ES2281076T3

ES2281076T3 - Empleo de la adn polimerasa con actividad editora intrinseca en 3'.

Info

Publication number: ES2281076T3
Application number: ES96108543T
Authority: ES
Inventors: Bruno Canard; Gregor Dr. Sagner
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1995-06-01
Filing date: 1996-05-29
Publication date: 2007-09-16
Anticipated expiration: 2016-05-29
Also published as: JP3013156B2; DE69636895T2; US6001566A; EP0745686A1; JPH08322600A; ATE353973T1; DE69636895D1

Abstract

LA INVENCION ESTA DIRIGIDA AL USO DE POLIMERASAS DE ARN O ADN QUE TIENEN ACTIVIDAD DE REVISION DE 3`INTRINSECA (3`IEA) EN PRESENCIA O AUSENCIA DE UN AGENTE DESACTIVANTE PARA ELIMINAR UN GRUPO PROTECTOR DE LA POSICION 3` DE OLIGO O POLIRIBO- O DEOXIRIBONUCLEOTIDOS. EL USO SE REFIERE A LA INCORPORACION DE DNTPS EN PLANTILLAS DE ADN PARA DETERMINAR LA CONCENTRACION Y/O SECUENCIA DE DICHAS PLANTILLAS. EN PARTICULAR EL USO SE REFIERE A UN METODO MEJORADO SECUENCIADOR NO BASADO EN GEL.

Description

Empleo de la ADN polimerasa con actividad editora intrínseca en 3'.

La invención se refiere al empleo de las ADN polimerasas que tienen actividad editora intrínseca en 3' (3'-IEA) en presencia o ausencia de un agente desactivante para eliminar un grupo protector de la posición 3' de los oligo- o polirribo- o desoxirribonucleótidos. El empleo se refiere particularmente a un método de secuenciación perfeccionado que no está basado en un gel.

La genética molecular moderna está logrando corrientemente importantes avances en la comprensión de procesos biológicos complejos y patologías tales como el cáncer o enfermedades hereditarias. Esto ha sido posible principalmente por el desarrollo de las técnicas de secuenciación de nucleótidos en los últimos años 70 (Sanger, 1977, Maxam y Gilbert, 1977). Estos métodos clásicos están todavía en uso en su forma original en la mayor parte de laboratorios de todo el mundo. A pesar de su amplia aceptación como método de selección, el método didesoxi de Sanger no ha sido todavía completamente automatizado, debido principalmente al paso de la electroforesis sobre gel. En consecuencia, este paso por partidas ha sido perfeccionado en cuanto a la velocidad y número de muestras procesadas, pero actualmente hay en marcha tentativas para descubrir métodos alternativos que soslayen estas evidentes limitaciones. Estos esfuerzos no han tenido gran éxito y solamente nuevos conceptos y proyectos emergentes han aparecido recientemente, como p. ej., la secuenciación por hibridación (Strezoska et al., 1991) ó la microscopía de escaneado por efecto túnel (Driscoll et al., 1990).

Con estas ideas en la mente, varios equipos investigadores han propuesto un nuevo método que se aprovecharía del poder enzimático del método didesoxy de Sanger, pero sin generar una mezcla compleja de productos que son subsiguientemente analizados mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida (Tsien 1991, Gibbs et al., 1993, Canard y Sarfati, !993). Este nuevo método se basa en la adición de una única base a una cadena de ADN creciente complementaria a la secuencia de nucleótidos que hay que determinar. Cada base añadida se identifica de manera paso a paso, y la secuencia desconocida se deduce en tiempo real durante un esquema completamente automatizado. Con el fin de controlar la adición de una y solamente una base mediante una ADN polimerasa, han tenido que diseñarse nucleótidos 5'-trifosfatos especiales de las cuatro bases ATGC, de tal forma que sean todavía buenos substratos de ADN polimerasa, puedan distinguirse fácilmente uno de otro, y pueden actuar bien sea como terminadores de cadena, o bien, una
vez incorporados puedan actuar como un nuevo cebador-3' para la adición de la próxima base para ser identificados.

La protección química del 3'-hidroxilo de dichos substratos daría a los mismos estas deseadas propiedades siempre que una vez ha sido incorporado, su hidroxilo 3' bloqueado pueda ser desprotegido para restaurar un extremo 3' funcional. De esta manera, la protección del 3' actúa como una marca de cada una de las cuatro bases ATGC, y su identificación significa la identificación de la nucleobase correspondiente al molde de ADN empleando las reglas estándar del emparejamiento de bases, y así se dispone de una forma muy fácil para determinar una secuencia de nucleótidos una vez este proceso ha sido ciclado eficientemente. Muchos 2'-desoxinucleótidos 5'-trifosfatos, 3'-modificados, han sido sintetizados y muestran ser substratos para las ADN polimerasas (Kornberg, 1980, Tabor y Richardson, 1989, Kraevsky, 1987, Canard & Sarfati, 1994a), y esto deja poca duda sobre la viabilidad de la reacción de incorporación en un tiempo razonable. Asimismo, la detección fluorimétrica de los nucleótidos o los ADN alargados con bases marcadas fluorescentemente, se emplea corrientemente en los protocolos estándar de las máquinas de secuenciación semiautomática (Venter et al., 1992), así como estaba previsto en moléculas fluorescentes individuales liberadas en una reacción conducida por la 3'-exonucleasa (Davis et al., 1991). Esto hace que los problemas de incorporación y detección sean fáciles de resolver a nivel de desarrollo y automatización.

Este no es sin duda el caso para la desprotección, la cual queda así como el paso clave. La posición 3' tiene que ser protegida de tal manera que sea completamente estable en las condiciones estándar de incorporación para evitar la formación de una indeseada insignificante concentración de nucleósido 5'-trifosfato desprotegido, pero es fácilmente desprotegido en otras condiciones suaves compatibles con la estabilidad del ADN químico y dúplex. Gibbs et al., 1994, han diseñado un substrato timidina nucleótido con un brazo separador 3', el cual es sensible a la luz y así restablece un extremo 3'-hidroxilo después de la irradiación con UV. Sin embargo, esto requiere la aplicación de una química sofisticada y difícil, a las tres bases AGC restantes, deja una baja flexibilidad en el espaciador con el diseño de brazo, y por lo tanto en el tag correspondiente, y no existen datos respecto al empleo de otros polos de ADN que el polo Bst ADN I (Gibbs et al., 1994).

Canard y Sarfati (1993) han diseñado 2'-desoxinucleótidos 3'-modificados que están indirectamente e inmediatamente desprotegidos en condiciones neutras a temperatura ambiente. Estos autores tienen también presentados datos sobre la desprotección enzimática empleando enzimas similares a la esterasa capaces de hidrolizar sin embargo los 3'-ésteres a una velocidad reducida, (Canard y Sarfati, 1994a). La desprotección enzimática tiene todas las propiedades requeridas para ser completamente integrada en un proceso de secuenciación, excepto que debe ser cinéticamente atractiva, es decir, la desprotección ideal debe efectuarse en cuestión de segundos.

Durante la búsqueda de las condiciones ideales de incorporación, se descubrió que la mayoría de ADN polimerasas podían emplearse para desproteger el extremo 3'-bloqueado del ADN terminado, eliminando la tediosa búsqueda ó método de una enzima apropiada de desbloqueo en 3', (Canard y Sarfati, 1994 a,b). Sin embargo, esta propiedad general de las ADN polimerasas se convierte completamente en no válida en los esquemas de secuenciación que no tienen un gel como base, como se describe en Tsien, 1991 o similar.

Esta secuenciación que no tiene un gel como base, mediante la cual se prepara una cadena complementaria paso a paso por medio se una ADN polimerasa y se necesitan después electroforesis sobre gel que no consuman tiempo, tienen ventajas esenciales sobre los métodos clásicos de p. ej., Sanger (WO 91/06678, WO 93/05183, DE 4141 178, US 5.302.509, FR 93 03 538). Un nucleótido modificado en 3' (terminadores de la cadena de ADN) es presentado como un substrato de ADN-polimerasa. Sin embargo, la eliminación del grupo, introducido en el extremo 3' de la cadena de ADN (3'-tag), debe efectuarse en un segundo paso. Respecto a esto, se aplican normalmente métodos químicos, fotoquímicos y enzimáticos.

El principal problema a resolver de acuerdo con la presente invención es, por lo tanto, salvar los inconvenientes mencionados más arriba.

Este problema se resuelve mediante la presente invención y se basa en el empleo de una ADN polimerasa que tiene una actividad editora intrínseca en el 3' (3'-IEA) como una herramienta en varias técnicas de biología molecular en particular en técnicas de secuenciación no basadas en un gel. La 3'-IEA permite el empleo de substratos de ADN polimerasa 3'-modificada, que no son terminadores de la cadena de ADN. Dado que el gen 3'-tag se elimina por la ADN polimerasa durante la adición del próximo nucleótido, el nucleótido 3'-modificado inicial, es un falso terminador de cadena que tiene su posición 3' convertida en un extremo 3' funcional capaz de actuar como un cebador para el próximo nucleótido. El hecho clave que es la base de la presente invención, es que el gen 3'-tag es liberado por la propia ADN polimerasa, simultáneamente a la adición del próximo nucleótido correcto. Por lo tanto, el gen 3'-tag liberado es indicativo de cuál nucleótido ha sido insertado pero solamente indicativo de cuál próximo nucleótido ha provocado la liberación del gen tag. El hecho de que la ADN polimerasa sea capaz de liberar el gen 3'-tag después de la inserción de un nucleótido con el gen 3'-tag seguido por la adición de un nucleótido clásico dado es pues informativo sobre dos nucleobases consecutivas sobre una cadena de un ADN desconocido. Esto puede ser empleado para eliminar un 3'-tag específico de un nucleótido insertado en un esquema de secuenciación no basado en un gel, como describe Tsien 1991, Gibbs et al., 1991, Canard y Sarfati, 1993. En este caso, la 3'-IEA es clave para efectuar eficientemente el paso de desprotección y subsiguientemente identificación de cuál base ha sido insertada. También es de interés notar que la polimerización de una mezcla de tres de los cuatro nucleótidos clásicos y el cuarto nucleótido conteniendo 3'-tag, en un ADN cebado en presencia de una ADN polimerasa con 3'-IEA procederá normalmente, pero el 3'-tag se liberará en el medio tan pronto como el nucleótido portador sea incorporado al ADN. Por lo tanto, la presencia del tag libre en el medio será indicativo de que la polimerización ha tenido lugar. Esto es de particular interés para comprobar rápidamente si la polimerización ha tenido lugar en una mezcla de reacción dada (tal como la PCR). De preferencia, el tag será fácilmente identificado en su forma libre comparado con su forma unida 3'-.

Los substratos típicos de ADN polimerasa de acuerdo con la presente invención son compuestos de fórmula general (I):

1

en donde X es un grupo de unión bifuncional, Y es un radical con la condición de que un grupo activado y el radical B sean una purina, pirimidina, desazapurina, desazapirimidina o análogos de las mismas, de preferencia compuestos en donde X es un oxígeno, azufre o un grupo -NH, e Y es un grupo -C(O)R, -CH_{2}-R, -C(S)NH-R ó -C(O)NH-R, en donde R es un hapteno, un colorante o un cromóforo como p. ej., un cromóforo fluorescente o un grupo alquilo ramificado o sin ramificar que consta por lo menos de un átomo.

En particular, los 5'-trifosfatos de nucleótido 2'-desoxi 3'-esterificado actúan como substratos para varias ADN polimerasas en un sencillo ensayo estándar de partida empleando el nucleótido afín solo. Sin embargo, cuando se empleó una mezcla de cuatro desoxinucleótidos esterificados en 3', se observó más de un producto de adición con un fragmento grande de E. coli ADN polimerasa I y ADN polimerasa T7. Este no era el caso de la Taq ADN polimerasa ni de varias otras enzimas termofílicas, sugiriendo que el "readthrough" ("continuación de la transcripción a través de un terminador de transcripción") no era debido a una pequeña concentración de desoxinucleótidos desprotegidos en 3'. Los niveles óptimos de incorporación empleando la Taq ADN polimerasa se logran sorprendentemente a temperaturas entre 37ºC y 45ºC, muy por debajo de la temperatura óptima conocida de 72ºC para la actividad de la Taq ADN polimerasa. Sin embargo, no hubo ninguna diferencia entre el modelo de producto cuando se empleó una enzima termofílica clonada frente a una nativa, desechando una posible contaminación del producto clonado por E. coli ADN polimerasas. La eliminación del 3'-éster fue también sistemáticamente independiente de la presencia o ausencia de actividad 3' a 5' exonucleasa asociada a menudo con moléculas de ADN polimerasa, como queda ejemplificado por el empleo de la T7 ADN polimerasa obtenida por ingeniería genética (Sequenase) exenta de dicha actividad de corrección de errores. Cuando los nucleótidos esterificados en 3' fueron preincubados con T7 ADN polimerasa en ausencia de ADN, la enzima subsiguientemente inactivada por el calor y la mezcla incubada con un molde/cebador de ADN y Taq ADN polimerasa, se observó un único producto de adición como antes, indicando que los ésteres en 3' no fueron hidrolizados antes de la incorporación.

Otro objeto de la invención para el empleo de ADN polimerasas que contienen 3'-IEA, se refiere a la cantidad de tag libre liberado en el medio el cual es estequiométrico con la cantidad de su nucleobase de soporte que ha sido insertada en la cadena creciente de ADN. Esto es de particular interés para determinar el número de repeticiones de una base dada, un dinucleótido dado, un trinucleótido dado, o cualquier secuencia repetida dada que contiene solamente tres de las cuatro bases ATGC. A continuación de dicho ensayo, la cantidad de tag liberado en el medio cuando tiene lugar la polimerización a través de un tramo de un motivo repetido, es directamente proporcional al número de repeticiones de dicho motivo. Esto es de particular importancia cuando el número de repeticiones en una secuencia de ADN es correlativa con la aparición o completa expresión de una enfermedad hereditaria, tal como por ejemplo el síndrome de X frágil (Fu et al., 1991) u otras enfermedades que implican defectos moleculares similares.

Otro aspecto de esta invención es que identifica una posición en nucleótidos modificados (o nucleótidos análogos) que pueden ser químicamente modificados sin alterar las propiedades de incorporación de estos substratos. Por lo tanto, esta posición 3'- puede emplearse para unir químicamente substituyentes que dan al análogo del nucleótido diferentes propiedades que el análogo 3'-hidroxil nucleótido de partida. A continuación es posible modificar propiedades físicas de análogos de nucleótido hacia una hidrofobicidad, hidrofilicidad, polaridad u otros, aumentados, sin alterar sus propiedades de incorporación mediante la polimerasa. Esto es de particular importancia en la química antivírica en donde la forma 5'-trifosfato de un análogo de nucleótido puede ser un potente inhibidor de la transcriptasa inversa víricamente codificada in vitro, pero ineficiente in vivo debido a que el 5'-mono, -di, o -trifosfato con una carga previenen el suministro dentro de la célula viva debido a su incapacidad para atravesar la membrana citoplasmática apolar. Un éster lipofílico en la posición 3' cambia en gran manera las propiedades hidrofóbicas de dicho 5'-monofosfato nucleótido análogo, permitiendo la fácil entrada dentro de la célula, y así soslayando la necesidad de una reacción 5'-quinasa específica sobre el análogo del nucleótido. Esto es de una gran importancia clínica ya que las cepas víricas pueden convertirse en resistentes a los fármacos mediante la pérdida de su gen quinasa. De una manera más general, uniendo un substituyente que tiene propiedades lipofílicas en la posición 3' de un nucleótido permite compensar un carácter hidrofílico o polar aportado por un 5'-mono, di o trifosfato. Una vez dentro de la célula este 3'-lipofílico nucleótido 5'-mono, di o trifosfato puede ser convertido en la forma 5'-trifosfato (si se desea) mediante quinasas celulares, y puede ser incorporado en el ADN. Si el nucleótido 3'-lipofílico lleva una base modificada, debido a la 3'-IEA, este nucleótido modificado será incorporado dentro del ADN de la célula juntamente con su base modificada, dejando el substituyente 3'-lipofílico original en la forma libre, es decir, unido no covalentemente al ADN, gracias al 3'-IEA. Es también evidente para un experto en la técnica que esto puede emplearse para suministrar un compuesto a la célula que no sería fácilmente introducido, solo, dentro de la célula.

A continuación, se ilustra como puede controlarse la 3'-IEA, ó por otra parte, como aprovechar la 3'-IEA como se ha descrito más arriba.

Como emplear una ADN polimerasa (5 unidades) y cuatro nucleótidos-5'-trifosfato (1 mM) con el gen tag en 3', en un esquema de secuenciación no basado en un gel, con el fin de determinar el nucleótido de una cadena de ADN desconocido (2 picomoles) el cual está inmovilizado sobre un soporte sólido (Dynabead M-280, DYNAL), se muestra en la figura 5, panel a). Está claro que la ADN polimerasa debe estar desprovista de 3'-IEA en estas condiciones de reacción, de otra manera, los dNTP con tag en 3' actuarían como falsos terminadores de cadena y harían una correcta y específica inserción de un nucleótido imposible. La figura 4a) muestra que la Taq polimerasa es capaz de efectuar lo que está representado en la figura 3, pero siempre que se tenga cuidado de cambiar las condiciones clásicas de reacción de la Taq polimerasa (72ºC, pH 8,3, 1-5 mM Mg^{2+}) con el fin de inhibir completamente su 3'-IEA (30º-45ºC, pH 7,5, 1 mM Mn^{2+}, 5 mM de citrato, 1 mM de cada uno de los nucleótidos que contienen el 3'-tag).

La figura 3 del panel b) muestra como este esquema de secuenciación puede adaptarse a un número muy grande de muestras de ADN inmovilizadas sobre un soporte sólido, tal como describe Fodor, 1994, y las puntuaciones estimadas de incorporación registradas por un sistema de análisis por imagen (cámara CCD). Se emplean las mismas condiciones experimentales que las de la figura 3a), excepto que la placa que lleva los ADN inmovilizados se sumerge en una mezcla de reacción que contiene solamente un nucleótido conteniendo 3'-tag a la vez que junto con la ADN polimerasa desprovista de 3'-IEA en un tampón apropiado, se lava con tampón de lavado, se analiza por medio de una cámara CCD, se registran las coordenadas de las muestras de ADN con el nucleótido con el 3'-tag incorporado, y el proceso se repite a su vez para los tres nucleótidos conteniendo los 3'-tag restantes. Después de que se han incorporado los cuatro nucleótidos conteniendo 3'-tag, todas las muestras de ADN están señalizadas con el tag. Todos los tags se eliminan con una solución de desprotección, y el proceso se repite para determinar cuál segunda base de cada muestra de ADN es capaz de incorporar. De nuevo está claro que una ADN polimerasa que presente actividad 3'-IEA llenaría completamente las cadenas de ADN como se muestra en la figura 1a), invalidando el método.

Los siguientes ejemplos especifican más la presente invención: Ejemplo 1 El empleo de la 3'-IEA como marcador de la incorporación del nucleótido dentro del ADN

La determinación del éxito de una reacción de incorporación (p. ej., una PCR), se efectúa corrientemente mediante el análisis de los productos de reacción por electroforesis sobre gel de agarosa o poliacrilamida. Aunque simple, este paso puede se extremadamente tedioso y poco apto para la automatización si se analizan un gran número de productos de la PCR al mismo tiempo. Así, probaría ser muy útil para ser capaz de comprobar visualmente la incorporación de los dNTP ó por lo menos soslayar la electroforesis sobre gel mediante el empleo de un test de incorporación automatizado. El empleo de los dNTP conteniendo 3'-tag, conjuntamente con los dNTP clásicos y una ADN polimerasa presentando actividad 3'-IEA eficientemente, permite decidir si los nucleótidos han sido incorporados o no, durante una reacción de polimerización. La figura 4) ilustra el método en donde una pequeña concentración de un dNTP conteniendo 3'-tag está incluida en una PCR juntamente con una mezcla de PCR clásica (los dNTP, cebadores, molde de ADN y tampón).

Debido a que el dNTP conteniendo 3'-tag está insertado al azar en lugar de su normal contrapartida 3'-OH-dNTP frente a su congénere Watson-Crick, y el tag es subsiguientemente eliminado cuando tiene lugar la adición del próximo nucleótido, la presencia de un tag sin acoplar en el sobrenadante es indicativo de que la polimerización ha tenido lugar, estando la concentración del tag en el sobrenadante directamente relacionada con el número de nucleótidos conteniendo 3'-tag insertados. La figura 4b) ilustra un camino para determinar la concentración del producto de doble cadena cuando la PCR se ha completado. Una mezcla de tres dNTP y un dNTP conteniendo 3'-tag se añade a la PCR, y solamente se efectúa un ciclo de la PCR teniendo cuidado de que la temperatura de adición de la ADN polimerasa sea la de actividad óptima. De nuevo, la concentración del producto ADN de doble cadena está en relación con la concentración del 3'-tag libre en el sobrenadante. A continuación, se puede seleccionar aquellas PCR en las que ha tenido lugar la incorporación, y analizar solamente aquellas para detectar la longitud correcta de producto empleando la electroforesis sobre gel.

Es también evidente que este método puede emplearse para determinar una concentración de ADN en una muestra de ADN desconocida. En efecto, en el caso de la figura 4b, está claro que la cantidad de tag liberado es proporcional a la cantidad de molde de ADN, y que la apropiada calibración con estándares cuya concentración es conocida, permite determinar la concentración de ADN de dicha muestra desconocida mediante la determinación del tag libre en el sobrenadante. Como se ha indicado antes, el tag puede indentificarse fácilmente en su forma libre comparado con su forma acoplada a 3'. Con esta finalidad, los mejores fluoróforos son aquellos que tienen un cambio del Stockes grande, de tal forma que la longitud de onda máxima de emisión correspondiente a su forma libre se solape lo menos posible con la longitud de onda máxima de emisión de su forma acoplada. Esta propiedad puede ser ventajosamente empleada con el fin de obtener una señal fluorescente solamente cuando existe un tag libre en el sobrenadante subsiguiente a la expresión de la 3'-IEA.

Ejemplo 2 Contaje del número de repeticiones del tri-nucleótido en una secuencia de ADN dada, empleando un único tubo y reacción: caso de las repeticiones de CGG y el síndrome de X frágil

El síndrome de X frágil es el retraso mental heredado más frecuente en los humanos (revisado por Oostra et al., 1993). La base molecular de la enfermedad es la llamada "mutación dinámica" en el locus FMR1, la cual implica la rápida expansión de un triplete (CGG)n de repetición cuyo número n está íntimamente correlacionado con los fenotipos normal, portador o patológico (Fu et al., 1991). Los fenotipos normales tienen repeticiones polimórficas (CGG) que oscilan de 6 a 23 unidades, mientras que las hembras portadoras tienen entre 43 y 200 unidades. Los individuos afectados tienen más de 200 unidades del repetidor CGG. Por lo tanto, es evidente que un contaje preciso del número de repeticiones CGG es clínicamente importante en el diagnóstico así como a nivel de predicción, y esto puede ser muy estimado por los métodos citogénicos clásicos o análisis del ADN empleando la PCR y subsiguiente electroforesis sobre gel. El empleo de la 3'-IEA puede substituir con ventaja el paso de la electroforesis sobre gel y dar un número preciso de repeticiones mediante un ensayo muy sencillo. Se emplean cebadores que flanquean la región de repetición del triplete (figura 5) para producir un producto de PCR que puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido empleando métodos estándar tales como el sistema biotina-estreptavidina y perlas magnéticas (Dynal, Noruega). Se prepara un molde de secuenciación de ADN monocatenario, por fusión del duplex con NaOH como recomienda el fabricante, e inmediatamente se coloca un cebador más arriba de la región (CGG)n. A continuación, el ADN encebado se incuba con una mezcla que contiene una ADN polimerasa que presenta 3'-IEA, 200 \muM de dGTP, 50 \muM de dATP y 50 \muM de ddTTP y 400 \muM de dCTP conteniendo 3'-tag, en condiciones de pH, temperatura y tiempo óptimas, tanto para las actividades de polimerización como de la 3'-IEA. El 2'3'didesoxinucleótido se incorpora solamente al exterior de la región CGG, y se interrumpe la reacción mediante la terminación de la cadena de ADN cuando encuentra su base afín. En el interior de la región CGG, el dGTP se incorpora a su base dC afín, y el dCTP conteniendo 3'-tag se incorpora también en la región CGG, y su 3'-tag se elimina durante la expresión de la 3'-IEA. Una vez terminada la reacción de extensión se analiza el sobrenadante para detectar la presencia de tag libre, bien sea directamente o después de un breve procedimiento de purificación destinado a separar el tag libre del dCTP conteniendo 3'-tag, no incorporado, como por ejemplo mediante una HPLC ó una rápida cromatografía de intercambio iónico capaz de eliminar los compuestos trifosfato pero no el tag libre. El mismo experimento se repite con un ADN de control en el cual la región CGG ha sido totalmente caracterizada mediante secuenciación del ADN, y la comparación de la concentración de tag libre entre las dos muestras permite determinar con precisión el valor del número n de repeticiones CGG tomando en consideración el número de alelos amplificados dado que la región FMR1 está situada en el cromosoma X.

Está claro que esta técnica puede aplicarse a cualquier otra secuencia de ADN que lleve una repetición de mono, di o tri nucleótido, o secuencias más largas que contengan solamente 3 de las cuatro bases clásicas A, T, G y C, tales como, por ejemplo, las secuencias teloméricas repetidas (TTAGGG)n, en las cuales n tiene una importancia biológica. La composición de la mezcla de ddNTP, dNTP y dNTP conteniendo 3'-tag, se adapta fácilmente al caso que se estudia para determinar convenientemente el número n de repeticiones de una secuencia corta dada.

Ejemplo 3 Determinación de la secuencia de nucleótidos de una muestra desconocida de ADN empleando un esquema de substitución de tag mediada por la 3'-IEA de ADN polimerasa

Se emplea la misma operatividad que se emplea en la figura 5 para el cebador:molde, pero la finalidad del experimento es la de determinar la secuencia de nuceótidos del ADN desconocida del molde. El ADN encebado se incuba secuencialmente con un solo dNTP conteniendo 3'-tag a la vez, y se comprueba la incorporación tanto in situ (p. ej., mediante detección fluorimétrica si el tag es fluorescente), como en el sobrenadante. En efecto, cuando la ADN polimerasa exhibe su actividad 3'-IEA, el tag unido en el extremo 3' se libera en el sobrenadante mientras que el ADN se termina mediante un nuevo nucleótido entrante que contiene un 3'-tag, y de esta forma, la fluorescencia puede ser determinada en el extremo 3' de la cadena de ADN y en el sobrenadante como un tag libre. Básicamente, un dNTP conteniendo 3'-tag se incuba cada vez en el ADN encebado. En la figura 6, el orden es el siguiente: A, Y, C, G, todos llevando un 3'-tag. Así, el dATP conteniendo 3'-tag se añade en primer lugar, y la fluorescencia se comprueba in situ y en el sobrenadante. Ambos dan una señal negativa debido a que A se encuentra en el molde justo adyacente al cebador. A continuación, se emplea el dTTP conteniendo 3'-tag, y se encuentra que está incorporado mediante detección fluorimétrica in situ solamente. Una señal fluorescente positiva solamente in situ, indica que no se ha expresado ninguna 3'-IEA, y así, que solamente un T ha sido incorporado. Después de encontrar cualquier señal positiva (in situ o en el sobrenadante), se emplea de nuevo el orden secuencial de los nucleótidos A, T, C y G conteniendo 3'-tag, y así la muestra sondada con dATP conteniendo 3'-tag, la cual es positiva en nuestro ejemplo porque la próxima base es T. La fluorescencia se detecta tanto in situ como en el sobrenadante, indicado la expresión de 3'-EIA. En este caso, es importante conocer cuantos As han sido insertado en una fila. Esto puede lograrse fácilmente añadiendo al sobrenadante un estándar fluorimétrico interno, es decir, una cantidad conocida de tag libre con el fin de estimar con exactitud cuantos tags por molde han sido liberados mediante la 3'-IEA, en este caso, solo uno.

Esto se ilustra para la base incorporada próxima, en donde cuatro dCTP conteniendo 3'-tag se añaden a una fila, liberando cuatro tags libres por molde. Estos se comprueban añadiendo un estándar interno en el sobrenadante y se cuantifican fluorimétricamente a continuación. Aunque el proceso se efectúa fácilmente a mano, está claro que un sistema de detección por fluorescencia acoplado a un ordenador puede conducir una estación robótica de trabajo que edita datos de secuenciación a tiempo real así como también deducir cuál base debe añadirse de acuerdo con la presencia o ausencia del tag en el extremo 3' del ADN ó como tag libre en el sobrenadante. Esos pasos ordenados y lógicos son reiterados para cada base del molde hasta que se ha determinado una secuencia completa de ADN.

Referencias

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Leyendas Figura 1

Estructuras de varios substratos nucleótido 5-trifosfa-tos modificados con 2'-desoxi-3'. Estos compuestos fueron sintetizados por Canard y Sarfati, Gene 148 (1994), 1-16, y son adecuados como substratos para varias ADN polimerasas.

Figura 2

Extensión del cebador marcado en el extremo y ensayo sobre gel empleando los 3'-ant-dNTP y ADN polimerasas. Los 3'-ant-dNTP están descritos en Gene 148 (1994), 1-16 por Canard y Sarfati. a. Los dNTP 3'-esterificados (400 \muM) se incubaron con el cebador/molde y sequenasa durante 0, 1, 2, 3, 4, 5 minutos (calles 0, 1, 2, 3, 4, 5 respectivamente). b. Se emplearon el mismo cebador/molde y los nucleótidos 3'-esterificados (2 mM) con Taq DNA polimerasa durante 0, 5, 10, 15 minutos (calles 0, 6, 7, 8 respectivamente). P: cebador (21-mero). Se pasaron muestras a través de un gel de poliacrilamida desnaturalizado al 15%, el cual fue autorradiografiado.

Figura 3

El panel a) muestra cómo emplear una ADN polimerasa (5 unidades) y cuatro nucleótido-5'-trifosfatos conteniendo 3'-tag (1 mM) y un esquema de secuenciación a base de ningún gel, para determinar el nucleótido de una cadena de ADN desconocido (2 picomoles) el cual se inmoviliza sobre un soporte sólido (Dynabead M-280, Dynal).

El panel b) muestra como este esquema de secuenciación puede adaptarse a un número muy grande de muestras de ADN inmovilizadas sobre un soporte sólido (S. Fodor, Science 264 (1994), 1400), y las puntuaciones estimadas de la incorporación registradas mediante un sistema de análisis por imagen (cámara CCD).

Figura 4

El panel a) muestra que la Taq polimerasa es capaz de realizar lo que se representa en la figura 3, pero en las condiciones clásicas de reacción (72ºC, pH 8,3, 1-5 mM Mg^{2+}) con la finalidad de inhibir completamente la 3'-IEA de la Taq polimerasa (30ºC-40ºC, pH 7,5, 1 mM de Mn^{2+}, 5 mM de citrato, 1 mM de cada uno de los nucleótidos conteniendo 3'-tag).

El panel b) ilustra un camino para determinar la concentración del producto de doble cadena cuando se ha completado la PCR. Una mezcla de tres dNTP y un dNTP conteniendo 3'-tag, se añade a la PCR, y se efectúa solamente un ciclo de la PCR a la temperatura de la actividad óptima de la ADN polimerasa.

Figura 5

Se emplean los cebadores que flanquean la región de repetición del triplete para producir un producto PCR, que puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido empleando métodos estándar tales como el sistema biotina-estreptavidina y perlas magnéticas (p. ej., de Dynal).

Figura 6

Determinación de la secuencia de nucleótidos de una muestra de ADN desconocido empleando un sistema de substitución del tag mediado por la 3'-IEA de la ADN-polimerasa. El ADN encebado se incuba secuencialmente solamente con un dNTP conteniendo 3'-tag cada vez, y la incorporación se comprueba tanto in situ (p. ej., mediante detección fluorimétrica si el tag es fluorescente), como en el sobrenadante (ver ejemplo 3).

Claims

1. Método para la eliminación del grupo Y de un oligo- ó polirribo- ó desoxirribonucleótido de fórmula (I):

3

en donde X es un grupo de unión bifuncional e Y es un radical que proporciona un grupo activado y B es una purina, pirimidina, desazapurina o un análogo de las mismas, en presencia de una ADN polimerasa, un ribo- o un desoxirribonucleótido-5'-trifosfato o un derivado de los mismos, un molde y un agente desactivante, en donde el grupo Y se elimina mediante la ADN polimerasa durante la adición del próximo nucleótido.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde X es un oxígeno, azufre, -NH-, e Y es un

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30

en donde R es un hapteno, un cromóforo o un grupo alquilo ramificado o sin ramificar que consta de un átomo o más.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R es un cromóforo fluorescente y/o el grupo alquilo consta de 1 a 20 átomos.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3, en donde la polimerasa es una ADN polimerasa dependiente del molde.

5. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde se emplea una polimerasa sin actividad 3'-5'-exonucleasa importante, y el molde es una secuencia de desoxinucleótidos capaz de formar un híbrido con el compuesto oligonucleótido de fórmula (I).

6. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en donde se emplea la 3'-5'-exo-minus T7-polimerasa, genética o químicamente construida, la Taq polimerasa y la HIV transcriptasa inversa.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ribo- ó un desoxirribonucleótido -5'-trifosfato o un derivado de los mismos es complementario al nucleótido de la cadena del molde que sigue al extremo 3' del compuesto oligonucleótido de fórmula (I).

8. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde un molde y un agente desactivante están presentes y el agente desactivante es un medio físico, químico o enzimático mediante el cual se inhibe significativamente la escisión de la unión X-Y.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 1 - 8, en donde se emplea una ADN polimerasa que tiene una actividad intrínsecamente 3'-editora.

10. Método de acuerdo con la reivindicación 1 - 9, en donde se incorpora uno o más desoxirribonucleotidotrifosfatos (dNTP) ó derivados de los mismos en el ADN y opcionalmente se determina la concentración o secuencia de dicho ADN, en donde se emplean cebadores apropiados, un molde de ADN y un tampón apropiado que se añaden a una ADN polimerasa con actividad intrínsecamente 3'-editora.

11. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 9, para emplear en el método de secuenciación de nucleótidos no basado en un gel.

12. Método de acuerdo con la reivindicación 1 - 9, para emplear en el contaje del número de repeticiones del nucleótido en una secuencia de ADN dada.