV y/o proteína de cubierta de HCV.
Ejemplo 22
Se diseñó el constructo génico pREV que contenía una secuencia de nucleótidos que codifica rev de VIH como única proteína diana. La secuencia codificante de rev se clona en el Esqueleto A descrito en el Ejemplo 11 procedente de BBG35 (RD Systems Inc., Minneapolis, MN), que contiene en pUC19 la región codificante de rev procedente de la cepa HX3B de VIH.
Ejemplo 23
En estos estudios, se inocularon ratones intravaginalmente con el constructo pCMV\beta, que codifica el gen de la \beta-galactosidasa bajo el control de un promotor de CMV.
Se introdujeron veinte microgramos de pCMV\beta en 20 \mul de solución PBS en la vagina desde un pipetteman sostenido con la mano. Se sacrificaron animales y recogió tejido en diversos tiempos tras la inoculación. Se evaluó la actividad de \beta-galactosidasa mediante un ensayo de quimioluminiscencia. Se sacrificaron grupo s de tres ratones y se cuantificó la actividad de \beta-galactosidasa (unidades relativas de luz o RLU) por \mug de proteína cuantificada. Se muestran los resultados representativos en las figuras 3A, 3B y 3C. La figura 3A muestra la actividad de \beta-galactosidasa en tejidos relacionados con mucosas del tracto urinario (trompas de Falopio, ovarios, cérvix, vagina y vejiga). La figura 3B muestra la actividad de \beta-galactosidasa en tejidos relacionados con la mucosa del tracto gastrointestinal (hígado, estómago, intestino, bazo y páncreas). La figura 3C muestra la actividad de \beta-galactosidasa en tejido no mucosal (pulmones, sangre, timo y músculo).
Se detectó actividad incrementada de \beta-galactosidasa incluso transcurridos sólo tres días, en sangre, hígado, vejiga, cérvix, pulmón y timo. Algunos tejidos, tales como hígado y timo, mostraron una elevación persistente de la expresión de la \beta-galactosidasa. La actividad de \beta-galactosidasa alcanzó niveles máximos en el hígado, ovarios y timo el día 8. De esta manera, se observó una expresión incrementada de \beta-galactosidasa el día 3 en muchos tejidos, y persistió en algunos tejidos el día 8. Esto indica la capacidad de los genes inoculados localmente de diseminarse a otros tejidos, y de expresarse en sitios distantes. Esto es una característica importante para las técnicas de terapia génica que utilizan la invención.
Ejemplo 24
Se trataron ratones de manera similar, mediante inoculación vaginal de un plásmido que se había mostrado previamente que inducía respuestas de anticuerpos tras la inoculación intramuscular. El plásmido pcMN160 codifica la proteína de cubierta de VIH-1 bajo el control de un promotor de CMV. Este plásmido induce potentes respuestas inmunológicas humorales y mediadas por células en ratones y primates no humanos tras la inoculación intramuscular facilitada. La administración vaginal consistió en el micropipeteado de 20 \mug de ADN de plásmido formulado en 1x PBS en la vagina desde un pipetteman sostenido con la mano los días 0 y 60. Se prepararon lavados vaginales mediante la administración de 200 \mul de 1X PBS intravaginalmente, seguido de la recolección con una pipeta de transferencia de plástico. Se recogieron sueros y lavados vaginales los días 0, 30, 90 y 180. Se determinaron las respuestas de anticuerpos mediante ELISA en lavados vaginales no diluidos o en sueros diluidos 1:100. Los resultados se muestran en las figuras 4A, 4B, 4C y 4D. La figura 4A muestra las respuestas de IgG contra la proteína de cubierta externa (gp120) de VIH. La figura 4B muestra las respuestas de IgG contra la proteína de cubierta transmembrana (gp41) de VIH-1. La figura 4C muestra las respuestas de IgA contra la proteína de cubierta externa (gp120) de VIH. La figura 4D muestra las respuestas de IgA contra la proteína de cubierta transmembrana (gp41) de VIH-1.
Se evaluaron los niveles específicos de IgG o de IgA mediante la aplicación de anticuerpos secundarios expecíficos antiIgA o antiIgG en la ELISA. El nivel de IgG antigp120 o antigp41 de los lavados vaginales se incrementó gradualmente tras la inoculación de ADN y continuó incrementándose tras el refuerzo secundario, alcanzando un nivel máximo el día 180 contra gp120 y gp41. El nivel de IgG sérico contra gp120 y gp41 se incrementó significativamente el día 30 tras la inoculación inicial, observándose un incremento adicional tras el refuerzo secundario el día 180. Se observó que el nivel de IgA antigp120 o antigp41 contra ambas proteínas de cubierta de lavados vaginales el día 30 se había incrementado hasta niveles bajos, observándose un incremento sostenido incluso tras 180 días; el IgA sérico se había incrementado a los 30 días y se incrementó nuevamente tras la inoculación secundaria. Conjuntamente, el nivel de IgG en sueros y lavados vaginales fue mucho más elevado que el nivel de IgA. Este patrón de respuesta inicial observado a los 30 días, seguido de un incremento posterior tras la inoculación secundaria es consistente con el patrón de expresión observado en el estudio de la \beta-galactosidasa. De manera similar, la predominancia del isotipo IgG en la respuesta, así como la respuesta de IgG más alta observada en suero que en vagina son compatibles con la expresión diseminada del gen, tal como se observó para la expresión de la \beta-galactosidasa. Esto indica que los genes administrados localmente se diseminan ampliamente y se expresan en una diversidad de
tejidos.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
100
101
102
103 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
104
105
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Weiner, David B.
\hskip3,9cm Wang, Bin
\hskip3,9cm Ugen, Kenneth E.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Suministro de moléculas de ácido nucleico al tejido de las mucosas
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 40
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz & Norris
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: One Liberty Place 46th Floor
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Philadelphia
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Pennsylvania
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: USA.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 19103
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: WordPerfect 5.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/357.398
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 diciembre 1994
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: DeLuca, Mark
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 33.229
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO/ETIQUETA: UPAP-0191
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 215-568-3100
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: 215-568-3429
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGCGTCTCG AGACAGAGGA GAGCAAGAAA TG 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTCCCTCTA GATAAGCCAT CCAATCACAC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGTTTAACT TTTGATCGAT CCATTCC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATTTGTATC GATGATCTGA C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTAGTAGCA AAAGAAATAG TTAAG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTTAAC TATTTCTTTT GCTAC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTTGTCGAC TGGTTTCAGC CTGCCATGGC AGGAAGAAGC 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACGACGCGTA TTCTTTAGCT CCTGACTCC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTGACGGTA GCGGCCGCAC AATT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTATTAAGCG GCCGCAATTG TT 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCAAGCTTA GACATGATAA GATACATTG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGCAGCTG GATCCCAGCT TC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATTTCTGG GGATCCAAGC TAGT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATAGGATCC GCGCAATGAA AGACCCCACC T 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATATGGATCC GCAATGAAAG ACCCCCGCTG A 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAAAGCGGCC GCTCCTATGG CAGGAAGACG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTACGCGTC TTATGCTTCT AGCCAGGCAC AATG 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 19
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTACGCGTT TATTACAGAA TGGAAAACAG ATGGCAGGTG 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTACGCGTT ATTGCAGAAT TCTTATTATG GC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGGCTTGGA GAGGATTATA GAAGTACTGC AAGAGCTG 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAATCCTCTC CAAGCCTCAG CTACTGCTAT AGCTGTGGC 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAAATAAAG CGGCCGCTCC TATGGCAGGA AGAGAAGCG 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAAAATTAC GCGTCTTATG CTTCTAGCCA GGCACAATG 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCAAGCTTG GGAATGCTCT GCCAGTGTTA C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 26
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGGCCGGA AGGGCACAAT AAAACTGTCT GCTTAC 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTGATTCAG GTGAAAATAT TGTTGATGCG CTG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 111 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 28
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGCGCGGG GATCCGCGTT GCGGCCGCAA AAAGTCGACG GGCGACGCGT AAAAA 
\hfill
55 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCTTTTTA CGCGTCGCCC GTCGACTTTT TGCGGCCGCA ACGCGGATCC CCGCG 
\hfill
55 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGTCGACTG GTTTCAGCCT GCCATGGCAG GAAGAAGC 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCCACGACG CGTCTATTCT TTAGCTCCTG ACTCC 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTGCGGCCG CGTAAGTGGA GAGAGATGGT GCGAG 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGGTGGGGC TGTTGGCTCT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 80 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 35
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 80 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 36
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGTTTTTG GGCATATGTA TGAGGGACAA TTGGAGAAGT G 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 38
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTATCTGG CATGGGTAC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCATGCCAGA TACTGGTAC 
\hfill
29

Claims (10)

1. Composición de crema, pomada, bálsamo, irrigación vaginal, enema o supositorio para el suministro mediante administración tópica o por lavado en el tejido de las mucosas constituido por tejido rectal, vaginal, uretral, sublingual o bucal, comprendiendo la composición bupivacaína y una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o péptido patogénicos libres de partículas víricas, en la que la secuencia de ácido nucleico se encuentra ligada a una secuencia reguladora que controla la expresión y en la que la molécula de ácido nucleico induce inmunidad mucosal contra dicho patógeno.
2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende por lo menos un epítopo que es idéntico a un epítopo de un antígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria, estando dicha secuencia de nucleótidos ligada funcionalmente a una secuencia reguladora.
3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha composición se encuentra en la forma de una crema.
4. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha composición se encuentra en la forma de una pomada.
5. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha composición se encuentra en la forma de un bálsamo.
6. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha composición se encuentra en la forma de una irrigación vaginal.
7. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha composición se encuentra en la forma de un enema.
8. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha composición se encuentra en la forma de un supositorio.
9. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un patógeno.
10. Utilización según la reivindicación 9, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende por lo menos un epítopo que es idéntico a un epítopo de un antígeno contra el que se desea una respuesta inmunológica.
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