JPH0348765A - 免疫的検出用物質及び免疫的検出法 - Google Patents
免疫的検出用物質及び免疫的検出法Info
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- JPH0348765A JPH0348765A JP1185519A JP18551989A JPH0348765A JP H0348765 A JPH0348765 A JP H0348765A JP 1185519 A JP1185519 A JP 1185519A JP 18551989 A JP18551989 A JP 18551989A JP H0348765 A JPH0348765 A JP H0348765A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明Ｃ−ｔ 主として臨床検査における病原体ある
いは疾病マーカーなどの検と さらには広〈産業上の極
微量検出に利用される免疫的検出用物質及び免疫的測定
法に関すも 従来の技術 天然に存在すゑ あるいは人工的に作製した抗体を用い
た測定法（よ 高特異性及び高感度の点に特徴を有し
極微量の存在割合の被検出物質を検出する目的で現在用
いられていも 例えば 血液中から病原体 あるいは腫
戚 心筋梗寡 脳血栓などの疾病時に特異的に分泌され
ているいわゆる疾患マーカーなどの臨床検査業務や、大
気中から極微蛍の物質を検出する場合などに用いられも
近年この様な目的で、例えば石川栄治河合忠 宮井潔著
［“酵素免疫測定法第３版」 （医学書院１９８７年、
３１−５４頁）に記載されているように多くの種類の免
疫測定法が開発されている。この方法（飄 検出物質が
高分子（タンパク質）か低分子（ハブテン）かによって
２分されも 本発明では主としてハプテン系を対象とし
ており、このための代表例であゑ ＥＬＩＳＡ法の実験
手順を段階を追って説明すも （Ａ、）抗原のコーティング キャリアー蛋巨 例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
に 検出物質あるいはこれに官能基を導入した誘導体を
結合したコンジュゲートをバッファに溶解して抗原溶液
とす４ マイクロプレート（塩化ビニル或はポリスチレン製９６
ウエルプレート）に抗原を１００μＬ／ウェル注入り、
２０℃で１夜保存すａ （Ｂ）ブロッキング ＢＳＡのバッファー溶液を２５０μｌ／ウエル注入し０
、５−２時間室温で放置すム その後、バッファーまた
は純水で３−５回洗浄する。
いは疾病マーカーなどの検と さらには広〈産業上の極
微量検出に利用される免疫的検出用物質及び免疫的測定
法に関すも 従来の技術 天然に存在すゑ あるいは人工的に作製した抗体を用い
た測定法（よ 高特異性及び高感度の点に特徴を有し
極微量の存在割合の被検出物質を検出する目的で現在用
いられていも 例えば 血液中から病原体 あるいは腫
戚 心筋梗寡 脳血栓などの疾病時に特異的に分泌され
ているいわゆる疾患マーカーなどの臨床検査業務や、大
気中から極微蛍の物質を検出する場合などに用いられも
近年この様な目的で、例えば石川栄治河合忠 宮井潔著
［“酵素免疫測定法第３版」 （医学書院１９８７年、
３１−５４頁）に記載されているように多くの種類の免
疫測定法が開発されている。この方法（飄 検出物質が
高分子（タンパク質）か低分子（ハブテン）かによって
２分されも 本発明では主としてハプテン系を対象とし
ており、このための代表例であゑ ＥＬＩＳＡ法の実験
手順を段階を追って説明すも （Ａ、）抗原のコーティング キャリアー蛋巨 例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
に 検出物質あるいはこれに官能基を導入した誘導体を
結合したコンジュゲートをバッファに溶解して抗原溶液
とす４ マイクロプレート（塩化ビニル或はポリスチレン製９６
ウエルプレート）に抗原を１００μＬ／ウェル注入り、
２０℃で１夜保存すａ （Ｂ）ブロッキング ＢＳＡのバッファー溶液を２５０μｌ／ウエル注入し０
、５−２時間室温で放置すム その後、バッファーまた
は純水で３−５回洗浄する。
（Ｃ）抗体の反応
検出物質溶液を注入し 振とうしながら抗体溶液をさら
に加えも 常温で３−５時間保存した後、アスピレータ
で抗体溶液を除去Ｕ バッファーまたは純水で３−５回
洗浄すａ （Ｄ）第２抗体の反応 （Ｃ）項の抗体に対する抗体を酵泰 例えばペルオキシ
ダーゼで標識したちのく第２抗体）の溶液を注入し 常
温で０．５−２時間放置すａ その後、バッファーまた
は純水で３−５回洗浄すム（Ｅ）基質の反応と停止 発色剋 例えば０−フェニレンジアミン（セレン検出用
）をバッファーに溶解し 直前に３０％過酸化水素水を
加えた溶液（基質溶液）を注入し 室温で発色反応を行
う。５−２０分＆４Ｎ硫酸で反応を停止すム （Ｆ）測定 マイクロプレート用吸光光度系を用いて４９２ｎｍの吸
光度を測定すも 最終的に被検出物質が多いほど吸光度
が小さいことを利用して、被検出物質の検出を行う。
に加えも 常温で３−５時間保存した後、アスピレータ
で抗体溶液を除去Ｕ バッファーまたは純水で３−５回
洗浄すａ （Ｄ）第２抗体の反応 （Ｃ）項の抗体に対する抗体を酵泰 例えばペルオキシ
ダーゼで標識したちのく第２抗体）の溶液を注入し 常
温で０．５−２時間放置すａ その後、バッファーまた
は純水で３−５回洗浄すム（Ｅ）基質の反応と停止 発色剋 例えば０−フェニレンジアミン（セレン検出用
）をバッファーに溶解し 直前に３０％過酸化水素水を
加えた溶液（基質溶液）を注入し 室温で発色反応を行
う。５−２０分＆４Ｎ硫酸で反応を停止すム （Ｆ）測定 マイクロプレート用吸光光度系を用いて４９２ｎｍの吸
光度を測定すも 最終的に被検出物質が多いほど吸光度
が小さいことを利用して、被検出物質の検出を行う。
発明が解決しようとする課題
従来の免疫的検出方法は 抗原抗体結合物と未結合物と
を分離するために多くの手順を必要としてい九 また反
応系が固相と液相め共存する不均一系であり、最終的な
検出に酵素反応を用いているたべ 通常５時間程度を要
してい九 本発明は このような従来技術の課題を解決することを
目的とすム 課題を解決するための手段 本発明（よ 被検出物質あるいはその類似物質に蛍光物
質を結合させたものであって、これが被検出物質に対す
る抗体を結合したとき抗体の発する蛍光を励起光として
蛍光が増強するものであることを特徴とする免疫的検出
用物質であもまた 本発明（よ 被検出物質に対する抗
体溶液にあらかじめその免疫的検出用物質を混合してお
き、その混合溶液に被検出物質を加えると免疫的検出用
物質と被検出物質との間の競合反応に伴う蛍光強度の変
化から被検出物質の存在量を測定することを特徴とする
免疫的測定法であも作用 本発明は 被検出物質に対する抗体溶液艮 あらかじめ
被検出物質あるいはその類似物質に蛍光物質を結合させ
たものを混合しておき、その混合溶液に被検出物質を加
えると、その混合物質と被検出物質との間の競合反応に
伴い蛍光強度が変化すも この変化を利用して、被検出
物質の存在量を測定すも このようにして、反応がすべて均−系（液相）で進行し
さらに酵素反応を用いないため検出時間の著しい短縮
を行うことが可能となん実施例 以下へ 本発明の実施例について図面を参照しながら説
明すも 発明者ら１よ メタンフェタミン、アンフエタミンある
いはエフェドリン家 それ自身蛍光性に蛍光消光性も有
していない物質と蛍光プローブの結合物質が抗体水溶液
中で抗体と結合した胤 抗体自身が本質的に有している
蛍光が、 蛍光プローブ物質の励起波長となり蛍光が増
強する事実を発児し この蛍光プローブ物質の合成を
し、この原理を検出方法に適用したものであａ 一般に抗体は２８０Ｉｍの励起光で３４０Ｉｍ付近に蛍
光を発する。この蛍光（よ 構成アミノ酸の一つである
Ｉ、トリプトファン残基などに由来するものであるが、
この蛍光の性質（よ 抗原が結合することによって変
化するこ七があム 例えばジニトロフェニルやジアゾ色
素へ 各々の抗体が結合すると抗体分子の持つトリプト
ファン残基の蛍光は消光されてしまう。この蛍光消光（
よ 抗原分子へのエネルギー転移の結果起こるものであ
ａ 一方 ダンシル基に対する抗体とダンシル基との抗
原抗体反応物を２８０ｎｌｌＩで励起すると５３０Ｉｍ
付近に蛍光を発することは知られていも この現象（上
結合部位の環境などに情報を与えるものであっム こ
れ（上２８０ｎｍで励起された抗体分子の３４０Ｉｍの
蛍光がダンシル基の励起波長となった結果５３０ｎｍ付
近に蛍光を発するものであム そこで我々はそれ自信蛍光性を持たないメタンフェタミ
ン（ＭＡ）とダンシル基の結合物（ＤＮＳ−ＡＢＭＡ）
を合成し九 このＤＮＳ−ＡＢＭＡｉｉ メタンフェ
タミンに対する抗体に特異的に結合しその結果２８０ｎ
ｍで励起すると５３０Ｉｍ付近の蛍光が増強し九 この
混合溶液に遊離のメタンフェタミンを加えるとメタンフ
ェタミンとＤＮＳ−ＡＢＭＡとの間に競合反応が起こり
５３０ｎａ＋付近の蛍光強度が変化し九 この蛍光強度の変化に基づいて遊離のメタンフェタミン
の存在量を測定することができ４ 以下、ＤＮＳ、−Ａ
ＢＭＡの合成及び実験的な検出の方法について手順を述
べも （１）ダンシル化メタンフェタミン（ＤＮＳ−ＡＢＭＡ
）の合成 Ｎ・（４−アミノブチル）メタンフェタミン（ＡＢＭＡ
）は＋−・アオキ、ワイ・クロイワ（Ｋ、 Ａｎｋｉ
、 Ｙ、 Ｋｕｒｏｉｗａ）の方法により合成し九
次にダンジルクロライドを加え、ｐＨ！１１．８で反
応させａＮｓ−ＡｎＭ″Ａを合成した。ＤＮＳ−ＡＢＭ
Ａの構造を次に示す。
を分離するために多くの手順を必要としてい九 また反
応系が固相と液相め共存する不均一系であり、最終的な
検出に酵素反応を用いているたべ 通常５時間程度を要
してい九 本発明は このような従来技術の課題を解決することを
目的とすム 課題を解決するための手段 本発明（よ 被検出物質あるいはその類似物質に蛍光物
質を結合させたものであって、これが被検出物質に対す
る抗体を結合したとき抗体の発する蛍光を励起光として
蛍光が増強するものであることを特徴とする免疫的検出
用物質であもまた 本発明（よ 被検出物質に対する抗
体溶液にあらかじめその免疫的検出用物質を混合してお
き、その混合溶液に被検出物質を加えると免疫的検出用
物質と被検出物質との間の競合反応に伴う蛍光強度の変
化から被検出物質の存在量を測定することを特徴とする
免疫的測定法であも作用 本発明は 被検出物質に対する抗体溶液艮 あらかじめ
被検出物質あるいはその類似物質に蛍光物質を結合させ
たものを混合しておき、その混合溶液に被検出物質を加
えると、その混合物質と被検出物質との間の競合反応に
伴い蛍光強度が変化すも この変化を利用して、被検出
物質の存在量を測定すも このようにして、反応がすべて均−系（液相）で進行し
さらに酵素反応を用いないため検出時間の著しい短縮
を行うことが可能となん実施例 以下へ 本発明の実施例について図面を参照しながら説
明すも 発明者ら１よ メタンフェタミン、アンフエタミンある
いはエフェドリン家 それ自身蛍光性に蛍光消光性も有
していない物質と蛍光プローブの結合物質が抗体水溶液
中で抗体と結合した胤 抗体自身が本質的に有している
蛍光が、 蛍光プローブ物質の励起波長となり蛍光が増
強する事実を発児し この蛍光プローブ物質の合成を
し、この原理を検出方法に適用したものであａ 一般に抗体は２８０Ｉｍの励起光で３４０Ｉｍ付近に蛍
光を発する。この蛍光（よ 構成アミノ酸の一つである
Ｉ、トリプトファン残基などに由来するものであるが、
この蛍光の性質（よ 抗原が結合することによって変
化するこ七があム 例えばジニトロフェニルやジアゾ色
素へ 各々の抗体が結合すると抗体分子の持つトリプト
ファン残基の蛍光は消光されてしまう。この蛍光消光（
よ 抗原分子へのエネルギー転移の結果起こるものであ
ａ 一方 ダンシル基に対する抗体とダンシル基との抗
原抗体反応物を２８０ｎｌｌＩで励起すると５３０Ｉｍ
付近に蛍光を発することは知られていも この現象（上
結合部位の環境などに情報を与えるものであっム こ
れ（上２８０ｎｍで励起された抗体分子の３４０Ｉｍの
蛍光がダンシル基の励起波長となった結果５３０ｎｍ付
近に蛍光を発するものであム そこで我々はそれ自信蛍光性を持たないメタンフェタミ
ン（ＭＡ）とダンシル基の結合物（ＤＮＳ−ＡＢＭＡ）
を合成し九 このＤＮＳ−ＡＢＭＡｉｉ メタンフェ
タミンに対する抗体に特異的に結合しその結果２８０ｎ
ｍで励起すると５３０Ｉｍ付近の蛍光が増強し九 この
混合溶液に遊離のメタンフェタミンを加えるとメタンフ
ェタミンとＤＮＳ−ＡＢＭＡとの間に競合反応が起こり
５３０ｎａ＋付近の蛍光強度が変化し九 この蛍光強度の変化に基づいて遊離のメタンフェタミン
の存在量を測定することができ４ 以下、ＤＮＳ、−Ａ
ＢＭＡの合成及び実験的な検出の方法について手順を述
べも （１）ダンシル化メタンフェタミン（ＤＮＳ−ＡＢＭＡ
）の合成 Ｎ・（４−アミノブチル）メタンフェタミン（ＡＢＭＡ
）は＋−・アオキ、ワイ・クロイワ（Ｋ、 Ａｎｋｉ
、 Ｙ、 Ｋｕｒｏｉｗａ）の方法により合成し九
次にダンジルクロライドを加え、ｐＨ！１１．８で反
応させａＮｓ−ＡｎＭ″Ａを合成した。ＤＮＳ−ＡＢＭ
Ａの構造を次に示す。
して５３０ｎａ＋の蛍光強度は減少しなその減少率 Ｉ
（％）を、次式を用いて算出しｔもＣＨ，ＣＨ。
（％）を、次式を用いて算出しｔもＣＨ，ＣＨ。
（２）検出方法
（Ａ）バッファー（ｐＨ７のリン酸バッファーを０．４
５μｍのフィルターでろ過したもの）でメタンフェタミ
ンに対する抗体を溶解して２Ｘ１０−７Ｍの濃度とした
。この溶液３ＧＯμｌを蛍光測定用恒温ミクロセル（２
０℃に設定）に入れ、さらにｉｘｌＯ−ｅＭのＤＮＳ−
五Ｂ１１１Ａを２０μｌ加えた。この混合溶液を２８
Ｏｎ、ｔｓで励起し５３０Ｉの蛍光強度を測定すると蛍
光強度は約８０であった。
５μｍのフィルターでろ過したもの）でメタンフェタミ
ンに対する抗体を溶解して２Ｘ１０−７Ｍの濃度とした
。この溶液３ＧＯμｌを蛍光測定用恒温ミクロセル（２
０℃に設定）に入れ、さらにｉｘｌＯ−ｅＭのＤＮＳ−
五Ｂ１１１Ａを２０μｌ加えた。この混合溶液を２８
Ｏｎ、ｔｓで励起し５３０Ｉの蛍光強度を測定すると蛍
光強度は約８０であった。
（Ｂ）上記（Ａ）の溶液に種々の濃度のメタンフェタミ
ン溶液２０μｍを加え２８０Ｉｍ励起の５３０Ｉｍの蛍
光強度を測定するとメタンフェタミンの濃度に依存ここ
で、Ｆは抗体溶液にＤＮＳ−ＡＢＭＡを加えたときの蛍
光強塞 また）’ ｏｂｓは上記の溶液にメタンフェタ
ミン溶液を加えたときの蛍光強度を示す。
ン溶液２０μｍを加え２８０Ｉｍ励起の５３０Ｉｍの蛍
光強度を測定するとメタンフェタミンの濃度に依存ここ
で、Ｆは抗体溶液にＤＮＳ−ＡＢＭＡを加えたときの蛍
光強塞 また）’ ｏｂｓは上記の溶液にメタンフェタ
ミン溶液を加えたときの蛍光強度を示す。
メタンフェタミンの濃度に対する蛍光強度の減少率を図
に示す。図の結果から約１０−″・６Ｍの濃度のメタン
フェタミンが本発明により検出できたことが証明された ま？＝ ＤＮＳ−ＡＢＭＡの代わりにＤＮＳ−ＡＢＡ
Ｐを用いても同様の結果を得ることができ島 さらに 蛍光測定温度を１０℃とすると、抗体の蛍光強
度は低温の方が大きいので、精度よく測定することがで
きた 以Ｌ 主としてメタンフェタミンの検出を例にと
って本発明の説明を行なったが、 もちろんその他の化
学物質すべてに応用可能な一般的方法であも このようにして、従来５時間以上要していた免疫的検出
を１分以下に短縮することが可能となっ九 発明の詳細 な説明したようＪＱ 本発明は 全反応が均−系で行
われ 抗原抗体結合物と結合物の分離操作を含まず、ま
た抗原抗体反応による抗体の蛍光を直接利用し蛍光プロ
ーブの蛍光の変化に基づく免疫的測定法及びそれに利用
する免疫的検出用物質を提供できも
に示す。図の結果から約１０−″・６Ｍの濃度のメタン
フェタミンが本発明により検出できたことが証明された ま？＝ ＤＮＳ−ＡＢＭＡの代わりにＤＮＳ−ＡＢＡ
Ｐを用いても同様の結果を得ることができ島 さらに 蛍光測定温度を１０℃とすると、抗体の蛍光強
度は低温の方が大きいので、精度よく測定することがで
きた 以Ｌ 主としてメタンフェタミンの検出を例にと
って本発明の説明を行なったが、 もちろんその他の化
学物質すべてに応用可能な一般的方法であも このようにして、従来５時間以上要していた免疫的検出
を１分以下に短縮することが可能となっ九 発明の詳細 な説明したようＪＱ 本発明は 全反応が均−系で行
われ 抗原抗体結合物と結合物の分離操作を含まず、ま
た抗原抗体反応による抗体の蛍光を直接利用し蛍光プロ
ーブの蛍光の変化に基づく免疫的測定法及びそれに利用
する免疫的検出用物質を提供できも
図は各メタンフェタミン濃度における蛍光減少率を示し
たグラフであム
たグラフであム
Claims (7)
- （１）被検出物質あるいはその類似物質に蛍光物質を結
合させたものであって、これが被検出物質に対する抗体
と結合したときの抗体の発する蛍光を励起光として蛍光
が増強するものであることを特徴とする免疫的検出用物
質。 - （２）被検出物質あるいはその類似物質に結合させた蛍
光物質が、ダンシル基であることを特徴とする請求項１
記載の免疫的検出用物質。 - （３）被検出物質に対する抗体溶液にあらかじめ請求項
１記載の免疫的検出用物質を混合しておき、その混合溶
液に被検出物質を加えると免疫的検出用物質と被検出物
質との間の競合反応に伴う蛍光強度の変化から被検出物
質の存在量を測定することを特徴とする免疫的測定法。 - （４）被検出物質が、メタンフェタミン、アンフェタミ
ンあるいはエフェドリンである請求項３記載の免疫的測
定法。 - （５）上記測定が、均一溶液中での反応で、抗体自身の
蛍光が蛍光プローブの励起波長となることを特徴とする
請求項３記載の免疫的測定法。 - （６）抗体としてモノクローナル抗体を用いることを特
徴とする請求項３記載の免疫的測定法。 - （７）抗体としてポリクローナル抗体を用いることを特
徴とする請求項３記載の免疫的測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1185519A JPH0348765A (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | 免疫的検出用物質及び免疫的検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1185519A JPH0348765A (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | 免疫的検出用物質及び免疫的検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0348765A true JPH0348765A (ja) | 1991-03-01 |
Family
ID=16172212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1185519A Pending JPH0348765A (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | 免疫的検出用物質及び免疫的検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0348765A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004027424A1 (ja) * | 2002-09-19 | 2004-04-01 | Hamamatsu Photonics K.K. | 蛍光化抗体を用いた蛍光分析方法 |
| US8574925B2 (en) | 2002-09-19 | 2013-11-05 | Hamamatsu Photonics K.K. | Fluorescence analysis method using fluorescent-activating antibodies |
-
1989
- 1989-07-18 JP JP1185519A patent/JPH0348765A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004027424A1 (ja) * | 2002-09-19 | 2004-04-01 | Hamamatsu Photonics K.K. | 蛍光化抗体を用いた蛍光分析方法 |
| US8574925B2 (en) | 2002-09-19 | 2013-11-05 | Hamamatsu Photonics K.K. | Fluorescence analysis method using fluorescent-activating antibodies |
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