ES2287067T3 - Vacunas que contienen polipeptidos hibridos que consisten en al menos dos proteinas alergenicas diferentes. - Google Patents
Vacunas que contienen polipeptidos hibridos que consisten en al menos dos proteinas alergenicas diferentes. Download PDFInfo
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Abstract
Un alérgeno híbrido que es un polipéptido que comprende al menos dos proteínas alergénicas diferentes o fragmentos de las mismas, en el que cada fragmento consiste en al menos ocho aminoácidos consecutivos de la proteína alergénica correspondiente, caracterizado por que la proteína alergénica de la que se obtiene el polipéptido híbrido consiste en los alérgenos principales sin relación inmunitaria entre sí del polen del fleo de los prados.
Description
Vacunas que contienen polipéptidos híbridos que
consisten en al menos dos proteínas alergénicas diferentes.
La alergia de tipo I es una enfermedad de
hipersensibilidad determinada genéticamente que afecta a casi 500
millones de individuos en todo el mundo. Los síntomas tempranos
(rinoconjuntivitis alérgica, asma, choque anafiláctico) así como
los síntomas tardíos (dermatitis atópica, algunas formas de asma
bronquial alérgica) se basan en el reconocimiento de los alérgenos
por los anticuerpos IgE. Los síntomas instantáneos son resultado
del entrecruzamiento inducido por los alérgenos de la IgE unida a
las células efectoras y la posterior liberación de mediadores
biológicos (por ejemplo, histamina, leucotrienos), mientras que los
síntomas tardíos pueden estar causados por la presentación mediada
por la IgE de alérgenos para la activación de los linfocitos T y de
los eosinófilos.
El único tratamiento curativo, la inmunoterapia
específica con alérgenos, se basa en la administración sistemática
de alérgenos a los pacientes para inducir una "ausencia de
respuesta" específica a los alérgenos [Noon, Lancet 191
1, 1: 1572-1573; Bousquet et al. (1998) J.
Allergy. Clin. Immunol. 102: 558-562; Durham y
Till (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102,
157-164]. Utilizando tecnologías convencionales no
ha sido posible producir alérgenos puros para la inmunoterapia
específica y, por lo tanto, las vacunas se realizan con extractos
de alérgenos. Estos extractos consisten en alérgenos y componentes
no alergénicos que son difíciles de estandarizar. Por lo tanto, los
pacientes no se pueden tratar según su perfil de sensibilización
específica y, frecuentemente, se observan efectos secundarios
anafilácticos debidos a la administración de material alergénico
[Mellerup et al. (2000). Clin. Exp. Allergy 30,
1423-1429].
Un objetivo de la presente invención es dar a
conocer una composición ventajosa para el tratamiento o la
prevención de los trastornos alérgicos.
Sorprendentemente, los inventores encontraron
que es posible generar alérgenos híbridos que reúnen los epítopos
de alérgenos inmunitariamente diferentes para el diagnóstico y el
tratamiento de la alergia de tipo I. Por lo tanto, la invención se
refiere a un polipéptido híbrido que comprende, al menos, dos
proteínas alergénicas diferentes, o fragmentos de las mismas, en el
que cada fragmento consiste en, al menos, ocho aminoácidos
consecutivos de la proteína alergénica correspondiente,
caracterizado por que la proteína alergénica de la que se obtiene
el polipéptido híbrido consiste en los alérgenos principales de
polen del fleo de los prados sin relación inmunitaria entre
ellos.
En una realización, el polipéptido híbrido
comprende, al menos, una proteína alergénica completa. También
puede comprender dos proteínas alergénicas completas diferentes. No
sólo es posible combinar diferentes grupos de polen de gramíneas
alergénicas sino también combinar proteínas alergénicas obtenidas de
diferentes fuentes. En una realización específica, todas las
secuencias del polipéptido híbrido obtenido de proteínas alergénicas
representan las proteínas alergénicas completas.
En otra realización, el polipéptido híbrido
comprende, al menos, un fragmento de una proteína alergénica, en el
que el fragmento consiste en, al menos, ocho aminoácidos
consecutivos de la proteína alergénica correspondiente.
Preferiblemente, el fragmento consiste en al menos 12, más
preferiblemente al menos 20, y lo más preferiblemente al menos 30,
aminoácidos consecutivos de las proteínas alergénicas
correspondientes. En otra realización, todas las secuencias de
aminoácidos obtenidas de proteínas alergénicas son fragmentos de, al
menos, 8 aminoácidos consecutivos de las proteínas alergénicas
correspondientes de las que derivan. La longitud preferida de estos
fragmentos es al menos 12, más preferiblemente al menos 20 y, lo más
preferiblemente, al menos 30 aminoácidos consecutivos de la proteína
alergénica correspondiente.
Cuando se emplean fragmentos de proteínas
alergénicas, es posible preparar un polipéptido híbrido que
comprende sólo fragmentos que tienen una actividad alergénica que
es inferior en comparación con las proteínas alergénicas
correspondientes de la que derivan. Este efecto se puede deber a la
destrucción de epítopos debido a la modificación de la estructura
secundaria o terciaria del fragmento en comparación con la proteína
completa. En la realización más preferida, el polipéptido híbrido
tiene una actividad alérgica que es menor que la actividad
alergénica de cada una de las proteínas alergénicas de las que se
obtiene el polipéptido híbrido. Normalmente, la actividad
alergénica del polipéptido híbrido es de menos del 50% de la de cada
una de las proteínas alergénicas de las que se obtiene el
polipéptido híbrido. En una realización particular, el polipéptido
híbrido no tiene actividad alergénica en esencia.
De acuerdo con la invención, la actividad
alergénica de una muestra se determina determinando los anticuerpos
IgE que se inducen en un animal de prueba al aplicarle la muestra.
La actividad alergénica se define preferiblemente en las pruebas
in vitro e in vivo adecuadas. Una prueba in
vitro preferida es el análisis de liberación de histamina de
los basófilos como se describe en Vrtala et al. J. Clin.
Invest. 1997, 99, pp. 1673-1681.
Alternativamente, la actividad alergénica se determina en una prueba
cutánea como se describe en van Hage-Hamsten et
al. J. Allergy Clin. Immunol. 1999, 104, pp.
969-977 o en Pauli et al. Clin. Exp. Allergy
2000, 30, pp. 1076-1084.
En una realización, el polipéptido híbrido
comprende dos porciones que se obtienen de dos proteínas alergénicas
diferentes. Sin embargo, el polipéptido híbrido de la invención
puede comprender tres, cuatro, cinco o incluso más trozos, cada uno
de los cuales se obtiene de una proteína alergénica diferente.
El polipéptido híbrido de la invención no
consiste necesariamente sólo en secuencias de aminoácidos obtenidas
de proteínas alergénicas. Es posible que se hayan introducido
secuencias artificiales (por ejemplo, secuencias espaciadoras)
entre las unidades que representan secuencias de proteínas
alergénicas diferentes. También es posible modificar las secuencias
de aminoácidos de las proteínas alergénicas que se producen en la
naturaleza, por ejemplo mediante ingeniería genética, para
introducir mutaciones que reducen la actividad alergénica del
fragmento. También se prefiere que el polipéptido híbrido comprenda
una secuencia "etiquetadora" (tag) que facilite la
purificación del polipéptido híbrido cuando se expresa en una célula
hospedadora. Un ejemplo de una "etiqueta" es la etiqueta de
hexahistidina que permite la purificación mediante la cromatografía
de quelatos de Ni^{2+}. En la técnica se conocen otras
etiquetas.
etiquetas.
El polipéptido híbrido de la invención se puede
preparar mediante varios métodos. En una realización, el polipéptido
se prepara expresando un polinucleótido en una célula hospedadora.
La célula hospedadora puede ser una célula procariótica o
eucariótica. Si se utilizan células procarióticas, el hospedador es
preferiblemente E. coli. Ejemplos de células eucarióticas
son la levadura, las células de insectos o las estirpes celulares
como las células CHO. Después de introducir un polipéptido adecuado
que codifica el polipéptido de la invención en una célula
hospedadora, se cultiva la célula hospedadora en las condiciones que
hacen que el polipéptido se exprese en la célula. El polipéptido
puede ser secretado por la célula o acumularse dentro de la célula.
Se pueden utilizar métodos de purificación conocidos para recuperar
el polipéptido híbrido a partir de la célula o del medio de
cultivo.
La invención también abarca la preparación del
polipéptido híbrido mediante síntesis química, tal como la síntesis
en fase sólida.
Además, la invención se refiere a un
polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido de acuerdo con la
invención. Debido a la degeneración del código genético, muchas
moléculas polinucleotídicas diferentes pueden codificar un único
polipéptido. El polinucleótido de la invención es preferiblemente
una construcción de expresión para obtener el polipéptido después
de que se exprese en las células hospedadoras. La construcción de
expresión puede comprender además compuestos que generalmente se
conocen en la técnica como secuencias promotoras, genes que
codifican factores de resistencia a los antibióticos, un origen de
replicación, etc.
La invención además se refiere a una célula
transfectada o transformada con un polinucleótido de la invención.
La célula puede ser una célula procariótica o eucariótica. Las
células eucarióticas se pueden transfectar mediante un método
conocido propiamente dicho tal como transfección mediada por el
fosfato de calcio, electroporación, lipofección, etc.
La invención se refiere además a una composición
farmacéutica que contiene un polipéptido, polinucleótido o célula
de acuerdo con la invención. La composición farmacéutica puede
contener además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable
tal como un tampón o una disolución salina. Preferiblemente, la
composición farmacéutica de la invención es una composición de
vacuna. En una realización particular, la composición farmacéutica
contiene además un adyuvante tal como
Al(OH)_{3}.
La invención también se refiere a un método para
la preparación de un polipéptido híbrido de la invención. El método
comprende proporcionar un polinucleótido que codifica un polipéptido
híbrido, introducir dicho polinucleótido en una célula hospedadora,
cultivar la célula hospedadora así obtenida en las condiciones que
hacen que se exprese el polipéptido híbrido, y recuperar el
producto de expresión de la célula. El polinucleótido se puede
preparar mediante los métodos conocidos en la técnica, y se prefiere
utilizar la tecnología de la PCR para preparar el polinucleótido que
codifica el polipéptido híbrido.
La invención se refiere además al uso de un
polipéptido híbrido, de un polinucleótido o de una célula de la
invención para la preparación de un fármaco para el tratamiento de
un trastorno alérgico.
Tal fármaco puede estar compuesto del
polinucleótido que codifica una vacuna híbrida que se puede utilizar
directamente para la vacunación a base de ADN contra la alergia de
tipo I. El polipéptido híbrido recombinante o sintético se puede
utilizar para preparar formas farmacéuticas para el tratamiento por
vía oral, sublingual o parenteral de los trastornos alérgicos de
tipo I tal y como se utilizan en la actualidad de forma sistemática
para la inmunoterapia. Son ejemplos las formas farmacéuticas para
inmunoterapia sublingual o los polipéptidos híbridos unidos a un
adyuvante para la inmunoterapia mediante inyección. Las posibles
aplicaciones comprenden también formas de inmunoterapia a base de
células que pueden estar basadas en, por ejemplo, células
dendríticas u otras células presentadoras de antígeno. Se
transforman dichas células y se expresa el antígeno in vivo.
Preferiblemente, se utilizan células autólogas transformadas con los
vectores adecuados.
Un modo de aplicaciones puede ser la inyección
subcutánea de polipéptidos híbridos unidos a un adyuvante. Otra
posibilidad es la administración oral o nasal del polipéptido
híbrido para inducir la tolerancia inmunitaria o anergia contra los
componentes de los polipéptidos híbridos. Todas estas formas
farmacéuticas posibles se pueden preparar de acuerdo con las normas
(dosis, adyuvantes, pautas de administración) conocidas por el
experto en la técnica.
La invención también se refiere al uso de un
polipéptido híbrido, de un polinucleótido o de una célula de la
invención para la preparación de un fármaco para la vacunación
profiláctica o la inducción de la tolerancia. La administración
profiláctica de polipéptidos híbridos significa la administración
del polipéptido a individuos, preferiblemente niños que todavía no
padecen la alergia de tipo I, para inducir un estado de tolerancia
inmunitaria, anergia o ausencia de respuesta, o una inmunidad
protectora contra los compuestos de la vacuna híbrida. Esto se
puede conseguir mediante los diferentes protocolos descritos en
líneas generales para el tratamiento de un trastorno alérgico
comprobado. Se puede realizar el tratamiento profiláctico con
polipéptidos híbridos que consisten en polipéptidos híbridos o
polinucleótidos que codifican los polipéptidos híbridos que se
describieron en líneas generales anteriormente.
En otra realización, la invención se refiere al
uso de un polipéptido híbrido de la invención para detectar
anticuerpos contra una proteína alergénica en una muestra. El
anticuerpo puede ser un anticuerpo IgM, IgE, IgG o IgA. La
concentración del anticuerpo se puede determinar a partir de una
muestra que se haya obtenido de un líquido corporal. La muestra se
puede obtener de animales o humanos. Tales pruebas pueden utilizar
un polipéptido híbrido inmovilizado en fase sólida o el polipéptido
híbrido en la fase líquida. Ejemplos de tales pruebas pueden ser
los análisis por ELISA, los análisis de inmunotransferencia o
cualquier otra prueba donde el polipéptido híbrido se inmoviliza
para unirse a los anticuerpos específicos que hay en la muestra a
analizar. Alternativamente, el polipéptido híbrido se añade
directamente al líquido que contiene anticuerpos para adsorber los
anticuerpos específicos como, por ejemplo, se hace para los
inmunoanálisis de competición.
El polipéptido de la invención también se puede
utilizar para análisis celulares tales como la prueba de
proliferación de linfocitos T, la prueba de liberación de
mediadores, etc. El polipéptido híbrido puede exponerse a varios
tipos de células para desencadenar respuestas medibles. Tales
respuestas pueden comprender la liberación de histamina u otros
mediadores (por ejemplo, leucotrienos, serotonina, ECP) en el caso
de las células efectoras alérgicas (por ejemplo, mastocitos,
basófilos, eosinófilos). En otro tipo de análisis, se puede medir la
proliferación o la muerte (por ejemplo, apoptosis) de las células,
por ejemplo mediante la captación de
^{3}H-timidina o cualquier otro análisis
adecuado. Tales células pueden ser linfocitos T. Además, se pueden
utilizar polipéptidos híbridos para inducir la liberación de
citocinas u otras sustancias relevantes inmunitariamente (por
ejemplo, desde los linfocitos T) y cuantificables. Además, se
pueden utilizar para los análisis de presentación de antígenos. El
polipéptido híbrido de la invención también se puede utilizar con
vistas a la detección diagnóstica. También se pueden utilizar
polipéptidos híbridos para la prueba de provocación in vivo.
Tales pruebas pueden comprender una prueba cutánea (por ejemplo,
prueba de punción o intradermorreacción), la prueba de provocación
nasal, todos los tipos de pruebas de tolerancia a los alimentos o
las pruebas de provocación bronquial.
Dado que los polipéptidos híbridos pueden
contener epítopos de alérgenos sin relación entre ellos, se pueden
utilizar para pruebas de detección diagnósticas (in vitro e
in vivo, como se describió anteriormente) para detectar la
sensibilización o la incapacidad de respuesta contra uno de los
componentes del polipéptido híbrido. Esto también proporciona al
médico una prueba diagnóstica adecuada para detectar los pacientes
sensibilizados de un modo rápido. Actualmente, tales pruebas (por
ejemplo, Phadiatop, Pharmacia, Uppsala, Suecia) consisten en una
mezcla de alérgenos unidos no covalentemente que se acoplan a un
vehículo. Por lo tanto, la tasa de unión de cada compuesto es
difícil de controlar mientras que un polipéptido híbrido
representaría una forma farmacéutica preferencial para la
preparación de tal prueba de detección.
Más del 40% de los pacientes alérgicos son
sensibles al polen de diferentes especies de gramíneas. Las
gramíneas también son fuentes alérgenas importantes debido a su
distribución mundial y a la gran cantidad de polen que producen.
Contienen una serie de compuestos alergénicos diferentes que
aparecen como alérgenos de reacción cruzada en diferentes
monocotiledóneas. Los inventores demostraron que es posible generar,
mediante la tecnología del ADN recombinante, alérgenos híbridos que
consisten en alérgenos sin relación inmunitaria y sus epítopos.
En una primera etapa, se determinaron las
cosensibilizaciones frecuentes utilizando alérgenos recombinantes
purificados del polen del fleo de los prados para seleccionar las
combinaciones de alérgenos reconocidas con más frecuencia por el
método del alérgeno híbrido. De acuerdo con los experimentos piloto,
se fabricaron híbridos que consisten en los principales alérgenos
del polen del fleo de los prados sin relación inmunitaria.
Comprendían los híbridos de los principales alérgenos del polen del
fleo de los prados Phl p 5/Phl p 1, Phl p 2/Phl p 6 y una
combinación de las cuatro moléculas. Tal y como se demostró para Phl
p 2/Phl p 6, no encontramos ninguna prueba de que un determinado
orden de fabricación para los compuestos por separado afectara la
presentación de los epítopos. Ambos, el híbrido rPhl p 2/Phl p 6 y
el híbrido rPhl p 6/Phl p 2 conservaron los epítopos de los
componentes relevantes para los linfocitos T y B. El gigante que
consiste en los 4 alérgenos también contenía los epítopos relevantes
de cada uno de los componentes.
El método de alérgenos híbridos abrirá nuevas
vías para el diagnóstico y el tratamiento de la alergia de tipo I.
Los híbridos que consisten en los alérgenos reconocidos con más
frecuencia y los epítopos conservados representan moléculas
candidatas para las pruebas de detección de alergia in vitro
así como in vivo. El gigante descrito en la presente
solicitud probablemente identificará más del 95% de los pacientes
alérgicos al polen del fleo de los prados cuando se utiliza para el
diagnóstico porque se parece a la mayoría de los epítopos
relevantes para la IgE presentes en extracto de polen del fleo de
los prados natural. Las moléculas como el gigante se pueden
producir también para otros sistemas de alérgenos (por ejemplo,
alergia a los ácaros). La ventaja de utilizar alérgenos híbridos
para el diagnóstico es que se pueden producir de una manera bien
controlada. A diferencia de los extractos de alérgenos naturales,
que consisten en una dificultad para estandarizar una mezcla de
alérgenos y de materiales no alergénicos, los alérgenos híbridos
contendrán los epítopos relevantes en una proporción bien
definida.
Los alérgenos híbridos recombinantes también se
pueden utilizar para la inmunoterapia. Pueden estar compuestos de
los compuestos biológicamente activos o de unidades de alérgenos
hipoalergénicas. A continuación, los alérgenos híbridos que cubren
patrones de consensibilización frecuente se pueden utilizar para el
tratamiento de alergias con el objeto de que se complejen con
fuentes de alérgenos, por ejemplo la alergia al polen de las
gramíneas, porque se parecen a los epítopos relevantes del extracto
total. Ya que los alérgenos híbridos consisten en componentes
definidos, será posible producir formas farmacéuticas bien definidas
para el tratamiento por vacunación. Los alérgenos híbridos
producidos de las variantes hipoalergénicas se tolerarán a grandes
dosis y, por lo tanto, se pueden utilizar regularmente como vacunas
que se usan para la prevención de infecciones víricas. En este
sentido, se puede considerar la utilización de alérgenos híbridos
que contienen los epítopos de la mayoría de los alérgenos
relevantes para la vacunación profiláctica o la inducción de la
tolerancia incluso en los individuos que todavía están sin
sensibilizar.
El hecho de que la fusión de diferentes
compuestos antigénicos en forma de una molécula híbrida aumentase
la inmunogenia de los compuestos individuales tiene varias
implicaciones para la inmunoterapia específica de alérgenos y para
la vacunación en general. Los alérgenos o los antígenos contra los
cuales se desean respuestas inmunitarias y que muestran por sí
mismos una inmunogenia baja, se pueden fusionar a los híbridos para
aumentar su inmunogenia sin utilizar otros adyuvantes o proteínas
transportadoras. Este principio permitirá inducir unos niveles
elevados de respuestas protectoras con anticuerpos contra alérgenos,
fragmentos de alérgenos, epítopos de alérgenos e imitaciones de los
mismos. Utilizando este principio, también es posible aumentar la
respuesta inmunitaria frente a epítopos de antígenos obtenidos de
agentes infecciosos, tumores u otros compuestos frente a los cuales
es difícil inducir respuestas inmunitarias.
La tabla 1 muestra el porcentaje de inhibición
de la unión de IgE a Phl p 2 y Phl p 6 recombinantes conseguida
después de la preadsorción de suero de 20 pacientes con los
alérgenos híbridos (rPhl p 2/rPhl p 6, rPhl p 6/rPhl p 2) o los
alérgenos recombinantes (rPhl p 2, rPhl p 6).
La tabla 2 muestra el porcentaje de inhibición
de la unión de IgE a Phl p 1, Phl p 5 y Bet v 1 recombinantes
conseguida después de la preadsorción de suero de 20 pacientes con
el alérgeno híbrido rPhl p 5/rPhl p 1 o los alérgenos recombinantes
(rPhl p 1, rPhl p 5, y rBet v 1).
Tabla 3. Los antisueros de ratón generados
contra las moléculas híbridas inhiben la unión de la IgE a los
distintos alérgenos en los pacientes alérgicos al polen de las
gramíneas. Los alérgenos unidos en la placa de ELISA (A: rPhl p 2 y
rPhl p 6; B: rPhl p 1 y rPhl p 5) se preincubaron con antisueros de
ratón (anti-rP2-P6,
anti-rP6-P2,
anti-rPhl p 2, anti-rPhl p 6,
anti-rP5-P1,
anti-rPhl p 1, anti-rPhl p 5 de
ratón). Se muestran los porcentajes de inhibición de la unión de la
IgE obtenidos de 4 pacientes alérgicos al polen de las
gramíneas.
La figura 1 muestra la frecuencia de
cosensibilización a los alérgenos del polen del fleo de los prados
rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, y rPhl p 6 que se determinó en una
población de 110 pacientes alérgicos al polen de las gramíneas.
La figura 2 ilustra la construcción de las
vacunas híbridas. La fusión de los dos genes (por ejemplo, Phl p 5,
Phl p 1) está mediada por una reacción de PCR de dos fases, lo que
crea unos extremos solapantes en la primera reacción de PCR seguido
de la amplificación de ambas secuencias en una segunda fase de la
PCR.
La figura 3 muestra el resultado del ejemplo 3.
Los alérgenos del polen del fleo de los prados purificados (rPhl p
1, rPhl p 2, rPhl p 5, y rPhl p 6) y sus híbridos (rPhl p 5/rPhl p
1, rPhl p 2/rPhl p 6, y rPhl p 6/rPhl p 2) se cargaron en un gel de
poliacrilamida en SDS y se tiñeron con azul brillante de Coomassie.
Las masas moleculares se muestran en el margen izquierdo.
En la figura 4 (A), un híbrido recombinante
purificado que consiste en Phl p 6/Phl p 2/Phl p 5/Phl p 1 se
transfirió de manera puntiforme sobre filtros de nitrocelulosa. En
la fila (B), se inmovilizaron rPhl p 2 (carriles 1, 3, 4 y 5) y rPhl
p 5 (carril 2). Los filtros se incubaron con antisuero de conejo
contra rPhl p 1 (carril 1), rPhl p 2 (carril 2), rPhl p 5 (carril
3), y rPhl p 6 (carril 4). El filtro en el carril 5 se expuso a un
anticuerpo monoclonal de ratón anti-etiqueta de
histidinas.
Las figuras 5 a 7 muestran que las moléculas
híbridas recombinantes inducen respuestas más fuertes de anticuerpos
IgG en los ratones que los compuestos individuales o las mezclas de
los mismos.
Figura 5. Los alérgenos recombinantes
purificados unidos a placas de ELISA (A: rPhl p 2; B: rPhl p 6; C:
rPhl p 1; D: rPhl p 5) se incubaron con suero de ratón (8 ratones
por grupo) que se habían inmunizado con moléculas híbridas
(rP2-P6, rP6-P2,
rP5-P1), los alérgenos recombinantes individuales
(rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, rPhl p 6), o con extracto del polen
del fleo de los prados, tal y como se indica en el eje x. Los
niveles medios de la IgG_{1} en suero recogido 4 y 8 semanas
después de la inmunización corresponden a los valores de DO
mostrados en el eje y.
Figura 6. Los alérgenos recombinantes
purificados unidos a placas de ELISA (rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5,
rPhl p 6) se incubaron con suero de ratones (8 ratones por grupo)
que se habían inmunizado con (A) la molécula gigante o los alérgenos
recombinantes individuales rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, rPhl p 6, y
con (B) la molécula gigante o una mezcla equimolar de rPhl p 1, rPhl
p 2, rPhl p 5, y rPhl p 6, tal y como se indica en el eje x. Los
niveles medios de la IgG_{1} en suero recogido 4 y 8 semanas
después de la inmunización corresponden a los valores de DO
mostrados en el eje y.
Figura 7. El gigante unido a la placa de ELISA
(A), y el extracto de polen del fleo de los prados (B) se incubaron
con suero de ratones (8 ratones por grupo) que se habían inmunizado
con el gigante o con extracto del polen del fleo de los prados tal y
como se indica en el eje x. Los niveles medios de la IgG_{1} en
suero recogido 4 y 8 semanas después de la inmunización corresponden
a los valores de DO mostrados en el eje y.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente
la invención:
El polen de las gramíneas contiene una serie de
alérgenos distintos y relacionados inmunitariamente. Estos
compuestos se reconocen con diferentes frecuencias e intensidades.
Los alérgenos recombinantes del polen del fleo de los prados, rPhl
p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, y rPhl p 6 se identificaron previamente
como los compuestos más importantes que se parecen más a los
epítopos para la IgE de los extractos naturales del polen de las
gramíneas [Niederberger et al. (1998) "IgE antibodies to
recombinant pollen allergens (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, and Bet v
2) account for a high percentage of grass
pollen-specific IgE". J Allergy Clin
Immunol 101: 258-264]. Los resultados de la
evaluación de las cosensibilizaciones en 110 pacientes alérgicos al
polen de las gramíneas a combinaciones de los alérgenos
recombinantes del polen del fleo de los prados se muestran en la
figura 1. Los análisis de ELISA con alérgenos recombinantes
purificados demostraron que el 60% de los pacientes estaban
cosensibilizados a rPhl p 1 y rPhl p 5, que el 30% contenía
anticuerpos IgE contra rPhl p 2 y rPhl p 6, y que el 30%
reaccionaba simultáneamente a los cuatro alérgenos recombinantes
(figura 1). Los estudios de competición previos indicaron que una
mezcla de los cuatro alérgenos anteriormente citados contenía la
mayor parte de los epítopos para la IgE presentes en 8 pólenes de
monocotiledóneas diferentes (gramíneas, maíz) [Laffer et al.
(1996) "Comparison of recombinant timothy grass pollen allergens
with natural extract for diagnosis of grass pollen allergy in
different populations". J Allergy Clin Immunol; 98
652-658].
Suero de pacientes, antisueros y alérgenos
recombinantes:
El suero de 110 pacientes alérgicos se
caracterizó mediante un resultado positivo del análisis RAST
(análisis radioalergosorbente) para el polen del fleo de los prados
y mediante la determinación de anticuerpos IgE contra extractos del
polen del fleo de los prados por análisis de inmunotransferencia tal
y como está descrito [Niederberger et al. (1998) J
Allergy Clin Inmunol 101: 258-264]. Los
alérgenos recombinantes del polen del fleo de los prados rPhl p 1,
rPhl p 2, rPhl p 5, y rPhl p 6 se purificaron tal y como se
describió previamente [Vrtala et al. (1995) J. Allergy
Clin. Immunol. 97: 781-787; Vrtala et al.
(1999) J. Immunol. 163: 5489-5496]. Se
generaron los antisueros de conejo anti-rPhl p 1,
anti-rPhl p 2, anti-rPhl p 5, y
anti-rPhl p 6 contra rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 y
rPhl p 6 purificados utilizando CFA (Charles River, Kissleg,
Alemania).
El protocolo para la construcción de los
alérgenos híbridos recombinantes se muestra en la figura 2. Tal y
como se ejemplificó para un híbrido que consiste en rPhl p 5 unido a
rPhl p 1, los ADNc que codifican los compuestos se amplifican con
las parejas de cebadores adecuados (figura 2: Phl p 5: w, x; Phl p
1: y, z) para crear extremos solapantes. En una segunda reacción de
PCR posterior, se crea un ADNc que comprende ambos ADNc mediante
cebadores específicos para el extremo 5' del primer ADNc (Phl p 5:
w) y el extremo 3' del segundo ADNc (Phl p 1: z) utilizando ambos
los productos de PCR de las primeras reacciones como moldes.
Mediante esta tecnología, se produjeron híbridos recombinantes que
consistían en una combinación de Phl p 5/Phl p 1, rPhl p 2/rPhl p
6, rPhl p 6/rPhl p 2 y de los cuatro alérgenos (extremo
amino-rPhl p 6-rPhl p
2-rPhl p 5-rPhl p
1-extremo carboxilo), denominándose el último el
"gigante".
Construcción de los plásmidos de expresión para
las proteínas híbridas rPhl p 5/rPhl p 1, rPhl p 2/rPhl p 6, rPhl p
6/rPhl p 2 y rPhl p 6/rPhl p 2/rPhl p 5/rPhl p 1.
Los ADNc de Phl p 5 y Phl p 1 se obtuvieron
mediante reacción en cadena de la polimerasa utilizando los
cebadores 5' GGA ATT CAT ATG GCC GAT CTC GGT TAC 3' (SEQ ID n.º 1)
y 5' CGG GGT ACC GAC TTT GTA GCC ACC AGT 3' (SEQ ID n.º 2) para Phl
p 5 y 5' CGG GGT ACC ATG ATC CCC AAG GTT CCC 3' (SEQ ID n.º 3) y 5'
CGG GAT CCT CAG TGG TGG TGG TGG TGG TGC TTG GAC TCG TAG CTG GT 3'
(SEQ ID n.º 4) para Phl p 1. El péptido señal de Phl p 5 se
reemplazó por un sitio de restricción Ndel, que contiene el
codón de inicio ATG en el extremo 5' de la región codificante. Se
introdujo un sitio de restricción Kpnl en el extremo 3' de
Phl p 5 que reemplazó el codón de parada. La secuencia Phl p 1, que
carece del péptido señal, comenzaba con un sitio de restricción
Kpnl en el extremo 5'. En el extremo 3', se introdujo una
cadena de nucleótidos que codifica la etiqueta de hexahistidina,
seguida de un codón de parada y un sitio de restricción
BamHI. Los productos de la PCR se introdujeron como fragmento
Ndel/KpnI/BamHI en el vector de expresión
pET17b.
Las secuencias Phl p 2/Phl p 6 y Phl p 6/Phl p 2
se construyeron utilizando el empalme génico por extensión del
solapamiento (gene SOEing) (17) basada en la PCR. En una
primera reacción de PCR, los ADNc de Phl p 2 y Phl p 6 se
amplificaron utilizando los cebadores 5' GGA ATT CAT ATG GTG CCG AAG
GTG ACG 3' (SEQ ID n.º 5), y 5' CGT GGC CTT CCC CAT AAG CTT CTC TTC
TGG CGC GTA GGT 3' (SEQ ID n.º 6) para Phl p 2 y 5' AAG CTT ATG GGG
AAG GCC ACG ACC 3' (SEQ ID n.º 7) y 5' C GGG ATC CTA GTG GTG GTG GTG
GTG GTG CGC GCC GGG CTT GAC AGC 3' (SEQ ID n.º 8) para Phl p 6 para
crear extremos solapantes. En una reacción de PCR posterior, dos
productos de PCR purificados en gel de agarosa (utilizando el kit de
purificación en gel de QIAGEN) se utilizaron como moldes y se
amplificaron utilizando los cebadores 5' 3' (SEQ ID n.º 9) y
5' 3' (SEQ ID n.º 10). El péptido señal de Phl p 2 se
reemplazó mediante un sitio de restricción Ndel en el
extremo 5', y se eliminó el codón de parada en el extremo 3'. En la
secuencia de Phl p 6, que también carece de péptido señal, se
introdujo la etiqueta de hexahistidina seguida de un codón de parada
y un sitio de restricción BamHI. La construcción Phl p 2/Phl
p 6 resultante se introdujo como fragmento NdeI/BamHI
en el vector de expresión pET17b.
La secuencia de Phl p 6/Phl p 2 se construyó
utilizando el mismo método con los cebadores de PCR 5' GGA ATT CAT
ATG GGG AAG GCC ACG ACC GAG 3' (SEQ ID n.º 11) y 5' CAC CTT CGG CAC
CAT AAG CTT CGC GCC GGG CTT GAC AGC 3' (SEQ ID n.º 12) para Phl p 6
y 5' AAG CTT ATG GTG CCG AAG GTG ACG 3' (SEQ ID n.º 13) y 5' C GGG
ATC CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC TTC TGG CGC GTA GGT 3' (SEQ ID
n.º 14) para Phl p 2 en la primera reacción de PCR, y los cebadores
5' GGA ATT CAT ATG GGG AAG GCC ACG ACC GAG 3' (SEQ ID n.º 15) y 5' C
GGG ATC CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC TTC TGG CGC GTA GGT 3' (SEQ
ID n.º 16) para la segunda reacción de PCR. La construcción Phl p
6/Phl p 2 resultante se introdujo en el vector pET17b como un
fragmento NdeI/BamHI.
Para la construcción del híbrido Phl p 6/Phl p
2/Phl p 5/Phl p 1 ("gigante"), se tomó la construcción Phl p
6/Phl p 2 como molde en una reacción de PCR con los cebadores 5' GGA
ATT CAT ATG GGG AAG GCC ACG ACC GAG 3' (SEQ ID n.º 17) y 5' GGG ATT
TCC ATA TGC TCT TCT GGC GCG TAG G 3' (SEQ ID n.º 18) que reemplaza
la etiqueta de hexahistidina en 3' y el codón de parada por un sitio
de restricción NdeI. Se clonó la secuencia en el vector
pETl7b, que contiene la construcción Phl p 5/Phl p 1 como un
fragmento NdeI. La orientación correcta del inserto se
examinó por digestión de restricción.
Los alérgenos híbridos recombinantes con una
etiqueta de hexahistidina en el extremo carboxilo se expresaron en
E. coli BL21 (DE3) y se purificaron mediante cromatografía de
afinidad de níquel. Los híbridos rPhl p 2/rPhl p 6 y rPhl p 6/rPhl
p 2 se purificaron a partir de la fracción citoplásmica soluble de
extractos de E. coli mientras que el híbrido rPhl p 5/rPhl p
1 y el "gigante" se solubilizaron en urea a partir de la
fracción insoluble de cuerpos de inclusión de E. coli. La
figura 3 muestra un SDS-PAGE teñido con Coomassie
que contiene tres de los híbridos y los alérgenos recombinantes por
separado. La masa molecular determinada mediante
SDS-PAGE correspondía a la masa molecular calculada
para los híbridos sobre la base de su secuencia de aminoácidos
deducida (rPhl p 5/rPhl p 1: 60 kDa; rPhl p 2/rPhl p 6 y rPhl p
6/rPhl p 2: 22 kDa; "gigante": 82 kDa; datos no mostrados).
Todas las construcciones se expresaron en E.
coli BL21 (DE3). Las células se cultivaron en medio LB que
contenía ampicilina a 100 mg/l hasta alcanzar una DO_{600} de 0,8.
Se indujo la expresión de las proteínas recombinantes añadiendo
isopropil-p-tiogalactopiranósido
(IPTG) a una concentración final de 0,5 mM. Después de 4 horas a
37ºC, se recogieron las células por centrifugación.
rPhl p 2/rPhl p 6 y rPhl p 6/rPhl p 2 se
expresaron como proteínas solubles. Las células se resuspendieron
en tampón de lisis (NaH_{2}PO_{4} a 50 mM, NaCl a 300 mM,
imidazol a 10 mM, pH 8,0) y se lisaron con un ultraturrax
(Polytron, Kinematica AG, Suiza). Se centrifugó el lisado a 10 000
xg durante 30 minutos a 4ºC para sedimentar los restos celulares.
Se cargó el sobrenadante en una columna Ni-NTA
(QIAGEN), se eluyeron las proteínas con imidazol a 250 mM y se
dializó frente a agua.
rPhl p 5/rPhl p 1 y rPhl p 6/rPhl p 2/rPhl p
5/rPhl p 1 se expresaron en la fracción de cuerpos de inclusión. Se
resuspendieron las células en Tris a 10 mM y Tritón al 0,1%, pH 7,4,
y se lisaron añadiendo lisozima a 1 mg/ml. Después de centrifugar a
14 000 xg durante 20 minutos a 4ºC, se lavó el sedimento 4 veces con
Tris a 5 mM pH 8,0, NaCl a 0,05 M, desoxicolato al 0,25% y
p-mercaptoetanol a 0,25 mM, y una vez con Tris a 10
mM, pH 8,0 e isopropanol al 3%. Se solubilizaron los cuerpos de
inclusión con urea a 8 M, NaH_{2}PO_{4} a 100 mM y Tris a 10
mM, pH 8,0. Después de centrifugar a 14 000 xg durante 20 minutos,
se cargó el sobrenadante en una columna de Ni-NTA
(Qiagen). Se renaturalizaron las proteínas sobre la columna
utilizando un gradiente de urea lineal de 6 M a 1 M en NaCl a 500
mM, glicerol al 20% y Tris a 20 mM, pH 7,4 durante un periodo de
1,5 horas (18). Se eluyeron las proteínas mediante la adición de
imidazol a 250 mM y se dializaron frente PBS a pH 7,4.
Los alérgenos híbridos recombinantes contenían
las secuencias de aminoácidos primarias completas de sus componentes
y, por lo tanto, el repertorio completo de epítopos de los
alérgenos por separado para los linfocitos T. Se investigó la
presencia de epítopos para los linfocitos B con anticuerpos de
especificidad predefinida para los compuestos por separado y
mediante experimentos inmunitarios de competición. La figura 4
muestra que el "gigante" es reconocido por los antisueros
generados contra rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 y rPhl p 6,
respectivamente (figura 4, fila A: 1-4). La
expresión correcta de la etiqueta de hexahistidina en el extremo
carboxilo se demostró mediante la reactividad de un anticuerpo
monoclonal de ratón anti-eitiqueta de hexahistidina
que reconoció específicamente el "gigante" (figura 4: fila A,
5) pero no el rPhl p 2 que no contiene ninguna etiqueta de
hexahistidina (figura 4: fila B, 5). Los Phl p 2 (fila B: 1, 3, 4)
y rPhl p 5 (fila B: 2) recombinantes (controles negativos) no
reaccionaron con los antisueros (figura 4: fila B).
A continuación, se investigó si los alérgenos
híbridos se pueden utilizar para bloquear la unión entre los
anticuerpos IgE de los pacientes alérgicos al polen de las gramíneas
(n = 20) y cada uno de los compuestos (tablas 1, 2). La tabla 1
muestra que el híbrido rPhl p 2/rPhl p 6, así como el rPhl p 6/rPhl
p 2, inhibía la unión de la IgE a ambos componentes (rPhl p 2, rPhl
p 6) de una manera comparable a la de los alérgenos recombinantes
por separado (una inhibición de aproximadamente el 80% de la unión
de la IgE). Asimismo, encontramos que el híbrido rPhl p 5/rPhl p 1
inhibió la unión de las IgE de los 20 pacientes a ambos, rPhl p 1 y
rPhl p 5, de forma tan eficaz como los compuestos por separado
(inhibición media del 85%) (tabla 2). No se observó ninguna
inhibición cuando los sueros se preadsorbieron con el híbrido rPhl p
5/rPhl p 1 y se hicieron reaccionar con un alérgeno no relacionado
(alérgeno principal del polen de abedul, Bet v 1) mientras que rBet
v 1 causó una autoinhibición casi completa (inhibición del
83%)
(tabla 2).
(tabla 2).
Experimentos de competición por ELISA:
Se diluyeron los sueros de 20 pacientes en una
solución salina tamponada con Tris (TBS) 1:10 para la inhibición
con rPhl p 5/rPhl p 1 y 1:5 para la inhibición con rPhl p 2/rPhl p 6
y rPhl p 6/rPhl p 2. Los sueros se preadsorbieron durante una noche
a 4ºC bien con Phl p 1, Phl p 5, Phl p 5/Phl p 1, Phl p 2, Phl p 6,
Phl p 2/Phl p 6, Phl p 6/Phl p 2, Bet v 1 recombinantes, o con SAB
(10 \mug/ml). Se recubrieron las placas de ELISA con Phl p 1, Phl
p 2, Phl p 5, Phl p 6 y Bet v 1 recombinantes (5 \mug/ml) a 4ºC
durante una noche. Se realizó el ELISA tal y como está descrito
[Niederberger et al. (1998) J Allergy Clin Immunol
101: 258-264].
Se transfirieron en puntos sobre membranas de
nitrocelulosa alícuotas de aproximadamente 1 \mug de Phl p 6/Phl
p 2/Phl p 5/Phl p 1 recombinante, y rPhl p 5 y rPhl p 2 purificados
como controles negativos. Los filtros se bloquearon con TBS, SAB al
1% y Tween-20 al 0,05% durante 1 hora y se incubaron
con sueros de conejo anti-Phl p 1,
anti-Phl p 5 (diluido 1:5000),
anti-Phl p 2 (diluido 1:500),
anti-Phl p 6 (diluido 1:2000), y un anticuerpo
monoclonal de ratón anti-hexahistidina (Dianova,
Alemania) diluido 1:1000 en TBS, SAB al 1% y
Tween-20 al 0,05%. Se lavaron los filtros 3 veces
con TBS y Tween-20 al 0,05%, se incubaron con un
segundo anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo
unido a fosfatasa alcalina (Jackson), y para la detección de la
etiqueta de histidinas con un anticuerpo anti-IgG
de ratón unido a fosfatasa alcalina (PharMingen) diluido 1:1000 en
TBS, SAB al 1% y Tween-20 al 0,05% durante 1 hora,
y se lavaron 3 veces con TBS y Tween-20 al 0,05%. Se
comenzó la reacción del color añadiendo NBT/BCIP (300 \mug/ml) y
se paró con la adición de agua.
Para evaluar si la inmunización con los
alérgenos híbridos induce anticuerpos IgG que reconocen los
componentes alergénicos por separado, se inmunizaron grupos de 8
ratones cada uno con los híbridos, los alérgenos por separado, o
con extracto de polen del fleo de los prados. La figura 5 muestra
que las respuestas de IgG_{1} medias inducidas por las moléculas
híbridas a cada uno de los alérgenos individuales (rPhl p 1, rPhl p
2, rPhl p 5, o rPhl p 6) fueron mayores que las obtenidas mediante
la inmunización con los componentes de los alérgenos por separado.
Los niveles elevados del anticuerpo IgG_{1} inducidos por los
híbridos ya eran detectables 4 semanas después de la primera
inmunización y habían aumentado más después de 4 semanas más. Quizás
lo más interesante fue el resultado de que las moléculas híbridas
inducían unos mayores niveles de IgG_{1} contra los compuestos de
los alérgenos por separado que con el extracto del polen del fleo de
los prados (figura 5). Lo último fue particularmente evidente para
Phl p 2, Phl p 6 y Phl p 1, que los anticuerpos inducidos por
extractos reconocían mal, mientras que las moléculas híbridas
indujeron unas respuestas fuertes de los anticuerpos
anti-Phl p 1, anti-Phl p 2 y
anti-Phl p 6 (figura 5).
Asimismo, encontramos que la inmunización con la
molécula gigante inducía unas mayores respuestas de anticuerpos
contra cada uno de los componentes (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p
6) que la inmunización con los antígenos por separado (figura 6A) o
una mezcla equimolar de los antígenos (figura 6B). La inmunización
con el gigante también produjo unas mejores respuestas inmunitarias
que la inmunización con el extracto del polen del fleo de los
prados. Los anticuerpos IgG inducidos con el extracto de polen del
fleo de los prados mostraron una menor reactividad contra el
gigante y contra el extracto que los inducidos con el gigante
(figura 7A, B).
Grupos de 8 ratones BALB/c hembra (edad: 8
semanas) (Charles River, Alemania) se inmunizaron por vía subcutánea
con rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, rPhl p 6, rP2-P6,
rP6-P2, rP5-P1, la molécula del
gigante, extracto del polen del fleo de los prados, o una mezcla
equimolar de rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, y rPhl p 6 absorbida a
Al(OH)_{3}
(Alu-Gel-S, Serva, Ingelheim,
Alemania). Se mantuvieron los animales en el estabulario del
Instituto de Fisiopatología, Universidad de Viena, según las
directrices locales para cuidado de los animales. Los ratones se
inmunizaron y se sangraron por la vena de la cola a intervalos de
cuatro semanas y los sueros se guardaron a -20ºC hasta el
análisis.
Las IgG_{1} de las respuestas contra rPhl p 1,
rPhl p 2, rPhl p 5, rPhl p 6, rP2-P6,
rP6-P2, rP5-P1, la molécula del
gigante, una mezcla equimolar de rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5, y
rPhl p 6 y el extracto del polen del fleo de los prados se midieron
por ELISA. Los alérgenos (alérgenos recombinantes: 5 \mug/ml;
extracto: 50 \mug/ml) se usaron para recubrir placas Nunc
Maxisorp (Roskilde, Dinamarca) y se incubaron con sueros de ratón
diluidos a 1:1000. Los anticuerpos unidos se detectaron con una
IgG_{1} monoclonal antirratón de rata diluido a 1:1000
(Pharmingen, San Diego, Cal, EE. UU.) y un antisuero de oveja
antirrata marcado con HRP diluido a 1:2000 (Amersham,
Buckinghamshire, GB).
A continuación, examinamos si los anticuerpos de
ratón inducidos con las moléculas híbridas pueden bloquear la unión
de los anticuerpos IgE de los pacientes alérgicos al polen de las
gramíneas con los alérgenos purificados del polen de las gramíneas
(tabla 3). Los experimentos de competición por ELISA realizados con
sueros de 4 pacientes representativos alérgicos al polen de las
gramíneas demostraron que los anticuerpos inducidos por las
moléculas híbridas inhibían fuertemente la unión de las IgE a los
alérgenos purificados: los anticuerpos IgG inducidos con la
molécula híbrida rP2-P6 y la rP6-P2
causaron una inhibición del 48%-54% de la unión de las IgE a Phl p
2, y una inhibición del 54%-67% de la unión de las IgE a Phl p 6
(tabla 3A). En cambio, la inhibición de la reactividad de la IgE
producida mediante la preincubación con los anticuerpos inducidos
con rPhl p 2 y rPhl p 6 solos fue muy baja (0-15%)
(tabla 3A). Los anticuerpos
anti-P5-P1 causaron una inhibición
de más del doble de la unión de IgE a Phl p 5 (inhibición media del
59,5%) que los anticuerpos generados contra Phl p 5 solo (28%)
(tabla 3B). La inhibición de la unión de IgE a Phl p 1 producida con
los anticuerpos generados contra el híbrido rP5-P1
(inhibición media del 18,5%) y Phl p 1 solo (inhibición media del
29,5%) fue menor (tabla 3B).
Se obtuvieron resultados similares con la
molécula gigante que induce anticuerpos IgG que bloquearon con
eficacia la unión de las IgE de los pacientes alérgicos al polen de
las gramíneas a Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6 y el extracto de
polen del fleo de los prados (datos no mostrados).
La capacidad de los anticuerpos de ratón
anti-rP2-P6,
anti-rP6-P2 y
anti-rP5-P1 para inhibir la unión de
los anticuerpos IgE de pacientes alérgicos al polen de las
gramíneas a rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 o rPhl p 6 se examinó
mediante experimentos de competición por ELISA. Se recubrieron las
placas de ELISA (Nunc) con Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 y Phl p 6
recombinantes (1 \mug/ml) durante una noche a 4ºC, las placas se
lavaron dos veces con TBST (solución salina tamponada con Tris,
Tween al 0,05%), se saturaron con 200 \mul de TBST/SAB al 1% y se
preincubaron con antisueros de ratón
anti-rP2-P6,
anti-rP6-P2 y
anti-rP5-P1 o, para propósitos de
control, con los correspondientes sueros preinmunitarios cada uno
diluido 1:50 en TBST/SAB al 0,5% durante una noche a 4ºC. Después
de lavar 5 veces con TBST, se incubaron las placas con sueros
humanos de pacientes alérgicos al polen de las gramíneas diluido
1:5 en TBST/SAB al 0,5% durante una noche a 4ºC. Después de lavar 5
veces con TBST, se detectó la IgE humana unida con un anticuerpo de
ratón anti-IgE humana marcado con FA (Pharmingen)
diluido 1:1000 en TBST/SAB al 0,5% (1 hora a 37ºC, 1 hora a 4ºC).
Después de lavar 5 veces con TBST, se comenzó la reacción del color
añadiendo 100 \mul del sustrato del ELISA (Sigma Diagnostics,
Inc., St. Louis, EE. UU.). El porcentaje de reducción de la unión
de la IgE humana después de la preincubación con antisueros de
ratón se determinó según la fórmula: % de inhibición de la unión de
IgE = 100 - DO_{l}/DO_{p} x 100. DO_{l} y DO_{p}
representan las extinciones después de la preincubación con el suero
inmunitario y el suero preinmunitario, respectivamente.
<110>
SHAN-Beteiligungsgesellschaft m.b.H.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacunas de alergia que contienen
polipéptidos híbridos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Vacunas de alergia que contienen
polipéptidos híbridos
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
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<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP-A 00.128660.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
28-12-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PADAT Sequenzmodul, versión 1,0
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<210> 1
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipggaattcata tggccgatct cggttac
\hfill27
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<210> 2
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipcggggtaccg actttgtagc caccag
\hfill27
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<210> 3
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<400> 3
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\hfill24
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipggaattcata tggggaaggc cacgaccgag
\hfill30
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<210> 12
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<211> 39
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<223> cebador
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<400> 12
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\hfill39
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<400> 13
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\hfill24
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<210> 14
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<212> ADN
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskipcgggatccta gtggtggtgg tggtggtgct cttctggcgc gtaggt
\hfill46
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<223> cebador
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskipggaattcata tggggaaggc cacgaccgag
\hfill30
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\hfill46
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggatttcca tatgctcttc tggcgcgtag g
\hfill31
Claims (20)
1. Un alérgeno híbrido que es un polipéptido que
comprende al menos dos proteínas alergénicas diferentes o fragmentos
de las mismas, en el que cada fragmento consiste en al menos ocho
aminoácidos consecutivos de la proteína alergénica correspondiente,
caracterizado porque la proteína alergénica de la que se
obtiene el polipéptido híbrido consiste en los alérgenos principales
sin relación inmunitaria entre sí del polen del fleo de los
prados.
2. Un alérgeno híbrido según la reivindicación
1, en la que el polipéptido híbrido comprende los alérgenos
principales sin relación entre sí del polen del fleo de los prados
seleccionados entre Phl p 5/Phl p 1, Phl p 2/Phl p 6 y una
combinación de las cuatro moléculas.
3. Un alérgeno híbrido según la reivindicación
1, en el que el polipéptido híbrido comprende al menos una proteína
alergénica completa.
4. Un alérgeno híbrido según la reivindicación
3, en el que el polipéptido híbrido comprende al menos dos proteínas
alergénicas completas.
5. Un alérgeno híbrido según la reivindicación
1, en el que el polipéptido híbrido comprende al menos un fragmento
de proteínas alergénicas cuyo fragmento tiene una actividad
alergénica sustancialmente reducida en comparación con la proteína
alergénica de la que se obtiene.
6. Un alérgeno híbrido según la reivindicación
5, en el que el polipéptido híbrido comprende fragmentos de al menos
dos proteínas alergénicas diferentes cuyos fragmentos, todos, tienen
una actividad alergénica sustancialmente reducida en comparación con
las proteínas alergénicas correspondientes de las que obtienen.
7. Un alérgeno híbrido según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que comprende al menos
tres proteínas alergénicas diferentes o fragmentos de las
mismas.
8. Un polinucleótido que codifica un polipéptido
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. El uso de un polinucleótido según la
reivindicación 8 para la preparación de una vacuna de ADN.
10. Una célula transfectada o transformada con
un polinucleótido que comprende un polinucleótido según la
reivindicación 8.
11. Una composición farmacéutica que contiene un
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un
polinucleótido según la reivindicación 8, o una célula según la
reivindicación 10.
12. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 11 que es una composición de vacuna.
13. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 11 o 12 que contiene además un adyuvante.
14. Un método para la preparación de un
polipéptido híbrido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
7, que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar un polinucleótido que codifica
el polipéptido híbrido;
b) introducir dicho polinucleótido en una célula
hospedadora; y
c) cultivar la célula hospedadora obtenida en la
etapa b) en condiciones tales que se exprese el polipéptido híbrido;
y
d) recuperar el producto de expresión de la
célula.
15. Un método según la reivindicación 14, en el
que el polinucleótido que codifica el polipéptido híbrido se prepara
utilizando la tecnología de la PCR.
16. Un método para la preparación de un
polipéptido híbrido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
7, caracterizado porque el polipéptido se prepara mediante
síntesis química.
17. El uso de un polipéptido híbrido según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de un polinucleótido
según la reivindicación 8, o de una célula según la reivindicación
10, para la preparación de un fármaco para el tratamiento de un
trastorno alérgico.
18. El uso de un polipéptido híbrido según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de un polinucleótido
según la reivindicación 8, o de una célula según la reivindicación
10, para la preparación de un fármaco para la vacunación
profiláctica o la inducción de tolerancia.
19. El uso de un polipéptido híbrido según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la detección de
anticuerpos contra una proteína alergénica en una muestra.
20. La utilización según la reivindicación 19,
en la que la detección se realiza mediante pruebas con anticuerpos
in vitro y pruebas que utilizan células.
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