ES2276476T3 - Vacunas de emulsion de aceite en agua contra la hepatitis b. - Google Patents
Vacunas de emulsion de aceite en agua contra la hepatitis b. Download PDFInfo
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Abstract
Una composición de una vacuna que comprende un antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B o un derivado del mismo, una emulsión de aceite en agua y una saponina, en la que las gotitas de aceite de dicha emulsión de aceite en agua comprenden escualeno y un esterol seleccionado del grupo constituido por colesterol, a-sitosterol, estigmasterol, ergosterol y ergocalciferol.
Description
Vacunas de emulsión de aceite en agua contra la
hepatitis B.
La presente invención se refiere a composiciones
de emulsiones de aceite en agua, su uso para la medicina,
especialmente su uso para aumentar la respuesta inmune al antígeno
de superficie del virus de la hepatitis B, y a sus procedimientos de
fabricación; comprendiendo las emulsiones de aceite en agua un
aceite metabolizable, una saponina y un esterol.
La inducción de respuestas citotóxicas de las
células T (CTL) ocurre de manera natural durante la infección de
una célula diana, o la síntesis no controlada de un antígeno
tumoral, en la que la degradación enzimática del antígeno diana
ocurre en el citoplasma celular. Este fenómeno permite a los
péptidos citoplasmáticos derivados del patógeno, o antígeno
específico para el tumor, entrar en la vía Th1 (procesamiento del
antígeno endógeno) y presentarse sobre la superficie de la célula
asociada con una molécula MHC de clase I. Si un antígeno vacunal no
entra en el citoplasma de la célula huésped, podría entonces ser
captada por la célula y entrar en la vía de procesamiento del
antígeno endógeno y finalmente presentarse sobre la superficie de la
célula asociada con una molécula MHC de clase II. Esta vía
alternativa resulta normalmente en respuestas de
T-auxiliares y en respuestas de anticuerpos
específicos de antígenos.
Tras la vacunación convencional con vacunas
subunitarias o muertas, el antígeno normalmente no entra al
citoplasma de una célula huésped y por lo tanto no entrará en la
vía de procesamiento del antígeno endógeno y no inducirá finalmente
una respuesta CTL. Se cree que la inducción de CTL está
correlacionada con respuestas de perfil de citoquina
Th-1, específicamente con la secreción de
IFN-\gamma e IL-2. La secreción de
IFN-\gamma está asociada con respuestas
protectoras contra patógenos intracelulares, incluyendo parásitos,
bacterias y virus. La activación de leucocitos mediante
IFN-\gamma potencia la destrucción de patógenos y
aumenta la expresión de receptores Fc. También puede darse
citotoxicidad directa, especialmente en sinergia con linfotoxina
(otro producto de las células TH). El IFN-\gamma
es también tanto un inductor y un producto de células NK, que son
efectores de protección innatos muy importantes. Las respuestas de
tipo TH1, a través de IFN-\gamma u otros
mecanismos, proporcionan ayuda preferencial para los isotipos de
inmunoglobulina IgG2a en ratones y el IgG1 humano.
La solicitud de patente internacional número WO
95/17210 describe un sistema de emulsión de adyuvantes basado
escualeno, \alpha-tocoferol y polioxietileno
sorbitán monooleato (TWEEN 80), formulado opcionalmente con los
inmunoestimulantes QS21 y/o 3D-MPL. Esta formulación
de adyuvante es un inductor muy potente de una amplia gama de
respuestas inmunes.
Estas emulsiones de aceite en agua, cuando se
formulan con monofosforil lípido A O-desacetilado en
posición 3 (3D-MPL) y QS21, son potentes inductores
de respuestas inmunes de Th1. En consecuencia, este sistema, cuando
se asocia con un antígeno estimula preferentemente el subisotipo de
IgG asociado con respuestas Th1 (por ejemplo, IgG2a en ratones e
IgG1 humano) y también inducirá niveles significativos de producción
de IFN-\gamma y respuestas CTL específicas a
antígenos. La observación de que la formulación de aceite básico en
agua/QS21/3D-MPL puede inducir fuertes respuestas
CTL es significativa, ya que se ha demostrado en ciertos modelos
animales que estas respuestas inducen protección contra
enfermedades.
Se conocen en la técnica fracciones de saponina
inmunológicamente activas (por ejemplo, Quil A) con distinta
actividad adyuvante derivada de la corteza del árbol sudamericano
Quillaza Saponaria Molina. En la patente estadounidense número
5.057.540 se describen derivados de Quil A, por ejemplo QS21 (una
fracción derivada de Quil A purificada por HPLC) y el procedimiento
para su producción. También se describen además de QS21 (conocido
como QA21) otras fracciones tales como QA17. El uso de tales
saponinas aisladamente viene acompañado de la desventaja de que se
produce necrosis local, es decir, muerte tisular localizada, en el
lugar de inyección, por tanto ocasionando dolor.
El monofosforil lípido A
O-desacetilado en posición 3 es un adyuvante bien
conocido fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Químicamente se
suministra a menudo como una mezcla de monofosforil lípido A
O-desacetilado en posición 3 junto con cadenas 4, 5
ó 6 acetiladas. Puede prepararse mediante los procedimientos que se
muestran en el documento GB 2122204B. Una forma preferida de
monofosforil lípido A O-desacetilado en posición 3
es en forma de una emulsión con un tamaño de partícula pequeño,
menor de 0,2 \mum de diámetro, y su procedimiento de fabricación
se describe en la Patente Europea número EP 0 671 948 B1.
Para que una composición de aceite en agua sea
aceptable para administración en humanos, la fase oleosa del
sistema de la emulsión debe comprender un aceite metabolizado. El
escualeno
(2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,23-tetracosahexaeno)
es un aceite insaturado que se encuentra en grandes cantidades en
aceite de hígado de tiburón, y en menores cantidades en aceite de
oliva, en aceite de germen de trigo, en aceite de salvado de arroz,
y en levadura, y es el aceite que se usa en la presente invención.
El escualeno es un aceite metabolizable gracias a que es un
producto intermedio en la biosíntesis del colesterol (Índice Merck,
10ª Edición, entrada número 8619).
Las emulsiones de aceite en agua por sí solas se
conocen bien en la técnica y se han propuesto como útiles como
composiciones adyuvantes (EP 0 399 843).
\newpage
Las emulsiones de aceite en agua descritas en la
solicitud de patente internacional número WO 95/17210 presentan
obviamente grandes ventajas sobre otros adyuvantes no inductores de
Th1. Sin embargo, hasta el momento la inclusión de QS21 ha hecho
que este potente adyuvante sea reactogénico, ocasionando dolor en el
lugar de la inyección.
Las formulaciones que comprenden QS21 con un
esterol se conocen de la solicitud de patente internacional PCT/EP
96/01464, aunque no se describen emulsiones de aceite en agua en
este documento. Los esteroles se conocen bien en la técnica, por
ejemplo, el colesterol se conoce bien y se describe, por ejemplo, en
el Índice Merck, 11ª Edición, página 341, como un esterol que se da
de manera natural y que se encuentra en la grasa animal.
El documento WO 97/01640 describe vacunas contra
el virus de la hepatitis C basados en emulsiones de aceite en agua.
El documento WO 96/33739 describe formulaciones de vacunas que
contienen una saponina y un esterol. El documento WO 90/03184
describe matrices ISCOM con actividad inmunomodulatoria.
El documento WO 98/15287 describe formulaciones
de vacunas que contienen alum, un antígeno, una fracción de
saponina inmunológicamente activa y un esterol.
Los presentes inventores han encontrado que las
formulaciones de aceite en agua que contienen un esterol, y QS21,
tienen una reactogenicidad local reducida tras la inyección en un
receptor con respecto a emulsiones comparables formuladas sin un
esterol. Esto es sorprendente, ya que los esteroles son solubles en
aceite, y se esperaría que se disolviesen en el núcleo de la gotita
de aceite, mientras que sin embargo el QS21 se espera
principalmente que se asociase con la fase acuosa. Por tanto, se
esperaría que el esterol se distinguiese físicamente del QS21. Sin
embargo, estas formu-
laciones son sorprendentemente menos reactogénicas que las emulsiones de aceite en agua que no contienen un esterol.
laciones son sorprendentemente menos reactogénicas que las emulsiones de aceite en agua que no contienen un esterol.
Por consiguiente, se proporciona una composición
de vacuna que comprende un antígeno de superficie del virus de la
hepatitis B o un derivado del mismo, una emulsión de aceite en agua
y una saponina, en la que las gotitas de dicha emulsión de aceite
en agua comprenden escualeno y esterol seleccionados del grupo
constituido por colesterol, \beta-sitosterol,
estigmasterol, ergosterol y ergocalciferol. Realizaciones
especialmente preferidas de la misma incluyen composiciones en las
que la saponina es la fracción no tóxica de Quil A, conocida como
QS21, y en la que el esterol es colesterol. Una composición tal
puede comprender adicionalmente otros inmunomoduladores que
incluyen: \alpha-tocoferol y polioxietileno
sorbitán monooleato (TWEEN 80), y 3D-MPL. La
inclusión de colesterol en la formulación reduce mucho la
reactogenicidad local de la composición una vez que se inyecta en
un receptor. Otros esteroles que pueden actuar fácilmente como
alternativas al colesterol incluyen
\beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol y
ergocalciferol.
Tales realizaciones de la presente invención se
usan como vacunas potentes. Ventajosamente inducen de manera
preferencial una respuesta Th1.
Las realizaciones de la presente invención
incluyen una composición que comprende (junto con el antígeno) una
emulsión de aceite en agua, una saponina y un esterol, caracterizada
porque se induce un perfil de reactogenicidad reducida al
administrarla a un receptor en comparación con el perfil de
reactogenicidad que se observa tras la administración de la misma
composición de la que se omite el esterol.
Ejemplos previos de emulsiones adyuvantes de
aceite en agua tales como se describen en la solicitud de patente
internacional número WO 95/17210 implicaban grandes cantidades de
escualeno. La razón de escualeno:saponina (p/p)en tales
preparaciones de vacunas se encontraba alrededor de 240:1. Un
beneficio adicional aportado por la adición de colesterol es la
oportunidad de reducir el nivel total de aceite en la emulsión. Esto
lleva a un reducido coste de fabricación, mejoras en la comodidad
global de la vacunación y también mejoras cualitativas y
cuantitativas de las respuestas inmunes resultantes, tales como una
mayor producción de IFN-\gamma. Por consiguiente,
el sistema adyuvante de la presente invención comprende normalmente
una razón de escualeno:saponina (p/p) en un intervalo de desde
200:1 hasta 300:1, también puede usarse la presente invención en una
forma "baja en aceite" para la que el intervalo preferido es
desde 1:1 hasta 200:1, preferiblemente desde 20:1 hasta 100:1, y
más preferiblemente sustancialmente 48:1, esta vacuna retiene las
propiedades beneficiosas como adyuvante de todos sus componentes,
con un perfil de reactogenicidad muy reducido. Por consiguiente, las
realizaciones particularmente preferidas tienen una razón de
escualeno:QS21 (p/p) en un intervalo desde 1:1 hasta 250:1, otro
intervalo también preferido es 20:1 hasta 200:1, preferiblemente
desde 20:1 hasta 100:1, y más preferiblemente sustancialmente
48:1.
Los sistemas de emulsión de la presente
invención tienen un tamaño de gotita de aceite pequeño del orden de
una submicra. Preferiblemente los tamaños de las gotitas de aceite
estarán en el intervalo de desde 120 hasta 750 nm, y más
preferiblemente desde 120-600 nm de diámetro.
Las formulaciones de la invención son adecuadas
para vacunas monovalentes o polivalentes. Adicionalmente, las
emulsiones de aceite en agua pueden contener monofosforil lípido A
O-desacetilado en posición 3
(3D-MPL) y/o polioxietileno sorbitán trioleato (tal
como SPAN 85). Adicionalmente la forma preferida de monofosforil
lípido A O-desacetilado en posición 3 se describe en
la solicitud de patente internacional publicada bajo el número
92116556 - SmithKline Beecham Biologicals S.A.
En la técnica se conocen bien derivados del
antígeno de superficie de la Hepatitis B e incluyen, entre otros,
los antígenos S PreS1, PreS2 descritos en las solicitudes de patente
europea EP-A-414 374;
EP-A-0304 578 y EP
198-474.
La razón de QS21 a colesterol (p/p), presente en
una realización preferida de la presente invención, se prevé que
esté en el intervalo de desde 1:1 hasta 1:20, sustancialmente de
1:10.
La razón de QS21: 3D-MPL (p/p)
estará normalmente en el orden de desde 1:10 hasta 10:1;
preferiblemente desde 1:5 hasta 5:1 y a menudo sustancialmente 1:1.
El intervalo preferido para una sinergia óptima es de desde 2,5:1
hasta 1:1 3D-MPL:QS21. Normalmente para la
administración en humanos QS21 y 3D-MPL estarán
presentes en una vacuna en un intervalo de desde 1
\mug-100 \mug, preferiblemente de desde 10
\mug-50 \mug por dosis. Normalmente la emulsión
de aceite en agua comprenderá desde 2 hasta 10% de
\alpha-tocoferol y desde 0,4 hasta 2%
polioxietileno sorbitán monooleato (TWEEN 80). Preferiblemente la
razón de escualeno:\alpha-tocoferol es igual o
menor que 1, ya que esto proporciona una emulsión más estable.
Sorbitán trioleato (SPAN 85) puede estar también presente en un
nivel de desde 0,5 hasta un 1%. En algunos casos puede ser
desventajoso que las vacunas de la presente invención contengan
además un estabilizador, por ejemplo otros agentes
emulsionantes/tensioactivos, incluyendo ácido caprílico (Índice
Merck, 10ª Edición, entrada número 1739), de las que la Tricaprilina
es una realización particularmente preferida.
La preparación de la vacuna se describe de
manera general en New Trends and Developments in Vaccines, editado
por Voller y cols., University Park Press, Baltimore, Maryland,
U.S.A. 1978. La conjugación de proteínas y macromoléculas la
describe Likhite en la patente estadounidense 4.372.945 y Armor y
cols. en la patente estadounidense 4.474.757.
La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna
se selecciona como una cantidad que induce una respuesta
inmunoprotectora sin efectos secundarios significativos en vacunas
normales. Tal cantidad puede variar dependiendo de qué inmunógeno
específico se emplea y cómo se presenta. Normalmente, se espera que
cada dosis comprenda 1-1000 \mug de proteína,
preferiblemente 1-100 \mug, de los cuales desde 1
hasta 50 \mug es el intervalo más preferido. Una cantidad óptima
para una vacuna específica puede determinarse mediante estudios
habituales que implican la observación de respuestas inmunes
adecuadas en individuos. Tras una vacunación inicial, los sujetos
pueden recibir una o varias inmunizaciones de recuerdo con una
separación adecuada.
En otro aspecto de la presente invención se
proporciona una vacuna tal como se describe en el presente documento
para su uso en medicina.
También se proporciona en la presente invención
un procedimiento para reducir la reactogenicidad de una saponina,
preferiblemente QS21, que contiene una emulsión de aceite en agua,
que comprende la adición de un esterol, preferiblemente colesterol,
en la fase oleosa de la emulsión de aceite en agua en una vacuna
según la invención.
Se sabe que el QS21 en una solución acuosa se
degenera con el tiempo en una forma inactiva como adyuvante,
QS21-H, cuya degeneración está mediada por
hidrólisis de ^{-}OH por el medio acuoso. Tal degeneración puede
ocurrir cuando el QS21 está presente en la fase acuosa de un
adyuvante de aceite en agua. Sorprendentemente se ha encontrado que
la adición de colesterol a la fase acuosa de la emulsión de aceite
en agua tiene el efecto de mantener el QS21 en su forma activa, con
evidentes beneficios para la caducidad de la formulación de
adyuvante/vacuna. La presente invención proporciona un
procedimiento para estabilizar una preparación de saponina,
preferiblemente QS21, en su forma no hidrolizada activa como
adyuvante, cuando el QS21 está presente en un adyuvante basado en
una emulsión de aceite en agua. Este procedimiento comprende la
adición de un esterol, preferiblemente colesterol, en la fase
oleosa de una emulsión de aceite en agua en una vacuna según la
invención.
También se proporciona en la presente invención
un proceso para la producción de un preparado de vacuna que
comprende la adición de colesterol al escualeno, seguido por la
emulsificación de la fase oleosa; emulsión a la cual se añade QS21,
un antígeno y opcionalmente 3D-MPL. Y
\alpha-tocoferol.
El preparado de vacuna de la presente invención
puede usarse para proteger o tratar a un mamífero susceptible a, o
que sufra de una infección por el virus de la Hepatitis B, mediante
la administración de dicha vacuna por vía sistémica o mucosa. Estas
administraciones pueden incluir la inyección por vía intramuscular,
intraperitoneal, intradermal o subcutánea; o vía la administración
mucosa a los tractos oral/digestivo, respiratorio, o
genitourinario.
Ejemplo
1
Las formulaciones de adyuvantes de emulsiones de
aceite en agua usadas en los ejemplos siguientes se realizaron cada
uno comprendiendo el siguiente componente de emulsión de aceite en
agua: 5% escualeno, 5% \alpha-tocoferol, 2,0%
polioxietileno sorbitán monooleato (TWEEN 80).
La emulsión se preparó de la manera siguiente
como un concentrado doble. Todos los ejemplos usados en los
experimentos inmunológicos se diluyen con la adición de componentes
adicionales y diluyentes para proporcionar o bien una concentración
1x (igual a una razón de escualeno:QS21 (p/p) de 240:1) o bien
mayores diluciones de los mismos.
En resumen, el TWEEN 80 se diluye en solución
salina tamponada con fosfato (PBS) para proporcionar una solución
al 2% en el PBS. Para proporcionar 100 ml de una concentración doble
de emulsión, se remueven en un vórtice 5 ml de DL
\alpha-tocoferol y 5 ml de escualeno para que se
mezclen bien. Se añaden 95 ml de solución PBS/TWEEN al aceite y se
mezcla bien. Entonces la emulsión resultante se pasa a través de una
aguja de jeringuilla y finalmente se microfluidiza usando una
máquina M110S Microfluidics. Las gotitas de aceite restantes tienen
un tamaño de aproximadamente 145-180 nm (expresado
como z, media medida por PCS) y se denomina "dosis completa"
SB62.
Estas formulaciones pueden ser estériles
filtradas a través de un filtro de 0,2 \mum. Los otros componentes
del adyuvante/vacuna (QS21, 3D-MPL o antígeno) se
añaden a la emulsión simplemente por adición.
Las vacunas que contienen antígeno usadas en el
presente documento se formulan o bien con una dosis completa de
adyuvante SB62 para proporcionar una razón elevada de escualeno:QS21
(240:1) o con una menor cantidad de emulsión para proporcionar una
formulación de menor razón (48:1), estas formulaciones de adyuvante
se denominan SB62 y SB62', respectivamente. Se formularon otras
vacunas con la adición de colesterol a la fase oleosa de la
emulsión antes del proceso de emulsificación, en las que la razón
QS21:colesterol era de 1:10 (indicado por la adición de la letra
"c").
Ejemplo
2
Se realizó un estudio para examinar la
reactogenicidad local y sistémica de varias formulaciones de
adyuvantes. Se sabe que los adyuvantes de vacunas de aceite en agua
que contienen QS21 producen síntomas clínicos adversos moderados
cuando se administran a un receptor. Este estudio comparó el perfil
de reactogenicidad resultante con el que resultó de las mismas
formulaciones de adyuvantes que contenían además colesterol.
Las emulsiones de aceite en agua que se probaron
se produjeron usando las técnicas descritas en el ejemplo 1. Grupos
de 5 conejos albinos de Nueva Zelanda criados SPF se inocularon
mediante inyección intramuscular en el músculo de la pata trasera
derecha (gastrocnemio) con 0,5 ml de las preparaciones de adyuvante.
Se tomaron muestras antes y después de la vacunación para valorar
el porcentaje de neutrófilos polimorfonucleares en sangre (como una
medida de inflamación % PMN) y creatinfosfoquinasa (como una medida
de daño muscular, CPK). Los animales se sacrificaron 3 días después
de la vacunación para un examen histológico del lugar de la
inyección.
Los niveles de CPK, en unidades por litro (U/L),
se determinaron a partir de suero en varios puntos temporales a lo
largo del experimento usando reactivos comercialmente disponibles
(Abbot) y un analizador de Abbot Vision Systems. El % PMN en las
muestras de sangre se determinó simultáneamente usando un analizador
hematológico Sysmex K-1000 (Toa Medical Electronics
Co.).
Tres días después de la inyección la inspección
post-mortem de los conejos determinó el
tamaño de las lesiones en el lugar de inyección y la histopatología
local.
A partir de la tabla 2 anterior, se puede ver
que las formulaciones de adyuvantes que contienen QS21 muestran un
marcado aumento en niveles plasmáticos de CPK 1 día después de la
inyección, indicando un nivel significativo de daño muscular en el
lugar de la inyección (grupos 19, 21 y 22).
La adición de colesterol a la formulación de
adyuvante reduce este efecto ya que no se observa tal aumento de
CPK después de la vacunación (grupo 20). Los resultados obtenidos
usando este adyuvante son muy similares a los obtenidos con PBS o
SB62 inyectados por separado (véanse los grupos 23, 24 y 25).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El porcentaje de PMN en sangre se toma como una
lectura de la magnitud de la reacción de inflamación local en
respuesta a la vacunación. Tal como se puede observar a partir de la
tabla 3, la adición de colesterol a la formulación que contiene
QS21 no afecta al proceso inflamatorio de manera significativa en el
día 1 después de la vacunación, a pesar de la ausencia de daño
muscular tal como se indica en la tabla 2. La adición de colesterol
no afecta al proceso inflamatorio inducido por SB62.
\vskip1.000000\baselineskip
El examen histológico en el lugar de la
inyección confirma los datos anteriores de CPK que se muestran en
la tabla 2 de reducción significativa de daño local mediante la
adición de colesterol en la formulación del adyuvante.
Se observó necrosis aguda, acompañada de
rabdomiólisis, edema y hemorragia con todos los adyuvantes de
vacunas que contenían QS21 "no reducido" (grupos 19, 21 y 22).
Estos indicios estaban asociados a lesiones muy grandes en el lugar
de la inyección.
La inclusión de colesterol (grupo 20) redujo la
apariencia macroscópica de las lesiones (sólo en 2 de los 5
conejos) cuando se compara con las que se observan en el grupo 19, y
redujo de manera significativa la intensidad de otros indicios
histopatológicos cuando los había.
Es evidente, a partir de los resultados
descritos anteriormente, que el uso de las formulaciones de
adyuvantes que comprenden QS21, o incluso QS21 por sí solo,
ocasionan una cantidad significativa de daño local en el lugar de
la inyección. Este efecto dañino puede reducirse satisfactoriamente
mediante la inclusión de colesterol en la formulación del
adyuvante.
Ejemplo
3
Se condujo un estudio en ratones Balb/C para
comparar la inmunogenicidad de varias formulaciones que contenían
S,L*. S,L* es un antígeno compuesto que comprende una proteína L
modificada de antígeno de superficie (L*) y una
S-proteína, ambas derivadas del virus de la
Hepatitis B (HB. Este antígeno compuesto es el sujeto de la
solicitud de patente europea número EP 0 414 374.
\newpage
Varias formulaciones con razones diferentes de
escualeno:QS21, opcionalmente con colesterol a una razón de
QS21:colesterol de 1:10, se combinaron con S,L* y se compararon en
su capacidad para inducir respuestas inmunes humorales y mediadas
por células (producción de citoquina y CTL). Estas emulsiones de
aceite en agua se produjeron usando los procedimientos descritos en
el ejemplo 1. se usó S,L* formulada sobre hidróxido de aluminio
(AlOH_{3}) como un control inductor de Th2.
En resumen, grupos de 10 ratones se inmunizaron
de manera intramuscular 4 veces con intervalos de 3 semanas con 2
\mug de S,L* liofilizado combinado con varios sistemas de
emulsiones de aceite en agua (SB62). 14 días después de la cuarta
inmunización se analizó la producción de citoquinas (IL5 e
IFN-\gamma) y la actividad CTL después de la
reestimulación in vitro de células del bazo y los ganglios
linfáticos con antígeno S,L*. La respuesta de los anticuerpos a
S,L* y el perfil isotípico inducido se monitorizaron mediante ELISA
21 días después de II y 14 días después de IV.
Grupos de 10 ratones Balb/C se inmunizaron de
manera intramuscular con las formulaciones descritas a continuación.
Se formuló SB62 junto con el antígeno a una razón de escualeno:QS21
normal (240:1, SB62) o baja (48:1, SB62'), opcionalmente con la
adición de colesterol (c).
Los animales se inmunizaron de manera
intramuscular en la pata (50 \mul para todos los grupos excepto
para el grupo 5 al que se le inyectaron 100 \mul) en los días 0,
21, 42 y 63. Se tomó sangre del seno retroorbital en varios puntos
temporales después de las inmunizaciones. En el día 77 se
sacrificaron animales de cada grupo, se extrajeron los bazos y los
ganglios linfáticos drenando el lugar de la inyección (ganglios
linfáticos ilíacos) para una reestimulación in vitro. Se
reunieron 3 ó 4 bazos y unos 10 GL para cada reserva y se trataron
por separado en las valoraciones in vitro.
La cuantificación de anticuerpos
anti-HBs se realizó mediante ELISA usando antígeno
de superficie HB como antígeno de recubrimiento. Las soluciones de
antígeno y anticuerpo se usaron a 50 \mul por pocillo. El antígeno
se diluyó a una concentración final de 1 \mug/ml en PBS y se
adsorbió durante la noche a 4ºC a los pocillos de 96 placas de
microtitulación (Maxisorb Immuno-plate, Nunc,
Dinamarca). Entonces las placas se incubaron durante 1 hr a 37ºC
con PBS que contenía un 1% de albúmina de suero bovino y un 0,1% de
Tween 20 (tampón de saturación). Diluciones dobles de suero
(empezando desde una dilución a 1/100) en el tampón de saturación
se añadieron a las placas recubiertas de HBs y se incubaron durante
1 hr y 30 min a 37ºC. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS
0,1% Tween 20 e IgG1, IgG2a, IgG2b o Ig (Amersham, UK)
anti-ratón conjugado con biotina diluido a 1/1000
en tampón de saturación se añadieron a cada pocillo y se incubaron
durante 1 hr y 30 min a 37ºC. Después de una etapa de lavado se
añadió complejo
estreptavidina-biotina-peroxidasa
(Amersham, UK) diluido a 1/5000 en tampón de saturación para 30 min
adicionales a 37ºC. Las placas se lavaron como anteriormente y se
incubaron durante 20 min con una solución de
o-fenilendiamina (Sigma) al 0,04% H_{2}O_{2}
0,03% en 0,1% TWEEN 20, tampón citrato al 0,05M pH 4,5. La reacción
se paró con H_{2}SO_{4} 2N y se leyó a 492/620 nm. Las
titulaciones ELISA se calcularon a partir de una referencia mediante
SoftmaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros) y se expresó
en UE/ml.
Los ratones se sacrificaron dos semanas después
de la segunda inmunización, se retiraron los bazos y los ganglios
linfáticos de manera aséptica y se reunieron (3 ó 4 órganos formando
una reserva para células del bazo, 1 reserva de 10 órganos para las
CGL). Se prepararon suspensiones de células en medio RPMI 1640
(GIBCO) que contiene L-glutamina 2 mM,
antibióticos, 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M y un
1% de suero de ratón normal singeneico. Las células se cultivaron a
una concentración final de 2 x 10^{6} células/ml (para CGL o CB)
en 200 \mul en 96 pocillos de placa con fondo redondeado con
diferentes concentraciones (10-0,03 \mug/ml) de
antígeno S,L* (25D84). Cada prueba se llevó a cabo por
cuadruplicado. Tras 96 hr de cultivo a 37ºC bajo un 5% de CO_{2},
las células se sometieron a impulsos durante 18 hr con
3H-Timidina (Amersham, UK, 5Ci/mmol) a 0,5
\muCi/pocillo y entonces se recogieron en un contador de centelleo
líquido. Los resultados se expresan en cpm (cpm medio en células
cuadruplicadas) o como un índice de estimulación (cpm medio en
cultivos de células con antígeno/cpm medio en cultivos de células
sin antígeno).
Los ratones se sacrificaron 2 semanas después de
la segunda inmunización, se retiraron los bazos y los ganglios
linfáticos de manera aséptica y se reunieron (3 ó 4 órganos formando
una reserva para células del bazo, 1 reserva de 10 órganos para las
CGL). Se prepararon suspensiones de células en medio RPMI 1640
(GIBCO) que contiene L-glutamina 2 mM,
antibióticos, 5 x 10^{6} células/ml (respectivamente para CGL o
CB) en 1 ml, en 24 pocillos de fondo plano con diferentes
concentraciones (1-0,01 \mug/ml) de S,L* (25D84).
Los sobrenadantes se recogieron 96 horas después y se congelaron
hasta ser analizados para la presencia de IFNg e
IL-5 mediante ELISA.
La cuantificación de
IFN-\gamma se realizó mediante ELISA usando
reactivos de Genzyme. Se usaron soluciones de muestras y
anticuerpos a 50 \mul por pocillo. Placas de 96 pocillos (Maxisorb
Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) se recubrieron
durante la noche a 4ºC con 50 \mul de IFNg
anti-ratón de hámster a 1,5 \mug/ml en tampón
carbonato a pH 9,5. Entonces las placas se incubaron durante 1 hr a
37ºC con 100 \mul de PBS que contiene un 1% de albúmina de suero
bovino y un 0,1% de TWEEN 20 (tampón de saturación). Diluciones
dobles de sobrenadante de estimulación in vitro (empezando
desde 1/2) en tampón de saturación se añadieron a las placas
recubiertas de anti-IFNg y se incubaron durante 1
hr a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces con PBS, TWEEN al 0,1%
(tampón de lavado) e IFNg anti-ratón de cabra
conjugado con biotina diluido en tampón de saturación a una
concentración final de 0,5 \mug/ml se añadió a cada pocillo y se
incubó durante 1 hr a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se
añadió conjugado AMDEX (Amersham) diluido al 1/10000 en tampón de
saturación durante 30 min a 37ºC. Las placas se lavaron como se
indicó anteriormente y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad)
durante 10 min. La reacción se paró con H2SO_{4} 0,4N y se leyó a
450 nm. Las concentraciones se calcularon usando una curva estándar
(IFN-\gamma estándar de ratón) mediante SoftmaxPro
(ecuación de cuatro parámetros) y se expresan en pg/ml.
La cuantificación de IL-5 se
realizó mediante ELISA usando reactivos de Pharmingen. Se usaron
muestras y soluciones de anticuerpos a 50 \mul por pocillo.
Placas de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc,
Dinamarca) se recubrieron durante la noche a 4ºC con 50 \mul de
IL-5 anti-ratón de rata a 1
\mug/ml en tampón carbonato a pH 9,5. Entonces las placas se
incubaron durante 1 hr a 37ºC con 100 \mul de PBS que contiene un
1% de albúmina de suero bovino y un 0,1% de TWEEN 20 (tampón de
saturación). Diluciones dobles de sobrenadante de estimulación
in vitro (empezando desde 1/2) en tampón de saturación se
añadieron a las placas recubiertas de
anti-IL-5 y se incubaron durante 1
hr 30 min a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces con PBS, TWEEN al
0,1% (tampón de lavado) e IL-5
anti-ratón de rata conjugado con biotina diluido en
tampón de saturación a una concentración final de 1 \mug/ml se
añadió a cada pocillo y se incubó durante 1 hr a 37ºC. Después de
una etapa de lavado, se añadió conjugado AMDEX (Amersham) diluido
al 1/10000 en tampón de saturación durante 30 min a 37ºC. Las
placas se lavaron como se indicó anteriormente y se incubaron con 50
\mul de TMB (Biorad) durante 15 min. La reacción se paró con
H2SO_{4} 0,4N y se leyó a 450 nm. Las concentraciones se
calcularon usando una curva estándar (IL-5
recombinante de ratón) mediante SoftmaxPro (ecuación de cuatro
parámetros) y se expresan en pg/ml.
Los ratones se sacrificaron 2 semanas después de
la segunda inmunización, se retiraron los bazos y los ganglios
linfáticos de manera aséptica en reservas de 3 ó 4 ratones (2
reservas de 3 y una reserva de 4 ratones por grupo). Se prepararon
suspensiones de células en medio RPMI 1640 (GIBCO) que contiene
L-glutamina 2 mM, antibióticos,
2-mercaptoetanol a 5 x 10^{-5} M, y un 5% de suero
fetal bovino. Las células se cultivaron a una concentración final
de 2 x 10^{6} células/ml en 10 ml de medio que contiene 2
\mug/ml de S,L* y 1,25% ConA sup (Matraces Falcon de 25 cm^{2})
y se incubaron durante 8 días a 37ºC bajo CO_{2} al 5%.
El día anterior a la valoración de CTL (d7) se
prepararon las células diana mediante la incubación de células P815
(10^{6} células/ml) con S,L* o péptido S_{28-39}
a 10 \mug/ml. Después de una incubación de 1 hr en tubos Falcon
de 15 ml en un pequeño volumen, se transfirieron las células a
placas de 24 pocillos y se incubaron O.N. a 37ºC.
El día de la valoración, 2 x 10^{6} S,L* y
células P815 y P815-S sometidas a impulsos de
S_{28-39} se centrifugan, se resuspenden en 50
\mul de FÁRMACOS y se incuban con 75 \mul de ^{51}Cr (375
\muCi) durante 1 hr a 37ºC (con agitación cada 15 min). Entonces
las células se lavan 4 veces con 10 ml de medio completo y se
incuban durante 30 min a 4ºC después del cuarto lavado. Entonces las
células se centrifugan y se resuspenden a una concentración de 2 x
10^{4} células/ml.
Entonces se centrifugan las células efectoras,
se cuentan y se resuspenden a 2 x 10^{6} células/ml. Se realizan
diluciones triples en serie de células efectoras en placas de 96
pocillos con fondo en V, empezando a una concentración de 2 x
10^{5} células/pocillo/100 \mul.
Se añaden 2 x 10^{3} células diana en 100
\mul a las células efectoras por triplicado. Se valora la
liberación espontánea y máxima mediante la incubación de células
diana respectivamente con medio o con Triton X100 al 3%.
Las placas se centrifugan durante 3 min a 700
rpm y se incuban durante 4 hrs a 37ºC. Después del tiempo de
incubación, se transfieren 50 ml del sobrenadante de cada pocillo a
placas Luma y se secan durante la noche antes de hacer el recuento
en contadores de centelleo Top-count.
Los resultados se expresan como lisis específica
calculada de la manera siguiente:
% SR = (media
cpm muestra - media cpm medio/media cpm max - media cpm medio)
\times
100
Las respuestas humorales (Ig e isotipos) se
midieron mediante ELISA usando antígeno de superficie de HB como
antígeno de recubrimiento. Sólo se analizó el punto temporal de 21
días después del punto II. Los resultados se muestran en las
figuras 1 y 2.
Figura 1. Muestra los títulos de respuestas de
anticuerpos anti-virus de la Hepatitis B (Ig)
expresados tanto como suero de ratones individuales y la media (21
días después del punto II).
Figura 2. Muestra la distribución
sub-isotipo de IgG específico para Hbs en el suero
de los ratones vacunados.
- \bullet
- Tal como se puede ver en la figura 1, las formulaciones relacionadas con SB62 inducen títulos de anticuerpos mucho más elevados que la formulación con S,L* Alum.
- \bullet
- El análisis de títulos promedio a partir de sueros individuales sugiere que se obtienen títulos de anticuerpos más elevados con las formulaciones SB62c y SB62'c (títulos de anticuerpos aproximadamente el doble de los obtenidos con SB62 y SB62' respectivamente).
- \bullet
- Los análisis estadísticos de sueros individuales (Test de Anova de Newman Keuls) no muestran ninguna diferencia significativa en títulos de anticuerpos inducidos por SB62c y SB62'c ni entre los títulos de anticuerpos inducidos por SB62 y SB62'c.
- \bullet
- El perfil de distribución sub-isotópico (tal como se muestra en la figura 2) es comparable para todas las formulaciones relacionadas con SB62 (IgG2a al 25-30%) mientras que las Alum sólo inducen un 4% de IgG2a.
Se midieron las respuestas inmunes mediadas por
células (linfoproliferación, producción de
IFN-\gamma/Il-5 y CTL) a los 14
días después de la reestipulación in vitro de las células del
bazo y de los ganglios linfáticos ilíacos con antígeno S,L*.
La producción de citoquina
(IFN-\gamma e IL-5) se ha medido
después de 96 hrs de reestimulación in vitro de células del
bazo y de ganglios linfáticos ilíacos con S,L*. Los resultados se
muestran en las figuras 3 a 6.
\newpage
Figura 3. Muestra los resultados del análisis de
la producción de IFN-\gamma por las células del
bazo (media de los datos obtenidos con tres reservas/grupo).
Figura 4. Muestra los resultados del análisis de
la producción de IL-5 por células del bazo (media de
los datos obtenidos con tres reservas/grupo).
Figura 5. Muestra los resultados del análisis de
la producción de IFN-\gamma por las células de los
ganglios linfáticos ilíacos (media de los datos obtenidos con tres
reservas/grupo).
Figura 6. Muestra los resultados del análisis de
la producción de IL-5 por las células de los
ganglios linfáticos ilíacos (media de los datos obtenidos con tres
reservas/grupo).
- \bullet
- Una razón de IFN-\gamma:IL-5 > 1 sugiere claramente que las formulaciones relacionadas con SB62 inducen una respuesta pro TH1 (calculada a 10 \mug/ml S,L*) (véase la tabla 6).
- \bullet
- La mayor producción de IFN-\gamma se obtiene después de la reestipulación de células del bazo de animales inmunizados con S,L* SB62' y SB62'c. Las formulaciones de SB62 inducen una mayor producción de IFN-\gamma que las formulaciones correspondientes de SB62 (células del bazo).
- \bullet
- Los animales inmunizados con formulaciones de S,L* SB62c producen niveles más altos de IL-5 que con las formulaciones S,L* SB62 que no contienen colesterol. Los animales inmunizados con S,L* Alum producen los niveles más altos de IL-5.
- \bullet
- No se observa ninguna diferencia significativa en la producción de IFN-\gamma por las células de los ganglios linfáticos entre las formulaciones de SB62 y de SB62c.
- \bullet
- La mayor producción de IFN-\gamma se obtiene tras la reestimulación de células del bazo de animales inmunizados con S,L* SB62c.
Las respuestas de las CTL específicas para S,L*
que se observaron en las células del bazo de los ratones dos
semanas después de la segunda inmunización se muestran en la figura
7.
La figura 7 muestra la actividad CTL de las
células T del bazo estimuladas in vitro durante 7 días con
antígeno S,L* (% medio de lisis específica de tres reservas).
- \bullet
- CTL específicas para S,L* se estimulan mediante la vacunación con todas las emulsiones de aceite en agua.
- \bullet
- Se observa una respuesta CTL más fuerte con formulaciones que contienen SB62' cuando se estudia limitar la razón E/T tal como 3/1.
- 1.
- El perfil de tipo TH1 de la respuesta inmune inducida por todas las formulaciones relacionadas con SB62 se confirma además mediante la razón de IFN-\gamma/IL-5.
- 2.
- Se obtiene un perfil isotípico comparable (25-30% IgG2a) con todas las formulaciones relacionadas con SB62, lo que sugiere la inducción de una respuesta inmune específica para HBs de tipo TH1.
\newpage
- 3.
- Todas las formulaciones relacionadas con SB62 inducen CTL específica, observándose una pequeña mejora con la administración de SB62'.
- 4.
- No se observa ninguna diferencia significativa entre los títulos de anticuerpos inducidos después de la inmunización con SB62c y SB62'.
- 5.
- La mayor producción de IFN-\gamma se observa después de la inmunización con SB62'c.
Ejemplo
4
Se ha descrito anteriormente que
QS21-H es el producto de la hidrólisis de QS21, que
ya no es activo como adyuvante. Se forma mediante la escisión de la
molécula QS21 por el OH- de la solución acuosa. Esta reacción se
produce cuando el pH del medio acuoso está por encima de un valor de
6,5, y se ve acelerada por temperaturas mayores. Se sabe que las
emulsiones de aceite en agua descritas en esta solicitud de patente
(por ejemplo SB62) exhiben un efecto estabilizador tal que se
inhibe la hidrólisis de QS21 en QS21-H. Al diluirse
la emulsión de aceite en agua en la presencia de QS21 constante,
pierde su propiedad estabilizadora y el QS21 degenera en la forma
QS21-H inactiva. Sorprendentemente, las emulsiones
que contienen colesterol adicional, que en una razón 1/1 no
muestran una estabilidad mejorada de QS21, mantienen el efecto
estabilizadora incluso a una dilución de
1/5.
1/5.
El QS21 y el QS21-H se valoran
directamente en la emulsión. Esto se consigue derivatizando la
formulación completa y realizando una etapa de extracción selectiva
que disuelve el QS21, pero deja atrás la mayoría de los compuestos
de la matriz que interfieren. La valoración se basa en HPLC, y los
compuestos se dansilan. La dansilación se realiza secando una
muestra de la emulsión y añadiendo 100 \mul de 3,5 mg de
dansilhidracina/ml C/M 2/1y 100 \mul de 1:4 ácido acético: C/M
2:1, en ese orden. La mezcla se agita bien en un vórtice y se
incuba a 60ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se seca en el
Speedvac.
Se reconstituye en 500 \mul de ACN al 30% en
H2O y se centrifuga dos veces a 14000 rpm durante dos minutos.
Entonces se recogen los sobrenadantes en un tubo de muestreador
automático. Se obtiene una curva estándar preparando QS21 y
QS21-H en una mezcla que contiene los mismos
compuestos que la emulsión que se está estudiando.
La valoración por HPLC se lleva a cabo en una
columna C18 RP Vydac 218TP54 con tamaño de partícula de 5 \mu, de
250*4,6 mm. Los disolventes son A: H2O + TFA (ácido trifluoracético)
al 0,05% y B: acetonitrilo + TFA al 0,05%. La tabla de gradientes
es la siguiente:
El caudal es de 1 ml/min. La detección se
realiza en fluorescencia, con excitación a 345 nm y emisión a 515
nm. Se inyectan 50 \mul en ambas muestras y en los estándares. El
calentador de columna se regula a 37ºC para esta separación. Los
picos para QS21, QS21-iso y QS21-H
se distinguen en el cromatograma.
Se analizó una serie de muestras con la
siguiente composición:
La valoración del QS21/QS21-H se
realizó tras la incubación de las muestras en varios intervalos
temporales y temperaturas (4ºC y 37ºC). Los datos para un mes a
37ºC en este modelo se correlacionan bien con la estabilidad de
QS21 después de un almacenamiento prolongado a 4ºC (por ejemplo 2
años).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados mostrados en la tabla anterior
muestran claramente (tanto para 7 días y para 1 mes) el efecto de
añadir un esterol, en este caso colesterol, al SB62' para mantener
la estabilidad de QS21.
\newpage
Está claro de los ejemplos anteriores que la
presente invención engloba una emulsión de aceite en agua que
preferiblemente induce fuertes respuestas inmunes de tipo ThI. Las
realizaciones de la presente invención, tal como se describen en
los ejemplos, incluyen composiciones que comprenden una emulsión de
aceite en agua, una saponina y un esterol, caracterizado porque se
induce un perfil de reactogenicidad reducido al administrarlo a un
receptor comparado con el perfil de reactogenicidad observado tras
la administración del mismo compuesto del que se omite el esterol.
Además, la adición de colesterol no afecta de manera adversa de
manera cuantitativa ni cualitativa las respuestas inmunes
inducidas.
Claims (15)
1. Una composición de una vacuna que comprende
un antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B o un derivado
del mismo, una emulsión de aceite en agua y una saponina, en la que
las gotitas de aceite de dicha emulsión de aceite en agua
comprenden escualeno y un esterol seleccionado del grupo constituido
por colesterol, \beta-sitosterol, estigmasterol,
ergosterol y ergocalciferol.
2. Una composición de una vacuna según la
reivindicación 1, en la que el esterol es colesterol.
3. Una composición según las reivindicaciones 1
ó 2, en la que dicha saponina es un derivado de QuilA.
4. Una composición según la reivindicación 3, en
la que dicho derivado de QuilA es QS21.
5. Una composición de una vacuna según la
reivindicación 4, en la que la razón de QS21:colesterol está en el
intervalo desde 1:1 hasta 1:10 (p/p).
6. Una composición de una vacuna según
cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5 en la que la razón de
escualeno:QS21 está en el intervalo desde 1:1 hasta 250:1
(p/p).
7. Una composición de una vacuna según la
reivindicación 6, en la que la razón de escualeno:QS21 es
sustancialmente 48:1 (p/p).
8. Una composición de una vacuna según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que contiene
adicionalmente uno o más inmunomoduladores distintos.
9. Una composición de una vacuna según la
reivindicación 8, en la que uno o más inmunomoduladores distintos
se seleccionan del grupo constituido por 3D-MPL y
\alpha-tocoferol.
10. Una composición de una vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la emulsión de
aceite en agua comprende gotitas de aceite que tienen un diámetro
menor a 1 micrómetro.
11. Una composición de una vacuna según la
reivindicación 10, en la que la emulsión de aceite en agua comprende
gotitas de aceite que están en el intervalo de 120 a 750 nm de
diámetro.
12. Una composición de una vacuna según la
reivindicación 11, en la que la emulsión de aceite en agua comprende
gotitas de aceite que están en el intervalo de 120 a 600 nm de
diámetro.
13. Una composición de una vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso como
medicamento.
14. Un procedimiento de fabricación de una
composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 12 que comprende (a) la mezcla de una emulsión de aceite en agua
en la que las gotitas de aceite comprenden escualeno y un esterol
seleccionado del grupo constituido por colesterol,
\beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol y
ergocalciferol; (b) QS21; y (c) un antígeno de superficie del virus
de la Hepatitis B o un derivado del mismo.
15. Uso de una composición según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 12 en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de un ser humano susceptible de sufrir una
infección por el virus de la Hepatitis B.
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