ES2284494T3 - Procedimiento para preparar composiciones de gonadotropina. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de purificación de gonadotropinas urinarias humanas de alta actividad biológica y pureza química absolutamente libres de materiales extraños contaminantes obtenidas del uso de reactivos biológicos o colorantes de cromatografía, a partir de gonadotropinas en bruto, que comprende las siguientes etapas: 1) purificación de dichas gonadotropinas en bruto diluidas en acetato de amonio 0, 05-0, 15 M, pH de 5, 0 a 6, 0, en una columna de intercambio iónico con una resina catiónica fuerte del tipo de sulfopropilo, eluyendo FSH y LH con soluciones de acetato de amonio 0, 05-0, 5 M, pH de 5, 0 a 7, 0; y 2) purificación de esta fracción diluida en acetato de amonio 0, 01-0, 05 M, pH de 5, 0 a 7, 0 en una columna de intercambio iónico con una resina aniónica fuerte del tipo de amonio cuaternario, eluyendo FSH y LH con soluciones de acetato de amonio 0, 05-0, 2 M, pH de 5, 0 a 7, 0; y 3) purificación de gonadotropinas en una columna con una resina de interacción hidrófoba por la adiciónsecuencial de al menos dos de las siguientes soluciones: a) tampón de fosfato de sodio 50-200 mM y sulfato de amonio 0, 8-1, 2 M, pH de 5, 0 a 6, 0; b) tampón de fosfato de sodio 50-200 mM, y sulfato de amonio 0, 4-0, 6 M; pH de 5, 0 a 7, 0; c) tampón de fosfato de sodio 50-200 mM (del 50 al 70% v/v) y etanol al 96% (del 50 al 30% v/v), o inserción de la resina de interacción hidrófoba entre las dos etapas de cromatografía de intercambio iónico.
Description
Procedimiento para preparar composiciones de
gonadotropina.
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La presente invención se refiere a composiciones
de gonadotropina, particularmente a FSH (hormona
foliculoestimulante: folitropina) y composiciones de menotropina de
alta actividad biológica y a un procedimiento para preparar estas
composiciones a partir de orina humana en bruto de mujeres
menopaúsicas o posmenopaúsicas. La pureza química obtenida es
superior al 95% medida por HPLC, mientras la actividad biológica
específica es superior a 2.500 UI/mg de proteína para las hormonas
FSH y LH para composición de menotropina (Gonadotropinas
Menopaúsicas Humanas; HMG) y superior a 5.000 UI/mg de proteína
para FSH.
El término "menotropinas" se aplica a una
combinación hormonal obtenida de la orina de mujeres menopaúsicas y
posmenopaúsicas que comprende dos hormonas de glucoproteína: hormona
foliculoestimulante y hormona luteinizante. Estas dos hormonas son
secretadas por la glándula pituitaria, y posteriormente se
metabolizan y se excretan en la orina.
Las menotropinas y la folitropina se han usado
durante mucho tiempo en el tratamiento terapéutico de trastornos de
infertilidad.
El papel de la FSH consiste en actuar sobre los
folículos ováricos, promoviendo su rápido crecimiento y maduración
con ulterior ovulación o atresia. La FSH junto con la LH está
implicada también en la biosíntesis de estradiol en los folículos
ováricos que ha estimulado. La teca interna es el lugar principal de
biosíntesis de andrógeno folicular que está bajo el control de la
LH. Controlado por la FSH, este andrógeno se aromatiza a
continuación en las células granulosas y se excreta al torrente
sanguíneo. Por tanto, la LH es un constituyente necesario junto con
la FSH en la estimulación folicular.
Las hormonas pituitarias FSH y LH, hormona
estimulante de la tiroides (TSH) y la hormona placentaria
gonadotropina coriónica humana (HCG) están estrechamente
relacionadas, ya que todas ellas son glucoproteínas que tienen en
su estructura dos subunidades denominadas \alpha y \beta. Ambas
subunidades están unidas por interacción no covalente. Estas
subunidades no tienen ninguna actividad biológica por separado. Las
cadenas \alpha de las cuatro hormonas mencionadas anteriormente
son comunes, mientras que las cadenas \beta son diferentes y
proporcionan una actividad biológica característica de cada hormona.
Sin embargo, partes importantes de la cadena \beta son también
comunes, lo que puede observarse particularmente en las cadenas
\beta de LH y HCG.
Las gonadotropinas obtenidas de orina humana se
han purificado parcialmente hasta que se alcanzan características
de bioseguridad compatibles con los requisitos de un producto
farmacéutico inyectable, y se han comercializado durante más de 30
años con el fin de resolver problemas de infertilidad; estando en la
forma de una preparación farmacéutica de calidad inyectable, se
enumeran en las farmacopeas más importantes del mundo y han sido
aprobadas para uso farmacéutico en prácticamente todos los países
del mundo.
La composición de la preparación de folitropina
puede describirse del modo siguiente:
- Hormona foliculoestimulante: 75 ó 150 unidades
internacionales de FSH.
- Excipiente (requerido para el procedimiento de
liofilización, generalmente de 5 a 20 mg de lactosa) y otras
proteínas no activas.
La composición de la preparación de menotropinas
puede describirse del modo siguiente:
- Hormona foliculoestimulante: 75 ó 150 unidades
internacionales de FSH.
- Hormona luteinizante 75 ó 150 unidades
internacionales de LH.
- Excipiente (requerido para el procedimiento de
liofilización, generalmente de 5 a 20 mg de lactosa) y otras
proteínas no activas.
Las unidades internacionales de la FSH y LH se
calculan midiendo las actividades biológicas en ratas con respecto
a un patrón internacional preparado por el Instituto Nacional de
Patrones y Control Biológico (NIBSC) dependiente de la Organización
Mundial de la Salud.
El requisito, impuesto por Farmacopeas como la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP XXIII) o la Farmacopea
Británica (BP) en términos de pureza del material de partida
requerido para la preparación de menotropinas de calidad
inyectable, consiste en un material de partida que tiene una
actividad de FSH superior a 40 UI/mg y una actividad de LH superior
a 40 UI/mg. En vista de esto, estos materiales de partida usados en
lo sucesivo se han obtenido por un procedimiento de fabricación que
asegura una actividad en el intervalo de 70 a 150 UI de FSH/LH por
mg, que es más que suficiente para cumplir los requisitos impuestos
por las organizaciones sanitarias en cuanto se refiere a
bioseguridad y eficacia.
Sin embargo, los últimos desarrollos en términos
de técnicas de purificación y el desarrollo de gonadotropinas de
origen recombinante han influido en la necesidad de preparaciones de
gonadotropinas nativas altamente purificadas de origen urinario,
sin la presencia de proteínas que generan impurezas.
En el pasado reciente se han descrito algunos
procedimientos de purificación de FSH y LH.
El documento
EP-0.322.438-B1 y las patentes de
EE.UU. equivalentes 5.128.453; 5.767.067 y 5.840.857 se refieren a
la preparación de hormona foliculoestimulante con alta actividad
específica de origen urinario. Sin embargo, estos procedimientos
incluyen una etapa específica de anticuerpos monoclonales. Desde el
punto de vista de la seguridad, este hecho suscita algunas
preocupaciones acerca de la contaminación del producto con proteínas
heterólogas, residuos de ADN de las células hospedadoras y virus.
Aunque las validaciones del procedimiento y las pruebas finales
pueden ayudar a excluir la posibilidad de una contaminación
potencial, es razonable valorar que un procedimiento que está
diseñado especialmente para evitar el uso de reactivos biológicos
tiene patrones de seguridad más altos que el que incluye este tipo
de etapa de purificación.
La solicitud de patente
WO-98/20.039 describe un procedimiento de separación
y purificación de FSH y LH que evita emplear reactivos biológicos.
Sin embargo, debido a la muy alta proporción FSH:LH del material en
bruto usado y los productos obtenidos, este procedimiento excluye
la posibilidad de obtener menotropinas, una preparación que
requiere una proporción FSH:LH de aproximadamente 1:1.
Además, el documento
WO-98/20.039 no consigue caracterizar las
gonadotropinas obtenidas como un material bioactivo, lo que es una
cuestión esencial para un producto terapéutico. Esta solicitud de
patente usa un procedimiento inmunorradiométrico para ensayar la
actividad, un procedimiento de determinación que suscita profundas
preocupaciones acerca de su precisión.
De hecho, se ha reconocido desde hace bastante
tiempo que la heterogeneidad estructural de las isoformas de FSH y
LH tiene un impacto importante en la actividad biológica y la
reactividad inmunológica de las dos hormonas [Costagliola y col. J.
Endocrinol. Invest. 17, 291 (1994)]. Las diferencias observadas en
los niveles biológicos e inmunológicos de FSH y LH sugieren que se
reconocen entidades estructurales separadas mediante los bioensayos
con respecto al inmunoensayo. Se ha debatido ampliamente que los
inmunoensayos no proporcionan de forma consistente una buena
estimación del nivel de gonadotropinas bioactivas y no refleja
necesariamente la actividad biológica [Dahl y Stone, J. Andrology,
13, 11 (1992); Rose y col. Endocrine Reviews 21, 5 (2000)].
Por otra parte, los bioensayos se consideran la
prueba apropiada para definir la actividad de hormonas, ya que
tienen en cuenta dos componentes importantes que están ausentes en
otros procedimientos: la acción biológica en el tejido objeto y la
depuración biológica [Rose y col. Endocrine Reviews 21, 5 (2000)].
Este hecho hace el bioensayo in vivo obligatorio para
calibrar las preparaciones terapéuticas [Rose, Clinica Chimica Acta
273, 103 (1998)].
Debe subrayarse también que el documento
WO-98/20.039 tampoco consigue caracterizar las
gonadotropinas como fármacos químicamente puros ya que no se
presenta ningún procedimiento analítico para apoyar este hecho.
La presente invención presenta una
caracterización completa de las gonadotropinas no sólo desde el
alcance de la bioactividad sino también desde el punto de vista
analítico introduciendo un procedimiento analítico sensible para
probar la pureza. Como los ensayos usados para establecer la
actividad de FSH y LH en la presente invención son, en todos los
casos, bioensayos in vivo que han demostrado desde hace mucho
tiempo ser una prueba específica robusta para garantizar la
bioactividad, puede asegurarse la potencia de la FSH y la LH para
cada gonadotropina obtenida y también su proporción.
Una segunda cuestión que ha de considerarse es
que la patente mencionada anteriormente
(WO-98/20.039) describe el uso de una cromatografía
de afinidad a colorantes para purificar gonadotropinas. Este
procedimiento podría suscitar cierta preocupación acerca de la
contaminación potencial del producto por la fuga del colorante.
Esta clase de compuestos extraños no es deseable en productos que
han de inyectarse en seres humanos [Protein Purification de R.K.
Scopes, Springler-Verlag, Nueva York Inc; 2ª
edición, página 156 (1998)]. Como la presente invención se diseñó
para excluir este tipo de cromatografía, el problema de
contaminación del colorante es una cuestión que se evita por
completo.
Las menotropinas actuales (el producto
disponible comercialmente) pueden sufrir el inconveniente de
reacciones alérgicas locales potenciales cuando se administran por
vía subcutánea, debido a la presencia de contaminantes de
proteínas.
Esta invención proporciona un procedimiento para
la purificación y la preparación de los primeros productos de
gonadotropina de alta pureza disponibles comercialmente. Esta
metodología se diseñó especialmente de manera que se evitara el uso
de reactivos biológicos como anticuerpos, receptores y otros
materiales heterólogos y colorantes de cromatografía. Además de la
cuestión de la seguridad, el uso de etapas no específicas durante
el aislamiento permite obtener todas las isoformas que están
presentes en el material de partida.
Según se describe extensamente, la
heterogeneidad es de particular importancia en las hormonas de
glucoproteínas. Existen al menos de 20 a 30 isoformas diferentes de
FSH, LH y TSH (Wide, Acta Endocr., Copenh 109,
181-189, 1985). Estas isoformas difieren en su peso
molecular y su carga. Aunque las isoformas de hormonas de
glucoproteína varían principalmente en la estructura de
oligosacáridos, las microheterogeneidades pueden estar también
presentes a partir de diferencias en la composición de aminoácidos
(Costagliola y col., J. Endocrinol. Invest., 17,
291-299, 1994; Wilson y col., J. Endocrinol. 125,
3-14, 1990).
En general se acepta que el tipo de diferentes
isoformas aisladas depende, entre otros factores, de las técnicas
de aislamiento (Cockburn y col., Biologicals 19,
257-264, 1991). El uso de técnicas altamente
discriminantes para el aislamiento, como anticuerpos monoclonales,
puede contribuir a seleccionar sólo una parte de las isoformas
presentes en la fuente del material. Al ser "demasiado
específicas", algunas variantes de gonadotropinas biológicamente
activas pueden no ser reconocidas por los anticuerpos y podrían
perderse (Costagliola y col. J. Endocrinol. Invest., 17,
291-299, 1994). Por otra parte, un enfoque no
selectivo, como el descrito en esta patente, puede ser útil para
purificar todos los tipos de isoformas presentes en la orina.
Diferentes isoformas han demostrado variar con respecto a la
interacción con los receptores de superficie celular y la depuración
metabólica (Thotakura y col., Glycobiology 5, 3-10,
1995). La estructura de oligosacáridos está bajo el control de
varios factores fisiológicos. Desde el punto de vista terapéutico,
es interesante tener un producto en el que todas las isoformas
presentes en la orina estén disponibles. De este modo, los productos
altamente purificados aquí descritos proporcionan los papeles
diferenciales de las isoformas de gonadotropina de ocurrencia
natural en el mantenimiento de la función reproductiva.
Debe subrayarse también que la presente
solicitud es la primera caracterización de una preparación de
menotropinas altamente purificadas que se confirmó no sólo por su
alta potencia biológica sino también por procedimientos relevantes
de detección selectiva (electroforesis PAGE, HPLC, cromatografía de
exclusión molecular).
Al estar disponibles ahora en una calidad
purificada y a una gran escala, estas moléculas de FSH y LH de
origen natural pueden investigarse y analizarse detenidamente a
continuación. La estructura tridimensional de las hormonas puede
contribuir a una mejor comprensión acerca del papel de los
oligosacáridos.
El procedimiento para obtener menotropinas
producidas actualmente es bien conocido. Según se indica en el
documento BP-1.980, las menotropinas pueden
prepararse a partir de orina de mujeres posmenopaúsicas por
adsorción en caolín, posterior elución alcalina y precipitación con
2 volúmenes de acetona. La fracción requerida se extrae de este
precipitado con una solución de acetato de amonio en etanol al 70% y
a continuación se precipita con una solución de acetato de amonio
al 10% en etanol al 90%. El producto de menotropinas se obtiene por
cromatografía de intercambio iónico de este precipitado.
El material de partida, a partir de ahora el
"material fuente de HMG", que puede usarse en la presente
invención para obtener menotropinas altamente purificadas,
constituye la especialidad de las menotropinas, según se especifica
en las farmacopeas (USP XXIII, BP-1.993 anexo 1995;
EP-1.986) o cualquier otro material estrechamente
relacionado con esta especialidad. Por tanto, se entiende que este
procedimiento de preparación es aplicable también a otros
materiales que no cumplen estrictamente los requisitos aplicables a
las menotropinas. De hecho, se obtuvieron resultados satisfactorios
usando la Fracción C (ver descripción de la invención, ejemplo 1 y
ejemplo 2), que es un material que no cumple con el requisito de
proporción de menotropinas de FSH:LH (FSH:LH, 1:1,
aproximadamente). Además, la presente invención proporciona un
procedimiento para ajustar la proporción FSH:LH cuando se necesita,
siendo por tanto capaz de proporcionar especialidad de menotropinas
altamente purificadas incluso cuando se usan materiales de partida
que están fuera de la proporción FSH:LH correcta. Gracias a esto,
es posible obtener un producto compuesto por FSH y LH en la
proporción 1:1 apropiada necesaria para producir la preparación
farmacéutica, sin tener que separar los dos principios activos
durante la purificación. Es decir, realizar la copurificación de
las dos hormonas, desde un grado de pureza de aproximadamente el 5%
en el material de partida a más del 95% en el producto final con
una potencia final de 25 a 35 veces superior a la inicial. El grado
de purificación según se obtiene puede visualizarse en la fig. 1,
que muestra el resultado de electroforesis en gel de poliacrilamida
del producto farmacéutico convencional frente a la nueva versión
purificada obtenida de la aplicación de la presente invención.
Las etapas descritas en la presente invención
pueden usarse siguiendo un orden diferente al descrito en la
presente memoria descriptiva, que no implica variar la filosofía de
la invención. Se obtuvieron resultados igualmente satisfactorios
insertando la resina de interacción hidrófoba entre las dos etapas
de cromatografía de intercambio iónico descritas
posteriormente.
Esta invención proporciona también la
preparación de gonadotropinas urinarias por separado, es decir, FSH
y LH.
La administración de composiciones de
menotropinas para fines terapéuticos se ha efectuado principalmente
por inyección intramuscular. Esta forma de administración crea un
malestar considerable en el paciente y requiere del paciente
visitas regulares a unidades clínicas, a veces durante semanas o
meses para recibir el tratamiento.
La administración subcutánea haría posible la
autoadministración y, en consecuencia, mejoraría la cooperación y
ela disposición cumplimiento por del paciente.
La administración subcutánea de gonadotropinas
urinarias ya ha sido descrita (Nakamura Y., y col., Fertil Steril
51, 423-429, 1989; Engmann L. y col., Fertil Steril.
69, 836-840, 1998). La administración subcutánea de
preparaciones no puras puede sufrir el inconveniente de alergias
locales debidas a la presencia de impurezas en el producto usado y,
en consecuencia, dar como resultado la suspensión del tratamiento.
Por tanto, merece la pena producir productos de alta pureza que
pueden reducir la posibilidad de estas reacciones alérgicas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para preparar composiciones de FSH y/o LH de alta
actividad biológica a partir de orina humana en bruto de mujeres
menopaúsicas o posmenopaúsicas. La pureza química es superior al
95% medida por HPLC, mientras que la actividad específica biológica
es superior a 2.500 UI/mg de proteína de FSH y LH para menotropinas
y superior a 5.000 UI/mg para folitropina.
Las composiciones obtenidas de acuerdo con el
método objeto de la presente invención pueden comprender: cualquier
excipiente convencional tal como hexosas, manitol y sus mezclas, un
estabilizante seleccionado del grupo de albúmina, detergentes y sus
mezclas.
Las composiciones inyectables obtenidas están
sustacialmente libres de materiales contaminantes y pueden estar
adaptadas para la administración subcutánea.
Las composiciones de folitropina y/o menotropina
obtenidas de acuerdo con el método objeto de la invención pueden
ser usadas para preparar una preparación farmacéutica de alta
actividad biológica y pureza química que comprende o no, un
portador farmaceúticamente aceptable.
El procedimiento de separación y purificación de
gonadotropinas urinarias humanas de alta actividad biológica y
pureza química del producto en bruto de gonadotropinas, incluyendo
material fuente de HMG, absolutamente libre de materiales
contaminantes derivados del uso de reactivos biológicos o colorantes
de cromatografía comprende principalmente las etapas
siguientes:
1) purificación de dichas gonadotropinas en
bruto diluidas en acetato de amonio 0,05-0,15 M, pH
de 5,0 a 6,0, en una columna de intercambio iónico con una resina
catiónica fuerte del tipo de sulfopropilo, eluyendo FSH y LH con
soluciones de acetato de amonio 0,05-0,5 M, pH de
5,0 a 7,0; y
2) purificación de esta fracción diluida en
acetato de amonio 0,01-0,05 M, pH de 5,0 a 7,0 en
una columna de intercambio iónico con una resina aniónica fuierte
del tipo de amonio cuaternario, eluyendo con FSH y LH con
soluciones de acetato de amonio 0,05-0,2 M, pH de
5,0 a 7,0; y
3) purificación de gonadotropinas en una columna
con una resina de interacción hidrófoba por la adición secuencial
de al menos dos de las siguientes soluciones:
- a)
- tampón de fosfato de sodio 50-200 mM, y sulfato de amonio 0,8-1,2 M, pH de 5,0 a 6,0;
- b)
- tampón de fosfato de sodio 50-200 mM, y sulfato de amonio 0,4-0,6 M; pH de 5,0 a 7,0;
- c)
- tampón de fosfato de sodio 50-200 mM (del 50 al 70% v/v), y etanol al 96% (del 50 al 30% v/v) o insertando la resina de interacción hidrófoba entre las dos etapas de cromatografía de intercambio iónico.
En estas etapas pueden usarse resinas del tipo
de SP-Sefarosa, Q-Sefarosa y resinas
de interacción hidrófobas. Una resina de interacción hidrófoba
preferida es una resina de fenil-sefarosa.
El procedimiento de la invención comprende
además etapas secundarias de precipitación, centrifugado,
ultrafiltración, diálisis, lavado, secado al vacío y enfriamiento.
La última etapa de este procedimiento puede realizarse
selectivamente para obtener fracciones que tienen sólo actividades
de menotropinas, FSH o LH.
Una de las ventajas principales del
procedimiento de la presente invención es que el procedimiento no
incluye reactivos y sustratos biológicos y sustratos y que el
producto está libre de biomateriales que generan impurezas.
El material de partida usado en la presente
invención para producir menotropinas altamente purificadas y FSH
altamente purificada se obtiene esencialmente de un procedimiento
muy bien conocido que emplea caolín para adsorber gonadotropinas de
la orina menopáusica/posmenopaúsicas (documento
BP-1.980). Brevemente, la fracción bioactiva se
extrae de la orina acidificada con caolín, se eluye con álcali y se
precipita con 2 volúmenes de acetona. A continuación, la fracción
bioactiva se extrae de este precipitado con solución de acetato de
amonio al 10% p/v en etanol (70%) y se precipita con acetato de
amonio al 10% en etanol (90%). Se realiza mayor purificación por
cromatografía de intercambio iónico. El material purificado obtenido
por este procedimiento constituye la composición de menotropinas o
alguna otra preparación equivalente, como Fracción C.
Las menotropinas o equivalentes (Fracción C) se
cromatografían en una fuerte columna de intercambio catiónico
fuerte, con la fracción activa eluyéndose con un tampón de acetato
de amonio 0,2-0,5 M, pH de 5,0 a 7,0. Se obtiene un
nuevo precipitado (Fracción F) añadiendo 4 volúmenes de etanol. La
Fracción F se cromatografía en una fuerte columna de intercambio
aniónico, con la fracción activa eluyéndose con un tampón de acetato
de amonio 0,05-0,2 M, pH de 5,0 a 7,0. La fracción
activa se congela a -75ºC (Fracción G).
La Fracción G se analiza por un ensayo biológico
para determinar precisamente su contenido en FSH y LH. Dependiendo
de la proporción encontrada entre las dos hormonas, se adopta la
siguiente etapa cromatográfica, siendo posibles dos
alternativas:
1) copurificación de las dos hormonas;
2) separación de la actividad de la hormona que
está en exceso de manera que se obtienen una menotropinas con
proporción FSH/LH 1:1. Alternativamente, la separación de FSH y LH
proporciona las dos actividades por separado para fines
terapéuticos (FSH neta y LH neta).
Una vez determinadas las etapas que se van a
adoptar, la Fracción G se dializa y se concentra de manera que se
adapte a las necesidades de la siguiente etapa cromatográfica. La
solución resultante se cromatografía en una columna de interacción
hidrófoba, eluyendo las fracciones activas según dos procedimientos
alternativos que tienen en cuenta las opciones 1) y 2) anteriores.
Las fracciones líquidas que se obtienen (Fracción J2, J3, J4) se
congelan a -75ºC. Posteriormente, estas fracciones se descongelan,
dializan y concentran, se filtran través de una membrana de
esterilización y se precipitan añadiendo 4 volúmenes de etanol,
obteniendo un precipitado que se seca al vacío hasta sequedad
(Fracción K).
La fig. 1 representa un pase de electroforesis
del producto convencional (HMG) frente al nuevo producto de
menotropinas altamente purificadas (Fracción K_{M}).
La fig. 2 representa un pase PAGE
(Electroforesis en Gel de Poliacrilamida) de pase de menotropinas
altamente purificadas (Fracción K_{M}) a diferentes
concentraciones junto con los patrones de peso molecular.
La fig. 3 representa un pase PAGE de una FSH
altamente purificada (Fracción K_{F}) en diferentes
concentraciones junto con los patrones de peso molecular.
La fig. 4 representa un pase PAGE de: 1)
Gonal-F (Serono) 1 FSH UI/\mul, 2) Metrodine HP
(Serono) 3 FSH UI/\mul, 3) Menotropinas altamente purificadas
(Fracción K_{M}) 3,7 FSH UI/\mul y 4) Patrones de peso
molecular (desde arriba) 14.400 D, 20.100 D, 30.000 D, 43.000 D,
67.000 D y 94.000 D.
La fig. 5 representa un enfoque isoeléctrico en
3-10 PhastGels con tinción de plata, en el que: el
carril 1 corresponde a los Kits de Calibrado para Ancho
3-10 pI, el carril 2 corresponde a pI 4,55 patrón
(inhibidor de tripsina de soja), el carril 3 corresponde a pI 5,85
patrón (anhidrasa carbónica bovina B) y los carriles 4, 5 y 6
corresponden a producto de folitropina altamente purificada
(K_{F}) (3 lotes de producción diferentes).
La fig. 6 representa un enfoque isoeléctrico en
3-10 PhastGels con tinción de plata, en el que el
carril 1 corresponde a los Kits de Calibrado para Ancho
3-10 pI y el carril 2 corresponde a producto de
Menotropinas Altamente Purificadas (K_{M}).
La fig. 7 es el resultado obtenido por HPLC con
una muestra de Menotropinas Altamente Purificadas (Fracción
K_{M}).
La fig. 8 es el resultado obtenido por HPLC con
una muestra de FSH Altamente Purificada (Fracción K_{F}).
La fig. 9 es el resultado obtenido por HPLC con
una muestra de Gonal-F (Serono). (El máximo de
tiempo de retención 11,2 se corresponde con un excipiente de la
preparación farmacéutica), y
La fig. 10 es un diagrama de flujo del
procedimiento para obtener las gonadotropinas altamente purificadas
de la presente invención.
El diagrama de flujo para obtener gonadotropinas
altamente purificadas se muestra en la fig. 10.
A continuación se describirá la técnica de
elaboración de la Fracción K_{M} que constituye menotropinas
purificadas.
Se cromatografía la Fracción C en una columna
cromatográfica que contiene 10 litros de resina de intercambio
catiónico fuerte del tipo sulfopropilo.
La Fracción C (110 a 140 g) se disuelve en de
1.600 a 1.800 ml de una solución de acetato de amonio
0,05-0,15 M, pH de 5,0 a 7,0. La columna se pone en
marcha y se eluye con la cantidad necesaria de solución de acetato
de amonio 0,05-0,15 M para llevar el volumen a 20
litros. Se continúa con la elución con soluciones de acetato de
amonio 0,15-0,20 M, pH de 5,0 a 7,0 (20 litros) y
acetato de amonio 0,2-0,5 M, pH de 5,0 a 7,0 (20
litros). La fracción activa eluida con la última solución se añade
con agitación a 4 volúmenes de etanol al 96% y suficiente ácido
acético para alcanzar un pH de mezcla de 5,5 a 5,7. Se forma un
precipitado, se separa por centrifugado, se lava con etanol y se
seca al vacío hasta que se elimina el etanol y la humedad es
inferior al 5% (Fracción F).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se cromatografía la Fracción F en una columna
cromatográfica que contiene 4 litros de resina de intercambio
aniónico fuerte de tipo amonio cuaternario.
La Fracción F (40 a 60 g en 650 ml) se disuelve
en solución de acetato de amonio 0,01-0,05 M, pH de
5,0 a 7,0, la columna se pone en marcha y se eluye con la misma
solución para llevar el volumen a 7 litros. Se continúa la elución
con 12 litros de acetato de amonio 0,05-0,07 M, pH
de 5,0 a 7,0, a continuación con 10 litros de acetato de amonio
0,07-0,2 M, pH de 5,0 a 7,0. La fracción activa
eluida con la última solución se somete a un procedimiento de
ultrafiltración usando una membrana Ultrafilters PM 10 (10.000 D)
(Amicon-Millipore). La solución se concentra y se
dializa frente a tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH de 5,5 a 5,7 a
una concentración de 2 a 4 g de proteína en 100 a 150 ml de tampón.
A continuación se congela a -75ºC (Fracción G).
Se cromatografía la Fracción G en una columna
cromatográfica que contiene 400 ml de una resina de interacción
hidrófoba (Fenil Sefarosa HP, Amersham-Pharmacia
Biotech).
Se añade una cantidad suficiente de sulfato de
amonio a la solución de la Fracción G para obtener una concentración
de 0,8 a 1,2 M.
El procedimiento cromatográfico que se efectuará
permitirá la copurificación de FSH y LH o la separación de las dos
hormonas. El curso de acción dependerá de los análisis anteriores
realizados con la Fracción G (ensayos biológicos), a través del
cual se ha determinado la proporción FSH:LH. Una vez conocida esta
proporción, se eliminará la existencia de la hormona en exceso de
proporción FSH:LH 1:1.
d-1) Si se equilibra el producto
(FSH:LH 1:1), la cromatografía de la Fracción G concentrada y
dializada se realizará del modo siguiente:
- Se dispone la solución de la Fracción G en la
columna cromatográfica, 0,8-1,2 M en sulfato de
amonio.
- Se eluye con 2 volúmenes de tampón de fosfato
de sodio 50-200 mM, sulfato de amonio
0,8-1,2 M, pH de 5,0 a 7,0.
- Se continúa la elución con 2 volúmenes de
tampón de fosfato 50-200 mM (del 50 al 70% v/v) y
etanol al 96% (del 50 al 30% v/v).
La fracción activa eluida con el último tampón
(Fracción J4) se congela a -75ºC. Esta fracción tiene actividad de
FSH y LH.
d-2) Si la proporción FSH:LH de
la Fracción G es diferente de 1:1, la existencia de la hormona en
exceso se eliminará del modo siguiente:
- Se pone en marcha una parte alícuota de la
solución de la Fracción G en la columna cromatográfica.
0,8-1,2 M en sulfato de amonio.
- Se eluye con 2 volúmenes de tampón de fosfato
de sodio 50-200 mM, sulfato de amonio
0,8-1,2 M, pH de 5,0 a 7,0.
- Se continúa con la elución con 2 volúmenes de
tampón de fosfato de sodio 50-200 mM, sulfato de
amonio 0,4-0,6 M, pH de 5,0 a 7,0, y finalmente con
2 volúmenes de tampón de fosfato 50- 200 mM (del 50 al 70% v/v) y
etanol al 96% (del 50 al 30% v/v).
La fracción activa eluida con tampón de fosfato
de sodio 50-200 mM, sulfato de amonio
0,4-0,6 M (Fracción J2) se congela a -75ºC. Esta
fracción tiene principalmente actividad FSH.
La fracción activa eluida con tampón de fosfato
50-200 mM (del 50 al 70% v/v) y etanol al 96% (del
50 al 30% v/v) (Fracción J3) se congela a -75ºC. Esta fracción sólo
tiene actividad LH.
Las fracciones J2, J3, J4 se descongelan, se
dializan y se concentran usando ultrafiltración a través de una
membrana PM 10 (Diaflo Ultrafilters,
Amicon-Millipore) frente a tampón de fosfato de
sodio 50 mM, pH 5,7.
Cada solución resultante se filtra usando una
membrana de 0,45 \mu en las condiciones necesarias para obtener
un producto estéril, y a continuación se añade a 4 volúmenes de
etanol al 96% y suficiente ácido acético para obtener un pH de la
mezcla pH de 5,5 a 5,7. Se deja reposar la mezcla durante toda la
noche. Se separa el precipitado por centrifugado y se seca al vacío
hasta que se elimina el etanol y la humedad es inferior al 5%
(Fracción K).
Las propiedades de la Fracción K pueden variar
dependiendo de que la fracción de precipitado sea J2, J3 o J4. La
Fracción K_{M} obtenida de la Fracción J4 contendrá
aproximadamente unidades equivalentes de FSH y LH. La Fracción
K_{F} obtenida de la Fracción J2 comprenderá trazas de FSH y LH.
La Fracción K_{L} obtenida de la Fracción J3 comprenderá trazas
de LH y FSH.
Se dividieron 231,2 g de la Fracción C en dos
partes iguales y se cromatografió en dos procedimientos equivalentes
en una columna cromatográfica según se describe anteriormente.
Se disolvieron 115,6 g de la Fracción C (en cada
procedimiento) en 1.700 ml de tampón de acetato de amonio 0,05 M,
pH 5,0. Se puso en marcha la columna y se eluyó con 18,7 litros más
del mismo tampón cromatográfico. Se continuó con la elución con 20
litros de tampón de acetato de amonio 0,15 M, pH 5,0 y finalmente
con 20 litros de tampón de acetato de amonio 0,5 M, pH 5,0. La
fracción activa obtenida eluyendo con acetato de amonio 0,5 M (22
litros) se añadió con agitación a una solución de 88 litros de
etanol al 96% y 2.400 ml de ácido acético. El pH de la mezcla fue
de 5,7. El precipitado obtenido se dejó en el frigorífico (2 a 8ºC)
durante toda la noche. El precipitado se centrifugó, se lavó con
etanol al 96% y se secó al vacío durante 17 h.
En cada uno de los dos procedimientos
equivalentes, se obtuvieron dos Fracciones F de 20,7 g y 19,5 g,
respectivamente.
Se pusieron juntas las dos fracciones F
obtenidas en la etapa anterior y se cromatografió en columna según
la técnica descrita.
Se disolvieron 40,2 g de la Fracción F en 650 ml
de tampón de acetato de amonio 0,01 M, pH 5,0. Se puso en marcha la
columna con esta solución y se eluyó con 6.350 ml del mismo tampón
de dilución. A continuación se continuó con la elución con 12
litros de acetato de amonio 0,05 M, pH 5,0 y a continuación con 10
litros de acetato de amonio 0,2 M, pH 5,0. La fracción activa
(4.500 ml) eluida con la última solución se sometió a un
procedimiento de ultrafiltración usando una membrana PM 10 (10.000
D) Diaflo Ultrafilters (Amicon Millipore). La solución se
concentra y se dializa frente a fosfato de sodio 50 mM, pH 5,7 para
obtener una concentración de 2 a 4 g de proteína en 150 ml de
tampón. La solución final (400 ml) se congeló a -75ºC.
Se ensayó biológicamente la Fracción G en
animales detectando una potencia de FSH de 42.000 UI/ml y una
potencia de LH de 33.780 UI/ml. Con este resultado, se consideró
procesar una parte de la solución (80 ml) de la Fracción G en
condiciones para separar la FSH y la LH (fracciones J2 y J3,
respectivamente). El resto (320 ml) se cromatografió en condiciones
de manera que no se separaran ambas hormonas (fracción J4). A
continuación se mezclaron partes alícuotas de la Fracción J3 y la
Fracción J4 para obtener una proporción final FSH:LH de
aproximadamente 1:1 (fracción K_{M}).
Se añadió sulfato de amonio a una parte alícuota
de la Fracción G (80 ml) hasta una concentración 1 M. Esta solución
se puso en marcha en columna cromatográfica de
Fenil-Sefarosa HP y se eluyó con 2 volúmenes de
tampón, fosfato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 1 M, pH 5,1. Se
continuó con la elución con 2 volúmenes de tampón, fosfato de sodio
50 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 5,1, y finalmente con 2 volúmenes
de tampón de fosfato de sodio 50 mM (60% v/v) y etanol al 96% (40%
v/v).
Se dializó la fracción activa de FSH eluida con
tampón, fosfato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 5,1
(Fracción J2) y se concentró usando ultrafiltración con membrana PM
10 (Diaflo Ultrafilters, Amicon-Millipore), frente
a un tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 5,7, y a continuación se
congeló a -75ºC.
Se dializó la fracción activa de LH eluida con
tampón de fosfato de sodio 50 mM (60% v/v) y etanol al 96% (40%
v/v) (Fracción J3) y se concentró usando ultrafiltración con
membrana PM 10 (Diaflo Ultrafilters,
Amicon-Millipore), frente a un tampón de fosfato de
sodio 50 mM, pH 5,7, y a continuación se congeló a -75ºC.
Se descongeló una segunda parte alícuota de la
Fracción G (320 ml) y se añadió sulfato de amonio hasta que se
obtuvo una concentración 1 M. Esta solución se puso en marcha en una
columna cromatográfica de Fenil-Sefarosa HP y se
eluyó con 2 volúmenes de tampón fosfato de sodio 50 mM, sulfato de
amonio 1 M, pH 5,1. Se continuó la elución con 2 volúmenes de
fosfato 50 mM (60% v/v) y etanol al 96% (40% v/v). La fracción
eluida con este tampón (Fracción J4) se congeló a -75ºC.
Se descongelaron las Fracciones J3 (40 ml) y J4
(25 ml), se filtraron a través de una membrana de 0,45 \mu en
condiciones necesarias para obtener un producto estéril (volumen
final 100 ml), y a continuación se mezcló y se agitó con 4
volúmenes de etanol al 96% (400 ml) y ácido acético necesario para
alcanzar un pH 5,5 (1 ml).
La Fracción J2 (40 ml) se descongeló, se filtró
a través de una membrana de 0,45 \mu en condiciones necesarias
para obtener un producto estéril (volumen final 60 ml), y a
continuación se mezcló y se agitó con 4 volúmenes de etanol al 96%
(400 ml) y ácido acético necesario para alcanzar un pH 5,5 (0,5
ml).
Se dejaron precipitar las Fracciones en el
frigorífico durante toda la noche a entre 2 y 8ºC. A la mañana
siguiente, el precipitado de menotropinas altamente purificadas,
obtenido de la Fracción J3 y J4, se separó por centrifugado y se
secó al vacío hasta que se eliminó el etanol y la humedad fue
inferior al 5% (Fracción K_{M}, 4,50 g).
El precipitado de FSH altamente purificada
obtenido de la Fracción J2 se separó por centrifugado y se secó al
vacío hasta que se eliminó el etanol y la humedad fue inferior al 5%
(Fracción K_{F}, 0,55 g).
El análisis biológico realizado con Fracciones
K_{M} (menotropinas altamente purificadas) y K_{F} (FSH
altamente purificada) mostró los siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla de
rendimiento
Se dividieron 250,06 g de la Fracción C en dos
partes iguales y se cromatografió en dos procedimientos equivalentes
en una columna cromatográfica como la que se describió
anteriormente.
Se disolvieron 125,03 g de la Fracción C (en
cada procedimiento) en 1.700 ml de tampón de acetato de amonio 0,05
M, pH 5,1. A continuación, se puso en marcha la columna y se eluyó
con 18,7 litros más del mismo tampón cromatográfico. Se continuó la
elución con 20 litros de tampón de acetato de amonio 0,15 M, pH 5,1,
y finalmente con 20 litros de tampón de acetato de amonio 0,5 M, pH
5,1. La fracción activa obtenida por elución con acetato de amonio
0,5 M (22 litros) se añadió en agitación a 88 litros de etanol al
96% y 2.200 ml de ácido acético. El pH de la mezcla fue 5,7. Se
observó la aparición de un precipitado. La mezcla se dejó en el
frigorífico a entre 2 y 8ºC durante toda la noche. El precipitado
se centrifugó, se lavó con etanol al 96% y se secó al vacío durante
22 h.
En cada uno de los procedimientos equivalentes,
se obtuvieron respectivamente dos fracciones F de 21,57 g y 21,15
g.
Las dos fracciones obtenidas en la fase anterior
se pusieron juntas y se cromatografió en columna según el
procedimiento descrito anteriormente.
Se disolvieron 42,58 g de la Fracción F en 650
ml de tampón de acetato de amonio 0,01 M, pH 5,1. Esta solución se
puso en marcha en la columna y se eluyó con 6.350 ml de la misma
disolución tampón. Se continuó la elución con 12 litros de acetato
de amonio 0,05 M, pH 5,0, y a continuación con 10 litros de acetato
de amonio 0,2 M, pH 5. La fracción activa (4.500 ml) eluida con
esta última solución se sometió a un procedimiento de
ultrafiltración con una membrana PM 10 (10.000 D) (Diaflo
Ultrafilters, Amicon-Millipore). Se concentró la
solución y se dializó frente a un tampón de fosfato de sodio 50 mM,
pH 5,7, hasta que se obtuvo una concentración de 2 a 4 g de
proteína en 150 ml de tampón. El volumen final de 500 ml se congeló
a -75ºC.
Se probó biológicamente la fracción G en
animales, que mostró una potencia FSH de 49.790 UI/ml y una potencia
LH de 39.600 UI/ml. Con este análisis, se consideró necesario
procesar una parte de la solución (100 ml) de la Fracción G en
condiciones para separar FSH y LH (fracciones J2 y J3,
respectivamente) y el resto (400 ml) en condiciones de manera que
no se separen las dos hormonas (J4).
A continuación se mezclaron partes alícuotas de
la Fracción J3 y la Fracción J4 para obtener una proporción final
FSH:LH de aproximadamente 1:1 (Fracción K_{M}).
Se añadió sulfato de amonio a una parte alícuota
de la Fracción G (100 ml) hasta que se obtuvo una concentración 1
M. Esta solución se puso en marcha en la columna cromatográfica de
Fenil-Sefarosa HP y se eluyó con 2 volúmenes de
tampón fosfato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 1 M, pH 5,1. A
continuación se continuó la elución con 2 volúmenes de tampón
fosfato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 5,1, y
finalmente con 2 volúmenes de fosfato de sodio 50 mM (60% v/v) y
etanol al 96% (40% v/v).
Se dializó la fracción activa de FSH eluida con
tampón fosfato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 5,1
(Fracción J2), se concentró usando ultrafiltración por membrana con
membrana PM 10 (Diaflo Ultrafilters,
Amicon-Millipore), frente a un tampón de fosfato de
sodio 50 mM, pH 5,7, y a continuación se congeló a -75ºC.
Se dializó la fracción activa de LH eluida con
tampón de fosfato de sodio 50 mM (60% v/v) y etanol al 96% (40%
v/v) (Fracción J3), se concentró usando ultrafiltración por membrana
con una membrana PM 10 (Diaflo Ultrafilters, Amicon- Millipore),
frente a un tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 5,7, y a
continuación se congeló a -75ºC.
A una segunda parte alícuota de la Fracción G
(400 ml) se añadió sulfato de amonio hasta que se obtuvo una
concentración 1 M. La solución se puso en marcha en columna
cromatográfica de Fenil-Sefarosa HP y se eluyó con
2 volúmenes de tampón fosfato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 1 M,
pH 5,1. Se continuó la elución con 2 volúmenes más de tampón de
fosfato 50 mM (60% v/v) y etanol al 96% (40% v/v). La fracción
activa eluida con este tampón (Fracción J4) se congeló a -75ºC.
\newpage
Se descongelaron las Fracciones J3 (50 ml) y J4
(30 ml), se filtró a través de una membrana de 0,45 \mu en
condiciones necesarias para obtener un producto estéril (volumen
final 110 ml), y a continuación se añadieron en agitación a 4
volúmenes de etanol al 96% (440 ml) y suficiente ácido acético para
alcanzar un pH 5,5 (1 ml).
Se descongeló la Fracción J2 (50 ml), se filtró
a través de una membrana de 0,45 \mu en condiciones necesarias
para obtener un producto estéril (volumen final 70 ml), y a
continuación se añadió en agitación a 4 volúmenes de etanol al 96%
(280 ml) y suficiente ácido acético para alcanzar un pH 5,5 (0,5
ml).
Se dejaron precipitar las fracciones en el
frigorífico durante toda la noche a entre 2 y 8ºC. A la mañana
siguiente, las menotropinas altamente purificadas precipitadas,
obtenidas de las Fracciones J3 y J4, se separaron por centrifugado
y se secaron al vacío hasta que se eliminó el etanol y la humedad
fue inferior al 5% (Fracción K_{M}, 5,71 g).
La FSH altamente purificada precipitada,
obtenida de la Fracción J2, se separó por centrifugado, se secó al
vacío hasta que se eliminó el etanol y humedad fue inferior al 5%
(Fracción K_{F}, 0,70 g).
El análisis biológico realizado con Fracciones
K_{M} (menotropinas altamente purificadas) y K_{F} (FSH
altamente purificada) mostró los siguientes resultados:
También se obtuvieron productos altamente
purificados usando el procedimiento de la presente invención
empezando por los materiales menos activos. En este caso, se obtuvo
una FSH de aproximadamente 5.000 UI/mg de proteína y menotropinas
de una potencia de aproximadamente 2.500 UI/mg de proteína para FSH
y para LH.
Las Fracciones K_{M} y K_{F} se
caracterizaron por las siguientes técnicas:
2.7.a) Electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE)
2.7.b) Electroforesis en gel de poliacrilamida
seguido por análisis de transferencia Western
2.7.c) Isoelectroenfoque
2.7.d) Cromatografía por exclusión de tamaño
(SEC) en HPLC
2.7.e) Medida de contenido en proteínas
2.7.f) Dosificación de potencia biológica en
animales (informada previamente)
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones K_{M} y K_{F} se analizaron
por electroforesis según el siguiente procedimiento:
Equipo: Sistema de electroforesis en gel de
poliacrilamida ultrafino, PhastSystem (Amersham Pharmacia
Biotech).
Geles: Phast Gel gradiente 8-25
(Amersham Pharmacia Biotech).
Tampón: Tiras de tampón/SDS (Amersham Pharmacia
Biotech).
Técnica de separación: Archivo 110, PhastSystem,
SDS-PAGE
Técnica de revelado: Archivo 200, PhastSystem
para azul brillante de Coomassie.
Sondas de bajo peso molecular: Kit de calibrado
electroforético que contiene 6 proteínas purificadas (Amersham
Pharmacia Biotech).
Peso molecular
- Fosforilasa b 94.000 D
- Albúmina 67.000 D
- Ovoalbúmina 43.000 D
- Anhidrasa carbónica 30.000 D
- Inhibidor de tripsina 20.100 D
- \alpha-lactalbúmina 14.400 D
Cada vial de kit contiene una mezcla liofilizada
con aproximadamente 100 \mug de cada proteína. Cada vial se
disolvió con 100 \muL de tampón de muestra.
Se disolvieron 250 mg de SDS y 0,5 ml de
\beta-mercaptoetanol en 10 ml de tampón A.
- Tampón A:
- EDTA 1 mM 372 mg
- \quad
- TRIS 10 mM 1,21 mg
- \quad
- H_{2}O q. s. t. 1.000 ml
- \quad
- pH 8,0
Las muestras se disolvieron de manera que la
concentración final fue de 1.100 a 1.300 UI/ml de FSH de tampón de
muestra.
La muestra se calentó a 100ºC durante 5 minutos.
Se añadió bromofenol azul hasta que se obtuvo una concentración del
0,01%.
Después de del pase de electroforesis y el
revelado, se secaron los geles con aire caliente.
Los pases de electroforesis de las Fracciones
K_{M} (fig. nº 2) y K_{F} (fig. nº 3) dieron como resultado un
perfil en el que se observa de un modo casi exclusivamente una
singular banda desarrollada con Azul Brillante de Coomassie con una
distancia de migración a medio camino de los patrones de peso
molecular 20.100 D y 30.000 D, lo que indica un peso molecular
aproximado de 25.000 D.
| Patrón 20.100 D | 0,196 |
| Fracciones K_{M}-K_{F} | 0,250 |
| Patrón 30.000 | 0,300 |
La asignación de la banda observada en la
electroforesis de las Fracciones K_{F} y K_{M} se realizó por
dos vías:
a) por comparación con 2 productos comerciales
que contienen FSH como el único ingrediente activo:
Gonal-F (Serono) que contiene FSH de origen
recombinante, Metrodine HP (Serono) que contiene FSH de origen
urinario (ver Figura 4).
b) Por
electroforesis-transferencia Western según se indicó
en 2.7.b).
Las muestras de las fracciones K_{M} y K_{F}
se analizaron por transferencia Western. Después de realizar un
procedimiento de electroforesis de poliacrilamida similar al
descrito en 2.7.a), las bandas se transfirieron a un soporte de
nitrocelulosa y se desarrollaron por acción de anticuerpos. Se
usaron anticuerpos específicos para la cadena
\beta-FSH, la cadena \beta-LH y
frente a la cadena \alpha de las dos hormonas.
- Técnica: Se usó la técnica de transferencia nº
221 por el PhastSystem (Amersham Pharmacia Biotech), empleando el
siguiente tampón de transferencia:
Tampón de transferencia: Tris 25 mM, Glicina 192
mM, pH 8,3, que contiene metanol al 20%.
Membrana: Probind 45, poro 0,45 \mum.
Condiciones de transferencia : 25 V, 25 mA, 1 W,
45 min.
Teñido con azul de Coomassie:
Solución de tinción: solución al 0,1% de Phast
Gel Blue R en metanol al 30% y ácido acético al 10% en agua
destilada.
Solución final: Se mezcla 1 parte de la solución
de tinción con 1 parte de ácido acético al 20% en agua
destilada.
Procedimiento: Se colorea la membrana en la
solución final durante 30 minutos con agitación suave. Se lava la
membrana con solución de metanol:agua:ácido acético (30:60:10) dos
veces y a continuación con ácido acético al 20%.
- Procedimiento de detección: Se usó el
procedimiento de detección por
estreptavidina-biotina.
Tampón usado: PBS (fosfato de sodio 0,01 M,
cloruro de sodio 0,25 M, pH 7,6).
Solución de bloqueo: Albúmina al 5% en PBS.
Solución de lavado: a) Albúmina al 5% en PBS, b)
PBS.
- Solución de anticuerpos primarios: Se usaron
los siguientes anticuerpos primarios.
1) anticuerpo monoclonal anti
\beta-LH (Immunotech) (IgG1 1 - ratones), Catálogo
nº 0374.
2) anticuerpo monoclonal anti
\beta-FSLH (Immunotech) (IgG1 1 - ratones),
Catálogo nº 0373.
3) anticuerpo monoclonal frente a subunidad
\alpha de hormonas pituitarias (Immunotech) (IgG1 - ratones),
Catálogo nº 0375.
- Dilución: se diluye el anticuerpo primario a
1:100.
- Solución de anticuerpos secundarios: El
anticuerpo secundario usado fue: Biotina-SP-
conjugada AffiniPure F(ab')_{2} Fragmento Cabra Antirratón
IgG (H+L), (cadena pesada y cadena ligera). (Immunotech, Cat. nº
0816) diluida a 1:500 en PBS.
- Solución de estreptavidina conjugada con
peroxidasa: Se usó una dilución 1:500 en PBS de estreptavidina
conjugada con peroxidasa (Immunotech, Cat. nº 0309).
- Solución de revelado: Se usó kit de sustrato
de conjugado de peroxidasa de rábano (Bio Rad, Cat nº
170-6431), que contenía una mezcla de solución de
agua oxigenada, 4-cloro-1- naftol y
tampón para revelar el color, para preparar 1 litro de
solución.
- Breve descripción del procedimiento:
1) incubar la membrana con solución de bloqueo
durante toda la noche.
2) lavar con solución de lavado a) dos veces
durante 5 min cada vez.
3) incubar con solución de anticuerpos primarios
durante toda la noche.
4) lavar con solución de lavado a) tres veces
durante 5 minutos cada vez.
5) incubar con anticuerpo secundario durante 1
hora.
6) lavar con solución de lavado a) tres veces
durante 5 minutos cada vez.
7) incubar con peroxidasa conjugada durante 30
minutos.
8) lavar con solución de lavado a) tres veces
durante 5 minutos cada vez.
9) incubar con solución de revelado durante 10
minutos.
10) parar la reacción.
Después de realizar la electroforesis en gel de
poliacrilamida de las Fracciones K_{M} y K_{F}, se transfirieron
las bandas a membranas de nitrocelulosa según la técnica comunicada
anteriormente, y se reveló. Se encontraron los siguientes
resultados.
En vista de estos resultados, se concluye que la
banda revelada con Azul de Coomassie en la electroforesis de la
Fracción K_{M} tiene actividades FSH y LH. A su vez, la fracción
K_{F} sólo reaccionó positivamente frente al anticuerpo
específico para FSH, y no para LH. Dado que las cadenas \alpha de
la FSH y LH son comunes, ambas fracciones K_{M} y K_{F}
mostraron una reacción positiva con un anticuerpo frente a la cadena
\alpha.
Se analizaron las Fracciones K_{M} (FSH
altamente purificada) y K_{F} (FSH altamente purificada) por
isoelectroenfoque según el siguiente procedimiento:
Equipo: Sistema de Electroforesis en Gel de
Poliacrilamida Ultrafino, PhastSystem (Amersham Pharmacia
Biotech).
Geles: Phast Gel IEF 3-9
(Amersham Pharmacia Biotech).
Técnica de separación: Archivo 100,
PhastSystem.
Técnica de revelado: Silver Kit (Amersham
Pharmacia Biotech).
Patrones PI: Kit de calibrado IEF; Kit pI Ancho
3-10 (Amersham Pharmacia Biotech). Inhibidor de
tripsina de soja, pI 5,85(Sigma). Anhidrasa carbónica
bovina, pI 4,55 (Sigma).
Se disolvieron muestras para tener una
concentración de 2,5 mg/ml a 1,25 mg/ml.
Después de del pase de electroforesis y el
revelado, se secaron los geles con aire caliente.
La distribución de pI para la K_{F} (FSH
altamente purificada) y la K_{M} (menotropinas altamente
purificadas) se muestra en la fig. 5 y la fig. 6. El carácter ácido
de las gonadotropinas se confirma por medio del patrón IEF. De
hecho, tal como se describe completamente en la bibliografía, las
isoformas se restringen al intervalo ácido.
Descripción del equipo:
- Aparato de cromatografía líquida de alto
rendimiento Shimadzu, LC-10AVP, con inyector manual
7725i, con sensor de posición y bucle de 20, 50 ó 200 \muL,
Rheodyne.
- Detector de espectrofotómetro visible en el
UV, modelo SPD-10AVP, Shimadzu
(190-600 nm).
- Estación de trabajo para procesar datos
cromatográficos Shimadzu Clase-CR 10, programa Clase
CR10 y módulo CBM-101.
- Columna cromatográfica
Bio-Rad. Bio-Sil^{TM} SEC250 (300
x 7,5 mm).
- Fase móvil: tampón de acetato de sodio 0,1 M,
pH 7,0, desgasificado y filtrado.
- Flujo: 1,0 ml/min.
Detección: UV a 220 nm.
Temperatura de columna: temperatura ambiente
Volumen de inyección: 50 a 200 \muL.
Preparación de muestra: inyectar aproximadamente
1 ml de la fase móvil en el vial que contiene la muestra, agitar
hasta disolución.
Los siguientes cromatogramas de las Fracciones
K_{M} y K_{F} muestran la presencia de sólo un pico en un
tiempo de retención de aproximadamente 8,1 a 8,2 seg. El tiempo de
retención coincide con el obtenido por cromatografía de un producto
comercial, Gonal-F (Serono), que contiene FSH
recombinante. (Ver fig. 7, 8 y 9).
Procedimiento: El procedimiento de Lowry
[Journal of Biological Chemistry 193, 265(1951)] con un
reactivo de Folin-Ciocalteu, y una curva patrón de
albúmina.
Resultados: El porcentaje de proteínas para las
dos fracciones K_{M} y K_{F} indicadas en los ejemplos 1 y 2
fue del 77% aproximadamente.
Según se comunicó anteriormente en la sección
2.5, las fracciones K_{M} y K_{F} se analizaron biológicamente
en ratas.
Se usó el procedimiento de
Steelman-Pohley [Steelman, S.L. & Pohley, F.M.,
Endocrinology 53, 604 (1953)] de aumento de peso ovárico en ratas
hembra inmaduras de 21 a 24 días de vida, se les inyectaron tres
dosis de un producto que contenía FSH. Las dosis deberían mantener
una proporción tal que la diferencia entre los logaritmos de la
dosis mayor y la dosis media sea igual a la diferencia entre los
logaritmos de la dosis media y la dosis menor. Se usaron lotes de
animales en los que la diferencia de peso entre el más pesado y el
más ligero era no superior a 10 gramos. Los animales fueron
inyectados por vía subcutánea durante tres días con tres dosis
diferentes de la muestra disueltas en tampón de fosfato/albúmina y
las dosis correspondientes de un patrón. En el quinto día se
sacrificaron los animales, se extrajeron los ovarios y se pesaron.
Se compararon los datos obtenidos con la muestra con los datos
obtenidos con el patrón y se calculó la potencia de las diferentes
muestras usando el esquema estadístico indicado para el análisis de
una muestra frente a un patrón en una prueba 3 x 3 (ver Análisis
biológico de USP XXIII).
Se usó el procedimiento de aumento de peso de la
vesícula seminal en ratas macho inmaduras de 21 a 24 días de vida a
las que se inyectaron tres dosis de un producto que contenía LH. Las
tres dosis deberían mantener una proporción tal que la diferencia
entre los logaritmos de la dosis mayor y la dosis media sea igual a
la diferencia entre los logaritmos de la dosis media y la dosis
menor. Se usaron lotes de animales en los que la diferencia de peso
entre el animal más pesado y el más ligero era no superior a 10
gramos. Se inyectó a los animales por vía subcutánea durante cuatro
días con tres dosis diferentes de la muestra disueltas en tampón de
fosfato/albúmina y las dosis correspondientes de un patrón. En el
quinto día se sacrificaron los animales, se extrajeron las
vesículas seminales y se pesaron. Se compararon los datos obtenidos
con la muestra con los datos obtenidos con el patrón y se calculó
la potencia de las diferentes muestras usando el esquema estadístico
indicado para el análisis de una muestra frente a un patrón en una
prueba 3 x 3 (ver Análisis biológico de USP XXIII).
El patrón usado era una muestra de Menotropinas
calibradas según el 3^{er} patrón internacional de FSH y LH
urinarias preparado por el NIBSC (Instituto Nacional de Patrones y
Control Biológico - Gran Bretaña) dependiente de la OMS
(Organización Mundial de la Salud).
Menotropinas inyectables altamente purificadas,
especialmente.
Excipientes que pueden ser usados en la
composición son lactosa, manitol y sus mezclas. También pueden ser
usados otros excipientes convencionales.
En la presente invención la lactosa se usó como
excipiente en la preparación iyectable.
El pH de la preparación puede corregirse a un
valor en el rango de 6,0 - 7,0 por adición de ácidos o bases (ácido
fosfórico u otros y fosfato de sodio u otros).
Se usaron viales de 3 ml de vidrio de
borosilicato tipo I con tapones de bromobutilo como recipientes.
La cantidad calculada de menotropinas de alta
pureza (con un 10% de sobrerellenado) se disuelve en 500 ml de agua
para inyección. Por otro lado, 100 gr de lactosa se disuelven en 4
litros de agua para inyección. Se mezclan ambas disoluciones, se
ajusta el pH, si es necesario mediante la adición de un ácido o una
base, la solución resultante se completa hasta 5.000 ml y
esteriliza mediante filtración a través de una membrana de 0,2\mu.
Los viales se rellenan con la solución preparada (1 ml) y se cargan
en un liofilizador estéril a una temperatura de -40ºC durante al
menos 8 h. La liofilización empieza a 3ºC/h hasta una temperatura de
+30ºC, que se mantiene hasta el final del ciclo.
El presente ejemplo se aplica de manera similar
a las preparaciones de folitropina altamente purificadas.
Claims (9)
1. Un procedimiento de purificación de
gonadotropinas urinarias humanas de alta actividad biológica y
pureza química absolutamente libres de materiales extraños
contaminantes obtenidas del uso de reactivos biológicos o
colorantes de cromatografía, a partir de gonadotropinas en bruto,
que comprende las siguientes etapas:
1) purificación de dichas gonadotropinas en
bruto diluidas en acetato de amonio 0,05-0,15 M, pH
de 5,0 a 6,0, en una columna de intercambio iónico con una resina
catiónica fuerte del tipo de sulfopropilo, eluyendo FSH y LH con
soluciones de acetato de amonio 0,05-0,5 M, pH de
5,0 a 7,0; y
2) purificación de esta fracción diluida en
acetato de amonio 0,01-0,05 M, pH de 5,0 a 7,0 en
una columna de intercambio iónico con una resina aniónica fuerte
del tipo de amonio cuaternario, eluyendo FSH y LH con soluciones de
acetato de amonio 0,05-0,2 M, pH de 5,0 a 7,0; y
3) purificación de gonadotropinas en una columna
con una resina de interacción hidrófoba por la adición secuencial
de al menos dos de las siguientes soluciones:
- a)
- tampón de fosfato de sodio 50-200 mM y sulfato de amonio 0,8-1,2 M, pH de 5,0 a 6,0;
- b)
- tampón de fosfato de sodio 50-200 mM, y sulfato de amonio 0,4-0,6 M; pH de 5,0 a 7,0;
- c)
- tampón de fosfato de sodio 50-200 mM (del 50 al 70% v/v) y etanol al 96% (del 50 al 30% v/v), o inserción de la resina de interacción hidrófoba entre las dos etapas de cromatografía de intercambio iónico.
2. El procedimiento de purificación de la
reivindicación 1 en el que la resina catiónica fuerte de la etapa
1) es una resina SP-Sefarosa.
3. El procedimiento de purificación de la
reivindicación 1 en el que la resina aniónica fuerte de la etapa 2)
es una resina Q-Sefarosa.
4. El procedimiento de purificación de la
reivindicación 1 en el que la resina de interacción hidrófoba de la
etapa 3) es una resina Fenil-Sefarosa.
5. El procedimiento de purificación de la
reivindicación 1, en el que la gonadotropina de FSH se eluye con
solución b; y la gonadotropina de LH se eluye con solución c, en la
secuencia de adición a, b, c de la etapa 3.
6. El procedimiento de purificación de la
reivindicación 1, en el que si la proporción de gonadotropina de
FSH:LH es aproximadamente similar a 1:1, las gonadotropinas se
eluyen con solución c, en una secuencia ordenada de adición a, c de
la etapa 3.
7. El procedimiento de purificación de la
reivindicación 1, en el que si la proporción de gonadotropina de
FSH:LH es diferente de 1:1, el procedimiento comprende además la
adición de FSH de gonadotropina eluida con solución b, o la adición
de LH de gonadotropina eluida con solución c, en una secuencia
ordenada de adición a, b, c de la etapa 3, hasta la proporción
1:1.
8. El procedimiento de purificación de la
reivindicación 1, en el que dichas gonadotropinas en bruto se
obtienen de la orina de mujeres menopaúsicas y/o
posmenopaúsicas.
9. El procedimiento de purificación de la
reivindicación 1, en el que dichas gonadotropinas en bruto tienen
una actividad de FSH superior a 40 UI/mg y un actividad de LH
superior a 40 UI/mg.
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