ES2284770T3 - Proteina estimulante de disociacion de gdp, proteina de ensamblaje de nucleosoma especifica de cerebro, enzima conjugante de ubiquitina especifica de musculo esqueletico, proteina de proliferacion celular, fosfatidilinositolquinasa, proteinas relacionadas con nel. - Google Patents
Proteina estimulante de disociacion de gdp, proteina de ensamblaje de nucleosoma especifica de cerebro, enzima conjugante de ubiquitina especifica de musculo esqueletico, proteina de proliferacion celular, fosfatidilinositolquinasa, proteinas relacionadas con nel. Download PDFInfo
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Abstract
Nuevo gen humano NPIK que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC. ID. nº: 28.
Description
Proteína estimulante de la disociación de GDP,
proteína de ensamblaje de nucleosoma específica de cerebro, enzima
conjugante de ubiquitina específica de músculo esquelético, proteína
de proliferación celular, fosfatidilinositolquinasa, proteínas
relacionadas con NEL.
La presente invención se refiere a un gen útil
como indicador en la profilaxis, el diagnóstico y el tratamiento de
enfermedades en seres humanos. Más particularmente, se refiere a un
nuevo gen humano análogo al de la rata, ratón, levadura, nematodo y
a genes humanos conocidos, entre otros, y utilizable, tras el
análisis del ADNc del mismo, a la cartografía de los cromosomas del
ADNc y al análisis funcional del ADNc, en el diagnóstico génico que
utiliza dicho gen y en el desarrollo de un nuevo procedimiento
terapéutico.
La información genética de un ser vivo se ha
acumulado en secuencias (ADN) de cuatro bases, a saber A, C, G y T,
que existen en los núcleos celulares. Dicha información genética ha
sido conservada para la conservación de la estirpe y la ontogenia
de cada ser vivo.
En el caso del ser humano, el número de dichas
bases se dice que es de aproximadamente 3 billones (3 \times
10^{9}) y supuestamente existen 50 a 100 mil genes en las mismas.
Dicha información genética sirve para mantener los fenómenos
biológicos en estas proteínas reguladoras, las proteínas y enzimas
estructurales se producen por dicha vía de modo que el ARNm se
transcribe desde un gen (ADN) y se traduce a continuación en una
proteína. Las anomalías en dicha ruta desde el gen a la traducción
en proteína se consideran que son causantes de anomalías de los
sistemas que soportan la vida, por ejemplo en la proliferación y
diferenciación celular, por consiguiente causantes de varias
enfermedades.
Como resultado del análisis génico realizado
hasta el presente, se ha descubierto un número de genes que puede
esperarse que sirvan como materiales útiles en el desarrollo de
fármacos, por ejemplo los genes para varios receptores tales como
el receptor de insulina y el receptor de LDL, los genes implicados
en la proliferación y diferenciación celular y los genes para las
enzimas metabólicas tales como las proteasas, ATPasa y las
superóxido dismutasas.
Sin embargo, el análisis de los genes humanos y
los estudios de las funciones de los genes analizados y de las
relaciones entre los genes analizados y varias enfermedades acaba de
empezar y quedan muchos puntos desconocidos. Además el análisis de
nuevos genes, el análisis de las funciones de los mismos, los
estudios de las relaciones entre los genes analizados y las
enfermedades y los estudios para aplicar los genes analizados al
diagnóstico génico o con fines medicinales, por ejemplo, se desean
por consiguiente en la técnica relacionada.
Si dicho nuevo gen humano mencionado
anteriormente puede proporcionarse, será posible analizar el nivel
de expresión del mismo en cada célula y la estructura y función del
mismo y, mediante la expresión del análisis del producto y otros
estudios, será posible descubrir la patogénesis de una enfermedad
asociada al mismo, por ejemplo una genopatía o cáncer, o por
ejemplo, diagnosticar y tratar dicha enfermedad. Un objetivo de la
presente invención consiste en proporcionar dicho nuevo gen
humano.
Para alcanzar el objetivo anterior, los
presentes inventores realizaron intensas investigaciones y
obtuvieron los descubrimientos mencionados a continuación.
Basándose en éstos, se ha concluido actualmente la presente
invención.
De esta manera, los presentes inventores
sintetizaron los ADNc basándose en los ARNm extraídos de varios
tejidos, inclusive del cerebro fetal humano, de los vasos
sanguíneos y placentas de adultos, construyeron bancos insertándoles
en vectores, permitiendo que las colonias de Escherichia
coli se transformen con dichos bancos para formar un medio de
agar-agar, seleccionaron colonias al azar y las
transfirieron a microplacas de 96 pocillos y registraron un gran
número de clones de E. coli que contenían el gen humano.
Cada clon así registrado se cultivó en un tamaño
pequeño, se extrajo y purificó el ADN, las reacciones de ampliación
de la terminación de las cuatro bases específicamente, se realizaron
por el procedimiento del terminador de la cadena didesoxi
utilizando el ADN extraído como plantilla, y en la secuencia de
bases del gen se determinaron más de aproximadamente 400 bases de
su terminal 5' utilizando el secuenciador de ADN automático.
Basándose en la información de la secuencia de bases así obtenida,
se buscó un nuevo gen de la familia análogo a los genes conocidos
de las especies animales y vegetales tales como bacterias,
levaduras, nemátodos, ratones y seres humanos.
El procedimiento de análisis de ADNc mencionado
anteriormente está descrito con detalle en la bibliografía por
Fujiwara, uno de los presentes inventores [Fujiwara, Tsutomu, Saibo
Kogaku (Cell Engineering), 14, 645-654
(1995)].
Entre este grupo, existen nuevos receptores,
factores de regulación de la transcripción que contienen el dominio
de unión al ADN, factores del sistema de transmisión de señal,
enzimas metabólicas y etcétera. Basándose en la homología del nuevo
gen de la presente invención obtenido mediante análisis génico con
los genes análogos a éste, el producto del gen, por consiguiente la
función de la proteína, puede estimarse aproximadamente por
analogía. Además, funciones tales como la actividad enzimática y la
capacidad de unión pueden investigarse insertando el gen
experimental en un vector de expresión para dar un recombinante.
Según la presente invención, se proporciona un
nuevo gen humano caracterizado porque contiene una codificación de
la secuencia nucleotídica para una secuencia de aminoácidos definida
por la SEC. ID. nº: 28, nº: 31, un gen humano caracterizado porque
contiene la secuencia nucleotídica definida por las SEC. ID. nº: 29,
nº: 32, respectivamente que codifica la secuencia de aminoácidos
mencionada anteriormente, y un nuevo gen humano caracterizado por
la secuencia nucleotídica definida por las SEC. ID. nº: 30, nº:
33.
Los símbolos utilizados en la presente memoria
para indicar aminoácidos, péptidos, nucleótidos, secuencias
nucleotídicas y así sucesivamente son las recomendadas por la IUPAC
y la IUB o en "Guideline for drafting specifications etc.,
including nucleotide sequences or amino acid sequences"(editado
por la oficina de patentes japonesa), o las de uso convencional en
el campo relacionado de la técnica.
Como ejemplos específicos de dicho gen de la
presente invención, pueden mencionarse los genes deducibles de las
secuencias de ADN del clon denominado
"GEN-428B12", mostrado a continuación en la
presente memoria en los Ejemplos 1 a 11. Las secuencias
nucleotídicas respectivas se presentan en el listado de
secuencias.
Estos clones presentan un marco de lectura
abierto que comprende nucleótidos (ácido nucleico) codificando
respectivamente los aminoácidos presentados en el listado de
secuencia. Sus pesos moleculares se calcularon en los valores
presentados a continuación en la presente memoria en los respectivos
ejemplos. En adelante, estos genes humanos se denominan a veces por
la denominación utilizada en los Ejemplos 1, 2 y 9.
En los párrafos siguientes, se describe con
mayor detalle el gen humano de la presente invención.
Como se mencionó anteriormente, cada gen humano
de la presente invención es análogo al de la rata, el ratón, la
levadura, el nematodo y a los genes humanos conocidos, entre otros,
y puede utilizarse en el análisis génico humano basándose en la
información sobre los genes análogos a éste y para estudiar la
función del gen analizado y la relación entre el gen analizado y
una enfermedad. Es posible utilizar dicho gen en el diagnóstico
génico de la enfermedad asociada a éste y en el aprovechamiento de
los estudios de dicho gen con fines medicinales.
El gen de la presente invención se representa
desde el punto de vista de la secuencia del ADN monocatenario, como
se muestra en la SEC. ID. nº: 29. Es de destacar, sin embargo, que
la presente invención comprende asimismo una secuencia de ADN
complementaria a dicha secuencia de ADN monocatenario y a un
componente que comprende a ambas. El gen de la presente invención
no se limita a ésta, pero desde luego puede tener una secuencia de
ADN en la que los codones se seleccionen de manera arbitraria y se
combinen con los restos de aminoácidos respectivos. La selección
del codón puede hacerse de manera convencional, por ejemplo teniendo
en cuenta las frecuencias de utilización del codón en el hospedador
que ha de utilizarse [Nucl. Acids Res., 9,
43-74 (1981)].
El gen de la presente invención incluye además
secuencias de ADN que codifican equivalentes funcionales procedentes
de la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente por
sustitución, deleción o adición parcial de aminoácidos o de la
secuencia de aminoácidos. Estos polipéptidos pueden producirse por
modificación espontánea (mutación) o pueden obtenerse por
modificación tras la traducción o por modificación del gen natural
(de la presente invención) mediante una técnica de ingeniería
genética, por ejemplo por mutagénesis específica para el sitio
[Methods in Enzymology, 154, pág. 350,
367-382 (1987); ibid., 100, pág. 468
(1983); Nucleic Acids Research, 12, pág. 9441 (1984);
Zoku Seikagaku Jikken Koza (Sequel to Experiments in Biochemistry)
1, "Idensi Kenkyu-ho (Methods in Gene Research)
II", editado por la Japan Biochemical Society, pág. 105 (1986)] o
sintetizando los ADN del mutante por una técnica química de
síntesis tal como el procedimiento del fosfotriéster o el
procedimiento de la fosfoamidita [J. Am. Chem. Soc.,
89, pág. 4.801 (1967); ibid., 91, pág. 3.350
(1969); Science, 150, pág. 178 (1968); Tetrahedron
Lett., 22,
pág. 1859 (1981); ibid., 24, pág. 245 (1983)] o utilizando las técnicas mencionadas anteriormente en la combinación.
pág. 1859 (1981); ibid., 24, pág. 245 (1983)] o utilizando las técnicas mencionadas anteriormente en la combinación.
La proteína codificada por el gen de la presente
invención puede expresarse de manera fácil y estable utilizando
dicho gen, por ejemplo insertándolo en un vector para su utilización
en un microorganismo y cultivando el microorganismo transformado de
esta manera.
La proteína obtenida utilizando el gen de la
presente invención puede utilizarse en la producción del anticuerpo
específico. En este caso, la proteína que puede producirse en
grandes cantidades mediante la técnica de ingeniería genética
mencionada anteriormente puede utilizarse como componente que sirve
como antígeno. El anticuerpo obtenido puede ser policlonal o
monoclonal y puede utilizarse de manera ventajosa en la
purificación, análisis, discriminación o identificación de la
proteína correspondiente.
El gen de la presente invención puede producirse
fácilmente basándose en la información de la secuencia del mismo
dada a conocer en la presente memoria utilizando las técnicas de
ingeniería genética generales [véase p. ej. Molecular
Cloning, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);
Zoku Seikagaku Jikken Koza, "Idenshi Kenkyu-ho I,
II y III", editada por la Japan Biochemical Society (1986)].
Esto puede conseguirse, por ejemplo,
seleccionando un clon deseado de entre un banco de ADNc humano
(preparado de forma convencional a partir de las células apropiadas
de origen en las que se expresa el gen) utilizando una sonda o
anticuerpo específico para el gen de la presente invención [p. ej.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6.613 (1981);
Science, 222, 778 (1983)].
Las células originales que han de utilizarse en
el procedimiento anterior son, por ejemplo, células o tejidos en
los que se expresa el gen en cuestión, o células cultivadas
procedentes de éstos. La separación el ARN completo, la separación
y purificación del ARNm, la conversión en (síntesis de) ADNc, la
clonación de los mismos y así sucesivamente pueden realizarse por
procedimientos convencionales. Los bancos de ADNc están también
comercialmente disponibles y dichos bancos de ADNc, por ejemplo
varios bancos de ADNc disponibles en Clontech Lab. Inc. pueden
utilizarse también en el procedimiento anterior.
El cribado del gen de la presente invención en
estos bancos de ADNc puede realizarse por el procedimiento
convencional mencionado anteriormente. Estos procedimientos de
cribado incluyen, por ejemplo, el procedimiento que comprende
seleccionar un clon de ADNc por cribado inmunológico utilizando un
anticuerpo específico para la proteína producido por el ADNc
correspondiente, la técnica de hibridación en placa o de colonias
que utiliza sondas que se unen selectivamente a la secuencia de ADN
deseada o una combinación de éstos. En cuanto a la sonda que ha de
utilizarse en la presente memoria, se utiliza generalmente una
secuencia de ADN sintetizada químicamente basándose en la
información sobre de la secuencia de ADN de la presente invención.
Desde luego es posible utilizar el gen de la presente invención o
fragmentos del mismo como sonda.
Además, un cebador transcrito y un cebador
complementario diseñado basándose en la información acerca de la
secuencia de aminoácidos parcial de un extracto natural aislado y
purificado a partir de las células o de un tejido pueden utilizarse
como sondas para el cribado.
Para obtener el gen de la presente invención,
puede utilizarse de manera adecuada la técnica de ampliación de
ADN/ARN por el procedimiento de la PCR [Science, 230,
1350-1354 (1984)]. Particularmente cuando el ADNc
completo puede difícilmente obtenerse a partir del banco, se utiliza
preferentemente el procedimiento RACE (ampliación rápida de los
extremos del ADNc; Jikken Igaku (Experimental Medicine), 12
(6), 35-38 (1994)], en particular el procedimiento
5'RACE [Frohman, M. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 85, 8998-9002 (1988)]. Los
cebadores que han de utilizarse en dicho procedimiento de PCR pueden
diseñarse de manera apropiada basándose en la información de la
secuencia del gen de la presente invención como se da a conocer en
la presente memoria y puede sintetizarse por un procedimiento
convencional.
El fragmento ampliado de ADN/ARN puede aislarse
y purificarse por un procedimiento convencional mencionado
anteriormente, por ejemplo por electroforesis en gel.
La secuencia nucleotídica del gen de la presente
invención obtenido de este modo o de cualquiera de los varios
fragmentos de ADN puede determinarse por un procedimiento
convencionalmente, por ejemplo el procedimiento didesoxi [Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467
(1977)] o por el procedimiento de Maxam-Gilbert
[Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)]. Dicha
determinación de la secuencia nucleotídica puede realizarse
fácilmente utilizando un kit de secuencia también comercialmente
disponible.
Cuando se utiliza el gen de la presente
invención y se siguen técnicas convencionales de tecnología de ADN
recombinante [véase p. ej. Science, 224, pág. 1431
(1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, pág. 692
(1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, pág. 5990
(1983) y las referencias citadas anteriormente], puede obtenerse
una proteína recombinante. Con mayor detalle, dicha proteína puede
producirse construyendo un ADN recombinante que permite que se
exprese el gen de la presente invención en células huésped, con su
introducción en las células huésped para la transformación de las
mismas y cultivando el transformante resultante.
En este caso, las células huésped pueden ser
eucarióticas o procarióticas. Las células eucarióticas incluyen
células de vertebrado, células de levadura y así sucesivamente, y
las células de vertebrado incluyen, pero no se limitan a, células
de simio denominadas células COS [Cell, 23,
175-182 (1981)], células de ovario de hámster chino
y una estirpe celular insuficiente en dihidrofolato reductasa
procedente de éstas [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,
4216-4220 (1980)] y similares, que se utilizan
frecuentemente.
En cuanto al vector de expresión que ha de
utilizarse con las células de vertebrado, pueden utilizarse
generalmente un vector de expresión que presenta un activador
situado corriente arriba del gen que ha de expresarse, puntos de
corte y empalme del ARN, una secuencia de poliadenilación y una
secuencia de terminación de la transcripción. Éste puede presentar
además un origen de replicación si es necesario. Como ejemplo de
dicho vector de expresión, puede mencionarse pSV2dhfr [Mol.
Cell. Biol., 1, 854 (1981)], que tiene el activador
precoz SV40. Como para los microorganismos eucarióticos, se
utilizan general y frecuentemente levaduras y, entre ellas, pueden
utilizarse de manera ventajosa las levaduras del género
Saccharomyces. En cuanto al vector de expresión para su
utilización con dichas levaduras y otros microorganismos
eucarióticos, puede utilizarse pAM82 [Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 80, 1-5 (1983)], que tiene el
activador del gen de la fosfatasa ácida, por ejemplo.
Además, un vector fusionado al gen procariótico
puede utilizarse preferentemente como vector de expresión para el
gen de la presente invención. Como ejemplos específicos de dicho
vector, pueden mencionarse pGEX-2TK y
pGEX-4T-2 que tienen un dominio GST
(procedente de de S. japonicum) con un peso molecular de
26.000.
Escherichia coli y Bacillus
subtilis se utilizan general y preferentemente como hospedadores
procarióticos. Cuando se utilizan éstas como hospedadores en la
puesta en práctica de la presente invención, se utiliza
preferentemente un plásmido de expresión procedente de un vector
plásmido capaz de replicarse en dichos organismos huésped y se
proporciona en este vector con un activador y la secuencia SD (Shine
y Dalgarno) corriente arriba de dicho gen para permitir la
expresión del gen de la presente invención y se proporciona además
con un codón de iniciación (p. ej. ATG) necesario para la
iniciación de la síntesis de proteínas. La cepa K12 de
Escherichia coli, entre otras, se utiliza preferentemente
como Escherichia coli huésped y pBR322 y los vectores
modificados procedentes de ésta se utilizan general y
preferentemente como vector, aunque pueden también utilizarse
varias cepas y vectores conocidos. Ejemplos del activador que puede
utilizarse son el activador de triptófano (trp), el activador 1lpp,
el activador lac y el activador de PL/PR.
El ADN recombinante obtenido de esta manera
puede introducirse en las células huésped para su transformación
utilizando varios procedimientos generales. El transformante
obtenido puede cultivarse por un procedimiento convencional y el
cultivo conduce a la expresión y a la producción de la proteína
deseada codificada por el gen de la presente invención. El medio
que ha de utilizarse en dicho cultivo puede seleccionarse de manera
apropiada de entre varios medios en la utilización convencional
según las células huésped empleadas. Las células huésped pueden
cultivarse en las condiciones adecuadas para el desarrollo de las
mismas.
De la manera anterior, la proteína recombinante
deseada se expresa y produce y acumula o se segrega en las células
transformantes o extracelularmente o en la membrana celular.
La proteína recombinante puede separarse y
purificarse como se desea por varios procedimientos de separación
utilizando sus propiedades físicas, químicas y otras [véase, p. ej.
"Seikagaku (Biochemistry) Data Book II", páginas
1.175-1.259, 1ª edición, 1ª impresión, publicada el
23 de junio de 1980 por Tokio Kagaku Dojin; Biochemistry,
25, (25), 8274-8277 (1986); Eur. J.
Biochem., 163, 313-321 (1987)].
Específicamente, dichos procedimientos incluyen, entre otros, el
tratamiento ordinario de reconstrucción, el tratamiento con un
agente precipitante de proteínas (salado), centrifugación,
tratamiento por choque osmótico, tratamiento por ultrasonidos,
ultrafiltración, varias técnicas de cromatografía líquida tales
como la cromatografía en tamices moleculares (filtración en gel),
la cromatografía por adsorción, la cromatografía de intercambio
iónico, la cromatografía por afinidad y la cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC), diálisis y combinaciones de las mismas.
Entre ellas, se prefiere particularmente la cromatografía por
afinidad que utiliza una columna con la proteína deseada unida a
ésta.
Además, basándose en la información de la
secuencia acerca del gen de la presente invención puesto de
manifiesto por la presente invención, por ejemplo utilizando parte
o la totalidad de dicho gen, es posible detectar la expresión del
gen de la presente invención en varios tejidos humanos. Esto puede
realizarse por un método convencional, por ejemplo por ampliación
por ARN por RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa
transcrita a la inversa) [Kawasaki, E. S., et al.,
Amplification of RNA, en PCR Protocol, A guide to methods and
applications, Academic Press, Inc., San Diego,
21-27 (1991)], o mediante análisis de transferencia
Northern [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
(1989)], con buenos resultados.
Los cebadores que han de utilizarse al emplear
el procedimiento de PCR mencionado anteriormente no se limitan a
ninguno en particular con la condición de que sean específicos para
el gen de la presente invención y permitan al gen de la presente
invención solo ser ampliado específicamente. Pueden diseñarse o
seleccionarse de manera apropiada basándose en la información
génica proporcionada por la presente invención. Pueden presentar una
secuencia parcial que comprende aproximadamente entre 20 y 30
nucleótidos según la práctica demostrada. Ejemplos adecuados son
los mostrados en los Ejemplos.
De esta manera, la presente invención
proporciona asimismo cebadores y/o sondas útiles para detectar
específicamente dicho nuevo gen.
Utilizando el nuevo gen proporcionado por la
presente invención, es posible detectar la expresión de dicho gen
en varios tejidos, analizar la estructura y función del mismo y,
además, producir la proteína humana codificada por dicho gen de la
manera de la ingeniería genética. Esto permite analizar el producto
de la expresión, poner de manifiesto la patología de una enfermedad
asociada a éste, por ejemplo una genopatía o cáncer, y diagnosticar
y tratar la enfermedad.
Los siguientes dibujos hacen referencia a los
ejemplos.
La Fig. 1 presenta el resultado obtenido
analizando la actividad de PI4 cinasa de NPIK en el Ejemplo 9. La
Fig. 2 presenta el efecto de Triton X-100 y de
adenosina sobre la actividad de NPIK.
Los ejemplos siguientes ilustran con mayor
detalle la presente invención.
Únicamente los antecedentes técnicos del Ejemplo
9. Gen estimulante de la disociación de GDP (no forma parte de la
invención)
Los ARNm extraídos de los tejidos del cerebro
fetal humano, de los vasos sanguíneos y de la placenta de adultos
se adquirieron en Clontech y se utilizaron como materiales de
partida.
Se sintetizó ADNc a partir de cada ARNm y se
insertó en el vector \lambdaZAPII (Stratagene) para construir de
esta manera un banco de ADNc (Otsuka GEN Research Institute, Otsuka
Pharmaceutical Co., Ltd.).
Pudieron formarse colonias de Escherichia
coli que contienen el gen humano en medio
agar-agar por la técnica de escisión in vivo
[Short, J. M., et al., Nucleic Acids Res., 16,
7583-7600 (1988)]. Se seleccionaron colonias al
azar y se registraron los clones de Escherichia coli que
contienen el gen humano en microplacas de 96 pocillos. Los clones
registrados se almacenaron a -80ºC.
Cada uno de los clones registrados se cultivó
durante la noche en 1,5 ml de medio LB, y se extrajo el ADN y se
purificó utilizando un extractor de plásmidos automático modelo
PI-100 (Kurabo). El ARN de Escherichia coli
contaminante se descompuso y se eliminó por tratamiento con RNasa.
Se disolvió el ADN hasta un volumen final de 30 \mul. Se utilizó
una parte de 2 \mul para comprobar aproximadamente el tamaño y
cantidad de ADN utilizando un minigel, se utilizaron 7 \mul para
las reacciones de secuenciado y la parte restante (21 \mul) se
almacenó como ADN plásmido a 4ºC.
Este procedimiento, tras ligeros cambios en el
programa, permite la extracción del cósmido, que es útil también
como sonda para FISH (hibridación in situ por fluorescencia)
presentado a continuación en los ejemplos.
A continuación se realizó, el método del
terminador didesoxi de Sanger et al. [Sanger, F., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74,
5463-5467 (1977)] utilizando T3, T7 o un cebador
oligonucleotídico sintético o el método de la secuencia del ciclo
[Carothers, A. M., et al., Bio. Techniques, 7,
494-499 (1989)] que comprende el procedimiento del
terminador de la cadena didesoxi más el procedimiento PCR. Estos son
los procedimientos de terminación de la reacción de ampliación
específicamente para las cuatro bases utilizando una pequeña
cantidad de ADN plásmido (aproximadamente 0,1 a 0,5 \mug) como
plantilla.
Los cebadores de la secuencia utilizados fueron
los marcados con FITC (isotiocianato de fluoresceína). Generalmente,
se realizaron aproximadamente 25 ciclos de reacción utilizando Taq
polimerasa. Se separaron los productos de la PCR en un gel de
poliacrilamida urea y los fragmentos de ADN marcador por
fluorescencia se sometieron a un secuenciador automático de ADN
(secuenciador de ADN ALF^{TM}; Pharmacia) para determinar la
secuencia de aproximadamente 400 bases a partir del lado del
terminal 5' del ADNc.
Dado que la zona 3' sin traducción tiene una
heterogeneidad muy alta para cada gen y por lo tanto es adecuada
para discriminar cada uno de los genes entre sí, se realizó el
secuenciado también en el lado 3' dependiendo de la situación.
La enorme suma de información de la secuencia
nucleotídica obtenida en el secuenciador de ADN se transfirió a un
ordenador DEC 3400 de 64 bits para análisis de homología en el
ordenador. En el análisis de homología, se utilizó una base de
datos (GenBank, EMBL) para búsqueda según el programa UMGCG FASTA
[Pearson, W. R. y Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85, 2444-2448 (1988)].
Como resultado de la selección arbitraria por el
procedimiento anterior y del análisis de la secuencia del ADNc, se
descubrió que un clon denominado GEN-501D08 y que
tiene una inserción de 0,8 kilobases presenta un alto nivel de
homología con la zona del terminal C del gen (RalGDS) estimulante de
la disociación del nucleótido guanina Ral humano. Dado que RalGDS
se considera que desempeña una determinada función en la serie de
reacciones de la transmisión de señal, se continuó determinando la
secuencia nucleotídica completa de la parte de la inserción del
ADNc que proporciona el homólogo humano.
La expresión del ARNm de la proteína RalGDS en
los tejidos humanos normales fue evaluada por transferencia
Northern utilizando, como sonda, el clon de ADNc humano marcado por
el método de cebado de oligonucleótidos al azar.
Se realizó el análisis por transferencia
Northern con una transferencia MTN humana (transferencia Northern
del tejido múltiple humano; Clontech, Palo Alto, CA, USA) según el
protocolo del fabricante.
De esta manera, el producto de la ampliación por
PCR del clon GEN-501D08 se marcó con
[^{32}P]-dCTP (kit de marcado de ADN cebado al
azar, Boehringer-Mannheim) para su utilización como
sonda.
Para la transferencia, se realizó la hibridación
durante la noche a 42ºC en una solución que comprende formamida al
50%/5 \times SSC/50 \times solución de Denhardt/SDS al 0,1% (que
contenía 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado). Después de lavar con dos fracciones de 2 \times
SSC/SDS al 0,01% a temperatura ambiente, el filtro de membrana se
continuó lavando tres veces con 0,1 \times SSC/SDS al 0,5% a 50ºC
durante 40 minutos. Se expuso una película de rayos X (Kodak) al
filtro a -70ºC durante 18 horas.
Como resultado, se descubrió que se había
expresado un transcrito de 900 bp en todos los tejidos humanos
probados. Además, se observó un transcrito de 3,2 kb
específicamente en el corazón y el músculo esquelético. La expresión
de estos transcritos que difieren en tamaño puede ser debida al
corte y empalme alternativo o a la hibridación cruzada con genes
homólogos.
Se realizó la FISH cribando un banco de
cromosomas humanos clonados en el vector pWE15 del cósmido
utilizando, como sonda, la inserción de 0,8 kb del clon del ADNc
[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, 2ª ed.,
págs. 3.1-3.58, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, Nueva York (1989)].
Se realizó la FISH para la asignación de
cromosomas por el procedimiento de Inazawa et al., que
comprende la comparación del modelo de tinción cromosómica en
bandas G para su confirmación [Inazawa, J., et al.,
Genomics, 17, 153-162 (1993)].
Para su utilización como sonda, el ADN cósmido
(0,5 \mug) obtenido del cribado de cromosomas y correspondiente a
GEN-501D08 se marcó con
biotina-16-dUTP mediante traducción
de la muesca.
Para eliminar el ruido de fondo debido a las
secuencias repetitivas, se añadieron 0,5 \mul de ADN (10 mg/ml)
de placenta humana sometido a ultrasonidos a 9,5 \mul de la
solución de la sonda. La mezcla se desnaturalizó a 80ºC durante 5
minutos y se mezcló con un volumen igual de 4 x SSC que contenía
dextransulfato al 20%. A continuación, se siembra una extensión
desnaturalizada con la mezcla de hibridación y, después de cubrir
con parafina, se incuba en una cámara húmeda a 37ºC durante 16 a 18
horas. Después de lavar con formamida al 50%/2 \times SSC a 37ºC
durante 15 minutos, la extensión se lavó con 2 x SSC durante 15
minutos y además con 1 \times SSC durante 15 minutos.
Se incubó a continuación la extensión en 4
\times SSC enriquecida con "1% Block Ace" (marca registrada;
Dainippon Pharmaceutical) que contenía avidina-FITC
(5 \mug/ml) a 37ºC durante 40 minutos. A continuación, se lavó la
extensión con 4 \times SSC durante 10 minutos y con 4 \times SSC
que contenía Triton X-100 al 0,05% durante 10
minutos y se sumergió en una solución de PPD antidecolorante
[preparada ajustando 100 mg de PPD (nº 164-015321
del catálogo de Wako) y 10 ml de PBS(-) (pH 7,4) a pH 8,0 con tampón
Na_{2}CO_{3} 0,5 M/NaHCO_{3} 0,5 M (9:1, v/v) (pH 9,0) y
añadiendo glicerol hasta hacer un volumen total de 100 ml] que
contiene DABCO al 1% [DABCO al 1% (Sigma) en PBS(-):glicerol 1:9
(v:v)], seguido de tinción de contador con DAPI
(4,6-diamino-2-fenilindol;
Sigma).
Con más de 100 células probadas en la metafase,
se observó una señal de hibridación específica en la banda de
cromosomas en 6p21.3, sin ninguna señal en los demás cromosomas. Se
confirmó así que el gen RalGDS está situado en el cromosoma
6p21.3.
(Únicamente a título
ilustrativo)
Se utilizó la técnica de 5' RACE [Frohman, M.
A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,
8998-9002 (1988)]. Un clon de ADNc que contenía la
fracción 5' del gen de la presente invención se aisló para el
análisis por la técnica 5' RACE utilizando un kit comercial
(5'-Rapid AmpliFinder RACE kit, Clontech) según el
protocolo del fabricante con modificaciones mínimas, de la forma
siguiente.
El cebador P1 y el cebador P2 específicos para
el gen, utilizados en la presente memoria se sintetizaron por el
procedimiento convencional y sus secuencias nucleotídicas se
presentan a continuación en la Tabla 1. El cebador de anclaje
utilizado fue el adjunto al kit comercial.
Se obtuvo el ADNc por transcripción inversa de
0,1 \mug de poli(A) + ARN de cerebro de feto humano por la
técnica del hexámero al azar utilizando transcriptasa inversa
(Superscript^{TM} II, Life Technologies) y el ADNc fue ampliado
por la primera PCR utilizando el cebador P1 y el cebador de anclaje
según Watanabe et al. [Watanabe, T., et al., Cell
Genet., en imprenta).
De esta manera, a 0,1 \mug del ADNc mencionado
anteriormente se añadieron Dntp 2,5 mM/1 \times tampón Taq
(Takara Shuzo)/0,2 mM de cebador P1, cebador adaptador
0,2 mM/0,25 unidades de enzima ExTaq (Takara Shuzo) para componer
un volumen total de 50 \mul, seguido de adición del cebador de
anclaje. La mezcla se sometió a PCR. De esta manera, se realizaron
35 ciclos de ampliación en las condiciones siguientes: 94ºC durante
45 segundos, 60ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 2 minutos. Por
último, se calentó la mezcla a 72ºC durante 5 minutos.
A continuación, 1 \mul de los 50 \mul de
producto de la primera PCR fue sometido a ampliación por la segunda
PCR utilizando el cebador P2 anidado específico y el cebador de
anclaje. El producto de la segunda PCR fue analizado por
electroforesis en 1,5% de gel de agarosa.
En la electroforesis en gel de agarosa, se
detectó una sola banda, de aproximadamente 650 nucleótidos de
tamaño. El producto de esta banda se insertó en un vector
(Pt7Blue®T-Vector, Novagen) y se seleccionaron
numerosos clones con una inserción de tamaño apropiado.
Seis de los clones de 5' RACE obtenidos del
producto por PCR presentaban la misma secuencia pero tenían
diferentes longitudes. Se determinaron por secuenciado dos clones
del ADNc de solapamiento, GEN-080G01 y
GEN-080G0149, la secuencia de codificación de la
proteína y las secuencias flanqueadoras 5' y 3', en total 1.015
nucleótidos.
Siguiendo los procedimientos del Ejemplo 1, se
seleccionaron de forma arbitraria clones de ADNc de un banco de
ADNc de cerebro de feto humano y se sometieron a análisis
secuencial, y se realizaron búsquedas en la base de datos. Como
resultado, se obtuvieron dos clones de ADNc muy homólogos al gen que
codifica una secuencia de aminoácidos conservada en las
fosfatidilinositol 3 y 4 cinasas [Kunz, J., et al.,
Cell, 73, 585-596 (1993)]. Éstos se
denominaron GEN-428B12c1 y
GEN-428B12c2 y se determinaron las secuencias
completas de éstos como en los ejemplos anteriores.
Como resultado, se descubrió que el clon de ADNc
GEN-428B12c1 y el clon GEN-428B12c2
tienen secuencias de codificación que se diferencian en 12 restos
de aminoácidos en el terminal 5', siendo el clon del ADNc
GEN-428B12c1 12 restos de aminoácido más largo.
La secuencia de ADNc del
GEN-428B12c1 del gen NPIK humano contenía un marco
de lectura abierto de 2.487 nucleótidos, como se presenta en la
SEC. ID. nº: 32, que codifica una secuencia de aminoácidos que
comprende 829 restos de aminoácido, como se muestra en la SEC. ID.
nº: 31. La secuencia de nucleótidos del clon del ADNc completo
comprendía 3.324 nucleótidos como se presenta en la SEC. ID. nº:
33.
El codón de iniciación estimado estaba situado,
según se muestra en la SEC. ID. nº: 33, en los nucleótidos nº 115 a
nº 117 correspondientes al segundo triplete ATG del clon del ADNc.
El codón de terminación estaba situado en los nucleótidos nº 2.602
a nº 2.604 y la señal de poliadenilación (AATAAA) en el nº 3.305 a
nº 3.310.
Por otra parte, la secuencia de ADNc del
GEN-428B12c2 del gen NPIK humano contenía un marco
de lectura abierto de 2.451 nucleótidos, como se muestra en la SEC.
ID. nº: 29. La secuencia de aminoácidos codificada por éste
comprendía 817 restos de aminoácido, como se muestra en la SEC. ID.
nº: 28. La secuencia de nucleótidos del clon del ADNc completo
comprendía 3.602 nucleótidos como se muestra en la SEC. ID. nº:
30.
El codón de iniciación estimado estaba situado,
según se muestra en la SEC. ID. nº: 30, en los nucleótidos nº 429 a
nº 431 correspondientes al 7º triplete ATG del clon del ADNc. El
codón de terminación estaba situado en los nucleótidos nº 2.880 a
nº 2.882 y la señal de poliadenilación (AATAAA) en los nº 3.583 a nº
3.588.
Se realizó el análisis por transferencia
Northern como se describe en el Ejemplo 1 (2). De este modo, se
amplió por PCR la secuencia completa del NPIK humano, se purificó
el producto de PCR y se marcó con [^{32}P]-dCTP
(kit de marcado del ADN cebado al azar, Boehringer Mannheim), y se
examinó la expresión en los tejidos normales humanos del ARNm del
NPIK humano utilizando la membrana de transferencia MTN con el
producto marcado como sonda.
Como resultado, se observó la expresión del gen
NPIK humano en 16 tejidos de adulto humano examinados y en un
transcrito de aproximadamente 3,8 kb y pudo detectarse uno de
aproximadamente 5 kb.
Utilizando el cebador A que tiene la secuencia
nucleotídica mostrada a continuación en la Tabla 2 y que contiene
el codón de iniciación del ADNc de GEN-428B12c2 y el
cebador B presentado en la Tabla 2 y que contiene el codón de
terminación, se realizó la PCR con ADNc
Marathon-Ready de cerebro de feto humano (Clontech)
como plantilla, y se determinó la secuencia nucleotídica del
producto de PCR.
Como resultado, se observó que el ARNm del NPIK
humano expresado incluía una carencia de los nucleótidos nº 1.060 a
nº 1.104 de la secuencia del ADNc GEN-428B12c1 (SEC.
ID. nº: 33) (aminoácidos nº 316 a nº 330 de la secuencia de
aminoácidos en la SEC. ID. nº: 31) y una carencia de los nucleótidos
nº 1.897 a nº 1.911 de la secuencia del ADNc
GEN-428B12c1 (SEC. ID. nº: 33) (aminoácidos nº 595 a
nº 599 de la secuencia de aminoácidos en la SEC. ID. nº: 31).
Se puso de manifiesto además que existía
polimorfismo en este gen (428B12c1.fasta) como se muestra a
continuación en la Tabla 3, en la zona de las bases nº 1.941 a nº
1.966 de la secuencia del ADNc GEN-428B12c1 mostrada
en la SEC. ID. nº: 33, mediante la cual una proteína mutante que se
codificó procedía de la mutación de IQDSCEITT (restos de
aminoácidos nº 610 a nº 618 en la secuencia de aminoácidos (SEC. ID.
nº: 31) codificada por GEN-428B12c1) en
YKILVISA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la cartografía cromosómica del gen
humano NPIK por FISH como se describe en el Ejemplo 1 (3).
Como resultado, se observó que el locus del gen
humano NPIK está en la posición 1q21.1-q21.3 del
cromosoma.
El gen humano NPIK, nuevo gen humano, de la
presente invención incluía dos ADNc que se diferencian en la zona
5' y son capaces de codificar los restos de aminoácido 829 y 817,
mencionados anteriormente. A la vista de esto y además a la vista
de los descubrimientos de que el ARNm correspondiente a este gen
incluye dos secuencias eliminables y que se produce polimorfismo en
una zona específica correspondiente a los restos de aminoácido nº
610 a nº 618 de la secuencia de aminoácidos
GEN-428B12c1 (SEC. ID. nº: 31), mediante la cual se
codifica la proteína mutante, es concebible que el NPIK humano
incluya especies procedentes de un determinado número de
combinaciones, a saber el NPIK humano, el NPIK humano que contiene
la deleción, el NPIK humano mutante y/o el NPIK humano mutante que
contiene la deleción.
Recientemente, varias proteínas que pertenecen a
la familia incluyendo las PI3 y 4 cinasas mencionadas
anteriormente presentan actividad de proteína cinasa [Dhand, R.,
et al., EMBO J., 13, 522-533
(1994); Stack, J. H. y Emr, S. D., J. Biol. Chem.,
269, 31552-31562 (1994); Hartley, K. O.,
et al., Cell, 82, 848-856
(1995)].
Se puso de manifiesto también que una proteína
que pertenece a esta familia está implicada en la reparación del
ADN [Hartley, K. O., et al., Cell, 82,
849-856 (1995)] y es un gen causal de ataxia
[Savitsky, K., et al., Science, 268,
1749-1753 (1995)].
Puede preveerse que la proteína codificada por
el gen humano NPIK muy homóloga a la familia de estas PI cinasas es
una nueva enzima que fosforila lípidos o proteínas.
Según este ejemplo, se proporciona el nuevo gen
NPIK humano. La utilización de dicho gen permite detectar la
expresión de dicho gen en varios tejidos y la preparación de la
proteína NPIK humana mediante la tecnología de ingeniería genética
y, mediante éstas será posible estudiar las enzimas de fosforilación
del lípido o proteína tales como las mencionadas anteriormente,
estudiar la reparación del ADN, estudiar o diagnosticar enfermedades
en las que éstas están implicadas, por ejemplo el cáncer e
identificar y evaluar fármacos para el tratamiento o la prevención
de las mismas.
Para subclonar la zona de codificación de un gen
humano NPIK (GEN-428B12c2), en primer lugar, dos
cebadores, C1 y C2, que tienen las secuencias mostradas a
continuación en la Tabla 4 se formaron basándose en la información
de las secuencias del ADN obtenidas anteriormente en (1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ambos cebadores C1 y C2 tienen un sitio
BglII, y el cebador C2 es un cebador complementario.
Utilizando estos dos cebadores, el ADNc
procedente del ARNm del cerebro del feto humano se amplió por PCR
para proporcionar un producto que tiene una longitud de
aproximadamente 2.500 bases. El ADN ampliado se precipitó en etanol
y se insertó en el vector pT7BlueT (producto de Novagen) y se
completó la subclonación. Se determinó la secuencia completa de la
misma manera que anteriormente en los Ejemplos. Como resultado se
puso de manifiesto que este gen presentaba el polimorfismo mostrado
anteriormente en la Tabla 3.
El ADNc anterior fue escindido por BglII
y se sometió a electroforesis en gel de agarosa. A continuación el
ADNc se escindió del gel de agarosa y se recogió utilizando
GENECLEAN II KIT (producto de Bio 101). Se insertó el ADNc en el
vector pBlueBacHis2B (producto de Invitrogen) en el sitio de
escisión BglII y se completó la subclonación.
El vector de fusión obtenido de esta manera
presentaba un sitio de escisión BglII y era un vector de
expresión para una proteína de expresión del producto génico
contemplado (aproximadamente 91 kd) y 38 aminoácidos procedentes
del vector pBlueBacHis2B y que contenía una zona de polihistidina y
un epítopo que reconoce el anticuerpo
Anti-Xpress^{TM} (producto de Invitrogen).
El gen NPIK humano se expresó según el sistema
de expresión de Baculovirus. El Baculovirus es un virus patógeno de
insecto bicatenario cíclico y puede producir grandes cantidades de
cuerpos de inclusión denominados polihedrinas en células de
insectos. Utilizando el kit de transfección
Bac-N-Blue^{TM} que utiliza esta
característica del Baculovirus y desarrollado por Invitrogen, se
llevó a cabo la expresión del Baculovirus.
Dicho de manera más específica, 4 \mug de
pBlueBacHis2B que contiene la zona del gen NPIK humano y 1 \mug
de ADN Bac-N-Blue^{TM} (producto
de Invitrogen) se cotransfectaron en células Sf-9 en
presencia de liposomas de Insectina^{TM} (producto de
Invitrogen).
Antes de la cotransfección, se incorporó el gen
LacZ en el ADN Bac-N-Blue^{TM}; de
modo que LacZ se expresaría solamente una vez tenga lugar la
recombinación homóloga entre el ADN
Bac-N-Blue^{TM} y pBlueBacHis2B.
De este modo cuando las células Sf-9
cotransfectadas se incuben en medio de agar-agar,
las placas del virus que expresan el gen contemplado se detectarán
fácilmente como placas azules.
Las placas azules se escindieron de cada medio
agar-agar y se suspendieron en 400 \mul
de medio para dispersar el virus en éstas. La suspensión se sometió
a centrifugación para dar un sobrenadante que contenía el virus. Se
infectaron Sf-9 con el virus otra vez para aumentar
el título y obtener una gran cantidad de solución del virus
infeccioso.
La expresión del gen NPIK humano contemplado se
confirmó tres días después de la infección con el virus de la manera
siguiente.
Se recogieron células Sf-9 y se
lavaron con PBS. Se hirvieron las células con un tampón de carga de
SDS-PAGE durante 5 minutos y se llevó a cabo la
SDS-PAGE. Según la técnica de transferencia Western
que utiliza Anti-Xpress como anticuerpo, se detectó
la proteína contemplada en la posición de su supuesto peso
molecular. En cambio, en el caso de las células de referencia no
infectadas con el virus, no se observó ninguna banda correspondiente
al NPIK humano en la misma prueba.
Dicho de forma más específica, tres días después
de la infección de 15 matraces (175 cm^{2}/FALCON) de células
Sf-9 semiconfluentes, se recogieron las células y se
lavaron con PBS, seguido de resuspensión en un tampón (Tris 20
mM/HCl (pH 7,5), EDTA 1 mM y DTT 1 mM). Las células en suspensión
se lisaron por tratamientos con ultrasonidos 4 veces durante 30
segundos a 4ºC a intervalos de 30 segundos. Las células tratadas con
ultrasonidos se sometieron a centrifugación y se recogió el
sobrenadante. La proteína en el sobrenadante se inmunoprecipitó
utilizando un anticuerpo Anti-Xpress y se obtuvo en
forma de suspensión de perlas de proteína
A-Sepharose. La suspensión se hirvió con un tampón
de carga de SDS-PAGE durante 5 minutos. Se realizó
la SDS-PAGE para la identificación y cuantificación
de NPIK. La propia suspensión se sometió al ensayo siguiente.
Es de esperar que NPIK tenga la actividad de la
incorporación del ácido fosfórico en la posición 4 del anillo de
inositol del fosfatidilinositol (PI), a saber la actividad de PI4
cinasa.
La actividad de PI4 cinasa de NPIK se ensayó
según el método de Takenawa, et al. (Yamakawa, A. Y Takenawa,
T., J. Biol. Chem., 263, 17555-17560
(1988)) como se muestra a continuación.
En primer lugar se preparó una mezcla de 10
\mul de una suspensión de NPIK (Tris 20 mM/HCl (pH
7,5), EDTA 1 mM, DTT 1 mM y perlas de proteína A al 50%), 10 \mul
de una solución de PI (preparada secando 5 mg de una solución de
cloroformo comercial que contiene PI en una corriente de nitrógeno
en la pared de un tubo de vidrio, añadiendo 1 ml de tampón Tris 20
mM/HCl (pH 7,5) y formando micelas por tratamiento con
ultrasonidos), 10 \mul de un tampón aplicado (Tris 210 mM/HCl (pH
7,5), EGTA 5 mM y MgCl_{2} 100 mM) y 10 \mul de agua destilada.
A éste se añadió 10 \mul de una solución de ATP (5 \mul de ATP
500 \muM, 4,9 \mul de agua destilada y 0,1 \mul de
\gamma-^{32}P ATP (6.000 Ci/moles, producto de
NEN Co., Ltd.)). Se inició la reacción a 30ºC y se continuó durante
2, 5, 10 y 20 minutos. Se fijó el periodo de 10 minutos
como tiempo de incubación debido a que se observó aumento lineal
aproximadamente 10 minutos en la incorporación del ácido fosfórico
en PI al ensayar el procedimiento descrito a continuación.
Una vez terminada la reacción, se fraccionó PI
por el procedimiento de extracción con disolvente y finalmente se
volvió a poner en suspensión en cloroformo. La suspensión se
desarrolló por cromatografía en capa fina (TLC) y se analizó la
radioactividad del producto de reacción en la posición PI4P
utilizando un analizador (denominación comercial:
Bio-Image; producto de Fuji Photo Film Co.,
Ltd.).
La Fig. 1 presenta los resultados. La Fig. 1 es
un diagrama analítico de los resultados del análisis de
radioactividad basado en TLC como se mencionó anteriormente. La
banda derecha (2) es la fracción de citoplasma de la célula
Sf-9 infectada con el virus que contiene NPIK,
mientras que la banda izquierda (1) es la fracción de citoplasma de
célula Sf-9 no infectado.
Asimismo, se añadieron cantidades
predeterminadas de Triton X-100 y adenosina al
sistema de reacción anterior para comprobar cómo dicha adición
afectaría la actividad de PI4 cinasa. La actividad de PI4 cinasa se
ensayó de la misma manera que anteriormente.
La Fig. 2 presenta los resultados. Los
resultados confirmaron que NPIK tenía una actividad de PI4 cinasa
típica acelerada por Triton X-100 e inhibida por
adenosina.
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 817 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2451 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- MOLECULAR TIPO: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3602 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BANCO: Banco de ADNc de cerebro de feto humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: GEN-428B12c2
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 429002879
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 31
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 829 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 32
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2487 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3324 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BANCO: Banco de ADNc de cerebro de feto humano
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: GEN-428B12c2
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 115..2601
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 33
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Nuevo gen humano NPIK que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos
mostrada como SEC. ID. nº: 28.
2. Gen humano NPIK que comprende una secuencia
nucleotídica mostrada como SEC. ID. nº: 29.
3. Gen humano NPIK según se define en la
reivindicación 2, que presenta la secuencia nucleotídica mostrada
como SEC. ID. nº: 30.
4. Gen humano NPIK que comprende una secuencia
nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada como
SEC. ID. nº: 31.
5. Gen humano NPIK que comprende una secuencia
nucleotídica mostrada como SEC. ID. nº: 32.
6. Gen humano NPIK según se define en la
reivindicación 5, que presenta la secuencia nucleotídica mostrada
como SEC. ID. nº: 33.
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