ES2286868T3 - Composicion acuosa a base de hormana del crecimiento humana. - Google Patents
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Abstract
SE PRESENTA UNA FORMULACION ACUOSA, ESTABLE, FARMACOLOGICAMENTE ACEPTABLE QUE CONTIENE HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANO, UN NEUTRALIZADOR, UN SURFACTANTE NO IONICO Y, OPCIONALMENTE, UNA SAL NEUTRA, MANITOL O UN CONSERVANTE. TAMBIEN SE PRESENTAN MEDIOS Y PROCEDIMIENTOS ASOCIADOS PARA LA PREPARACION, ALMACENAMIENTO Y UTILIZACION DE LAS FORMULACIONES.
Description
Composición acuosa a base de hormona de
crecimiento humana.
La presente invención está dirigida a
formulaciones farmacéuticas que contienen la hormona de crecimiento
humana (hGH) y a los procedimientos y utilización de tales
formulaciones. En particular, esta invención hace referencia a
aquellas formulaciones farmacéuticas que tienen una estabilidad
incrementada en formulación acuosa.
Todas las formulaciones de la hormona de
crecimiento humana conocidas en la materia son preparaciones
liofilizadas que requieren reconstitución. Por cada vial, la hGH
Protropina está compuesta de 5 mg de hGH, 40 mg de manitol, 0,1 mg
de fosfato sódico monobásico, 1,6 mg de fosfato sódico dibásico,
reconstituida a pH 7,8 (Physician's Desk Reference, Medical
Economices Co., Orawell, NJ, pág. 1049, 1992). Por cada vial, la hGH
Humatrope está compuesta de 5 mg de hGH, 25 mg de manitol, 5 mg de
glicina, 1,13 mg de fosfato sódico dibásico, reconstituida a pH 7,5
(Physician's Desk Reference, pág. 1266, 1992).
Para una revisión general de las formulaciones
de la hormona de crecimiento, ver Pearlman y col.,
Current Communications in Molecular Biology, eds. D.
Marshak y D. Liu, págs. 23-30, Cold Spring Harbor
Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY, 1989. Otras publicaciones
de interés relacionadas con la estabilización de proteínas se
describen a continuación.
La patente americana U.S. 4.297.344 describe la
estabilización de factores de coagulación II y VIII, antitrombina
III y plasminógeno contra el calor mediante la adición de
aminoácidos seleccionados como la glicina, alanina, hidroxiprolina,
glutamina y ácido aminobutírico y un carbohidrato como un
monosacárido, un oligosacárido, o un alcohol de azúcar.
La patente americana U.S. 4.783.441 describe un
procedimiento para la prevención de la desnaturalización de
proteínas como la insulina en solución acuosa en las interfases,
mediante la adición de hasta 500 ppm de sustancias tensoactivas que
contienen una cadena de zonas alternantes débilmente hidrofílicas y
débilmente hidrofóbicas a pH 6,8-8,0.
La patente americana U.S. 4.812.557 describe un
procedimiento de estabilización de la interleucina-2
mediante la utilización de albúmina sérica humana.
La publicación de la solicitud de patente
europea nº 0 303 746 describe la estabilización de hormonas
promotoras del crecimiento con polioles compuestos de azúcares
no-reductores, alcoholes de azúcares, ácidos de
azúcar, pentaeritritol, lactosa, dextranos solubles en agua y
Ficoll, aminoácidos, polímeros de aminoácidos que tienen un grupo
lateral cargado a pH fisiológico y sales de colina.
La publicación de la solicitud de patente
europea nº 0 211 601 describe la estabilización de hormonas
promotoras del crecimiento en una matriz de gel formada por un
bloque de copolímero que contiene unidades de
polioxietilén-polioxipropilén con un peso molecular
medio de aproximadamente 1.100 a 40.000.
La publicación de la solicitud de patente
europea nº 0 193 917 describe una composición biológicamente activa
para la liberación lenta caracterizada por una solución acuosa de un
complejo entre una proteína y un carbohidrato.
La publicación de la solicitud de patente
australiana nº AU-A-30771/89
describe la estabilización de la hormona de crecimiento mediante la
utilización de glicina y manitol.
La patente americana U.S. 5.096.885 (que no
corresponde con la del estado de la técnica) describe una
formulación de hGH para la liofilización que contiene glicina,
manitol, un tensoactivo no-iónico y un tampón. La
mencionada invención proporciona una formulación acuosa
inesperadamente estabilizada en ausencia de glicina.
La hGH se somete a diversos procesos de
degradación, especialmente la desamidación, agregación, acortamiento
del esqueleto peptídico y la oxidación de los residuos de
metionina. Muchas de estas reacciones pueden ralentizarse de modo
significativo mediante la eliminación de agua de la proteína. Sin
embargo, el desarrollo de una formulación acuosa para hGH tiene la
ventaja de eliminar los errores de reconstitución, por lo que se
incrementa la exactitud de la dosificación, así como se simplifica
la utilización clínica del producto y se aumenta así el cumplimiento
por parte del paciente. Por ello, es un objetivo de esta invención
el proporcionar una formulación de hGH acuosa que facilite un
control aceptable de los productos de degradación, que sea estable
tras agitación vigorosa (lo que induce la agregación) y sea
resistente a la contaminación microbiana (lo que permite un
empaquetado de múltiples utilizaciones).
\newpage
Según ello, en un aspecto de la presente
invención se proporcionan formulaciones farmacéuticas líquidas,
acuosas y estables para su almacenamiento durante
6-18 meses a 2-8ºC, que comprenden
la hormona de crecimiento humana, un tampón que proporciona un pH
en el intervalo de 5,5 a 7, del 0,1 al 1% en peso de un tensoactivo
no iónico, manitol, y fenol como un conservante.
La Figura 1 es un cromatograma de exclusión por
tamaño de la formulación acuosa de la hormona de crecimiento
almacenada durante 28 días a 40ºC (es decir, estresada térmicamente)
y durante un año a 5ºC (es decir, en condiciones recomendadas de
almacenamiento).
La Figura 2 es un trazado del análisis del valor
de Arrhenius de la agregación de la hormona de crecimiento en
formulación acuosa.
La Figura 3 es un cromatograma de intercambio
aniónico que compara una muestra de una formulación acuosa de hGH
estresada térmicamente (40ºC) con una muestra de formulación acuosa
de hGH almacenada en las condiciones recomendadas
(2-8ºC) durante un año.
La Figura 4 es un trazado del análisis del valor
de Arrhenius de la desamidación de hGH en formulación acuosa.
La Figura 5 es una gráfica del porcentaje de
monómero presente en diversas formulaciones en donde el manitol se
ha sustituido por una sal neutra.
Los siguientes términos pretenden tener los
significados indicados más adelante tal como se utilizan en la
especificación y reivindicaciones.
Los términos "hormona de crecimiento
humana" o "hGH" quieren decir la hormona de crecimiento
humana producida mediante procedimientos que incluyen la extracción
y purificación a partir de una fuente natural, y mediante sistemas
de cultivo de células recombinantes. Su secuencia y características
se indican, por ejemplo, en Hormone Drugs, Gueriguian y
col., U.S.P. Convención, Rockville, MD (1982). Los términos
similares engloban las equivalentes a la hormona de crecimiento
humana biológicamente activa, p.ej., las que difieren en uno o más
aminoácidos en la secuencia total. Además, los términos utilizados
en esta solicitud pretenden englobar las variantes por sustitución,
deleción e inserción aminoacídica de la hGH, o modificaciones
post-traduccionales. Dos especies a destacar son la
especie nativa de 191 aminoácidos (somatropina) y la especie
(somatrem) de 192 aminoácidos con una metionina en el extremo
N-terminal (met), que se obtiene generalmente
mediante recombinación.
El término "cantidad eficaz
farmacéuticamente" de hGH hace referencia a la cantidad que
proporciona el efecto terapéutico en un régimen de administración.
Las composiciones de ello se preparan de forma que contengan
cantidades de hGH de al menos unos 0,1 mg/ml, y hasta unos 10 mg/ml,
preferentemente desde aproximadamente 1 mg/ml a 20 mg/ml, más
preferentemente desde aproximadamente 1 mg/ml a 5 mg/ml. Para
utilizar estas composiciones en la administración a pacientes
humanos que sufren de enanismo hipofisiario, por ejemplo, estas
composiciones contienen desde 0,1 mg/ml a 10 mg/ml, correspondiendo
con el régimen de dosificación considerado actualmente para el
pretendido tratamiento. El intervalo de concentración no es crítico
para la invención, y puede ser variado por el clínico.
La presente invención no requiere glicina. La
glicina es un componente opcional de la formulación acuosa, aunque
con menor interés en las formulaciones acuosas comparado con
aquellas formulaciones que están liofilizadas para su posterior
reconstitución. Las cantidades de glicina se hallarán en un
intervalo desde 0 mg/ml a aproximadamente
7 mg/ml.
7 mg/ml.
Los tensoactivos no-iónicos
incluyen un polisorbato, como el polisorbato 20 u 80, etc., y los
poloxámeros, como el poloxámero 184 o 188, polioles de Pluronic® y
otros polímeros en bloque de etilén/propilén, etc. Se utilizarán
cantidades eficaces para proporcionar una formulación acuosa
estable, generalmente en el intervalo del 0,1% (p/v) al 1% (p/v).
La utilización de tensoactivos no-iónicos permite
que la formulación sea expuesta a tensiones de corte y superficie
sin causar la desnaturalización de la proteína. Por ejemplo, tales
formulaciones que contienen tensoactivos se utilizan en
dispositivos de aerosol como los empleados en la dosificación
pulmonar y pistolas de inyección sin aguja.
Los tampones incluyen el tampón fosfato, Tris,
citrato, succinato, acetato o tampones de histidina.
Preferentemente, el tampón se hallará en el intervalo de
aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. El tampón preferido
es un tampón de citrato sódico.
El fenol se incluye como un conservante para
retrasar el crecimiento microbiano y de ese modo se permite el
empaquetamiento "de múltiples utilizaciones" de la hGH. Los
conservantes preferidos son fenol al 0,2-0,4%
(p/v).
Los intervalos adecuados de pH, ajustados con
tampón, para la formulación de hGH acuosa van desde 5,5 a 7, más
preferiblemente de 6,0. De forma preferente, se elige un intervalo
de concentración de tampón para minimizar la desamidación, la
agregación y la precipitación de hGH.
El manitol se incluye en la formulación acuosa
de hGH. La cantidad preferida de manitol es de aproximadamente 5
mg/ml a 50 mg/ml.
En los ejemplos, una formulación acuosa que
comprende los siguientes componentes a pH 6,0 se utiliza como
referencia para la comparación con las formulaciones reivindicadas
que comprenden manitol. En estos estudios también se utiliza una
formulación liofilizada conocida del estado de la técnica.
Se sobreentenderá que las anteriores cantidades
son flexibles dentro de un intervalo, como se indicó con mayor
detalle anteriormente, y que los materiales son intercambiables
dentro de las categorías de componentes. Esto es, se puede
sustituir el polisorbato 80, o un poloxámero, por polisorbato 20, a
su vez se puede utilizar un tampón succinato o acetato y se pueden
utilizar conservantes alternativos y pH diferentes. Además, se puede
utilizar más de un agente tamponante, conservante, azúcar, sal
neutra o tensoactivo no-iónico. Preferentemente, la
formulación es isotónica y estéril.
En general, las formulaciones de la presente
invención pueden contener otros componentes en cantidades tales que
no desvirtúen la preparación de las formas estables y en cantidades
adecuadas para una administración farmacéutica segura. Por ejemplo,
otros excipientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos por
aquellos expertos en la materia pueden formar parte de las
composiciones presentes. Estos incluyen, por ejemplo, diversos
agentes de carga, agentes tamponantes adicionales, agentes
quelantes, antioxidantes, cosolventes y similares; ejemplos
específicos de estos podrían incluir sales de trimetilamina
("tampón Tris"), y edetato de sodio.
La cromatografía de intercambio aniónico (HPIEC)
se llevó a cabo en una columna TSK DEAE 5PW (1,0 x 7,5 cm) a 45ºC
con una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. La columna se equilibró
con fosfato potásico 50 mM, pH 5,5, que contenía acetonitrilo al
10% (p/v). La elución se realizó utilizando un gradiente constante
de 25 minutos de tampón fosfato potásico 50-100 mM,
pH 5,5 con acetonitrilo al 10% (p/v). La carga de la columna fue de
83 \mug de proteína. La detección se realizó a 230 nm.
La cromatografía de exclusión por tamaño
no-desnaturalizante se llevó a cabo en una columna
TSK 2000 SWXL con fosfato sódico 50 mM, pH 7,2 que contenía cloruro
sódico 150 mM. La velocidad de flujo fue de 1 ml/min, con una carga
de columna de 50-75 \mug y la detección a 214 o
280 nm.
La cromatografía de exclusión por tamaño
desnaturalizante se llevó a cabo en una columna Zorbax GF250 en
fosfato sódico 200 mM, pH 6,8-7,2/SDS al 0,1%. La
velocidad de flujo fue de 1,0 ml/minuto, con una carga de
50-75 \mug y la detección a 214 o 280 nm.
En general, las muestras de la formulación de
hGH para el análisis en estos ejemplos experimentales se prepararon
mediante cambio de tampón en una columna de filtración en gel. El
tampón de elución contenía cloruro sódico o manitol, tampón y el
tensoactivo no-iónico en sus proporciones finales.
Esta solución resultante se diluyó a una concentración de hGH
deseada y se añadió el conservante. La solución se filtró
estérilmente utilizando un filtro de membrana esterilizado (tamaño
del poro de 0,2 micras o equivalente) y se introdujo en viales de
vidrio del tipo 1 de 3 cc, éstos se taparon y sellaron con tapones
de goma de tipo butil acuoso y capuchones de aluminio de tipo tirar
y abrir.
La formulación de hGH acuosa utilizada en los
ejemplos experimentales consistió de 5,0 mg de somatropina
(Genentech, Inc.), 45,0 mg de manitol, 2,5 mg de fenol, 2,0 mg de
polisorbato 20 y 2,5 mg de citrato sódico, pH 6,0, por ml de
solución. La formulación liofilizada que se utilizó como referencia
para la comparación en los ejemplos consistió de 5,0 mg de
somatropina, 1,7 mg de glicina, 45,0 mg de manitol, 1,7 mg de
fosfato sódico, 9 mg de alcohol bencílico por ml de solución
estéril después de la reconstitución.
C. Ejemplo
I
Viales de la formulación acuosa de hGH (lotes
12738/55-102 y 12738/55-105) se
incubaron a cualquiera de las temperaturas de almacenamiento
recomendadas de 2-8ºC, o a temperaturas de
almacenamientos elevadas de 15ºC, o 25ºC, y luego los viales se
retiraron en diferentes tiempos y se analizaron para conocer los
cambios en el pH, color y apariencia, y la concentración de
proteína. Además, las muestras se incubaron a 40ºC con el fin de
estudiar los patrones de degradación en condiciones de estrés
extremo. Los patrones de degradación para la formulación acuosa se
compararon también con los patrones de degradación conocidos de la
hormona de crecimiento liofilizada.
Después del almacenamiento a
2-8ºC durante un año como máximo, la formulación
acuosa mostró cambios no significativos en el pH, color y
apariencia y en la concentración de proteína. La HPLC de exclusión
de tamaño no-desnaturalizante realizada con
muestras guardadas durante un año como máximo a
2-8ºC, no mostró agregación significativa del
producto del fármaco (Figura 1). Este resultado es inesperado a la
luz de las enseñanzas de la patente americana U.S. 5.096.885 donde
la glicina contribuye a prevenir la agregación en la preparación
liofilizada.
A temperaturas de aproximadamente 8ºC, se
observaron pocos o ningún cambio en el pH o en la concentración de
proteína a lo largo del tiempo. La inspección visual puso de
manifiesto un incremento en la opalescencia con el tiempo en las
muestras guardadas a 40ºC. Este cambio fue mínimo durante el
almacenamiento a 15-25ºC y no se observó durante el
almacenamiento a 2-8ºC.
La cantidad de producto de degradación se
calculó como un porcentaje del área de hGH total del cromatograma.
Se calculó entonces la constante de velocidad para cada reacción
mediante sustracción a partir del 100% del porcentaje de producto
de degradación, tomando el log_{10}, y representando el trazado
frente al tiempo en días. Para encajar estos resultados se utilizó
la pendiente de una línea recta como la constante de la reacción
(k). El análisis de Arrhenius se realizó trazando una recta con los
valores obtenidos del logaritmo natural (ln) del valor absoluto de
cada constante de velocidad de reacción, calculada a 15ºC, 25ºC y
40ºC, como una función del inverso de la temperatura absoluta; y
luego mediante prolongación de la recta se extrapoló el valor a
5ºC. El análisis de Arrhenius y la velocidad en tiempo real (Figura
2) de los resultados a partir de la HPLC de exclusión de tamaño
indican que la cantidad de agregación de la hormona de crecimiento
al cabo de 18 meses de almacenamiento será inferior al 1%
(p/v).
El análisis por HPLC de intercambio aniónico
realizado sobre la formulación de hGH acuosa almacenada a 40ºC
indicó un incremento en picos acídicos alrededor de los 28 días
(Figura 3). Tres de estos picos, que se eluyeron a los 15, 17,5 y
26 minutos, se produjeron mediante desamidación de hGH en las
posiciones 149, 152 y 149 más 152. Los análisis de Arrhenius y de
velocidad en tiempo real (Figura 4) de los resultados a partir de
este procedimiento, se representaron gráficamente tal como se
describió anteriormente, e indicaron que la cantidad de hGH
desamidada en estos lotes al cabo de 18 meses de almacenamiento a
2-8ºC será de aproximadamente del 9% (p/v). Esto
incluye una cantidad inicial de aproximadamente el 2,4% (p/v) de hGH
desamidada en el tiempo cero. Para otros productos de hGH se han
citado valores tan altos como el 15% (p/v) de desamidación (Larhmar,
H., y col., (1985) Int. J. Pharmaceutics
23:13-23). Aunque la velocidad de desamidación es
más rápida en el estado acuoso, esta velocidad se minimiza a pH 6,0
y por debajo.
D. Ejemplo
II
Cada uno de los seis viales de hormona de
crecimiento liofilizados se reconstituyeron con 1 ml de agua
bacteriostática para inyección (BWFI) U.S.P. Después de su
disolución, los contenidos se transfirieron a viales de 3 cc, se
les colocó un tapón y un capuchón para proporcionar la misma
configuración que la de la formulación acuosa. Los seis viales de
la formulación acuosa de hGH y los seis viales de hGH liofilizada
reconstituida se agitaron vigorosamente de abajo a arriba de manera
horizontal en un agitador giratorio para vidrio
("Glas-Col
Shaker-in-the-Round")
a 240 sacudidas por minuto utilizando un ajuste de golpe de 2,5,
proporcionando un desplazamiento horizontal de 8\pm1 cm de hasta
24 horas a temperatura ambiente para valorar los efectos de la
agitación sobre la estabilidad física de la formulación acuosa de
hGH. Las doce muestras se colocaron en línea recta sobre el
agitador para asegurar que todas se expondrían a la misma fuerza
para cada formulación. Se retiraron dos viales para analizar a los
30 minutos, a las 6 y a las 24 horas.
Los resultados se muestran en la Tabla I. La
agitación produjo muy poco cambio en la claridad visual de la
formulación acuosa. No hubo cambios en el contenido total del
monómero de hormona de crecimiento detectado mediante un ensayo de
HPLC de exclusión de tamaño no-desnaturalizante.
Este ensayo detecta agregados no covalentes, los cuales son
completamente dispersados mediante SDS en un ensayo de HPLC de
exclusión de tamaño desnaturalizante.
Mediante comparación, estos resultados también
demostraron que el producto liofilizado reconstituido fue más
sensible al tratamiento, aún después de sólo 30 minutos de
agitación. Esta sensibilidad es típica para todas las formulaciones
actualmente disponibles de hGH, distintas a la formulación acuosa de
la presente invención. La inclusión del tensoactivo
no-iónico es el factor más importante para prevenir
la aparición de este fenómeno.
E. Ejemplo
II
Muestras de la formulación acuosa de hGH se
sometieron a una prueba de contaminación bacteriológico de acuerdo
con una prueba de contaminación abreviada utilizando el test
estándar U.S.P. En este test, se añadió una suspensión de E.
coli o de S. aureus a una alícuota de la formulación
acuosa de hGH para proporcionar una concentración final de
bacterias entre 10^{5} a 10^{6} CFU/ml. Se contaron las
bacterias viables que permanecieron en los tubos inmediatamente y
al cabo de 4 y 24 horas a 20-25ºC. El cambio del
porcentaje en la concentración de los microorganismos durante la
prueba de contaminación se calculó de acuerdo con la siguiente
ecuación:
% título
inicial = \frac{t\text{í}tulo \ a \ T \ = \ X \ horas \ x \
100}{t\text{í}tulo \ a \ T \ = \
0}
Los resultados de este experimento indicaron que
para las dos especies de bacterias, las concentraciones de las
bacterias viables se redujeron a menos del 0,01% de las
concentraciones iniciales al cabo de 24 horas.
F. Ejemplo
IV
En este experimento, se compararon formulaciones
acuosas de hGH con concentraciones variables de sal, manitol y
tensoactivo no-iónico. Todas las formulaciones
contenían 5 mg/ml de hGH/fenol al 0,25% (p/v)/citrato sódico 10 mM,
pH 6,0. Las muestras se almacenaron durante 3-4
meses a 2-8ºC. La Figura 5 indica el porcentaje de
monómero presente en las formulaciones indicadas. La Tabla inferior
indica la composición de cada formulación. Estos resultados
demuestran la estabilidad inesperada de hGH en una formulación en
donde el manitol se ha sustituido por una sal neutra en presencia
de un tensoactivo.
Claims (8)
1. Formulación farmacéutica líquida, acuosa y
estable para el almacenamiento durante 6-18 meses a
2-8ºC, que comprende la hormona de crecimiento
humana, un tampón que proporciona un pH en el intervalo de 5,5 a 7,
del 0,1 al 1% en peso de un tensoactivo no-iónico,
el manitol, y el fenol como conservante.
2. Formulación según la reivindicación 1, en
donde el manitol está presente entre 5 a 50 mg/ml.
3. Formulación según la reivindicación 1, en
donde el fenol está presente a una concentración del 0,2 al 0,4%
(p/v).
4. Formulación según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde la concentración de la hormona
de crecimiento humana es aproximadamente de 1 a 20 mg/ml.
5. Formulación según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde el tampón es un tampón de
citrato, fosfato, Tris, acetato o histidina.
6. Formulación según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde la concentración del tampón es
aproximadamente de 2 mM a 50 mM.
7. Formulación según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde el tensoactivo no iónico es un
poloxámero o un polisorbato.
8. Formulación según la reivindicación 7, en
donde el poloxámero es el poloxámero 188 o 184, o el polisorbato es
el polisorbato 20 u 80.
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