ES2278181T3 - Produccion microbiana de vitamina c. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la producción de vitamina C a partir de D-sorbitol, L-sorbosa, L-sorbosona o L-gulosa que comprende los pasos de: (a) cultivo de un microorganismo en un medio nutriente acuoso que contiene D-sorbitol, L-sorbosa, L-sorbosona o L-gulosa, donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), un microorganismo perteneciente al género Gluconobacter y con características identificativas de G. Oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) y mutantes de éstos, y (b) aislamiento y purificación de la vitamina C producida mediante microorganismos directamente a partir del medio de fermentación.
Description
Producción microbiana de vitamina C.
La presente invención se relaciona con la
producción microbiana de ácido L-ascórbico (vitamina
C).
La vitamina C, que es uno de los factores
nutricionales muy importantes e indispensables para los seres
humanos, ha sido producida comercialmente mediante el denominado
"Método Reichstein", que es bien conocido como un proceso
tecnológicamente establecido. Este método, sin embargo, comprende
una serie de pasos complejos y es difícil lograr una mejora en el
rendimiento global. Por consiguiente, se han hecho una cantidad de
propuestas que contemplan una reducción en el número de pasos y/o
una mejora en el rendimiento general.
La presente invención proporciona un proceso
para la producción de vitamina C a partir de
D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa mediante el
cultivo de un microorganismo seleccionado entre la cepa
Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM
BP-3812), un microorganismo perteneciente al género
Gluconobacter y con características identificativas de G.
oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) y mutantes de
éstos, en un medio nutriente acuoso que contiene
D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa y el
aislamiento y la purificación de la vitamina C del medio de
fermentación.
Más particularmente, la presente invención
proporciona un proceso para la producción de vitamina C a partir de
D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa que comprende
los pasos de:
(a) cultivo de un microorganismo en un medio
nutriente acuoso que contiene D-sorbitol,
L-sorbosa, L-sorbosona o
L-gulosa, donde el microorganismo se selecciona del
grupo que consiste en Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM
BP-3812), un microorganismo perteneciente al género
Gluconobacter y con características identificativas de G.
oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) y mutantes de
éstos, y
(b) aislamiento y purificación de la vitamina C
del medio de fermentación.
En una materialización preferida, la vitamina C
se produce a partir de L-gulosa o
L-sorbosona mediante el proceso definido antes. Una
materialización que se prefiere más es un proceso para la producción
de vitamina C a partir de L-gulosa que comprende los
pasos de:
(a) cultivo de un microorganismo en un medio
nutriente acuoso que contiene L-gulosa, donde el
microorganismo se selecciona del grupo que consiste en
Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM
BP-3812), un microorganismo perteneciente al género
Gluconobacter y con características identificativas de G.
oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) y mutantes de
éstos, y
(b) aislamiento y purificación de la vitamina C
del medio de fermentación.
La presente invención también proporciona un
proceso para la producción de vitamina C a partir de
D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa el cual
comprende poner en contacto un microorganismo seleccionado entre la
cepa G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), un
microorganismo perteneciente al género Gluconobacter y con
características identificativas de G. oxydans DSM 4025 (FERM
BP-3812) y mutantes de éstos con
D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa en una mezcla
de reacción y aislar y purificar la vitamina C de la mezcla de
reacción.
Más particularmente, la presente invención
apunta a un método para producir vitamina C a partir de
D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa el cual
comprende poner en contacto un microorganismo seleccionado entre la
cepa Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM
BP-3812), un microorganismo perteneciente al género
Gluconobacter y con características identificativas de G.
oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) y mutantes de
éstos con D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa en una mezcla
de reacción y aislar y purificar la vitamina C de la mezcla
de
reacción.
reacción.
G. oxydans DSM 4025 se depositó en el
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) en
Göttingen (Alemania), sobre la base de las estipulaciones del
Tratado de Budapest, con el Nº DSM 4025 el 17 de marzo de 1987. El
depositante fue The Oriental Scientific Instruments Import and
Export Corporation por el Instituto de Microbiología de la Academia
Sinica, 52 San-Li-He Rd., Beijing,
República Popular de China. El depositante efectivo fue dicho
Instituto, del cual la dirección completa es Institute of
Microbiology, Academia of Sciences de China, Haidian, Zhongguancun,
Beijing 100080, República Popular de China.
Por otra parte, también se depositó un
subcultivo de la cepa en el National Institute of Advanced
Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba Central
6,1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki
305-8566, Japón, también sobre la base de las
estipulaciones del Tratado de Budapest, con el Nº de depósito FERM
BP-3812 el 30 de marzo de 1992. El depositante fue
Nippon Roche K.K., 6-1, Shiba
2-chome, Minato-ku, Tokio
105-8532 Japón. Este subcultivo también se puede
utilizar en la presente invención.
Los mutantes de G. oxydans DSM 4025 (FERM
BP-3812) o de un microorganismo perteneciente al
género
Gluconobacter y con características identificativas de G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) se pueden obtener tratando las células por medio de, por ejemplo, irradiación ultravioleta o de rayos X, o de un mutágeno químico como la mostaza de nitrógeno o N-metil-n-nitro-N-nitrosoguanidina.
Gluconobacter y con características identificativas de G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) se pueden obtener tratando las células por medio de, por ejemplo, irradiación ultravioleta o de rayos X, o de un mutágeno químico como la mostaza de nitrógeno o N-metil-n-nitro-N-nitrosoguanidina.
Se comprende que "Gluconobacter
oxydans" también incluye sinónimos o basónimos de dicha
especie que tengan las mismas propiedades fisicoquímicas, según
define el Código Internacional de Nomenclatura de Procariotas.
Se puede usar cualquier tipo de microorganismo,
por ejemplo, células en reposo, células tratadas con acetona,
células liofilizadas, células inmovilizadas y similares para que
actúen directamente sobre el sustrato. Se puede adoptar cualquier
medio conocido en sí como un método relacionado con la técnica de
incubación a través del uso de aireación y se prefieren
particularmente los fermentadores sumergidos con agitación. El rango
de concentración celular preferido para llevar a cabo la reacción es
entre aproximadamente 0,01 g de peso húmedo de las células por ml y
0,7 g de células húmedas por ml, preferentemente entre 0,03 g de
células húmedas por ml y 0,5 g de células húmedas por ml.
El cultivo se puede realizar a un pH de 4,0 a
9,0, donde se prefiere un valor de pH de aproximadamente 5,0 a 8,0.
El período de cultivo varía dependiendo del pH, la temperatura y el
medio nutriente que se va a usar, y es preferentemente de
aproximadamente 1 a 5 días, muy preferentemente de aproximadamente 1
a 3 días. El rango de temperatura preferido para llevar a cabo el
cultivo es entre aproximadamente 13°C y 36°C, más preferentemente
entre 18°C y 33°C. Un resultado que se prefiere se puede obtener de
una incubación que utiliza un medio de cultivo líquido como un
caldo.
Por consiguiente, es un aspecto de la presente
invención proporcionar un proceso para la producción de vitamina C a
partir de D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa que comprende
los pasos de:
(a) cultivo de un microorganismo en un medio
nutriente acuoso que contiene D-sorbitol,
L-sorbosa, L-sorbosona o
L-gulosa, donde el microorganismo se selecciona del
grupo que consiste en Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM
BP-3812), un microorganismo perteneciente al género
Gluconobacter y con características identificativas de G.
oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) y mutantes de
éstos, y
(b) aislamiento y purificación de la vitamina C
del medio de fermentación;
donde el proceso se lleva a cabo a
un pH en el rango de aproximadamente 4,0 a 9,0 y a un rango de
temperaturas entre aproximadamente 13°C y 36°C durante 1 a 5
días.
En una materialización preferida, el proceso se
lleva a cabo a un pH en el rango de aproximadamente 5,0 a 8,0 y a un
rango de temperaturas entre aproximadamente 18°C y 33°C durante 1 a
3 días.
Como medio nutriente para la incubación de los
microorganismos se puede usar cualquier medio nutriente acuoso que
contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, otras sales
inorgánicas, pequeñas cantidades de otros nutrientes y similares,
incluidos minerales y vitaminas, que puedan ser utilizados por el
microorganismo. Varios nutrientes que generalmente se usan para
mejorar el crecimiento de los microorganismos pueden ser
adecuadamente incluidos en el medio.
En general se requiere que el medio de cultivo
contenga dichos nutrientes como fuentes de carbono asimilables, por
ejemplo glicerol, D-manitol, eritritol, ribitol,
xilitol, arabitol, inositol, dulcitol, D-ribosa,
D-fructosa, D-glucosa y sacarosa
además de las fuentes de carbono convertidas en vitamina C; y las
fuentes de nitrógeno digeribles como las sustancias orgánicas, por
ejemplo, peptona, extracto de levadura, levadura de panadería, urea,
aminoácidos y agua de macerado del maíz. También se pueden utilizar
como fuentes de nitrógeno diversas sustancias inorgánicas, por
ejemplo, nitratos y sales de amonio. Además, el medio de cultivo
habitualmente contiene sales inorgánicas, por ejemplo sulfato de
magnesio, fosfato de potasio y carbonato de calcio.
Para un rendimiento ventajoso de la incubación,
se puede agregar al medio cualquier factor adecuado que pueda
promover la formación del producto final. Dichos factores
comprenden, pero no exclusivamente, solventes, detergentes,
antiespumante y condiciones de aireación como concentración de
oxígeno aplicada a la reacción.
Aunque la concentración de
D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa también se
puede variar con las condiciones de cultivo, una concentración de
aproximadamente 2 a 120 g/L es en general aplicable. Se prefiere una
concentración de 4 a 100 g/L.
La vitamina C producida y acumulada de este modo
en el medio o mezcla de reacción se puede separar y purificar por
cualquier método convencional conocido en sí que utilice
adecuadamente la propiedad del producto y se puede separar como el
ácido libre o como una sal de sodio, potasio, calcio, amonio o
similar.
Específicamente, la separación se puede realizar
mediante cualquier combinación o repetición adecuada de los pasos
siguientes: por formación de una sal, utilizando las diferencias en
las propiedades entre el producto y las impurezas que lo rodean,
como solubilidad, absorbabilidad y coeficiente de distribución entre
los solventes, por absorción, por ejemplo sobre resina de
intercambio iónico. Cualquiera de estos procedimientos solo o
combinado constituye un medio conveniente para aislar el producto.
El producto obtenido de este modo se puede purificar posteriormente
de manera convencional, p. ej. por recristalización o
cromatografía.
La identificación de la vitamina C obtenida por
el método de esta invención se puede realizar mediante, por ejemplo,
análisis elemental así como por medición de las propiedades
fisicoquímicas como el espectro de absorción infrarroja, el espectro
de masa, RMN y similares.
De acuerdo con la presente invención, la mejora
en términos de la reducción del número de pasos es muy significativa
porque conduce a una vía de un paso dirigida a la producción de la
vitamina C a partir de cualquiera de los sustratos
D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa.
En los ejemplos siguientes, el proceso de la
presente invención se ilustrará en más detalle.
Una ansada de G. oxydans DSM 4025 (FERM
BP-3812) crecido en el medio de agar que contenía un
5,0% de D-manitol, 0,25% de MgSO_{4}.7H_{2}O,
1,75% de agua de macerado del maíz, 5,0% de levadura de panadería,
0,5% de urea, 0,5% de CaCO_{3} y 2,0% de agar, que se cultivó a
27°C durante 4 días, se inoculó en 5 ml de medio de cultivo de
siembra que contenía 8,0% de D-sorbitol, 5,0% de
levadura de panadería, 0,05% de glicerol, 0,25% de
MgSO_{4}.7H_{2}O, 1,75% de agua de macerado del maíz, 0,5% de
urea, 1,5% de CaCO_{3} y una gota de antiespumante en tubo de
ensayo y luego se cultivó a 30°C con 240 rpm durante 20 h en un
agitador recíproco.
3 ml del cultivo de siembra se transfirieron a
un matraz Erlenmeyer de 500 ml que contenía 50 ml del medio de
producción que contenía 8,0% de D-sorbitol, 5,0% de
levadura de panadería, 0,05% de glicerol, 0,25% de
MgSO_{4}.7H_{2}O, 3,0% de agua de macerado del maíz, 1,5% de
CaCO_{3} y 0,15% de antiespumante. El cultivo se llevó a cabo a
30°C con 180 rpm durante 45 h en un agitador rotatorio. Después, se
midió la concentración de vitamina C producida por HPLC a una
longitud de onda de 264 nm con el sistema que estaba compuesto por
un detector UV (TOSOH UV8000; TOSOH Co., Kyobashi
3-2-4, Chuo-ku,
Tokio, Japón), una bomba dual (TOSOH CCPE; TOSOH Co.), un integrador
(Shimadzu C-R6A; Shimadzu Co.,
Kuwahara-cho 1, Nishinokyo,
Chukyo-ku, Kioto, Japón) y una columna
(YMC-Pack de poliamina II; YMC, Inc., 3233 Burnt
Mill Drive Wilimington, NC 28403, USA). Como resultado se
produjeron 118,1 mg/L de vitamina C.
Una ansada de G. oxydans DSM 4025 (FERM
BP-3812) crecido en el medio de agar que contenía
5,0% de D-manitol, 0,25% de MgSO_{4}.7H_{2}O,
1,75% de agua de macerado del maíz, 5,0% de levadura de panadería,
0,5% de urea, 0,5% de CaCO_{3} y 2,0% de agar, que se cultivó a
27°C durante 4 días, se inoculó en 5 ml de medio de cultivo de
siembra que contenía 8,0% de L-sorbosa, 5,0% de
levadura de panadería, 0,05% de glicerol, 0,25% de
MgSO_{4}.7H_{2}O, 1,75% de de agua de macerado del maíz, 0,5% de
urea, 1,5% de CaCO_{3} y una gota de antiespumante en tubo de
ensayo, y después se cultivó a 30°C con 240 rpm durante 20 h en un
agitador recíproco.
3 ml del cultivo de siembra se transfirieron a
un matraz Erlenmeyer de 500 ml que contenía 50 ml del medio de
producción que contenía 8,0% de L-sorbosa, 5,0% de
levadura de panadería, 0,05% de glicerol, 0,25% de
MgSO_{4}.7H_{2}O, 3,0% de agua de macerado del maíz, 1,5% de
CaCO_{3} y 0,15% de antiespumante. El cultivo se llevó a cabo a
30°C con 180 rpm durante 20 h en un agitador rotatorio. Como
resultado se produjeron 407,1 mg/L de vitamina C.
Se cultivó G. oxydans DSM 4025 (FERM
BP-3812) en el medio de agar que consistía en 8,0%
de L-sorbosa, 0,25% de MgSO_{4}.7H_{2}O, 1,75%
de agua de macerado del maíz, 5,0% de levadura de panadería, 0,5% de
urea, 0,5% de CaCO_{3} y 2,0% de agar a 27°C durante 4 días. Las
células de G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812)
crecidas en el medio anterior se transfirieron a tampón de fosfato
de potasio 50 mM (pH 7,0) y se lavaron dos veces con el mismo
tampón. La densidad óptica de la suspensión de células a 600 nm fue
de 21,9. Contenía 0,057 g de peso húmedo de células por ml.
La mezcla de reacción (5 ml en tubo de ensayo)
contenía la suspensión de células y 8,0% de
D-sorbitol, 8,0% de L-sorbosa, 0,5%
de L-sorbosona o 1,0% de L-gulosa en
tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,0). La reacción se inició
mediante la inoculación de la suspensión de células y se llevó a
cabo a 30°C y con 180 rpm en un agitador recíproco. El contenido de
vitamina C se midió a los tiempos de reacción correspondientes a 4,
20 y 24 h con HPLC. La Tabla 1 muestra la cantidad de vitamina C
producida a partir de cada sustrato por G. oxydans DSM 4025
(FERM BP-3812).
Claims (6)
1. Un proceso para la producción de vitamina C
a partir de D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa que comprende
los pasos de:
(a) cultivo de un microorganismo en un medio
nutriente acuoso que contiene D-sorbitol,
L-sorbosa, L-sorbosona o
L-gulosa, donde el microorganismo se selecciona del
grupo que consiste en Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM
BP-3812), un microorganismo perteneciente al género
Gluconobacter y con características identificativas de G.
Oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) y mutantes de
éstos, y
(b) aislamiento y purificación de la vitamina C
producida mediante microorganismos directamente a partir del medio
de fermentación.
2. Un proceso para la producción de vitamina C
a partir de D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa donde un
microorganismo se cultiva en un medio nutriente acuoso que contiene
D-sorbitol, L-sorbosa,
L-sorbosona o L-gulosa y la vitamina
C producida mediante microorganismos se aísla directamente del caldo
de fermentación y se purifica por los métodos convencionales, donde
dicho microorganismo se selecciona del grupo que consiste en
Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), un microorganismo perteneciente al género Gluconobacter y con características identificativas de G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) y mutantes de éstos.
Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), un microorganismo perteneciente al género Gluconobacter y con características identificativas de G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) y mutantes de éstos.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2 donde el microorganismo es Gluconobacter oxydans DSM
4025 (FERM BP-3812).
4. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes donde la vitamina C se produce a partir
de L-gulosa.
5. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el proceso se lleva a cabo a un
pH en el rango de aproximadamente 4,0 a 9,0 y en un rango de
temperaturas entre aproximadamente 13°C y 36°C durante 1 a 5
días.
6. El proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el proceso se lleva a cabo a un
pH en el rango de aproximadamente 5,0 a 8,0 y a un rango de
temperaturas entre aproximadamente 18° y 33°C durante 1 a 3
días.
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