ES2282693T3

ES2282693T3 - Pirazoloquinolinas con actividad inmunomodulante.

Info

Publication number: ES2282693T3
Application number: ES03773026T
Authority: ES
Inventors: Ian Richard Matthews; Thomas Stephen Coulter; Chiara Ghiron; Chris James Brennan; Muhammed Kamal Uddin; Lars Olof Goran Pettersson; Dorthe Da Graca Thrige; Philip Huxley
Original assignee: Active Biotech AB
Current assignee: Active Biotech AB
Priority date: 2002-11-22
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2007-10-16
Anticipated expiration: 2023-11-21
Also published as: US20050203118A9; EP1813616A3; NO20053018D0; NZ540081A; EP1813616B1; WO2004048378A1; AU2003279687A1; EP1562944A1; DE60311861D1; NO20053018L; US7291612B2; US7081456B2; US20060217411A1; ATE353898T1; HK1086562A1; RU2005119639A; CN100347173C; EP1813616A2; RU2328496C2; US20040116461A1

Abstract

Un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo farmacéutica- o veterinariamente aceptable: (Ver fórmula) en la que R1 y R3 independientemente representan H; F; Cl; Br; -NO2; -CN; alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido por F o Cl; o alcoxi C1-C6 opcionalmente sustituido por F; R2 representa H, o alquilo C1-C8, cicloalquilo C3-C7 o fenilo, opcionalmente sustituido con uno o más de alquilo C1-C6, trifluorometilo, alcoxi C1-C6, trifluorometoxi, alquiltio C1-C6, fenilo, bencilo, fenoxi, cicloalquilo C3-C8, hidroxi, mercapto, amino, fluoro, cloro, bromo, ciano, nitro, oxo, -COOH, -SO2OH, -CONH2, -SO2NH2, -COR A , -COOR A , -SO2OR A , -NHCOR A -, -NHSO2R A , -CONHR A -, SO2NHR A , -NHR A , -NR A R B , -CONR A R B o -SO2NR A R B en el que R A y R B son independientemente un grupo alquilo C1-C6, y en el caso en el que ¿sustituido¿ significa sustituido por cicloalquilo C3-C8, fenilo, bencilo o fenoxi, el anillo del mismo puede estar él mismo opcionalmente sustituido con cualquier de los anteriores,excepto cicloalquilo C3-C8, fenilo, bencilo o fenoxi; Y representa -O-, -S-, N-óxido, o -N(R5)- en el que R5 representa H o alquilo C1-C6; X representa un enlace o un radical alquileno C1-C6 divalente; R4 representa -C(=O)NR6R7, en el que R6 representa un radical de fórmula -(Alk)b-Q en el que b es 1 y Alk es una cadena lineal o ramificada divalente de alquileno C1-C12, alquenileno C2-C12 o radical alquinileno C2-C12, opcionalmente sustituido con uno o más de alquil C1-C6, trifluorometil, alcoxi (C1-C6), trifluorometoxi, alquiltio (C1-C6), fenilo, bencilo, fenoxi, cicloalquilo (C3-C8), hidroxi, mercapto, amino, fluoro, cloro, bromo, ciano, nitro, oxo, -COOH, -SO2OH, -CONH2, -SO2NH2, -COB A , -COOR A , -SO20R A , -NHCOR A -, -NHSO2R A , -CONHR A -, SO2NHR A , -NHR A , -NR A R B , -CONR A R B o -SO2NR A R B en el que R A y R B son independientemente un grupo alquilo (C1-C6), y en el caso en el que ¿sustituido¿ significa sustituido por cicloalquilo (C3-C8), fenilo, bencilo o fenoxi, el anillodel mismo puede estar él mismo opcionalmente sustituido con cualquier de los anteriores, excepto cicloalquilo (C3-C8), fenilo, bencilo o fenoxi; cadena lineal divalente o ramificada de alquileno C1-C12, alquenileno C2-C12 o radical alquinileno C2-C12 que puede estar interrumpida por uno o más radicales -O-, -S- o -N(R8)- no adyacentes en el que R8 representa H o alquilo C1-C4, alquenilo C3-C4, alquinilo C3-C4, o cicloalquilo C3-C6, y Q representa H; -CF3; -OH; -SH; -NR8R8 en el que cada R8 puede ser el mismo o diferente; un grupo éster; o un fenilo, cicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7 o anillo heterocíclico que tiene anillos desde 5 hasta 8 átomos, opcionalmente sustituidos con uno o más de alquilo C1-C6, trifluorometilo, alcoxi C1-C6, trifluorometoxi, alquiltio C1-C6, fenilo, bencilo, fenoxi, cicloalquilo C3-C8, hidroxi, mercapto, amino, fluoro, cloro, bromo, ciano, nitro, oxo, -COOH, -SO2OH, -CONH2, -SO2NH2, -COB A , -COOR A , -SO2OR A , -NHCOR A -, -NHSO2R A , -CONHR A -, SO2NHR A ,-NHR A , -NR A R B , -CONR A R B o -SO2NR A R B en el que R A y R B son independientemente un grupo alquilo (C1-C6), y en el caso en el que ¿sustituido¿ significa sustituido por cicloalquilo (C3-C8), fenilo, bencilo o fenoxi, el anillo del mismo puede estar él mismo opcionalmente sustituido con cualquier de los anteriores, excepto cicloalquilo (C3-C8), fenilo, bencilo o fenoxi; y R7 representa H o alquilo C1-C6; o cuando son tomados juntos con el átomo o átomos a los que se unen R6 y R7 forman un anillo heterocíclico que tiene anillos desde 5 hasta 8 átomos, anillos que pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más de alquilo C1-C6, trifluorometilo, alcoxi C1-C6, trifluorometoxi, alquiltio C1-C6, fenilo, bencilo, fenoxi, cicloalquilo C3-C8, hidroxi, mercapto, amino, fluoro, cloro, bromo, ciano, nitro, oxo, -COOH, -SO2OH, -CONH2, -SO2NH2, -COR A , -COOR A , -SO2OR A , -NHCOR A -, -NHSO2R A , -CONHR A -, SO2NHR A , -NHR A , -NR A R B , -CONR A R B o -SO2NR A R B en el que R A y R B son independientemente un grupo alquilo (C1-C6), y en el caso en el que ¿sustituido¿ significa sustituido por cicloalquilo (C3-C8), fenilo, bencilo o fenoxi, el anillo del mismo puede él mismo estar opcionalmente sustituido con cualquier de los anteriores, excepto cicloalquilo (C3-C8), fenilo, bencilo o fenoxi.

Description

Pirazoloquinolinas con actividad inmunomodulante.

El presente invento se refiere a nuevos compuestos heterocíclicos, a métodos para su preparación, a composiciones que los contienen, y a métodos y usos para tratamiento clínico de estados médicos que pueden beneficiarse de la inmunomodulación, incluyendo artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes, asma, transplante, lupus eritematoso sistémico y psoriasis. Más particularmente el presente invento se refiere a nuevos compuestos heterocíclicos, que son antagonistas de CD80 capaces de inhibir las interacciones entre CD80 y CD28.

Antecedentes del invento

El sistema inmune posee la capacidad de controlar la homeostasis entre la activación e inactivación de linfocitos a través de diversos mecanismos reguladores durante y después de una respuesta inmune. Entre estos están los mecanismos que inhiben específicamente y/o apagan una respuesta inmune. Así, cuando un antígeno es presentado por moléculas MHC al receptor de células T, las células T se activan apropiadamente sólo en presencia de señales coestimuladoras adicionales. En ausencia de señales accesorias no hay activación linfocitaria y bien un estado de inactivación funcional llamado anergia o tolerancia es inducida, o bien la célula T es específicamente delecionada mediante apoptosis. Una de tales señales coestimuladoras implica la interacción de CD80 en células presentadoras de antígeno especializadas con CD28 en células T, que ha sido demostrada que es esencial para la completa activación de las células T. (Lenschow y otros, (1996) Annu. Rev. Immunol., 14, 233-258)

Una publicación por Erbe y otros, en J. Biol. Chem. Vol. 277, N° 9, pags. 7363-7368 (2002), describe tres ligandos de moléculas pequeñas que se unen a CD80, e inhiben la unión de CD80 a CD28 y CTLA4. Dos de los ligandos descritos son pirazolonas fusionadas de estructuras A y B:

1

Descripción del invento

Según el presente invento se proporcionan un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéutica- o veterinariamente aceptable del mismo:

2

en la que

R_{1} y R_{3} representan independientemente H; F; Cl; Br; -NO_{2}; -CN; alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido por F o Cl; o un alcoxi C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido por F;

R_{2} representa H, u opcionalmente alquilo C_{1}-C_{6} sustituido, cicloalquilo C_{3}-C_{7} u opcionalmente un fenilo opcionalmente sustituido;

Y representa -O-, -S-, N-óxido, o -N (R_{5})- en el que R_{5} representa H o alquilo C_{1}-C_{6};

X representa un enlace o un radical alquileno C_{1}-C_{6} divalente;

R_{4} representa -C(=O) NR_{6}R_{7}, en el que

R_{6} representa un radical de fórmula -(Alk)_{b}-Q en el que b es 1, y Alk es opcionalmente es un alquileno C_{1}-C_{12}, un alquilenileno C_{2}-C_{12}, o radical alquileno C_{1}-C_{12} ramificado o de cadena lineal sustituido que puede ser interrumpido por uno o más radicales no adyacentes -O-, S- S- o -N(R_{8})- en los que R_{8} representa H o alquilo C_{1}-C_{4}, alquenilo C_{3}-C_{4}, alquinilo C_{3}-C_{4}, o cicloalquilo C_{3}-C_{6}, y

Q representa H; -CF_{3}; -OH; -SH; -NR_{8}R_{8} en el que cada R_{8} puede ser el mismo o diferente; un grupo éster; o un fenilo opcionalmente sustituido, un cicloalquilo C_{3}-C_{7}, cicloalquenilo C_{5}-C_{7} o un anillo heterocíclico que tiene anillos de desde 5 hasta 8 átomos; y

R_{7} representa H o alquilo C_{1}-C_{6}; o cuando son tomados juntos con el átomo o átomos a los que se unen R_{6} y R_{7} forman un anillo heterocíclico sustituido con anillos de 5 a 8 átomos.

Compuestos de fórmula general (I) son antagonistas de CD80. Inhiben la interacción entre CD80 y CD28 y así la activación de las células T, modulando de ese modo la respuesta inmune.

Por consiguiente el invento también incluye

(i) un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo farmacéutica- o veterinariamente aceptable para su uso en el tratamiento de estados que se benefician de la inmunomodulación.

(ii) el uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo farmacéutica o veterinariamente aceptable en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de estados que se benefician de la inmunomodulación.

(iii) un método para la inmunomodulación en humanos y primates no humanos, que comprenden la administración a un sujeto con necesidad de tal tratamiento en una dosis inmunomoduladora eficaz de un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

(iv) una composición farmacéutica o veterinaria que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo farmacéutica o veterinariamente aceptable junto con un excipiente o vehículo farmacéutica- o veterinariamente aceptable

Estados que se benefician de la inmunomodulación incluyen:

Insuficiencia renal

Angitis alérgica y granulomatosis

Amilodiosis

Espondilitis anquilosante

Asma

Enfermedad de Addison autoinmune

Alopecia autoinmune

Hepatitis activa crónica autoinmune

Anemia hemolítica autoimmune

Neutropenia autoinmune

Púrpura trobocitopénica autoinmune

Vasculitis autoinmune

Enfermedad de Behget

Degeneración cerebelosa

Hepatitis activa crónica

Poliradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica

Dermatitis herpetiformis

Diabetes

Síndrome miasténico Eaton-Lambert

Encefalomielitis

Epidermolisis bullosa

Eritema nodoso

Enteropatía sensible al gluten

Síndrome de Goodpasture

Enfermedad de transplante versus injerto

Síndrome de Guillain-Barre

Tiroiditis de Hashimoto

Hipertiroidismo

Hemacromatosis idiopática

Glomerulonefritis membranosa idiopática

Enfermedad renal de cambio mínimo

Enfermedad de tejido conectivo mixto

Neuropatía motora multifocal

Esclerosis múltiple

Miastenia gravis

Síndrome opsoclonus-mioclonus

Penfigoide

Pénfigo

Anemia perniciosa

Poliarteritis nodosa

Polimiocitis/dermatomiositis

Artritis post infección

Esclerosis biliar primaria

Psoriasis

Artritis reactiva

Enfermedad de Reiter

Retinopatía

Artritis reumatoide

Colangitis esclerótica

Síndrome de Sjdgren

Síndrome de Staff-man

Tiroiditis subaguda

Lupus eritematoso sistémico

Esclerosis sistémica (escleroderma)

Artritis temporal

Tromboangeitis obliterante

Rechazo al trasplante

Síndrome poliglandular autoinmune de tipo I y tipo II

Colitis ulcerosa

Uveítis

Granulomatosis de Wegener

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Como se usa aquí el término "alquileno" se refiere a una cadena alquilo lineal o ramificada que tiene dos valencias libres, por ejemplo -CH_{2}-, -CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CH_{2}CH_{2}-, -CH(CH_{3})CH_{2}-, -CH(CH_{2}CH_{3})CH_{2}CH_{2}CH_{3}, y -C(CH_{3})_{3}.

Como se usa aquí el término "heteroarilo" se refiere a un anillo aromático de 5 ó 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos. Ilustrativo de tales grupos son el tienilo, furilo, pirrolilo, imidazolilo, benzimidazolilo, tiazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, piridinilo. Piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo.

Como se usa aquí el término no calificado "heterociclilo" o "heterocíclico" incluye "heteroarilo" como se define anteriormente, y en particular significa un anillo heterocíclico aromático o no aromático de 5-8 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de S, N y O, incluyendo por ejemplo, pirrolilo, furanilo, tienilo, piperidinilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, piraxolilo, piridinilo, pirrolidinilo, pirimidinilo, morfolinilo, piperazinilo, indolilo, morfolinilo, benzofuranilo, piranilo, isoxazolilo, quinuclidinilo, aza-biciclo[3,2,1]octanilo, benzimidazolilo, metilendioxifenilo, maleimido y grupos succinimida.

A menos que se especifique de otro modo en el contexto en el que tiene lugar, el término "sustituido" como se aplica a cualquier resto aquí significa sustituido con uno o más de los siguientes constituyentes, a saber alquilo (C_{1}-C_{6}), trifluorometilo, alcoxi (C_{1}-C_{6}) (incluyendo el caso especial en el que un anillo es sustituido en átomos de un anillo C adyacente por metilendioxi o etilendioxi), trifluorometoxi, alquiltio (C_{1}-C_{6}), fenilo, bencilo, fenoxi, cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), hidroxi, mercapto, amino, fluoro, cloro, bromo, ciano, nitro, oxo, -COOH, -SO_{2}OH, -CONH_{2}, -SO_{2}NH_{2}, -COR^{A}, -COOR^{A}, -SO_{2}OR^{A}, -NHCOR^{A}, -NHSO_{2}R^{A}, -CONHR^{A}, -SO_{2}NHR^{A}, -NHR^{A}, -NR^{A}R^{B}, -CONR^{A}R^{B} o -SO_{2}NR^{A}R^{B} en las que R^{A} y R^{B} son independientemente un grupo alquilo (C_{1}-C_{6}). En el caso en que "sustituido" significa sustituido por cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), fenilo, bencilo o fenoxi, el anillo del mismo puede estar él mismo sustituido con cualquiera de los anteriores, excepto fenilo cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), bencilo o fenoxi.

Como se usa aquí el término sin calificar "carbocíclilo" o "carbocíclico" se refiere a un anillo de 5-8 miembros cuyos átomos del anillo son todos carbonos.

Algunos compuestos del invento contienen uno o más centros quirales debido a la presencia de átomos de carbono asimétricos. La presencia de átomos de carbono asimétricos da lugar a estereoisómeros o diastereoisómeros con esteroquímica R o S en cada centro quiral. El invento incluye todos tales estereoisómeros y diastereoisómeros y mezclas de los mismos.

Sales de compuestos que forman sales del invento incluyen sales de adición ácidas fisiológicamente aceptables por ejemplo hidrocloruros, hidrobromuros, sulfatos, metano sulfonatos, p-toluensulfonatos, fosfatos, acetatos, citratos, succinatos, lactatos, tartratos, fumaratos y maleatos; y sales de adición básica, por ejemplo sodio, potasio, magnesio, y sales de calcio. Donde los compuestos contienen un grupo amino, sales amino cuaternarias son también factibles, y están incluidas en el invento.

En los compuestos del invento los siguientes ejemplos son de las diversas variables estructurales:

R_{1} puede ser, por ejemplo, H, F, Cl, metilo, metoxi o metilendioxi. Actualmente se prefiere que R_{1} sea H, Cl o especialmente F;

R_{2} puede ser, por ejemplo, H, metilo, metoxi, ciclopropilo, fenilo, o fenilo sustituido con flúor-, cloro-, metilo, o metoxi. H o ciclopropilo son por la presente preferidos;

R_{3} puede ser, por ejemplo, H, F, Cl, metilo, o metoxi. Actualmente se prefiere que R_{3} sea F o Cl, y es más preferido que R_{3} sea H;

Y puede ser, por ejemplo, -O-, -S-, o -N(R_{5})- en el que R_{5} representa H o metilo. -NH- o -S- es actualmente preferido.

X puede ser, por ejemplo un enlace, o un radical -CH_{2}- o -CH_{2}CH_{2}-. Un enlace es por la presente preferido.

R_{4} representa -C(=O)NR_{6}R_{7}, R_{7} es preferiblemente H, pero un amplio intervalo de sustituyentes R_{6} han dado lugar a compuestos altamente activos del invento. Muchos sustituyentes R_{6} del invento aparecen en los compuestos de los Ejemplos a continuación.

R_{6} puede ser, por ejemplo, H o un radical de fórmula -Alk_{b}-Q en el que b es 0 ó 1 y

Alk puede ser, por ejemplo un radical -(CH_{2})_{n}-, -CH((CH_{2})_{m}CH_{3})(CH_{2})_{n}-, -C((CH_{2})_{m}CH_{3})((CH_{2})_{p}CH_{3})(CH_{2})_{n}-, -(CH_{2})_{n}-O- (CH_{2})_{m}-, -(CH_{2})_{n}-NH-(CH_{2})_{m}-, o -(CH_{2})N-NH-(CH_{2})_{m}-NH-(CH_{2})_{p}-, en el que n es 1, 2, 3 ó 4 y m y p son independientemente 0, 1, 2, 3 ó 4, y

Q puede representar H, -OH, -COOCH_{3}, fenilo, ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, piridilo, furilo, tienilo, o oxazolilo; y

R_{7} puede ser, por ejemplo, H, o cuando se toma junto con el átomo o átomos a los que están unidos R_{6} y R_{7} pueden formar un anillo heterocíclico de 5, ó 6 7 miembros.

Ejemplos específicos de los grupos R_{4} incluyen los presentes en los compuestos de los Ejemplos presentes.

Los compuestos del invento pueden ser preparados mediante métodos sintéticos conocidos en la literatura, a partir de compuestos que son comercialmente disponibles o son accesibles a partir de compuestos comercialmente disponibles. Por ejemplo, los compuestos de fórmula (I) en el que R_{4} es un grupo -NR_{7}C(=O)R_{6} pueden ser preparados mediante acilación de una amina de fórmula (II) con un ácido clorado de fórmula (III):

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3

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Los compuestos del invento en el que R_{4} es un grupo -NHC(=O)NHR_{6} puede ser preparado mediante la reacción de una amina de fórmula (IIA) con un isocianato de fórmula (IIIA)

4

Los compuestos del invento en el que R_{4} es un grupo -C(=O)NHR_{6} puede ser preparado mediante la reacción de un ácido clorado de fórmula (IIB) con una amina NHR_{6}R_{7}:

5

Los compuestos del invento en el que R_{4} es un grupo -NR_{7}C(=O)OR_{6} puede ser preparado mediante la reacción de una amina de fórmula (II) con un cloroformiato ClC(=O)OR_{6}.

Los siguientes ejemplos ilustran la preparación de los compuestos del invento:

La preparación del intermedio 1

2-(4-nitrofenil)-6-flouro-2,5-dihidropirazol[4,3-c]-quinolin-3-ona

6

4-nitrofenilhidrazina (2,28 g, 0,014 moles) fue añadida en una porción a una disolución agitada de ácido 4-cloro-8-fluoro-quinolina-3- carboxílico etil éster (3,58 g, 0,014 moles) en alcohol n-butílico anhidro (50 ml) a temperatura ambiente. La mezcla fue recirculada durante 16 h en atmósfera de nitrógeno, enfriada a temperatura ambiente y entonces filtrada hasta dejar un sólido naranja. El sólido fue purificado lavando secuencialmente con acetato de etilo (20 ml) y heptano (20 ml) y después finalmente secado bajo succión para dar la pirazolona (3,93 g, 87%) como un sólido naranja oscuro, LCMS m/z 325,24 [M+H]^{+} a Temp. ambiente durante 1,47 min.

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Preparación del intermedio 2

2-(4-aminofenil)-6-fluoro-2,5- dihidropirazolo[4,3-c]-quinolín-3-ona

7

Cloruro de estaño (II) dihidrato (12,5 g, 0,055 moles) fue añadido en una porción a una disolución agitada de 2-(4-nitrofenilo)-6-fluoro-2,5-dihidro-pirazolo[4,3-c]quinolín-3-ona (intermedio 1) (3,59 g, 0,011 moles) en alcohol etílico (110 ml) a temperatura ambiente. La mezcla fue entonces calentada a 80°C durante 8 horas, enfriada a temperatura ambiente y filtrada para dejar un sólido amarillo. El sólido fue resuspendido en una disolución bifásica de acetato de etilo (1 L), una disolución saturada de sales de Rochelles (500 ml) y una disolución saturada de bicarbonoato sódico (500 ml) y agitada a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla fue filtrada y el sólido restante fue lavado con agua y secado al vacío para permitir el compuesto titular (3,39 g, 99%) como un sólido amarillo brillante, LCMS m/z 295,30 [M+H]^{+} a Temp ambiente durante 0,84 min.

Ejemplo 1 N-[4-[6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidropirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-fenil]2-metil-butiramida

8

Cloruro de (\pm)-2-metilbutirilo (13,6 \mul, 0,11 mmoles) fue añadido gota a gota a lo largo de 30 segundos a una disolución agitada de 2-(4-amino-fenil)-6-fluoro-2,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-3-ona (intermedio 2) (30 mg, 0,10 mmoles), trietilamina (14 \mul, 0,11 mmoles) y 4- dimetilaminopiridina (2,4 mg, 0,02 mmoles) en diclorometano (1 ml) a temperatura ambiente. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 16 h. el sólido amarillo fue entonces filtrado y purificado lavándolo secuencialmente con una disolución saturada de bicarbonato sódico (1 ml), acetato de etilo (1 ml) y alcohol etílico (0,5 ml) y finalmente secado bajo succión para dar el compuesto titular (10 mg, 26%) como un sólido amarillo brillante, LCMS m/z 379,36 [M+H]^{+} a Temp. Ambiente 1,18 min. \delta_{H} (400 MHz, (CD_{3})_{2}SO) 9,89 (1H, s), 8,52 (1H, s), 8,15 (2H, d J 9, 0Hz), 8,01 (1H, d J 7,0 Hz), 7,69 (2H, d J 9.0 Hz) 7,57-7,46 (2H, m), 2,46-2,39 (1H, m) 1,69-1,36 (2H, m), 1,11 (3H, d J 6,8 Hz), 0,91 (3H, t J 7,3 Hz).

El compuesto titular, y los compuestos de los Ejemplos subsiguientes, fueron ensayados en el ensayo descrito a continuación en la sección de Ensayo, para determinar sus actividades como inhibidores de la interacción CD80-CD28. El presente compuesto titular tiene una tasa de actividad de ***.

Ejemplo 2-49

Los siguientes compuestos fueron sintetizados por la ruta descrita en el Ejemplo 1, sustituyendo el ácido clorado apropiado por cloruro de (\pm)-2-metilbutirilo:

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Ejemplo 2

Ácido 2-metilopentanoico[4-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidropirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-fenil]-amida

9

\delta_{H} (400 MHz, (CD_{3})_{2}SO) 9,92 (1H, s), 8,53 (1H, s), 8,12 (2H, d J 9,2 Hz), 8,05 (1H, d J 7,6 Hz), 7,70 (2H, d J 9.2 Hz) 7,63-7,53 (2H, m), 1,68-1,58 (1H, m) 1,38-1,28 (3H, m), 1,11 (3H, d J 6,6 Hz), 0,91 (3H, t J 7,1 Hz).

Actividad ***

Ejemplo 3

Ácido 1-metil-1H-pirrol-2-carboxílico[4-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-fenil]-amida

10

\delta_{H} (400 MHz, (CD_{3})_{2}SO) 9,76 (1H, s), 8,50 (1H, s), 8,26 (2H, d 9,0 Hz), 7,97-7,94 (1H, m), 7,73 (2H, d J 9.0 Hz) 7,39-7,28 (2H, m), 7,07-7,01 (2H, m) 3,91 (3H, s).

Actividad *

Ejemplo 4

N-[4-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-fenil]-3-metil-butiramida

11

\delta_{H} (400 MHz, (CD_{3})_{2}SO) 9,92 (1H, s), 8,52 (1H, s), 8,14 (2H, d J 9,2 Hz), 8,01 (1H, d J 7,3 Hz), 7,67 (2H, d J 9.2 Hz) 7,57-7,47 (2H, m), 2,21 (2H, d J 6,8 Hz) 2,14-2,07 (1H, m), 0,96 (6H, d J 6,6 Hz).

Actividad **

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Ejemplo 5

Ácido 2-Propil-pentanoico[4-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-fenil]-amida

12

\delta_{H} (400 MHz, (CD_{3})_{2}SO) 9,93 (1H, s), 8,53 (1H, s), 8,11 (2H, d J 9,2 Hz), 8,05 (1H, d J 7,8 Hz), 7,70 (2H, d J 9,0 Hz) 7,59-7,46 (2H, m), 2,46-2,35 (1H, m) 1,63-1,27 (4H, m), 0,90 (6H, t J 7,1 Hz).

Actividad *

Ejemplo 6

Ácido 5-[4-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-i1)-fenilcarbamoil]pentanoico-metil éster

13

\delta_{H} (400 MHz, (CD_{3})_{2}SO) 9,85 (1H, s), 8,47 (1H, s), 8,25 (2H, d J 9,0 Hz), 7,91-7,90 (1H, m), 7,59 (2H, d J 9,0 Hz) 7,29-7,20 (2H, m), 3,61 (3H, s) 2,38-2,28 (4H, m), 1,64-1,50 (4H, m).

Actividad ***

Ejemplo 7

N-[4-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-fenil]-2,2-dimetil-propionamida

14

\delta_{H} (400 MHz, (CD_{3})_{2}SO) 9,26 (1H, s), 8,52 (1H, s), 8,15 (2H, d J 9,2 Hz), 8,03 (1H, d J 8,8 Hz) 7,71 (2H, d J 9,2 Hz), 7,56-7,47 (2H, m), 1,26 (9H, s).

Actividad **

Los Ejemplos 8 a 28 fueron también preparados mediante el método del Ejemplo 1 usando el ácido clorado apropiado:

15

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16

17

18

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Preparación del intermedio 3

Ácido 3-(6-Flouro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-i1)-benzoico

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19

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Ácido 3-hidrazinobenzoico (1,91 g, 0,013 moles) fueron añadidos en una porción a una disolución agitada de ácido 4-cloro-8-fluoro-quinolin-3-carboxílico etil éster (2,93 g, 0,011 moles) en n-butanol (60 ml) a temperatura ambiente. La disolución fue calentada con reflujo durante 16 h, enfriada a temperatura ambiente y el sólido amarillo resultantes filtrado, lavado con tert-butil metil éter y después secado. El sólido fue redisuelto en una disolución de tetrahidrofurano: agua (2:1; 21 ml) e hidróxido de litio (1,27 g, 0,031 moles) fue después añadido. Tras agitación a temperatura ambiente durante 16 h, el ácido clorhídrico concentrado (3 ml) fue añadido gota a gota a la mezcla para precipitar un sólido amarillo que fue filtrado y secado al vacío para dar el compuesto titular (intermedio 3) (2, 32 g, 63%) como un sólido amarillo brillante.

\newpage

Preparación del intermedio 4

Cloruro de 3-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzoilo

20

Cloruro de oxalilo (20 ml, 0,2 moles) fue añadido gota a gota a lo largo de 2 min a una disolución agitada de ácido 3-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzoico (intermedio 3) (2, 0 g, 6,1 mmoles) en diclorometano (10 ml) a temperatura ambiente. N,N-dimetilformamida (50 \mul) fue añadida y la mezcla resultante calentada a 50°C durante 1 h. la disolución fue entonces enfriada a temperatura ambiente y después concentrada in vacuo para dejar el compuesto titular (intermedio 4) (2, 0 g, 96%) como un sólido beige.

Ejemplo 50 3-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-N-(3-metoxi-propilo)-benzamida

21

3-metoxipropilamina (0,026 g, 0,29 mmoles) fue añadida a una disolución agitada de cloruro de 3-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzoilo (intermedio 4) (26 mg 0,29 mmoles) en tetrahidrofurano (2 ml) y la mezcla agitada a temperatura ambiente durante 15 min. Trietanolamina (0,2 ml, 1,4 mmoles) fue entonces añadida y la mezcla resultante agitada durante toda la noche. Ácido clorhídrico 1 M (3-4 ml) fue añadido gota a gota para precipitar un sólido amarillo que fue filtrado y secado bajo succión para dar la amida (79 mg, 0,20 mmoles) como un sólido amarillo, LCMS m/z 395,25 [M+H]^{+} a Temp. Ambiente 1,04 min; \delta_{H} (400 MHz, (CD_{3})_{2}SO) 8,59 (1H, m), 8,57 (1H, s), 8,39 (1H, app d J 9,3 Hz), 8,08 (1H, app d J 7,3 Hz) 7,66-7,53 (5H, m), 3,37-3,33 (4H, m) 3,27 (3H, s), 1,83-1,77 (2H, m).

Actividad **

Ejemplo 51 N-Etil-3-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-i1)-benzamida

22

Preparado mediante el método del Ejemplo 53 sustituyendo etilamina por 3-metoxipropilamina.

\delta_{H} (400 MHz, (CD_{3})_{2}SO) rotómero principal medido; 8,56 (1H, brs), 8,47 (1H, m), 8,21 (2H, d J 8,5 Hz), 7,94 (2H, d J 8,5 Hz) 3,96 (3H, s), 3,31 (2H, q J 7,3 Hz) 2,58 (3H, s), 1,15 (3H, t J 7,4 Hz).

Actividad **

Ejemplo 52 N-Bencil-3-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-i1)-benzamida

23

Preparado mediante el método del Ejemplo 53 sustituyendo bencilamina por 3-metoxipropilamina.

LCMS m/z 427,16 [M+H]^{+} a Temp. Ambiente 1,28 min.

Actividad *

Los Ejemplos 53 a 64 fueron preparados mediante el método del ejemplo 50, usando la amina apropiada.

24

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25

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Ejemplo 65 N-(3-Dimetil amino propil)-4-(4-ciclopropil-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-i1)-benzamida

Etapa 1

Ácido 2-ciclopropil-4-oxo-1,4-dihidro-quinolina-3-carboxílico etil éster

26

Una disolución de ácido 3-ciclopropilo-3-oxo-propiónico metil éster (6,2 g, 0,038 moles), -acido 2-amino benzoico etil éster (4,95 g, 0,03 moles) y ácido p-toluén sulfónico (0,04 g, 0,2 mmoles) en tolueno (25 ml) fue calentado a 125°C durante 2 h; 15 ml de disolvente fue entonces destilado. A la disolución naranja residual se añadió etóxido sódico (2 M, 15 ml) en etanol (la mezcla de reacción se vuelve roja). Esta mezcla roja fue agitada a 120°C durante 2 h; 15 ml de disolvente fueron de nuevo destilados. La mezcla de reacción fue dejada enfriar a temperatura ambiente, diluida con acetato de etilo (1 litro), extraída con HCl 0,1 M y agua. Los extractos orgánicos combinados fueron secados sobre sulfato de sodio y concentrados in vacuo para dejar una residuo naranja que fue lavado una vez con acetato de etilo frío para dar ácido 2-ciclo-propil-4-oxo-1,4-dihidro-quinolin-3-carboxílico etil éster (3,87 g, 53%) como un sólido blanco hueso. LCMS m/z 244,14 [M+H]^{+} a Temp. Ambiente 0,78 min, 89%, m/z 230, 11 [Ácido+H]+ a Temp. Ambiente 1,27, 11%.

\delta_{H} (400 MHz, (CD_{3})_{2}SO) 11,04(1 H, s), 8,06 (1H, dd J_{1} 1. 1, J_{2} 8,1), 7,76-7,66 (2 H, m), 7,36 (1 H, td J_{1} 1,1 J_{2} 7,5) 3,89 (3 H, s), 2,16 (1 H, m) 1,18 (4H, d J 7,0).

Etapa 2

Ácido 4-Cloro-2-ciclopropil-quinolin-3-carboxílico etil éster

27

Oxicloruro fosfórico (0,77 ml, 0,082 moles) fue añadido en una porción a una suspensión de ácido 2-ciclopropilo-4-oxo-1,4- dihidro-quinolin-3-carboxílico etil éster (1,0 g, 0,041 moles) en acetonitrilo y la mezcla fue calentada a 75°C durante 90 minutos (se vuelve una disolución clara por encima de 65°C). La disolución marrón clara resultante fue vertida en bicarbonato sódico saturado (100 ml); la suspensión fue extraída con acetato de etilo y los extractos orgánicos combinados fueron secados y concentrados in vacuo para dejar el ácido 4-cloro-2-ciclopropil-quinolín-3-carboxílico etil éster (1,15 g, 106%) como un sólido blanco hueso. Rf (AcOEt) = 0,73.

Etapa 3

Ácido 4-(4-ciclopropilo-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzoico

28

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Ácido 4-cloro-2-ciclopropilo-quinolín-3-carboxílico etil éster (1,15 g, 0,0041 moles) y ácido 4-hidrazino-benzoico (1,0 g, 0,0068 moles) fueron agitados en etanol (30 ml) con reflujo durante 16 h. La suspensión amarillo brillante fue diluida con heptano, filtrada, lavada con éter t-butilmetilo frío y dejada secar bajo succión para dar un sólido en bruto que contienen hidracina. Este sólido fue suspendido en HCl 1 M, filtrado, lavado con agua y después secado in vacuo para dar ácido 4-(4-ciclopropilo-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-i1)-benzoico (1,135 g, 80%) como un sólido amarillo, LCMS m/z 346,20 [M+H]^{+} a Temp ambiente 1,05 min: 96% de pureza.

\delta_{H} (400 MHz, (CD_{3})_{2}SO) 11,4 (1H, s), 8,43 (2H, d J 8,1), 8,21 (1H, dd J_{1} 1, 2, J_{2} 8,1), 8,07 (2 H, d J 8,1) 7,92 (1 H, d J 8,1), 7,67 (1 H, t J 6,6), 7,52 (1 H, t J 6,5), 3,43 (1 H, m), 1,59 (2 H, m), 1,43 (2 H, m).

Etapa 4

Cloruro de 4-(4-ciclopropil-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-i1)-benzoilo

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29

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A una suspensión de ácido 4-(4-ciclopropil-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)- benzoico (0,19 g 0,55 mmoles) en diclorometano (4 ml) se añadió cloruro de oxalilo (1,6 ml, 0,01 moles) seguido por una gota de dimetil formamida. La mezcla fue agitada en atmósfera de nitrógeno a 45°C durante 8 h. El disolvente fue eliminado in vacuo para dar cloruro de 4-(4-ciclopropil-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzoilo como un sólido amarillo pálido, LCMS m/z [M+MeOH-Cl]^{+} a Temp. Ambiente 1,46 min: 95% de pureza. Usado sin purificación adicional.

Etapa 5

N-(3-dimetilamino propilo)-4-(4-ciclopropil-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)- benzamida

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30

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A una disolución parcial de cloruro de 4-(4-ciclopropil-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzoilo (0,1 g, 0,28 mmoles) finamente triturado en tetrahidrofurano (6 ml) en atmósfera de nitrógeno se añadió una disolución de 3-dimetilamino-propilamina (0,03 g, 0,3 mmoles) en tetrahidrofurano (3 ml). La mezcla fue agitada a Temp. Ambiente durante 3 h. El disolvente fue eliminado bajo presión reducida y el sólido amarillo fue lavado con un poco de agua saturada con bicarbonato sódico, y secado al vacío para dar N-(3-dimetilamino propil)-4-(4-ciclopropil-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzamida (57 mg, 47%) como un sólido amarillo. LCMS m/z 430,11
[M+H]^{+} a Temp. Ambiente 0,99 min: 100% de pureza.

Actividad ***

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Preparación del intermedio 5

Cloruro de 4-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzoilo

31

A una suspensión de ácido 4-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzoico (1,1 g, 3,4 mmoles) finamente triturado en diclorometano (6 ml) se añadió cloruro de oxalilo (2,4 ml, 29 mmoles) seguido por una gota de dimetilformamida. La mezcla fue agitada en atmósfera de nitrógeno a 45°C durante 3 h. El disolvente fue eliminado al vacío para dar cloruro de 4-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzoilo (1,15 g, cuantitativo) como un sólido amarillo pálido que fue usado sin purificación adicional.

Ejemplo 66 Hidrocloruro de N-(3-dimetilamino propil)-4-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzamida

32

A una disolución parcial de cloruro de 4-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzoilo (0,1 g, 0,3 mmoles) en tetrahidrofurano (5 ml) en atmósfera de nitrógeno se añadió una disolución de 3-dimetilamino propilamina (0,03 g, 0,3 mmoles) en tetrahidrofurano. La mezcla fue agitada a Temp. ambiente durante 90 minutos. El disolvente fue eliminado bajo presión reducida y el sólido amarillo fue purificado vía gel de sílice FCC (un gradiente de elusión, McOH:H_{2}O, Fluka C_{18} de fase inversa para dar hidrocloruro de N-(3-dimetilamino propilo)-4-(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,3-c]quinolín-2-il)-benzamida (70 mg, 53%) como un sólido amarillo.

LCMS m/z 408,39 [M+H]^{+} a Temp. Ambiente 0,89 min: 90% de pureza

Actividad ***

Ejemplos 67-141 fueron preparados de modo análogo a partir del cloruro de benzoilo apropiado y la amina apropiada

33

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38

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Ejemplo 142 Ácido {3-[4(6-fluoro-3-oxo-3,5-dihidro-pirazol[4,5-c]quinolin-2-il)-fenil]ureido}acético etil éster

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100

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Etil cianatoacetato (31 mg, 0,24 mmoles) fueron añadidos en una porción a una disolución agitada de 2-(4- aminofenil)-6-fluoro-2,5-dihidropirazol[4,3-c]quiniolín-3-ona (intermedio 2) (50 mg, 0,17 mmoles) en N,N-dimetilformamida (2 ml) y la mezcla agitada a temperatura ambiente durante 16 h. Se añadió entonces agua (1 ml) a la mezcla para precipitar un sólido, que fue filtrado, lavado con agua (1 ml) y después con acetato de etilo (1 ml) y finalmente secado mediante succión para dejar la urea como un sólido amarillo, LCMS m/z 424,40 [M+H]^{+} a Temp. ambiente durante 1,06 min.

Actividad ***

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Ejemplos 143 y 144

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39

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Los siguientes compuestos fueron sintetizados mediante el método del Ejemplo 142, sustituyendo el isocianato apropiado, isotiocianato o cloroformiato por cianatoacetato de etilo.

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40

41

Intermedio 6

Preparación de metil 4-oxotiocromano-3-carboxilato

42

El tetrahidrofurano seco (60 ml) fue enfriado en atmósfera de nitrógeno hasta -50 a -60°C. Una disolución de bis (trimetilsilil) amida de litio 1 M en hexano (56 ml, 56 mmoles) fue añadida. La temperatura fue mantenida a -50 hasta -60°C y tiocroman-4-ona fue añadida gota a gota a lo largo de 20 min. La agitación fue continuada a baja temperatura durante 60 min. Metil cianoformiato (4,84 ml, 60,9 mmoles) fue añadido gota a gota a lo largo de 5 min a la mezcla de reacción. La suspensión obtenida fue agitada a -50 hasta -60°C durante 80 min y después fue dejada calentar a temperatura ambiente. Una disolución de cloruro de amonio saturada (100 ml) fue añadida. Las fases fueron separadas, la fase acuosa extraída con acetato de etilo (2 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas fueron lavadas con agua (50 ml), secadas sobre sulfato de magnesio, filtradas y concentradas al vacío. Un aceite anaranjado fue obtenido y purificado mediante cromatografía en columna. El compuesto titular fue aislado como un sólido amarillo (4,70 g, 21,1 mmoles, 42%). LCMS: m/z 221 [M-H]+.

Intermedio 7

Preparación de ácido 4-(3-oxo-3a,4-dihidro-3H-tiocromeno[4,3-c]pirazol-2-ilo)-benzoico

43

4-oxotiocromano-3-carboxilato (0,50 g, 2,25 mmoles) y ácido hidrazinobenzoico (0,377 g, 2,48 mmoles) fueron mezclados en ácido acético (6 ml). La mezcla fue calentada con reflujo durante 30 min. El exceso de ácido acético fue eliminado mediante destilación para dar un aceite marrón. Dietiléter fue añadido, se formó un precipitado que fue recogido mediante filtración y secado al vacío. El producto en bruto fue aislado como un sólido rojizo/marrón (797 mg). LCMS: m/z 325 [M+H]^{+}. No se llevó a cabo purificación.

Intermediario 8

Preparación de ácido 4-(3-oxotiocromeno [4,3-c]pirazol-2(3H)-ilo)-benzoico

44

Ácido 4-(3-oxo-3a,4-dihidro-3H-tiocromeno[4,3-c]pirazol-2-ilo)-benzoico en bruto (250 mg, 0,77 mmoles) fue disuelto en sulfóxido de dimetilo (6 ml). O-cloranilo (189 mg, 0,77 mmoles) fue añadido y la mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. Se añadió agua (20 ml) y los sólidos fueron recogidos mediante filtración y lavados con agua. La galleta de filtro fue triturada con tolueno, filtrada y secada al vacío. El compuesto titular fue aislado como un sólido marrón oscuro (230 mg, 0,71 mmoles, 92%). LCMS: M/Z 323 [M+H]^{+}

Alternativamente el ácido 4-(3-oxo-3a,4-dihidro-3H-tiocromeno[4,3-c]pirazol-2-ilo)-benzoico en bruto puede ser agitado en sulfóxido de dimetilo bajo exposición al aire. Se encontró que la oxidación por aire proporciona un producto limpio, sin embargo la reacción es mucho más lenta.

Ejemplo 165 Preparación de N[3-(dimetilamino)propilo]-4-(3-oxotiocromeno[4,3-c]pirazol-2(3H)-il)benzamida

45

El ácido 4-(3-oxotiocromeno[4,3-c]pirazol-2(3H)-il)-benzoico (55 mg, 0,17 mmoles) fue suspendido en dimetilacetamida anhidra (1 ml). Diisopropil-etil amina (46,5 mg, 0,36 mmoles, 62 \mul) fue añadida seguida por 3-dimetilaminopropilamina (17,5 mg, 0,17 mmoles) y [(benzotriazol-1-iloxi)-dimetilamino-metilen]dimetil-amonio hexafluoruro de fosfato (65 mg, 0,17 mmoles). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 4 h y fue purificada mediante HPLC preparativa. El compuesto titular fue aislado como un sólido marrón. LCMS: m/z 407 [M+H]^{+}

Actividad **

Ejemplo 166 Preparación de N-[(ciclohexilamino)propil]-4-(3-oxotiocromeno[4,3-c]pirazol-2(3H)-il)benzamida

46

La reacción fue llevada a cabo como se describe anteriormente. LCMS: m/z 461 [M+H]^{+}

Actividad ***

Ejemplo 167 Preparación de N-(pirrolidin-1-il-butil)-4-(3-oxotiocromeno[4,3-c]pirazol-2(3H)-il)benzamida

47

La reacción fue llevada a cabo como se describe anteriormente. LCMS: m/z 447 [M+H]^{+}

Actividad *

Ejemplo 168 Preparación de 4-(3-oxotiocromeno[4,3-c]pirazol-2(3H)-il)-N-1, 2, 2, 6, 6-pentametilpiperidin-4-ilbenzamida

48

La reacción fue llevada a cabo como se describe anteriormente. LCMS: m/z 475 [M+H]^{+}

Actividad **

Intermedio 9

Preparación de ácido 3-[(2-fluorofenil)sulfanil]propanoico

49

2-fluorotiofenol (5,0 g, 39 mmoles) fue disuelto en tetrahidrofurano (50 ml) en atmósfera de nitrógeno. Trietilamina (3,94 g, 5,33 m, 85,8 mmoles) fue añadida. Acido acrílico (2,81 g, 2,67 ml, 39 mmoles) fue disuelto en tetrahidrofurano y añadido gota a gota a la disolución de reacción a lo largo de 2 h a temperatura ambiente. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche. Ácido clorhídrico 1 M (50 ml) fue añadido y las fases fueron separadas: La fase acuosa fue lavada con acetato de etilo (2 x 50 ml). Las fase orgánicas combinadas fueron secadas sobre sulfato de magnesio, filtradas y concentradas al vacío. Un aceite amarillo fue obtenido el cual solidificó tras almacenarlo a temperatura ambiente. El sólido fue triturado con hexano, filtrado y secado al vacío. El compuesto titular fue aislado como un sólido blanco hueso (4,19 g, 20,9 mmoles, 54%).

Intermedio 10

Preparación de 8-fluoro-2,3-dihidro-4H-tiocromen-4-ona

50

Ácido 3-[(2-flurofenil)sulfanil]propanoico (4,0 g, 20 mmoles) fueron mezclados con ácido sulfúrico concentrado (20 m1) a 0-5°C. La disolución de reacción fue agitada a 0 hasta 5°C durante 3 h después dejada calentar a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla fue detenida mediante goteo en hielo para dar usa suspensión blanca. La fase acuosa fue extraída con acetato de etilo (1 x 200 ml, 1 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas fueron lavadas con una disolución de bicarbonato sódico saturada (1 x 50 ml), agua (1 x 50 ml), ácido clorhídrico 1 M (50 ml) y agua (2 x 50 m1). La fase orgánica fue secada sobre sulfato de magnesio, filtrada y concentrada al vacío. El compuesto titular fue aislado como un sólido amarillo (2,10 g, 11,5 mmoles, 58%).

Intermedio 11

Preparación de metil 8-fluoro-4-oxotiocromano-3-carboxilato

51

Una disolución de hexametildisilazida de litio 1 M en hexano (13,2 ml) fue disuelta en tetrahidrofurano anhidro (20 ml) en atmósfera de nitrógeno. La disolución fue enfriada a 78°C. 8-fluro-2,3-dihidro-4H-tiocromen-4-ona (2,00 g, 11 mmoles) fue disuelta en tetrahidrofurano (40 ml), la disolución fue transferida a un embudo de goteo y añadida gota a gota a lo largo de 30 minutos a la mezcla de reacción manteniendo la temperatura por debajo de -60°C. Una disolución naranja clara fue obtenida y fue agitada a -78°C hasta -65°C durante 2 h. El cianoformiato de metilo (0,935 g, 0,87 ml) fue disuelto en tetrahidrofurano (2 ml) y añadido gota a gota a la disolución de reacción. La agitación fue continuada a baja temperatura durante 1 h, la mezcla fue entonces dejada calentar a temperatura ambiente. La disolución de cloruro de amino saturada (20 ml) y agua (10 ml) fueron añadidas, las fases mezcladas durante 5 min y separadas. La fase acuosa fue lavada con acetato de etilo (2 x 100 ml) y las fase orgánicas combinadas fueron secadas sobre sulfato de magnesio. La mezcla fue filtrada y el disolvente eliminado al vacío para dar un aceite anaranjado. El aceite en bruto fue purificado mediante cromatografía en columna; fase móvil: hexanos, gradiente de hexanos/acetato de etilo [90:10]. El compuesto titular fue aislado como un sólido amarillo (1,19 g, 4,95 mmoles, 45%).

Intermedio 12

Preparación de ácido 4-(6-fluoro-3-oxotiocromeno[4,3-c]pirazol-2(3H)-il)benzoico

52

Metil 8-fluoro-4-oxotiocromano-3-carboxilato (1,19 g, 4,95 mmoles) y ácido 4-hidrazinobenzoico (7,55 mg, 4,95 mmoles) fueron mezclados con ácido acético glacial (10 ml). La mezcla fue calentada con reflujo durante 4 h. El exceso de ácido acético fue eliminado al vacío para dar un aceite anaranjado. Acetato de etilo (10 ml) fue añadido y la mezcla sonicada. La precipitación de un sólido anaranjado fue observada. Los sólidos fueron recogidos mediante filtración y lavados con acetato de etilo. La galleta de filtro fue introducida en sulfóxido de dimetilo (10 ml) y oxidada al aire a temperatura ambiente durante una semana. Agua (20 ml) fue añadida a la mezcla de reacción, los sólidos fueron recogidos mediante filtración, suspendidos en acetato de etilo, filtrados y secados al vacío. El compuesto titular fue aislado como un polvo anaranjado (175 mg, 0,51 mmoles, 10%). LCMS: m/z 341.

Ejemplo 169 Preparación de N-[3-(dimetilamino)propil]-4-(6-fluoro-3-oxotiocromeno[4,3-c]pirazol-2(3H)-il)benzamida

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53

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Ácido 4-(6-fluoro-3-oxotiocromeno[4,3-c]pirazol-2(3H)-il)benzoico (41 mg, 0,12 mmoles) fue disuelto en dimetil acetamida anhidra (1 ml). Diisopropil-etil amina (46 mg, 0,36 mmoles, 62 \mul) fue añadida seguida por [(benzotriazol-1-iloxi)-dimetilamino-metilen]dimetil-amonio hexafluoruro fosfato (65 mg, 0,17 mmoles) y 3-dimetilaminopropilamino (12 mg, 0,12 mmoles). La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante toda la noche y purificada mediante HPLC preparativo. El compuesto titular fue alisado como un sólido marrón. LCMS: M/z 425 [M+H]^{+}.

Actividad **

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Ejemplo 170 Preparación de N-[(ciclohexilamino)propil]-4-(6-fluoro-3-oxotiocromeno[4,3-c]pirazol-2(3H)-il)benzamida

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54

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La reacción fue llevada a cabo como se describe anteriormente. LCMS: M/Z 479 [M+H]^{+}

Actividad **

Ejemplo 171 Preparación de N-(pirrolidin-1-il-butil)-4-(6-fluoro-3-oxotiocromeno[4,3-c]pirazol-2(3H)-il)benzamida

55

La reacción fue llevada a cabo como se describe a continuación. LCMS: M/Z [M+H]^{+}

Actividad ***

Ejemplo 173 Preparación de 4-(6-fluoro-3-oxotiocromeno[4,3-c]pirazol-2(3H)-il)-N-1, 2, 2, 6, 6-pentametilpiperidin-4-ilbenzamida

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La reacción fue llevada a cabo como se describe a continuación. LCMS: m/z 493 [M+H]^{+}

Actividad ***

Sección de Ensayo

Los ejemplos descritos anteriormente fueron ensayados en un ensayo de fluorescencia de resolución temporal homogéneo libre de células (HTRF) para determinar su actividad como inhibidores de la interacción CD80-CD28.

En el ensayo, Europio y aloficocianina (APC) se asocian con CD28 y CD80 indirectamente (a través de agentes de entrecruzamiento de anticuerpos) para formar un complejo, que une el Europio con el APC en cercana proximidad para generar una señal. El complejo comprende las siguientes seis proteínas: etiqueta de fluorescencia 1, agente de entrecruzamiento de anticuerpos 1, proteína de fusión CD28, proteína de fusión CD80, agente de entrecruzamiento de anticuerpos 2, y etiqueta fluorescente 2. La tabla a continuación describe estos agentes en mayor detalle.

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Durante la formación del complejo, Europio y APC son aproximados y una señal es generada.

Se midió la interacción inespecífica sustituyendo un fragmento Fab de ratón (C215) para la proteína de fusión del fragmento Fab de ratón CDE80 (1,9 \mug/ml). El ensayo fue llevado a cabo en placas negras de 384 pocillos en un volumen final de 30 \mul. Tampón de ensayo: Tris-HC1 50 mM, NaCl 150 mM pH 7,8, que contiene BSA 0,1% (p/v) añadido justo antes a ser usado.

Los compuestos fueron añadidos a los reactivos anteriores en una serie de concentraciones que oscila entre 100 \muM- 1,7 nM. La reacción fue incubada durante 4 horas a temperatura ambiente. Medidas duales fueron hechas usando un Contador de multimarcaje Wallac Victor 1420. La primera medida: excitación a 340 nm, emisión a 665 nm, retraso 50 \mus, ventana de tiempo 200 \mus. Segunda medida: excitación a 340 nm, emisión a 615 nm, retraso 50 \mus, ventana de tiempo 200 \mus. Las cuentas fueron corregidas automáticamente para el cruce de fluorescencias, apagado y fondo.

A modo de ilustración, los resultados de EC_{50} para los compuestos de los Ejemplos 15, 21, 29, 35 y 83 fueron 8 \muM, 1,9 \muM, 950 nm, 148 nm y 90 nm respectivamente. Por conveniencia, las EC_{50} de actividad de los compuestos ensayados son recogidas anteriormente en la forma de sumario como:

EC_{50}: * = >10 \muM, ** = 1-10 \muM, *** = < 1 \muM.

Claims

1. Un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo farmacéutica- o veterinariamente aceptable:

58

en la que

R_{1} y R_{3} independientemente representan H; F; Cl; Br; -NO_{2}; -CN; alquilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido por F o Cl; o alcoxi C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido por F;

R_{2} representa H, o alquilo C_{1}-C_{8}, cicloalquilo C_{3}-C_{7} o fenilo, opcionalmente sustituido con uno o más de alquilo C_{1}-C_{6}, trifluorometilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, trifluorometoxi, alquiltio C_{1}-C_{6}, fenilo, bencilo, fenoxi, cicloalquilo C_{3}-C_{8}, hidroxi, mercapto, amino, fluoro, cloro, bromo, ciano, nitro, oxo, -COOH, -SO_{2}OH, -CONH_{2}, -SO_{2}NH_{2}, -COR^{A}, -COOR^{A}, -SO_{2}OR^{A}, -NHCOR^{A}-, -NHSO_{2}R^{A}, -CONHR^{A}-, SO_{2}NHR^{A}, -NHR^{A}, -NR^{A}R^{B}, -CONR^{A}R^{B} o -SO_{2}NR^{A}R^{B} en el que R^{A} y R^{B} son independientemente un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, y en el caso en el que "sustituido" significa sustituido por cicloalquilo C_{3}-C_{8}, fenilo, bencilo o fenoxi, el anillo del mismo puede estar él mismo opcionalmente sustituido con cualquier de los anteriores, excepto cicloalquilo C_{3}-C_{8}, fenilo, bencilo o fenoxi;

Y representa -O-, -S-, N-óxido, o -N(R_{5})- en el que R_{5} representa H o alquilo C_{1}-C_{6};

X representa un enlace o un radical alquileno C_{1}-C_{6} divalente;

R_{4} representa -C(=O)NR_{6}R_{7}, en el que

R_{6} representa un radical de fórmula -(Alk)_{b}-Q en el que b es 1 y

Alk es una cadena lineal o ramificada divalente de alquileno C_{1}-C_{12}, alquenileno C_{2}-C_{12} o radical alquinileno C_{2}-C_{12}, opcionalmente sustituido con uno o más de alquil C_{1}-C_{6}, trifluorometil, alcoxi (C_{1}-C_{6}), trifluorometoxi, alquiltio (C_{1}-C_{6}),fenilo, bencilo, fenoxi, cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), hidroxi, mercapto, amino, fluoro, cloro, bromo, ciano, nitro, oxo, -COOH, -SO_{2}OH, -CONH_{2}, -SO_{2}NH_{2}, -COB^{A}, -COOR^{A}, -SO_{2}0R^{A}, -NHCOR^{A}-, -NHSO_{2}R^{A}, -CONHR^{A}-, SO_{2}NHR^{A}, -NHR^{A}, -NR^{A}R^{B}, -CONR^{A}R^{B} o -SO_{2}NR^{A}R^{B} en el que R^{A} y R^{B} son independientemente un grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), y en el caso en el que "sustituido" significa sustituido por cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), fenilo, bencilo o fenoxi, el anillo del mismo puede estar él mismo opcionalmente sustituido con cualquier de los anteriores, excepto cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), fenilo, bencilo o fenoxi;

cadena lineal divalente o ramificada de alquileno C_{1}-C_{12}, alquenileno C_{2}-C_{12} o radical alquinileno C_{2}-C_{12} que puede estar interrumpida por uno o más radicales -O-, -S- o -N(R_{8})- no adyacentes en el que R8 representa H o alquilo C_{1}-C_{4}, alquenilo C_{3}-C_{4}, alquinilo C_{3}-C_{4}, o cicloalquilo C_{3}-C_{6}, y

Q representa H; -CF_{3}; -OH; -SH; -NR_{8}R_{8} en el que cada R_{8} puede ser el mismo o diferente; un grupo éster; o un fenilo, cicloalquilo C_{3}-C_{7}, cicloalquenilo C_{5}-C_{7} o anillo heterocíclico que tiene anillos desde 5 hasta 8 átomos, opcionalmente sustituidos con uno o más de alquilo C_{1}-C_{6}, trifluorometilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, trifluorometoxi, alquiltio C_{1}-C_{6}, fenilo, bencilo, fenoxi, cicloalquilo C_{3}-C_{8}, hidroxi, mercapto, amino, fluoro, cloro, bromo, ciano, nitro, oxo, -COOH, -SO_{2}OH, -CONH_{2}, -SO_{2}NH_{2}, -COB^{A}, -COOR^{A}, -SO_{2}OR^{A}, -NHCOR^{A}-, -NHSO_{2}R^{A}, -CONHR^{A}-, SO_{2}NHR^{A}, -NHR^{A}, -NR^{A}R^{B}, -CONR^{A}R^{B} o -SO_{2}NR^{A}R^{B} en el que R^{A} y R^{B} son independientemente un grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), y en el caso en el que "sustituido" significa sustituido por cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), fenilo, bencilo o fenoxi, el anillo del mismo puede estar él mismo opcionalmente sustituido con cualquier de los anteriores, excepto cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), fenilo, bencilo o fenoxi; y

R_{7} representa H o alquilo C_{1}-C_{6}; o cuando son tomados juntos con el átomo o átomos a los que se unen R_{6} y R_{7} forman un anillo heterocíclico que tiene anillos desde 5 hasta 8 átomos, anillos que pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más de alquilo C_{1}-C_{6}, trifluorometilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, trifluorometoxi, alquiltio C_{1}-C_{6}, fenilo, bencilo, fenoxi, cicloalquilo C_{3}-C_{8}, hidroxi, mercapto, amino, fluoro, cloro, bromo, ciano, nitro, oxo, -COOH, -SO_{2}OH, -CONH_{2}, -SO_{2}NH_{2}, -COR^{A}, -COOR^{A}, -SO_{2}OR^{A}, -NHCOR^{A}-, -NHSO_{2}R^{A}, -CONHR^{A}-, SO_{2}NHR^{A}, -NHR^{A}, -NR^{A}R^{B}, -CONR^{A}R^{B} o -SO_{2}NR^{A}R^{B} en el que R^{A} y R^{B} son independientemente un grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), y en el caso en el que "sustituido" significa sustituido por cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), fenilo, bencilo o fenoxi, el anillo del mismo puede él mismo estar opcionalmente sustituido con cualquier de los anteriores, excepto cicloalquilo (C_{3}-C_{8}), fenilo, bencilo o fenoxi.

2. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1, en el que R_{1} es H, F, Cl, metil o metoxi.

3. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que R_{2} es H, metilo, metoxi, ciclopropilo, fenilo, o fluoro-, cloro, metilo, o fenilo sustituido con metoxi.

4. Un compuesto como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que R_{3} es H, F, Cl, metilo, o metoxi.

5. Un compuesto como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que Y es -O-, -S-, o -N(R_{5})- en el que R_{5} representa H o metilo.

6. Un compuesto como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que X es un enlace, o un radical -CH_{2}- o -CH_{2}CH_{2}-.

7. Un compuesto como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que R_{4} representa -C(=O)NHR_{6}, en el que R_{6} es un radical de fórmula -Alk_{b}-Q en el que

b es 1 y

Alk es -(CH_{2})N-, -CH((CH_{2})_{m}CH_{3})(CH_{2})_{n}-, -CH((CH_{2})_{m}CH_{3})((CH_{2})_{p}CH_{3})(CH_{2})_{n}-, -(CH_{2})_{n}-O-(CH_{2})_{m}-, O-(CH_{2})_{n}
-O-(CH_{2})_{n}-O-(CH_{2})_{m}-, radical en el que n es 1, 2, 3 ó 4 y m y p son independientemente 0, 1, 2, 3 ó 4, y

Q representa H, -OH, -COOCH_{3} fenilo, ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, piridilo, furilo, tienilo, o oxazolilo.

8. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1, en el que R_{1} es H, F, o Cl; R_{2} es H; R_{3} es H, F, o Cl; Y es -NH-; X es un enlace; y R_{4} representa -C(=O)NHR_{6} en el que:

R_{6} es un radical de fórmula -Alk_{b}-Q en el que

b es 1 y

Alk es -(CH_{2})_{n}-, -CH((CH_{2})_{m}CH_{3})(CH_{2})_{n}-, -CH((CH_{2})_{m}CH_{3})((CH_{2})_{p}CH_{3})(CH_{2})_{n}-, -(CH_{2})_{n}-O-(CH_{2})_{m}-, o -(CH_{2})_{n}-O-(CH_{2})_{n}-O-(CH_{2})_{m}-, radical en el que n es 1, 2, 3 ó 4 y m y p son independientemente 0, 1, 2, 3 ó 4, y

Q representa H, -OH, -COOCH_{3} fenilo, ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, piridilo, furilo, tienilo, u oxazolilo.

9. Un compuesto como se reivindica en la reivindicación 1, en el que R_{1} es F, R_{2} es H o ciclopropilo, R_{3} es H, X es un enlace, y R_{4} es -C(=O)NHR_{6}.

10. N-(3-dimetilaminopropil)-4-(4-ciclopropil-3-oxo-3,5-dihidro-pirazolo[4,3-c]quinolín-2-il]-benzamida, o una sal del mismo farmacéutica- o veterinariamente aceptable del mismo.

11. Un compuesto como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para usar en el tratamiento de estados que se benefician de la inmunomodulación.

12. El uso de un compuesto como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de estados que se benefician de la inmunomodulación.

13. Una composición farmacéutica o veterinaria que comprende un compuesto como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 junto con un excipiente o vehículo farmacéutica- o veterinariamente aceptable.