PT759088E

PT759088E - Producao do acido l-ascorbico em microrganismos

Info

Publication number: PT759088E
Application number: PT95910200T
Authority: PT
Inventors: Ronald John Huss; Jeffrey A Running; Thomas J Skatrud
Original assignee: Dcv Inc
Priority date: 1994-02-10
Filing date: 1995-02-10
Publication date: 2001-09-28
Also published as: AU1839795A; GR3036276T3; JPH10500002A; CN1150459A; CN1058055C; DE69520829D1; CA2183034A1; DK0759088T3; EP0759088A1; ES2156206T3; EP0759088B1; DE69520829T2; ATE200913T1; WO1995021933A1

Description

DESCRIÇÃO "PRODUÇÃO DO ÁCIDO L-ASCÓRBICO EM MICRORGANISMOS" *.

ÂMBITO DA INVENÇÃO refere-se à produção do ácido L-ascórbico (Vitamina C) por microalgas. Particularmente, a invenção refere-se a um processo para a produção de ácido L-ascórbico por microalgas a pH baixo (2,5-6,0).

ENQUADRAMENTO GERAL DA INVENÇÃO O ácido L-ascórbico (Vitamina C) é uma vitamina solúvel em água vastamente distribuída nos reinos vegetal e animal. O ácido L-ascórbico (L-AA) pode ser extraído a partir de várias fontes vegetais, tais como pimentão doce, folhas de gladíolo, frutos da roseira brava, dióspiro e citrinos; ou sintetizado a partir de L-xilose, L-galactose ou D-glucose. F. A. Loewus, L-Ascorbic Acid: Metabolism, Biosynthesis, Function, em The Biochemistry of Plants, Vol. 3, Academic Press, Nova Iorque, 1980, pág. 77 a 99, faz uma revisão da biossíntese e fontes de ácido L-ascórbico.

Apesar da maior parte das espécies animais sintetizarem ácido L-ascórbico, os seres humanos e outros primatas, cobaias, morcegos que comem frutos, alguns pássaros e peixes tais como salmão Coho, truta arco-íris e carpa não o conseguem sintetizar. Estes animais requerem uma fonte dietética de ácido L-ascórbico para prevenir o escorbuto. O défice do ácido L-ascórbico em peixes pode também causar escoliose, lordose, reduzido aumento de peso, susceptibilidade aumentada às infecções bacterianas, coloração escura da pele, erosão das barbatanas e formação reduzida da cartilagem óssea. O ácido L-ascórbico é um composto químico de produção em larga escala industrial que requer processos de produção económicos e eficientes, várias algas produzem ácido L-ascórbico. [Ver, por exemplo, Aaronson, Arch. Microbiol., 112, 57-59 (1977) e 2

Renstrom, Plant Sei. Letters, 28, 299-305 (1982/1983)]. A produção do ácido L-ascórbico por microalgas não tem sido um processo de produção útil em grande escala porque a utilização da fonte de carbono é má e o ácido é produzido em baixa concentração.

Skatrud, Patente U.S. 5 001 059, descreve um processo que usa microalgas da espécie Chlorella pyrenoidosa para obter ácido L-ascórbico com elevado rendimento. Este método foi um aperfeiçoamento significativo na produção do ácido L-ascórbico por microalgas porque a concentração do ácido L-ascórbico e a utilização da fonte de carbono melhoraram significativamente. No entanto, ao pH relativamente elevado necessário para a produção continuada do ácido L-ascórbico (6,5-7), o ácido extracelular é facilmente oxidado pelo ar requerido pelo metabolismo celular e para a produção do ácido L-ascórbico. Existe a necessidade dum processo eficiente para a produção do ácido L-ascórbico por microalgas a baixo pH (inferior a 6,5).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção dirige-se para um processo para a produção do ácido L-ascórbico. O processo compreende fazer-se a cultura de um organismo escolhido de entre o grupo que consiste em organismos do género Prototheca e organismos da espécie Chlorella protothecoides num processo de fermentação a um pH inferior a cerca de 6,0. O processo inclui ainda a recuperação do ácido L-ascórbico a partir do meio de fermentação. Uma realização alternativa inclui um processo para a produção do ácido L-ascórbico, mediante a cultura de um dos organismos anteriormente identificados, num meio de fermentação que tem uma fonte de oxigénio assimilável, em que, o meio de fermentação inclui ácido L-ascórbico extracelular e um processo para a recuperação do ácido L-ascórbico a partir do meio de fermentação. Os organismos preferidos são organismos do género Prototheca e organismos particularmente preferidos são os das espécies Prototheca moriformis e Prototheca zopfii. O processo da presente invenção é particularmente vantajoso porque pode dar origem à produção de concentrações significativas de ácido L-ascórbico extracelular que toma a recuperação do ácido L-ascórbico mais simples do que seria se o ácido L-ascórbico fosse segregado dentro das 3

células. O presente processo pode ser conduzido em presença duma fonte de oxigénio assimilável por que nas condições de pH da presente invenção, a degradação do ácido L-ascórbico extracelular não produzido é significativa. A recuperação do ácido L-ascórbico extracelular pode ser obtida mediante o uso de vários processos incluindo permuta iónica, cromatografia, extracção, separação através de membranas, osmose inversa, destilação, derivatização química e cristalização. O processo pode compreender, adicionalmente, a recuperação do ácido L-ascórbico intracelular. Numa realização da invenção, células são removidas a partir do caldo de fermentação e ácido L-ascórbico é recuperado do caldo de fermentação isento de células e o ácido L-ascórbico é recuperado separadamente a partir das células separadas.

Um outro aspecto da presente invenção compreende uma cultura de fermentação que inclui microalgas produtoras de ácido L-ascórbico e um meio de fermentação. Nesta realização, o meio de fermentação inclui ácido L-ascórbico extracelular e tem uma fonte de oxigénio assimilável. Nas realizações preferidas da cultura de fermentação, as microalgas podem ser escolhidas de entre o grupo que consiste em organismos do género Prototheca e organismos da espécie Chlorella protothecoid.es. Além disso, as realizações preferidas da cultura de fermentação incluem uma cultura de fermentação com um pH inferior a cerca de 6, sendo de preferência inferior a 5,5 e ainda mais preferencialmente inferior a cerca de 5,0.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Microrganismos Os microrganismos para a produção de ácido L-ascórbico a baixo pH são microalgas do género Prototheca, especialmente as espécies Prototheca zopfii e Prototheca moriformis, e microalgas da espécie Chlorella protothecoides. O método foi demonstrado com: Prototheca zopfii, estirpe BTR 1254; Prototheca moriformis, estirpe BTR 1385 (ATCC 75669); Chlorella protothecoides BTR 902 (ATCC 75667). A Prototheca zopfii estirpe UTEX 1438 é capaz de produzir ácido L-ascórbico a pH elevado e deverá produzi-lo também a pH baixo. 4

Prototheca zopfii estirpe UTEX 1438 foi obtida a partir da Colecção de Cultura de Algas do Departamento de Botânica da Universidade do Texas em Austin, Austin, Texas 78713-7640, Estados Unidos da América. As culturas estão disponíveis ao público por um preço nominal de USD 25,00 cada. Prototheca zopfii, estirpe BTR 1254, Prototheca moriformis estirpe BTR 1385, Chlorella protothecoides BTR 902 foram colhidas num meio selvagem. Prototheca moriformis estirpe BTR 1385 (ATCC 75669) e Chlorella protothecoides BTR 902 (ATCC 75667) foram depositadas na American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive Rockville, MD 20852, Estados Unidos da América, em 9 de Fevereiro de 1994.

Meio O meio de cultura inclui a fonte de carbono, uma variedade de sais e, geralmente, vestígios metálicos. A fonte de carbono pode ser qualquer fonte de carbono adequada para a fermentação de microrganismos da presente invenção. Em particular, a fonte de carbono pode ser escolhida de etanol, glicerol e glicose e preferencialmente é glicose. A fonte de glicose pode ser glicose ou qualquer carbo-hidrato que possa ser convertido em glicose in situ, por exemplo, melaço, xarope de milho, etc.

Para promover um crescimento celular óptimo, mas não inibir ou limitar indevidamente, deve ser usada uma quantidade da fonte de glicose, não repressiva e não limitativa, no fermentador. Apesar de concentração óptima de glicose poder variar de organismo para organismo, esta é facilmente determinada mediante um ensaio. Adições periódicas que mantenham a fonte de glicose no intervalo 5-30 g/L são normalmente suficientes para promover o crescimento celular evitando a inibição da glicose.

Desejavelmente, estão inicialmente presentes outros aditivos juntamente com a fonte de glicose e podem ser continuamente adicionados ao meio para manter as suas concentrações. Estes aditivos incluem fosfatos de metais alcalinos, particularmente sob a forma do fosfato de sódio dibásico e fosfato de potássio monobásico. A quantidade total do fosfato de sódio dibásico está tipicamente compreendida entre 1-2 g total/L, de preferência entre 1-1,5 g total/L e preferencialmente é cerca de 1,3 g total/L. A quantidade total do fosfato de sódio dibásico inicialmente presente no fermentador é 5

( tipicamente cerca de 35-50%, mais tipicamente cerca de 40-45% da quantidade total do fosfato de sódio dibásico adicionado. A quantidade total do fosfato de potássio monobásico é normalmente cerca de 1,5-3 g/L, mais usualmente cerca de 2-2,5 g/L. A quantidade presente inicialmente é geralmente cerca de 40 a 50%, mais usualmente cerca de 45 a 50% da quantidade total.

Um agente de quelação biologicamente aceitável, tal como citrato de trissódio, é vantajosamente adicionado numa quantidade total de cerca de 0,8-1,2 g/L, usualmente cerca de 1,0 g/L. É adicionado um ácido mineral biologicamente aceitável para manter os vestígios metálicos em solução e para neutralizar o amoníaco que normalmente é usado como fonte de azoto. Convenientemente, é usado ácido sulfurico concentrado a cerca de 1-2 mL/L, tipicamente cerca de 1,2-1,5 mL/L. É adicionado magnésio, como sal fisiologicamente aceitável, por exemplo sulfato, cerca de 0,1-0,2 g/L, de preferência cerca de 0,1-0,15 g/L. Como ferro e cobre aceleram a ruptura do ácido L-ascórbico extracelular e, consequentemente, inibem a sua acumulação no meio, a quantidade usada destes metais é limitada. O ferro (+2) está inicialmente presente numa concentração de cerca de 2-5 mg/L, de preferência entre cerca de 3-4 mg/L, e não está incluído em qualquer das adições subsequentes. O cobre está presente em quantidades relativamente diminutas, geralmente cerca de 1-50 g/g de glicose. Uma solução de vestígios metálicos (Tabela 3) é adicionada numa quantidade total de cerca de 10-15 mL/L, tipicamente cerca de 12-14 mL/L. Baseada na glicose, a solução de vestígios metálicos corresponde a 0,1-0,2 mL/g. Por conveniência, a solução apresentada na Tabela 1 é adicionada durante a fermentação. (A preparação da solução é descrita na Tabela 5). Embora vários sais sejam referidos como mono-básicos ou dibásicos, deve entender-se que este facto deve-se a conveniência e não a necessidade. Como estes compostos são tampões, a extensão da protonação varia com o pH do meio. Para evitar a introdução de microrganismos estranhos, são usadas condições assépticas. 6 6 TABELA 1 Formulação do Meio

(Relativamente à glicose)

Componente

Glicose 1,0

Citrato trissódico, di-hidratado 0,0125

Sulfato de magnésio anidro 0,0082

Fosfato de sódio monobásico 0,0116

Fosfato de potássio monobásico 0,0238

Fosfato de sódio dibásico 0,0121 Ácido sulfórico a 98% (p/p) 0,0329

Mistura de vestígios metálicos (Tabela 3) 0,1675 mL/g

Fermentação

Antes da inoculação, o meio nutritivo é levado à temperatura desejada, tipicamente a 30-40°C, de preferência cerca de 35°C. O meio é inoculado com uma cultura em crescimento activo do microrganismo desejado, numa quantidade suficiente para produzir uma densidade celular elevada, após um período de crescimento razoável. As densidades celulares iniciais típicas são 0,1-0,5 g/L, mais tipicamente são 0,15-0,4 g/L, com base no peso seco das células. As células são cultivadas até atingirem uma densidade celular de pelo menos cerca de 5 g/L, de preferência cerca de 10-80 g/L, sendo preferencialmente de 40-60 g/L. Esta fase requer, tipicamente, entre 10-40 horas, mais tipicamente entre 15-25 horas.

Inicialmente, é adicionado cerca de 15-30%, tipicamente cerca de 20-25% da fonte total de glicose. Quando a concentração de glicose desce, é reposta, como necessário, adicionando de alíquotas da solução glicose-concentrado de sais a cerca de 20% (Tabela 1) mantendo a concentração de glicose total abaixo dos 30 g/L. As técnicas convencionais, tais como o teste de enzima glicose oxidase e a cromatografia líquida a pressão elevada, podem ser usadas para monitorizar a concentração da glicose no 7

sobrenadante, isto é, componente do meio isento de células. Uma pequena quantidade de agente antiespuma pode ser adicionada durante a fermentação.

Amoníaco é adicionado como fonte de azoto e para controlo do pH. Consequentemente, a quantidade de azoto no meio depende da sua acidez e capacidade tampão. O amoníaco é convenientemente adicionado mediante a adição de uma corrente de amoníaco gasoso ao fluxo de ar ou de outra fonte de oxigénio, que é introduzida dentro do fermentador. O pH do meio pode ser controlado dentro dos limites desejados, pela adição de amoníaco ou de uma base inorgânica como necessário. O pH é preferencialmente mantido abaixo de um pH ao qual ocorre degradação significativa do ácido L-ascórbico extracelular por oxidação. Neste contexto, a expressão “degradação significativa” refere-se à degradação de mais do que cerca de 20% do ácido L-ascórbico produzido, mais particularmente, superior a cerca de 10% do ácido L-ascórbico produzido, e mais particularmente, superior a cerca de 5% do ácido L-ascórbico extracelular. O pH do meio é mantido abaixo de cerca de 6,0, mais preferencialmente inferior a cerca de pH 5,5, e mais preferencialmente ainda inferior a cerca de pH 5,0. Ao manter o pH do meio de fermentação dentro dos parâmetros acima mencionados, são obtidas vantagens significativas relacionadas com a produção do ácido L-ascórbico. A valores inferiores de pH, a degradação do ácido L-ascórbico extracelular é reduzida. Consequentemente, podem ser obtidas produtividades mais elevadas de ácido L-ascórbico. Os peritos na técnica reconhecem que o ácido L-ascórbico extracelular é significativamente mais fácil de recuperar do que o ácido L-ascórbico intracelular. Adicionalmente, a produção extracelular do ácido L-ascórbico pode permitir o desenvolvimento de processos de produtividade mais elevada porque os processos comerciais podem ser desenvolvidos sem a necessitarem de concentrações ultra elevadas de ácido L-ascórbico intracelular que podem originar a inibição inversa da produção metabólica do ácido L-ascórbico.

Numa realização da presente invenção, durante o crescimento inicial de células o pH é controlado no intervalo entre cerca de 3,0-6,0, de preferência a cerca de 3,5-5,0, sendo preferencialmente cerca de 3,5-4,5. Quando a densidade das celular é superior a cerca de 8 8

/ f 10 g/L, geralmente, depois de cerca de 10-25 horas, o pH é reduzido para 2,5-5,0, de preferência para 2,5-4,0. Isso, pode ser convenientemente realizado parando temporariamente a adição de amoníaco. O pH do caldo desce devido ao ácido produzido pelas células. Quando o pH do caldo atinge o pH desejado, a adição de amoníaco é retomada.

Tal como acima se refere, mediante a operação do processo de fermentação da presente invenção, mantendo os valores de pH dentro dos parâmetros acima definidos, é possível existir ácido L-ascórbico extracelular no meio de fermentação sem que seja degradado por oxidação. Além disso, é possível acumular-se ácido L-ascórbico no meio de fermentação para se atingir concentrações elevadas do ácido ascórbico extracelular sem que ocorra degradação significativa do ácido ascórbico por oxidação. Assim, enquanto o processo de fermentação requer a presença de oxigénio, tal como se descreve abaixo com mais detalhe, é possível conduzir com sucesso o processo de fermentação da presente invenção produzindo elevadas quantidades de ácido ascórbico extracelular mesmo em presença de uma fonte de oxigénio assimilável. Deve notar-se que a fonte de oxigénio assimilável não se limita a ar ou oxigénio gasoso, mas que pode incluir também outras espécies químicas que no ambiente da fermentação são convertidas em oxigénio.

Deve ser adicionado oxigénio suficiente ao meio durante o decurso da fermentação para manter o crescimento das células durante o crescimento inicial e para manter o metabolismo e a formação do ácido L-ascórbico. Oxigénio é convenientemente fornecido por agitação e arejamento do meio. Os métodos convencionais, tais como agitação ou mistura, podem ser usados para agitar e arejar o meio. A concentração de oxigénio no meio é de preferência 20-100% do valor de saturação (isto é, a solubilidade do oxigénio no meio à pressão atmosférica e a cerca de 30-40 °C) apesar de poderem ocorrer descidas para concentrações inferiores se a fermentação não for adversamente afectada. A concentração de oxigénio do meio pode ser monitorizado mediante processos convencionais, tal como um eléctrodo sensível a oxigénio. Podem ser usadas outras fontes de oxigénio, tal como oxigénio gasoso não diluído e oxigénio gasoso 9

diluído com um gás inerte diferente de azoto. A fermentação é continuada até que a formação do ácido L-ascórbico cessa, essencialmente, tal como é evidenciado pela acumulação do ácido L-ascórbico extracelular. O tempo total de fermentação é tipicamente 24 a 120 horas.

Tipicamente, a maior parte do ácido L-ascórbico produzido no presente processo é extracelular. As células podem ser removidas do caldo mediante processos convencionais, tais como filtração ou centrifugação, e o ácido L-ascórbico pode ser recuperado a partir da solução sobrenadante isenta de células, mediante processos convencionais, tais como permuta iónica, cromatografia, extracção, cristalização, separação através de membrana, osmose inversa, destilação, processos de derivatização química, etc. A expressão “processos de derivatização química” refere-se a um processo em que o ácido L-ascórbico produzido reage com outra espécie química que é mais fácil de recuperar e/ou mais estável. Por exemplo, Cayle, Patente U.S. 4 595 659 divulga um processo de isolamento do ácido L-ascórbico a partir de um meio de fermentação aquoso mediante um processo convencional de absorção por resina de permuta iónica e eluição seguida de descoloração, evaporação e cristalização. O isolamento do ácido iso-ascórbico estruturalmente semelhante a partir do caldo de fermentação por um sistema contínuo de extracção de leitos múltiplos de resina de permuta iónica é descrito por K. Shimizu, Agr. Biol. Chem. 31, 346-353 (1967). A recuperação do ácido L-ascórbico dos processos da presente invenção pode incluir processos contínuos, semicontínuos ou descontínuos por cargas. Nos processos contínuos ou semicontínuos, as concentrações do ácido L-ascórbico extracelular não são tão elevadas como nos processos de recuperação por cargas descontínuas porque o ácido L-ascórbico extracelular será removido a partir do vaso de fermentação durante a fermentação. De facto, podem ser conduzidos processos contínuos ou semicontínuos em que a concentração do ácido L-ascórbico extracelular permaneça muito baixa ou perto de não ser detectável. 10 η / Λ

Tal como se notou acima, o processo da presente invenção produz quantidades significativas de ácido L-ascórbico extracelular. Em particular, o processo produz ácido L-ascórbico extracelular tal que pelo menos 2% do ácido L-ascórbico total é extracelular, preferivelmente pelo menos cerca de 10% do ácido L-ascórbico total é extracelular, e mais preferivelmente pelo menos 20% do ácido L-ascórbico total é extracelular. Mediante o uso da presente invenção pode ser obtida, uma produção de uma concentração de ácido L-ascórbico extracelular que é superior a cerca de 1 mg/L, sendo de preferência superior a cerca de 10 mg/L, e mais preferencialmente superior a cerca de 20 mg/L.

Uma outra realização da presente invenção inclui uma cultura por fermentação que inclui a produção de ácido L-ascórbico por microalgas do género Prototheca ou da espécie Chlorela protothecoides e um meio de fermentação com um pH compreendido entre 2,5 e 6,0. Nesta realização, o meio de fermentação inclui ácido L-ascórbico extracelular e uma fonte de oxigénio assimilável. As algas produtoras do ácido L-ascórbico podem ser as acima descritas. De forma semelhante, a composição do meio de fermentação, incluindo o ácido L-ascórbico extracelular, foi acima descrita dum modo geral.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL O processo produz ácido L-ascórbico por fermentação num caldo de fermentação de pH baixo (2,5-6,0). A este pH, o ácido L-ascórbico não é facilmente oxidado pelo ar. Consequentemente, não é necessário que o ácido L-ascórbico produzido seja intracelular. O ácido L-ascórbico que se acumula no meio não é imediatamente oxidado pelo oxigénio presente no caldo. O ácido L-ascórbico (Vitamina C) é usado como suplemento alimentar para prevenção do escorbuto. O ácido L-ascórbico e alguns dos seus derivados, como palmitato de ascorbilo, têm sido usados como antioxidantes para produtos alimentares.

Exemplo 1

Este exemplo demonstra que Prototheca são capazes de produzir ácido L-ascórbico (L-AA) a pH elevado. A maior parte do ácido L-ascórbico produzido era intracelular.

Preparação do Meio: Uma solução de 0,27 g de fosfato monobásico de potássio e 0,23 g de fosfato dibásico de sódio em 600 mL de água destilada, foi esterilizada por aquecimento num fermentador de vidro de 1 L equipado com meios para agitação do meio e alimentação dos componentes nutritivos ao meio, uma fonte de oxigénio e outros agentes abaixo descritos. Após o meio ter arrefecido, adicionaram-se 5 mL de uma solução com 1,9 g/L de sulfato ferroso hepta-hidratada através dum filtro estéril de 0,2 pm.

Concentrado de sais de glicose: Os componentes listados na Tabela 2 foram esterilizados, e combinados, após arrefecimento, até um volume final de 600 mL. TABELA 2

Concentrado de sais de glicose

Quantidade Composto/Componente 56 g Grupo 1 Glicose, mono-hidrato de grau alimentar (base anidra) em 80 mL de água 0,7 g 0,46 g 0,7 mL Grupo 2 Citrato trissódico di-hidratado sulfato de magnésio, anidro ácido sulfurico em 10 ml de água 0,65 g 1,3 g 0,68 g Grupo 3 fosfato monobásico de sódio fosfato monobásico de potássio fosfato dibásico de sódio em 10 mL de água 9,4 mL Grupo 4 Solução de metais vestigiais (Ver Tabela 3) 12 ί

Tabela 3

Solução de metais vestigiais

Componente Concentração5 (mg/L) Cloreto de cálcio, di-hidratado 3120 Sulfato de magnésio (II), mono-hidratado 400 Sulfato de cobre (II), mono-hidratado 16 Cloreto de cobalto (II), penta-hidraado 40 Acido bórico 160 Sulfato de zinco (II), hepta-hidratado 400 Molibdato de sódio, di-hidratado 19 Sulfato de vanádio, di-hidratado 20 Nitrato de níquel (II), hexa-hidratado 8 Selenito de sódio 18 a Concentração do metal.

Solução de metais vestigiais: Os ingredientes listados na Tabela 3 e 20 mL de ácido clorídrico concentrado foram diluídos com água destilada até 1L.

Meio Nutritivo: 20 mL de concentrado de sais de glicose foram adicionados ao meio de fosfato no fermentador.

Crescimento de células e Produção de Ácido L-Ascórbico: O meio nutritivo foi aquecido e mantido a 35°C, iniciou-se a agitação a 300 rpm, ar foi espalhado para o meio a 0,1 L/min, o pH foi ajustado para 6,9 mediante a adição de amoníaco na conduta de ar. O meio foi inoculado com uma cultura em crescimento activo para obter uma densidade de células inicial de aproximadamente 0,3 g/L de peso seco.

Desenvolveram-se células até densidades compreendidas entre cerca de 20-50 g/L (base seca). O pH foi controlado para valores entre cerca de 6,5-7,0 por adição de amoníaco gasoso. Para manter um excesso de oxigénio dissolvido entre 20% e 90% de saturação do ar, durante o decorrer da fermentação, a agitação foi iniciada a 450 rpm e aumentada 13

para 800 rpm. O arejamento foi iniciado a 0,2 L/min e aumentado para 0,6 L/min. A disponibilidade da glicose no sobrenadante foi monitorizada quer pelo teste com a enzima glicose oxidase quer por cromatografia líquida de alta pressão. Quando a concentração da glicose baixou, esta foi reposta por adição de alíquotas da solução de concentrado glicose -sais a 20% enquanto se manteve a concentração total de glicose abaixo de 30g/L. Após se ter adicionado todo concentrado glicose - de sais é subsequentemente consumido, o meio de cultura foi ensaiado para determinação do ácido L-ascórbico. 0 método usado para determinação do ácido L-ascórbico (L-AA) é descrito por Grun e Loewus, Analytical Biochemistiy (1983) 130:191-198. O método é uma técnica de permuta iónica, usando uma coluna cromatográfíca de análise de ácidos orgânicos 7,8 x 300 mm, HPX-87 (Bio-Rad Laboratoires, Richmond, CA). As condições são: fase móvel, ácido nítrico 0,013 M; caudal 0,8 mL/min; pressão 1500 psig (1,04 x 108 dines/cm2); detecção, absorvância a 245 nm. Este sistema faz a discriminação entre os isómeros L- e D- do ácido ascórbico.

Para determinação do peso seco da densidade de células, amostras globais do meio de cultura foram removidas a partir da cultura, 5 mL foram centrifugados a 4000 x g durante 5 min e o sedimento foi lavado uma vez com água destilada, e foi depois lavada para dentro de uma cápsula de alumínio para pesagem tarada conhecida. As células foram secas durante um período de 8-24 horas a 60°C e durante um período adicional de 1 hora a 105°C. O peso das células foi calculado pela diferença. Os resultados são apresentados na Tabela 4.

Tabela 4

Espécie Tempo. Peso de L-AA total (°C) Células Secas

Prototheca zopfii 35 27,4 37,8 UTEX 1438a a Os valores são a média de quatro fermentações. 14 /

Exemplo 2

Este exemplo ilustra a produção do ácido L-ascórbico por Prototheca zopfii a baixo pH (3,5-5,0). Uma quantidade significativa de ácido L-ascórbico foi produzida no meio extracelular, mesmo com oxigénio dissolvido mensurável no meio de cultura. A não ser que se indique de outra forma, foi seguida a técnica do Exemplo 1. A fermentação decorreu num fermentador de 14-L, configurado e controlado da mesma forma que o fermentador de 1-L. O concentrado usado é apresentado na Tabela 5. TABELA 5 Concentrado de Sais de Glicose Quantidade Composto/Componente 800 g Grupo 1 glicose, mono-hidratada de grau alimentar (base anidra) em 2,1 L de água 15 g 6,6 g 10 mL Grupo 2 citrato trissódico di-hidratado sulfato de magnésio, anidro ácido sulfurico em 250 mL de água 22 g 22 g Grupo 3 fosfato de sódio monobásico fosfato de sódio dibásico em 250 mL de água 134 mL Grupo 4 solução de metais vestigiais (Ver Tabela 3)

Preparação do Meio de: Uma solução de 3,9 g de fosfato de potássio monobásico e 3,3 g de fosfato de sódio dibásico em 7,2 L de água destilada, foi esterilizada por aquecimento num fermentador de vidro de 14-L. Após o meio ter arrefecido , adicionaram-se 27 mL de uma solução de sulfato ferroso hepta-hidratado com 6,0 gL através dum filtro estéril de 0,2 pm.

Crescimento das Células e Produção de Ácido L-ascórbico: Em adição aos ingredientes listados na Tabela 6, o meio continha 2 mg/L de hidrocloreto de tiamina foi adicionado em condições assépticas após o fermentador ter sido esterilizado por aquecimento e 15 arrefecido. A temperatura era de 30 °C. O meio foi inoculado com uma cultura em crescimento activo da espécie Prototheca zopfii BTR 1254 para obter uma densidade de células inicial de aproximadamente 0,3 g/L de peso seco.

As células cresceram até densidades de 56 g/L de peso seco (taxa de crescimento 0,20 h'1). O pH foi mantido valores entre cerca de 3,5 e 5,0 por adição de amoníaco gasoso. A agitação foi iniciada a 100 rpm e aumentada para 800 rpm. O arejamento foi iniciado a, 2,0 L/min e aumentado para 0,6 L/min de ar. Os resultados analíticos e são condições são apresentados na Tabela 6. TABELA 6

Sobrenadante Total

Tempo D.C. L-AA L-AA (h) pH (g/L) (mg/L) (mg/L) Comentários 6 5,0 0,6 12 4,8 3,3 250 rpm; 200 mLa 21 350 rpm; 4,0 L/min 22 5,0 15,9 400 mL 24 3,8 24,0 34,6 11,2 6,0 L/min; 500 mL 25 4,0 32,2 39,7 15,8 800 rpmb 27 3,9 48,6 58,6 27,0 28 4,0 53,6 71,6 71,6 oxigénio dissolvido media zero 29 4,0 55,8 73,5 73,5 a Concentrado de sais de glicose b 1050 mL de concentrado de sais de glicose foram adicionados durante as 3 horas seguintes

Exemplo 3

Este exemplo ilustra a produção de ácido L-ascórbico por Prototheca moriformis a baixo pH (4,0-5,0). Uma quantidade significativa de ácido L-ascórbico foi produzida no meio extracelular, mesmo com oxigénio dissolvido mensurável no meio de cultural. A não ser que se indique de outra forma, foi seguida a técnica do Exemplo 2. 16

Crescimento de Células e Produção de Ácido L-Ascórbico: Em adição aos ingredientes listados na Tabela 1, o meio continha hidrocloreto de tiamina 2 mg/L adicionado em condições assépticas após o fermentador ter sido esterilizado por aquecimento e arrefecido. A temperatura foi 30°C. O meio foi inoculado com uma cultura em crescimento activo da espécie Prototheca moriformis ATCC 75669 para obter uma densidade de células inicial de cerca de 0,3 g/L de peso seco. As células cresceram até densidades de células de 42 g/L de peso seco (taxa de crescimento 0,23 h'1). Durante as primeiras 22 horas o pH foi mantido a cerca 5,0 por adição de amoníaco gasoso. Foi então interrompida a adição de amoníaco para controlo do pH. Quando o pH desceu para 4,0, a adição de amoníaco foi retomada. O pH foi mantido a 4,0 durante a restante fermentação. Os resultados são apresentados na Tabela 7. TABELA 7

Sobrenadante Total

Tempo 00 pH D.C (g/L) L-AA (mg/L) L-AA (mgL) mg L-AA/g de células Comentários 11 5,0 0,9 12 250 rpm 17 4,8 3,9 400 rpm; 3,0 1/min; 200 mLa 20 5,2 8,2 400 rpm 21 500 ml; 4 L/min 22 5,2 10,8 400 mlb 24 800 rpm; 5 L/min 26 4,3 27,7 105 109 3,8 28 4,1 34,5 132 140 3,8 850 rpm 30 4,1 4,19 150 162 3,8 a Glicose - concentrado de sais b mais 1115 ml durante as 6 horas seguintes

Exemplo 4

Este exemplo ilustra a produção do ácido L-ascórbico pela Chlorella protothecoides a baixo pH (3,5-5,0). Uma quantidade significativa do ácido L-ascórbico foi produzida no 17

meio extracelular, mesmo com oxigénio dissolvido mensurável no meio cultural. A não ser que de outra forma se indique, foi seguida a técnica do Exemplo 3.

Crescimento Celular e Produção de Ácido L-Ascórbico: O meio foi inoculado com uma cultura em crescimento activo da espécie Chlorella protothecoides ATCC 75667 para obter uma densidade celular inicial de cerca de 0,3 g/L em peso seco. As células cresceram para densidades celulares de 37 g/L em peso seco (taxa de crescimento 0,16 h'1). Durante as primeiras 18 horas o pH foi mantido a cerca 5,0 por adição de amoníaco anidrido gasoso. Foi então parada a adição de amoníaco para controlo do pH. Quando o pH desceu para 3,5, a adição de amoníaco foi resumida. O pH foi mantido a 3,5 para a restante fermentação. Os resultados são apresentados na Tabela 8. TABELA 8

Sobrenadante Total

Tempo (h) pH D.C <g/L) L-AA (mg/L) L-AA (mg/L) Comentários 5 5,1 0,6 300 rpm; 50 mL 18 5,0 4,8 22 -- -- 400 rpm; 350 mLa 24 3,4 11,9 15,2 1,8 600 ml; 4,0 L/min 27 3,4 17,0 24,5 11,2 700 rpmb 32 3,5 23,5 64,0 21,0 35 3,5 36,7 100,4 52,0 glicose esgotada a - Concentrado de sais de glicose b 1800 mL de concentrado de sais de glicose adicionados durante as 3 horas seguintes

Lisboa, 1 5 JUN. 2001

Dra. Maria Silvina Ferreira Agente Of’wld«! 'ndusirial R. Ca;í""o, ;ΰ - rí - - 'oõ LISBOA

Teleís. 213 Ô51289 - 213815050

Claims

1

REIVINDICA ÇÕES 1. Processo para a produção de ácido L-ascórbico, caracterizado pelo facto de o processo compreender: (a) fazer-se uma cultura de um organismo escolhido do grupo que consiste nos organismos do género Prototheca e nos organismos do género Chlorella protothecoides num meio de fermentação com um pH inferior a 6,0 em presença duma fonte de oxigénio assimilável; e (b) recuperar o ácido L-ascórbico a partir do referido meio de fermentação.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido organismo ser um organismo do género Prototheca.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido organismo ser escolhido do grupo que consiste em Prototheca moriformis e Prototheca zopfii.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido processo ser levado a cabo até ser produzido extracelularmente pelo menos 10% de ácido L-ascórbico.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido processo ser levado a cabo até ser produzido extracelularmente pelo menos 20% de ácido L-ascórbico.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido ácido L-ascórbico se acumular extracelularmente no referido meio de fermentação. 2

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida fase de recuperação compreender a recuperação do ácido L-ascórbico a partir do meio de fermentação extracelular.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a referida fase de recuperação de ácido L-ascórbico a partir do meio de fermentação extracelular ser realizada mediante um processo escolhido do grupo de processos que consiste em permuta iónica, cromatografia, extracção, separação por membrana, osmose inversa, destilação, derivatização química e cristalização.

9. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a referida fase de recuperação compreender ainda a fase de recuperação do ácido L-ascórbico intracelular.

10. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido do meio de fermentação possuir um pH inferior a cerca de 5,5.

11. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido meio de fermentação possuir um pH inferior a cerca de 5,0.

12. Processo de acordo com a reivindicação l, caracterizado pelo facto de a densidade celular do referido organismo ser inferior a cerca de 5 g/1.

13. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de não ocorrer degradação significativa do ácido L-ascórbico.

14. Cultura por fermentação, caracterizada pelo facto de compreender um organismo escolhido do grupo que consiste em organismos do género Prototheca e organismos da espécie Chlorella protothecoides e um meio de fermentação com um pH compreendido no intervalo entre 2,5 e 6,0 e compreende ácido ascórbico extracelular em que a referida cultura por fermentação é produzida mediante um 3 t processo que compreende fazer-se a cultura do referido organismo no mencionado meio de fermentação numa fonte de oxigénio assimilável até o referido ácido ascórbico extracelular ser produzido pelo referido organismo.

15. Cultura por fermentação de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo facto de o referido meio de fermentação compreender pelo menos 1 mg/ml de ácido L-ascórbico extracelular.

16. Processo para a produção de ácido L-ascórbico, caracterizado pelo facto de o processo compreender: (a) fazer-se a cultura de um organismo escolhido do grupo que consiste em organismos do género Prototheca e organismos da espécie Chlorella protothecoides num meio de fermentação com um pH inferior a 6,0 na presença duma fonte de oxigénio assimilável em que o referido processo é levado a cabo até o referido meio de fermentação apresentar uma concentração de ácido L-ascórbico superior a cerca de lmg/1; e (b) recuperar do ácido L-ascórbico a partir do referido meio de fermentação.

17. Processo para a produção de ácido L-ascórbico, caracterizado pelo facto do processo compreender: (a) fazer-se a cultura de um organismo escolhido do grupo que consiste em organismos do género Prototheca e organismos da espécie Chlorella protothecoides num meio de fermentação com um pH inferior a 5,0 na presença duma fonte de oxigénio assimilável; e (b) recuperar do ácido L-ascórbico a partir do referido meio de fermentação.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de o processo ser levado a cabo até pelo menos 2% do referido ácido L-ascórbico ser extracelular. 4 I

19. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a densidade celular do referido organismo ser inferior a cerca de 5 g/1.

20. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o processo ser levado a cabo até pelo menos 2% do referido ácido L-ascórbico no mencionado meio de fermentação ser extracelular. Lisboa, 15 m. 2001

Dra. Maria Filvina Ferreira Agente CV.:·' R.Cost:i :.:0-:1

Telefs.213 851539 - 2138150 50