ES2285830T3 - Procedimiento para la medicion de analito total. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para someter a ensayo un analito que se encuentra al menos parcialmente unido como un complejo con su receptor o proteína de unión soluble, comprendiendo el procedimiento las etapas de: i) formar una mezcla de fluido mezclando una muestra de fluido biológico libre de células que contiene el analito que va a determinarse con un detergente para disociar dicho complejo, en la que la concentración de detergente esté en el intervalo del 0, 25 - 4% en peso del fluido biológico, ii) mezclar la mezcla de fluido de la etapa i) con reactivos, incluyendo un componente de unión específica del analito para su unión al analito, y realizar un ensayo de unión específica para el analito, iii) y mezclar la mezcla de fluido de la etapa i) con un secuestrante para el detergente, estando la cantidad de secuestrante en el intervalo del 1 - 5% de la mezcla de reacción de unión, mediante lo cual el ensayo de unión específica de la etapa ii) se realiza en presencia del secuestrante.
Description
Procedimiento para la medición de analito
total.
La presente invención se refiere al campo de los
inmunoensayos. La invención proporciona un procedimiento sencillo y
conveniente adecuado para la medición de una gama de diferentes
tipos de analito que se encuentran total o bien parcialmente
complejados con proteínas de unión o receptores solubles, en suero o
plasma. La invención también se refiere a kits de reactivos
adecuados para realizar mediciones de analitos usando inmunoensayos
homogéneos o basados en separación.
Durante más de treinta años, los inmunoensayos
han sido el procedimiento de elección para medir concentraciones
bajas de analito en fluidos biológicos complejos. El procedimiento
es igualmente aplicable a la medición de compuestos de bajo peso
molecular tales como fármacos, esteroides y similares, así como
compuestos de peso molecular grande tales como moléculas de
proteína. La técnica combina sensibilidad y especificidad y se ha
usado en la investigación biológica básica para investigar el papel
fisiológico y patológico posible de una amplia gama de potentes
sustancias biológicamente activas, incluyendo citocinas, hormonas
esteroideas, nucleótidos cíclicos, prostaglandinas, leucotrienos y
factores de crecimiento. Han proliferado diseños de ensayos durante
los últimos treinta años, como lo han hecho los diferentes tipos de
sistemas de detección y reactivos de señal. Se han desarrollado
instrumentos sofisticados con hardware informático asociado con el
objetivo de aumentar la productividad de las muestras. Puede
encontrarse información adicional sobre los antecedentes referente
a técnicas de inmunoensayo en "The Immunoassay Handbook",
(Wild, D.G. Ed, Stockton Press, Nueva York, [1994]).
Los procedimientos iniciales eran aquellos que
suponían una etapa de separación del analito unido del libre, con
el fin de poder medir la cantidad de analito unido. Se han descrito
diversos procedimientos de separación, incluyendo absorción con
carbón, precipitación con sulfato de amonio. Más recientemente, se
han utilizado soportes sólidos para procedimientos de inmunoensayo,
incluyendo partículas magnéticas y las paredes de placas de
pocillos de microtitulación. Un desarrollo reciente ha sido la
introducción de la tecnología de radioinmunoensayo homogéneo, por
ejemplo la técnica de ensayos de proximidad de centelleo (SPA,
"scintillation proximity assays") cubiertos por la patente
estadounidense número 4.568.649.
Como alternativa a los procedimientos de
inmunoensayo basados en radioisótopos, se han introducido sistemas
no radiactivos. En la actualidad, las enzimas son los trazadores
usados más ampliamente en sistemas de inmunoensayo tales como los
ELISA y EIA. Cuando se usan en combinación con puntos finales
colorimétricos, proporcionan inmunoensayos altamente sensibles,
robustos, precisos, exactos y convenientes. Se obtuvo un gran avance
con la introducción de placas de microtitulación de noventa y seis
pocillos. Se dispone de lectores de placas de múltiples pocillos
colorimétricos, automáticos y baratos. Se han descrito varios otros
marcadores no isotópicos, de los que los marcadores luminiscentes y
fluorescentes son los más populares.
A pesar del amplio uso de los inmunoensayos,
existen todavía dificultades en la medición de analitos derivados
de tipos de muestras particulares, notablemente plasma y suero, en
las que el analito puede estar total o parcialmente complejado con
un receptor o proteína de unión soluble. Engelberts et al
(The Lancet, 338, 515-6, 1991) han comparado los
resultados de la medición de TNF\alpha en muestras de plasma de
pacientes con choque séptico usando una gama de tipos de ensayo y
se ha observado una marcada variación en la cantidad de TNF
detectada. En este contexto, se ha sugerido que las proteínas de
unión a TNF presentes en fluidos biológicos evitan la actividad
biológica de TNF y producen discrepancias entre diversas mediciones
de ensayos. La dificultad para medir analitos en la forma de sus
complejos con receptores o proteínas de unión solubles, puede
deberse al enmascaramiento de los sitios de unión a anticuerpos.
Este problema se ha tratado previamente mediante
el desarrollo de un sistema de ensayo "oligoclonal" (Medgenix),
en el que se usan hasta tres anticuerpos monoclonales no
neutralizantes en un ensayo ELISA convencional para la medición de
citocinas. En este formato de ensayo, se seleccionan anticuerpos
monoclonales para reconocer epítopos que se pueden reconocer de
manera diferente al sitio de unión del receptor o proteína de unión.
Como resultado, se reivindica que el ensayo no experimenta
interferencia de receptores o inhibidores solubles y puede medir la
citocina total.
La patente estadounidense número 4.121.975
(Ullman y Lavine) describe un procedimiento para el pretratamiento
de muestras de suero antes de la determinación mediante inmunoensayo
de poliyodotironina, particularmente tiroxina. En este ensayo, se
añade salicilato alcalino al suero como agente para liberar tiroxina
de su proteína de unión. También se incluye
alfa-ciclodextrina en la muestra de suero para
complejar moléculas interferentes endógenas, que se producen de
manera natural tales como ácidos grasos libres, lípidos y fármacos.
No se añadió ciclodextrina al suero para secuestrar el salicilato o
salvaguardar los componentes de anticuerpo del inmunoensayo.
Además, el procedimiento se describe para su uso sólo con un
analito.
La patente estadounidense número 4.798.804
(Khanna y Pearlman) describe un procedimiento para el pretratamiento
de suero antes del inmunoensayo con digoxina. El procedimiento
comprende poner en contacto la muestra de suero que va a analizarse
con \beta-ciclodextrina o polímero de
\beta-ciclodextrina en una cantidad y en
condiciones suficientes para dejar que una parte sustancial de la
digoxina en la muestra se una a la
\beta-ciclodextrina. El complejo de
\beta-ciclodextrina-digoxina se
separa de los demás componentes del medio por filtración o
centrifugación, y así se concentra enormemente la digoxina de la
muestra. Se libera la digoxina del complejo de
\beta-ciclodextrina usando ciclohexanol para
proporcionar una muestra de digoxina que puede analizarse mediante
varias técnicas de inmunoensayo.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La publicación de patente europea número 0348
173 describe el uso de un detergente en una composición líquida de
un único reactivo para inhibir la unión de un conjugado de
analito/donador enzimático y un componente
anti-analito. La adición de la muestra y una
ciclodextrina al reactivo único líquido revierte los efectos del
detergente y permite que tenga lugar la reacción de
analito/anti-analito.
El documento JP 04-326 046
describe el uso de una ciclodextrina para permitir la liberación de
un constituyente insoluble o inestable de un organismo vivo y la
medición del constituyente en presencia de un detergente.
El presente procedimiento proporciona un
procedimiento novedoso, conveniente y rápido para la cuantificación
de analito total en una muestra en la que el analito puede estar
parcial o totalmente unido a su receptor o proteína de unión
soluble. El procedimiento no depende del uso de un formato de
múltiples anticuerpos, y no requiere una manipulación extensa de la
muestra para garantizar que el analito está en una forma adecuada
para la medición. El procedimiento descrito en el presente documento
combina la tecnología de inmunoensayo convencional con una
disociación mediada por detergente del analito de su receptor o
proteína de unión.
En consecuencia, la presente invención
proporciona un procedimiento para someter a ensayo un analito que se
encuentra al menos parcialmente unido como un complejo con su
receptor o proteína de unión soluble, comprendiendo el procedimiento
las etapas de:
i) formar una mezcla de fluido mezclando una
muestra de fluido biológico libre de células que contiene el
analito que va a determinarse con un detergente para disociar dicho
complejo, en la que la concentración de detergente esté en el
intervalo del 0,25-4% en peso del fluido
biológico,
ii) mezclar la mezcla de fluido de la etapa i)
con reactivos, incluyendo un componente de unión específica del
analito para su unión al analito, y realizar un ensayo de unión
específica para el analito,
iii) y mezclar la mezcla de fluido de la etapa
i) con un secuestrante para el detergente, estando la cantidad de
secuestrante en el intervalo del 1-5% de la mezcla
de reacción de unión, mediante lo cual el ensayo de unión
específica de la etapa ii) se realiza en presencia del
secuestrante.
El analito puede ser un componente de un fluido
biológico. En principio, puede utilizarse en la invención cualquier
analito para el que esté disponible un componente de unión
específica. Las combinaciones típicas de componentes de unión
específica adecuadas para su uso con la invención pueden
seleccionarse de: interacciones hapteno-anticuerpo,
fármaco-anticuerpo, hormona
esteroidea-anticuerpo,
proteína-anticuerpo,
péptido-anticuerpo y
polipéptido-anticuerpo. Puede sustituirse una
preparación proteica de unión específica por un anticuerpo en estos
sistemas. Preferiblemente, el ensayo de unión específica es un
ensayo de unión a proteínas o particularmente un inmunoensayo. Los
analitos típicos incluyen proteínas, péptidos, citocinas,
quimiocinas, segundos mensajeros tales como AMP cíclico y GMPc,
hormonas, fármacos, esteroides, prostaglandinas, vitaminas y
leucotrienos.
El ensayo puede diseñarse para medir un analito
presente en una muestra de fluido biológico, por ejemplo suero,
plasma o líquido amniótico, muestra en la que el analito puede estar
total o parcialmente unido como un complejo con su receptor o
proteína de unión soluble. Los fluidos preferidos son suero y
plasma.
De manera adecuada, el detergente puede ser
cualquier reactivo que puede disociar un analito de su receptor o
proteína de unión complementario y puede ser de naturaleza
catiónica, aniónica, bipolar o no iónica. Los ejemplos de
detergentes adecuados incluyen bromuro de dodeciltrimetilamonio
(DTAB); cloruro de cetilpiridinio (CPC); cloruro de bencetonio
(BZC); dodecilsulfato de sodio (SDS), y
1-propansulfonato de
N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio
(DDAPS). DTAB, CPC y BZC son tensioactivos catiónicos; DDAPS es un
tensioactivo bipolar y SDS es un tensioactivo aniónico. Las
concentraciones típicas de detergente están preferiblemente en el
intervalo del 0,5-2,5% en peso del peso de la
muestra que va a determinarse. Si se usa demasiado poco detergente,
entonces la disociación del analito de su receptor o proteína de
unión soluble puede ser lenta o incompleta. Además de la actividad
disociativa del detergente con el fin de liberar un analito adecuado
para la medición, el detergente también puede afectar adversamente
a la unión del analito a su componente de unión específica añadido
en el transcurso de la etapa ii) para su ensayo. Se usa el
secuestrante para inhibir o anular este efecto adverso no
deseado.
Una característica clave de la invención es el
uso de un secuestrante para el detergente. El secuestrante actúa
para evitar que el detergente y cualquier componente asociado unido
al mismo afecten adversamente a una reacción de unión entre el
analito y su componente de unión específica. El secuestrante puede
realizar esto, por ejemplo, reaccionando químicamente con el
detergente o absorbiéndolo físicamente. Los secuestrantes
preferidos son moléculas de hidratos de carbono complejos tales como
ciclodextrinas. Las ciclodextrinas son moléculas toroidales
constituidas por 6, 7 u 8 unidades de glucosa (\alpha-, \beta- y
\gamma-ciclodextrina).
El interior del anillo se une a una cola
hidrófoba de una molécula tal como un tensioactivo. El complejo de
inclusión resultante está formado generalmente con una
estequiometría 1:1 entre tensioactivo y ciclodextrina. Se prefieren
la \gamma-ciclodextrina y particularmente la
\alpha-ciclodextrina para su uso en esta
invención. Se usa preferiblemente suficiente secuestrante para
poder secuestrar o inactivar todo el reactivo de lisis celular
presente.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, se realizan múltiples etapas en
orden en una placa de múltiples pocillos, tal como una placa de
microtitulación, o en tubos de ensayo. Si se desea, puede
transferirse el contenido de pocillos individuales de una placa de
múltiples pocillos a pocillos individuales de otra placa de
múltiples pocillos en cualquier etapa durante la realización del
procedimiento. Sin embargo, es una ventaja de la invención que todas
las etapas i), ii) y iii) pueden realizarse preferiblemente en un
único recipiente de reacción usando un inmunoensayo homogéneo.
Preferiblemente, se usa la muestra tratada que
resulta de la etapa i), sin ninguna separación o purificación
intermedia, para realizar las etapas ii) y iii). Preferiblemente, el
secuestrante se incluye en uno de los reactivos que se mezclan con
la muestra de fluido en la etapa ii). Por tanto, los componentes
presentes en un ensayo según la invención pueden comprender
normalmente:
a) una muestra que posiblemente, o que se
sospecha que, contiene el analito;
b) un detergente;
c) un componente de unión específica no marcado
del analito que está, o que puede estar, inmovilizado sobre un
soporte sólido;
d) un componente de unión específica o un
análogo del analito, que están marcados, o bien no están marcados y
pueden marcarse.
Uno o ambos de los componentes c) y d) incluye
un secuestrante, siendo irrelevante el orden de adición de los
componentes c) y d).
En un formato de la invención, el inmunoensayo
es un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). En este
formato, los componentes a), b), c) y d) están contenidos en los
pocillos de una placa de pocillos de microtitulación, siendo el
componente d) un componente de unión específica marcado con enzima
del compuesto que se está sometiendo a prueba. La medición del
ensayo se inicia mediante la adición a los pocillos de reactivos de
detección adecuados para la detección del marcador enzimático. En un
formato alternativo de la invención, el inmunoensayo es un
radioinmunoensayo. En este formato, los componentes a), b), c) y d)
están contenidos en tubos de ensayo, siendo el componente d) un
análogo marcado radiactivamente del compuesto que se está sometiendo
a prueba.
Los reactivos secuestrantes adecuados se eligen
del grupo constituido por hidratos de carbono complejos, incluyendo
ciclodextrinas. En un formato preferido, se emplea
alfa-ciclodextrina en el procedimiento de esta
invención.
El procedimiento comprende incubar con
detergente una muestra que contiene o se sospecha que contiene un
analito que va a medirse, añadir a la mezcla los reactivos
necesarios para realizar un inmunoensayo para la medición del
analito, estando disueltos uno o más de dichos reactivos en un
tampón que contiene agente secuestrante y medir la señal generada
como una medida de la cantidad de analito presente. La señal
obtenida puede compararse con las señales obtenidas usando un
conjunto de cantidades patrón de analito usando un procedimiento
paralelo y generando una curva patrón para el ensayo.
En un formato, el proceso del inmunoensayo es un
radioinmunoensayo, en el que el reactivo d) es un análogo que
contiene un radioisótopo. Los radioisótopos adecuados para su uso en
el procedimiento de ensayo de la presente invención incluyen
isótopos emisores \beta tales como tritio, y
yodo-125 que emite electrones Auger.
En un formato alternativo, el proceso de
inmunoensayo es un inmunoensayo enzimático, en el que el reactivo
d) es un componente de unión específica que está, o puede estar,
unido a un marcador enzimático. Los marcadores enzimáticos típicos
adecuados para su uso en la presente invención son fosfatasa
alcalina, \beta-galactosidasa, peroxidasa del
rábano blanco, malato deshidrogenasa y
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. La
peroxidasa del rábano blanco es un marcador enzimático
particularmente preferido para su uso en el procedimiento de
inmunoensayo enzimático según la presente invención.
En otro formato, el componente de unión
específica marcado puede incluir un marcador de fluorescencia. Los
marcadores fluorescentes adecuados para su uso en la presente
invención pueden seleccionarse de fluoresceína, rodamina y
colorantes de cianina.
El formato de ensayo preciso, la elección del
componente de unión específica, el marcador de detección y la
naturaleza de la sustancia que va a someterse a prueba, no son
críticos para la presente invención. En su lugar, la invención se
basa en la observación inesperada de que un analito, que puede estar
total o parcialmente complejado con su proteína de unión o
receptores solubles, puede determinarse mediante el uso de una etapa
de tratamiento con detergente en el procedimiento de ensayo,
mediante lo cual también puede incluirse un agente secuestrante
para convertir el analito en una forma adecuada para su
medición.
Son ilustrativos de los procedimientos de
inmunoensayo que pueden utilizarse en la presente invención los
siguientes formatos de ensayo.
El presente procedimiento proporciona un
procedimiento sencillo para medir analitos que pueden estar total o
parcialmente complejados con receptores o proteínas de unión
solubles. Los reactivos del inmunoensayo (antisueros y trazador)
pueden añadirse a los mismos pocillos que se usan para la etapa i)
del procedimiento. En la alternativa, puede transferirse una
alícuota de la muestra de la etapa i) a pocillos individuales de un
segundo recipiente a los que se añaden los reactivos del
inmunoensayo. Posteriormente, el procedimiento se lleva a cabo en
tubos o pocillos únicos sin preparación de la muestra adicional.
Se añade un detergente a la muestra de plasma o
suero que va a medirse, seguido por un componente de unión
específica no marcado y un análogo marcado del analito, preparándose
uno o ambos reactivos en un tampón que contiene el agente
secuestrante. Se incuban los reactivos juntos durante un periodo de
tiempo adecuado. El complejo inmunitario de componente de unión
específica-analito marcado unido se separa del
marcador no unido mediante medios convencionales (por ejemplo,
absorción con carbón, precipitación con sulfato de amonio o
partículas magnéticas), y se retira para el recuento una alícuota
del sobrenadante o el sedimento. Se determina la concentración de
analito en las muestras mediante interpolación a partir de una curva
patrón.
Se añade un detergente a la muestra de plasma o
suero, seguido por componente de unión específica marcado,
componente de unión no marcado y perlas centelleantes derivatizadas
con un segundo anticuerpo preparadas en un tampón que contiene el
agente secuestrante. Pueden añadirse los reactivos del inmunoensayo
(antisueros, trazador, perlas SPA preparadas en el agente
secuestrante) a los mismos pocillos de la placa de microtitulación
que se usan para el tratamiento de las muestras con detergente.
Pueden añadirse patrones a pocillos de microtitulación vacíos en la
misma placa. Pueden añadirse los reactivos (antisueros, trazador y
perlas SPA) a los mismos pocillos que se usan para la etapa i) del
procedimiento. En la alternativa, puede transferirse una alícuota de
la muestra de plasma o suero de la etapa i) a pocillos individuales
de un segundo recipiente a los que se añaden los reactivos del
inmunoensayo preparados en agente secuestrante. Se incuba la placa o
los tubos de ensayo durante un periodo de tiempo adecuado antes del
recuento en un contador de centelleo \beta. Se determina la
concentración de analito en las muestras mediante interpolación a
partir de una curva patrón.
Como alternativa, tras el tratamiento con
detergente, se incuba un componente de unión específica acoplado a
perlas centelleantes con el analito, junto con un segundo componente
de unión específica. El segundo componente de unión no está marcado
y la detección es a través de un tercer reactivo de unión que está
marcado.
Como alternativa, tras el tratamiento con
detergente, se une el complejo de antígeno/segundo componente de
unión específica a las perlas centelleantes, estando sin marcar el
segundo componente de unión específica y siendo la detección a
través de un tercer reactivo de unión que está marcado.
Este enfoque se basa en la competencia entre un
analito no marcado y una cantidad fijada de analito marcado con
enzima por un número limitado de sitios de unión en un anticuerpo
específico para el analito. Con cantidades fijadas de anticuerpo
específico y analito marcado con enzima, la cantidad de ligando
marcado con enzima unido por el anticuerpo es inversamente
proporcional a la concentración de ligando no marcado añadido. El
ligando marcado con enzima unido al anticuerpo está inmovilizado en
pocillos de microtitulación de poliestireno revestidos previamente
con un segundo anticuerpo. Por tanto, se elimina cualquier ligando
no unido del pocillo mediante simple lavado. Se determina la
cantidad de ligando marcado con enzima unido al anticuerpo con la
adición de sustrato de enzima.
Se tratan con detergente las muestras de plasma
o suero que van a medirse como en la etapa i). Se preparan patrones
de trabajo en tampón que contiene el detergente. Se preparan el
anticuerpo específico y conjugado de enzima con tampón de ensayo
que contiene agente secuestrante (ciclodextrina). Se añaden los
patrones y muestra de suero o plasma pretratada a los pocillos de
una placa de microtitulación revestida con un segundo anticuerpo.
Se mide la unión no específica en ausencia de antisueros
específicos. El patrón cero está constituido por tampón de ensayo
que solamente contiene detergente. Se pipetean en los pocillos los
antisueros específicos y el conjugado de enzima (preparados en
tampón de ensayo que contiene ciclodextrina). Se incuban las placas
de microtitulación, seguido por lavado meticuloso y adición del
sustrato de enzima. Se mide la densidad óptica y se determina la
concentración de analito en las muestras de suero o plasma mediante
interpolación a partir de una curva patrón.
Este enfoque emplea la técnica de inmunoensayo
enzimático de "intercalación" ("sandwich") cuantitativo.
Se recubren anticuerpos específicos para el analito sobre los
pocillos de una placa de microtitulación.
Se tratan con detergente las muestras de plasma
o suero que van a medirse como en la etapa i). Se preparan patrones
de trabajo en tampón que contiene el detergente de manera similar a
las muestras. Los otros componentes del sistema de ELISA (por
ejemplo anticuerpo biotinilado, anticuerpo específico marcado con
enzima, enzima marcada con estreptavidina, anticuerpo específico no
marcado y/o segundos anticuerpos marcados con enzima) se añaden
conteniendo el agente secuestrante (ciclodextrina). Se mide la
densidad óptica y se determina la concentración de analito en las
muestras de suero o plasma mediante interpolación a partir de una
curva patrón.
Se han usado extensamente las enzimas malato
deshidrogenasa y glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa en el inmunoensayo homogéneo puesto como ejemplo
mediante el sistema EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique,
técnica de inmunoensayo enzimático multiplicado). Se controlan
ambas enzimas mediante la conversión del cofactor NAD en NADH_{2}
en un espectrofotómetro a 340 nm. En este sistema de ensayo, el
analito compite con el antígeno marcado por los sitios de unión del
anticuerpo. Se modifica la actividad de la enzima cuando el
anticuerpo se une al antígeno marcado.
Se tratan con detergente las muestras de plasma
o suero que van a medirse como en la etapa i), y luego se añaden
los otros componentes del EIA EMIT homogéneo disueltos en tampón que
contiene el agente secuestrante (ciclodextrina). Se mide la
densidad óptica y se determina la concentración de analito en las
muestras mediante interpolación a partir de una curva patrón.
En el procedimiento de inmunoensayo de donador
enzimático clonado, se han sintetizado dos fragmentos inactivos de
la \beta-galactosidasa mediante ingeniería
genética. El fragmento grande, el aceptor enzimático, contiene el
95% de la enzima, y el fragmento pequeño, el donador enzimático,
está constituido por el 5% restante. Al mezclar, los dos fragmentos
se agregan en tetrámeros que tienen actividad de la enzima
\beta-galactosidasa. En este ensayo, se conjuga
un antígeno al donador enzimático de tal manera que se bloquea la
agregación con el aceptor enzimático si se une el anticuerpo al
antígeno. En presencia de analito, está unido menos conjugado por
el anticuerpo, y se estimula la actividad enzimática. En ausencia de
analito, la unión del anticuerpo al conjugado evita la formación de
la enzima activa.
Se tratan con detergente las muestras de plasma
o suero que van a medirse como en la etapa i), y luego se añaden
los otros componentes del CEDIA homogéneo (anticuerpo, conjugado de
donador enzimático/ligando, monómero de aceptor enzimático)
disueltos en tampón que contiene el agente secuestrante
(ciclodextrina). Se mide la densidad óptica y se determina la
concentración de analito en las muestras mediante interpolación a
partir de una curva
patrón.
patrón.
Como con otros marcadores, el uso de fluoróforos
da lugar a varios procedimientos de inmunoensayo diferentes que
pueden dividirse en las categorías básicas de inmunoensayo de
fluorescencia (FIA; con reactivo limitado, antígeno marcado) y
ensayo inmunofluorométrico (IFMA; reactivo en exceso, anticuerpo
marcado). Fundamentalmente, los FIA e IFMA son idénticos a los
otros inmunoensayos, tales como los EIA y ELISA, excepto porque se
usa un fluoróforo (por ejemplo un colorante de cianina, rodamina o
fluoresceína) como marcador.
En estos ensayos, se tratan con detergente las
muestras de plasma o suero que van a medirse como en la etapa i).
Se preparan patrones de trabajo en tampón que contiene el detergente
de manera similar a las muestras. Se añaden otros componentes clave
del sistema de ensayo preparados en tampón que contiene el agente
secuestrante (ciclodextrina). Se mide la intensidad de
fluorescencia y se determina la concentración de analito en las
muestras mediante interpolación a partir de una curva patrón.
La polarización de fluorescencia es una técnica
usada para distinguir el analito libre sin necesidad de separación.
En ensayos competitivos, para moléculas pequeñas, antígenos marcados
con fluorescencia (por ejemplo usando reactivos de fluoresceína,
rodamina o colorante de cianina) como trazador. En la etapa de
generación y detección de señales, un fluorímetro genera luz
verticalmente polarizada a la longitud de onda de excitación del
fluoróforo.
Se detecta la luz emitida, a una longitud de
onda inferior debido al desplazamiento de Stokes, a través de un
filtro de polarización vertical. Debido a que el trazador libre rota
a muy alta velocidad, la luz emitida está siempre en un plano
diferente al de la luz incidente, de modo que la cantidad de luz
detectada a través del filtro de polarización es mínima. Sin
embargo, el trazador unido a la molécula de anticuerpo mucho mayor
está impedido para rotar a tan alta velocidad y la luz emitida está
casi en el mismo plano que la luz incidente. Se tratan con
detergente las muestras de plasma o suero que van a medirse como en
la etapa i), y luego se añaden los otros componentes del ensayo de
fluorescencia homogéneo (anticuerpo, antígeno marcado con etiqueta
fluorescente) disueltos en tampón que contiene el agente
secuestrante (ciclodextrina). Se mide la fluorescencia y se
determina la concentración de analito en las muestras mediante
interpolación a partir de una curva patrón.
Diferentes fluoróforos tienen con frecuencia
diferentes espectros de activación y emisión (véase la tabla 1).
Sin embargo, el pico de activación de un fluoróforo puede solapar
con el pico de emisión de otro fluoróforo. Puede aplicarse este
principio para ensayos homogéneos de una o dos maneras, dependiendo
de las propiedades del segundo fluoróforo. Si el segundo fluoróforo
se sitúa en las proximidades del primero, tiene lugar la extinción
de la emisión fluorescente a través de transferencia de energía. Se
ha usado este principio en FRET mediante el acoplamiento de un
fluoróforo a un anticuerpo y de otro a un antígeno. La unión del
antígeno al anticuerpo conduce a una estrecha proximidad y a la
posterior extinción. Un sistema alternativo supone dos poblaciones
de anticuerpos obtenidos frente al mismo antígeno, marcados con dos
fluoróforos diferentes. La unión de los dos anticuerpos da lugar a
una estrecha proximidad y por tanto, la transferencia de energía
entre los dos que conduce a la extinción o reducción en la
fluorescencia. El segundo fluoróforo puede actuar como aceptor de
la transferencia de energía y emitir a una longitud de onda
superior, que el fluoróforo donador, en lugar de actuar como un
extintor. Por tanto, la determinación de la emisión a una longitud
de onda superior refleja el nivel de unión del antígeno marcado al
anticuerpo en ensayos competitivos, o anticuerpos marcados en un
ensayo de intercalación. Se tratan con detergente las muestras de
plasma o suero que van a medirse como en la etapa i), y luego se
añaden los otros componentes del ensayo de transferencia de energía
de fluorescencia homogéneo disueltos en tampón que contiene el
agente secuestrante (ciclodextrina). Se mide la fluorescencia y se
determina la concentración de analito en las muestras mediante
interpolación a partir de una curva patrón.
La fluorescencia de fondo es uno de los
principales problemas con el uso de inmunoensayos de fluorescencia,
y su presencia puede limitar gravemente el uso de estos
procedimientos. Sin embargo, la fluorescencia de fondo presente en
la mayoría de materiales biológicos tiene un corto tiempo de vida de
unos cuantos nanosegundos. Para fluoróforos con largos tiempos de
vida de fluorescencia, es posible medir la fluorescencia en un
momento en el que ha desaparecido casi toda la fluorescencia de
fondo. Éste es esencialmente el principio de la fluorescencia de
resolución temporal y puede usarse este procedimiento en combinación
con técnicas de transferencia de energía de fluorescencia y
polarización de fluorescencia.
El procedimiento descrito en esta patente puede
aplicarse a otras técnicas de inmunoensayo tales como
quimioluminiscencia, nefelometría, ensayos de aglutinación en látex
y sus variantes.
Se seleccionó la medición de interleucina 6
(IL-6) como sistema modelo para estudiar la
disociación de los receptores solubles y la medición de citocina
total en plasma. Se usaron detergentes en una serie de experimentos
preliminares en combinación con reactivo secuestrante con el fin de
determinar la concentración óptima. Se prepararon curvas de
dosis-respuesta para IL-6 en
detergente y ciclodextrina. Se usaron parámetros tales como
sensibilidad del ensayo, intervalo de trabajo y unión de
antígeno:anticuerpo para establecer los reactivos más adecuados y
las concentraciones óptimas tanto para el detergente como la
ciclodextrina.
Kit de ELISA para interleucina 6 humana,
Amersham, RPN 2754
Alfa-ciclodextrina, USB,
13979
Bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB), Sigma,
D8638
Tubos de ensayo desechables para preparar
patrones de trabajo
Pipetas y equipo de pipeteo
Material de vidrio para laboratorio
Agua destilada
Agitador magnético
Lavador de placas de microtitulación
Lector de placas de microtitulación
Se prepararon curvas patrón tal como sigue. Se
prepararon patrones de trabajo (10,24-400 pg/ml de
IL-6) en tubos de polipropileno con tampón de
ensayo que contenía DTAB al 1% (p/v). Se preparó el anticuerpo
biotinilado en tampón que contenía
alfa-ciclodextrina al 3% (p/v). Se añadieron 50
\mul de reactivo de anticuerpo biotinilado (que contenía
ciclodextrina) a la placa revestida con
anti-IL-6. Se pipetearon 50 \mul
de patrón de trabajo en los pocillos de la placa revestida con
anti-IL-6. Se determinó la unión no
específica en ausencia de IL-6 (patrón cero de
IL-6). El orden de adición del anticuerpo
biotinilado y patrones no es crítico para el procedimiento. Sin
embargo, en todos los ejemplos, se obtuvieron resultados mejorados
cuando se añadió el anticuerpo biotinilado a la placa revestida con
anti-IL-6 antes de los patrones. Se
incubó la placa con anti-IL-6, que
contenía el anticuerpo biotinilado y los patrones, durante 2 horas
a temperatura ambiente. Se lavó meticulosamente la placa, seguido
por la adición de 100 \mul/pocillo de estreptavidina marcada con
peroxidasa diluida (30 \mul de concentrado a 12 ml de tampón de
dilución de estreptavidina). Se incubó la placa a temperatura
ambiente durante 30 minutos seguido por lavado meticuloso. Se
añadieron 100 \mul de sustrato TMB a cada pocillo de la placa,
seguido por una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Se
terminó la reacción mediante la adición de 100 \mul/pocillo de
ácido sulfúrico. Se determinó la densidad óptica con un
espectrofotómetro para placas de microtitulación.
Se realizaron comparaciones con curvas
preparadas con tampón de ensayo que contenía:
Patrones y anticuerpos en tampón de ensayo
solamente (DTAB y ciclodextrina ausentes)
Patrones preparados en DTAB, anticuerpos
preparados en tampón de ensayo solamente.
Se presenta el efecto de incluir detergente y
secuestrante en el sistema de IL-6 ELISA en las
figuras 1 y 2. La figura 1 muestra una inhibición de la unión del
anticuerpo cuando se añade DTAB al 1% (p/v) al ensayo de
IL-6. Se restauró la unión con la inclusión de
alfa-ciclodextrina al 3% (p/v) en el anticuerpo
biotinilado anti-IL-6.
Este experimento describe un procedimiento
sencillo para la medición de citocina total en plasma. La técnica
descrita en el presente documento es un procedimiento de dos etapas
en el que se añade un detergente al plasma y se retira
posteriormente una alícuota para la medición usando una técnica de
inmunoensayo (ELISA). Se preparó el componente crítico del ELISA
(el anticuerpo biotinilado) en tampón que contenía
ciclodextrina.
Kit de ELISA para interleucina 6 humana,
Amersham, RPN 2754
Plasma humano normal
Alfa-ciclodextrina, USB,
13979
Bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB), Sigma,
D8638
Tubos de ensayo desechables para preparar
patrones de trabajo
Pipetas y equipo de pipeteo
Material de vidrio para laboratorio
Agua destilada
Agitador magnético
Lavador de placas de microtitulación
Lector de placas de microtitulación
Se añadió detergente (DTAB) a plasma o suero
para dar una concentración final del 1% (p/v). Normalmente, se
añadieron 100 \mul de DTAB al 10% (p/v) en tampón de ensayo a 900
\mul de muestra de suero o plasma. Se retiró para el ensayo una
alícuota (50 \mul) del suero o plasma tratado. Se prepararon
patrones de IL-6 con tampón de ensayo que contenía
DTAB al 1% (p/v).
Se prepararon patrones de trabajo
(10,24-400 \mug/ml de IL-6) en
tubos de polipropileno con tampón de ensayo que contenía DTAB al 1%
(p/v). Se preparó el anticuerpo biotinilado en tampón que contenía
alfa-ciclodextrina al 3% (p/v). Se añadieron 50
\mul de reactivo de anticuerpo biotinilado (que contenía
ciclodextrina) a la placa revestida con
anti-IL-6. Se pipetearon 50 \mul
de patrón de trabajo y muestra de suero o plasma pretratado en
pocillos separados de la placa revestida con
anti-IL-6. Se determinó la unión no
específica en ausencia de IL-6. Se incubó la placa
con anti-IL-6, que contenía
anticuerpo biotinilado y patrones/muestra, durante 2 horas a
temperatura ambiente. Se lavó meticulosamente la placa, seguido por
la adición de 100 \mul/pocillo de estreptavidina marcada con
peroxidasa diluida (30 \mul de concentrado a 12 ml de tampón de
dilución de estreptavidina). Se incubó la placa a temperatura
ambiente durante 30 minutos seguido por lavado meticuloso. Se
añadieron 100 \mul de sustrato TMB a cada pocillo de la placa,
seguido por una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Se
terminó la reacción mediante la adición de 100 \mul/pocillo de
ácido sulfúrico. Se determinó la densidad óptica con un
espectrofotómetro para placas de microtitulación. Se determinaron
los niveles de IL-6 usando análisis log/lineal con
referencia a una curva patrón. Se determinaron los niveles de
citocina en suero o plasma mediante interpolación.
Se muestran los efectos de añadir detergente a
muestras de plasma humano normal, y, ciclodextrina a los reactivos
clave del sistema de ELISA para IL-6 en la tabla 2.
Se diluyeron muestras de plasma con tampón de ensayo (plasma puro y
diluido 1:5-1:20) antes de la medición. Se
prepararon muestras control en ausencia de detergente y se midieron
sin la adición de ciclodextrina a los anticuerpos biotinilados. Las
muestras tratadas con detergente y medidas en presencia de
ciclodextrina mostraron un aumento significativo en la concentración
de IL-6 (un ascenso medio del 165%). Esta
observación inesperada se considera que es el resultado de la
disociación de IL-6 plasmática del receptor de
IL-6 soluble, que se produce de forma natural.
Con el fin de confirmar la utilidad del
procedimiento, se llevaron a cabo experimentos de recuperación con
cantidades conocidas de IL- 6 añadidas a plasma humano normal. Se
midieron las muestras en presencia y ausencia de detergente y
ciclodextrina. Se evaluaron un intervalo de concentraciones de
IL-6 y diluciones de plasma.
Kit de ELISA para interleucina 6 humana,
Amersham, RPN 2754
Plasma humano normal
Interleucina 6 humana recombinante, Amersham,
ARM 20010
Alfa-ciclodextrina, USB,
13979
Bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB), Sigma,
D8638
Tubos de ensayo desechables para preparar
patrones de trabajo
Pipetas y equipo de pipeteo
Material de vidrio para laboratorio
Agua destilada
Agitador magnético
Lavador de placas de microtitulación
Lector de placas de microtitulación
Se añadió IL-6 recombinante a
plasma humano normal a un intervalo de concentraciones
(25-200 pg/ml). Se añadieron cantidades conocidas
de IL-6 a varias diluciones diferentes (plasma puro,
1:5-1:20) de plasma. Se añadió detergente (DTAB) al
plasma para dar una concentración final del 1% (p/v). Normalmente,
se añadieron 100 \mul de DTAB al 10% (p/v) preparado en tampón de
ensayo a 900 \mul de muestra de plasma. Se retiró para el ensayo
una alícuota (50 \mul) del plasma tratado. Se prepararon patrones
de IL-6 con tampón de ensayo que contenía DTAB al 1%
(p/v).
Se prepararon patrones de trabajo
(10,24-400 pg/ml de IL-6) en tubos
de polipropileno con tampón de ensayo que contenía DTAB al 1%
(p/v). Se preparó el anticuerpo biotinilado en tampón que contenía
alfa-ciclodextrina al 3% (p/v). 50 \mul de
reactivo de anticuerpo biotinilado (que contenía ciclodextrina) a la
placa revestida con anti-IL-6. Se
pipetearon 50 \mul de patrón de trabajo y muestras de plasma
pretratadas en pocillos separados de la placa revestida con
anti-IL-6. Se determinó la unión no
específica en ausencia de IL-6. Se incubó la placa
con anti-IL-6, que contenía
anticuerpo biotinilado y patrones/muestras durante 2 horas a
temperatura ambiente. Se lavó meticulosamente la placa, seguido por
la adición de 100 \mul/pocillo de estreptavidina marcada con
peroxidasa diluida (30 \mul de concentrado a 12 ml de tampón de
dilución de estreptavidina). Se incubó la placa a temperatura
ambiente durante 30 minutos seguido por lavado meticuloso. Se
añadieron 100 \mul de sustrato TMB a cada pocillo de la placa,
seguido por una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Se
terminó la reacción mediante la adición de 100 \mul/pocillo de
ácido sulfúrico. Se determinó la densidad óptica con un
espectrofotómetro para placas de microtitulación. Se determinaron
los niveles de interleucina 6 usando análisis log/lineal con
referencia a una curva patrón. Se determinaron los niveles de
citocina en plasma mediante interpolación. Se prepararon muestras
control en ausencia de detergente y se midieron sin la adición de
ciclodextrina a los anticuerpos biotinilados.
Se muestra el efecto de añadir detergente a
muestras de plasma humano normal con la adición de concentraciones
conocidas de IL-6 recombinante en la figura 3. La
recuperación de IL-6 medida en ausencia de
detergente y ciclodextrina fue relativamente baja (recuperación
media del 63%). Las muestras tratadas con detergente y medidas en
presencia de ciclodextrina mostraron un aumento en la recuperación
de IL-6 añadida (recuperación media del 93%). Esta
observación inesperada se considera que es el resultado de la
disociación de IL-6 plasmática del receptor de
IL-6 soluble, que se produce de forma natural.
Se llevaron a cabo experimentos de recuperación
con cantidades conocidas de IL-6 y receptor soluble
añadidas a plasma humano normal. Se midieron las muestras tanto en
presencia como en ausencia de detergente y ciclodextrina. Se
evaluaron un intervalo de concentraciones de IL-6 y
diluciones de plasma.
\newpage
Kit de ELISA para interleucina 6 humana,
Amersham, RPN 2754
Plasma humano normal
Interleucina 6 humana recombinante, Amersham,
ARM 20010
Receptor soluble de IL-6 humano
recombinante, R&D Systems, 227SR-025
Alfa-ciclodextrina, USB,
13979
Bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB), Sigma,
D8638
Tubos de ensayo desechables para preparar
patrones de trabajo
Pipetas y equipo de pipeteo
Material de vidrio para laboratorio
Agua destilada
Agitador magnético
Lavador de placas de microtitulación
Lector de placas de microtitulación
Se añadió IL-6 recombinante a
plasma humano normal a un intervalo de concentraciones
(25-200 pg/ml) en presencia del receptor de
IL-6 soluble 12,5 ng/ml. Se añadieron cantidades
conocidas de IL-6 a varias diluciones diferentes
(plasma puro, 1:5-1:20) de plasma. Se añadió
detergente (DTAB) al plasma para dar una concentración final del 1%
(p/v). Normalmente, se añadieron 100 \mul de DTAB al 10% (p/v)
preparado en tampón de ensayo a 900 \mul de muestra de plasma. Se
retiró para el ensayo una alícuota (50 \mul) del plasma tratado.
Se prepararon patrones de IL-6 con tampón de ensayo
que contenía DTAB al 1% (p/v). Se prepararon patrones de trabajo
(10,24-400 pg/ml de IL-6) en tubos
de polipropileno con tampón de ensayo que contenía DTAB al 1% (p/v).
Se preparó el anticuerpo biotinilado en tampón que contenía
alfa-ciclodextrina al 3% (p/v). Se añadieron 50
\mul de reactivo de anticuerpo biotinilado (que contenía
ciclodextrina) a la placa revestida con
anti-IL-6. Se pipetearon 50 \mul
de patrón de trabajo y muestra de plasma pretratada en pocillos
separados de la placa revestida con
anti-IL-6. Se determinó la unión no
específica en ausencia de IL-6. Se incubó la placa
con anti-IL-6, que contenía
anticuerpo biotinilado y patrones/muestras durante 2 horas a
temperatura ambiente. Se lavó meticulosamente la placa, seguido por
la adición de 100 \mul/pocillo de estreptavidina marcada con
peroxidasa diluida (30 \mul de concentrado a 12 ml de tampón de
dilución de estreptavidina). Se incubó la placa a temperatura
ambiente durante 30 minutos seguido por lavado meticuloso. Se
añadieron 100 \mul de sustrato TMB a cada pocillo de la placa,
seguido por una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Se
terminó la reacción mediante la adición de 100 \mul/pocillo de
ácido sulfúrico. Se determinó la densidad óptica con un
espectrofotómetro para placas de microtitulación. Se determinaron
los niveles de interleucina 6 usando análisis log/lineal con
referencia a una curva patrón. Se determinaron los niveles de
citocina en plasma mediante interpolación. Se prepararon muestras
control en ausencia de detergente y se midieron sin la adición de
ciclodextrina a los anticuerpos biotinilados.
Se muestran los efectos de añadir detergente a
muestras de plasma humano normal con adición de concentraciones
conocidas de IL-6 recombinante y receptor de
IL-6 soluble 12,5 mg/ml en la figura 4. La
recuperación de IL-6 medida en ausencia de
detergente y ciclodextrina fue relativamente baja (recuperación
media del 22%). Las muestras tratadas con detergente y medidas en
presencia de ciclodextrina mostraron un aumento en la recuperación
de IL-6 añadida (recuperación media del 47%).
Claramente, el aumento en la recuperación es el resultado directo
de la disociación de IL-6 plasmática del receptor de
IL-6 recombinante.
Este experimento describe un procedimiento
sencillo para la medición directa de prostaglandina E_{2}
(PGE_{2}) en plasma. Según el procedimiento, se añade detergente
al plasma y posteriormente se retira una alícuota para la medición
usando a inmunoensayo enzimático competitivo (EIA). Se prepararon
los componentes críticos del ensayo (los antisueros y el conjugado
de PGE_{2}) en tampón que contenía ciclodextrina.
Kit de EIA para prostaglandina E_{2}, Amersham
Pharmacia Biotech, RPN 222
Plasma humano normal (preparado en presencia de
indometacina- véase a continuación)
Alfa-ciclodextrina, USB,
13979
Bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB), Sigma,
D8638
Tubos de ensayo desechables para preparar
patrones de trabajo
Pipetas y equipo de pipeteo
Material de vidrio para laboratorio
Agua destilada
Agitador magnético
Lavador de placas de microtitulación
Lector de placas de microtitulación
Se procesaron todas las muestras de plasma
inmediatamente después de la recogida y se sometieron a ensayo lo
antes posible. Los niveles de PGE_{2} en plasma disminuyen
significativamente si se almacena de -15ºC a -30ºC durante una
semana. Se recomiendan EDTA o citrato como anticoagulantes. Se
añadieron 2 g de EDTA de disodio y 0,8 g de NaCl a agua, se ajustó
el pH con NaOH 1 M hasta 7,4, y, se enrasó el volumen final hasta
100 ml con agua destilada. Se añadieron 50 mg de indometacina a 3,5
ml de etanol absoluto. Para cada tubo de recogida de sangre, se
añadieron 0,25 ml de disolución de EDTA a 0,05 ml de indometacina.
Se añadieron 10 ml de sangre fresca a cada tubo, se centrifugó
inmediatamente la muestra a 15000xg durante 15 minutos a 4ºC, se
retiró la fase plasmática superior y se congeló rápidamente. Se
almacenaron las muestras de -15ºC a -30ºC. Se añadió detergente
(DTAB) al plasma para dar una concentración final del 0,25% (p/v).
Normalmente, se añadieron 100 \mul de DTAB al 2,5% (p/v),
preparado en tampón de ensayo del kit de EIA para PGE_{2}, a 900
\mul de muestra de plasma. Se retiró para el ensayo una alícuota
(50 \mul) del plasma tratado. Se prepararon patrones de PGE_{2}
con tampón de ensayo que contenía DTAB al 0,25% (p/v). Se prepararon
patrones de trabajo de PGE_{2} (2,5-320
pg/pocillo) en tubos de polipropileno con tampón de ensayo que
contenía DTAB al 0,25% (p/v). Se prepararon el anticuerpo frente a
PGE_{2} y el conjugado de PGE_{2} con tampón de ensayo que
contenía alfa-ciclodextrina al 1,5% (p/v). Se
pipetearon 50 \mul de patrón de trabajo y muestra de plasma
tratada con DTAB en pocillos separados de una placa revestida con
IgG de cabra anti-ratón. Se midió la unión no
específica en ausencia de antisueros de PGE_{2}. La PGE_{2} de
patrón cero estaba constituida por tampón de ensayo que contenía
DTAB al 0,25% (p/v) solamente. Se pipetearon 50 \mul de antisueros
y 50 \mul de conjugado (preparados en tampón de ensayo que
contenía alfa-ciclodextrina al 1,5% (p/v)) en los
pocillos de prueba apropiados (que contenían patrones o muestras de
plasma tratadas). Se incubaron las placas durante 1 hora a
temperatura ambiente con agitación constante, seguido por lavado
meticuloso. Se añadieron 150 \mul de sustrato TMB a todos los
pocillos y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Se terminó la reacción mediante la adición de 100 \mul/pocillo de
ácido sulfúrico. Se determinaron las densidades ópticas con un
espectrofotómetro para placas de microtitulación fijo a 450 nm. Se
determinaron los niveles de PGE_{2} intracelular usando análisis
log/lineal con referencia a una curva patrón. Se estimaron los
niveles mediante interpolación.
Se muestran los efectos de añadir detergente a
muestras de plasma, y, ciclodextrina a los reactivos clave del
sistema de EIA para PGE_{2} en la tabla 3. Se prepararon muestras
control en ausencia de detergente y se midieron sin la adición de
ciclodextrina a los antisueros y conjugado. Las muestras de plasma
tratadas con detergente y medidas en presencia de ciclodextrina
mostraron un aumento significativo en la concentración de PGE_{2}
(ascenso medio del 215%). Esta observación inesperada se considera
que es el resultado de la disociación de PGE_{2} del receptor de
PGE_{2} soluble, que se produce de forma natural.
Se prepararon muestras de plasma en presencia de
indometacina tal como se describe en el ejemplo 5. Se evaluaron un
intervalo de concentraciones de PGE_{2} y diluciones de
plasma.
Kit de EIA para prostaglandina E_{2}, Amersham
Pharmacia Biotech, RPN 222
Plasma humano normal (preparado en presencia de
indometacina)
Alfa-ciclodextrina, USB,
13979
Bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB), Sigma,
D8638
Tubos de ensayo desechables para preparar
patrones de trabajo
Pipetas y equipo de pipeteo
Material de vidrio para laboratorio
Agua destilada
Agitador magnético
Lavador de placas de microtitulación
Lector de placas de microtitulación
Se añadió PGE_{2} a plasma humano en un
intervalo de concentraciones (25-200 pg/ml). Se
añadieron cantidades conocidas de PGE_{2} a varias diluciones
diferentes (plasma puro, 1:5-1:20) de plasma.
Normalmente, se añadieron 100 \mul de DTAB al 2,5% (p/v),
preparado en tampón de ensayo del kit de EIA para PGE_{2}, a 900
\mul de muestra de plasma. Se retiró para el ensayo una alícuota
(50 \mul) del plasma tratado. Se prepararon patrones de PGE_{2}
con tampón de ensayo que contenía DTAB al 2,5% (p/v). Se prepararon
patrones de trabajo de PGE_{2} (2,5-320
\mug/pocillo) en tubos de polipropileno con tampón de ensayo que
contenía DTAB al 0,25% (p/v). Se prepararon el anticuerpo frente a
PGE_{2} y el conjugado de PGE_{2} con tampón de ensayo que
contenía alfa-ciclodextrina al 1,5% (p/v). Se
pipetearon 50 \mul de patrón de trabajo y muestra de plasma
tratada con DTAB en pocillos separados de una placa de IgG de cabra
anti-ratón. Se midió la unión no específica en
ausencia de antisueros de PGE_{2}. La PGE_{2} de patrón cero
estaba constituida por tampón de ensayo que contenía DTAB al 0,25%
(p/v) solamente. Se pipetearon 50 \mul de antisueros y 50 \mul
de conjugado (preparados en tampón de ensayo que contenía
alfa-ciclodextrina al 1,5% (p/v)) en los pocillos de
prueba apropiados (que contenían patrones o muestras de plasma
tratadas). Se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura
ambiente con agitación constante, seguido por lavado meticuloso. Se
añadieron 150 \mul de sustrato TMB a todos los pocillos y se
incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se terminó la
reacción mediante la adición de 100 \mul/pocillo de ácido
sulfúrico. Se determinaron las densidades ópticas con un
espectrofotómetro para placas de microtitulación fijo a 450 nm. Se
determinaron los niveles de PGE_{2} intracelular usando análisis
log/lineal con referencia a una curva patrón. Se estimaron los
niveles mediante interpolación. Se prepararon muestras control en
ausencia de detergente y se midieron sin la adición de ciclodextrina
a los antisueros y conjugado.
Se muestra el efecto de añadir detergente a
muestras de plasma humano normal con la adición de una concentración
conocida de PGE_{2} en la figura 5. La recuperación de PGE_{2}
medida en ausencia de detergente y ciclodextrina fue relativamente
baja (recuperación media del 63%). Las muestras tratadas con
detergente y medidas en presencia de ciclodextrina mostraron un
aumento en la recuperación de PGE_{2} añadida (recuperación media
del 103%). Esta observación inesperada se considera que es el
resultado de la disociación de PGE_{2} del receptor de PGE_{2}
soluble, que se produce de forma natural.
Figura
1
Se prepararon patrones de interleucina 6
(10,24-400 pg/ml) en diluyente patrón en presencia
(\Box) o bien en ausencia (\bullet) de detergente (DTAB al 1%
p/v). Se añadieron alícuotas (50 \mul) de anticuerpo biotinilado
(ciclodextrina cero) a la placa revestida con
anti-IL-6 seguido por patrón (50
\mul). Se incubó la placa durante 2 horas a temperatura ambiente,
y se midió la densidad óptica según se describe en la sección de
procedimientos.
Figura
2
Se preparó interleucina 6
(10,24-400 pg/ml) en diluyente patrón en presencia
(\Box) o bien en ausencia (\bullet) de detergente (DTAB al 1%).
Se añadieron alícuotas (50 \mul) de anticuerpo biotinilado,
preparado en presencia (\Box) o ausencia (\bullet) de
ciclodextrina (al 3% p/v), a la placa revestida con
anti-IL-6 seguido por patrón (50
\mul). Se incubó la placa durante 2 horas a temperatura ambiente,
y se midió la densidad óptica según se describe en la sección de
procedimientos.
Figura
3
Se añadieron concentraciones conocidas
(25-200 pg/ml) de interleucina 6 humana recombinante
a muestras de plasma humano normal. Se midieron las muestras en
presencia (A) y ausencia (B) de detergente y ciclodextrina. Se
evaluaron varias diluciones diferentes de plasma. Se llevaron a cabo
los ensayos según se describe en la sección de procedimientos.
Figura
4
Se añadieron concentraciones conocidas
(25-200 pg/ml) de interleucina 6 humana recombinante
y receptor de IL-6 soluble (12,5 ng/ml) a muestras
de plasma humano normal. Se midieron las muestras en presencia (A) y
ausencia (B) de detergente y ciclodextrina. Se evaluaron varias
diluciones diferentes de plasma. Se llevaron a cabo los ensayos
según se describe en la sección de procedimientos.
Figura
5
Se añadieron concentraciones conocidas
(25-200 pg/ml) de PGE_{2} a muestras de plasma
humano normal. Se midieron las muestras en presencia (A) y ausencia
(B) de detergente y ciclodextrina. Se evaluaron varias diluciones
diferentes de plasma. Se llevaron a cabo los ensayos según se
describe en la sección de procedimientos.
Claims (8)
1. Un procedimiento para someter a ensayo un
analito que se encuentra al menos parcialmente unido como un
complejo con su receptor o proteína de unión soluble, comprendiendo
el procedimiento las etapas de:
i) formar una mezcla de fluido mezclando una
muestra de fluido biológico libre de células que contiene el analito
que va a determinarse con un detergente para disociar dicho
complejo, en la que la concentración de detergente esté en el
intervalo del 0,25 - 4% en peso del fluido biológico,
ii) mezclar la mezcla de fluido de la etapa i)
con reactivos, incluyendo un componente de unión específica del
analito para su unión al analito, y realizar un ensayo de unión
específica para el analito,
iii) y mezclar la mezcla de fluido de la etapa
i) con un secuestrante para el detergente, estando la cantidad de
secuestrante en el intervalo del 1 - 5% de la mezcla de reacción de
unión, mediante lo cual el ensayo de unión específica de la etapa
ii) se realiza en presencia del secuestrante.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el secuestrante es una ciclodextrina.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que las etapas i), ii) y iii) se
realizan todas en un único recipiente de reacción.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que se realizan múltiples ensayos en
paralelo en pocillos de una placa de múltiples pocillos o con tubos
de ensayo.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el ensayo de la etapa ii) es un
ensayo homogéneo.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el ensayo de la etapa ii) es un ensayo de proximidad de
centelleo.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el ensayo de unión específica de
la etapa ii) es un inmunoensayo.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el analito es interleucina 6 o
prostaglandina E_{2}, el detergente es bromuro de
dodeciltrimetilamonio y el secuestrante es
\alpha-ciclodextrina.
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