ES2273854T3 - Medio de preservacion y almacenamiento para materiales biologicos. - Google Patents
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Abstract
Medio acuoso de conservación en la forma de una solución líquida para la conservación de materiales biológicos, que comprende: (a) un material biológico; (b) por lo menos un compuesto polihidroxi, en el que la cantidad total de compuesto polihidroxi en el medio es de entre 5% y 60% en peso del medio; y (c) iones fosfato, en el que la cantidad total de iones fosfato en el medio es suficiente para que la proporción molar de iones fosfato a grupos hidroxilo en el compuesto polihidroxi sea de entre 0, 0625 y 0, 625.
Description
Medio de conservación y de almacenamiento para
materiales biológicos.
La presente invención se refiere de manera
general a la conservación y estabilización de materiales biológicos
mediante congelación, secado y secado por congelación, y más
específicamente a mezclas protectoras y medios acuosos de
conservación para conservar materiales biológicos, así como a
procedimientos para conservar materiales biológicos y a las propias
composiciones de material biológico conservadas.
La conservación de la estructura y función de
las moléculas biológicas es de importancia fundamental para la
Biología, Bioquímica y Medicina. Los materiales biológicos, tales
como las proteínas, enzimas, células, tejidos, ácidos nucleicos,
semen, sangre y sus componentes, órganos de mamífero, y alimentos
con frecuencia deben almacenarse y conservarse para su utilización
posterior. La conservación de estos materiales biológicos
habitualmente se consigue mediante congelación o secado, o una
combinación de los dos procedimientos. Existen varias técnicas de
secado utilizadas comúnmente: secado por evaporación en un flujo de
gas en movimiento (secado en aire ambiente), secado bajo vacío a
temperaturas ambientes (secado bajo vacío), o secado mediante la
puesta en contacto de una niebla fina de gotas con aire caliente
(secado por pulverización). La congelación simple con frecuencia se
realiza cuando el secado resulta perjudicial o innecesario.
Determinados materiales biológicos se conservan mejor mediante
secado por congelación (liofilización), un procedimiento de dos
etapas en el que la muestra en primer lugar se congela y después se
seca a baja temperatura bajo vacío.
La estructura y función de la mayoría de
materiales biológicos depende de su ambiente acuoso. Por lo tanto,
los cambios en su ambiente acuoso resultantes de los procedimientos
de congelación y de secado con frecuencia pueden presentar
consecuencias drásticas para los materiales biológicos. Además, el
secado por congelación combina las tensiones debidas a la
congelación y al secado. La etapa de congelación de este
procedimiento puede presentar efectos secundarios no deseables,
tales como la desnaturalización de las proteínas y de los enzimas,
y la ruptura de las células. Estos efectos resultan de las tensiones
mecánicas, químicas y osmóticas inducidas por la cristalización del
hielo en estos materiales. Como resultado, tras la rehidratación se
pierde la actividad del material biológico de manera completa o en
un grado suficientemente significativo para que el material ya no
resulte útil para el propósito pretendido.
Con el fin de prevenir o reducir estos efectos
adversos tras la reconstitución o rehidratación, se utilizan
agentes protectores, tales como crioprotectores o lioprotectores
(secado por congelación). Para que estos agentes protectores
resulten eficaces, deben ser no tóxicos para el material biológico a
las concentraciones encontradas durante el procedimiento de
conservación, y deben interaccionar favorablemente con el agua y con
el material biológico. Se han utilizado diversos agentes
protectores en la técnica, con diversos niveles de éxito. Entre
estos se incluyen proteínas de pescado, determinados polímeros,
leche desnatada, glicerol, dimetilsulfóxido y disacáridos, tales
como la trehalosa. Por desgracia, sólo se han desarrollado agentes
protectores y protocolos de crioconservación adecuados para un
número limitado de sistemas.
Los disacáridos, tales como la sacarosa y la
trehalosa, son crioprotectores naturales. La trehalosa es un
crioprotector particularmente atractivo debido a que de hecho ha
sido aislado de plantas y animales que permanecen en un estado de
animación suspendida durante periodos de sequía. Se ha demostrado
que la trehalosa resulta un protector eficaz para una diversidad de
materiales biológicos, tanto en el secado con aire ambiente como en
el secado por congelación. La investigación ha demostrado (ver
Crowe, J.H., Crowe, L.M. y Mouriadian, R., Cryobiology
20:346-356, 1983) que los liposomas secados en
presencia de trehalosa conservan su integridad tanto funcional como
estructural tras la rehidratación. La patente US nº 5.556.771 da a
conocer la utilización de trehalosa, o de trehalosa en combinación
con polivinilpirrolidona, para conservar la transcriptasa inversa y
la ARN polimerasa. La patente US nº 5.512.547 da a conocer la
utilización de trehalosa para conservar la neurotoxina botulínica.
De manera similar, la patente US nº 4.891.319 da a conocer un
procedimiento para proteger las proteínas y otras macromoléculas
biológicas, tales como los enzimas, suero, complemento del suero,
anticuerpos, antígenos, proteínas fluorescentes y componentes de
vacuna utilizando trehalosa. Específicamente, se seca una mezcla
acuosa que contiene la macromolécula y trehalosa a una temperatura
superior a la de congelación en presencia de entre 0,05% y
aproximadamente 20% de trehalosa en peso del sistema acuoso.
Sin embargo, existen algunas desventajas
asociadas a la utilización de la trehalosa como único crioprotector.
Para conservar muchos materiales biológicos mediante secado por
congelación, deben utilizarse grandes cantidades de trehalosa; en
ocasiones resultan necesarias concentraciones de trehalosa
superiores al 60% en peso de un medio de conservación dado. Esto
resulta costoso. Además, una concentración elevada de trehalosa
reduce la solubilidad de otros solutos en el sistema.
De esta manera, se ha propuesto utilizar
trehalosa en combinación con un agente gelificante polimérico, tal
como carboximetilcelulosa o carboxietilcelulosa. Se ha sugerido para
la sangre humana que algunos sacáridos combinados con polímeros
resultan crioprotectores todavía más eficaces que la trehalosa pura
(ver la patente US nº 5.171.661; Sutton, R.L., J. Chem. Soc.
Faraday Trans. 87:3747, 1991). Por desgracia, los intentos para
confirmar el efecto beneficioso de los agentes gelificantes no han
tenido éxito (G. Spieles, I. Heschel, y G. Rau,
Cryo-Letters 17:43-52, 1996; J.H.
Crow, A.E. Oliver, F.A. Hoekstra y L.M. Crowe, Cryobiology
35:20-30, 1997). Además, esta combinación
protectora no puede utilizarse con fines médicos, debido a que los
agentes gelificantes polímeros no resultan bien aceptados por el
cuerpo humano. como resultado, esta combinación no resulta muy
útil, y proporciona una mejora práctica reducida o nula respecto a
la utilización de la trehalosa sola.
Las patentes WO nº 95/20399, EP nº 0356257 y EP
nº 0508496 describen composiciones para el secado por congelación
que contienen azúcares y fosfato.
Las patentes EP nº 0580444 y US nº 476221
describen composiciones que contienen azúcares y fosfato para la
utilización en la conservación de órganos vivos y células sanguíneas
descongeladas, respectivamente.
Otro problema más grave asociado a la
utilización de la trehalosa es que los materiales biológicos
conservados utilizando trehalosa sola no resultan estables durante
el almacenamiento de periodos de tiempo extensos, especialmente
aquellos almacenados a temperaturas superiores a las ambientales y/o
en ambientes húmedos. En otras palabras, los materiales biológicos
conservados con trehalosa pueden perder su actividad en cuestión de
horas o días, dependiendo de la humedad y la temperatura de las
condiciones de almacenamiento.
Por lo tanto, en la actualidad, el secado por
congelación con trehalosa resulta de utilidad limitada para el
almacenamiento prolongado de materiales biológicos, tales como
proteínas, enzimas, células, tejidos, ácidos nucleicos, semen,
sangre y sus componentes, órganos de mamífero, y alimentos, en un
amplio abanico de condiciones de almacenamiento, debido a que el
material se degrada y no presenta suficiente actividad tras la
reconstitución. Desde un punto de vista práctico, esto resulta
claramente inaceptable para los productos médicos, debido a que una
de las razones de partida para conservar los materiales es
proporcionar un producto estable durante el almacenamiento.
Además, en la actualidad muchas de las diversas
técnicas de secado a temperatura ambiente no pueden utilizarse
eficazmente. Estos procedimiento, aunque menos complicados y
costosos que el secado por congelación, generalmente resultan más
destructivos de los materiales biológicos. Muchos materiales
biológicos presentan una mayor tendencia a cambios conformacionales
considerables y reacciones no deseados cuando se conservan
utilizado procedimientos que tienen lugar a temperatura ambiente que
cuando se utiliza el secado por congelación. Como resultado,
incluso en los casos en que se utilizan agentes protectores
actualmente conocidos, la actividad de muchos materiales biológicos
rehidratados resulta tanto insatisfactoria por sí misma como
significativamente inferior que si se conservan mediante secado por
congelación.
De esta manera, existe una necesidad de una
mezcla protectora que resulte útil para un amplio abanico de
materiales biológicos. Existe una necesidad adicional de una mezcla
protectora que pueda utilizarse eficazmente tanto en procedimientos
de secado por congelación como en procedimientos de secado que
implican el secado a temperatura ambiente. También existe una
necesidad de una mezcla protectora que resulte menos costosas que
aquéllas que se están utilizando en la actualidad. Finalmente,
resulta muy importante que existe una necesidad de una mezcla
protectora que proporciona un medio estable para la conservación de
materiales biológicos a lo largo de periodos prolongados de tiempo
a temperaturas elevadas y grados variables de humedad, que pueden
encontrarse durante el transporte y almacenamiento de los
materiales, pero conservando una cantidad significativa de
actividad tras la rehidratación.
Todas estas necesidades se cumplen con la mezcla
protectora, medio protector acuoso y composiciones de material
biológico conservado resultantes de la presente invención.
Se ha descubierto que puede utilizarse un medio
acuoso de conservación para la utilización en la conservación de
materiales biológicos, según las reivindicaciones con una amplia
variedad de materiales biológicos, proporcionando un medio acuoso
de conservación. Este medio acuoso de conservación seguidamente
puede utilizarse en una multiplicidad de procedimientos de
conservación, incluyendo la congelación, secado por congelación y
otros procedimientos de secado, tales como el secado por
pulverización, el secado bajo vacío, o el secado en aire ambiente,
proporcionando una composición conservada estable del material
biológico de interés. Esta composición conservada es estable
durante periodos prolongados de tiempo a temperaturas superiores y/o
humedades relativas superiores a las ambientales. Además, cuando la
composición de material biológico conservado se rehidrata, se
conserva la integridad estructural y funcional del material
biológico conservado en grado suficiente para que pueda utilizarse
el material biológico para su propósito pretendido.
Por lo tanto, la presente invención también
proporciona un procedimiento para la preparación de una composición
de material biológico conservado a partir del medio de conservación
anteriormente indicado, así como la composición misma de material
biológico conservado.
La fig. 1 es un gráfico del porcentaje de
actividad recuperada de composiciones de lactato deshidrogenasa
secadas por pulverización preparadas utilizando cantidades y
proporciones molares variables de fosfato y de trehalosa.
La fig. 2 es un gráfico del porcentaje de
actividad recuperado de las composiciones congeladas de lactato
deshidrogenasa utilizando cantidades y proporciones molares
variables de fosfato y de trehalosa.
La fig. 3 es un gráfico del porcentaje de
actividad a lo largo del tiempo de composiciones de lactato
deshidrogenasa secadas por congelación preparadas utilizando
cantidades y proporciones molares variables de fosfato y de
trehalosa.
La fig. 4 es un gráfico del porcentaje de
actividad recuperado a lo largo del tiempo de composiciones de
lactato deshidrogenasa secadas por congelación preparadas
utilizando cantidades y proporciones molares variables de fosfato y
de trehalosa.
La fig. 5 es un gráfico del porcentaje de
actividad recuperado a lo largo del tiempo de composiciones de
lactato deshidrogenasa secadas por congelación preparadas
utilizando cantidades y proporciones molares variables de fosfato y
de trehalosa.
La fig. 6 es un gráfico de temperaturas de
transición vítrea para diversas mezclas de protector de la
invención.
La presente invención se basa en el notable
descubrimiento de que los materiales biológicos pueden conservarse
reteniendo una actividad sustancial cuando el material biológico se
combina con la mezcla protectora para formar un medio acuoso de
conservación, que a su vez se forma en una composición de material
biológico conservado sometiendo el medio acuoso de conservación de
la presente invención a: (1) diversas técnicas de secado,
incluyendo el secado por congelación, el secado en aire ambiente, el
secado bajo vacío, y el secado por pulverización, o (2) otros
procedimientos de conservación conocidos en la técnica, tales como
la congelación. La mezcla protectora comprende: (a) por lo menos un
compuesto polihidroxi, en el que la cantidad total de compuesto
polihidroxi en la mezcla es de entre 5% y 60% en peso de la mezcla
si la mezcla se encuentra en solución acuosa, y entre 10% y 95% en
peso si la mezcla se encuentra en forma sólida; y (b) iones fosfato,
en la que la cantidad total de iones fosfato en la mezcla es
suficiente para que la proporción molar entre iones fosfato y
grupos hidroxilo en el compuesto polihidroxi se encuentre entre
0,025 y 0,625, o entre 0,0625 y 0,625 en una solución acuosa. El
medio acuoso de conservación de la presente invención comprende: (a)
un material biológico; (b) por lo menos un compuesto polihidroxi,
en el que la cantidad total de compuesto polihidroxi en el medio es
de entre 5% y 60% en peso del medio; y (c) iones fosfato, en el que
la cantidad total de iones fosfato en el medio es suficiente para
que la proporción molar entre iones fosfato y grupos hidroxilo en el
compuesto polihidroxi se encuentre comprendida entre 0,0625 y
0,625.
Puede utilizarse un amplio abanico de materiales
biológicos con las mezclas protectoras de la invención para formar
el medio acuoso de conservación de la presente invención. A
continuación, este medio de conservación se somete a los
procedimientos de la presente invención para preparar una
composición de material biológico conservado. Entre estos
materiales biológicos se incluyen:
- (a)
- enzimas, tales como la lactato deshidrogenasa y la fosfofructoquinasa;
- (b)
- proteínas, tales como la insulina;
- (c)
- complemento del suero;
- (d)
- vacunas;
- (e)
- tejido, incluyendo piel, venas y arterias;
- (f)
- virus, tales como los adenovirus;
- (g)
- órganos de mamífero no humano, tales como el hígado, páncreas y pulmones;
- (h)
- sangre, y sus componentes, incluyendo glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas;
- (i)
- células, incluyendo células procarióticas (incluyendo bacterias) y células eucarióticas, pero no células embrionarias no humanas ni células germinales humanas;
- (j)
- semen no humano;
- (k)
- otros materiales biológicos, incluyendo ácidos nucleicos y vesículas lipídicas; y
- (l)
- alimentos.
Lo anteriormente expuesto es meramente ejemplar
de algunos de la multitud de materiales biológicos que pueden
prepararse en las composiciones de material biológico conservado de
la invención reivindicada utilizando la mezcla protectora, el medio
acuoso de conservación y el procedimiento de la invención
reivindicada. Con la mezcla protectora puede utilizarse cualquier
material biológico para el que resulte deseable la conservación
para su utilización posterior, que después puede conservarse
mediante los procedimientos de conservación de la invención para
formar composiciones conservadas.
Entre los compuestos polihidroxi útiles en la
presente invención se incluyen monosacáridos y polisacáridos
naturales y sintéticos, otros carbohidratos y polialcoholes y sus
derivados. En la presente memoria, "polisacáridos" se define
como los sacáridos que contienen dos o más unidades de monosacárido.
Los compuestos polihidroxi individuales pueden utilizarse
individualmente o en combinación con otros tipos de compuestos
polihidroxi. De entre la amplia diversidad de compuestos
polihidroxi útiles, resulta preferente la utilización de
monosacáridos y polisacáridos. De entre los sacáridos, resultan
preferentes para la utilización en la presente invención los
disacáridos, tales como trehalosa, maltosa, lactosa y sacarosa,
siendo el más preferente la trehalosa.
La cantidad de compuesto polihidroxi presente en
la mezcla protectora, medio de conservación y composición
conservada de la presente invención depende de los compuestos
polihidroxi y materiales biológicos específicos seleccionados para
la utilización, así como de la masa de material biológico que se
conserva. Esto puede ajustarse y optimizarse para un sistema
dado.
Generalmente, los compuestos polihidroxi se
encuentre presente en la mezcla protectora en una cantidad total de
entre aproximadamente 5% y aproximadamente 60% en peso de la mezcla,
en la que la mezcla es una solución acuosa. En el caso de que la
mezcla protectora se suministre en forma de un sólido, por ejemplo
en forma de polvos, los compuestos polihidroxi deben encontrarse
presentes en una cantidad total de entre aproximadamente 10% y
aproximadamente 95% en peso de la mezcla, siendo preferente una
cantidad comprendida en el intervalo entre aproximadamente 20% y
aproximadamente 95% en peso de la mezcla. En el caso de que la
mezcla protectora se encuentre en solución acuosa, los compuestos
polihidroxi preferentemente se encuentran presentes en una cantidad
total suficiente para que la cantidad total de compuesto polihidroxi
en la mezcla se encuentre comprendida entre aproximadamente 5% y
aproximadamente 40% en peso de la mezcla, siendo particularmente
preferente una cantidad comprendida en el intervalo entre
aproximadamente 10% y aproximadamente 30% en peso de la mezcla.
De manera similar, los compuestos polihidroxi
deben encontrarse presentes en el medio de conservación en una
cantidad suficiente para que la cantidad total de compuestos
polihidroxi en el medio acuoso de conservación se encuentre
comprendida entre aproximadamente 5% y aproximadamente 60% en peso
del medio acuoso de conservación. Preferentemente, la cantidad
total de compuesto polihidroxi presente debe encontrarse comprendida
entre aproximadamente 5% y aproximadamente 40% en peso del medio
acuoso de conservación, siendo particularmente preferente una
cantidad comprendida en el intervalo entre aproximadamente 10% y
aproximadamente 30% en peso del medio acuoso de conservación.
Debe enfatizarse que los intervalos
anteriormente indicados pueden variarse, por ejemplo dependiendo de
la cantidad de material biológico en el medio de conservación y del
procedimiento de conservación seleccionado para su utilización.
La utilización de las cantidades anteriormente
indicadas de compuesto polihidroxi en el medio acuoso de
conservación de la presente invención resultara, tras la eliminación
parcial o total de agua líquida, en una composición de material
biológico conservado comprendida entre aproximadamente 5% y
aproximadamente 95% de compuesto polihidroxi en peso de la
composición. Nuevamente, esta cantidad dependerá de la masa del
material biológico que se conserva, de la cantidad de fosfato
presente, y de la cantidad de agua eliminada del sistema durante la
conservación. La cantidad de compuesto polihidroxi en la composición
biológica conservada puede determinarse a partir de la cantidad
presente en la mezcla protectora y/o medio acuoso de conservación.
Alternativamente, la cantidad de compuesto polihidroxi en la
composición de material biológico conservado puede determinarse
mediante procedimientos analíticos conocidos de la técnica, tales
como la cromatografía de columna.
Puede utilizarse cualquier fuente de iones
fosfato en la mezcla protectora, medio de conservación,
procedimiento de conservación y composición conservada de la
presente invención. Aunque sin pretender restringirse a ninguna
teoría en particular, se cree que los iones fosfato forman un
complejo con el compuesto polihidroxi, que puede contener varias
moléculas del compuesto polihidroxi en una estructura supramolecular
tridimensional entrecruzada por los iones fosfato. El medio acuoso
e conservación presenta una viscosidad mucho más elevada que un
sistema que contenga el compuesto polihidroxi solo en la misma
cantidad, y la composición de material biológico conservado
presenta una temperatura de transición vítrea (Tg) más elevada que
una composición que contenga únicamente el compuesto
polihidroxi.
Tal como se ha indicado anteriormente, los iones
fosfato pueden proporcionarse de cualquier fuente, incluyendo
ácidos y sales. La utilización de sales de sodio y de potasio
resulta preferente. Las sales de potasio son las más preferentes,
debido a que presentan excelentes características de solubilidad a
temperatura reducida, y cristalizan en forma de cristales anhidros.
Por lo tanto, los iones fosfato preferentemente se proporciona
mediante la utilización de sales de sodio y/o de potasio, siendo
particularmente preferente la utilización de una mezcla de fosfato
de potasio monobásico y dibásico.
La cantidad de iones fosfato que resulta óptima
para una mezcla protectora dada y/o medio de conservación depende
de varias variables, incluyendo el material biológico específico a
conservar, la cantidad y el tipo de compuesto polihidroxi en la
mezcla protectora y/o en el medio de conservación, y la cantidad de
material biológico en el sistema. Generalmente, los iones fosfato
deben encontrarse presentes en la mezcla protectora y/o medio
acuoso de conservación en una cantidad total suficiente para que la
proporción molar entre iones fosfato y grupos hidroxilo en el
compuesto polihidroxi se encuentre comprendida entre 0,025 ó 0,0625
y 0,625. Preferentemente, los iones fosfato se encuentran presentes
en una cantidad suficiente para que la proporción molar entre iones
fosfato y grupos hidroxilo en la mezcla protectora se encuentre
comprendida entre 0,0375 y aproximadamente 0,625.
La proporción molar entre iones fosfato y grupos
hidroxilo en el compuesto polihidroxi permanece sustancialmente
constante durante todo el procedimiento de conservación, resultando
en un material biológico conservado que presenta sustancialmente la
misma proporción molar de iones fosfato a grupos hidroxilo en el
compuesto polihidroxi. De esta manera, la cantidad de iones fosfato
presente en la composición de material biológico conservado se
infiere directamente a partir de la cantidad presente en el medio
acuoso de conservación. Alternativamente, la cantidad de iones
fosfato en la composición de material biológico conservado puede
determinarse analíticamente mediante procedimientos conocidos de la
técnica, incluyendo cromatografía iónica y quimioluminiscencia.
La cantidad útil de iones fosfato también puede
determinarse a partir de los moles de ion fosfato por mol de
compuesto polihidroxi multiplicando las proporciones anteriores por
el número de grupos hidroxilo presentes por mol de compuesto
polihidroxi que se utiliza. Por ejemplo, la trehalosa y la sacarosa
presentan 8 moles de grupos hidroxilo por mol de compuesto. Por lo
tanto, en el caso que se utilice trehalosa o sacarosa como el
compuesto polihidroxi, la proporción de entre aproximadamente 0,025
y aproximadamente 0,625 moles de iones fosfato por mol de grupos
hidroxilo puede conseguirse mediante la adición de suficientes iones
fosfato para conseguir una proporción molar de iones fosfato a
sacarosa o a trehalosa de entre aproximadamente 0,2 y
aproximadamente 5. Para la trehalosa o la sacarosa, la proporción
molar preferente de entre aproximadamente 0,0375 y aproximadamente
0,625 se traduce en una proporción molar de iones fosfato a sacarosa
o a trehalosa de entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 5.
Se ha descubierto que la eficacia de los iones
fosfato en la estabilización y conservación de la estructura y
función de un material biológico dado se incrementa en la medida en
que se incrementa desde cero la proporción molar entre iones
fosfato y grupos hidroxilo, aunque sólo hasta un punto (la
proporción óptima), a partir de la cual la utilización de iones
fosfato adicionales proporciona un incremento nulo o prácticamente
nulo de eficacia. Tal como se ha comentado anteriormente, la
proporción óptima depende de varios factores, incluyendo la
cantidad y el tipo de material biológico utilizado, la cantidad y el
tipo de compuestos polihidroxi en el medio de conservación, el pH
del medio de conservación, y la técnica de conservación que se
utilice.
La utilización de iones fosfato a una proporción
molar de iones fosfato a grupos hidroxilo en el compuesto
polihidroxi que sea superior a la que se encuentra que resulta
óptima para un medio acuoso de conservación dado del a presente
invención puede, en muchas circunstancias, todavía funcional, tras
la conservación, en una composición de material biológico
conservado con integridad estructural y funcional mejorada, tal como
actividad mejorada tras la rehidratación, estabilidad durante el
almacenamiento o ventajas de coste o de procesamiento respecto a
una composición conservada resultante de un medio acuoso de
conservación que contenga únicamente el compuesto polihidroxi. Por
lo tanto, resulta preferente que la proporción para un medio acuoso
de conservación dado de la presente invención sea inferior o igual
al que resulta en estabilidad y actividad óptimas tras la
rehidratación, siendo más preferente la utilización de la proporción
óptima. Sin embargo, puede utilizarse un medio acuoso de
conservación con una proporción superior a la necesaria para la
actividad óptima del material biológico conservado tras la
rehidratación.
La mezcla protectora y/o medio acuoso de
conservación de la presente invención pueden contener otros
componentes. Por ejemplo, pueden contener un tampón para mantener el
pH del medio en un valor óptimo para un material biológico dado.
Debe indicarse que los iones fosfato en la mezcla y/o en el medio
también funcionan como tampón, de manera que pueden resultar
innecesarios tampones no fosfato adicionales. Si se utiliza un
tampón fosfato, debe incluirse la cantidad de iones fosfato presente
en el tampón al determinar la proporción molar entre iones fosfato
y grupos hidroxilo del compuesto polihidroxi en la mezcla y/ en el
medio acuoso de conservación, así como la composición de material
biológico conservado resultante. El pH al que un material biológico
dado es más estable es conocido de la técnica. Generalmente, el
medio de conservación de la presente invención debe presentar un pH
comprendido en el intervalo entre aproximadamente 5 y
aproximadamente 10, siendo más preferente un pH comprendido en el
intervalo entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9.
La mezcla protectora y/o medio acuoso de
conservación también pueden contener uno o más antioxidantes, tales
como tiosulfato sódico, ácido ascórbico, ácido cítrico, y citrato
sódico. Si se utiliza un antioxidante, puede encontrarse presente
en una cantidad que es conocido en la técnica que resulta útil.
La mezcla protectora y/o medio acuoso de
conservación también pueden contener otros componentes que pueden
actuar como agentes de secado y/o osmoprotectores, tales como
metanol, etanol, glicerol y DMSO. Estos componentes tienden a
reducir la humedad residual o las tensiones osmóticas en el
equilibrio en las composiciones de material biológico conservado
preparadas a partir de los medios acuosos de conservación de la
presente invención, que pueden en algunos casos resultar en una
mejor capacidad de almacenamiento.
La mezcla protectora de la presente invención
puede prepararse de la manera siguiente. El compuesto polihidroxi y
la fuente de iones fosfato se añaden en la proporción deseada a una
solución acuosa. Resulta preferente que la fuente de iones fosfato
se disuelva en la solución previamente a la adición del compuesto
polihidroxi. La mezcla puede calentarse si resulta necesario para
llevar a cabo la disolución. La solución debe mezclarse
uniformemente, hasta obtener una mezcla homogénea de protector. A
continuación, esta mezcla protectora puede almacenarse en forma de
solución acuosa, o puede someterse a diversos procedimientos
conocidos de la técnica para producir una mezcla sólida, tal como
unos polvos. Los polvos pueden ser anhidros o un material
parcialmente cristalino hidratado. En el caso de que la mezcla
protectora sea un sólido, tal como unos polvos, debe reconstituirse
con una solución acuosa antes de utilizarse para preparar el medio
acuoso de conservación de la presente invención. Sin embargo, la
mezcla sólida puede añadirse directamente a una solución acuosa que
contenga el material biológico, formando el presente medio
acuoso.
La mezcla protectora en la forma de una solución
acuosa seguidamente se añade a una solución acuosa del material
biológico. Si se prepara la mezcla protectora en una solución acuosa
de tampón, la solución acuosa de los materiales biológicos
preferentemente se prepara en el mismo tampón. A continuación, se
mezclan uniformemente estas dos soluciones, formando el medio
acuoso de conservación de la presente invención. Si se utiliza un
antioxidante, generalmente se añade a la solución acuosa de material
biológico antes de la adición de la solución protectora.
La cantidad de material biológico utilizada en
el medio acuoso de conservación de la presente invención puede
variarse según se desee, dependiendo por ejemplo del material
biológico específico que debe conservarse, de las cantidades de
iones fosfato y compuesto polihidroxi presentes, y de la técnica de
conservación que se utilizará.
A continuación, el medio acuoso de conservación
puede conservarse mediante una o más técnicas conocidas de la
técnica, incluyendo la congelación, el secado por congelación, el
secado con aire ambiente, y/o el secado por pulverización,
proporcionando una composición de material biológico conservado de
la presente invención. La composición de material biológico
conservado resultante puede ser anhidra, o puede ser un material
hidratado parcialmente cristalino. Resulta preferente que el
material biológico conservado sea de naturaleza sustancialmente
anhidra. En la presente memoria, "sustancialmente anhidro"
significa que la composición de material biológico conservado
contiene menos de un 10% de agua según medición efectuada mediante
análisis de Karl Fischer.
Ejemplo
1
Se prepararon diversas mezclas protectoras en
forma de solución acuosa en tampón de Butterfield (agua tamponada
con fosfato de potasio 0,6 mM que presenta un pH de 7,2) mediante la
adición de cantidades predeterminadas de un compuesto polihidroxi e
iones fosfato, y mezclando para formar una solución homogénea. A
continuación, se añadió una mezcla protectora dada a una solución
celular de L. acidophilus en una proporción en masa de 1:1,
y el medio protector acuoso resultante se mezcló uniformemente y se
dejó incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución
celular de L. acidophilus se preparó de la manera siguiente:
se mezclaron cultivos bacterianos de L. acidophilus
concentrado que presentaban una masa seca del 15,3% en peso con
tiosulfato sódico al 1,9%, formando una solución celular de L.
acidophilus, y se dejó incubar a temperatura ambiente durante
30 minutos.
A continuación, se sometieron muestras de cada
medio protector acuoso preparado de la manera anterior a
congelación, a secado por congelación o secado bajo vacío.
Para las muestras que se encontraban congeladas,
se introdujo por goteo en nitrógeno líquido el medio acuoso de
conservación a través de la aguja de una jeringa de calibre 25. Las
gotas habitualmente formaron pellets de 2 a 3 mm de diámetro que se
congelaron por completo en aproximadamente 10 segundos. Estas
muestras de composición celular conservada seguidamente se dejó que
se descongelasen en atmósfera abierta a temperatura ambiente.
Las muestras que se habían secado por
congelación se sometieron a congelación tal como se ha detallado
anteriormente, y los pellets resultantes se introdujeron en un
secador por congelación Virtis 12EL sobre bandejas preenfriadas a
una temperatura no superior a -45ºC. Además, se pesaron muestras
pequeñas del medio de conservación con el fin de determinar su
densidad, y después se secaron por congelación en forma de capa fina
en platos de vidrio. Estas muestras se pesaron antes y después del
secado por congelación para calcular la cantidad de agua que había
perdido cada muestra durante el secado por congelación, y por lo
tanto para determinar la cantidad de agua necesaria para la
rehidratación.
Todas las muestras secadas por congelación se
sometieron al protocolo de secado por congelación siguiente, en el
que las presiones y temperaturas son valores de ajuste. Tras
introducir las muestras en el secador por congelación tal como se
ha comentado anteriormente, se evacuó el secador por congelación con
una presión de 0 Pa (0 mtorr). Las muestras se mantuvieron a -45ºC
y a 0 Pa durante 1.200 minutos, después de lo cual la temperatura y
la presión se incrementaron a -40ºC y a 2,67 Pa (20 mtorr),
respectivamente, a lo largo de un periodo de 50 minutos. A
continuación, las muestras se mantuvieron a -40ºC y a 2,67 Pa (20
mtorr) durante 600 minutos. Después, la temperatura se incrementó
hasta -35ºC a lo largo de un periodo de 50 minutos, y las muestras
se mantuvieron seguidamente a -35ºC y a 2,67 Pa (20 mtorr) durante
600 minutos. A continuación, se incrementó la temperatura y la
presión hasta -30ºC y 6,67 Pa (50 mtorr), respectivamente, a lo
largo de 50 minutos y las muestras seguidamente se mantuvieron a
-30ºC y a 6,67 Pa (50 mtorr) durante 600 minutos. Al final de este
periodo de tiempo, se incrementaron la temperatura y la presión
hasta -25ºC y 13,33 Pa (100 mtorr), respectivamente, a lo largo de
50 minutos, y las muestras se mantuvieron a -25ºC y a 13,33 Pa (100
mtorr) durante 600 minutos. A continuación, la temperatura se
incrementó hasta -20ºC a lo largo de 50 minutos, y las muestras
seguidamente se mantuvieron a 20ºC y a 13,33 Pa (100 mtorr) durante
600 minutos. Seguidamente, la temperatura se incrementó hasta -10ºC
a lo largo de 100 minutos, y las muestras se mantuvieron a esa
temperatura y a 13,33 Pa (100 mtorr) durante 600 minutos.
A continuación, las muestras se calentaron hasta
una temperatura final de 40ºC a una tasa de 0,5ºC/minuto a 6,67 Pa
(50 mtorr). Seguidamente, las muestras se mantuvieron a la
temperatura final a 0 Pa durante 1.200 a 2.400 minutos. A
continuación, se pasó gas nitrógeno por el secador por congelación,
y las muestras de composición celular conservada se extrajeron, se
sellaron en tubos de centrifugación de plástico de 50 ml, y se
almacenaron en un incubador a 37ºC.
Para las muestras sometidas a secado bajo vacío,
se introdujeron 0,2 ml del medio de conservación en un tubo de
microcentrífuga de plástico de 1,8 ml. A continuación, la muestra se
introdujo en un secador de vacío SVC-100H SpeedVac
Concentrator de Savant Instruments y se sometió a evaporación en un
evaporador rotatorio a temperatura ambiente durante aproximadamente
4 días a una presión final de 11,33 Pa (85 mtorr) con el fin de
obtener las composiciones celulares conservadas. A continuación, los
tubos se sellaron y se almacenaron a temperatura ambiente en un
desecador.
Al tiempo que se preparaban las muestras y se
sometían a congelación, a secado bajo vacío o a secado por
congelación, se tomaron muestras adicionales de los medios acuosos
de conservación, se diluyeron y se introdujeron en placas de medio
ágar utilizando una técnica estándar de vertido en placa para
determinar el número de células viables en el medio de conservación
previamente a que se llevase a cabo cualquier procedimiento de
conservación. En primer lugar, las muestras se diluyeron para
conseguir una concentración celular de aproximadamente 100
células/ml. A continuación, se introdujeron uno o dos mililitros del
medio de conservación diluido en una placa de Petri y se mezclaron
con medio de cultivo de ágar líquido (15 g/l de ágar con 55 g/l de
caldo MRS para Lactobacillus y L-cisteína al
0,1%) a 45ºC. Se dejó enfriar la placa, solidificando el ágar,
momento en el que las placas se invirtieron y se introdujeron en una
cámara de cultivo anaeróbica (jarra GasPak) a 37ºC durante 2 a 3
días, después de los cuales las colonias resultaban visibles en el
ágar. En principio, cada colonia representa una sola célula viable
en el medio de conservación.
En diversos tiempos, se rehidrataron en tampón
de Butterfield partes de las composiciones celulares conservadas
que se habían preparado mediante secado por congelación y mediante
secado bajo vacío. Se rehidrataron muestras secadas por congelación
hasta aproximadamente 1/100 de su concentración original, se dejaron
incubar durante 30 minutos, se diluyeron, y se sembraron en placa
tal como se ha descrito anteriormente. Las muestras secadas bajo
vacío se rehidrataron hasta aproximadamente 1/5 de su concentración
original, se mezclaron para disolver por completo el pellet, se
diluyeron, y se sembraron en placa tal como se ha descrito
anteriormente. Todas las muestras se sembraron en palca por lo
menos por triplicado. Para estos experimentos, el tiempo cero es el
tiempo en el que se extrajeron las muestras de los secadores. Las
composiciones celulares conservadas que se prepararon mediante
congelación de las muestras del medio de conservación en nitrógeno
líquido se sembraron en placa tal como se ha descrito anteriormente
tras producirse la descongelación completa a temperatura
ambiente.
Los resultados para un conjunto dado de muestras
se proporcionan a continuación, en la Tabla 1, en la que los
números representan el porcentaje de actividad original recuperado
tras la rehidratación. La columna de "solución" proporciona el
número de células viables en un medio de conservación dado,
definiendo el número de células viables en la muestra de "células
sólo" como el 100%.
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(Tabla pasa a página
siguente)
Ejemplo
2
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1
utilizando iones fosfato, carbonato o sulfato con compuestos
polihidroxi en cantidades variables. Los resultados para un conjunto
dado de muestras se proporcionan a continuación en la Tabla 2, en
la que los números representan el porcentaje de actividad original
recuperado tras la rehidratación. La columna de "solución"
proporciona el número de células viables en un medio de conservación
dado, definiendo el número de células viables en la muestra de
"células sólo" como el 100%.
Ejemplo
3
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1,
utilizando medios de conservación que contenían diversas fuentes de
iones fosfato en cantidades variables, y cantidades variables de
trehalosa, con la excepción de que las muestras secadas por
congelación se secaron a 50ºC. Además, se midió el agua residual en
las muestras secadas por congelación mediante análisis de Karl
Fischer (KF), y se obtuvo la temperatura de transición vítrea (Tg).
Los resultados se proporcionan para un conjunto dado de muestras en
la Tabla 3, en la que los números representan el porcentaje de
actividad original recuperada tras la rehidratación. La columna de
"solución" proporciona el número de células viables en un
medio de conservación dado, definiendo el número de células viables
en la muestra de "células sólo" como el 100%.
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Ejemplo
4
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1,
utilizando cantidades variables de trehalosa y diferentes fuentes
de iones fosfato en el medio de conservación, con la excepción de
que las muestras secadas por congelación se secaron hasta una
temperatura de 50ºC. En dos muestras se añadió etanol como agente de
secado al medio de conservación, mientras que en una muestra, las
célula de L. acidophilus se "lavaron" (se centrifugaron,
se decantaron y se resuspendieron) para eliminar medio de cultivo
residual. También se sometieron a ensayo los medios que contenían
diferentes tampones. Los resultados para un conjunto dado de
muestras se proporcionan a continuación, en la Tabla 4, en la que
los números representan el porcentaje de actividad original
recuperada tras la rehidratación. La columna "solución"
proporciona el número de células viables en un medio de conservación
dado, definiendo el número de células viables en la muestra de
"células sólo" como el 100%.
Ejemplo
5
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1,
utilizando trehalosa, iones fosfato y diversos antioxidantes o
ningún antioxidante, con la excepción de que las muestras se secaron
por congelación hasta una temperatura de 50ºC. Se proporcionan los
resultados para un conjunto dado de muestras a continuación, en la
Tabla 5, en la que los números representan el porcentaje de
actividad original recuperada tras la rehidratación. La columna
"solución" proporciona el número de células viables en un medio
de conservación dado, definiendo el número de células viables en la
muestra de "células sólo" como el 100%.
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Ejemplo
6
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1, con
las excepciones de que se sustituyeron las células de L.
acidophilus por células de una especie de Pediococcus, y
las muestras secadas por congelación se secaron hasta una
temperatura de 25ºC o se secaron adicionalmente hasta 50ºC. Se
proporcionan los resultados para un conjunto de muestras dado a
continuación, en la Tabla 6, en la que los números representan el
porcentaje de actividad original recuperada tras la rehidratación.
La columna "solución" proporciona el número de células viables
en un medio de conservación dado, definiendo el número de células
viables en la muestra de "células sólo + tio" como el
100%.
Ejemplo
7
Se dializó L-lactato
deshidrogenasa (LDH, EC 1.1.1.27, tipo II, músculo de conejo)
durante la noche a 4ºC en solución tampón de fosfato de potasio 100
mM a pH 7,5. Se sometió a ensayo el contenido de proteínas totales
utilizando SIGMA DIAGNOSTIC, un kit de determinación de proteínas
adquirido de Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri)
utilizando el procedimiento de Biuret modificado de Ohnishi y Barr,
"Simplified Method for Quantitating Protein using the Biuret and
Phenol Reagents", Analytical Biochem. 86:193-200,
1978. El ensayo de proteínas se llevó a cabo a la absorción
característica de 725 nm a temperatura ambiente utilizando un
espectrofotómetro de UV Varian. La mezcla de reacción contenía
tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,5), NADH 0,150 mM y ácido
pirúvico 1,20 mM.
Para preparar las muestras, la LDH dializada se
diluyó con el mismo tampón de fosfato de potasio que se había
utilizado para la diálisis. La solución de enzima resultante
presentaba una concentración de ión fosfato de 100 mM, y una
concentración de LDH de 50 \mug/ml. A continuación, se prepararon
tres conjuntos de mezclas protectoras. Los conjuntos de mezclas
presentaban una concentración de trehalosa de 200 mM, 400 mM y 600
mM, respectivamente. Cada conjunto de mezclas consistía de cuatro
muestras separadas de protector, que contenían iones fosfato a una
concentración de 100 mM, 300 mM, 500 mM y 700 mM, respectivamente.
Estas muestras se prepararon mediante la disolución de la trehalosa
en una solución acuosa de fosfato que contenía una cantidad dada de
iones fosfato.
A continuación, se mezclaron dos mililitros de
la solución de LDH con 2 ml de cada una de las doce mezclas de
protector, proporcionando soluciones de 4 ml de medio acuoso de
conservación con una concentración de trehalosa de 100 mM, 200 mM o
300 mM, concentración de LDH de 25 \mug/ml y concentraciones de
ion fosfato de 100 mM, 200 mM, 300 mM o 400 mM. Se muestra la
preparación de muestra anterior en la Tabla 7.
A continuación, se prepararon cuarenta y ocho
viales para cada una de las muestras anteriores de medio de
conservación. Se etiquetó y se pesó cada vial, y se introdujo con
una pipeta 1 ml de medio de conservación en cada vial. A
continuación, se pesó nuevamente cada vial. Seguidamente, se
congelaron las muestras por inmersión de los viales en nitrógeno
líquido ("refrescamiento") o mediante introducción en el
secador por congelación en bandejas preenfriadas a una temperatura
no superior a -45ºC ("congelación lenta"). Todas las muestras
secadas por congelación se sometieron al protocolo de secado por
congelación siguiente en un secador por congelación Virtis 12EL, en
el que todas las presiones y temperaturas se habían prefijado. Tras
introducir las muestras en el secado por congelación tal como se ha
comentado anteriormente, el secador por congelación se evacuó hasta
una presión de 0 Pa. Las muestras se mantuvieron a -45ºC y 0 Pa
durante 600 minutos, después de los cual se incrementaron la
temperatura y la presión a -40ºC y 2,67 Pa (20 mtorr),
respectivamente, a lo largo de un periodo de 50 minutos. A
continuación, las muestras se mantuvieron a -40ºC y 2,67 Pa (20
mtorr) durante 600 minutos. A continuación, la temperatura se
incrementó a -35ºC a lo largo de un periodo de 50 minutos, y las
muestras seguidamente se mantuvieron a -30ºC y 6,67 Pa (50 mtorr)
durante 600 minutos. Al final de este periodo de tiempo, se
incrementaron la temperatura y la presión a -25ºC y 13,33 Pa (100
mtorr), respectivamente, a lo largo de 50 minutos, y las muestras
se mantuvieron a -25ºC y 13,33 Pa (100 mtorr) durante 600 minutos.
A continuación, la temperatura se incrementó a -20ºC a lo largo de
50 minutos, y las muestras seguidamente se mantuvieron a -20ºC y
13,33 Pa (100 mtorr) durante 600 minutos. Seguidamente, la
temperatura se incrementó a -10ºC a lo largo de 100 minutos, y las
muestras se mantuvieron a esa temperatura y a 13,33 Pa (100 mtorr)
durante 600 minutos.
A continuación, las muestras se calentaron hasta
una temperatura de 25ºC a 6,67 Pa (50 mtorr) a lo largo de un
periodo de 700 minutos. Seguidamente las muestras se mantuvieron a
la temperatura final a 0 Pa durante 2.140 minutos hasta su
descarga. A continuación, se pasó gas nitrógeno por el secador por
congelación, y las muestras de LDH conservadas en los viales se
extrajeron y se midió la actividad de LDH. Antes de medir la
actividad, se pesó cada muestra para determinar la cantidad de agua
perdida y se rehidrataron utilizando agua purificada (sistema
MiliQ, de Millipore Corp.) en la cantidad que se había perdido. A
continuación, se determinó la actividad de LDH utilizando el mismo
procedimiento comentado anteriormente.
Los resultados para un conjunto dado de muestras
se proporcionan en la fig. 1 (secado por congelación) y en la fig.
2 (congelación).
\newpage
Ejemplo
8
Se dializó L-lactato
deshidrogenasa (LDH, EC 1.1.1.27, tipo II, músculo de conejo)
durante la noche a 4ºC en solución de tampón de fosfato de potasio
100 mM a pH 7,5. Se sometió a ensayo el contenido de proteínas
totales utilizando SIGMA DIAGNOSTIC, un kit de determinación de
proteínas adquirido de Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri)
utilizando el procedimiento de Biuret modificado de Ohnishi y Barr,
"Simplified Method for Quantitating Protein using the Biuret and
Phenol Reagents", Analytic Biochem. 86:193-200,
1978. El ensayo de proteínas se llevó a cabo a la absorción
característica a 725 nm a temperatura ambiente utilizando un
espectrofotómetro de UV Varian. La mezcla de reacción contenía
tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,5), NADH 0,150 mM y ácido
pirúvico 1,20 mM.
Para preparar las muestras, se añadió LDH a
cuatro recipientes de 50 ml y se diluyeron con el mismo tampón de
fosfato de potasio que se había utilizado para preparar una solución
de 25 ml. En cada una de las muestras, la concentración de enzima
era de 50 \mug/ml. A continuación, se prepararon mezclas de
protector con un volumen de 25 ml en recipientes de 50 ml. Cada
mezcla contenía trehalosa 400 mM y cantidades variables de ión
fosfato. Para la segunda mezcla, la trehalosa se disolvió en
solución de fosfato de potasio 100 mM. La tercera y cuarta mezclas
se prepararon disolviendo la trehalosa en solución de fosfato de
potasio 500 mM y solución de fosfato de potasio 900 mM,
respectivamente.
A continuación, se mezclaron las muestras de LDH
con las mezclas de protector, proporcionando soluciones de 50 ml de
medios acuosos de conservación con una concentración de LDH de 25
\mug/ml, una concentración de trehalosa de 200 mM y
concentraciones variables de LDH y de ion fosfato. La concentración
de ion fosfato para las muestras 1 a 4 eran de 10 mM, 100 mM, 300
mM y 500 mM, respectivamente, para una proporción molar de ion
fosfato a trehalosa de 0,05 para la Muestra 1, de 0,5 para la
Muestra 2, de 1,5 para la Muestra 3, y de 2,5 para la Muestra 4. A
continuación, se proporciona en la Tabla 8 la muestra anterior.
A continuación, se prepararon cuarenta viales
para cada una de las cuatro muestras anteriores de medios de
conservación. Se etiquetó y se pesó cada vial, y se introdujo con
una pipeta 1 ml de medio de conservación en cada vial. A
continuación, se pesó nuevamente cada vial. Seguidamente, se secaron
por congelación las muestras utilizando el mismo protocolo descrito
en el Ejemplo 7.
Tras completar el secado por congelación, se
extrajeron las muestras de LDH conservadas en los viales, se
sellaron los viales, y se almacenaron en un incubador a 37ºC, en un
incubador a 30ºC o en un refrigerador a 4ºC.
A continuación, se midió la actividad de LDH
periódicamente para las muestras. Antes de medir la actividad, se
pesó cada muestra con el fin de determinar la cantidad de agua
perdida, y se rehidrataron con agua purificada (sistema MilliQ, de
Millipore Corp.) en la cantidad de agua que se había perdido. A
continuación, se determinó la actividad de LDH utilizando el mismo
procedimiento que el comentado anteriormente.
Se proporcionan los resultados para un conjunto
dado de muestras en las figs. 3 a 5, en las que "Z" es la
proporción molar de iones fosfato a trehalosa.
Ejemplo
9
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1. Se
proporcionan los resultados a continuación en la Tabla 9, en la que
los números representan porcentajes de actividad original recuperada
tras la rehidratación. La columna "solución" proporciona la
cantidad de células viables en un medio de conservación dado,
definiendo el número de células viables en la muestra de "células
sólo" como el 100%.
Ejemplo
10
Se prepararon mezclas acuosas de protector que
contenían 7,5% de sacarosa o de trehalosa sobre base molar y
cantidades variables de iones fosfato con monofosfato de potasio o
con difosfato de potasio, y se sellaron 25 microlitros de cada
mezcla en una bandeja de aluminio de calorimetría de escaneo
diferencial. A continuación, las muestras se refrescaron mediante
inmersión en nitrógeno líquido y se cargaron en el calorímetro de
escaneo diferencial, que había sido preenfriada a -140ºC. Después,
las muestras se escanearon a una tasa de 5ºC/minuto hasta una
temperatura de 50ºC, y se determinó la temperatura de transición
vítrea (Tg). Se muestran los resultados para cada muestra en
la
fig. 6.
fig. 6.
Claims (32)
1. Medio acuoso de conservación en la forma de
una solución líquida para la conservación de materiales biológicos,
que comprende:
- (a)
- un material biológico;
- (b)
- por lo menos un compuesto polihidroxi, en el que la cantidad total de compuesto polihidroxi en el medio es de entre 5% y 60% en peso del medio; y
- (c)
- iones fosfato, en el que la cantidad total de iones fosfato en el medio es suficiente para que la proporción molar de iones fosfato a grupos hidroxilo en el compuesto polihidroxi sea de entre 0,0625 y 0,625.
2. Medio acuoso de conservación según la
reivindicación 1, en el que el pH del medio es de entre 5 y 10.
3. Medio acuoso de conservación según la
reivindicación 1, en el que el compuesto polihidroxi se selecciona
de entre el grupo que consiste de monosacáridos, disacáridos y
polisacáridos.
4. Medio acuoso de conservación según la
reivindicación 3, en el que el compuesto polihidroxi es
trehalosa.
5. Medio acuoso de conservación según la
reivindicación 1, en el que la cantidad total de compuesto
polihidroxi en el medio es de entre 10% y 30% en peso del
medio.
6. Medio acuoso de conservación según la
reivindicación 3, en el que la cantidad total de compuesto
polihidroxi en el medio es de entre 10% y 30% en peso del
medio.
7. Medio acuoso de conservación según la
reivindicación 1, en el que el material biológico se selecciona de
entre el grupo que consiste de células, proteínas y enzimas.
8. Medio acuoso de conservación en forma de una
solución líquida para la conservación de materiales biológicos, que
comprende:
- (a)
- un material biológico;
- (b)
- trehalosa, en el que la trehalosa se encuentra presente en una cantidad de entre 5% y 60% en peso del medio; y
- (c)
- iones fosfatos, en el que la cantidad total de iones fosfato en el medio es suficiente para que la proporción molar de iones fosfato a trehalosa sea de entre 0,5 y 5.
9. Medio acuoso de conservación según la
reivindicación 8, en el que la trehalosa se encuentra presente en
una cantidad de entre 10% y 30% en peso del medio.
10. Medio acuoso de conservación según la
reivindicación 9, en el que el pH es de entre 5 y 10.
11. Medio acuoso de conservación según la
reivindicación 8, en el que el material biológico se selecciona de
entre el grupo que consiste de células, proteínas y enzimas.
12. Procedimiento de preparación de una
composición de material biológico conservado, que comprende:
- (a)
- formar un medio acuoso de conservación en la forma de una solución líquida que comprende: (i) un material biológico; (ii) por lo menos un compuesto polihidroxi, en el que la cantidad total de compuesto polihidroxi en el medio es de entre 5% y 60% en peso del medio; y (iii) iones fosfato, en el que la cantidad total de iones fosfato en el medio es suficiente para que la proporción molar de iones fosfato a moles de grupos hidroxilo en el compuesto polihidroxi sea de entre 0,0625 y 0,625; y
- (b)
- conservar el medio acuoso de conservación utilizando por lo menos un procedimiento de conservación.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que los procedimientos de conservación son uno o más
procedimientos seleccionados de entre el grupo que consiste de
congelación, secado por congelación, secado en aire ambiente,
secado bajo vacío y secado por pulverización.
14. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el pH del medio es de entre 5 y 10.
15. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el compuesto polihidroxi se selecciona de entre el grupo que
consiste de monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
16. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el compuesto polihidroxi es trehalosa.
17. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que la cantidad total de compuesto polihidroxi en el medio es de
entre 10% y 30% en peso del medio.
18. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que la cantidad total de compuesto polihidroxi en el medio es de
entre 10% y 30% en peso del medio.
19. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el material biológico se selecciona de entre el grupo que
consiste de células, proteínas y enzimas.
20. Procedimiento de preparación de una
composición de material biológico conservado, que comprende:
- (a)
- formar un medio acuoso de conservación en la forma de una solución líquida que comprende: (i) un material biológico; (ii) trehalosa, en el que la cantidad total de trehalosa es de entre 5% y 60% en peso del medio; y (iii) iones fosfato, en el que la cantidad total de iones fosfato en el medio es suficiente para que la proporción molar de iones fosfato a trehalosa sea de entre 0,5 y 5; y
- (b)
- conservar el medio acuoso de conservación utilizando por lo menos un procedimiento de conservación.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que los procedimientos de conservación son uno o más
procedimientos seleccionados de entre el grupo que consiste de
congelación, secado por congelación, secado en aire ambiente,
secado bajo vacío y secado por pulverización.
22. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que la trehalosa se encuentra presente en una cantidad de entre
10% y 30% en peso del medio.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, en
el que el pH es de entre aproximadamente 5 y aproximadamente
10.
24. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que el material biológico se selecciona de entre el grupo que
consiste de células, proteínas y enzimas.
25. Mezcla protectora en forma sólida para la
utilización en la conservación de materiales biológicos, que
comprende:
- (a)
- por lo menos un compuesto polihidroxi, en el que la cantidad total de compuesto polihidroxi en la mezcla es de entre 10% y 95% en peso de la mezcla; y
- (b)
- iones fosfato, en el que la cantidad total de iones fosfato en la mezcla es suficiente para que la proporción molar de iones fosfato a grupos hidroxilo en el compuesto polihidroxi sea de entre 0,025 y 0,625.
26. Mezcla protectora según la reivindicación
25, en la que la cantidad total de compuesto polihidroxi en la
mezcla es de entre 20% y 95% en peso de la mezcla.
27. Mezcla protectora según la reivindicación
25, en la que el compuesto polihidroxi se selecciona de entre el
grupo que consiste de monosacáridos y polisacáridos.
28. Mezcla protectora según la reivindicación
27, en la que el compuesto polihidroxi es la trehalosa.
29. Mezcla protectora según la reivindicación
25, en la que la proporción molar de iones fosfato a grupos
hidroxilo en el compuesto polihidroxi es de entre 0,0375 y
0,625.
30. Mezcla protectora en forma sólida para la
utilización en la conservación de materiales biológicos, que
comprende:
- (a)
- trehalosa, en la que la trehalosa se encuentra presente en la mezcla en una cantidad de entre 10% y 95% en peso de la mezcla; y
- (b)
- iones fosfato, en la que la cantidad total de iones fosfato en la mezcla es suficiente para que la proporción molar de iones fosfato a trehalosa sea de entre 0,2 y 5.
31. Mezcla protectora según la reivindicación
30, en la que la trehalosa se encuentra presente en una cantidad de
entre 20% y 95% en peso de la mezcla.
32. Mezcla protectora según la reivindicación
30, en la que la proporción molar de iones fosfato a trehalosa es
de entre 0,3 y 5.
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