ES2280105T3 - Proteinas de tejido de cemento de rhipicephalus appendiculatus. - Google Patents

Abstract

Una proteína de cemento de tejido cuya proteína consta de (i) la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO. 16 o SEQ ID NO. 11 o que contiene una de las secuencias parciales de aminoácido mostradas en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8 o SEQ ID NO. 17; o (ii) una secuencia de aminoácido que tiene al menos 50% de homología a lo largo de toda la secuencia de aminoácido de (i).

Description

Proteínas de tejido de cemento de Rhipicephalus appendiculatus.

La presente invención consiste en proteínas de cemento de tejido producidas por ciertas especies de ectoparásitos que se alimentan de sangre. Estas proteínas y composiciones que comprenden estas proteínas resultan particularmente útiles para la unión temporal o permanente de tejido de animales entre sí o con otros biomateriales. La presente invención también se relaciona con el uso de proteínas de cemento de tejido en la producción de vacunas para proteger animales contra la mordedura de ectoparásitos que chupan la sangre y la transmisión de virus, bacterias y otros agentes patógenos por tales ectoparásitos.

El cemento se produce a través de muchos ectoparásitos que se alimentan de sangre, incluyendo ciertas especies de garrapatas ixodidas. Las garrapatas ixodidas (duras) son parásitos hematófogos que se sujetan a un vertebrado huésped por medio de un "cono de cemento", un producto del tipo II y tipo III acini de las glándulas salivales de garrapata (Kemp et al., 1982; Walker et al., 1985). (Todos los documentos aquí referidos están listados al final de la descripción.)

El cemento que forma el cono es una secreción de color blanco leche que se inyecta en la piel de los animales de los cuales se alimentan estos parásitos. El cemento se extiende en la zona de mordedura y sobre la piel y, después de que se endurezca, asegura que las partes de la boca permanezcan firmemente ancladas al huésped durante el periodo de alimentación, que normalmente dura entre 4 y 8 días. El cono de cemento funciona adicionalmente como una junta para prevenir la fuga o escape de fluidos desde la zona de mordedura durante la alimentación.

El cono de cemento de garrapata es una estructura en capas, construida a partir de dos tipos principales de cemento. El primer tipo de cemento se produce justo minutos después de establecer la zona de mordedura y se endurece rápidamente para formar un "centro" rígido de cono. Más tarde, se segrega un segundo tipo de cemento, aproximadamente 24 horas después de la unión, y se endurece de manera más lenta para forma una corteza más flexible. En garrapatas adultas, la producción de cemento normalmente continúa hasta el 3º o 4º días después de la unión (Kemp et al., 1982; Sonenshire et al., 1991).

El cono de cemento de garrapata parece ser fundamentalmente proteínico, pero también contiene algunos carbohidratos y lípidos. Un estudio previo reveló la composición de aminoácido de todo el cemento en Boophilus microplus por ser rico en glicina, leucina, serina y tirosina (Kemp et al., 1982). Sin embargo, las proteínas individuales que conforman el cemento de garrapata apenas se caracterizan. A pesar de la movilidad de las proteínas de los componentes se ha mostrado en geles SD-PAGE, ninguno ha sido aún purificado.

El proceso por el cual los componentes de cemento se endurecen tampoco está muy claro, a pesar de que se han propuesto mecanismos similares para el endurecimiento de catículas y coagulación de hemolinfo (Kemp et al., 1982; Moorhouse and Tatchtell, 1966). En el presente, no se ha producido ninguna prueba científica para sustentar estos mecanismos teóricos.

Se ha observado que los polipéptidos que forman la corteza de cemento parecen ser similares a ciertos componentes estructurales de piel de vertebrados. La relación de estas moléculas similares a las de los vertebrados puede hacer posible que las garrapatas usen enzimas derivadas del huésped durante el proceso de endurecimiento del cemento, por ejemplo: lisil-oxidasas que cruzan colágeno y elastina (Siegel, 1979); o transglutaminasas, como factor coagulación XIIIa, que se produce durante la curación de la herida y cruza fibronectina, fibrinas y colágeno (Ichinose et al., 1990). Estas enzimas pueden cruzar polipéptidos de corteza con las proteínas de matriz extracelular de la piel.

Otras enzimas como fenoloxidasas o peroxidasas que catalizan el endurecimiento de estructuras extracelulares artrópodas (Sugumaran et al., 1992) se han identificado en glándulas salivales de R. Appendiculatus y por lo tanto tienen posibilidades de jugar un papel en la solidificación de cono de cemento.

La composición de cemento de garrapatas parece ser similar entre diferentes especies de garrapata ixodida. Por ejemplo, un antisuero creado contra una proteína salival 90 kD de la garrapata de oreja marrón, Rhipicephalus appendiculatus, ha demostrado reconocer polipéptidos procedentes de las glándulas salivales y proteínas de cemento de la garrapata de perro americano, Dermacenter variabilis, la garrapata de estrella solitaria, Amblyomma americanum, y la garrapata de perro marrón, R. sanguineus (Jaworski et al., 1992).

Todas estas especies de garrapata son altamente efectivas como transmisoras de enfermedad. Por ejemplo, Rhipicephalus appendiculatus representa un obstáculo mayor para el desarrollo del ganado en varias regiones subsaharianas. Transmite el parásito protozoario Theileria parva que provoca la normalmente fatal Fiebre de la Costa Este. Esta enfermedad es considerada con frecuencia como la enfermedad más importante para el ganado (Norval et al., 1992a; Norval et al., 1992b). Esta garrapata es también la principal portadora del virus que causa la enfermedad de oveja de Nairobi, una enfermedad incapacitadora y a menudo mortal en ovejas y cabras (Davies, 1988). Rhipicephalus appendiculatus y otras pestes de garrapatas también provocan daños considerables en la piel, afectando de este modo la industria peletera.

En un esfuerzo por combatir enfermedades transmitidas por parásitos, se han testado componentes de cemento no purificado como provocadores de resistencia al huésped (Brown et al., 1986; Shapiro et al., 1989), pero no se han desarrollado con éxito vacunas fiables y seguras basadas en proteínas de cemento. Las proteínas de cono resultarían ser un objetivo razonable para una vacuna debido a que la formación del cono es esencial para que la garrapata se una al huésped y se alimente. Sin embargo, sólo algunas de las proteínas de cono son antigénicas.

Por lo tanto, existe una gran necesidad de una vacuna eficaz para combatir enfermedades que se transmiten por ectoparásitos que se alimentan de sangre. La aclaración de los componentes de cemento de tejido producido por estos organismos permitiría el diseño racional de tales vacunas.

Además, estas moléculas podrían resultar útiles en medicina como componentes de cemento de tejido. Los cementos de tejido actualmente disponibles son de dos tipos, teniendo los dos tipos ventajas significativas. Pegamentos de base acrílica son extremadamente fuertes, así como tóxicos y pueden por lo tanto usarse solamente en pequeñas cantidades en el cuerpo. El segundo tipo de cemento de tejido es no inmunogénico pero forma una unión mucho menos fuerte. Como consecuencia, este tipo de cemento sólo resulta útil en un pequeño número de procedimientos quirúrgicos. Por consiguiente, existe la necesidad de un cemento de tejido inmunogénico que sea capaz de unirse a tejido de mamífero con gran fuerza.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención se proporciona una proteína de cemente de tejido que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura 3 o Figura 7 o que contiene cualquiera de las secuencias parciales de aminoácido mostradas en las Figuras 2, 4, a 6, 9, proteínas de cemento de tejido relacionado procedentes de parásitos que se alimentan de sangre, preferentemente garrapatas, y equivalentes funcionales de los mismos.

Las proteínas de la presente invención se presentan en dos subtipos: grupo A y grupo B. Las proteínas del grupo A forman el centro del cono de cemento cuando se segregan en saliva y se endurecen rápido para formar una estructura rígida similar al látex. Las proteínas del grupo B forman la corteza del cono de cemento y se endurecen de manera más lenta. La estructura resultante es más flexible. Por lo tanto, los equivalentes funcionales de proteínas de los grupos A y B poseerán estas respectivas actividades y propiedades.

El término "equivalentes funcionales" aquí se emplea para describir estas proteínas que tienen una función análoga a las proteínas de cemento de tejido que contienen las secuencias de aminoácido identificadas en cualquiera de las Figuras 2 a 8.

Estas proteínas pueden pertenecer a la misma familia de proteínas a la de las proteínas y proteínas parciales identificadas en las Figuras 2 a 8. Por familia de proteína se entiende un grupo de polipéptidos que comparten una función común y muestran homología de secuencia común entre características presentes en secuencias polipéptidas.

Por homología de secuencia se entiende que las secuencias de polipéptidos se relacionan por divergencia a partir de un antecesor común. En particular, como se describirá con más detalle a continuación, las proteínas y proteínas parciales aquí identificadas poseen ciertas secuencias en común que se repiten varias veces a lo largo de la secuencia de la proteína. Preferentemente, la homología entre secuencias de polipéptido es al menos del 50% en toda la secuencia de aminoácido de la proteína. Más preferentemente, la homología es de al menos 75% en toda la secuencia de aminoácido de la proteína. Más preferentemente, la homología es superior al 80% en toda la secuencia de la proteína.

Por "función análoga" se entiende en primer lugar que las proteínas han retenido la capacidad para formar un cemento. Tales proteínas serán por lo tanto capaces de endurecerse durante un periodo de tiempo para formar una masa sólida o pegamento. En segundo lugar, este término puede referirse a proteínas que son estructuralmente similares a las proteínas del grupo A o grupo B y que por lo tanto contienen epítopes similares o idénticos. Estos equivalentes funcionales pueden por lo tanto emplearse como inmunogenes para desarrollar vacunas, dirigidas contra parásitos que se alimentan de sangre, y que tienen como objetivo los miembros de la familia de proteínas de cemento de
tejido.

Equivalentes funcionales de proteínas de cemento de tejido pueden incluir, por ejemplo, mutantes que contienen sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácido de la secuencia de tipo salvaje. Los equivalentes funcionales con función mejorada de la de la secuencia de tipo salvaje pueden también diseñarse a través de mutación sistemática o dirigida de residuos específicos en la secuencia de proteína. Mejoras que se pueden desear en la función incluirán mayor fuerza de enlace, mayor rapidez de enlace o mayor flexibilidad del cemento endurecido.

Los equivalentes funcionales de proteínas de cemento de tejido o fragmentos de proteína pueden hacerse más o menos inmunogénicos que la proteína o el fragmento de proteína correspondiente de tipo salvaje con el fin de conseguir la aplicación deseada. Si las proteínas se van a emplear en procesos quirúrgicos como cementos de tejido, entonces las proteínas deberían ser no inmunogénicas para evitar el ataque del sistema inmunológico. Sin embargo, si las proteínas de cemento de tejido van a emplearse en régimen de vacunas para provocar resistencia del huésped a las proteínas del parásito, entonces las proteínas pueden modificarse para que aumenten su inmunogenicidad. Por lo tanto, tendrán más posibilidades de provocar una respuesta inmune en el huésped vacunado.

Los equivalentes funcionales incluyen sustituciones de aminoácido conservadores que no afectan la función o actividad de la proteína de una manera adversa. Este término también pretende incluir variantes biológicas naturales (p. ej., variantes alélicas o variaciones geográficas de las especies de las cuales se derivan las proteínas de cemento de tejido).

De acuerdo con la invención, los fragmentos de proteínas de cemento de tejido también se prevén como equivalentes funcionales. Los fragmentos que han retenido aquellas porciones de proteína que son las responsables de la actividad deseada pueden resultar ideales en ciertas aplicaciones. Por ejemplo, tramos cortos de péptido derivados de porciones inmunogénicas de proteínas de cemento de tejido pueden resultar útiles como inmunogenes. Un anticuerpo normalmente reconocerá un epítope que esté formado por entre seis y doce residuos de aminoácido. Tales tramos cortos de secuencia de polipéptido son sencillos de producir en grandes cantidades, bien sintéticamente o a través de medios recombinantes.

Las proteínas de cemento de tejido de la presente invención pueden funcionar bien como un componente estructural de tejido de cemento o pueden tener una actividad enzimática dirigida contra los componentes estructurales del cemento de tejido.

Se considera que la mayor parte de las secuencias de proteína y proteína parcial identificadas hasta ahora mostradas en las Figuras 2 a 8 son componentes estructurales de cemento de tejido. En cambio, el solicitante no desea vincularse a esta teoría. Por ejemplo, la secuencia de proteína identificada en la Figura 2 parece contener una secuencia de señal y su secuencia se parece a la de la queratina, una proteína estructural ampliamente estudiada. De modo similar, la proteína cuya secuencia se establece en la Figura 3 también contiene una secuencia de señal y es rica en glicina y prolina, al igual que muchas proteínas estructurales. La proteína cemA, cuya secuencia parcial se ilustra en la Figura 4, contienen un número de repeticiones y por lo tanto es posible que sea un componente estructural de cemento de tejido.

La proteína de la Figura 5 está compuesta por un número de repeticiones y se asemeja al colágeno en secuencia. El cADN codificador comparte secuencias en común con glutenina, una proteína de automontaje conocida. Sin embargo, el solicitante no desea vincularse a esta teoría. La posibilidad de que esta secuencia particular pueda estar implicada en el automontaje crea la oportunidad de usar estas características para otorgar a una proteína no relacionada la habilidad para automontarse.

En común con algunas de las otras proteínas ilustradas en las Figuras acompañantes, la proteína de la Figura 6 contiene un número de puntos de reconocimiento para partes de molécula de carbohidrato, en particular glicosaminoglicanos.

La secuencia de proteína mostrada en la Figura 7 también contiene puntos de unión de consenso para partes de molécula de glicosaminoglicano y tiene una secuencia de señal putativa. La mitad de la terminal amino de la proteína se asemeja a colágeno, mientras que la terminal carboxi tiene más aspectos en común con la queratina. La proteína es rica en glicina y contiene varias repeticiones del motivo (C/S)1-4(Y/F) que también se encuentra en proteínas estructurales de las cáscaras de huevo de ciertos insectos. Las tirosinas en estas secuencias de consenso pueden involucrarse en la unión cruzada de esta proteína por medio de la formación de puentes de ditirosina por la acción de fenoloxi-
dasas.

La secuencia de la Figura 8 es rica tanto en glicina como en tirosina y se asemeja a proteína de cemento de la polychaeta del arrecife Pragmatopoma califomica (ver Figura 9). Por lo tanto, es posible que esta proteína sea también un componente estructural de cemento de tejido. En cambio, el solicitante no desea vincularse a esta teoría.

La actividad enzimática que puede ocurrir en las proteínas de cemento de tejido de la presente invención puede incluir la habilidad para ejercer tales modificaciones covalentes como fosforilación, glicosilación, reducción u oxidación de otras proteínas y moléculas de carbohidrato y puede dar como resultado el enlace cruzado de los componentes estructurales del cemento de tejido. El enlace cruzado puede ser bien reversible o irreversible y puede darse entre componentes homólogos o heterólogos del cemento de tejido y proteínas no parásitas como, por ejemplo, componentes de tejido vertebrado.

Las proteínas de cemento de tejido de la presente invención pueden ser proteínas del grupo A. Por el "grupo A" se entiende que en la saliva del parásito estas proteínas forman el centro del cono de cemento. La función del centro del cono en parásitos es sujetarse a la piel de un huésped vertebrado y formar una unión rígida que no se romperá fácilmente. Por consiguiente, estas proteínas forman un cemento duro similar al látex que se establece y une a la piel del vertebrado rápidamente. Las proteínas del grupo A son por lo tanto ideales para aplicaciones que precisan una unión resistente y de rápida acción.

Las proteínas de cemento de tejido de la presente invención puede ser proteínas del grupo B. Por el "grupo B" se entiende que en la saliva de garrapata estas proteínas forman la corteza del cono de cemento. Una función de la corteza en parásitos es formar un sello similar a una junta alrededor de la zona de la mordedura para evitar el escape de fluidos. Una función adicional de las proteínas de la corteza es la de formar un enganche flexible para que el parásito no se pueda separar de su huésped. Por lo tanto, las proteínas del grupo B endurecen más lentamente que las proteínas del grupo A, pero forman un cemento más flexible y maleable. Estas proteínas resultan por lo tanto ideales cuando se requiere una unión más flexible.

Muchas de las proteínas de cemento de tejido de la presente invención tienen en común la habilidad para unirse a tejido vertebrado. Este enlace puede ser debido a una afinidad inherente incluida en la proteína para ciertos componentes de la piel vertebrada, como colágeno. Sin embargo, una afinidad para proteínas vertebradas puede manifestarse sólo por sí misma en la presencia de enzimas cuya actividad es necesaria con el fin de generar una asociación entre la proteína de cemento de tejido y un componente de la piel. Esta actividad enzimática puede derivarse de las proteínas de cemento de tejido por sí mismas o puede proporcionarse por componentes de enzima de la piel del vertebrado, como lisil oxidasas, que enlazan de manera cruzada colágeno y elastina o transglutaminasas, como el factor de coagulación XIIIa, que cruza fibronectina, fibrinas y colágeno durante muchos procesos de curación de vertebrados.

Las proteínas de cemento de tejido o sus equivalentes funcionales de acuerdo con la presente invención pueden derivarse de cualquier parásito que se alimente de sangre. Preferentemente, las proteínas de cemento de tejido de la presente invención se derivan de ectoparásitos que se alimentan de sangre, más preferentemente garrapatas. Más preferentemente, las proteínas de cemento de tejido de la presente invención se derivan de la garrapata de oreja marrón Rhipicephalus appendiculatus.

Las proteínas de cemento de tejido de la presente invención también pueden comprender componentes de carbohidrato. Muchas proteínas de cemento de tejido son en realidad glicoproteínas, que contienen uniones de carbohidrato covalentemente enlazadas en varios puntos de la proteína. El carbohidrato normalmente constará de una serie de unidades de monosacárido que comúnmente se dan como un oligosacárido o polisacárido bastante pequeño. Como se ha comentado anteriormente, muchas de las proteínas hasta ahora identificadas en garrapatas poseen puntos de unión de consenso para glicosaminoglicanos (glicanos que contienen residuos de aminosacáridos).

Las proteínas de cemento de tejido de la invención pueden estar presentes en el cemento de tejido como monómeros, dímeros, tetrámeros, o como oligómeros que constan de un número de monómeros homólogos o heterólogos como una unidad. Esto resulta particularmente cierto en cuanto a proteínas de tejido estructural que pueden asociarse de modo no covalente como parte del proceso de endurecimiento del cemento. Sin embargo, el solicitante no desea vincularse a esta teoría.

Las proteínas de cemento de tejido de la presente invención pueden purificarse a partir de cemento producido por parásitos vivos. Esto puede realizarse mediante el tratamiento de conos recogidos con una solución de lavado como PBS, un búfer TRIS o detergentes no iónicos, por ejemplo Tween-20 o Triton. Las proteínas de cemento pueden prepararse por medio de inmunoprecipitación usando anticuerpos que son específicos para epítopes en la secuencia de proteína. De modo alternativo, las proteínas pueden preparase sintéticamente, o empleando técnicas de ingeniería genética. Preferentemente, las proteínas de cemento de tejido de la presente invención constan de polipéptidos recombinantes producidos por expresión a partir de un ácido nucleico codificador.

Las moléculas sintéticas diseñadas para imitar la estructura terciaria o zona activa de las proteínas de cemento de tejido constituyen un aspecto adicional de la invención.

Un aspecto adicional de la presente invención comprende proteínas de cemento de tejido que se fusionan con otras moléculas tales como etiquetas, toxinas o moléculas bioactivas. Particularmente, candidatos adecuados para la fusión serán moléculas reporteras, como luciferaza, proteínas verde fluorescente o peroxidasa de rábano de caballo. Moléculas de enlace como estreptavidina o biotina también pueden emplearse. Además, péptidos bioactivos o polipéptidos pueden fusionarse con una proteína de cemento de tejido. Tales moléculas comprenden moléculas con propiedades antisépticas o antibióticas, o toxinas para alcanzar células cancerígenas.

Las proteínas pueden fusionarse químicamente, empleando métodos como enlace cruzado químico. Tales métodos serán conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden comprender, por ejemplo, el enlace cruzado de los grupo tiol de residuos de cisteína. Los enlaces cruzados químicos se emplearán en la mayoría de los casos para fusionar proteínas de cemento de tejido con moléculas de no proteínas, como etiquetas. Las etiquetas pueden ser radioetiquetas o etiquetas que pueden detectarse espectroscópicamente, por ejemplo grupos químicos fluorescentes o fosforescentes.

Cuando se desea fusionar una proteína de cemento de tejido con otra moléculas de proteína, el método elegido será a menudo la fusión genética de las moléculas. Con el fin de generar una proteína de fusión recombinante, los genes o porciones de gen que codifican las proteínas o fragmentos de proteína de interés se crean para formar un gen contiguo dispuesto de tal modo que los codones de las dos secuencias de genes se transcriban en marco.

Una proteína de cemento de tejido puede fusionarse genéticamente con cualquier proteína para la cual la secuencia de gen codificadora es o se convierte en conocida. En particular, candidatas adecuados para la fusión serán las moléculas reporteras, como luciferaza, proteínas verde fluorescente o peroxidasa de rábano de caballo. Adicionalmente, péptidos de tóxina o polipéptidos pueden fusionarse con una proteína de cemento de tejido. Proteínas antisépticas o antibióticas y péptidos también pueden fusionarse con las proteínas de cemento de tejido de la presente invención.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende un cemento de tejido formado por una mezcla de proteínas de cemento de tejido del grupo A y grupo B en la ausencia de otras proteínas de saliva parásitas, opcionalmente en la presencia de uno o más compuestos capaces de enlazar dichas proteínas de cemento de tejido junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Tal composición farmacéutica tiene muchas aplicaciones, en particular cirugía en la piel y curación de heridas, para la unión temporal o permanente de tejidos humanos o animales a otro u otros biomateriales.

Previamente se usó cemento de tejido en procesos quirúrgicos para proporcionar adhesión y estabilidad a tejidos vivos para facilitar los procesos normales de curación y reparación que tienen lugar o para proporcionar una unión a largo plazo en situaciones en las que la curación normal se retrasa o tiene pocas posibilidades de ocurrir. El cemento de tejido formado a partir de proteínas de la presente invención tiene ventajas sobre otros cementos de tejido convencionales. Por ejemplo, las proteínas de la invención forman fuertes uniones con tejidos de vertebrados. Esto las hace ideales para su uso como componentes de un cemento de tejido que une dos superficies de tejido o bordes.

Los diferentes procedimientos quirúrgicos necesitan el uso de cemento de tejido con propiedades diferentes. El cemento de tejido formado a partir de proteínas de la presente invención es por lo tanto ideal, ya que las propiedades de endurecimiento o elasticidad del cemento pueden adaptarse de manera precisa con el fin de proporcionar los requisitos particulares del procedimiento quirúrgico a través de modificaciones de las cantidades relativas de proteínas del grupo A y grupo B de las que está compuesto el cemento. El cemento de tejido es de esta manera extremadamente versátil.

El cemento de tejido con un alto contenido de proteínas del grupo A será generalmente útil para procesos en los cuales se requiera una unión extremadamente resistente que no necesite flexionarse en gran medida. Un buen ejemplo de tal unión podría ser una unión entre dos superficies óseas o entre una superficie ósea y la superficie de una unión artificial. Un cemento de tejido con un alto contenido del grupo A también será necesario cuando se requiera que la unión se fije rápidamente.

Para procedimientos tales como la unión de laceraciones de la piel, donde se precisa un alto nivel de flexibilidad, se empleará un cemento de tejido que contenga un alto contenido de proteínas del grupo B. Sin embargo, las proteínas del grupo B no se unen más despacio, por lo que el cemento de tejido con un alto contenido de proteínas del grupo B generalmente no se empleará para procedimientos que requieran una unión resistente para que se forme rápidamente. Sin embargo, este cemento se puede emplear junto con otras medidas, como grapas quirúrgicas o cemento de tejido del grupo A, que puede formar una rápida unión de sujeción de los tejidos mientras las proteínas del grupo B se endurecen.

Las composiciones farmacéuticas que están formadas por proteínas de cemento de tejido de acuerdo con la presente invención también pueden contener conservantes adicionales, o componentes responsables de la prevención de fijación prematura. La composición también puede estar formada por un propelente, por ejemplo, si el cemento de tejido se va a introducir mediante spray en las superficies de tejido. Tales compuestos serán bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.

Una importante ventaja que presentan las proteínas de cemento de tejido de la presente invención es que in situ en tejidos de vertebrados estas proteínas son no inmunogénicas y por lo tanto no provocan inflamación del tejido. Esto resulta particularmente relevante cuando el cemento de tejido está dirigido a uso interno, por ejemplo para asegurar órganos de prolapso. Si el cemento de tejido fuera inmunogénico, un ataque inmune podría dirigirse contra el cemento de tejido, causando inflamación local, afectando al cemento e impidiendo la unión permanente del tejido.

La base actual en cirugía para superar el rechazo inmune incluye combatir el fenómeno de rechazo inicial hasta que, finalmente, el sistema inmune se vuelva tolerante. Por ejemplo, después de transplantes de órganos, inicialmente se precisan grandes cantidades de dosis combinadas de agentes inmunosupresivos que gradualmente se reducen durante el tratamiento hasta que, si el transplante sobrevive de manera óptima durante aproximadamente un año, se requiere muy poco mantenimiento de inmunoterapia.

Las proteínas de cemento de tejido de la presente invención también pueden emplearse para impedir el rechazo inmune. Aparte de su carencia de inmunogenecidad natural, otra propiedad de las proteínas de cemento de tejido de la presente invención es que las propias proteínas se enlazan con proteínas bioactivas en la saliva de un ectoparásito, como proteínas de enlace con histamina en garrapatas. De este modo, las proteínas de cemento localizan la acción de varias moléculas inmusupresivas producidas por el organismo. Estos compuestos inmunosupresivos se alteran a lo largo del tiempo durante el curso de alimentación con el fin de adaptarse a la respuesta de rechazo del huésped. De ahí que el cono de cemento, en efecto, sea una estructura inmunosupresiva local activa.

La habilidad para enlazarse con proteínas parásitas bioactivas significa que el cemento de tejido que comprende proteínas de cemento de tejido de acuerdo con la presente invención puede complementarse con ciertas moléculas inmunosupresivas producidas por algunos parásitos. Por ejemplo, moléculas adecuadas pueden incluir moléculas de enlace de amino vasoactivo que son el objeto de la solicitud de patente internacional copendiente PCT/GB97/01372. Estas moléculas se enlazarán con cemento de tejido, y por lo tanto proporcionarán una estructura inmunosupresiva local que ocultará cualquier órgano alogenéico o incluso xenogenéico e impedirán su rechazo.

Estas propiedades de las proteínas de cemento de tejido de la presente invención proporcionan por lo tanto una adición a los usos convencionales de cemento de tejido para sujetar uniones articuladas al hueso o para reparar órganos dañados. Aparte de su uso como un adhesivo no inmunogénico, el cemento de tejido producido de acuerdo con la presente invención puede emplearse como un complemento o adjunto al transplante de órgano para suministrar y localizar compuestos inmunosupresivos a la localización del transplante.

Un aspecto adicional de la presente invención es por lo tanto proporcionar un cemento de tejido con propiedades inmunosupresivas por complementación del cemento básico con una o más proteínas de cemento de tejido de la presente invención, opcionalmente junto con compuestos inmusupresivos derivados de parásitos.

Otras aplicaciones específicas de cemento de tejido formado a partir de proteínas de cemento de tejido de la presente invención pueden incluir, aunque no sólo limitarse, a las aplicaciones listadas a continuación:

reparación de lesiones quirúrgicas en las que se ha practicado una incisión en lugar de cierres convencionales como suturas o grapas; reparación de laceraciones tales como lágrimas perineales tras el parto o laceraciones de una parte de tejido tras un trauma; el injerto de piel, reemplazos de piel cultivada o reemplazos de biomaterial para heridas crónicas, quemaduras, puntos de donante de injertos de piel y en cirugía plástica reconstructiva o cirugía estética; la aseguración de partes de tejido de mioplastia; tejido para reparación de tejido como reparación de laceraciones del hígado u otros órganos parenquimatosos; tejido para anostomosis de tejido como anostomosis gastrointestinal o tejido para anostomosis biomaterial como reparación vascular o anastomosis; tejido para reconstrucción de tejido como la aseguración de órganos prolapsados en su punto anatómico; tejido para aproximación de tejido como en adhesión pleuro-pleural tras pneumotórax; como un esclerosante en procedimientos tales como la inyección de hemorroides; en procedimientos neuroquirúrgicos tales como la reparación o parcheo del mater de dura con reemplazos naturales o artificiales y el injerto o reparación de tejido neural severo; en procesos de ortodoncia como la reimplantación de dientes o la reconstrucción de los arcos mandibulares o maxilares usando fragmentos de hueso o materiales tales como matrices de colágeno o hidroxiapatita; en procedimiento ortopédicos que incluyen fusión vertebral, artrodesis, fijación de fracciones y osteotomías y la implantación de prótesis como artroplastia de cadera; en procedimientos tales como ritidectomía donde el uso de suturas no se desea por motivos estéticos; aseguración de materiales artificiales como la malla de Marlex^{Tm} en hernioplastia (llevada a cabo en operación abierta o endoscopicalmente); reparación de tejido desmenuzable como tendón o músculo; como un hemostato en superficies de supuración o en circunstancias en las que es difícil de asegurar hemostasis llevada a cabo mediante medios convencionales (por ejemplo durante cirugía endoscópica); para la obliteración de sinos y fístulas; y para sellar perforaciones de vísceras huecas como el estómago o duodeno (bien usados solo o en compañía de un tejido o parche artificial).

En otra realización de la invención, el uso de proteínas de cemento de tejido se emplea como herramienta en el estudio de montaje de cono de cemento y en el desarrollo de estrategias para prevenir el montaje de cono de cemento, y por lo tanto evitar la sujeción y alimentación de las garrapatas. Por ejemplo, podrían usarse anticuerpos monoclonales y vacunas de ingeniería genética dirigidas a las proteínas de cemento de tejido para prevenir que los parásitos se alimenten.

Los parásitos artrópodos son fuentes de agentes de enfermedades infecciosas como virus de encefalitis transmitida por garrapata, virus de la fiebre hemorrágica Crimea-Congo, virus de oveja Nairobi, Borrelia burgdorferi (el agente de enfermedad de Lyme), Theileria parva (el agente de la fiebre de la Costa Este) y otros efectos dañinos que tienen grandes impactos en medicina humana y veterinaria. Actualmente, el control de parásitos artrópodos se basa principalmente en el uso de sustancias químicas tales como acaricidas.

Se han realizado intentos para emplear medios inmunológicos de control a través de tecnología de vacunas. Se han logrado algunos éxitos al identificar ciertos antígenos protectores de parásitos artrópodos por ser candidatos para vacunas potenciales, pero tan sólo unos pocos se han llevado a buen término comercial, más notablemente para la garrapata de ganado Boophilus microplus. A pesar de estos desarrollos, existe aún una necesidad de vacunas contra parásitos artrópodos que puedan usarse contra garrapatas.

Una estrategia alternativa de vacuna que hasta ahora no ha sido posible es la de vacunar animales utilizando antígenos purificados. El sistema inmune del animal desarrolla por lo tanto una respuesta humoral mejorada ante estos polipéptidos antigénicos y como consecuencia desarrolla resistencia contra los propios parásitos artrópodos.

Una desventaja de usar vacunas dirigidas a una enfermedad específica transmitida por vector para controlar tal enfermedad es que normalmente se requiere una vacuna diferente para proteger contra cada enfermedad. Las vacunas dirigidas a vectores (como garrapatas y mosquitos) tienen una ventaja añadida que reside en el hecho de que su efecto puede controlar varias infecciones diferentes, siempre y cuando estas infecciones se transmitan por sólo un tipo de vector de enfermedad.

La presente invención por lo tanto también proporciona el uso de proteínas de cemento de tejido como se ha descrito anteriormente como inmunogenes. Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente invención incluye una vacuna que consta de una o más proteínas de cemento de tejido como se han definido anteriormente en una vacuna contra parásitos artrópodos y en particular como inmunogenes protectores en el control de enfermedades causadas por infecciones transmitidas por parásitos artrópodos.

La vacuna puede administrarse sola, o en combinación de otros inmunogenes. La vacuna puede incluir adyuvantes del tipo bien conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, alumbre. Entre los candidatos adecuados para la vacuna se incluyen ganado, cabras, ovejas, perros, gatos y otros mamíferos. Todas estas especies requieren protección contra parásitos artrópodos, en particular garrapatas, y las infecciones que transmiten.

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De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de cemento de tejido tal y como se ha descrito anteriormente, o una forma funcionalmente equivalente. Las secuencias de ácido nucleico que se elijan constan de o contienen las secuencias de ácido nucleico que se muestran en las Figuras 2 a 8. El experto en la técnica apreciará que se pueden realizar cambios en el nivel nucleótido por adición, sustitución, eliminación o inserción de uno o más nucleótidos, cuyos cambios pueden o no reflejarse en el nivel de aminoácido, dependiente de la degeneración del código genético.

La molécula de ácido nucleico de acuerdo con este aspecto de la presente invención puede constar de ADN, ARN o cADN y muchas además constan de análogos nucleótidos en su secuencia. Preferentemente, el ácido nucleico está formado por ADN, más preferentemente cADN sencillo o de doble trenzado.

Secuencias antisentido también pueden diseñarse con respecto a los ácidos nucleicos de este aspecto de la invención y en secuencia constarán en parte o por completo del trenzado complementario para la codificación del trenzado de ácido nucleico. Oligonucleótidos que forman secuencias antisentido para los genes de proteínas de cemento de tejido pueden emplearse como herramientas de diagnóstico en la detección de organismos o vectores que expresan ácidos nucleicos codificadores de proteínas de cemento de tejido. Estos oligonucleótidos de trenzado sencillo estarán formados por longitudes de ácido nucleico de entre 10 y 300 nucleótidos, preferentemente entre 10 y 100 nucleótidos, más preferentemente entre 10 y 30 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden etiquetarse con el fin de ayudar a su detección. Sistemas de etiquetaje adecuado son bien conocidos en la técnica.

Los métodos aquí descritos para analizar bibliotecas de cADN para análogos de proteínas en proteínas de cemento de tejido resultarán obvios para aquel experto en la técnica. Las secuencias antisentido de este aspecto de la invención no corresponderán por lo tanto exactamente con el trenzado complementario del ácido nucleico que codifica una proteína de cemento de tejido. Por ejemplo, cuando se usan oligonucleótidos antisentido como pruebas o ensayos en el análisis de una biblioteca cADN para análogos de proteínas en la proteínas de cemento de tejido aquí descritos, debido a la degeneración del código genético y a la divergencia de secuencia entre especies, cualquier gen análogo a los aquí descritos tiene posibilidades de estar formado por secuencias que sean notablemente diferentes a las de la prueba o ensayo.

Por consiguiente, secuencias antisentido para uso de acuerdo con este aspecto de la presente invención constan de secuencias que hibridizan bajo condiciones estándar las secuencias de ácido nucleico mostradas en las Figuras 2 a 8. Las "secuencias hibridizadoras" incluidas en el ámbito de la invención son aquellas que se enlazan bajo condiciones estándar. Como aquí se emplea, por "condiciones estándar" se entiende tanto condiciones estándar de hibridización no astringente (6 x SSC/50% formamida a temperatura ambiente) con lavado bajo condiciones de baja estringencia (2 x, temperatura ambiente, o 2 x SSC, 42ºC) como condiciones estándar de alta estringencia, por ejemplo, 2 x SCC, 65ºC (donde SCC = 0.15 M NaCl, 0.015 M citrato sódico, pH 7.2). Preferentemente las condiciones estándar se refieren a condiciones de alta estringencia.

Un aspecto adicional de la presente invención comprende un método de producción de proteína de cemento de tejido que consta de la expresión a partir del ácido nucleico codificador del mismo. La expresión puede conseguirse de manera óptima y adecuada cultivando bajo condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contienen ácido nucleico.

Sistemas para donar y expresar un polipéptido en una variedad de diferentes células huésped son bien conocidos. Células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, sistemas de levadura y baculovirus. Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de cría de hámster. Un huésped bacterial común y preferente es E. coli.

La expresión de de polipéptidos heterólogos y fragmentos de polipéptidos en células procarióticas tales como E. coli es un aspecto bien establecido en la técnica; ver por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. La expresión en células procarióticas en cultivo es también una opción disponible y válida para aquellos expertos en la técnica para la producción de proteínas heterólogas; ver documentación reciente, por ejemplo, O'Reilly et al., (1994), Baculoviurs expression vectors: a Laboratory Manual, Oxford University Press.

Se pueden elegir o construir vectores simples y sencillos para la expresión de proteínas de cemento de tejido que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias impulsoras, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias realzantes, genes marcadores y otras secuencias que se consideren apropiadas. Los vectores pueden ser plásmidos, virales como bacteriófagos, o fagémidos, o lo que se considere más apropiado. Para más detalles consultar Molecular Cloning: a Laboratory Cloning (loc. Cit). Muchas técnicas conocidas y protocolos para manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuencias, introducción de ADN en expresión de células y gen, y análisis de proteínas, se describen con detalle en Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel et al. Eds., John Wiley & Sons, 1992. Por ejemplo, en células eucarióticas, los vectores que se eligen están basados en virus, como los basados en baculovirus.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula huésped que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de cemento de tejido o un equivalente funcional del mismo. Incluso otro aspecto adicional proporciona un método que comprende la introducción de tal ácido nucleico en una célula huésped u organismo. La introducción de ácido nucleico puede emplear cualquier técnica disponible. En células eucarióticas, las técnicas pueden incluir transfección de fosfato cálcico, transfeccion mediada por DEAE-Dextran, electroporación, transfección mediada por liposoma o transducción empleando retrovirus u otros virus, como vacunas o, para células de insectos, baculovirus. En células bacteriales, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación de cloruro cálcico, electroporación o transfección usando bacteriófago.

La introducción de ácido nucleico puede estar seguida por la provocación o la realización de la expresión procedente del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células huésped bajo condiciones para la expresión de los genes.

En una realización, el ácido nucleico de la invención se integra en el genoma (p. ej., cromosoma) de la célula huésped. La integración puede estar provocada por la inclusión de secuencias que así mismo provocan recombinación con el genoma, de acuerdo con las técnicas estándar.

Los animales transgénicos transformados para que expresen o sobreexpresen en la línea germinal una o más de las proteínas de cemento de tejido o equivalentes funcionales como aquí se describen forman además otro aspecto adicional de la invención, junto con los métodos para su producción. Actualmente existen muchas técnicas para introducir transgenes en el embrión o línea germinal de un organismo, como los ilustrados en Watson et al., (1994) Recombinant DNA (2ª edición), Scientific American Books.

Varios aspectos y realizaciones de la presente invención se describirán a continuación con más detalle y a modo de ejemplo, con particular referencia a proteínas de cemento de tejido aisladas de garrapatas, y especialmente de Rhipicephalus appendiculatus. Se apreciará que la modificación de algún detalle puede llevarse a cabo sin salir del campo de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A es un gel SDS que contiene extractos de glándulas salivales de macho y hembra (SGE) y polipéptidos de cemento de macho y hembra obtenidos por medio de enjuague de conos de cemento en PBS.

La Figura 1B es el Western Blot correspondiente a la Figura 1A, puesto en ensayo con un antisuero monoclonal elevado contra una proteína purificada de 17 DK procedente de extracto de glándula salival de garrapata.

La Figura 2 es una secuencia parcial de cADN y producto de translación del clon 21. La proteína inferida por cADN es una proteína de cemento; contiene una región de terminal N hidrofóbica que posiblemente constituye una secuencia de señal, típica de proteínas segregadas. La proteína se parece en gran medida a otras proteínas estructurales, especialmente a la queratina. Se subraya una secuencia de reconocimiento para unión post-translacional de grupos glicosaminoglicanos.

La Figura 3 es el cADN y la secuencia polipéptida inferida por cADN del clon 33. Se muestra una secuencia de señal putativa en negrita. Como muchas otra proteínas estructurales, esta proteína es rica en glicina y prolina. La proteína también muestra algún parecido con queratina.

La Figura 4 es una secuencia parcial de cemA cADN y la secuencia polipéptida inferida por cADN. La proteína es muy repetitiva, con la secuencia KGALLQQQQASQVKGALKAI, o ligeras diferencias de la misma, repetidas varias veces.

La Figura 5 es cADN parcial y la secuencia polipéptida inferida por cADN del clon 24. La proteína tiene parecido con proteínas estructurales (entre otra, colágeno), y su contenido se repite. El cADN también tiene una región en común con glutenina, una proteína de automontaje.

La Figura 6 es cADN parcial y la secuencia polipéptida inferida por cADN del clon 68. Las proteínas codificadas se parecen a proteínas estructurales, como queratina. Una serie de puntos de unión de glicosaminoglicano putativo están subrayados.

La Figura 7 es la secuencia completa de cADN y secuencia polipéptida inferida por cADN del clon 64. La secuencia de señal putativa está indicada en negrita. Se subraya un posible punto de unión de glicosaminoglicano. La primera sección de 40 aminoácidos de la proteína madura es similar al colágeno, mientras que el resto de la secuencia se parece a la queratina. La proteína es rica en glicina y contiene varias repeticiones del motivo (CIS)1-4(Y/F), que también se encuentra en proteínas estructurales de cáscaras de huevos de insectos. Las tirosinas pueden tomar parte en el enlace cruzado por la formación de puentes de ditirosina por fenoloxidasas. Una proteína similar se codifica por el clon 1 (ver Figura 8).

La Figura 8 es una secuencia parcial de cADN y la secuencia polipéptida inferida por cADN. La proteína inferida es rica en glicina y tirosina y se parece a proteína de cemento de la polychaeta de arrecife Pragmatopoma californica (un componente del cemento teñido de quinona en los tubos construidos por estos gusanos marinos).

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La Figura 9 es una alineación de ADN entre la secuencia de proteína mostrada en la Figura 8 y una proteína de cemento procedente de la polychaeta de arrecife Pragmatopoma californica.

La Figura 10A muestra un gel PAGE que muestra las proteínas expresadas de células E. coli transformadas con una secuencia codificadora truncada del clon 64.

La Figura 10B muestra un Western blot correspondiente a la Figura 10A.

Las Figuras 11.a y 11.b muestran alineamientos de la proteína del clon 64 truncada con varias proteínas naturales.

Las Figuras 12.a y 12.b muestran secciones histológicas de miel de hámster tintada con varios tintes convencionales.

Las Figuras 13.a, 13.b y 13.c muestran secciones tintadas de inmunoperoxidasa de piel de hámster.

Ejemplos Garrapatas

Las garrapatas se trataron de acuerdo a lo expresado por Jones et al., (1988). Las tres etapas de desarrollo de Rhipicephalus appendiculatus se alimentaron en cerdos guinea Dunkin Hartley. Cuando no se estaban alimentando, todas las garrapatas se mantuvieron a 21-26ºC y a un 85% de relativa humedad.

Ejemplo 1 Identificación de proteínas

Se recogieron los conos de cemento de las garrapatas (crías y adultos) que se alimentaban en cerdos guinea en diferentes puntos del periodo de unión o adhesión. Los conos se homogenizaron en salina de búfer de fosfato (PBS), para extraer las proteínas solubles, y en alcali caliente y ácido para extraer componentes menos solubles (Kemp et al., 1982; Jaworski et al.,1992).

Los patrones de proteína se analizaron usando SDS-PAGE; el gel resultante se muestra como en la Figura 1A. Bandas o puntos correspondientes a las proteínas (grupo A) expresadas de manera temprana y a proteínas (grupo B) expresadas posteriormente se eliminaron del gel y se usaron para la producción de suero anticlinal. Un buen antisuero podía obtenerse contra las proteínas menos antigénicas siempre y cuando estas proteínas no pudieran renaturalizar completamente.

Los antisueros resultantes se usaron para analizar bibliotecas de cADN y también para inmunoblots (ver Figura 1B) e innmunoquímica.

Las proteínas para las cuales se puede crear buen antisuero se secaron con membranas de difluorido polivinilideno para determinación de secuencia amino terminal. Para secuenciar aminoácido, las muestras se llevaron a cabo en un 494A Biosistemas Aplicados, "Procise sequencer" (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Division, Warrington (U.K).

Las muestras electrosecadas se llevan a cabo usando cartucho "Mini-Blott" de Biosistemas Aplicados en lugar del cartucho estándar. Se extrajeron bandas de interés de la membrana y se cortaron en piezas de 1 x 3 mm para la inserción en el cartucho. Estas se secuencian utilizando el programa recomendado por el fabricante para muestras enlazadas a membrana (Shagger y von Jagow, 1987; Matsudaira, 1987).

Esta información se empleó posteriormente para diseñar oligonucleótidos para analizar una biblioteca de cADN para clones de interés.

Ejemplo 2 Construcción de biblioteca cADN

Las glándulas salivales se extrajeron de 20 machos y 20 hembras adultos de especimenes R. appendiculatus que se habían alimentado sobre cerdos de guinea durante dos días. Las glándulas se recogieron sobre hielo seco en un tubo Eppendorf. El ARN mensajero se aisló usando el kit de aislamiento Fast Track mARN (Invitrogen).

Para sintetizar cADN e insertar el cADN en el vector Lambda Zap II, se empleó el kit de síntesis cADN ZAP (Stratagene). Antes de la inserción unidireccional del cADN en el vector lambda, el ácido nucleico se fraccionó sobre columna Sefacril S-400 (Pharmacia).

Una biblioteca (denominada d2-I) se construyó a partir de cADNs de bajo peso molecular (que oscilaban entre aproximadamente 100 a 2,000 pares de base). La fracción de peso molecular más alto se usó para construir una biblioteca secundaria (d2-II). El empaquetado se llevó a cabo usando extractos de empaquetado Packagene (Promega). Aproximadamente 1.5 x 106 unidades que forman placas (PFU) de cada biblioteca se amplificaron en células XL-1-Azul (Stratagene) para uso subsecuente.

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Ejemplo 3 Análisis de la biblioteca cADN d2-II

Los fagémidos se extrajeron in vivo de una fracción seleccionada al azar de la biblioteca, y se usaron para generar plásmidos pBluescript SK(-) de doble trenzado en células XL1-Azul (Stratagene) como se describió en Short et al. (1988).

Las colonias de XL1-Azul se colocaron en placas agar LB (Luria-Bertani) que contenía ampicilina, suplementadas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosida (X-Gal, Melford Laboratories, UK) e isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG, Novabiochem) para selección de colonia azul/blanca.

Se seleccionaron aproximadamente 75 plásmidos (de colonias blancas) con añadidos que oscilaban entre 250 y 1000 de pares base (como se determinó por digestión con PvuII y electroforesis sobre un gel 1% agarosa) para las secuencias. Los oligonucleótidos empleados para las secuencias corresponden con los puntos principales T3 y T7 en el plásmido pBluescript ADN.

Ejemplo 4 Secuenciación

Los plásmidos se purificaron de cultivos que habían estado durante toda la noche de acuerdo con Goode y Feinstein (1992) alcali-denaturalizados (Mierendorf y Pfeffer, 1987), y se secuenciaron empleando la reacción de terminación de cadena mediada por dideoxi Sanger (Sanger y Coulson, 1975). Los datos de secuencia se analizaron usando el software de análisis secuencia) GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, 1994).

Las búsquedas de base de datos de proteínas se llevaron a cabo en el Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI) usando el servicio de red BLAST.

Un número de clones se secuenciaron total o parcialmente. Las secuencias o secuencias parciales se mostraron en las Figuras 2 a 8 aquí adjuntas. Las explicaciones de la estructura y características de las secuencias clonadas se dan en la descripción Breve de las Figuras anteriormente citada y en otras partes de la descripción.

Ejemplo 5 Producción del Antisuero CemA

Se produjo un antisuero contra una proteína de glándula salival prominente de aproximadamente un tamaño de 17 kDa.

Para la producción del antisuero policlonal, las glándulas salivales tomadas el día 6 del paso de alimentación de un adulto se homogenizaron en salina de búfer de fosfato (PBS) y se sometieron a centrifugación (3 min; 12,000 x g). Las proteínas en el sobrenadante [es decir, el extracto de glándula salival (SGE)] se descompusieron en un gel 15% SDS-poliacrilamida, de acuerdo con Laemmli (1970).

El gel se tiñó en una solución de hielo 100 mM KCI y la proteína 17 kDa se extrajo. La sección de poliacrilamida que contenía la proteína se secó bajo vacío, se homogenizó en PBS, se mezcló con un volumen igual de Montanide ISA 50 adyuvante (Seppic, France) y se inyectó seguidamente en cerdos guinea Dunkin Hartley. Este procedimiento se repitió cada 10 días. El suero se recogió 10 días después tras la 4ª inyección.

El Western blot, llevado a acabo de acuerdo con Kyshe-Anderson (1984), mostró una fuerte reacción de antisuero con una proteína 17kDa desde la superficie de conos de cemento (ver Figura 1A). Esta proteína, denominada CemA, estuvo presente en todos los pasos de alimentación de las garrapatas y se podía obtener fácilmente por lavado de conos de cemento en PBS.

Ejemplo 6 Inmunohistoquímica/Western Blot/Northern Blot/Hibridización in situ

Los antisueros policlonales se emplearon en western blots y en secciones de tinción de conos de cemento y glándulas salivales, tomadas en diferentes momentos del periodo de alimentación. Donde la microscopia de luz no proporcionó suficiente resolución para visualizar el tinte, se empleó la microscopia de electrón.

Para proteínas contra las cuales no se produjo antisuero, se realizaron western blots usando pruebas de ADN etiquetadas con digoxigenina construidas por etiquetaje principal al azar (Sambrook et al., 1989) usando añadido purificado a partir de los clones originales. Un antisuero anti-digoxigenina conjugado con alcalino-fosfatasa permite la detección de la prueba. De hecho, la hibridización in situ puede ser más adecuada para la localización y seguimiento de la expresión de genes en las glándulas salivales, ya que cuando la inmunohistoquímica se lleva a cabo en glándulas salivales a menudo resulta en un contexto mayor.

Junto con la información SDS-PAGE, estas técnicas permiten la determinación de los tiempos en los que las proteínas específicas se expresaron durante el periodo de alimentación, donde en las glándulas salivales se produjeron y a cuya capa contribuyeron (por lo tanto definen mejor las proteínas de los grupos A y B).

Ejemplo 7 Construcción de bibliotecas genómicas y examen de expresión diferencial

Con el fin de evaluar la expresión diferencial de genes de proteína de cemento de tejido, se sigue el siguiente procedimiento. El ADN genómico de garrapata, digerido con endonucleasas adecuadas, se inserta en el vector Lambda Fix II (Stratagene), que permite el fácil trazado de restricción. Las pruebas cADN etiquetadas digoxigenina se emplean para el análisis de bibliotecas.

Las regiones que flanquean las secuencias codificadoras e intrones se secuencian y examinan para la presencia de puntos que puedan jugar un papel en la expresión ordenada de las proteínas (por ejemplo ecdisteroide o elementos de respuesta de shock por calor). Se pensó que la comparación de genes y proteínas expresadas simultáneamente podría revelar secuencias comunes en dirección ascendente o descendente que son responsables de la regulación de expresión de genes. Todos los genes de proteína del grupo A, por ejemplo, pueden tener puntos de reconocimiento idénticos para factores reguladores.

Las regiones reguladoras prospectivas se enganchan a un gen reportero, por ejemplo luciferaza, se transfectan a células adecuadas (por ejemplo células Drosophila), y se envían a ensayos funcionales. El retardo de gel, la protección de ADN o ensayos de cambio de banda también pueden llevarse a cabo para confirmar la existencia de dominios reguladores funcionales.

Es posible que una sola región impulsora controle la expresión simultanea de un conjunto de series de genes. Estos genes probablemente están localizados muy próximos entre sí en el genoma. Para investigar esta posibilidad, se emplean las pruebas etiquetadas con digoxigenina para localizar los genes en el genoma por medio de hibridización in situ, Southern blot y análisis de biblioteca genómico.

La expresión de proteínas de cemento puede regularse por uno o más factores soportados por hemolinfo. Esta posibilidad está siendo investigada incubando glándulas salivales tomadas de animales que sólo han estado unidos a su huésped en medio del cultivo de tejido que contenía hemolinfo de garrapatas que han sido alimentadas durante 24 o 48 horas. En este caso, se realiza Blot (Northern o Southern) o PCR transcriptasa inversa para determinar si los genes se han encendido o apagado.

Cuando existe evidencia del factor soportado por hemolinfo que controla la expresión de genes de cemento, se lleva a cabo el transplante de glándulas salivales de garrapatas primero en el periodo primario de la alimentación a animales posteriormente en el paso de la alimentación, en el caso de que los experimentos de incubación in vitro no proporcionen los resultados adecuadamente claros. Este factor ha sido identificado por HPLC y otras técnicas estándar.

Ejemplo 8 Agregación/Estudios de enlace cruzado - expresión de proteína

La agregación (polimerización) y enlace cruzado están siendo determinados usando proteínas extraídas de glándulas salivales y conos de cemento, y también empleando proteínas recombinantes expresadas. Las proteínas de cono de cemento se examinan directamente por hidrólisis de proteína seguido de detección de di- o tri-tirosinas entre los aminoácidos. También se emplean otros ensayos para la detección de enzimas de enlace cruzado y SDS-PAGE en la presencia y ausencia de agentes reductores para revelar puentes de disulfido inter- o intramolecular.

Además, las proteínas de grupo A y grupo B se aislaron de los extractos de cemento y glándulas salivales por medios de inmunoprecipitación. Esto es sólo posible para las proteínas más solubles. El peso molecular de las proteínas precipitadas se determina por filtración de gel. Las comparaciones se realizan con el peso molecular de monómeros como se determinó por SDS-PAGE y Western Blot, o como se calculó de las secuencias de proteína derivadas de cADN.

Otros componentes que co-precipitan con una proteína (A o B) dada se identifican analizando la biblioteca cADN con pruebas de oligonucleótidos diseñadas usando secuencias de aminoácido de terminal N.

La naturaleza de enlaces intermoleculares finales también se están determinando. Los enlaces de hidrógeno pueden destruirse con interacciones hidrofóbicas y de urea con detergentes. La detección de aminoácidos de puentes de disulfido y de enlace cruzado puede llevarse a cabo como se ha descrito previamente (Creighton, 1989; Malencik et al., 1996).

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Estudiar las proteínas nativas no es siempre sencillo. Por ejemplo, puede resultar complicado extraer las proteínas suficientes para lograr un estudio exhaustivo. Muchos de estos problemas pueden solucionarse empleando proteínas recombinantes en su lugar.

Las proteínas recombinantes del grupo A y grupo B se expresan por lo tanto en bacterias o, cuando la glicosolación u otras modificaciones post-translacionales son cruciales, en un sistema eucariótico (baculoviral). Estas proteínas que no son muy solubles pueden expresarse en fusión con tioredoxina usando, por ejemplo, el sistema ThioFusion (Invitrogen). En este sistema, las proteínas cuentan con etiquetas de oligohistidina, que permiten la fácil purificación por medio de cromatografía de níquel-agarosa (Janknecht et al., 1991). Enteroquinasa y/o puntos de trombina se incorporaron para retirar las etiquetas y proteínas fusionadas de la proteína de cemento tras la purificación, en casos donde sea necesario. En el caso de que exista la agregación de una proteína, o si se da una interacción entre, por ejemplo, dos proteínas diferentes del grupo A, la naturaleza de los enlaces debe determinarse como para las proteínas nativas, ver arriba. Las proteínas expresadas que pueden reconocerse en todo momento por sus etiquetas de histidina, o por antisuero, se incubaron con extractos de glándulas salivales, en la ausencia o presencia de inhibidores de enzima específicos o no específicos, con el fin de identificar el enlace cruzado.

Las proteínas expresadas etiquetadas con histidina pueden por lo tanto engancharse a níquel-agarosa y usarse en cromatografía de afinidad (Bugge et al., 1992; Lu et al., 1993) para aislar las proteínas que interactúan desde los extractos de glándulas salivales o conos de cemento. Estas proteínas pueden identificarse a través de análisis de bibliotecas de cADN. Por medio de experimentos de eliminación y mutación, se identifican los dominios y residuos que participan en la agregación o enlace cruzado de proteínas recombinantes.

Ejemplo 9 Expresión de proteínas de cemento trucado (64TRP) en bacterias.

Los oligonucleótidos con puntos de restricción de enzimas apropiados se diseñaron para permitir la donación PCR de un fragmento terminal N de clon 64, como se muestra en la Figura 7. Este fragmento, conocido como 64P (aminoácidos 34 a 85) de cADN, fue clonado PCR en el marco en el vector Pet23 (Novagen). El constructo, 64TRP (que codifica aminoácidos 34 a 85), etiquetado en los 6 x His-Tab del vector pET23, se obtuvo usando métodos de clonación estándar PCR (Sambrook et al., 1989). El plásmido se transformó en células E. coli AD494 (Sambrook et al. 1989).

Las histidina expresada en etiquetas expresada 64TRP (proteína de cemento truncado) se purificó por medio de cromatografía de afinidad níquel-agarosa (Janknecht et al., 1991). Las proteína se analizó por SDA-PAGE (Leammli, 1970) y el gel resultante se muestra en la Figura 10A. La banda de proteína esperada de aproximadamente 7.8 kDa de tamaño se obtuvo junto con una banda superior extra de aproximadamente 10 Kda. El tamaño aparente de la banda superior indica que no es un dímero. El análisis de secuencia amino-terminal (Schaggter y von Jagow, 1987; Matsudira, 1987) de las dos bandas actualmente se lleva a cabo para determinar la relación entre las dos bandas. Se muestra un Western Blot correspondientes en la Figura 10B.

Ejemplo 10 Expresión de proteína de cemento de longitud plena (64P) en células de insectos utilizando baculovirus recombinantes

El clon de longitud plena de la proteína de cemento 64P (es decir, 144 aminoácidos en longitud) se amplificó del cADN utilizando oligonucleótidos que contenían puntos de enzima de restricción apropiados, insertados en el C129. Su vector de baculovirus se transfectó a células de insecto Sodoptera fugiperda para expresión eucariótica (O'Reilly et al. 1994).

Ejemplo 11 Similitud de la secuencia de aminoácido de la proteína de cemento de R. appendiculatus con secuencias de otras proteínas estructurales

Las búsquedas de base de datos de proteínas se llevaron a cabo en el Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI) usando el servicio de red BLAST para las secuencias de aminoácido tanto del clon truncado como el de longitud completa de la proteína de cemento. Las Figuras 11a y 11b muestran las relaciones entre 64P, 64TRP truncado y otras proteínas estructurales.

Los primeros 11 aminoácidos de proteína de cemento son fuertemente parecidos al colágeno (ver Fig. 11b) y el resto de las secuencia se parece a la queratina (Fig. 11a). Las proteína es rica en glicina y contiene varias repeticiones del motivo (C/S) 1-4 (Y/F) que se parece a las proteínas estructurales de Drosophila melanogaster (proteína cuticular) y otras cáscaras de huevos de insectos, así como citoqueratinas de vertebrados que incluyen proteína básica 2 de complejo de queratina, queratina de ratón, queratina de humano, colágeno tipo IV alfa y precursor IPIB2. Parecería que la proteína de cemento se ha diseñado para que sea similar a las proteínas de la piel del huésped, con el objetivo de evitar la sujeción de la garrapata a la piel por los mecanismos de defensa inmune natural del huésped. El parecido composicional de 64P con los tejidos circundantes también puede facilitar el enlace profundo entre el cono de cemento y los tejidos circundantes de la piel (ver Ejemplos 12 y 13).

Ejemplo 12 Estudios Histológicos

Se llevaron a cabo estudios histológicos que usaban bien hematoxilina y eosina o tintes de van Gieson (Bancroft y Stevens, 1990) en secciones de piel de hámster y en secciones de piel de hámster en los cuales las garrapatas R. appendiculatus se habían alimentado. La Figura 12.a.A muestra una sección de piel normal con capa epidérmica, dérmica y subcutánea intactas. La hematoxilina y eosina, y los tintes de van Gieson indican los tipos te tejido esperados (es decir, las membranas base, fibras de colágeno y fibras reticulares). En las secciones de piel en las cuales se han alimentado R. appendiculatus, el cono de cemento de garrapata está claramente unido a la piel (Figura 12.b.A) y puede verse unido a la dermis (Figura 12.a.B y 12.b.B) con las partes de la boca in situ. En comparación, el cono de cemento parece ser similar a las membranas de base de piel normal, fibras de colágeno/reticulina, en la respuesta de tinción de tejido. También, no hay muestras de infiltración por células inflamatorias en relación con el cono de cemento. La aparente ausencia de inflamación apoya la creencia de la hipótesis de que la estructura y composición del cono de cemento se parece a la de los tejidos de la piel y que se diseña para evitar provocar una respuesta del huésped contra la garrapata. La estructura en capas del cono de cemento es claramente distinguible en la Figura 12.a.B. La aparente estructura en capas probablemente se debe a la deposición discontinua de proteínas de cemento cuando la garrapata alterna entre la salivación (es decir, secreción) y la ingesta de fluidos del
huésped.

Ejemplo 13 Estudios InmunohistoquímicoslWestern Blot

La proteína 64TRP recombinante desnaturalizada se purificó además por cromatografía de intercambio catión-ión de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Pharmacia). La proteína purificada se empleó para provocar antisuero policlonal por inyecciones subcutáneas de volúmenes iguales de proteína y Montanide ISA 50 adyuvante en cerdos guinea Dunkin Hartley.

El Western Blot (Kyshe-Anderson (1984)) mostró una fuerte reacción del antisuero a las bandas de proteína de cemento 64TRP recombinante desnaturalizadas (Figura 11B). Western blots con glándula salival de R. appendiculatus y extractos de cono de cemento de garrapatas hembras y machos (preparados como se ha descrito previamente en el Ejemplo 5) no mostraron ninguna reacción con el antisuero. La explicación más probable para los resultados negativos es que los epítopes de enlace de antisuero anti-64TRP no estaban fácilmente disponibles en las proteínas extraídas debido a la conformación de las proteínas.

Usando el antisuero anti-64TRP, los estudios inmunohistoquímicos se llevaron a cabo en secciones de piel de hámster normal, y glándulas salivales de R. appendiculatus, en conos de cemento y conos de cemento unidos a piel de hámster donde las garrapatas R. appendiculatus se habían sujetado (Coligan et al., 1991).

Usando piel normal, el antisuero anti-64TRP reaccionó fuertemente con las membranas base, los tejidos epidérmicos y dérmicos así como las estructuras foliculares del cabello (comparar la Figura 13.a.A con el suero de control, Figura 13.a.B). En piel de hámster donde las garrapatas se han alimentado, las secciones de conos de cemento individuales reaccionaron con el antisuero (Figuras 13.b y Figuras 13.c). Las reacciones fueron principalmente con la capa más externa y la capa interna unida a la membrana base de la piel. El patrón de reacción con los conos de cemento indica que 64P es una proteína de cemento que cubre el cono de cemento, posiblemente actuando como un pegamento que une el cono de cemento con los tejidos epidérmicos y dérmicos circundantes.

Referencias

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Claims (34)

1. Una proteína de cemento de tejido cuya proteína consta de (i) la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO. 16 o SEQ ID NO. 11 o que contiene una de las secuencias parciales de aminoácido mostradas en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8 o SEQ ID NO. 17; o (ii) una secuencia de aminoácido que tiene al menos 50% de homología a lo largo de toda la secuencia de aminoácido de (i).

2. Una proteína que es un fragmento inmunogénico de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Una proteína de cemento de tejido de acuerdo con la reivindicación 1 que se une con tejidos de vertebrados.

4. La proteína de cemento de tejido de la reivindicación 1 o 3 que se deriva de un ectoparásito que se alimenta de sangre.

5. La proteína de cemento de tejido de la reivindicación 4 que se deriva de garrapatas.

6. La proteína de cemento de tejido de la reivindicación 5 que se deriva de garrapatas ixodidas.

7. La proteína de cemento de tejido de la reivindicación 6 que se deriva de R. appendiculatus.

8. La proteína de cemento de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 5, 6 o 7 que se asocia con una o más moléculas de carbohidrato.

9. La proteína de cemento de tejido la reivindicación 8 que se asocia con una o más moléculas de glicosaminoglicano.

10. La proteína de cemento de tejido de las reivindicaciones 1 o 3 a 9 que se expresa en forma recombinante.

11. La proteína de cemento de tejido de las reivindicaciones 1 o 3 a 9 que se asocia con uno o más péptidos o polipéptidos.

12. La proteína de cemento de tejido de acuerdo con la reivindicación 11 que se asocia con una o más automoléculas para formar una unidad homodímera, homotrímera o en forma de homotetrámero.

13. La proteína de cemento de tejido de acuerdo con la reivindicación 11 asociada con una o más moléculas que no se forman a sí misma para formar una unidad homodímera, homotrímera o en forma de homotetrámero.

14. La proteína de cemento de tejido de una de las reivindicaciones 1 o 3 a 13 que se ha fusionado genéticamente o químicamente con uno o más péptidos o polipéptidos.

15. La proteína de cemento de tejido de una de las reivindicaciones 1 o 3 a 14 que se ha enlazado de manera cruzada con uno o más péptidos o polipéptidos.

16. La proteína de cemento de tejido de una de las reivindicaciones 1 o 3 a 15 unida a una etiqueta.

17. La proteína de cemento de tejido de una de las reivindicaciones 1 o 3 a 16 unida a una toxina.

18. La proteína de cemento de tejido de una de las reivindicaciones 1 o 3 a 17 que está sujeta a un soporte, como una resina.

19. Una composición farmacéutica que consta de una proteína de cemento de tejido o un fragmento inmunogénico de la misma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

20. Una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o una composición farmacéutica de la reivindicación 19 para uso en terapia.

21. Una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para uso como una vacuna o como un componente de una vacuna.

22. Uso de una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en la fabricación de una vacuna o un componente de vacuna.

23. Una vacuna que está formada por una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

24. Una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o una composición farmacéutica de la reivindicación 19 para uso en la unión temporal o permanente de tejidos.

25. Una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para uso como un inmunogen protector en el control de enfermedades causadas por infecciones transmitidas por parásitos antrópodos.

26. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de cemento de tejido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

27. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 26 que está formada por ADN, cADN y ARN.

28. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 26 o 27 que está formada por ADN.

29. Un vector de clonación o expresión que está formado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28.

30. El vector de la reivindicación 29 que está basado en un virus.

31. El vector de la reivindicación 30 que está basado en baculovirus.

32. Una célula huésped transformada o transfectada con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32.

33. Un animal transgénico no humano que se ha transformado por la acción de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 o por un vector de cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32.

34. Un método de preparación de una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende la expresión de un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 en una célula huésped y que también comprende el cultivo de dicha célula huésped bajo condiciones donde dicha proteína se expresa, y la recuperación de dicha proteína por lo tanto expresada.