ES2285706T3 - Tecnologia de expresion y exportacion de proteinas como inmunofusinas. - Google Patents

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Abstract

Molécula de ADN que codifica para una proteína de fusión de un dominio Fc de inmunoglobulina unida a una proteína objetivo, que tiene la bioactividad de la proteína objetivo y se secreta a partir de una célula huésped de expresión de mamífero transformada con la molécula de ADN, comprendiendo dicha molécula de ADN una secuencia de polinucleótido que codifica desde su sentido 5¿ al 3¿ para: (a) una secuencia de péptido que dirige la secreción de la proteína de fusión, (b) una región Fc de inmunoglobulina que comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 de una inmunoglobulina y (c) una secuencia de proteína objetivo.

Description

Tecnología de expresión y exportación de proteínas como inmunofusinas.
Antecedentes
La invención se refiere a sistemas de expresión de proteínas de fusión para su uso en células de mamífero que estimulan la producción de una proteína objetivo dada. Más específicamente, la invención se refiere a un casete de secreción, compuesto de un péptido señal de mamífero y una parte de inmunoglobulinas de mamífero, que, cuando se usa como la pareja de fusión amino-terminal para la proteína objetivo, generalmente conduce a una expresión y secreción de alto nivel del producto de fusión. Tales proteínas de fusión son útiles, por ejemplo, para la producción y recogida extracelular de proteínas objetivo sin necesidad de la lisis de una célula huésped. La invención quizá es más útil para la expresión de proteínas objetivo que normalmente no se secretan a partir de una célula huésped, que se secretan a bajos niveles a partir de una célula huésped, o que son tóxicas o, en cualquier caso, nocivas para una célula huésped.
Los sistemas de expresión que emplean constructos de fusión génicos se han usado para estimular la producción de proteínas en bacterias. El empleo de una proteína bacteriana que normalmente se expresa a un nivel muy alto como la pareja de fusión amino-terminal de una proteína de fusión ayuda a garantizar la transcripción y traducción eficaces del mensaje, y en algunos casos, la secreción y solubilización de la proteína de fusión (Smith y Johnson (1988) Gene 67:31; Hopp et al. (1988) Biotechnology 6:1204; La Vallie et al. (1993) Biotechnology 11:187).
El principal objetivo de la expresión de las proteínas de fusión recombinantes en células de mamífero ha sido conferir propiedades novedosas a las moléculas híbridas, por ejemplo, selección como objetivo de una citocina o toxina in vivo, unión al receptor de Fc, fijación del complemento, unión a la proteína A, aumento de la semivida, y capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica. Ejemplos de proteínas de fusión recombinantes producidas en células de mamífero incluyen inmunoconjugados de citocina (Gillies et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428; Gillies et al. (1993) Bioconjugate Chemistry 4:230), inmunoadhesinas (Capon et al. (1989) Nature 337:525), inmunotoxinas (Chaudhary et al. (1989) Nature 339:394), y un conjugado del factor de crecimiento nervioso (Friden et.al. (1993) Science 259:373). En la publicación PCT WO 91/08298 se describen proteínas de fusión que comprenden en el sentido de N-terminal a C-terminal (5' \rightarrow 3') una secuencia señal unida a una proteína objetivo ("pareja de unión a ligando") unida a una región bisagra que finalmente está unida a la región Fc de una inmunoglobulina (dominio CH2-CH3). Estos constructos muestran un aumento de la estabilidad en plasma de la pareja de unión a ligando. Gillies et al. (Bioconjugate Chem. 1993, 4, 230-235) enseña proteínas de fusión que consisten en un anticuerpo completo intacto unido en su extremo C-terminal al extremo N-terminal de una citocina tal como IL2 y GM-CSF. Estas inmunocitocinas muestran una tasa de aclaramiento rápida significativa in vivo, con respecto al anticuerpo libre. Las proteínas producidas en células de mamífero a menudo no tienen los problemas de solubilidad y secreción encontrados en la expresión bacteriana. El uso de constructos de fusión génica para estimular la producción o la secreción de una proteína objetivo en un sistema de mamífero no se ha explorado completamente.
El objeto de la invención es proporcionar ADN que faciliten la producción y la secreción de una proteína objetivo. En particular, los objetos de la invención son proporcionar ADN novedosos que: faciliten la producción y la secreción eficaces de proteínas difíciles de expresar, tales como proteínas nucleares, proteínas reguladoras y proteínas que en cualquier caso pueden ser tóxicas para una célula huésped, y puedan adaptarse a cualquier polipéptido objetivo de interés que puede codificarse y expresarse en un organismo huésped; proporcionar constructos de ADN para la producción y la secreción rápidas y eficaces de proteínas en una variedad de células huésped; y proporcionar un método para la producción, secreción y recogida de proteínas obtenidas por ingeniería genética, incluyendo proteínas no naturales, biosintéticas o en cualquier caso artificiales, tales como proteínas que se han creado mediante diseño racional. Otros objetos de la invención son proporcionar secuencias de ADN que, cuando se unen a un polinucleótido que codifica para una proteína objetivo, codifican para un polipéptido de fusión que puede purificarse usando reactivos y técnicas comunes, y opcionalmente para interponer un sitio de escisión proteolítica entre el casete de secreción codificado y la proteína objetivo codificada, de manera que el casete de secreción puede escindirse de la proteína objetivo y la proteína objetivo puede purificarse independientemente. Todavía otro objeto es proporcionar un procedimiento que sea tanto eficaz como económico.
Estos y otros objetos de la invención serán evidentes a partir de la descripción, los dibujos y las reivindicaciones siguientes.
Sumario de la invención
La presente invención ofrece un ADN de aplicabilidad general para la producción y la secreción de proteínas de fusión. El ADN comprende un casete de secreción, como la pareja de fusión amino-terminal, y una proteína objetivo, y se denomina en el presente documento una "inmunofusina". La invención proporciona, en sus diversos aspectos, un ADN recombinante que codifica para la inmunofusina, y métodos para producir la proteína de inmunofusina codificada. La inmunofusina es un ADN que comprende un polinucleótido que codifica para un casete de secreción, que comprende en su sentido 5' a 3', una secuencia señal y una región Fc de inmunoglobulina, y un polinucleótido que codifica para una proteína objetivo unido al extremo 3' del casete de secreción. Un casete de secreción de la invención, una vez construido, puede unirse a diversas proteínas objetivo. Adicionalmente, pueden optimizarse las secuencias que regulan la expresión de un casete de secreción y, por tanto, la expresión de la inmunofusina. El ADN resultante puede expresarse a altos niveles en una célula huésped, y la proteína de fusión se produce y secreta eficazmente a partir de la célula huésped. La inmunofusina secretada puede recogerse de los medios de cultivo sin necesidad de la lisis de la célula huésped, y puede someterse a ensayo para determinar su actividad o purificarse usando reactivos comunes, según se desee.
La parte del ADN que codifica para la secuencia señal preferiblemente codifica para un segmento peptídico que dirige la secreción de la proteína de inmunofusina y por tanto, se escinde. Tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "región Fc de inmunoglobulina" significa la parte carboxilo-terminal de una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Tal como se conoce, cada región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina está compuesta por cuatro o cinco dominios. Los dominios se denominan secuencialmente tal como sigue: CH1-bisagra-CH2-CH3(=CH4), y la región Fc de cada subclase de inmunoglobulina carece del dominio CH1. Tal como resulta evidente a partir de una revisión de la secuencias de ADN de las subclases de inmunoglobulina, la secuencias de ADN de los dominios de la cadena pesada tienen homología cruzada entre las clases de inmunoglobulina, por ejemplo, el dominio CH2 de la IgG es homólogo al dominio CH2 de la IgA y la IgD, y al dominio CH3 de la IgM y la IgE.
El casete de secreción preferido en la actualidad es un polinucleótido que codifica, en su sentido 5' a 3', para la secuencia señal de un gen de la cadena ligera de la inmunoglobulina y la región Pcy1 del gen \gamma^{1} de la inmunoglobulina humana. La región Fc\gamma^{1} del gen \gamma^{1} de la inmunoglobulina incluye una parte del dominio bisagra, dominio CH2 y dominio CH3. El ADN que codifica para el casete de secreción puede estar en su configuración genómica o en su configuración de ADNc. Sin embargo, los estudios descritos más adelante utilizan un casete de secreción en la configuración genómica. El uso de Fc\gamma^{1} humana como la secuencia de la región Fc tiene varias ventajas. Por ejemplo, si la proteína de fusión va a usarse como un producto biofarmacéutico, el dominio Fc\gamma^{1} puede conferir actividades de función efectora a la proteína de fusión. Las actividades de función efectora incluyen las actividades biológicas tales como fijación al complemento, citotoxicidad celular dirigida por anticuerpos, capacidad de transferencia placentaria y una semivida sérica más larga. El dominio Fc también proporciona detección mediante ELISA anti-Fc y purificación a través de la unión a la proteína A de Staphylococcus aureus ("Proteína A"). En determinadas aplicaciones puede ser deseable eliminar funciones efectoras específicas de la región Fc, tal 
\hbox{como la unión
al receptor  de Fc o la fijación al complemento.}
En otra realización, la región Fc puede ser un gen de inmunoglobulina murina. El uso de Fc murina como la región Fc puede tener ventajas. Por ejemplo, si la proteína de fusión va a usarse para la preparación de proteínas en ratones, entonces la región Fc murina no provocará una respuesta inmunitaria en el animal huésped. El dominio Fc puede conferir las actividades de función efectora a la proteína de fusión, y permitir la detección de la proteína de fusión mediante ELISA anti-Fc y purificación a través de la unión a la proteína A. En determinadas aplicaciones puede ser deseable eliminar funciones efectoras específicas de la región Fc.
En otra realización, la secuencia de ADN codifica para un sitio de escisión proteolítica interpuesto entre el casete de secreción y la proteína objetivo. Un sitio de escisión proporciona la escisión proteolítica la proteína de fusión codificada, separando así el dominio Fc de la proteína objetivo. Tal como se usa en el presente documento, se entiende que "sitio de escisión proteolítica" significa las secuencias de aminoácidos que se escinden mediante una enzima proteolítica u otros agentes de escisión proteolítica. Tal como se describirá en más detalle más adelante, los sitios de escisión proteolítica útiles incluyen secuencias de aminoácidos que se reconocen por las enzimas proteolíticas, tales como tripsina, plasmina o enterocinasa K.
En una realización preferida, la secuencia de proteína objetivo codifica para el antígeno de membrana específico de la próstata, PSMA. PSMA es una proteína de membrana de tipo II, por lo que el dominio extracelular o la forma soluble de la proteína, se utiliza como la secuencia de proteína objetivo. La forma soluble codificada de PSMA puede ser una secuencia humana, tal como la secuencia proporcionada en Israeli et al. (1993) Cancer Res., 53:227 y siguientes.
En otra realización preferida, la secuencia de proteína objetivo codifica para la proteína gp120. La proteína de la envuelta gp120 del virus de la inmunodeficiencia humana es una glucoproteína que se expresa en las células infectadas como una poliproteína, gp160, y después se escinde mediante una proteasa celular para dar gp120 y gp41. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de gp120 se facilita en Ratner et al., 1985, Nature, 313:277 y siguientes.
En otro aspecto, la secuencia de ADN de la invención está integrada dentro de un vector de expresión replicable. Tal como se usa en el presente documento, se entiende que "vector" significa cualquier ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de interés y competente para incorporarse en una célula huésped y para recombinarse con e integrarse en el genoma de la célula huésped, o para replicarse de forma autónoma como un episoma. Tales vectores incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, cósmidos y similares. Un vector de expresión preferido es pdC, en el que la transcripción del ADN de inmunofusina se ubica bajo el control del potenciador y el promotor del citomegalovirus humano. El vector pdC se derivó del pdEMp, que se describe en Lo et al. 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088:712, tal como sigue. El fragmento SalI-XhoI que contiene la secuencia original del potenciador y el promotor se sustituyó por el potenciador y el promotor del citomegalovirus humano mediante técnicas de biología molecular convencionales. La secuencia del potenciador y el promotor del citomegalovirus humano usada se derivó de los nucleótidos -601 a +7 de la secuencia proporcionada en Boshart et al., 1985, Cell 41:521. El vector también contiene el gen de la dihidrofolato reductasa mutante como un marcador de selección (Simonsen y Levinson (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:2495.
Una célula huésped apropiada puede transformarse o transfectarse con la secuencia de ADN de la invención, y utilizarse para la expresión y la secreción de una proteína objetivo. Las células huésped preferidas en la actualidad para su uso en la invención incluyen células de hibridoma inmortales, células de mieloma, células 293, células de ovario de hámster chino, células Hela y célula COS. Tal como se usa en el presente documento, se entiende que "expresión génica" o "expresión de una proteína objetivo" se refiere a la transcripción de la secuencia de ADN, la traducción del transcrito de ARNm y la secreción del producto de la proteína de fusión.
El método de la invención incluye proporcionar una secuencia de ADN que codifica para una inmunofusina, transfectar la secuencia de ADN en una célula huésped mediante una técnica de transfección o transformación disponible, cultivar la célula huésped transfectada en un medio adecuado en condiciones que estimulan la expresión y la secreción de la inmunofusina, y recoger la proteína de fusión del medio extracelular. Cuando se desee, la proteína objetivo puede escindirse del casete de secreción, o bien antes o bien después de que se recoja del medio extracelular.
Otras ventajas y características de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción, los dibujos y las reivindicaciones siguientes.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A-D son una ilustración esquemática de una inmunofusina. La figura 1A, "ADN," ilustra el ADN que codifica para una proteína de inmunofusina. La figura 1B, "proteína fusionada 1," ilustra la proteína de inmunofusina antes de la escisión de la secuencia señal. La figura 1C, "proteína fusionada 2," ilustra la proteína de inmunofusina tras la escisión de la secuencia señal. La figura 1D, "Proteína Objetivo," ilustra la parte de la proteína objetivo de una proteína de inmunofusina tras la escisión de la proteína de inmunofusina en el sitio de escisión que está interpuesto entre la región Fc y la proteína objetivo.
Descripción detallada
La presente invención es un ADN que comprende un polinucleótido que codifica, en el sentido de 5' a 3', para una secuencia señal, una región Fc de una inmunoglobulina y una proteína objetivo. Este enfoque para la expresión y la posterior secreción de una proteína objetivo es superior a las técnicas existentes debido a la elección y a la configuración del casete de secreción que está situado en el extremo 5' del constructo de fusión. Adicionalmente, pueden optimizarse las secuencias reguladoras que dirigen la expresión del casete de secreción, y el casete de secreción optimizado puede emparejarse con numerosas proteínas objetivo, permitiendo así la producción eficaz de numerosas proteínas de fusión.
La producción de las proteínas de inmunofusina se caracteriza por su nivel eficaz y elevado, debido a que la proteína objetivo se ha producido en el nivel de varios microgramos/mililitros utilizando los ADN y los métodos según la invención. Anteriormente, los trabajadores en la técnica habían cuantificado pocas veces los niveles de expresión de las proteínas difíciles de expresar debido a los bajos niveles de expresión que se obtienen en los sistemas de expresión de mamíferos conocidos y a las dificultades a las que se enfrentaban en la cuantificación de las proteínas mediante técnicas tales como inmunotransferencia de tipo Western y RIA (radioinmunoensayo). Antes de las enseñanzas de esta invención, la expresión de microgramos por mililitro de las proteínas difíciles de expresar se intentaría a menudo utilizando sistemas de expresión bacterianos.
Esta invención se basa en el concepto de que la facilidad de la producción y recogida de una proteína objetivo podía mejorarse si el polipéptido de interés estuviese unido a un dominio Fc de inmunoglobulina y la proteína de fusión se expresara en una célula huésped, en particular una célula huésped complementaria que expresa naturalmente la inmunoglobulina, de manera que la proteína de fusión se secretaría fácilmente de la célula huésped. Además de estimular la secreción de la proteína de fusión de la célula huésped, la región Fc puede aprovecharse para ayudar en la purificación del polipéptido fusionado. El enfoque general de la invención supone la construcción de ADN recombinante que codifica para un polipéptido fusionado, que con la expresión, da como resultado la expresión de un casete de secreción unido a una proteína objetivo, es decir, una proteína de interés que tiene una utilidad posible o demostrable.
La estructura global del ADN preferido de la invención, la proteína de fusión para la que codifica, la forma de la proteína que se secreta con más frecuencia y el producto de la proteína objetivo tras la escisión enzimática se ilustran esquemáticamente en las figuras 1A-D. Los caracteres de referencia en el ADN, figura 1A, se extienden a la proteína, figuras 1B-D, como los caracteres cebados correspondientes. El ADN que codifica para la inmunofusina se muestra entre los marcadores de inicio y de terminación en la secuencia de ADN ilustrada, figura 1A. Los elementos reguladores en el sentido de 5' se muestran en el extremo de 5' del ADN y están marcados como "secuencias reguladoras". El ADN se compone de tres polinucleótidos distintos que están unidos entre sí. En la figura 1A, 3' de las secuencias reguladoras, que pueden optimizarse para cada casete de secreción, es un primer ADN 8 que codifica para un casete de secreción que comprende dos de los tres polinucleótidos: 1) una secuencia señal 10, y 2) una región 12 Fc\gamma de inmunoglobulina. La región Fc\gamma de inmunoglobulina está compuesta por tres sub-regiones: 1) una región 14 bisagra, 2) una región 16 CH2, y una región 20 CH3. Unido al extremo 3' del ADN que codifica para el casete de secreción está el tercer polinucleótido, un ADN que codifica para la proteína 24 objetivo. Opcionalmente, el ADN que codifica para un sitio 22 de escisión proteolítica puede interponerse entre el ADN que codifica para la región CH3 de la región Fc\gamma de inmunoglobulina y el ADN que codifica para la proteína objetivo.
La proteína fusionada codificada comprende el casete 8' de secreción y la proteína 24' objetivo, mostrada como la proteína fusionada 1 en la figura 1B. Lo más frecuente será que el péptido 10' señal se escinda enzimáticamente de la proteína de fusión mediante la célula huésped antes de la secreción de la inmunofusina y, por tanto, la proteína 2 fusionada, mostrada en la figura 1C, muestra la proteína fusionada secretada que comprende el péptido 12' Fc\gamma fusionado al polipéptido 24' objetivo. Tanto la proteína 1 fusionada como la proteína 2 fusionada muestran la interposición opcional de un sitio 22' de escisión proteolítica entre el dominio 20' CH3 de la región 12' Fc\gamma y la proteína 24' objetivo. La escisión de cualquier proteína fusionada con el agente proteolítico apropiado en el sitio 22' de escisión da como resultado la liberación de la proteína 24' objetivo de la región 12' Fc, tal como se muestra en la figura
1D.
Los procedimientos para manipular, amplificar y recombinar ADN generalmente se conocen bien en la técnica y, por tanto, no se describen en detalle en el presente documento. Los métodos para identificar y aislar genes que codifica para las proteínas de interés, o para construir tales genes, se entienden y se desarrollan bien. En general, los métodos suponen seleccionar material genético que codifica para los aminoácidos que definen el polipéptido de interés según el código genético.
En consecuencia, el principio de construcción del ADN descrito en el presente documento puede aprovecharse utilizando técnicas de ADN recombinante conocidas que suponen el uso de diversas enzimas de restricción que producen cortes específicos de secuencia en el ADN para producir extremos romos o extremos cohesivos, técnicas con ADN ligasa que permiten la adición enzimática de los extremos cohesivos al ADN de extremos romos, construcción de ADN sintéticos mediante el ensamblaje de oligonucleótidos cortos, técnicas de síntesis de ADNc, reacción en cadena de la polimerasa y sondas sintéticas para aislar genes que tienen una función particular. También se conocen y se dispone de diversas secuencias promotoras y otras secuencias de ADN reguladoras utilizadas para lograr la expresión y diversos tipos de células huésped. Las técnicas de transfección convencionales y las técnicas igualmente convencionales para clonar y subclonar el ADN son útiles en la práctica de esta invención y conocidas por los expertos en la técnica. Pueden usarse diversos tipos de vectores tales como plásmidos y virus, incluyendo virus animales. Los vectores pueden aprovechar diversos genes marcadores que confieren a una célula transfectada satisfactoriamente una propiedad fenotípica detectable que puede usarse para identificar cuál de una familia de células ha incorporado satisfactoriamente el ADN recombinante del vector. Dado el estado anterior de la técnica de la ingeniería genética, los expertos en la técnica pueden poner en práctica la invención descrita en el presente documento en vista de esta descripción.
Un método para obtener el ADN que codifica para los diversos ligadores sintéticos descritos en el presente documento es mediante el ensamblaje de oligonucleótidos sintéticos en un sintetizador de polinucleótidos convencional automático, seguido por el ligamiento con una ligasa. Por ejemplo, los ligadores pueden sintetizarse como fragmentos de ADN complementario usando la química de la fosforamidita.
La secuencia señal de la invención es un polinucleótido que codifica para una secuencia de aminoácidos que inicia el transporte de una proteína a través de la membrana del retículo endoplasmático. Las secuencias señal que serán útiles en la invención incluyen secuencias señal de la cadena ligera de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpo 14.18 (Gillies et. al., 1989, Jour. of Immunol. Meth., 125:191-202), secuencias señal de la cadena pesada de anticuerpos, por ejemplo, la secuencia señal de la cadena pesada del anticuerpo MOPC141 (Sakano et al., 1980, Nature 286:5774), y cualquier otra secuencia señal que se conozca en la técnica (véase, por ejemplo, Watson, 1984, Nucleic Acids Research 12:5145). Las secuencias señal se han caracterizado bien en la técnica y se sabe que normalmente contienen de 16 a 30 residuos de aminoácidos, y pueden contener más o menos residuos de aminoácidos. Un péptido señal típico consiste en tres regiones: una región N-terminal básica, una región hidrófoba central y una región C-terminal más polar. La región hidrófoba central contiene de 4 a 12 residuos hidrófobos que anclan el péptido señal a través de la bicapa lipídica de la membrana durante el transporte del polipéptido incipiente. Tras el inicio, el péptido señal normalmente se escinde dentro de la luz del retículo endoplasmático mediante enzimas celulares conocidas como peptidasas señal. Los posibles sitios de escisión del péptido señal generalmente siguen la "regla (-3, -1)". Por tanto, un péptido señal típico tiene residuos de aminoácidos pequeños, neutros, en las posiciones -1 y -3 y carece de residuos de prolina en esta región. La peptidasa señal escindirá un péptido señal de este tipo entre los aminoácidos -1 y +1. Por tanto, la parte del ADN que codifica para la secuencia señal puede escindirse del extremo amino terminal de la proteína de inmunofusina durante la secreción. Esto da como resultado la secreción de una proteína de inmunofusina que consiste en la región Fc y la proteína objetivo. Una discusión detallada de las secuencias del péptido señal la facilita por von Heijne (1986) Nucleic Acids Res., 14:4683. Tal como sería evidente para un experto en la técnica, la idoneidad de una secuencia señal particular para su uso en el casete de secreción puede requerir alguna experimentación de rutina. Una experimentación de este tipo incluirá determinar la capacidad de la secuencia señal para dirigir la secreción de una inmunofusina y también una determinación de la configuración óptima, estructura genómica o ADNc, de la secuencia que va a usarse, con el fin de lograr la secreción eficaz de las inmunofusinas. Adicionalmente, un experto en la técnica puede crear un péptido señal sintético siguiendo las reglas presentadas por von Heijne, al que se hizo referencia anteriormente, y probar la eficacia de tal secuencia señal sintética mediante experimentación de rutina. Una secuencia señal también se denomina un "péptido señal", "secuencia líder" o "péptidos líder" y en el presente documento puede utilizarse cada uno de estos términos que tienen significados sinónimos para la secuencia
señal.
La región Fc de una inmunoglobulina es la secuencia de aminoácidos para la parte carboxilo terminal de una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Las regiones Fc son particularmente importantes para determinar las funciones biológicas de la inmunoglobulina y estas funciones biológicas se denominan funciones efectoras. Tal como se conoce, las cadenas pesadas de las subclases de inmunoglobulina comprenden cuatro o cinco dominios: IgM e IgE tienen cinco dominios de cadena pesada, e IgA, IgD e IgG tienen cuatro dominios de cadena pesada. La región Fc de IgA, IgD e IgG es un dímero de los dominios bisagra-CH2-CH3, y en IgM e IgE hay un dímero de los dominios bisagra-CH2-CH3-CH4. Además, el dominio CH3 de IgM e IgE es estructuralmente equivalente al dominio CH2 de IgG, y el dominio CH4 de IgM e IgE es el homólogo del dominio CH3 de IgG (véase, W. E. Paul, ed., 1993, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, Nueva York). Cualquiera de las regiones Fc conocidas sería útil como la región Fc del casete de secreción. Sin embargo, es importante que los sitios de unión para determinadas proteínas se delecionen de la región Fc durante la construcción del casete de secreción. Por ejemplo, dado que no es necesaria la coexpresión con la cadena ligera, debe delecionarse el sitio de unión para la proteína de unión a la cadena pesada, Bip (Hendershot et al. (1987) Immunol. Today 8:111-114), del dominio CH2 de la región Fc de IgE, de manera que este sitio no interfiera con la secreción eficaz de la inmunofusina. Asimismo, deben delecionarse los residuos de cisteína presentes en las regiones Fc que son responsables de la unión a la cadena ligera de la inmunoglobulina o sustituirse por otro aminoácido, de manera que estos residuos de cisteína no interfieran con el plegamiento apropiado de la región Fc cuando se produce como una inmunofusina. De la misma forma, las secuencias del dominio transmembrana, tales como las presentes en la IgM, deben delecionarse de manera que estas secuencias no den como resultado la dirección errónea de la inmunofusina a la membrana como una proteína
transmembrana.
Con la expresión y la producción de la región Fc como una parte del casete de secreción, pueden conservarse algunas de las propiedades biológicas, denominadas "funciones efectoras", que son naturales para la clase de inmunoglobulina particular de la que se obtiene la región Fc. Funciones efectoras útiles incluyen, por ejemplo, fijación al complemento, unión al receptor de Fc, unión a membranas celulares y transferencia placentaria. En algunos casos, puede ser ventajoso modificar o eliminar una o más de estas funciones efectoras, tales como la unión al receptor de Fc o la fijación al complemento, usando mutagénesis dirigida al sitio u otras técnicas de biología molecular bien conocidas. Por ejemplo, Duncan et al. (Nature, 1988, 332:738) han mapeado los aminoácidos responsables de varias de las actividades de las funciones efectoras de las inmunoglobulina gamma, véase también, Duncan et al., 1988, 332:563; Yasmeen et al., Immunol., 1976, 116:518; Tao et al., J. Immunol., 1989, 143:2595. Los aminoácidos o segmentos peptídicos responsables de estas funciones pueden delecionarse por tanto eliminando esa parte de la región Fc, o sustituirse por secuencias que no conferirían la función usando técnicas de biología molecular bien
conocidas.
La clase preferida en la actualidad de la inmunoglobulina de la que se deriva la región Fc es la inmunoglobulina gamma-1, porque se ha caracterizado bien y se secreta eficazmente de la mayoría de los tipos celulares. La región Fc de las otras subclases de la inmunoglobulina gamma (gamma-2, gamma-3 y gamma-4) funcionaría igualmente bien en el casete de secreción. La región Fc de la inmunoglobulina gamma-1 que se usa preferiblemente en el casete de secreción incluye al menos parte de la región bisagra, la región CH2 y la región CH3. Además, la región Fc de la inmunoglobulina gamma-1 puede ser una región Fc con CH2 delecionada, que incluye una parte de una región bisagra y una región CH3 en la que se ha delecionado la región CH2. Una región Fc con CH2 delecionada se ha descrito por Gillies et al., 1990, Hum. Antibod. Hybridomas, 1:47, publicación que se incorpora al presente documento como referencia.
Tal como resulta evidente a partir de lo tratado anteriormente sobre las regiones Fc, las regiones Fc de las otras clases inmunoglobulinas, IgA, IgD, IgE e IgM, también podrían ser útiles como la región Fc del casete de secreción. Además, también serían útiles constructos de deleción de estas regiones Fc, en las que uno o más de los dominios constantes están delecionados. Un experto habitual en la técnica podría preparar tales constructos de deleción usando técnicas de biología molecular bien conocidas.
La identidad de la proteína objetivo producida según la invención esencialmente no está limitada. De hecho, una característica importante de la invención es que proporciona un constructo de ADN generalizado y un procedimiento que puede adaptarse para facilitar la producción recombinante de cualquier proteína objetivo deseada. Por ejemplo, la aplicación de la invención a la expresión de las proteínas reguladoras, tal como factores de transcripción que se ubican normalmente en el núcleo, permite la secreción eficaz de tales proteínas que normalmente no se secretan. Además, las proteínas reguladoras, en general, son difíciles de expresar y los procedimientos de purificación generalmente son engorrosos (véase, por ejemplo, Meisterernst et al. (1991) Cell 66:981). Por tanto, es especialmente deseable que tales proteínas se exporten al medio de cultivo. Adicionalmente, la invención puede usarse para potenciar la producción y la secreción de proteínas que normalmente se secretan a bajos niveles. Si una proteína objetivo deseada incluye secuencias que codifican para una señal de secreción o una señal transmembrana, estas secuencias pueden eliminarse de la proteína objetivo, de manera que el casete de secreción dirige la secreción de la proteína de
fusión.
El sitio de escisión proteolítica opcional puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que se reconozca por agentes de escisión específicos. Esta especificidad de los agentes de escisión está determinada por la identidad de la secuencia de los aminoácidos en o cerca del enlace peptídico que va a hidrolizarse. Un agente de escisión dado puede reconocer el enlace entre dos aminoácidos específicos o puede reconocer un enlace tras uno o una secuencia específica de aminoácidos. Se conoce la especificidad de muchos agentes de escisión. La tabla 1 a continuación expone listas de diversos agentes de escisión conocidos y sus sitios primarios (y en algunos casos secundarios) de
acción.
TABLA 1 
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100
101 
\vskip1.000000\baselineskip
Se conocen otros agentes de escisión. Los preferidos para su uso en la invención son enzimas con un sitio primario de acción que escinde en el lado C-terminal del residuo del sitio de escisión.
El sitio de escisión en la proteína fusionada generalmente puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos que puede escindirse mediante un agente de escisión específico para el sitio en un entorno apropiado. Puede aumentarse la especificidad de la escisión y puede disminuirse la posibilidad de escisión no deseada dentro de la proteína objetivo o en otro sitio en el polipéptido fusionado, mediante la selección del agente de escisión que tiene un sitio de acción que está ausente del polipéptido objetivo. El polipéptido fusionado se escinde preferiblemente en condiciones en las que se ha supuesto su conformación natural. Esto tiene el efecto de enmascarar la presencia de posibles sitios de escisión en el polipéptido objetivo.
La invención se ilustra adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplo 1
Construcción de un casete de secreción
A continuación se describe la construcción de un casete de secreción a modo de ejemplo. Tal como apreciarían los expertos habituales en la técnica, la secuencia señal y la región Fc de una inmunoglobulina podrían ser otras secuencias distintas a las descritas.
Se seleccionó la secuencia señal de una cadena ligera de la inmunoglobulina del anticuerpo 14.18 para su uso como la secuencia señal del casete de secreción. La secuencia de la cadena ligera del anticuerpo 14.18 se facilita en Gillies et al., 1989, Jour. Immunol. Meth., 125:191-202 y se incorpora al presente documento como referencia. Se modificó la secuencia señal para facilitar la clonación como un fragmento XbaI-AflII del ADN. Tal como resultaría evidente para los expertos en la técnica, también podría utilizarse el ADN que codifica para una secuencia señal humana. Específicamente, se introdujo un sitio XbaI en 5' del codón de iniciación de la traducción y la secuencia consenso para la unión óptima al ribosoma (Kozak, 1984, Nature 308:241). Se introdujo un sitio AflII en el extremo 3' de la secuencia señal mediante la mutagénesis del ADN que codifica para el penúltimo residuo de aminoácido del péptido señal de una serina a una leucina, por lo que la secuencia ATC se mutagenizó a TTA usando mutagénesis dirigida al sitio.
Se seleccionó la región Fc de una inmunoglobulina para que fuera el ADN genómico de Fc\gamma1 humana, incluyendo la configuración genómica de los dominios bisagra, CH2 y CH3. La secuencia genómica de Fc\gamma1 humana se facilita en Huck et al., (1986) Nucleic Acids Res. 14:1779. Tal como resultaría evidente para un experto habitual en la técnica, una región Fc con CH2 delecionado también puede usarse como la región Fc del casete de secreción (véase, Gillies et al., 1990, Hum. Antibod. Hybridomas, 1:47), en cuyo caso, el dominio CH2 se delecionaría de la región Fc usando técnicas de biología molecular establecidas durante la construcción del casete de secreción. El ADN genómico de Fc\gamma1 se modificó para facilitar la clonación como un fragmento AflII-XmaI. El extremo 5' del ADN genómico de la región Fc humana se mutagenizó a un sitio AflII mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) usando un cebador en el sentido 5' con la secuencia siguiente (Secuencia ID No. 1):
GAGAATTCTTAAGCGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCAC
Este cebador introdujo un sitio AflII (subrayado) y una mutación de cisteína a serina (de TGT a TCT, en negrita). La cisteína que se está mutando es la que normalmente participa en el enlace disulfuro con la cadena ligera y, por tanto, no afecta a las funciones efectoras de la región Fc. La deleción de esta cisteína puede servir para estimular la producción de la región Fc\gamma1, ya que la producción eficaz de esta región Fc\gamma1 modificada no requerirá la coexpresión de la cadena ligera de inmunoglobulina. La cisteína también se eliminó, de manera que no interfiere con el plegamiento adecuado de la región Fc\gamma1 o la proteína objetivo fusionada. El extremo 3' del ADN genómico de Fc\gamma1 codifica para dos sitios de restricción XmaI. Se ubican en 10 y 280 pb en el sentido de 5' del codón de terminación de la traducción en el dominio CH3. Se destruyó el sitio XmaI distal mediante la introducción de una mutación silenciosa, usando mutagénesis dirigida al sitio (TCC a TCA, en la que CC eran las primeras dos bases del sitio XmaI), de manera que las 10 pb del sitio XmaI en el sentido de 5' del codón de terminación lleguen a ser únicas.
El fragmento de restricción XbaI-AflII que codifica para el péptido señal de la cadena ligera se ligó entonces al fragmento de restricción AfIII-XmaI que codifica para la región Fc. El fragmento de restricción resultante XbaI-XmaI codifica, por tanto, para el casete de secreción, y el gen que codifica para la proteína objetivo de interés puede ligarse al extremo 3' del casete de secreción a través del sitio XmaI.
En general, el ADN que codifica para la proteína objetivo puede ligarse el sitio XmaI único a través del uso de un ligador-adaptador, y tal ligador-adaptador también puede incluir sitios de endonucleasa de restricción además de un sitio XmaI. El uso de un ligador-adaptador tiene la característica adicional de que puede codificar para un sitio de escisión proteolítica para su posterior uso en la escisión de la proteína objetivo del casete de secreción tras la producción y secreción de la proteína de fusión. Por ejemplo, el ligador-adaptador puede codificar para un residuo de lisina en la unión de la proteína de fusión, lo que proporciona la opción de escindir la proteína objetivo del dominio Fc mediante enzimas proteolíticas, tales como tripsina o plasmina. De manera similar, el ligador-adaptador puede incluir un ADN que codifica para el sitio de escisión de enterocinasa K (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) con el fin de proporcionar la escisión específica de la proteína de fusión secretada por la enterocinasa K.
Ejemplo 2
Construcción de una inmunofusina
A continuación se describe la construcción de una inmunofusina a modo de ejemplo, incluyendo un casete de secreción y una proteína objetivo. Tal como resultaría evidente para los expertos habituales en la técnica, pueden fusionarse otras proteínas objetivo a un casete de secreción usando las mismas u otras técnicas de clonación molecular.
La proteína objetivo para la inmunofusina a modo de ejemplo se escogió para que fuera CD26, que es una proteína de membrana de tipo II que tiene su sitio activo dentro de la región carboxilo-terminal de la proteína que es el dominio extracelular. Durante la construcción de una inmunofusina de CD26, se delecionaron los dominios citoplasmático y transmembrana de CD26 de modo que no pudieran interferir con la secreción de la inmunofusina por el casete de secreción. Se modificó el extremo 5' del ADNc que codifica para el dominio extracelular para facilitar la clonación para incluir un sitio XmaI, que se introdujo mediante un ligador-adaptador. También se modificó el extremo 3' del ADNc de CD26 para facilitar la clonación para incluir un sitio Xhol, que podría introducirse en el sentido de 3' del codón de terminación de la traducción o bien mediante PCR o bien mediante un ligamiento ligador-adaptador.
Pueden usarse diversos ligadores-adaptadores dependiendo del deseo de introducción de un sitio de escisión proteolítica entre el ADN que codifica para la región Fc y el ADNc de CD26. Por ejemplo, un ligador-adaptador que puede usarse para CD26 es:
5' CCG GGT (AAA) GGC ACA GAT GAT GCT ACA G
3' CA (TTT) TTG TGT CTA CTA CGA TGT C
tal como se facilita en las secuencias ID Nos. 2 y 3. Los primeros tres codones en la hebra superior codifican para los tres últimos residuos de aminoácidos del dominio CH3, y comenzando con el codón GGC es la secuencia génica del dominio extracelular de CD26. Este ligador-adaptador tiene el extremo cohesivo de un sitio XmaI en su extremo 5' y el extremo romo de un sitio PvuII en su extremo 3', siendo el sitio PvuII de extremos romos un sitio conveniente para la reconstrucción con el resto del ADNc de CD26. El codón de lisina (AAA, entre paréntesis) en el ligador-adaptador no es sino una de las muchas secuencias de aminoácidos opcionales que son útiles para proporcionar un sitio de escisión proteolítica mediante agentes de escisión. Por ejemplo, este residuo de lisina puede escindirse mediante enzimas tales como tripsina o plasmina.
Alternativamente, para la escisión proteolítica más específica mediante la enterocinasa K, puede introducirse la secuencia génica que codifica para el sitio de escisión de enterocinasa K mediante el siguiente ligador-adaptador:
5' CCG GGT TCA GGG GAT GAC GAT GAC GAT A
3' CA AGT CCC CTA CTG CTA CTG CTA TTC GA
tal como se facilita en las Seq. ID Nos. 4 y 5. Los nucleótidos en negrita codifican para los residuos de aminoácidos (Asp)4-Lys, que constituyen el sitio de reconocimiento de la enterocinasa K. El ligador-adaptador termina con un sitio HindIII, al que puede unirse el gen de CD26 u otras secuencias génicas de la proteína objetivo.
Ejemplo 3
Células huésped y transfección
Las líneas de células huésped preferidas incluyen las células de mieloma (o hibridoma) de ratón NS/0 y Sp2/0 Ag14. Las células de mieloma se transfectaron mediante fusión de protoplastos y se seleccionaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (Gibco) que contenía suero bovino fetal al 10% y metotrexato 100 nM, tal como se describe por Gillies et al., 1989, BioTechnology, 7: 799, publicación que se incorpora al presente documento como referencia. Se identificaron los transfectantes que secretan las inmunofusinas mediante ELISA anti-Fc, tal como se describe por Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191, publicación que se incorpora al presente documento como referencia. Los principales productores se adaptaron al medio que contenía MTX 1 \muM y se subclonaron mediante diluciones limitantes. Para la producción de inmunofusinas, se hicieron crecer las células en medio libre de suero de hibridoma (HSFM, Gibco) que contenía suero bovino fetal al 1% y MTX 1 \muM.
La otra línea celular receptora preferida son las células 293 de riñón humanas, que son útiles tanto para la expresión transitoria como para la estable. En el sistema también funcionaron otras células, tales como las células HeLa y las células de ovario del hámster chino (CHO). El método preferido para la transfección de estas células adherentes es mediante la coprecipitación del ADN de plásmido con fosfato de calcio, y otros métodos incluyen lipofección y electroporación. Para una descripción de estos métodos y otros métodos de transfección útiles, véase, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning- -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, incorporado al presente documento como referencia.
Ejemplo 4
Caracterización y purificación de inmunofusinas
Para la caracterización de rutina mediante electroforesis en gel, se capturaron las inmunofusinas en medio condicionado en primer lugar sobre Proteína A-Sepharose (Repligen, Cambridge, MA) y después se eluyeron hirviendo en tampón de muestra de proteína con o sin 2-mercaptoetanol. Tras la electroforesis en un gel de SDS, las bandas de proteína se visualizaron mediante tinción con azul de Coomassie. Por ejemplo, la inmunofusina de IL2, véase el ejemplo 5, dio una banda que tenía el peso molecular de 45 kD en condiciones reductoras y una banda que tenía el peso molecular de 90 kD en condiciones no reductoras, lo que demuestra que la inmunofusina de IL2 se producía como un dímero, presumiblemente a través de puentes disulfuro en el dominio bisagra de la región Fc.
Para la purificación, se recogió el medio de cultivo celular y se unieron entonces las inmunofusinas en la Proteína A-Sepharose. Las inmunofusinas se eluyeron posteriormente de la proteína A en un tampón citrato de sodio (100 mM, pH 4). El eluato se neutralizó entonces inmediatamente con 0,1 volúmenes de Tris-clorhidrato 1 M, pH 8. En el caso de la inmunofusina de CD26, se demostró que un procedimiento de elución de este tipo daba como resultado una recuperación mayor del 80% de la inmunofusina de CD26 sin pérdida de la actividad enzimática.
Ejemplo 5
Expresión de la inmunofusina de IL2
Se modificó el ADNc de la proteína IL2 madura para facilitar la clonación para tener una sitio de endonucleasa de restricción XmaI en 5' y un sitio de endonucleasa de restricción XhoI en 3', usando técnicas moleculares bien conocidas, tales como las que se describieron en el ejemplo 2. Las secuencias del ADNc de IL2 madura se facilitan en Taniguchi et al., 1983, Nature, 302:305 y se incorporan al presente documento como referencia. El ADNc de la proteína IL2 madura se construyó usando técnicas recombinantes como un gen sintético con el fin de optimizar el uso del codón e introducir sitios de escisión de endonucleasa de restricción deseables. El gen sintético se creó usando técnicas de manipulación de ADN convencionales. Una vez que se construyó el ADNc de IL-2 sintético, se ligó el sitio XmaI en 5' del ADNc de IL2 con el sitio XmaI en 3' del casete de secreción, descrito en el ejemplo 1. Se clonó entonces la inmunofusina de IL2 en el vector de expresión pdC. El vector de expresión de la inmunofusión de IL2 se transfectó en NS/0 y Sp2/0 como células huésped mediante fusión de protoplastos, tal como se describe por Gillies et al., 1989, Biotechnology, 7:799.
De dos a tres semanas tras la transfección, aparecieron clones NS/0 y Sp2/0 resistentes a MTX. Se examinaron los clones iniciales mediante ELISA anti-Fc. La inmunofusina de proteína IL2 se recogió del medio. Un ensayo apropiado para determinar la actividad biológica de IL2 fueron los ensayos de proliferación de células T convencionales según Gillies et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89:1428). El cultivo agotado del mejor clon contenía aproximadamente 100 \mug/ml de inmunofusina de IL2. Los clones de célula huésped que producían y secretaban eficazmente la inmunofusina de proteína IL2 se subclonaron en medio que contenía MTX 100 nM, y el mejor subclón produjo aproximadamente 200 \mug/ml de proteína en el cultivo agotado. Cuando se excluyó el MTX del medio en la subclonación, el mejor subclón así aislado produjo aproximadamente 180 \mug/ml en el cultivo agotado. Por tanto, la construcción de una inmunofusina de IL2 proporcionó inesperadamente la producción de IL2 a un nivel que es aproximadamente 80 veces el que puede lograrse mediante la expresión de IL2 sola usando el vector pdEMp (datos no publicados), y muchas veces el de IL2 que se expresaba en células de mamífero (Conradt et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17368) y en levadura (Ernst et al., 1989, Biotechnology, 7:716). Tal como se mencionó en el ejemplo 4, se produjo inmunofusina de IL-2 como un homodímero de peso molecular de 90 kD, presumiblemente a través de puentes disulfuro en el dominio bisagra de los monómeros de 45 kD.
Ejemplo 6
Expresión de inmunofusina de CD26
Se llevó a cabo la construcción de CD26 como una inmunofusina para demostrar que la invención puede aplicarse a la expresión de proteínas ancladas en la membrana, tales como las proteínas de membrana de tipo II. Una proteína de membrana de tipo II muestra el dominio carboxilo-terminal en la superficie extracelular, y lo más frecuentemente incluye su región activa dentro de este dominio carboxilo-terminal. La unión de un polipéptido de fusión a la región carboxilo-terminal de una proteína de este tipo puede interferir con el plegamiento apropiado del sitio activo, y reducir o evitar así la producción de la proteína activa.
CD26 es una proteína de membrana de tipo II que comprende 766 residuos de aminoácidos. La función biológica de CD26 es como un antígeno de activación de las células T y el posible correceptor para la entrada del VIH en las células CD4+ (Callebaut et al. (1993) Science 262:2045). La proteína CD26 está anclada a la bicapa lipídica de la membrana plasmática a través de un dominio hidrófobo entre los residuos 7 y 28 en el extremo N-terminal. Los aminoácidos 1 a 6 forman una corta cola citoplasmática. El resto de la proteína, entre los residuos 29 y 766, es extracelular e incluye varios posibles sitios de N-glucosilación y el sitio activo de la enzima (Tanaka et al. (1992) J. Immunol. 149:481). Los 728 residuos del extremo carboxilo-terminal en CD26 sobresalen de la superficie de la membrana y el extremo C-terminal es libre. Una CD26 soluble expresada como una inmunoadhesina, tendrá una conformación diferente de la de CD26 natural, debido a que el extremo carboxilo-terminal en una proteína CD26 de inmunoadhesina no está libre, sino conectado a la secuencia del anticuerpo. Por otra parte, si se obtiene mediante ingeniería genética una inmunofusina en la que la secuencia del anticuerpo es amino-terminal para la proteína objetivo, tal como CD26, se conservará la conformación natural de CD26, es decir el extremo C-terminal está libre, y la secuencia del anticuerpo, en el presente documento una región Fc, ocupa el lugar de la membrana en el que normalmente se ancla CD26. Las actividades biológicas y enzimáticas de una inmunofusina de CD26 soluble de este tipo no se verán comprometidas. Además, CD26 es una proteasa y su expresión puede ser perjudicial para la célula huésped. Por tanto, mediante la exportación eficaz de la proteasa CD26 fuera de la célula huésped en forma de una inmunofusina, puede lograrse un mayor nivel de expresión.
Se usó un fragmento de ADNc de 2,3 kb que codifica para el dominio extracelular de CD26 para construir el vector de expresión de la inmunofusina de CD26. La secuencia de ADN de CD26 se facilita en Tanaka et al., 1992, J. Immunol., 149:481. CD26 se unió en el extremo 3' del casete de secreción tal como se describió anteriormente en el ejemplo 2, y entonces se clonaron el casete de secreción y la proteína objetivo CD26 en el vector de expresión pdC usando el sitio 5' de la endonucleasa de restricción XbaI de la secuencia señal de la cadena ligera y el sitio 3' de la endonucleasa de restricción XhoI de la proteína CD26, tal como se describió en el ejemplo 2 anteriormente. El vector de expresión de la inmunofusina de CD26 resultante se transfectó en una célula huésped, tal como se describió en el ejemplo 3 anteriormente. Se examinaron los clones resistentes a MTX de las células NS/0 y Sp2/0 transfectadas mediante ELISA anti-Fc y ensayo de actividad de DPPIV. CD26 también se conoce como DPPIV, que es una exopeptidasa que escinde tras X-P amino-terminal (X puede ser cualquier residuo de aminoácido y P es prolina). Se sometió a ensayo la actividad enzimática de DPPIV de la inmunofusina de CD26 según Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1993, 90:4586, usando tosilato de glicilprolina-p-nitroanilida (Gly-Pro-pNA) como sustrato. El mejor clon NS/0 produjo aproximadamente 3,5 \mug/ml de inmunofusina de CD26. Se determinó que el resto de DPPIV del producto proteico era completamente activo, teniendo valores de K_{M} y k_{cat} similares a los de CD26 natural. Además, se inhibió la actividad enzimática de la inmunofusina de CD26 mediante inhibidores peptídicos conocidos de una manera dependiente de la dosis. Los inhibidores peptídicos probados incluyeron los tripéptidos IPI y VPL y APL, cada uno de los cuales inhibió la actividad enzimática de CD26 en más del 30% a 0,15 mM, en más del 70% a 1 mM y en más del 90% a 4 mM. Como control, también se probaron péptidos no inhibidores conocidos para determinar su efecto en la actividad enzimática de CD26 y se encontró que los no inhibidores conocidos, GGG y GPHyP (en el que HyP es hidroxiprolina), no tenían efecto sobre la actividad de CD26 cuando se incubaba con la inmunofusina de CD26 a concentraciones que oscilaban entre 0,01 mM y 11 mM.
Ejemplo 7
Expresión de inmunofusina de Tat
La invención también se aplicó a la expresión de proteínas reguladoras que normalmente se ubican en el núcleo. Dado que las proteínas reguladoras en general son difíciles de expresar y purificar, es especialmente deseable idear un método mediante el cual puedan secretarse eficazmente tales proteínas a partir de una célula huésped. Se prepararon constructos de inmunofusina de Tat y Rev (descritos en el ejemplo 8), que son dos proteínas codificadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que regulan la expresión de las proteínas virales en el núcleo de la célula, con el fin de determinar la eficacia con la que pueden expresarse y recogerse estas proteínas. Se obtuvo expresión y secreción de alto nivel de las inmunofusinas de Tat y Rev, y se purificaron las inmunofusinas fácilmente en una única etapa.
Se clonó un fragmento de ADNc de 260 pares de bases que codifica para Tat en los sitios XmaI y XhoI del vector de expresión pdC mediante la modificación de los extremos 5' y 3' de la proteína Tat usando técnicas de ADN recombinante, tal como se describió anteriormente. La secuencia del ADNc que codifica para la proteína Tat se facilita en Ratner et al., 1985, Nature, 313:277. Específicamente, la secuencia en el extremo 5' se modificó a la Seq. ID No. 6, C CCG GGT CGC ATG GAG...., en la que la secuencia subrayada es el sitio XmaI y el ATG en negrita es el codón de inicio de la traducción del gen de Tat. En el extremo 3', se introdujo un sitio XhoI inmediatamente en el sentido de 3'del codón de terminación de la traducción mediante técnicas de PCR convencionales. Entonces se transfectó el vector de expresión de la inmunofusina de Tat en una célula huésped, tal como se describió anteriormente, y se analizaron las células huésped para determinar la producción de la proteína inmunofusina de Tat. Se obtuvo expresión de alto nivel en células 293 transfectadas transitoriamente y células NS/O transfectadas establemente. Los clones de NS/0 estables produjeron aproximadamente 3 \mug/ml de una proteína de 48 kD, analizada en un gel de SDS en condiciones reductoras. Se confirmó que esta proteína era la inmunofusina de Tat mediante un anticuerpo anti-Tat (número de catálogo 7001, American BioTechnologies, Cambridge, MA).
Se demostró que la inmunofusina de Tat era activa mediante el siguiente experimento de expresión transitoria en células 293, cuyos resultados se presentan más adelante en la tabla 2. Se cotransfectó el vector de expresión para la inmunofusina de Tat con un vector separado que contenía LTR-TAR-Kappa, en el que LTR-TAR es la secuencia de repetición terminal larga del ADN de VIH que está transactivada por la proteína Tat, y Kappa es la secuencia génica que codifica para la cadena ligera Kappa de la inmunoglobulina. Para medir los niveles de expresión de Fc-Tat (inmunofusina de Tat) y Kappa, se sometieron a ensayo los sobrenadantes mediante ELISA anti-Fc y anti-Kappa, respectivamente. En la tabla 2, pdC-Fc-Tat representa el vector de expresión pdC para inmunofusina de Tat; LTRTAR- Kappa representa el vector de expresión para la cadena ligera Kappa, en el que la región reguladora de LTR-TAR puede transactivarse mediante Tat; y pCEP-Tat es un vector de expresión para Tat, cuya transcripción está bajo el control del potenciador y el promotor del citomegalovirus humano. Se utilizó pCEP-Tat como control positivo para monitorizar la transactivación de LTR-TAR-Kappa mediante la proteína Tat. Como control negativo, se transfectó LTR-TAR-Kappa solo para demostrar que no se transactiva en ausencia de la proteína Tat o la inmunofusina de Tat. Tal como se muestra en la tabla 2, se observó expresión de alto nivel de la inmunofusina de Tat en la transfección 1; se observó expresión de alto nivel tanto de Tat como de la cadena ligera Kappa en el experimento de cotransfección, transfección 2. Se observó la transactivación de Kappa mediante Tat en el control positivo, transfección 3, tal como se esperaba. Se observó poca o ninguna expresión de Kappa en el control negativo, transfección 4, también tal como se esperaba. Por tanto, la cadena ligera Kappa se expresa sólo a través de la transactivación de la región LTR-TAR mediante una proteína Tat funcional, y la inmunofusina de Tat proporciona una proteína Tat funcional que se secreta fácilmente a partir de la célula huésped. Este resultado también demuestra que el casete de secreción puede dirigir la secreción de una proteína que normalmente se transporta hacia el núcleo de la célula huésped.
TABLA 2
102 
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Ejemplo 8
Expresión de inmunofusina de Rev
Se modificó un fragmento de ADNc de 350 pares de bases que codifica para Rev para incluir un sitio XmaI en 5' y un sitio XhoI en 3' y después se ligó al extremo 3' del casete de secreción descrito en el vector de expresión pdC. La secuencia del ADNc que codifica para la proteína Rev se facilita en Ratner et al., 1985, Nature, 313:277, y se incorpora al presente documento como referencia. Específicamente, el extremo 5' del ADNc se modificó a C CCG GGT CGC ATG GCA.... (Seq. ID No. 7), en la que la secuencia subrayada es el sitio XmaI y el ATG en negrita es el codón de inicio de la traducción del gen de Rev. En el extremo 3', se introdujo un sitio XhoI inmediatamente en el sentido de 3' del codón de terminación de la traducción mediante técnicas de PCR convencionales. Se obtuvo expresión de alto nivel en células 293 transfectadas transitoriamente y en células NS/O transfectadas establemente. Los clones NS/0 estables produjeron aproximadamente 3 \mug/10^{6} células/día de la inmunofusina de Rev, que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kD cuando se analizó en un gel de SDS en condiciones reductoras.
Ejemplo 9
Escisión proteolítica específica de sitio de una inmunofusina
A continuación se describe una escisión a modo de ejemplo de una inmunofusina, tal como sería evidente para un experto habitual en la técnica, pudiendo escindirse cada una de las inmunofusinas descritas anteriormente de sus casetes de secreción respectivos usando el mismo método o un método análogo.
Se escindió inmunofusina de CD26 que tiene un residuo de lisina ("Fc(Lys)-inmunofusina de CD26"), introducida mediante el ligador-adaptador durante la construcción de la inmunofusina entre la región Fc y la secuencia de la proteína objetivo CD26, usando tripsina. Para escindir la Fc(Lys)-inmunofusina de CD26, se unió la inmunofusina en Proteína A-Sepharose y se escindió en la posición de lisina deseada mediante tripsina para liberar CD26, tal como sigue: se incubó Fc(Lys)-inmunofusina de CD26 unida a Proteína A-Sepharose con una solución de tripsina al 1% a 37ºC durante 2 h. Entonces se añadió el inhibidor de tripsina (Sigma) para detener cualquier digestión adicional. Después se extrajo el sobrenadante y se analizó en un gel de SDS en condiciones reductoras. Tras la tinción con azul de Coomassie, se obtuvo una banda que tenía un peso molecular de 110 kD, que corresponde al tamaño de CD26 sin el casete de secreción. Como control, se unió la inmunofusina de CD26, sin el residuo de lisina en la unión de la fusión entre el dominio Fc y la proteína objetivo CD26 ("Fc-inmunofusina de CD26"), en Proteína A-Sepharose y se trató de manera similar. Se encontró que CD26 no se liberaba del casete de secreción de la Fc-Inmunofusina de CD26, tal como se esperaba, y esto también confirmó la escisión específica de la inmunofusina en el aminoácido lisina que estaba insertado entre el dominio CH3 de la región Fc y la proteína objetivo CD26. Como un control adicional, se hirvió una alícuota idéntica de Fc-inmunofusina de CD26 que estaba unida a Proteína A-Sepharose en el tampón de muestra de la proteína y el análisis en gel de SDS del sobrenadante mostró una banda de 140 kD que correspondía a la longitud completa del monómero proteico de la inmunofusina de CD26.
Los resultados del experimento de electroforesis en gel se confirmaron mediante ensayos de la actividad de DPPIV de los digestos con tripsina. Se obtuvo la recuperación cuantitativa de la actividad enzimática de DPPIV en el sobrenadante cuando la Fc(Lys)-inmunofusina de CD26 unida a la Proteína A-Sepharose se trató con tripsina. En el experimento paralelo con Fc-inmunofusina de CD26, no hubo actividad de DPPIV en el sobrenadante, porque la proteína CD26 no se liberó de la proteína A-Sepharose.
Ejemplo 10
Expresión de inmunofusina de OSF-2
OSF-2 es una proteína secretora de 80-kD que participa en el proceso de osificación. La secuencia del ADN que codifica para OSF-2 se facilita en Takeshita et al., 1993, Biochem. J. 294:271, y se incorpora al presente documento como referencia. El ADNc que codifica para la proteína OSF-2 con su péptido señal se clonó en el vector de expresión pdC. Se usaron células NS/0 para la transfección estable y se usaron células 293 para la expresión transitoria; pero en ninguno de los casos se detectó la proteína OSF-2.
Entonces se adaptó el ADNc de OSF-2 para que se expresara como una inmunofusina. En el extremo 3', se convirtió el sitio XbaI en el codón de terminación de la traducción en un sitio XhoI mediante el ligamiento del ligador. En el extremo 5' se usó el siguiente ligador-adaptador:
5' CCG GGT AAA AAC AAT CAT TAT GAC AA 3' CA TTT TTG TTA GTA ATA CTG TTC TAG
tal como se facilita en las Seq. ID Nos. 8 y 9. Los nucleótidos en negrita codifican para el extremo N-terminal de la proteína OSF-2 madura, que termina con los extremos cohesivos de BgIII. Estos extremos cohesivos de BgIII se ligaron al fragmento BglII-XhoI del ADNc de OSF-2. Los extremos cohesivos de XmaI en el extremo 5' del ligador-adaptador (subrayado) se ligaron al único sitio XmaI en el vector de expresión de la inmunofusina.
Se obtuvo expresión de alto nivel en células 293 transfectadas transitoriamente y en células NS/O transfectadas establemente. Los clones de NS/O estables produjeron aproximadamente de 5 a 7 \mug/ml de una proteína de 110 kD, cuando se analizaron en un gel de SDS en condiciones reductoras. Se confirmó que esta proteína era la inmunofusina de OSF-2 mediante inmunotransferencia de tipo Western con un anticuerpo anti-OSF-2.
También se encontró que la expresión de OSF-2 como una inmunofusina en un sistema de mamífero era superior a la expresión de OSF-2 en el sistema de expresión de fusión del gen de tiorredoxina en E. coli (LaVallie et al., 1993, Biotechnology, 11:187). El sistema de fusión del gen de tiorredoxina se diseñó para sortear la formación de cuerpos de inclusión debido a que la fusión a tiorredoxina aumenta la solubilidad de muchas proteínas heterólogas producidas en el citoplasma de E. coli. Para probar este sistema para la expresión de OSF-2, se insertó ADNc que codifica para la OSF-2 madura en el sitio SmaI del vector pTrxFus (Invitrogen, San Diego, CA), creando así una proteína de fusión tiorredoxina-OSF-2. Se siguió el protocolo del proveedor para la expresión de las proteínas de fusión. Se expresó la proteína de fusión tiorredoxina-OSF-2 y, como control, se expresó la proteína tiorredoxina sola sin una pareja de fusión. Los resultados demostraron que, aunque podía producirse la tiorredoxina sola como una proteína soluble a alto nivel, la proteína de fusión tiorredoxina-OSF-2 estaba presente sólo en la fracción insoluble. Por tanto, además de la falta de modificación tras la traducción en la expresión bacteriana, no se sintetizó una proteína de mamífero relativamente compleja tal como OSF-2 como una proteína soluble cuando se unió a tiorredoxina.
Ejemplo 11
Expresión de inmunofusina de \betaIG-H3
\betaIG-H3, un producto génico que se induce mediante el factor de crecimiento transformante \beta, es una proteína secretora de 68 kD que comparte homología de secuencia con OSF-2. La secuencia de ADNc que codifica para \betaIG-H3 se facilita en Skonier et al. (1992) DNA and Cell Biology, 11:511, y se incorpora al presente documento como referencia. El ADNc que codifica para \betaIG-H3 natural se clonó en el vector de expresión pdC; pero los intentos para obtener transfectantes estables que produjeran \betaIG-H3 fueron infructuosos.
Entonces se adaptó el ADNc de \betaIG-H3 para que se expresase como una inmunofusina. En el extremo 3', el sitio BsmI en el sentido de 3' del codón de terminación de la traducción se convirtió en un sitio XhoI mediante ligamiento con ligador. En el extremo 5', se utilizó el siguiente ligador-adaptador:
5' CCG GGT AAA GCC CTG GGC C
3' CA TTT CGC GAC
(Seq ID. Nos. 10 y 11). Los nucleótidos en negrita codifican para el extremo N-terminal de la proteína \betaIG-H3 madura. El ligador-adaptador tenía extremos cohesivos de XmaI para el ligamiento al vector de expresión, tal como se describió en los ejemplos anteriores, y los extremos cohesivos de ApaI para el ligamiento al sitio ApaI en el extremo 5' de la secuencia de ADNc que codifica para \betaIG-H3 madura.
Se obtuvo expresión de alto nivel en células 293 transfectadas transitoriamente y células NS/O transfectadas establemente. Los clones de NS/0 estables produjeron aproximadamente 3,5 \mug/10^{6} células/día de una proteína de 100 kD cuando se analizaron en un gel de SDS en condiciones reductoras. Se confirmó que esta proteína era la inmunofusina de \betaIG-H3 mediante inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpo anti-bIG-H3.
Ejemplo 12
Expresión de la forma soluble del receptor de IgE como una inmunofusina
Se construyó la subunidad alfa del receptor de IgE de alta afinidad (IgE-R), cuya secuencia de ADN puede encontrarse en Kochan et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 3584 y se incorpora al presente documento como referencia, como una inmunofusina tal como sigue: Se introdujo un sitio XmaI en el extremo 5' del ADNc que codifica para el IgE-R maduro, de modo que la secuencia en la unión de la fusión fue C CCG GGT GTC CCT CAG - - - (Seq. ID No. 12), en la que el sitio XmaI está subrayado y los tres codones en negrita son los tres primeros residuos de aminoácidos del IgE-R maduro. En el extremo 3' de IgE-R, se delecionó el ADNc que codifica para el dominio transmembrana y el resto del extremo C-terminal y se colocó un codón de terminación de la traducción tras el último codón del dominio extracelular. Por tanto, la secuencia de la inmunofusina de IgE-R en el extremo 3' fue TAC TGG CTA TAA CTC GAG (Seq. ID No. 13), en la que los tres codones en negrita eran los tres últimos residuos de aminoácidos del dominio extracelular de IgE-R, e iban seguidos por un codón de terminación y un sitio XhoI
(subrayado).
El vector de expresión pdC que contenía la inmunofusina de IgE-R se transfectó en células 293 y células NS/0. Se detectaron altos niveles de expresión (de 3 a 5 \mug/ml) de la inmunofusina de IgE-R en los medios de cultivo celular mediante ELISA anti(Fc). Los análisis en gel de SDS en condiciones reductoras mostraron una banda del tamaño esperado de 70 kD. Se demostró que la proteína parcialmente purificada (en Proteína A-Sepharose) se unía a IgE en un ELISA IgE-R/IgE.
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Ejemplo 13
Expresión de Fc\gamma1
Se expresó Fc\gamma1 por sí mismo sin una proteína objetivo en el extremo C-terminal. Esto se logró mediante el ligamiento del siguiente ligador (que tenía extremos cohesivos de XmaI y XhoI)
5' CCG GGT AAA TAG C
3' CA TTT ATC GAG CT
(Seq. ID Nos. 14 y 15), a los sitios XmaI y XhoI de pdC para reconstruir la región codificante de Fc. Se detectaron altos niveles de expresión mediante ELISA anti(Fc) en los medios de cultivo celular de las células 293 transfectadas transitoriamente (de 5 a 7 \mug/ml) y los clones de NS/0 transfectados establemente (de 5 a 10 \mug/ml). El análisis en gel de SDS en condiciones reductoras demostró una banda de Fc del tamaño esperado de 31 kD.
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Ejemplo 14
Expresión de inmunofusina de PSMA
La PSMA, antígeno de membrana específico de la próstata, es una proteína de membrana de tipo II que tiene un peso molecular superior a 100 kD. PSMA es una proteína integral de membrana, y como tal, es un objetivo atractivo para la obtención de imágenes y la administración de inmunoconjugados. Para facilitar la expresión de cantidades significativas de PSMA, se subclonó el dominio extracelular de PSMA (la forma soluble) y se expresó este dominio de PSMA como una inmunofusina. Una parte del dominio extracelular de PSMA, que es una forma soluble de PSMA, puede producirse como una inmunofusina.
El ADNc que codifica para la PSMA de longitud completa se clonó a partir de una línea celular de carcinoma de próstata humano, LNCaP [Israeli et al. (1993) Cancer Res., 53:227. La parte del ADNc de PSMA correspondiente al dominio extracelular se adaptó para que se expresase como una inmunofusina mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa usando los cebadores siguientes:
N-terminal: 5' AAGCTT AAA TCC TCC AAT GAA GC
C-terminal: 5' CTCGAG TTA GGC TAC TTC ACT CAA AG
(Seq. ID Nos. 16 y 17). Los dos cebadores proporcionan los sitios HindIII y XhoI (subrayados) para clonar en el vector de expresión de la inmunofusina. En el cebador N-terminal, el sitio HindIII va seguido por la secuencia codificante del dominio extracelular de PSMA (en negrita) inmediatamente tras la región transmembrana. En el cebador C-terminal, el sitio XhoI va seguido por el anticodón del codón de terminación y la secuencia codificante C-terminal de PSMA (en negrita). La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de PSMA se muestra en la Seq. ID No.
18.
Se obtuvo expresión de alto nivel en células 290 y Sp2/0 transfectadas establemente. La inmunofusina de PSMA secretada en los medios de cultivo celular se purificó mediante Proteína A-Sepharose. El tratamiento de la inmunofusina con la proteasa plasmina convirtió cuantitativamente Fc-PSMA de 130 kD en dos productos: el dominio extracelular de PSMA de 100 kD y Fc de 31 kD. Fc se extrajo entonces de la solución mediante adsorción en Proteína A-Sepharose. La PSMA soluble se purificó y se usó para inmunizar ratones. Se espera que un anticuerpo específico sólo frente a PSMA facilite el diagnóstico y el tratamiento del cáncer de próstata.
Ejemplo 15
Expresión de Fc murina
Se preparó la región Fc de \gamma2a murina para su expresión como una inmunofusina. Dado que la región Fc murina no será inmunogénica para los ratones, puede usarse una inmunofusina de este tipo que contiene la Fc murina seguida, por ejemplo, por una pareja de fusión de proteína humana, para inmunizar ratones directamente sin escisión previa para deshacerse de la región Fc. La Fc murina se clonó en el vector de expresión de inmunofusina, tal como se describe más adelante, y se expresó a un alto nivel en las condiciones de expresión.
El dominio \gamma2a de Fc murina, precedido por el péptido señal descrito anteriormente, se clonó en un vector de expresión, pdC, y se expresó sin fusión a una proteína objetivo. El ADNc de \gamma2a de Fc murina (Sikorav et al., 1980, Nucleic Acids Res., 8:3143-3155) se adaptó para clonarse en el vector de expresión mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa usando los cebadores siguientes:
N-terminal: 5' CTTAAGC GAG CCC AGA GGG CCC ACA
C-terminal: 5' CTCGAGC TCA TTT ACC CGG AGT CCG
(Seq. ID Nos. 19 y 20). El cebador N-terminal contiene un sitio AfIII (subrayado) para el ligamiento al sitio AfIII en el extremo 3' del péptido señal, descrito anteriormente. La secuencia tras el sitio AfIII (en negrita) codifica para los residuos de aminoácidos en la región bisagra del gen \gamma2a murino. El cebador C-terminal contiene un sitio XhoI para su clonación en el vector de expresión, seguido por los anticodones del codón de terminación de la traducción y el extremo carboxilo de \gamma2a murino (en negrita).
Se demostró expresión de alto nivel de la región Fc\gamma2a murina en células 293 mediante análisis en gel de SDS, seguido por inmunotransferencia de tipo Western con un anticuerpo anti-IgG murina.
Ejemplo 16
Expresión de gp120
La proteína de la envuelta gp120 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es una glucoproteína que tiene un peso molecular de 120 kD, y se expresa en la superficie de las partículas de VIH y en las células infectadas por el VIH. La proteína gp120 se expresa originalmente en las células infectadas como una glucoproteína, gp160, que entonces se escinde mediante una proteína celular a gp120 y gp41. Se preparó gp120 como una inmunofusina y se determinó que la inmunofusina de gp120 se expresaba a un nivel muy alto. También puede prepararse cualquier parte deseada de gp120 como una inmunofusina. El resto de Fc de la inmunofusina de gp120 pudo eliminarse por escisión y se purificó gp120.
La secuencia de nucleótidos completa del VIH se ha publicado en Rather et al. (1985) Nature, 313:277. Para preparar la inmunofusina de gp120, se introdujo un codón de terminación de la traducción seguido por un sitio de restricción XhoI en la unión gp120-gp41 tras el aminoácido Arg-518 de gp160 usando técnicas de biología molecular convencionales, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa. El sitio de restricción NdeI existente presente en el nucleótido 5979, que está dentro de la parte amino terminal de gp120, se convirtió en un sitio de restricción de HindIII a través del ligamiento de ligador-adaptador para generar una fusión en marco. Entonces se clonó el fragmento HindIII-XhoI resultante (1,36 pares de kilobases) que codifica para gp120 en el vector de expresión de la inmunofusina, pdC, tal como se describió anteriormente.
El vector de expresión de la inmunofusina de gp120 se expresó en células 293 transfectadas establemente según los métodos descritos anteriormente y se obtuvo una expresión de alto nivel de la inmunofusina de gp120. La inmunofusina de gp120 era funcionalmente activa, tal como se determinó mediante la unión a CD4 en un ELISA. También se determinó que la inmunofusina de gp120 se escindía cuantitativamente mediante la enterocinasa para liberar gp120 y la región Fc.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
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(A)
NOMBRE: FUJI IMMUNOPHARMACEUTICALS CORP.
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(B)
CALLE: 125 HARTWELL AVENUE
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(C)
CIUDAD: LEXINGTON
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(D)
ESTADO: MA
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(E)
PAÍS: EE.UU.
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(F)
CÓDIGO POSTAL: 02173
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(G)
TELÉFONO: (617) 861-5300
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(H)
FAX: (617) 861-5301
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(I)
TELEX:
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: TECNOLOGÍA DE EXPRESIÓN Y EXPORTACIÓN DE PROTEÍNAS COMO INMUNOFUSINAS
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 20
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(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
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(A)
DESTINATARIO: AGENTE DE PATENTES, TESTA, HURWITZ & THIBEAULT
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(B)
CALLE: 125 HIGH CALLE
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(C)
CIUDAD: BOSTON
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(D)
ESTADO: MA
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(E)
PAÍS: EE.UU.
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(F)
CÓDIGO POSTAL: 02110
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(v)
FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
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(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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(D)
SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25
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(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
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(C)
CLASIFICACIÓN:
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(viii)
INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO / AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: PITCHER, EDMUND R.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 27.829
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA / EXPEDIENTE: FIP-001
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 617-248-7000
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: 617-248-7100
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGAATTCTT AAGCGAGCCC AAATCTTCTG ACAAAACTCA C 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGGGTAAAG GCACAGATGA TGCTACAG 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGTAGCATC ATCTGTGTTT TTAC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGGGTTCAG GGGATGACGA TGACGATA 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCTTATCGT CATCGTCATC CCCTGAAC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCGGGTCGC ATGGAG 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCGGGTCGC ATGGCA 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGGGTAAAA ACAATCATTA TGACAA 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCTTGTCA TAATGATTGT TTTTAC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGGGTAAAG CCCTGGGCC 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGGGCTTA C 
\hfill
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCGGGTGTC CCTCAG 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TACTGGCTAT AACTCGAG 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGGGTAAAT AGC 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGAGCTATT TAC 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGCTTAAAT CCTCCAATGA AGC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCGAGTTAG GCTACTTCAC TCAAAG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 707 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..707
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= "DOMINIO EXTRACELULAR DE PSMA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
1
2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTAAGCGAG CCCAGAGGGC CCACA 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCGAGCTCA TTTACCCGGA GTCCG 
\hfill
25

Claims (12)

1. Molécula de ADN que codifica para una proteína de fusión de un dominio Fc de inmunoglobulina unida a una proteína objetivo, que tiene la bioactividad de la proteína objetivo y se secreta a partir de una célula huésped de expresión de mamífero transformada con la molécula de ADN, comprendiendo dicha molécula de ADN una secuencia de polinucleótido que codifica desde su sentido 5' al 3' para:
(a) una secuencia de péptido que dirige la secreción de la proteína de fusión,
(b) una región Fc de inmunoglobulina que comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 de una inmunoglobulina y
(c) una secuencia de proteína objetivo.
2. Molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que la inmunoglobulina es IgG1.
3. Molécula de ADN según la reivindicación 1 o 2, que comprende además una secuencia de polinucleótido que codifica para un sitio de escisión proteolítica, que permite la liberación de la proteína objetivo del dominio Fc, estando interpuesta dicha secuencia entre el extremo 3'-terminal de la secuencia de polinucleótido que codifica para el dominio Fc y el extremo 5'-terminal de la secuencia de polinucleótido que codifica para la secuencia objetivo.
4. Molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, que comprende además secuencias reguladoras fusionadas al extremo 5'-terminal de la secuencia señal.
5. Molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en la que la proteína objetivo es una proteína que normalmente no se secreta o se secreta a niveles bajos.
6. Molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en la que dicha proteína objetivo es PSMA, gp120, o IL-2.
7. Vector de expresión replicable que comprende una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6.
8. Célula huésped de expresión que comprende el vector según la reivindicación 7.
9. Uso de la molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7 en un sistema de expresión in vitro para estimular la producción y la secreción de proteínas que normalmente no se secretan o se secretan a niveles bajos.
10. Método para producir in vitro una proteína de fusión de un dominio Fc de inmunoglobulina, unida a una proteína objetivo, que tiene la bioactividad de la proteína objetivo, comprendiendo dicho método las etapas de
(i) transformar una célula huésped con el vector de expresión según la reivindicación 7 para obtener la célula huésped según la reivindicación 8,
(ii) cultivar dicha célula huésped en un medio en condiciones para estimular la expresión y la secreción de dicha proteína de fusión, y
(iii) recoger la proteína de fusión del medio.
11. Método para producir una proteína objetivo, comprendiendo el método las etapas según la reivindicación 10, seguidas por las etapas:
(iv) escindir la región Fc de la proteína objetivo, y
(v) recoger la proteína objetivo.
12. Método para estimular la producción in vitro de una proteína objetivo o una proteína de fusión que comprende la proteína objetivo, que normalmente no se secreta o se secreta a niveles bajos en un procedimiento de producción recombinante, comprendiendo dicho método las etapas según las reivindicaciones 10 u 11.
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