JPH08322600A - ３’−固有の校正活性を有するｄｎａポリメラーゼの使用 - Google Patents
３’−固有の校正活性を有するｄｎａポリメラーゼの使用Info
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- JPH08322600A JPH08322600A JP8160550A JP16055096A JPH08322600A JP H08322600 A JPH08322600 A JP H08322600A JP 8160550 A JP8160550 A JP 8160550A JP 16055096 A JP16055096 A JP 16055096A JP H08322600 A JPH08322600 A JP H08322600A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】脱活性化剤の存在又は非存在下に、オリゴ
−もしくはポリ−リボヌクレオチド、又はオリゴ−もし
くはポリ−デゾキシリボヌクレオチドの３' 位から保護
基を除去するための３' −固有の校正活性を有するＲＮ
Ａ又はＤＮＡポリメラーゼの使用。 【効果】本発明を用いることにより、未知ＤＮＡの配列
及び／又はその濃度を決定することができる。本発明の
方法はゲルを用いないＤＮＡの配列決定法の改良法を提
供するものであり、ＤＮＡの配列決定の自動化を可能と
するものである。
−もしくはポリ−リボヌクレオチド、又はオリゴ−もし
くはポリ−デゾキシリボヌクレオチドの３' 位から保護
基を除去するための３' −固有の校正活性を有するＲＮ
Ａ又はＤＮＡポリメラーゼの使用。 【効果】本発明を用いることにより、未知ＤＮＡの配列
及び／又はその濃度を決定することができる。本発明の
方法はゲルを用いないＤＮＡの配列決定法の改良法を提
供するものであり、ＤＮＡの配列決定の自動化を可能と
するものである。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴ−又はポリ
リボ−又はデゾキシリボヌクレオチドの３’−位から保
護基を除去するための脱活性化剤の存在下又は非存在下
に、３’−固有の校正活性（３’−ＩＥＡ）を有するＤ
ＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼの使用に関する。この使用
は、部分的にゲルを使用しない配列決定法の改良に関す
る。
リボ−又はデゾキシリボヌクレオチドの３’−位から保
護基を除去するための脱活性化剤の存在下又は非存在下
に、３’−固有の校正活性（３’−ＩＥＡ）を有するＤ
ＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼの使用に関する。この使用
は、部分的にゲルを使用しない配列決定法の改良に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】現代分子遺伝学は、いまや、ガンや遺伝
病などの複雑な生物学的過程及び病理学の理解において
重要な進展をもたらしている。これは、主として７０年
代後半のヌクレオチド配列決定法（サンガーら（Sange
r, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R. :プロシーデ
ィングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイ
エンスＵＳＡ 74 (1977)，5463-5467 、マキサムとギル
バート（Maxam, A. M. andGilbert, W. :プロシーディ
ングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンスＵＳＡ 74 (1977)，560-564)の進展により可能とさ
れたものである。これらの古典的方法はいまでもや世界
中のほとんどの研究室でその元の形のまま使用されてい
る。第一選択の方法として広く受入れられているにもか
かわらず、サンガーのジデオキシ法は未だ完全自動化に
は至っていない。主としてゲル電気泳動段階のためであ
る。従って、このバッチステップは速度及び処理試料数
の面で改善されてきた。しかし、これらの明白な限界を
克服する別法の探索する試みが現在行われているところ
である。これらの試みは大きな報いを受けておらず、最
近、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ストレゾ
スカら（Strezoska, Z.,Paunescu, T., Radosalvjevic,
D., Labat, I., Drmanac, R. and Crkvenjakov, R. :
プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー
オブ サイエンスＵＳＡ 88 (1991) 10089-10093) や走
査型トンネル顕微鏡法（ドリスコルら（Driscoll，R.
J., Youngquist, M. G. and Baldeschwieler, J. D. :
ネイチャー 346 (1990) 294-296)などの新規出現の概念
やプロジェクトが現れたにすぎない。
病などの複雑な生物学的過程及び病理学の理解において
重要な進展をもたらしている。これは、主として７０年
代後半のヌクレオチド配列決定法（サンガーら（Sange
r, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R. :プロシーデ
ィングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイ
エンスＵＳＡ 74 (1977)，5463-5467 、マキサムとギル
バート（Maxam, A. M. andGilbert, W. :プロシーディ
ングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンスＵＳＡ 74 (1977)，560-564)の進展により可能とさ
れたものである。これらの古典的方法はいまでもや世界
中のほとんどの研究室でその元の形のまま使用されてい
る。第一選択の方法として広く受入れられているにもか
かわらず、サンガーのジデオキシ法は未だ完全自動化に
は至っていない。主としてゲル電気泳動段階のためであ
る。従って、このバッチステップは速度及び処理試料数
の面で改善されてきた。しかし、これらの明白な限界を
克服する別法の探索する試みが現在行われているところ
である。これらの試みは大きな報いを受けておらず、最
近、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ストレゾ
スカら（Strezoska, Z.,Paunescu, T., Radosalvjevic,
D., Labat, I., Drmanac, R. and Crkvenjakov, R. :
プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー
オブ サイエンスＵＳＡ 88 (1991) 10089-10093) や走
査型トンネル顕微鏡法（ドリスコルら（Driscoll，R.
J., Youngquist, M. G. and Baldeschwieler, J. D. :
ネイチャー 346 (1990) 294-296)などの新規出現の概念
やプロジェクトが現れたにすぎない。
【０００３】このような考えを秘めて、幾つかのチーム
は新たなアプローチを提案している。それは、サンガー
のジデオキシ法の酵素力を利用するが、その後にポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分析される生産物の複
雑な混合物を生成させない方法である（ツィエン（Tsie
n, R. : ＷＯ９１／０６６７８号、ギブスら(Gibbs，
R., Civitello, A., Burgess, K., Raghavachari, R.,
Metzker, M. : ＷＯ９３／０５１８号、キャナードとサ
ルファティ(Canard and Sarfati)：フランス特許930353
8 号）。この新たな取組みは決定対象であるヌクレオチ
ド配列に相補的な成長途中のＤＮＡ鎖中に単塩基付加を
行うことに依存する。付加された塩基はそれぞれ段階的
手法で同定され、そして未知の配列は完全自動化されリ
アルタイムで決定(deduced) される。ＤＮＡポリメラー
ゼによる１個のそして１個だけの塩基の付加を制御する
ため、４種の塩基ＡＴＧＣの特定のヌクレオシド５’−
三リン酸は、それらがなおＤＮＡポリメラーゼの良い基
質であり、相互に容易に区別され得るものであり、そし
て鎖−終結基として機能することができ、あるいはいっ
たん組み込まれたときは同定の対象となる次の塩基の付
加のための新たな３’−プライマーとして機能すること
ができるように設計されなければならない。
は新たなアプローチを提案している。それは、サンガー
のジデオキシ法の酵素力を利用するが、その後にポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分析される生産物の複
雑な混合物を生成させない方法である（ツィエン（Tsie
n, R. : ＷＯ９１／０６６７８号、ギブスら(Gibbs，
R., Civitello, A., Burgess, K., Raghavachari, R.,
Metzker, M. : ＷＯ９３／０５１８号、キャナードとサ
ルファティ(Canard and Sarfati)：フランス特許930353
8 号）。この新たな取組みは決定対象であるヌクレオチ
ド配列に相補的な成長途中のＤＮＡ鎖中に単塩基付加を
行うことに依存する。付加された塩基はそれぞれ段階的
手法で同定され、そして未知の配列は完全自動化されリ
アルタイムで決定(deduced) される。ＤＮＡポリメラー
ゼによる１個のそして１個だけの塩基の付加を制御する
ため、４種の塩基ＡＴＧＣの特定のヌクレオシド５’−
三リン酸は、それらがなおＤＮＡポリメラーゼの良い基
質であり、相互に容易に区別され得るものであり、そし
て鎖−終結基として機能することができ、あるいはいっ
たん組み込まれたときは同定の対象となる次の塩基の付
加のための新たな３’−プライマーとして機能すること
ができるように設計されなければならない。
【０００４】このような基質の３’−水酸基の化学的保
護は組み込まれるかぎり所望の性質をこれらの基質に与
えるであろう、そしてそれらの３’−ブロック水酸基は
脱保護により官能性の３’−末端を回復するであろう。
このようにして、３’−保護は４種の塩基ＡＴＧＣのそ
れぞれの標識として働き、その同定は塩基対合の標準則
を用いてＤＮＡ鋳型に対応する核酸塩基の同定を意味す
ることになり、従って、このプロセスが効率的に回ると
きはヌクレオチド配列を決定するための極めて容易な方
法を提供する。多数の３’−修飾−２’−デオキシヌク
レオシド５’−三リン酸が合成され、これらがＤＮＡポ
リメラーゼの基質となることが明らかにされ（コーンバ
ーグ(Kornberg, A.) :ＤＮＡ複製（１９８０）フリーマ
ン、サンフランシスコ、テイバーとリチャードソン(Tab
or, S. and Richardson, C. : プロシーディングス オ
ブ ナショナル アカデミー オブ サイエンスＵＳＡ
86 (1989) 4076-4080、クラエブスキー(Kraevsky, A.
A.) : モレキュラー バイオロジー 21 (1987) 25-29、
キャナードとサルファティ(Canard and Sarfati):ジー
ン 148 (1994) 1-16）、従って妥当な時間で組み込み反
応が容易に行われることについてはほとんど疑いがな
い。同様に、蛍光標識塩基を持つヌクレオチドや伸長さ
れたＤＮＡの蛍光検出が、現在半自動配列決定装置（ベ
ンターら(Venter, C. J.. Adams, M. D., Martin-galla
rdo, A., McCombie, R. W. and Fields,C. : T. I. B.
S. 10 (1992) 8-11) の標準的プロトコールに採用され
ており、また３’−エキソヌクレアーゼによる反応で放
出される１種の蛍光分子について適用されている（デイ
ビスら(Davis, L., Fairfield, F. R., Harger, C. A.,
Jett, J. H., Keller, R. A., Hahn, J. H., Kratowsk
i, L. A., Marropne, B. L., Martin, J. C., Nutter,
H. L., Ratcliff, R. L., Shera, B. E., Simpson,D.
J. and Soper, S. A. : ジェネティック アナリシス
テクニクス アンドアプリケーションズ 8 (1991) 1-7
) 。このことは、開発や自動化のレベルで、組み込み
や検出の問題を既に解決容易なものとしている。
護は組み込まれるかぎり所望の性質をこれらの基質に与
えるであろう、そしてそれらの３’−ブロック水酸基は
脱保護により官能性の３’−末端を回復するであろう。
このようにして、３’−保護は４種の塩基ＡＴＧＣのそ
れぞれの標識として働き、その同定は塩基対合の標準則
を用いてＤＮＡ鋳型に対応する核酸塩基の同定を意味す
ることになり、従って、このプロセスが効率的に回ると
きはヌクレオチド配列を決定するための極めて容易な方
法を提供する。多数の３’−修飾−２’−デオキシヌク
レオシド５’−三リン酸が合成され、これらがＤＮＡポ
リメラーゼの基質となることが明らかにされ（コーンバ
ーグ(Kornberg, A.) :ＤＮＡ複製（１９８０）フリーマ
ン、サンフランシスコ、テイバーとリチャードソン(Tab
or, S. and Richardson, C. : プロシーディングス オ
ブ ナショナル アカデミー オブ サイエンスＵＳＡ
86 (1989) 4076-4080、クラエブスキー(Kraevsky, A.
A.) : モレキュラー バイオロジー 21 (1987) 25-29、
キャナードとサルファティ(Canard and Sarfati):ジー
ン 148 (1994) 1-16）、従って妥当な時間で組み込み反
応が容易に行われることについてはほとんど疑いがな
い。同様に、蛍光標識塩基を持つヌクレオチドや伸長さ
れたＤＮＡの蛍光検出が、現在半自動配列決定装置（ベ
ンターら(Venter, C. J.. Adams, M. D., Martin-galla
rdo, A., McCombie, R. W. and Fields,C. : T. I. B.
S. 10 (1992) 8-11) の標準的プロトコールに採用され
ており、また３’−エキソヌクレアーゼによる反応で放
出される１種の蛍光分子について適用されている（デイ
ビスら(Davis, L., Fairfield, F. R., Harger, C. A.,
Jett, J. H., Keller, R. A., Hahn, J. H., Kratowsk
i, L. A., Marropne, B. L., Martin, J. C., Nutter,
H. L., Ratcliff, R. L., Shera, B. E., Simpson,D.
J. and Soper, S. A. : ジェネティック アナリシス
テクニクス アンドアプリケーションズ 8 (1991) 1-7
) 。このことは、開発や自動化のレベルで、組み込み
や検出の問題を既に解決容易なものとしている。
【０００５】しかし、脱保護の問題は明らかに未解決で
あり、従って重要なステップである。３’−位は標準組
み込み条件下で完全に安定であるように保護し、望まし
くない僅かな濃度の未保護ヌクレオシド５’−三リン酸
の形成を回避しなければならない。しかし、３’−位は
ＤＮＡの化学的安定性及び二本鎖安定性と両立し得る他
の温和な条件下で容易に脱保護される。ギブスら(Gibb
s, R., Civitello, A.,Burgess, K., Raghavachari,
R., Metzker, M. : ＷＯ９３／０５１８号) は、光感受
性の従ってＵＶ照射により３’−水酸基末端を回復する
３’−スペーサーアームを持つこのようなチミジンヌク
レオチド基質を設計した。しかしながら、これは精巧を
要し、他の３種の塩基であるＡＧＣに適用するには化学
的に困難であり、スペーサーアームの設計従って対応す
る標識には柔軟性がほとんどなく、そしてＢｓｔＤＮＡ
ポール(pole)Ｉ以外の他のＤＮＡポールの使用に関して
はデータが存在しない（ギブスら（Metzker, M., Ragha
vachari, R., Burgess, K. and Gibbs, R. :コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー アブストラク
ト、ゲノムマッピング アンド シーケンシング ミー
ティング，(1994) ｐ170 ）。
あり、従って重要なステップである。３’−位は標準組
み込み条件下で完全に安定であるように保護し、望まし
くない僅かな濃度の未保護ヌクレオシド５’−三リン酸
の形成を回避しなければならない。しかし、３’−位は
ＤＮＡの化学的安定性及び二本鎖安定性と両立し得る他
の温和な条件下で容易に脱保護される。ギブスら(Gibb
s, R., Civitello, A.,Burgess, K., Raghavachari,
R., Metzker, M. : ＷＯ９３／０５１８号) は、光感受
性の従ってＵＶ照射により３’−水酸基末端を回復する
３’−スペーサーアームを持つこのようなチミジンヌク
レオチド基質を設計した。しかしながら、これは精巧を
要し、他の３種の塩基であるＡＧＣに適用するには化学
的に困難であり、スペーサーアームの設計従って対応す
る標識には柔軟性がほとんどなく、そしてＢｓｔＤＮＡ
ポール(pole)Ｉ以外の他のＤＮＡポールの使用に関して
はデータが存在しない（ギブスら（Metzker, M., Ragha
vachari, R., Burgess, K. and Gibbs, R. :コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー アブストラク
ト、ゲノムマッピング アンド シーケンシング ミー
ティング，(1994) ｐ170 ）。
【０００６】キャナードとサルファティ（(Canard and
Sarfati) :フランス特許9303538 号）は、室温における
中性条件下で間接的にそして直ちに脱保護される新たな
３’−修飾−２’デオキシヌクレオチドを設計した。こ
れらの著者は低い速度ではあるけれども、３’−エステ
ルを加水分解することができるエステラーゼ様酵素を用
いる酵素的脱保護に関するデータをも提供した（キャナ
ードとサルファティ(Canard and Sarfati): ジーン 148
(1994) 1-16）。酵素的脱保護は、それが動力学的に魅
力的である、すなわち脱保護が理想的に数秒間で進行す
るに違いないことを除き、このような配列決定過程に組
み込むに要望される多くの性質がある。
Sarfati) :フランス特許9303538 号）は、室温における
中性条件下で間接的にそして直ちに脱保護される新たな
３’−修飾−２’デオキシヌクレオチドを設計した。こ
れらの著者は低い速度ではあるけれども、３’−エステ
ルを加水分解することができるエステラーゼ様酵素を用
いる酵素的脱保護に関するデータをも提供した（キャナ
ードとサルファティ(Canard and Sarfati): ジーン 148
(1994) 1-16）。酵素的脱保護は、それが動力学的に魅
力的である、すなわち脱保護が理想的に数秒間で進行す
るに違いないことを除き、このような配列決定過程に組
み込むに要望される多くの性質がある。
【０００７】理想的な組み込み条件をサーチする間に、
終結したＤＮＡの３’−ブロック端を脱保護するために
ほとんどのＤＮＡポリメラーゼを使用することができ、
適当な３’−脱保護酵素を探索する苦労から開放される
ことを発見した（キャナードとサルファティ(Canard an
d Sarfati): ジーン 148 (1994) 1-16、及び印刷中(199
4)）。しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼのこの一般的
性質は、ツィエン(Tsien, R. :ＷＯ９１／０６６７８
号) などに記載されているようにゲルを用いない配列決
定法では全く無効となる。
終結したＤＮＡの３’−ブロック端を脱保護するために
ほとんどのＤＮＡポリメラーゼを使用することができ、
適当な３’−脱保護酵素を探索する苦労から開放される
ことを発見した（キャナードとサルファティ(Canard an
d Sarfati): ジーン 148 (1994) 1-16、及び印刷中(199
4)）。しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼのこの一般的
性質は、ツィエン(Tsien, R. :ＷＯ９１／０６６７８
号) などに記載されているようにゲルを用いない配列決
定法では全く無効となる。
【０００８】ＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖が段階的
に作られ、そしてその後に長時間を要するゲル電気泳動
を必要としない、上記のようなゲルを用いない配列決定
法は、例えばサンガー(Sanger)の古典的方法（ＷＯ９１
／０６６７８、ＷＯ９３／０５１８３、ＤＥ４１４１１
７８、ＵＳ５．３０２．５０９、ＦＲ９３０３５３８）
に勝る本質的利点がある。３’−修飾ヌクレオチド（Ｄ
ＮＡチェインターミネーター）はＤＮＡポリメラーゼの
基質として表される。しかし、ＤＮＡ鎖の３’−末端に
導入されたこの基（３’−標識）の除去は、第二のステ
ップで行わなければならない。化学的、光化学的及び酵
素的方法がこれに関し通常適用される。
に作られ、そしてその後に長時間を要するゲル電気泳動
を必要としない、上記のようなゲルを用いない配列決定
法は、例えばサンガー(Sanger)の古典的方法（ＷＯ９１
／０６６７８、ＷＯ９３／０５１８３、ＤＥ４１４１１
７８、ＵＳ５．３０２．５０９、ＦＲ９３０３５３８）
に勝る本質的利点がある。３’−修飾ヌクレオチド（Ｄ
ＮＡチェインターミネーター）はＤＮＡポリメラーゼの
基質として表される。しかし、ＤＮＡ鎖の３’−末端に
導入されたこの基（３’−標識）の除去は、第二のステ
ップで行わなければならない。化学的、光化学的及び酵
素的方法がこれに関し通常適用される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明が解決
しようとする主要な問題は、上述の欠点を克服すること
である。
しようとする主要な問題は、上述の欠点を克服すること
である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
（１） ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、脱保護剤、及
び必要に応じ鋳型と脱活性化剤の存在下に、式（Ｉ）
（１） ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、脱保護剤、及
び必要に応じ鋳型と脱活性化剤の存在下に、式（Ｉ）
【００１１】
【化２】
【００１２】（式中、Ｘは二官能性連結基であり、Ｙは
活性基を付与する残基であり、Ｂはプリン、ピリミジ
ン、デアザプリン、デアザピリミジン又はそれらのアナ
ログである。）で表されるオリゴ−もしくはポリ−リボ
ヌクレオチド、又はオリゴ−もしくはポリ−デゾキシリ
ボヌクレオチドからＹ基を除去する方法、（２） Ｘが
酸素、硫黄又は−ＮＨ−であり、Ｙが−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−
ＣＨ2 −Ｒ、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−Ｒ、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ
−Ｒ基であり、ここでＲはハプテン、発色団又は分岐し
又は分岐していない１原子以上からなるアルキル基であ
る、前記（１）記載の方法、（３） Ｒが蛍光発色団で
あり及び／又はアルキル基が１〜２０原子よりなるもの
である、前記（１）記載の方法、（４） 該ポリメラー
ゼが鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼである、前記
（１）〜（３）いずれかに記載の方法、（５） ポリメ
ラーゼとして顕著な３’−５’−エキソヌクレアーゼ活
性を有しないポリメラーゼを用い、鋳型が式（Ｉ）のオ
リゴヌクレオチド化合物とハイブリッドを形成すること
ができるデゾキシヌクレオチド配列である、前記（１）
〜（４）いずれかに記載の方法、（６） 遺伝子工学的
に又は化学的に合成された３’−５’−エキソ−マイナ
スＴ７−ポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ及びＨＩＶ
逆転写酵素が用いられる、前記（１）〜（５）いずれか
に記載の方法、（７） 脱保護剤がリボ−又はデゾキシ
リボヌクレオシド−５’−三リン酸又はその誘導体であ
る、前記（１）〜（６）いずれかに記載の方法、（８）
脱保護剤が式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドの３’末端
に続く鋳型鎖のヌクレオチドに相補的である、前記
（７）記載の方法、（９） 鋳型及び脱活性化剤が存在
し、そしてその脱活性化剤がＸ−Ｙ結合の開裂を顕著に
阻害する物理的、化学的又は酵素的手段である、前記
（１）記載の方法、（１０） ３’−固有の校正活性を
有するＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼが使
用されるものである、前記（１）〜（９）いずれかに記
載の方法、（１１） １個以上のデゾキシヌクレオシド
三リン酸（ｄＮＴＰｓ）又はその誘導体をＤＮＡに組み
込み、そして必要があれば該ＤＮＡの濃度又は配列を決
定することを特徴とし、適当なプライマー、ＤＮＡ鋳型
及び適当な緩衝液を３’−固有の校正活性を有するＤＮ
Ａポリメラーゼに加えて使用する前記（１）〜（１０）
いずれかに記載の方法、（１２） ゲルを用いないヌク
レオチド配列決定法において使用される、前記（１）〜
（１０）いずれかに記載の方法、並びに（１３） 目的
のＤＮＡ配列中のヌクレオチド反復の数の計測において
使用される、前記（１）〜（１０）いずれかに記載の方
法、に関する。
活性基を付与する残基であり、Ｂはプリン、ピリミジ
ン、デアザプリン、デアザピリミジン又はそれらのアナ
ログである。）で表されるオリゴ−もしくはポリ−リボ
ヌクレオチド、又はオリゴ−もしくはポリ−デゾキシリ
ボヌクレオチドからＹ基を除去する方法、（２） Ｘが
酸素、硫黄又は−ＮＨ−であり、Ｙが−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−
ＣＨ2 −Ｒ、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−Ｒ、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ
−Ｒ基であり、ここでＲはハプテン、発色団又は分岐し
又は分岐していない１原子以上からなるアルキル基であ
る、前記（１）記載の方法、（３） Ｒが蛍光発色団で
あり及び／又はアルキル基が１〜２０原子よりなるもの
である、前記（１）記載の方法、（４） 該ポリメラー
ゼが鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼである、前記
（１）〜（３）いずれかに記載の方法、（５） ポリメ
ラーゼとして顕著な３’−５’−エキソヌクレアーゼ活
性を有しないポリメラーゼを用い、鋳型が式（Ｉ）のオ
リゴヌクレオチド化合物とハイブリッドを形成すること
ができるデゾキシヌクレオチド配列である、前記（１）
〜（４）いずれかに記載の方法、（６） 遺伝子工学的
に又は化学的に合成された３’−５’−エキソ−マイナ
スＴ７−ポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ及びＨＩＶ
逆転写酵素が用いられる、前記（１）〜（５）いずれか
に記載の方法、（７） 脱保護剤がリボ−又はデゾキシ
リボヌクレオシド−５’−三リン酸又はその誘導体であ
る、前記（１）〜（６）いずれかに記載の方法、（８）
脱保護剤が式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドの３’末端
に続く鋳型鎖のヌクレオチドに相補的である、前記
（７）記載の方法、（９） 鋳型及び脱活性化剤が存在
し、そしてその脱活性化剤がＸ−Ｙ結合の開裂を顕著に
阻害する物理的、化学的又は酵素的手段である、前記
（１）記載の方法、（１０） ３’−固有の校正活性を
有するＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼが使
用されるものである、前記（１）〜（９）いずれかに記
載の方法、（１１） １個以上のデゾキシヌクレオシド
三リン酸（ｄＮＴＰｓ）又はその誘導体をＤＮＡに組み
込み、そして必要があれば該ＤＮＡの濃度又は配列を決
定することを特徴とし、適当なプライマー、ＤＮＡ鋳型
及び適当な緩衝液を３’−固有の校正活性を有するＤＮ
Ａポリメラーゼに加えて使用する前記（１）〜（１０）
いずれかに記載の方法、（１２） ゲルを用いないヌク
レオチド配列決定法において使用される、前記（１）〜
（１０）いずれかに記載の方法、並びに（１３） 目的
のＤＮＡ配列中のヌクレオチド反復の数の計測において
使用される、前記（１）〜（１０）いずれかに記載の方
法、に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下に本発明について説明する。
上記の問題は、本発明によって解決され、そして幾つか
の分子生物学的技法、特にゲルを使用しない配列決定法
における一つの道具として３’−固有の校正活性（３’
−ＩＥＡ）を有するＤＮＡポリメラーゼの使用に向けら
れる。この３’−ＩＥＡはＤＮＡチェインターミネータ
ーでない３’−修飾ＤＮＡポリメラーゼ基質の使用を可
能とする。３’−標識は次のヌクレオチドの付加の間に
ＤＮＡポリメラーゼにより除去されるから、最初の３’
−修飾ヌクレオチドは次のヌクレオチドに対するプライ
マーとして働くことができる機能的３’−末端に変換さ
れる３’−位を有する虚偽のチェインターミネーターで
ある。本発明の基盤となる重要な事実は、３’−標識が
次の正しいヌクレオチドの付加と同時にＤＮＡポリメラ
ーゼそれ自体により放出されるということである。従っ
て、放出された３’−標識はヌクレオチドが挿入された
ことの指標であり、そして次のヌクレオチドがその標識
の放出を呼び起こしたことの指標ともなる。従って、Ｄ
ＮＡポリメラーゼが、３’−標識ヌクレオチドの挿入及
びその後の古典的ヌクレオチドの付加の際、３’−標識
を放出することができるという事実は、未知のＤＮＡ鎖
上の二つの連続する核酸塩基についての情報を与える。
このことは、ツィエン(Tsien,R. : ＷＯ９１／０６６
７８号) 、ギブス(Gibbs) ら１９９１、キャナードとサ
ルファティ(Canard and Sarfati) :フランス特許930353
8 号に記載されたゲルを用いない配列決定法において挿
入されたヌクレオチドに特異的な３’−標識を除去する
ために使用することができる。この場合、３’−ＩＥＡ
は脱保護段階を効率的に行うためのそしてそれに続く挿
入された塩基を同定するための鍵となる。４種の古典的
ヌクレオチドのうちから３種の混合物の重合化及び第４
の３’−標識ヌクレオチドの重合化は、３’−ＩＥＡを
有するＤＮＡポリメラーゼの存在下にプライマーＤＮＡ
に付加すると、正常に進行するが、３’−標識を持つヌ
クレオチドがＤＮＡに組み込まれると直ちに培地中に
３’−標識が放出されることを指摘するのも興味があ
る。従って、培地中に遊離の標識が存在することは、重
合が起こったことの指標となる。所与の反応混合物（Ｐ
ＣＲのような）中で重合が起こったか否かを素早くチェ
ックできるから、これは特に興味深い。この標識は、
３’−付加形に比べると３’−遊離形で容易に同定され
るものが好ましい。
上記の問題は、本発明によって解決され、そして幾つか
の分子生物学的技法、特にゲルを使用しない配列決定法
における一つの道具として３’−固有の校正活性（３’
−ＩＥＡ）を有するＤＮＡポリメラーゼの使用に向けら
れる。この３’−ＩＥＡはＤＮＡチェインターミネータ
ーでない３’−修飾ＤＮＡポリメラーゼ基質の使用を可
能とする。３’−標識は次のヌクレオチドの付加の間に
ＤＮＡポリメラーゼにより除去されるから、最初の３’
−修飾ヌクレオチドは次のヌクレオチドに対するプライ
マーとして働くことができる機能的３’−末端に変換さ
れる３’−位を有する虚偽のチェインターミネーターで
ある。本発明の基盤となる重要な事実は、３’−標識が
次の正しいヌクレオチドの付加と同時にＤＮＡポリメラ
ーゼそれ自体により放出されるということである。従っ
て、放出された３’−標識はヌクレオチドが挿入された
ことの指標であり、そして次のヌクレオチドがその標識
の放出を呼び起こしたことの指標ともなる。従って、Ｄ
ＮＡポリメラーゼが、３’−標識ヌクレオチドの挿入及
びその後の古典的ヌクレオチドの付加の際、３’−標識
を放出することができるという事実は、未知のＤＮＡ鎖
上の二つの連続する核酸塩基についての情報を与える。
このことは、ツィエン(Tsien,R. : ＷＯ９１／０６６
７８号) 、ギブス(Gibbs) ら１９９１、キャナードとサ
ルファティ(Canard and Sarfati) :フランス特許930353
8 号に記載されたゲルを用いない配列決定法において挿
入されたヌクレオチドに特異的な３’−標識を除去する
ために使用することができる。この場合、３’−ＩＥＡ
は脱保護段階を効率的に行うためのそしてそれに続く挿
入された塩基を同定するための鍵となる。４種の古典的
ヌクレオチドのうちから３種の混合物の重合化及び第４
の３’−標識ヌクレオチドの重合化は、３’−ＩＥＡを
有するＤＮＡポリメラーゼの存在下にプライマーＤＮＡ
に付加すると、正常に進行するが、３’−標識を持つヌ
クレオチドがＤＮＡに組み込まれると直ちに培地中に
３’−標識が放出されることを指摘するのも興味があ
る。従って、培地中に遊離の標識が存在することは、重
合が起こったことの指標となる。所与の反応混合物（Ｐ
ＣＲのような）中で重合が起こったか否かを素早くチェ
ックできるから、これは特に興味深い。この標識は、
３’−付加形に比べると３’−遊離形で容易に同定され
るものが好ましい。
【００１４】本発明の典型的なＤＮＡポリメラーゼ基質
は一般式（Ｉ）の化合物である。
は一般式（Ｉ）の化合物である。
【００１５】
【化３】
【００１６】上式中、Ｘは２官能性の連結基、Ｙは活性
基を付与する残基、そして残基Ｂはプリン、ピリミジ
ン、デアザプリン、デアザピリミジン、又はそれらのア
ナログであり、好ましい化合物はＸが酸素、硫黄又は−
ＮＨ−基でありそしてＹは−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＨ2 −
Ｒ、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−Ｒ、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ基で
あり、ここでＲはハプテン、色素又は蛍光発色団などの
発色団又は分岐し又は分岐していない少なくとも１原子
からなるアルキル基である。特に、２’−デオキシ３’
−エステル化ヌクレオシド５’−三リン酸は、同種のヌ
クレオチドのみを用いる単純始発測定（simple standin
g start assay)において幾つかのＤＮＡポリメラーゼの
基質となる。しかし、４種の３’−エステル化デオキシ
ヌクレオチドの混合物を使用するときは、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ大断片とＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用い
て１個以上の付加産物が観察された。ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼ及びその他の幾つかの好熱性酵素ではこれは観
察されなかった。このことは、読み取りが３’−非保護
デオキシヌクレオチドの微量によるものではないことを
示唆する。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いる最適組み
込みレベルは、驚くべきことに、ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼに対する７２℃という既知の最適温度よりも遙に低
い３７℃と４５℃の間の温度にある。しかしながら、ク
ローニングされた好熱性酵素と天然の好熱性酵素を使用
した場合、生産物パターンに差異はみられなかったこと
から、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼによるクローニング産
物の汚染の可能性は否定できる。３’−エステルの除去
も、遺伝子工学的に作成されたこのような校正活性を欠
くＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（シークエナーゼ（Sequenas
e)）の使用により例示されるように、ＤＮＡポリメラー
ゼ分子としばしば結合している３’→５’エキソヌクレ
アーゼ活性の存在不存在には一貫して無関係であった。
３’−エステル化ヌクレオチドをＤＮＡの不存在下にＴ
７ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートし、この酵
素を熱失活させ、この混合物をＤＮＡ鋳型／プライマー
及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする
と、以前のように１個の付加産物が観察された。これは
３’−エステルが組み込みの前に加水分解されないこと
を示すものである。
基を付与する残基、そして残基Ｂはプリン、ピリミジ
ン、デアザプリン、デアザピリミジン、又はそれらのア
ナログであり、好ましい化合物はＸが酸素、硫黄又は−
ＮＨ−基でありそしてＹは−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＨ2 −
Ｒ、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−Ｒ、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ基で
あり、ここでＲはハプテン、色素又は蛍光発色団などの
発色団又は分岐し又は分岐していない少なくとも１原子
からなるアルキル基である。特に、２’−デオキシ３’
−エステル化ヌクレオシド５’−三リン酸は、同種のヌ
クレオチドのみを用いる単純始発測定（simple standin
g start assay)において幾つかのＤＮＡポリメラーゼの
基質となる。しかし、４種の３’−エステル化デオキシ
ヌクレオチドの混合物を使用するときは、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ大断片とＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用い
て１個以上の付加産物が観察された。ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼ及びその他の幾つかの好熱性酵素ではこれは観
察されなかった。このことは、読み取りが３’−非保護
デオキシヌクレオチドの微量によるものではないことを
示唆する。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いる最適組み
込みレベルは、驚くべきことに、ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼに対する７２℃という既知の最適温度よりも遙に低
い３７℃と４５℃の間の温度にある。しかしながら、ク
ローニングされた好熱性酵素と天然の好熱性酵素を使用
した場合、生産物パターンに差異はみられなかったこと
から、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼによるクローニング産
物の汚染の可能性は否定できる。３’−エステルの除去
も、遺伝子工学的に作成されたこのような校正活性を欠
くＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（シークエナーゼ（Sequenas
e)）の使用により例示されるように、ＤＮＡポリメラー
ゼ分子としばしば結合している３’→５’エキソヌクレ
アーゼ活性の存在不存在には一貫して無関係であった。
３’−エステル化ヌクレオチドをＤＮＡの不存在下にＴ
７ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートし、この酵
素を熱失活させ、この混合物をＤＮＡ鋳型／プライマー
及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする
と、以前のように１個の付加産物が観察された。これは
３’−エステルが組み込みの前に加水分解されないこと
を示すものである。
【００１７】３’−ＩＥＡを有するＤＮＡポリメラーゼ
の使用にかかる本発明の他の目的は、成長しつつあるＤ
ＮＡ鎖中に挿入されたその担体核酸塩基の量に化学量論
的である培地中に放出される遊離の標識の量に関する。
これは、所与の塩基、所与のジヌクレオチド、所与のト
リヌクレオチド、又は４種の塩基ＡＴＧＣのうちの３種
のみを含む所与の反復配列の反復の数を決定する場合に
特に興味がある。次に、このような測定において、反復
するモチーフの伸長により重合が起こるとき、培地中に
放出される標識の量は該モチーフの反復の数に直接比例
する。これは、ＤＮＡ配列中の反復の数が、例えば、脆
弱Ｘ染色体症候群（フーら(Fu, Y.-H.,Kuhl, D. P. A.,
Pizzuti, A., Pieretti, M., Sutcliff, J., Richard
s, S., Verkerk, A. J. M. H., Holden, J. J. A., Fen
wick, R. G., Warren, S. T., Oostra, B. A., Nelson,
D. L. and Caskey, C. T. : セル 67 (1991) 1047-10
58) や同様の分子欠陥を含むその他の疾病などの遺伝病
の開始又は完全発症と相関しているときは特に重要であ
る。
の使用にかかる本発明の他の目的は、成長しつつあるＤ
ＮＡ鎖中に挿入されたその担体核酸塩基の量に化学量論
的である培地中に放出される遊離の標識の量に関する。
これは、所与の塩基、所与のジヌクレオチド、所与のト
リヌクレオチド、又は４種の塩基ＡＴＧＣのうちの３種
のみを含む所与の反復配列の反復の数を決定する場合に
特に興味がある。次に、このような測定において、反復
するモチーフの伸長により重合が起こるとき、培地中に
放出される標識の量は該モチーフの反復の数に直接比例
する。これは、ＤＮＡ配列中の反復の数が、例えば、脆
弱Ｘ染色体症候群（フーら(Fu, Y.-H.,Kuhl, D. P. A.,
Pizzuti, A., Pieretti, M., Sutcliff, J., Richard
s, S., Verkerk, A. J. M. H., Holden, J. J. A., Fen
wick, R. G., Warren, S. T., Oostra, B. A., Nelson,
D. L. and Caskey, C. T. : セル 67 (1991) 1047-10
58) や同様の分子欠陥を含むその他の疾病などの遺伝病
の開始又は完全発症と相関しているときは特に重要であ
る。
【００１８】本発明の他の側面は、それがこれらの基質
の組み込み特性を変えることなく化学的に修飾され得る
修飾ヌクレオチド（又はヌクレオチドアナログ）におけ
るある位置を同定することである。従って、この３’−
位はヌクレオチドアナログに元の３’−ヒドロキシルヌ
クレオチドアナログとは異なる性質を与える置換基を化
学的に付着させるために使用することができる。つい
で、ヌクレオチドアナログの物理的性質を変更して、ポ
リメラーゼによる組み込み特性を変更することなく、疎
水性、親水性、極性、その他の性質を増加させることが
できる。これは、ヌクレオチドアナログの５’−三リン
酸型がウイルスにコードされた逆転写酵素のインビトロ
での強い阻害剤であり得るが、荷電をもった５’−モ
ノ、ジ、又はトリリン酸は生体の非極性細胞質膜を通過
できないため生体内での送達を阻止するためインビボで
は無効であるとき、抗ウイルス化学において特に重要で
ある。３’−位における親油性のエステルは５’−モノ
リン酸ヌクレオチドアナログの疎水性を大きく変え、細
胞内に容易に侵入することを可能とし、従ってヌクレオ
チドアナログに対する特異的５’−キナーゼ反応の必要
性を回避することを可能とする。ウイルス株はそのキナ
ーゼ遺伝子の欠失により薬剤耐性となることができるか
ら、これは臨床的に極めて重要である。より一般的様式
では、ヌクレオチドの３’−位に親油性を有する置換基
の付加は、５’−位のモノ、ジ、又はトリリン酸により
もたらされる親水性又は極性を相殺することを可能とす
る。細胞内にいったんはいると、この３’−親油性ヌク
レオシド５’−モノ、ジ、又はトリリン酸は、必要なと
きは、細胞内キナーゼにより５’−トリリン酸型に変換
され、ＤＮＡ内に組み込まれる。３’−親油性ヌクレオ
チドが修飾された塩基を持つときは、３’−ＩＥＡのた
めに、この修飾されたヌクレオチドはその修飾された塩
基と一緒に細胞のＤＮＡ中に組み込まれ、そして前者の
３’−親油性置換基を遊離型とし、すなわち３’−ＩＥ
ＡのためにＤＮＡに非共有結合的に結合する形になる。
これを、単独では細胞内に容易に導入されない化合物を
細胞内に送達するために使用できることは、当分野にお
ける熟練者には自明でもある。
の組み込み特性を変えることなく化学的に修飾され得る
修飾ヌクレオチド（又はヌクレオチドアナログ）におけ
るある位置を同定することである。従って、この３’−
位はヌクレオチドアナログに元の３’−ヒドロキシルヌ
クレオチドアナログとは異なる性質を与える置換基を化
学的に付着させるために使用することができる。つい
で、ヌクレオチドアナログの物理的性質を変更して、ポ
リメラーゼによる組み込み特性を変更することなく、疎
水性、親水性、極性、その他の性質を増加させることが
できる。これは、ヌクレオチドアナログの５’−三リン
酸型がウイルスにコードされた逆転写酵素のインビトロ
での強い阻害剤であり得るが、荷電をもった５’−モ
ノ、ジ、又はトリリン酸は生体の非極性細胞質膜を通過
できないため生体内での送達を阻止するためインビボで
は無効であるとき、抗ウイルス化学において特に重要で
ある。３’−位における親油性のエステルは５’−モノ
リン酸ヌクレオチドアナログの疎水性を大きく変え、細
胞内に容易に侵入することを可能とし、従ってヌクレオ
チドアナログに対する特異的５’−キナーゼ反応の必要
性を回避することを可能とする。ウイルス株はそのキナ
ーゼ遺伝子の欠失により薬剤耐性となることができるか
ら、これは臨床的に極めて重要である。より一般的様式
では、ヌクレオチドの３’−位に親油性を有する置換基
の付加は、５’−位のモノ、ジ、又はトリリン酸により
もたらされる親水性又は極性を相殺することを可能とす
る。細胞内にいったんはいると、この３’−親油性ヌク
レオシド５’−モノ、ジ、又はトリリン酸は、必要なと
きは、細胞内キナーゼにより５’−トリリン酸型に変換
され、ＤＮＡ内に組み込まれる。３’−親油性ヌクレオ
チドが修飾された塩基を持つときは、３’−ＩＥＡのた
めに、この修飾されたヌクレオチドはその修飾された塩
基と一緒に細胞のＤＮＡ中に組み込まれ、そして前者の
３’−親油性置換基を遊離型とし、すなわち３’−ＩＥ
ＡのためにＤＮＡに非共有結合的に結合する形になる。
これを、単独では細胞内に容易に導入されない化合物を
細胞内に送達するために使用できることは、当分野にお
ける熟練者には自明でもある。
【００１９】以下に、３’−ＩＥＡの制御法と一方上記
のような３’−ＩＥＡの利用法を例示する。ゲルを用い
ない配列決定法で固体支持体（ダイナビードＭ−２８
０、ダイナル(DYNAL) 図３パネルａに示す )に固定した
未知ＤＮＡ鎖のヌクレオチド（２ピコモル）を決定する
ためのＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット）と４種の３’
−標識ヌクレオシド−５’三リン酸（１ｍＭ）の使用
法。ＤＮＡポリメラーゼはこれらの反応条件下で３’−
ＩＥＡを持っていてはならないことは明らかである。そ
うでなければ、３’−標識化ｄＮＴＰｓは誤ったチェイ
ンターミネーターとして作用し、１個のヌクレオチドの
正確かつ特異的な挿入を不可能とする。図４は、Ｔａｑ
ポリメラーゼが図３に描かれていることを実行すること
ができるが、その３’−ＩＥＡを完全に阻害するために
（３０〜４５℃、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｎ2+、５ｍＭ
のクエン酸塩、１ｍＭの各３’−標識ヌクレオチド）、
Ｔａｑポリメラーゼの古典的反応条件（７２℃、ｐＨ
８．３、１〜５ｍＭのＭｇ2+）を変更するための注意が
必要となる。
のような３’−ＩＥＡの利用法を例示する。ゲルを用い
ない配列決定法で固体支持体（ダイナビードＭ−２８
０、ダイナル(DYNAL) 図３パネルａに示す )に固定した
未知ＤＮＡ鎖のヌクレオチド（２ピコモル）を決定する
ためのＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット）と４種の３’
−標識ヌクレオシド−５’三リン酸（１ｍＭ）の使用
法。ＤＮＡポリメラーゼはこれらの反応条件下で３’−
ＩＥＡを持っていてはならないことは明らかである。そ
うでなければ、３’−標識化ｄＮＴＰｓは誤ったチェイ
ンターミネーターとして作用し、１個のヌクレオチドの
正確かつ特異的な挿入を不可能とする。図４は、Ｔａｑ
ポリメラーゼが図３に描かれていることを実行すること
ができるが、その３’−ＩＥＡを完全に阻害するために
（３０〜４５℃、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｎ2+、５ｍＭ
のクエン酸塩、１ｍＭの各３’−標識ヌクレオチド）、
Ｔａｑポリメラーゼの古典的反応条件（７２℃、ｐＨ
８．３、１〜５ｍＭのＭｇ2+）を変更するための注意が
必要となる。
【００２０】図３パネルｂ）は、フォーダー(Fodor,
S.) ：サイエンス 264 (1994) 1400によって記載された
ものなどの固体支持体に固定された極めて多くのＤＮＡ
試料及びイメージ分析システム（ＣＣＤカメラ）により
記録された組み込みスコアに、この配列決定法が如何に
適用されるかを示す。固定化ＤＮＡを保持するチップ
を、適当な緩衝液中に３’−ＩＥＡを持たないＤＮＡポ
リメラーゼと共に一度にただ１種の３’−標識ヌクレオ
チドのみを含む反応混合物中に浸漬し、洗浄緩衝液で濯
ぎ、ＣＣＤカメラにより分析し、３’−標識ヌクレオチ
ドを組み込んだＤＮＡ試料の座標(coordinates) を記録
し、そしてこのプロセスを残りの３種の３’−標識ヌク
レオチドについて順番に繰り返すことを除き、図３ａと
同じ実験条件を用いる。４種の３’−標識ヌクレオチド
が組み込まれると、すべてのＤＮＡ試料はこの標識(ta
g) で標識される。すべての標識を脱保護溶液により除
去し、各ＤＮＡ試料がどの第二の塩基を組み込むことが
できるかを決定するため、このプロセスを繰り返す。
３’−ＩＥＡ活性を示すＤＮＡポリメラーゼは図４に示
すようにＤＮＡ鎖を完全に埋め、この方法を無効とする
ことはここでも明らかである。
S.) ：サイエンス 264 (1994) 1400によって記載された
ものなどの固体支持体に固定された極めて多くのＤＮＡ
試料及びイメージ分析システム（ＣＣＤカメラ）により
記録された組み込みスコアに、この配列決定法が如何に
適用されるかを示す。固定化ＤＮＡを保持するチップ
を、適当な緩衝液中に３’−ＩＥＡを持たないＤＮＡポ
リメラーゼと共に一度にただ１種の３’−標識ヌクレオ
チドのみを含む反応混合物中に浸漬し、洗浄緩衝液で濯
ぎ、ＣＣＤカメラにより分析し、３’−標識ヌクレオチ
ドを組み込んだＤＮＡ試料の座標(coordinates) を記録
し、そしてこのプロセスを残りの３種の３’−標識ヌク
レオチドについて順番に繰り返すことを除き、図３ａと
同じ実験条件を用いる。４種の３’−標識ヌクレオチド
が組み込まれると、すべてのＤＮＡ試料はこの標識(ta
g) で標識される。すべての標識を脱保護溶液により除
去し、各ＤＮＡ試料がどの第二の塩基を組み込むことが
できるかを決定するため、このプロセスを繰り返す。
３’−ＩＥＡ活性を示すＤＮＡポリメラーゼは図４に示
すようにＤＮＡ鎖を完全に埋め、この方法を無効とする
ことはここでも明らかである。
【００２１】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。
【００２２】実施例１ＤＮＡ中へのヌクレオチド組み込みのマーカーとしての
３’−ＩＥＡの使用 。 組み込み反応（例えばＰＣＲ）の成功度は、現在、アガ
ロース又はポリアクリルアミド ゲル電気泳動による反
応生産物の分析によって測られている。簡単ではある
が、この方法は、一時に大量のＰＣＲ産物を分析すると
きは、極めて厄介であり、自動化するのが困難である。
従って、ｄＮＴＰｓの組み込みを可視的にチェックする
ことができれば、あるいは少なくとも自動化組み込み試
験の利用によりゲル電気泳動を回避することができれ
ば、極めて有用となろう。古典的ｄＮＴＰｓ及び３’−
ＩＥＡを示すＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて３’−
標識ｄＮＴＰｓを使用すると、重合反応によりヌクレオ
チドが組み込まれたか否かを効率的に決定することがで
きる。図４、５は、低濃度の３’−標識ｄＮＴＰが、古
典的ＰＣＲ混合物（ｄＮＴＰｓ、プライマー、ＤＮＡ鋳
型及び緩衝液）を用いるＰＣＲに含められる方法を例示
する。
３’−ＩＥＡの使用 。 組み込み反応（例えばＰＣＲ）の成功度は、現在、アガ
ロース又はポリアクリルアミド ゲル電気泳動による反
応生産物の分析によって測られている。簡単ではある
が、この方法は、一時に大量のＰＣＲ産物を分析すると
きは、極めて厄介であり、自動化するのが困難である。
従って、ｄＮＴＰｓの組み込みを可視的にチェックする
ことができれば、あるいは少なくとも自動化組み込み試
験の利用によりゲル電気泳動を回避することができれ
ば、極めて有用となろう。古典的ｄＮＴＰｓ及び３’−
ＩＥＡを示すＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて３’−
標識ｄＮＴＰｓを使用すると、重合反応によりヌクレオ
チドが組み込まれたか否かを効率的に決定することがで
きる。図４、５は、低濃度の３’−標識ｄＮＴＰが、古
典的ＰＣＲ混合物（ｄＮＴＰｓ、プライマー、ＤＮＡ鋳
型及び緩衝液）を用いるＰＣＲに含められる方法を例示
する。
【００２３】３’−標識ｄＮＴＰが正常な３’−ＯＨ−
ｄＮＴＰ部分の代わりにそのワトソン−クリック対鎖(c
ognate) の前に無差別に挿入されるから、そしてこの標
識がその後次のヌクレオチドの付加が起こると除去され
るから、上清中における非結合標識の存在は重合が起こ
ったことの指標となり、上清中の標識の濃度は挿入され
た３’−標識ヌクレオチドの数に直接関係する。図５
は、ＰＣＲが完了したときの二本鎖産物の濃度を測定す
る方法を例示する。３種のｄＮＴＰと３’−標識ｄＮＴ
Ｐの混合物をこのＰＣＲに添加し、添加したＤＮＡポリ
メラーゼの最適活性温度に注意しながら１サイクルだけ
ＰＣＲを実施する。また、二本鎖ＤＮＡ産物の濃度は上
清中の遊離の３’−標識濃度に関係する。次に組み込み
が起こったＰＣＲを選択し、そしてゲル電気泳動により
正確な長さの産物があるか否かだけを分析することがで
きる。
ｄＮＴＰ部分の代わりにそのワトソン−クリック対鎖(c
ognate) の前に無差別に挿入されるから、そしてこの標
識がその後次のヌクレオチドの付加が起こると除去され
るから、上清中における非結合標識の存在は重合が起こ
ったことの指標となり、上清中の標識の濃度は挿入され
た３’−標識ヌクレオチドの数に直接関係する。図５
は、ＰＣＲが完了したときの二本鎖産物の濃度を測定す
る方法を例示する。３種のｄＮＴＰと３’−標識ｄＮＴ
Ｐの混合物をこのＰＣＲに添加し、添加したＤＮＡポリ
メラーゼの最適活性温度に注意しながら１サイクルだけ
ＰＣＲを実施する。また、二本鎖ＤＮＡ産物の濃度は上
清中の遊離の３’−標識濃度に関係する。次に組み込み
が起こったＰＣＲを選択し、そしてゲル電気泳動により
正確な長さの産物があるか否かだけを分析することがで
きる。
【００２４】この方法は、未知のＤＮＡ試料中のＤＮＡ
濃度を測定するために使用することができることも明ら
かである。実際、図５の場合には、放出された標識の量
は鋳型ＤＮＡの量に比例し、濃度が既知の標準品を用い
る適当な計算によって上清中の遊離標識を直接測定する
ことにより該未知試料のＤＮＡ濃度を決定することがで
きることは明らかである。前に述べたように、この標識
はその３’−結合型に比べてその遊離型で同定するのが
容易である。その目的にとって、最上の蛍光団は大きな
ストウクスシフト(Stokes shift)を持つもの、すなわち
その遊離型に対応する極大放出波長がその結合型の極大
放出波長に可能な限り重ならないようなものである。こ
の性質は、３’−ＩＥＡの発現に続き僅か１個の遊離標
識が上清中に存在する場合の蛍光シグナルを得るために
有利に使用することができる。
濃度を測定するために使用することができることも明ら
かである。実際、図５の場合には、放出された標識の量
は鋳型ＤＮＡの量に比例し、濃度が既知の標準品を用い
る適当な計算によって上清中の遊離標識を直接測定する
ことにより該未知試料のＤＮＡ濃度を決定することがで
きることは明らかである。前に述べたように、この標識
はその３’−結合型に比べてその遊離型で同定するのが
容易である。その目的にとって、最上の蛍光団は大きな
ストウクスシフト(Stokes shift)を持つもの、すなわち
その遊離型に対応する極大放出波長がその結合型の極大
放出波長に可能な限り重ならないようなものである。こ
の性質は、３’−ＩＥＡの発現に続き僅か１個の遊離標
識が上清中に存在する場合の蛍光シグナルを得るために
有利に使用することができる。
【００２５】実施例２１本の試験管と１個の反応を用いる所与のＤＮＡ配列中
のトリ−ヌクレオチド反復の数の計算：ＣＧＧ反復及び
脆弱Ｘ症候群の症例 脆弱性Ｘ症候群はヒトの最も頻度の多い遺伝的精神遅滞
である（オーストラらによる総説(Oostra, B. A., Will
ems, P. J. and Verkerk, A. J. M. H. : 脆弱性Ｘ症候
群：ア グロウイング ジーン、１９９３）。この疾病
の分子的基礎は、（ＣＧＧ）n トリプレット反復の迅速
な拡張を含むいわゆるＦＭＲ１座位における「動的変異
(dynamic mutation)」である。ここで数ｎは正常な、キ
ャリアの、又は病理的な表現型（フーら(Fu, Y.-H., Ku
hl, D. P. A., Pizzuti, A., Pieretti, M., Sutcliff,
J., Richards, S., Verkerk, A. J. M. H., Holden,
J.J. A., Fenwick, R. G., Warren, S. T., Oostra, B.
A., Nelson, D. L. and Caskey, C. T. :セル 67 (19
91) 1047-1058)に密接に相関している。正常な表現型は
６〜２３ユニットにわたる多形性（ＣＧＧ）反復を有す
るが、キャリアの女性は４３と２００ユニットの間の反
復を有する。罹患した個体は２００ユニット以上のＣＧ
Ｇ反復を有する。従って、ＣＧＧ反復の数を正確に計測
することは、その診断並びに予想のレベルで臨床的に重
要であり、これは古典的細胞遺伝学的方法やＰＣＲおよ
びその後のゲル電気泳動を用いるＤＮＡ分析により大雑
把ではあるが評価することができる。３’−ＩＥＡを使
用すれば、ゲル電気泳動の段階を有利に置換することが
でき、極めて簡単な測定により正確な反復数を得ること
ができる。このトリプレット反復領域の両側のプライマ
ー（図６）を使用し、ビオチン−ストレプトアビジン系
やマグネティックビーズ（ダイナル(Dynal) 、ノールウ
エー）などの標準的方法を用い、個体支持体上に固定さ
れ得るＰＣＲ産物を生産する。二本鎖を製造者推薦のよ
うにＮａＯＨで溶解して一本鎖ＤＮＡ配列の鋳型を調製
し、そしてプライマーを（ＣＧＧ）n 領域の直ぐ上流に
配置する。次に、プライマーの結合したＤＮＡを３’−
ＩＥＡを示すＤＮＡポリメラーゼ、２００μＭのｄＧＴ
Ｐ、５０μＭのｄＡＴＰ、５０μＭのｄｄＴＴＰ、及び
４００μＭの３’−標識ｄＣＴＰを含む混合物と共に、
重合及び３’−ＩＥＡ活性の両者に最適のｐＨ、温度及
び時間の条件下でインキュベートする。２’３’−ジデ
オキシヌクレオチドはＣＧＧ領域の外側でのみ組み込ま
れ、そしてそれがその同種の塩基と遭遇するとＤＮＡチ
ェインターミネーションによりこの反応を停止する。Ｃ
ＧＧ領域の内側ではｄＧＴＰが同種のｄＣ塩基の前に組
み込まれ、そして３’−標識ｄＣＴＰはＣＧＧ領域内で
も組み込まれ、そしてその３’−標識は３’−ＩＥＡの
発現により除去される。伸長反応の終了の後、この上清
を直接又は上清を三リン酸塩化合物を除去し得るが遊離
の標識を除去し得ないＨＰＬＣや迅速イオン交換クロマ
トグラフィーなどの組み込まれていない３’−標識ｄＣ
ＴＰから遊離の標識を分離することを目的とする簡単な
精製操作の後に、遊離の標識の存在について分析する。
同じ実験をそのＣＧＧ領域がＤＮＡ配列決定により完全
に明らかにされた対照のＤＮＡについて行い、そしてこ
の２試料の間の遊離標識濃度の比較により、ＦＭＲ１領
域がＸ染色体上に位置するので増幅された対立遺伝子の
数を考慮に入れて、ＣＧＧ反復数の値を正確に決定する
ことができる。
のトリ−ヌクレオチド反復の数の計算：ＣＧＧ反復及び
脆弱Ｘ症候群の症例 脆弱性Ｘ症候群はヒトの最も頻度の多い遺伝的精神遅滞
である（オーストラらによる総説(Oostra, B. A., Will
ems, P. J. and Verkerk, A. J. M. H. : 脆弱性Ｘ症候
群：ア グロウイング ジーン、１９９３）。この疾病
の分子的基礎は、（ＣＧＧ）n トリプレット反復の迅速
な拡張を含むいわゆるＦＭＲ１座位における「動的変異
(dynamic mutation)」である。ここで数ｎは正常な、キ
ャリアの、又は病理的な表現型（フーら(Fu, Y.-H., Ku
hl, D. P. A., Pizzuti, A., Pieretti, M., Sutcliff,
J., Richards, S., Verkerk, A. J. M. H., Holden,
J.J. A., Fenwick, R. G., Warren, S. T., Oostra, B.
A., Nelson, D. L. and Caskey, C. T. :セル 67 (19
91) 1047-1058)に密接に相関している。正常な表現型は
６〜２３ユニットにわたる多形性（ＣＧＧ）反復を有す
るが、キャリアの女性は４３と２００ユニットの間の反
復を有する。罹患した個体は２００ユニット以上のＣＧ
Ｇ反復を有する。従って、ＣＧＧ反復の数を正確に計測
することは、その診断並びに予想のレベルで臨床的に重
要であり、これは古典的細胞遺伝学的方法やＰＣＲおよ
びその後のゲル電気泳動を用いるＤＮＡ分析により大雑
把ではあるが評価することができる。３’−ＩＥＡを使
用すれば、ゲル電気泳動の段階を有利に置換することが
でき、極めて簡単な測定により正確な反復数を得ること
ができる。このトリプレット反復領域の両側のプライマ
ー（図６）を使用し、ビオチン−ストレプトアビジン系
やマグネティックビーズ（ダイナル(Dynal) 、ノールウ
エー）などの標準的方法を用い、個体支持体上に固定さ
れ得るＰＣＲ産物を生産する。二本鎖を製造者推薦のよ
うにＮａＯＨで溶解して一本鎖ＤＮＡ配列の鋳型を調製
し、そしてプライマーを（ＣＧＧ）n 領域の直ぐ上流に
配置する。次に、プライマーの結合したＤＮＡを３’−
ＩＥＡを示すＤＮＡポリメラーゼ、２００μＭのｄＧＴ
Ｐ、５０μＭのｄＡＴＰ、５０μＭのｄｄＴＴＰ、及び
４００μＭの３’−標識ｄＣＴＰを含む混合物と共に、
重合及び３’−ＩＥＡ活性の両者に最適のｐＨ、温度及
び時間の条件下でインキュベートする。２’３’−ジデ
オキシヌクレオチドはＣＧＧ領域の外側でのみ組み込ま
れ、そしてそれがその同種の塩基と遭遇するとＤＮＡチ
ェインターミネーションによりこの反応を停止する。Ｃ
ＧＧ領域の内側ではｄＧＴＰが同種のｄＣ塩基の前に組
み込まれ、そして３’−標識ｄＣＴＰはＣＧＧ領域内で
も組み込まれ、そしてその３’−標識は３’−ＩＥＡの
発現により除去される。伸長反応の終了の後、この上清
を直接又は上清を三リン酸塩化合物を除去し得るが遊離
の標識を除去し得ないＨＰＬＣや迅速イオン交換クロマ
トグラフィーなどの組み込まれていない３’−標識ｄＣ
ＴＰから遊離の標識を分離することを目的とする簡単な
精製操作の後に、遊離の標識の存在について分析する。
同じ実験をそのＣＧＧ領域がＤＮＡ配列決定により完全
に明らかにされた対照のＤＮＡについて行い、そしてこ
の２試料の間の遊離標識濃度の比較により、ＦＭＲ１領
域がＸ染色体上に位置するので増幅された対立遺伝子の
数を考慮に入れて、ＣＧＧ反復数の値を正確に決定する
ことができる。
【００２６】この技術は、モノ、ジ、トリ−ヌクレオチ
ド反復を持つ他のいかなるＤＮＡ配列や、例えば、ｎが
生物学的意味を有する反復テロマー配列（ＴＴＡＧＧ
Ｇ）nなどの４種の古典的塩基Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣのうち
の３種のみを含むもっと長い配列に適用できることが明
らかである。ｄｄＮＴＰ、ｄＮＴＰ、及び３’−標識ｄ
ＮＴＰの混合物の組成を、短い配列の反復数ｎを決定す
る研究の場合に便利なように適合させることは容易であ
る。
ド反復を持つ他のいかなるＤＮＡ配列や、例えば、ｎが
生物学的意味を有する反復テロマー配列（ＴＴＡＧＧ
Ｇ）nなどの４種の古典的塩基Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣのうち
の３種のみを含むもっと長い配列に適用できることが明
らかである。ｄｄＮＴＰ、ｄＮＴＰ、及び３’−標識ｄ
ＮＴＰの混合物の組成を、短い配列の反復数ｎを決定す
る研究の場合に便利なように適合させることは容易であ
る。
【００２７】実施例３ＤＮＡポリメラーゼの３’−ＩＥＡにより媒介される標
識置換法を用いる未知ＤＮＡ試料のヌクレオチド配列の
決定 図６と同じ実験条件下でプライマー、鋳型を用いるが、
実験の目的は鋳型の未知のＤＮＡヌクレオチド配列を決
定することにある。プライマーを添加したＤＮＡを一度
にただ１種の３’−標識ｄＮＴＰと逐次インキュベート
し、そして組み込みを、インサイチュ（例えば、標識が
蛍光性のものであれば、蛍光検出により）及び上清の両
方でチェックする。実際、ＤＮＡポリメラーゼが３’−
ＩＥＡを示すときは、３’−末端に付加された標識は上
清中に放出される、一方ＤＮＡは新たにやってくる３’
−標識を持つヌクレオチドにより終結される、従って、
蛍光はＤＮＡ鎖の３’−末端においてそして遊離の標識
として上清中で測定されるに違いない。基本的には、一
度に１種の３’−標識ｄＮＴＰをプライマー化されたＤ
ＮＡとインキュベートする。図７では、その順序は次の
とおりである：すべて３’−標識を持つＡ、Ｔ、Ｃ、
Ｇ。すなわち、３’−標識−ｄＡＴＰをまず付加させ、
そして蛍光をインサイチュ及び上清中でチェックする。
Ａはプライマーに直ぐ隣接する鋳型中に見出されるから
両者共ネガティブである。ついで、３’−標識−ｄＴＴ
Ｐを用いるとインサイチュのみで蛍光検出により組み込
まれたことが分かる。インサイチュのみで陽性の蛍光シ
グナルが観察されることは３’−ＩＥＡが発現していな
いことを示すものであり、従ってただ１個のＴが組み込
まれたことを示す。いずれも（インサイチュ及び上清
中）陽性のシグナルが観察された後は、再びＡ、Ｔ、Ｃ
及びＧ−３’−標識ヌクレオチドの順に逐次使用し、こ
うして３’−標識−ｄＡＴＰをプローブとする混合物で
は、この実験では次の塩基がＴであるから陽性となる。
蛍光はインサイチュと上清中の両方で検出されるとき、
３’−ＩＥＡの発現を示すことになる。この場合、何個
のＡが列に挿入されたかを知ることが重要である。これ
は内部蛍光標準、すなわちこの場合ただ１種の３’−Ｉ
ＥＡにより鋳型当たり何個の標識が放出されたかを正確
に評価するために遊離標識の既知の量を上清に添加する
ことにより容易に行うことができる。
識置換法を用いる未知ＤＮＡ試料のヌクレオチド配列の
決定 図６と同じ実験条件下でプライマー、鋳型を用いるが、
実験の目的は鋳型の未知のＤＮＡヌクレオチド配列を決
定することにある。プライマーを添加したＤＮＡを一度
にただ１種の３’−標識ｄＮＴＰと逐次インキュベート
し、そして組み込みを、インサイチュ（例えば、標識が
蛍光性のものであれば、蛍光検出により）及び上清の両
方でチェックする。実際、ＤＮＡポリメラーゼが３’−
ＩＥＡを示すときは、３’−末端に付加された標識は上
清中に放出される、一方ＤＮＡは新たにやってくる３’
−標識を持つヌクレオチドにより終結される、従って、
蛍光はＤＮＡ鎖の３’−末端においてそして遊離の標識
として上清中で測定されるに違いない。基本的には、一
度に１種の３’−標識ｄＮＴＰをプライマー化されたＤ
ＮＡとインキュベートする。図７では、その順序は次の
とおりである：すべて３’−標識を持つＡ、Ｔ、Ｃ、
Ｇ。すなわち、３’−標識−ｄＡＴＰをまず付加させ、
そして蛍光をインサイチュ及び上清中でチェックする。
Ａはプライマーに直ぐ隣接する鋳型中に見出されるから
両者共ネガティブである。ついで、３’−標識−ｄＴＴ
Ｐを用いるとインサイチュのみで蛍光検出により組み込
まれたことが分かる。インサイチュのみで陽性の蛍光シ
グナルが観察されることは３’−ＩＥＡが発現していな
いことを示すものであり、従ってただ１個のＴが組み込
まれたことを示す。いずれも（インサイチュ及び上清
中）陽性のシグナルが観察された後は、再びＡ、Ｔ、Ｃ
及びＧ−３’−標識ヌクレオチドの順に逐次使用し、こ
うして３’−標識−ｄＡＴＰをプローブとする混合物で
は、この実験では次の塩基がＴであるから陽性となる。
蛍光はインサイチュと上清中の両方で検出されるとき、
３’−ＩＥＡの発現を示すことになる。この場合、何個
のＡが列に挿入されたかを知ることが重要である。これ
は内部蛍光標準、すなわちこの場合ただ１種の３’−Ｉ
ＥＡにより鋳型当たり何個の標識が放出されたかを正確
に評価するために遊離標識の既知の量を上清に添加する
ことにより容易に行うことができる。
【００２８】このことを次に組み込まれた塩基について
例示する。ここで、４種の３’−標識ｄＣＴＰを列に付
加すると鋳型当たり４種の遊離標識が放出される。上清
に内部標準を添加し、ついで蛍光法で定量することによ
り、これらを測定する。このプロセスは手で容易になさ
れるが、コンピューターに連結した蛍光検出系は、リア
ルタイムで配列データを編集し並びにＤＮＡの３’−末
端の標識又は上清中の遊離の標識の存在又は不存在によ
り、どの塩基が付加されたかを演繹するロボット化され
たワークステーションを動かすことができることは明ら
かである。これらの順序立てられかつ論理的ステップ
は、完全なＤＮＡ配列が決定されるまで鋳型の各塩基に
対して繰り返される。
例示する。ここで、４種の３’−標識ｄＣＴＰを列に付
加すると鋳型当たり４種の遊離標識が放出される。上清
に内部標準を添加し、ついで蛍光法で定量することによ
り、これらを測定する。このプロセスは手で容易になさ
れるが、コンピューターに連結した蛍光検出系は、リア
ルタイムで配列データを編集し並びにＤＮＡの３’−末
端の標識又は上清中の遊離の標識の存在又は不存在によ
り、どの塩基が付加されたかを演繹するロボット化され
たワークステーションを動かすことができることは明ら
かである。これらの順序立てられかつ論理的ステップ
は、完全なＤＮＡ配列が決定されるまで鋳型の各塩基に
対して繰り返される。
【００２９】
【発明の効果】本発明を用いることにより、未知ＤＮＡ
の配列及び／又はその濃度を決定することができる。本
発明の方法はゲルを用いないＤＮＡの配列決定法の改良
法を提供するものであり、ＤＮＡの配列決定の自動化を
可能とするものである。
の配列及び／又はその濃度を決定することができる。本
発明の方法はゲルを用いないＤＮＡの配列決定法の改良
法を提供するものであり、ＤＮＡの配列決定の自動化を
可能とするものである。
【図１】図１は、本発明に使用される幾つかの２’−デ
オキシ−３’−修飾ヌクレオシド５’−三リン酸基質の
構造を示す図である。これらの化合物は、キャナードと
サルファティ(Canard and Sarfati)、ジーン 148 (199
4) 1-16 により合成されたものであり、幾つかのＤＮ
Ａポリメラーゼの基質として適当である。
オキシ−３’−修飾ヌクレオシド５’−三リン酸基質の
構造を示す図である。これらの化合物は、キャナードと
サルファティ(Canard and Sarfati)、ジーン 148 (199
4) 1-16 により合成されたものであり、幾つかのＤＮ
Ａポリメラーゼの基質として適当である。
【図２】図２は、３’−ａｎｔ−ｄＮＴＰｓとＤＮＡポ
リメラーゼを用いる末端標識プライマー伸長及びゲル測
定の結果を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動の図で
ある。３’−ａｎｔ−ｄＮＴＰｓは、キャナードとサル
ファティ(Canard and Sarfati)、ジーン 148 (1994) 1-
16 に記載されたものである。図２ａは、３’−エステ
ル化−ｄＮＴＰｓ（４００μＭ）をプライマー／鋳型及
びシ−クエナーゼと０、１、２、３、４、５分間（それ
ぞれレーン０、１、２、３、４、５）インキュベートし
た結果である。図２ｂは、同じプライマー／鋳型及び
３’−エステル化−ヌクレオチド（２ｍＭ）をＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼと共に用い、０、５、１０、１５分間
（それぞれレーン０、６、７、８）インキュベートし
た。Ｐはプライマー（２１−マー）であり、試料は１５
％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、オート
ラジオグラフィーで可視化した。
リメラーゼを用いる末端標識プライマー伸長及びゲル測
定の結果を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動の図で
ある。３’−ａｎｔ−ｄＮＴＰｓは、キャナードとサル
ファティ(Canard and Sarfati)、ジーン 148 (1994) 1-
16 に記載されたものである。図２ａは、３’−エステ
ル化−ｄＮＴＰｓ（４００μＭ）をプライマー／鋳型及
びシ−クエナーゼと０、１、２、３、４、５分間（それ
ぞれレーン０、１、２、３、４、５）インキュベートし
た結果である。図２ｂは、同じプライマー／鋳型及び
３’−エステル化−ヌクレオチド（２ｍＭ）をＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼと共に用い、０、５、１０、１５分間
（それぞれレーン０、６、７、８）インキュベートし
た。Ｐはプライマー（２１−マー）であり、試料は１５
％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、オート
ラジオグラフィーで可視化した。
【図３】図３は、ゲルを用いないＤＮＡの配列決定法を
示す図である。図３パネルａは、固体支持体（ダイナビ
ーズＭ−２８０、ダイナル）に固定した未知のＤＮＡ鎖
のヌクレオチド（２ピコモル）のゲルを用いない配列決
定法において、ＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット）と４
種の３’−標識ヌクレオシド−５’−三リン酸（１ｍ
Ｍ）を如何に使用するかを示す。図３パネルｂは、固体
支持体に固定した極めて多数のＤＮＡ試料（フォ−ダー
(S. Fodor)サイエンス 264 (1994) 1400）及びイメージ
分析システム（ＣＣＤカメラ）により記録される組み込
みスコアへのこの配列決定法の適用法を示す。
示す図である。図３パネルａは、固体支持体（ダイナビ
ーズＭ−２８０、ダイナル）に固定した未知のＤＮＡ鎖
のヌクレオチド（２ピコモル）のゲルを用いない配列決
定法において、ＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット）と４
種の３’−標識ヌクレオシド−５’−三リン酸（１ｍ
Ｍ）を如何に使用するかを示す。図３パネルｂは、固体
支持体に固定した極めて多数のＤＮＡ試料（フォ−ダー
(S. Fodor)サイエンス 264 (1994) 1400）及びイメージ
分析システム（ＣＣＤカメラ）により記録される組み込
みスコアへのこの配列決定法の適用法を示す。
【図４】図４は、図３に記載したことをＴａｑポリメラ
ーゼが行うことができることを示す図である。。ただ
し、Ｔａｑポリメラーゼの３’−ＩＥＡ（３０〜４０
℃、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｎ2+、５ｍＭのクエン酸、
１ｍＭの各３’−標識ヌクレオチド）を十分に阻害する
ために、古典的反応条件下（７２℃、ｐＨ８．３、１〜
５ｍＭのＭｇ2+）を変更する必要がある。
ーゼが行うことができることを示す図である。。ただ
し、Ｔａｑポリメラーゼの３’−ＩＥＡ（３０〜４０
℃、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｎ2+、５ｍＭのクエン酸、
１ｍＭの各３’−標識ヌクレオチド）を十分に阻害する
ために、古典的反応条件下（７２℃、ｐＨ８．３、１〜
５ｍＭのＭｇ2+）を変更する必要がある。
【図５】図５は、ＰＣＲが終了したとき、二本鎖産物の
濃度を測定する方法を例示した図である。３種のｄＮＴ
Ｐｓと３’−標識ｄＮＴＰの１種の混合物をこのＰＣＲ
に添加し、このＤＮＡポリメラーゼの最適活性の温度で
１サイクルだけＰＣＲを行う。
濃度を測定する方法を例示した図である。３種のｄＮＴ
Ｐｓと３’−標識ｄＮＴＰの１種の混合物をこのＰＣＲ
に添加し、このＤＮＡポリメラーゼの最適活性の温度で
１サイクルだけＰＣＲを行う。
【図６】図６は、トリプレット反復数ｎの決定法を示す
図である。。トリプレット反復領域の両側に隣接するプ
ライマーを用い、ビオチン−ストレプトアビジン系やマ
グネティックビーズ（例えばダイナルから）などの標準
的方法により固体支持体に固定化され得るＰＣＲ産物を
作成する。遊離の標識を測定し標準品と比較してｎを決
定する。
図である。。トリプレット反復領域の両側に隣接するプ
ライマーを用い、ビオチン−ストレプトアビジン系やマ
グネティックビーズ（例えばダイナルから）などの標準
的方法により固体支持体に固定化され得るＰＣＲ産物を
作成する。遊離の標識を測定し標準品と比較してｎを決
定する。
【図７】図７は、ＤＮＡポリメラーゼの３’−ＩＥＡに
より媒介される標識置換系を用いる未知ＤＮＡ試料のヌ
クレオチド配列の決定を示す図である。プライマーを付
加されたＤＮＡを一度に１種だけの３’−標識ｄＮＴＰ
と逐次インキュベートし、そして組み込みをインサイチ
ュ（標識が蛍光性であるときは蛍光検出法により）及び
上清中の両方でチェックする（実施例３を参照）。
より媒介される標識置換系を用いる未知ＤＮＡ試料のヌ
クレオチド配列の決定を示す図である。プライマーを付
加されたＤＮＡを一度に１種だけの３’−標識ｄＮＴＰ
と逐次インキュベートし、そして組み込みをインサイチ
ュ（標識が蛍光性であるときは蛍光検出法により）及び
上清中の両方でチェックする（実施例３を参照）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 9/12 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Claims (9)
- 【請求項１】 ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、脱保護
剤、及び必要に応じ鋳型と脱活性化剤の存在下に、式
（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｘは二官能性連結基であり、Ｙは活性基を付与
する残基であり、Ｂはプリン、ピリミジン、デアザプリ
ン、デアザピリミジン又はそれらのアナログである。） で表されるオリゴ−もしくはポリ−リボヌクレオチド、
又はオリゴ−もしくはポリ−デゾキシリボヌクレオチド
からＹ基を除去する方法。 - 【請求項２】 Ｘが酸素、硫黄又は−ＮＨ−であり、Ｙ
が−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＨ2 −Ｒ、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−Ｒ、
又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ基であり、ここでＲはハプテ
ン、発色団又は分岐し又は分岐していない１原子以上か
らなるアルキル基である、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ポリメラーゼとして顕著な３’−５’−
エキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼを用
い、鋳型が式（Ｉ）のオリゴヌクレオチド化合物とハイ
ブリッドを形成することができるデゾキシヌクレオチド
配列である、請求項１又は請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 遺伝子工学的に又は化学的に合成された
３’−５’−エキソ−マイナスＴ７−ポリメラーゼ、Ｔ
ａｑポリメラーゼ及びＨＩＶ逆転写酵素が用いられる、
請求項１〜請求項３いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 鋳型及び脱活性化剤が存在し、そしてそ
の脱活性化剤がＸ−Ｙ結合の開裂を顕著に阻害する物理
的、化学的又は酵素的手段である、請求項１記載の方
法。 - 【請求項６】 ３’−固有の校正活性を有するＤＮＡポ
リメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼが使用されるもので
ある、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 １個以上のデゾキシヌクレオシド三リン
酸（ｄＮＴＰｓ）又はその誘導体をＤＮＡに組み込み、
そして必要があれば該ＤＮＡの濃度又は配列を決定する
ことを特徴とし、適当なプライマー、ＤＮＡ鋳型及び適
当な緩衝液を３’−固有の校正活性を有するＤＮＡポリ
メラーゼに加えて使用する、請求項１〜請求項６いずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項８】 ゲルを用いないヌクレオチド配列決定法
において使用される、請求項１〜請求項６いずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項９】 目的のＤＮＡ配列中のヌクレオチド反復
の数の計測において使用される、請求項１〜請求項６い
ずれか１項に記載の方法。
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