ES2290524T3 - Dispositivos de ensayo de flujo continuo, autocalibrados. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo de ensayo de flujo continuo, capaz de Dispositivo de ensayo de flujo continuo, capaz de detectar la presencia o la cantidad de un analito detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en una muestra a analizar, comprendiendque reside en una muestra a analizar, comprendiendo dicho dispositivo de ensayo de flujo continuo uno dicho dispositivo de ensayo de flujo continuo una membrana porosa, estando dicha membrana porosa ea membrana porosa, estando dicha membrana porosa en comunicación con sondas de detección capaces de n comunicación con sondas de detección capaces de generar una señal de detección y sondas de calibragenerar una señal de detección y sondas de calibración capaces de generar una señal de calibración, ción capaces de generar una señal de calibración, en el que se puede determinar la cantidad del analen el que se puede determinar la cantidad del analito a partir de dicha señal de detección que está ito a partir de dicha señal de detección que está calibrada por dicha señal de calibración, en el qucalibrada por dicha señal de calibración, en el que dichas sondas de detección, dichas sondas de cale dichas sondas de detección, dichas sondas de calibración, o combinaciones de las mismas están conjibración, o combinaciones de las mismas están conjugadas a un miembro de unión específico para el anugadas a un miembro de unión específico para el analito, caracterizado el ensayo de flujo continuo palito, caracterizado el ensayo de flujo continuo porque dicha membrana porosa define una única zona orque dicha membrana porosa define una única zona de detección/calibración dentro de la cual está inde detección/calibración dentro de la cual está inmovilizado un reactivo de captura polielectrolíticmovilizado un reactivo de captura polielectrolítico que está configurado para unirse directa o indiro que está configurado para unirse directa o indirectamente a combinaciones de las sondas de detecciectamente a combinaciones de las sondas de detección y las sondas de calibración, en el que dichas són y las sondas de calibración, en el que dichas sondas de detección son capaces de generar una señaondas de detección son capaces de generar una señal de detección y dichas sondas de calibración son l de detección y dichas sondas de calibración son capaces de generar una señal de calibración mientrcapaces de generar una señal de calibración mientras permanecen dentro de dicha zona de detección/caas permanecen dentro de dicha zona de detección/calibración, y en el que dicho polielectrólito tienelibración, y en el que dicho polielectrólito tiene una carga positiva neta y se selecciona entre el una carga positiva neta y se selecciona entre el grupo que consiste en polilisina, polietilenimina,grupo que consiste en polilisina, polietilenimina, poliaminas o poliamidoaminas funcionalizadas con poliaminas o poliamidoaminas funcionalizadas con epiclorohidrina, cloruro de polidialildimetilamoniepiclorohidrina, cloruro de polidialildimetilamonio, derivados catiónicos de la celulosa, y combinaco, derivados catiónicos de la celulosa, y combinaciones de los mismos, o dicho polielectrólito tieneiones de los mismos, o dicho polielectrólito tiene una carga negativa neta y es un ácido poliacrílic una carga negativa neta y es un ácido poliacrílico, o dicho polielectrólito es anfipático. o, o dicho polielectrólito es anfipático.
Description
Dispositivos de ensayo de flujo continuo,
autocalibrados.
Habitualmente se emplean varios procedimientos y
dispositivos analíticos en los ensayos de flujo continuo para
determinar la presencia y/o la concentración de analitos que pueden
encontrarse presentes en una muestra a analizar. Por ejemplo, los
inmunoensayos utilizan mecanismos de los sistemas inmunitarios, en
los que se producen anticuerpos en respuesta a la presencia de
antígenos que son patógenos o extraños a los organismos. Estos
anticuerpos y antígenos, es decir, inmunorreactivos, son capaces de
unirse uno con otro, lo que causa un mecanismo de reacción muy
específico que se puede utilizar para determinar la presencia o la
concentración de ese antígeno particular en una muestra
biológica.
Hay varios métodos de inmunoensayo bien
conocidos que utilizan inmunorreactivos marcados con un componente
detectable de tal forma que el analito se puede detectar
analíticamente. Por ejemplo, los ensayos de tipo "sandwich"
normalmente implican mezclar la muestra a analizar con sondas
detectables, tales como un látex coloreado o un radioisótopo, que
están conjugados con un miembro de unión específico para el analito.
Las sondas conjugadas forman complejos con el analito. A
continuación, estos complejos alcanzan una zona de anticuerpos
inmovilizados donde se produce la unión entre los anticuerpos y el
analito para formar "complejos sandwich" ternarios. Los
complejos sandwich están localizados en la zona para la detección
del analito. Se puede utilizar esta técnica para obtener resultados
cuantitativos o semicuantitativos. Algunos ejemplos de tales ensayos
de tipo sandwich se describen en las patentes de los EE.UU. n.º
4.168.146 de Grubb y otros y n.º 4.366.241 de Tom y otros.
Además, la solicitud de patente internacional WO
97/09620 se refiere a un método para la determinación de analitos
en una muestra a analizar y describe el uso de una o más zonas de
análisis para detectar el analito y una o más zonas de calibración
que reciben los agentes de calibración marcados. Las señales
asociadas en las diferentes zonas de análisis y zonas de
calibración se comparan para determinar la presencia del
analito.
Una técnica alternativa es el ensayo "de tipo
competitivo". En un ensayo de "tipo competitivo", la
marcación normalmente es un analito marcado o un análogo de analito
que compite por la unión de un anticuerpo con cualquier analito sin
marcar presente en la muestra. Normalmente, los análisis
competitivos se utilizan para detectar analitos tales como los
haptenos, siendo cada hapteno monovalente y siendo capaz de unir
sólo una molécula de anticuerpo. Ejemplos de dispositivos de
inmunoensayos competitivos se describen en las patentes de los
EE.UU. n.º 4.235.601 de Deutsch y otros, 4.442.204 de Liotta y
5.208.535 de Buecher y otros.
Muchos de estos ensayos dependen de la
calibración para proporcionar resultados válidos y significativos,
particularmente para las detecciones cuantitativas y
semicuantitativas. Específicamente, por lo general se pueden
emplear sistemas de calibración externos o internos. En un sistema
de calibración externo, se puede obtener una curva estándar a
partir de muestras estándares que contienen una serie de cantidades
conocidas de un analito y a continuación se comparan los resultados
obtenidos a partir de las muestras con la curva estándar para
extraer la presencia y/o la cantidad del analito en la muestra. El
método de calibración externa es relativamente fácil de diseñar y
fácil de aplicar. Sin embargo, a menudo está sometido a la
interferencia de variaciones medioambientales y entre lotes y, por
lo tanto, es poco fiable.
Los sistemas de calibración interna
convencionales, por otra parte, utilizan típicamente una membrana
que tiene una zona de calibración y una zona de detección en las
que está inmovilizado el reactivo de captura específico para el
analito. Desgraciadamente, la capacidad de la zona de calibración
para proporcionar una comparación fiable y precisa para la zona de
detección es a menudo limitada. Además, las zonas de calibración
más internas son relativamente caras, lo que las convierten en
impracticables para determinadas aplicaciones.
Así pues, actualmente existe la necesidad de un
sistema de calibración preciso para los ensayos de flujo continuo
que sea preciso y barato.
El dispositivo de ensayo de flujo continuo de la
presente invención es el dispositivo de ensayo de flujo continuo de
la reivindicación 1. De acuerdo con una realización de la presente
invención, se describe un dispositivo de ensayo de flujo continuo
(por ejemplo, sandwich, competitivo, etc.) que es capaz de detectar
la presencia o la cantidad de un analito que reside en una muestra
a analizar. El dispositivo de ensayo comprende una membrana porosa
que está en comunicación con sondas de detección y sondas de
calibración que son capaces de generar una señal de detección y una
señal de calibración, respectivamente. Por ejemplo, en algunas
realizaciones, las sondas se seleccionan entre el grupo que
consiste en cromógenos, catalizadores, compuestos fluorescentes,
compuestos quimioluminiscentes, compuestos fosforescentes,
compuestos radiactivos, marcadores visuales directos, liposomas y
combinaciones de los mismos. En una realización particular, las
sondas contienen una micropartícula de látex.
La membrana porosa define una zona de
calibración/detección dentro de la cual está inmovilizado un
reactivo de captura polielectrolítico que se configura para unirse
directa o indirectamente a una combinación de sondas de detección y
sondas de calibración. Se puede utilizar un segundo reactivo de
captura que es un miembro de unión específico para el analito. La
zona de detección/calibración es capaz de generar una señal de
detección y calibración de tal forma que la cantidad del analito se
puede determinar a partir de la señal de detección calibrada por la
señal de calibración.
De acuerdo con otra realización de la presente
invención, en la reivindicación 13 se describe un método para
detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una
muestra a analizar. El método comprende proporcionar un dispositivo
de ensayo de flujo continuo. Una muestra a analizar que contiene el
analito se pone en contacto con las sondas de detección y las
sondas de calibración presentes en el dispositivo. En una zona de
detección/calibración se mide la intensidad de la señal de
detección y de la señal de calibración. La cantidad del analito
dentro de la muestra a analizar es proporcional a la intensidad de
la señal de detección calibrada por la intensidad de la señal de
calibración.
Otras características y aspectos de la presente
invención se discuten con más detalle posteriormente.
Una descripción completa y de apoyo de la
presente invención, incluido el mejor modo de la misma, dirigida a
un experto en la técnica, se expone más particularmente en el resto
de la memoria, que hace referencia a las figuras anexas, en las
que:
la figura 1 es una vista en perspectiva de una
realización de un dispositivo de ensayo de flujo continuo de la
presente invención;
la figura 2 es una ilustración gráfica de una
realización para conjugar covalentemente un anticuerpo a
nanopartículas carboxiladas;
la figura 3 es una ilustración esquemática de
una realización de un dispositivo de ensayo de flujo continuo de la
presente invención;
la figura 4 es una ilustración esquemática de
otra realización de un dispositivo de ensayo de flujo continuo de
la presente invención;
la figura 5 es una ilustración esquemática de
otra realización más de un dispositivo de ensayo de flujo continuo
de la presente invención; y
La figura 6 es una ilustración esquemática de
otra realización de un dispositivo de ensayo de flujo continuo de
la presente invención.
El uso repetido de caracteres de referencia en
la presente memoria y dibujos pretende representar las mismas o
análogas características o elementos de la invención.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
terminología "analito" generalmente se refiere a una sustancia
que hay que detectar. Por ejemplo, los analitos pueden incluir
sustancias antigénicas, haptenos, anticuerpos y combinaciones de
los mismos. Los analitos incluyen, pero sin limitarse a ellos,
toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos,
microorganismos, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas,
esteroides, vitaminas, fármacos (incluidos los administrados para
propósitos terapéuticos, así como los administrados para propósitos
ilícitos), fármacos intermediarios o subproductos de fármacos,
bacterias, partículas víricas y metabolitos de cualquiera de las
sustancias anteriores o anticuerpos contra las mismas. Ejemplos
específicos de algunos analitos incluyen ferritina; creatinina
cinasa MIB (CK-MIB); digoxina; fenitoína;
fenobarbitol; carbamazepina; vancomicina; gentamicina; teofilina;
ácido valproico; quinidina; lutropina (LH); folitropina (FSH);
estradiol, progesterona; proteína C reactiva; lipocalinas;
anticuerpos de IgE; microglobulina de vitamina B2; hemoglobina
glicada (Gly. Hb); cortisol; digitoxina;
N-acetilprocainamida (NAPA); procainamida;
anticuerpos contra la rubéola, tales como
rubéola-IgE y rubéola-IgM;
anticuerpos contra la toxoplasmosis, tales como IgG contra la
toxoplasmosis (Toxo-IgG) e IgM contra la
toxoplasmosis (Toxo-IgM); testosterona; salicilatos;
acetaminofeno; antígeno de superficie del virus de la hepatitis B
(HBsAg); anticuerpos contra el antígeno central de la hepatitis B,
tales como IgG e IgM contra el antígeno central de la hepatitis B
(Anti-HBC); virus de la inmunodeficiencia humana 1
y 2 (VIH 1 y 2); virus de la leucemia de los linfocitos T humanos 1
y 2 (HTLV); antígeno e de la hepatitis B (HBeAg); anticuerpos
contra el antígeno e de la hepatitis B (Anti-HBe);
tirotropina (TSH); tiroxina (T4); triyodotironina total (Total T3);
triyodotironina libre (Free T3); antígeno carcinoembrionario (CEA);
y proteína fetal \alpha (AFP). Entre los medicamentos de posible
abuso y sustancias contraindicadas se incluyen, pero sin pretender
limitarse a ellos, anfetamina; metanfetamina; barbituratos, tales
como amobarbital, secobarbital, pentobarbital, fenobarbital y
barbital; benzodiacepinas, tales como librium y valium;
cannabinoides, tales como hachís y marihuana; cocaína; fentanilo;
LSD; metacualona; opiatos, tales como heroína; morfina, codeína,
hidromorfona, hidrocodona, metadona, oxicodona, oximorfona y opio;
fenciclidina; y propoxiheno. Otros posibles analitos pueden estar
descritos en las patentes de los EE.UU. n.º 6.436.651 de Evehart y
otros, y n.º 4.366.241 de Tom y otros.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
terminología "muestra a analizar" generalmente se refiere a un
material que se sospecha que contiene el analito. La muestra a
analizar se puede utilizar directamente tal y como se obtiene de la
fuente o después de un pretratamiento para modificar la naturaleza
de la muestra. La muestra a analizar se puede obtener de cualquier
fuente biológica, tal como un líquido fisiológico, que incluye
sangre, saliva, humor vítreo, líquido cefalorraquídeo, sudor, orina,
leche, líquido ascítico, flemas, líquido sinovial, líquido
peritoneal, líquido amniótico o similares. A la muestra a analizar
se le puede dar un tratamiento previo antes de usarla, tal como
preparar plasma a partir de sangre, diluir fluidos viscosos y
similares. Los métodos de tratamiento pueden implicar la filtración,
destilación, concentración, inactivación de componentes
interferentes y la adición de reactivos. Además de los líquidos
fisiológicos, se pueden utilizar otras muestras líquidas tal como
agua, productos alimenticios y similares para la realización de
ensayos medioambientales o de producción de alimentos.
Adicionalmente, se puede utilizar como muestra a analizar un
material sólido que se sospeche que contiene el analito. En algunos
casos, puede ser beneficioso modificar una muestra a analizar
sólida para formar un medio líquido o para liberar el analito.
A continuación se hará referencia en detalle a
varias realizaciones de la invención, uno o más ejemplos de las
cuales se presentan más abajo. Cada ejemplo se proporciona a modo de
explicación de la invención, y no como una limitación de la misma.
De hecho, para los expertos en la técnica será evidente que se
pueden realizar varias modificaciones y variaciones en la presente
invención sin alejarse del alcance de la invención. Por ejemplo,
las características ilustradas o descritas como parte de una
realización se pueden usar en otra realización para producir otra
realización más. Así, se pretende que la presente invención cubra
tales variaciones y modificaciones tal y como vienen dentro del
alcance de las reivindicaciones anexas.
En general, la presente invención se refiere a
un sistema interno autocalibrado para dispositivos de ensayos de
flujo continuo. En particular, la presente invención emplea el uso
de una sola zona de detección/calibración definida por una membrana
porosa del ensayo. Transmitir una detección de la señal y una
calibración interna al mismo tiempo puede aumentar enormemente la
fiabilidad y reproducibilidad de la detección al eliminar las
influencias de los factores medioambientales, como la temperatura,
el pH y la inestabilidad instrumental de la señal de detección.
En relación con la figura 1, por ejemplo, una
realización de un dispositivo de ensayo de flujo continuo (20) que
se puede realizar de acuerdo con la presente invención se describirá
a continuación con más detalle. Tal como se muestra, el dispositivo
(20) contiene una membrana porosa (23) soportada opcionalmente por
un material rígido (21). En general, la membrana porosa (23) se
puede fabricar de cualquiera de una serie de materiales que la
muestra a analizar es capaz de atravesar. Por ejemplo, los
materiales utilizados para formar la membrana porosa (23) pueden
incluir, pero sin limitarse a ellos, materiales naturales,
sintéticos o que se producen de forma natural, que se modifican
sintéticamente, tales como polisacáridos (por ejemplo, materiales de
celulosa tales como papel y derivados de celulosa, tales como
acetato de celulosa y nitrocelulosa); sílice; materiales
inorgánicos, tales como aluminio desactivado, tierra de diatomeas,
MgSO_{4} u otro material inorgánico desintegrado finamente y
dispersado uniformemente en una matriz polimérica porosa, con
polímeros tales como cloruro de vinilo, copolímero de cloruro de
vinilo-propileno y copolímero de cloruro de
vinilo-acetato de vinilo; tela, que se produce de
forma natural (por ejemplo, algodón) y sintética (por ejemplo, nilón
o rayón); geles porosos, tales como gel de sílice, agarosa,
dextrano y gelatina; películas poliméricas, tales como
poliacrilamida, y similares. En una realización particular, la
membrana porosa (23) está formada a partir de materiales de
nitrocelulosa y/o sulfona de poliéster. Se debe entender que la
terminología "nitrocelulosa" se refiere a ésteres de ácido
nítrico con celulosa, que puede ser nitrocelulosa solo o un éster
mixto de ácido nítrico y otros ácidos, tales como ácidos
carboxílicos alifáticos que tienen de 1 a 7 átomos de carbono.
El dispositivo (20) también puede contener una
almohadilla de mecha (28). La almohadilla de mecha (28) recibe
generalmente líquido que ha migrado a través de toda la membrana
porosa (23). Como se conoce bien en la técnica, la almohadilla de
mecha (28) puede ayudar a promover la acción capilar y el flujo de
líquido a través de la membrana (23).
Para iniciar la detección de un analito dentro
de la muestra a analizar, un usuario puede aplicar directamente la
muestra a analizar a una parte de la membrana porosa (23) a través
de la cual se puede desplazar hasta alcanzar una zona de
detección/calibración (31) (descrita más abajo). Alternativamente,
se puede aplicar primero la muestra a analizar a una almohadilla de
muestra (no mostrada) que se encuentra en comunicación mediante
líquido con la membrana porosa (23). Algunos de los materiales
adecuados que se pueden utilizar para formar la almohadilla de
muestreo incluyen, pero sin limitarse a ellos, nitrocelulosa,
celulosa, almohadillas de polietileno poroso y papel de filtro de
fibra de vidrio. Si se desea, la almohadilla de muestreo también
puede contener uno o más reactivos de pretratamiento del ensayo,
unidos difusivamente o no difusivamente a ella.
En la realización ilustrada, la muestra a
analizar se desplaza de la almohadilla de muestreo (no mostrada)
hasta una almohadilla de conjugado (22) que está colocada en
comunicación con un extremo de la almohadilla de muestreo. La
almohadilla de conjugado (22) está formada por un material que la
muestra a analizar es capaz de atravesar. Por ejemplo, en una
realización, la almohadilla de conjugado (22) está formada de fibras
de vidrio. Aunque solo se muestra una almohadilla de conjugado
(22), se debe entender que también se pueden utilizar otras
almohadillas de conjugado en la presente invención.
\newpage
Para facilitar la detección exacta de la
presencia o la ausencia de un analito dentro de la muestra a
analizar, se aplican sondas en diferentes localizaciones del
dispositivo (20). Como se describirá con más detalle más adelante,
se utilizan sondas tanto para la detección del analito como para la
calibración. Cualquier sustancia que sea generalmente capaz de
generar una señal que sea detectable visualmente o mediante un
dispositivo instrumental se puede utilizar como sonda. Diferentes
sustancias adecuadas pueden incluir cromógenos; catalizadores;
compuestos fluorescentes; compuestos quimioluminiscentes;
compuestos fosforescentes; compuestos radiactivos; marcadores
visuales directos, que incluyen partículas coloidales metálicas (por
ejemplo, oro) y no metálicas, partículas, enzimas o sustratos
colorantes, o partículas de látex de polímero orgánico; liposomas u
otras vesículas que contienen sustancias productoras de señales; y
similares. Por ejemplo, algunas enzimas adecuadas para utilizarse
como sondas se describen en la patente de los EE.UU. n.º 4.275.149
de Litman y otros.
Un ejemplo de un sistema de enzima/sustrato es
la enzima fosfatasa alcalina y el sustrato azul de
nitrotetrazolio-5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato,
o un derivado o análogo del mismo, o el sustrato
4-metilumbeliferilfosfato. Otras sondas adecuadas
pueden estar descritas en las patentes de los EE.UU n.º 5.670.381
de Jou y otros y n.º 5.252.459 de Tarcha y otros.
En algunas realizaciones, las sondas pueden
contener un compuesto fluorescente que produce una señal detectable.
Los compuestos fluorescentes pueden ser moléculas fluorescentes,
polímeros, dendrímeros, partículas y similares. Algunos ejemplos de
moléculas fluorescentes adecuadas, por ejemplo, incluyen, pero sin
limitarse a ellas, fluoresceína, quelatos de europio,
ficobiliproteína, rodamina y sus derivados y análogos. También se
puede utilizar como una sonda un compuesto coloreado visualmente
detectable, por medio de lo cual se proporciona una lectura
coloreada directa de la presencia o la concentración del analito en
la muestra sin necesidad de otros reactivos productores de
señales.
señales.
Las sondas, tales como las descritas
anteriormente, se puede utilizar solas o junto con una
micropartícula (algunas veces citadas como "perlas" o
"microperlas"). Por ejemplo, se pueden utilizar
micropartículas que se producen de forma natural, tales como
núcleos, micoplasmas, plásmidos, plastidios, células de mamíferos
(por ejemplo, fantasmas de eritrocitos), microorganismos
unicelulares (por ejemplo, bacterias), polisacáridos (por ejemplo,
agarosa) y similares. Además, también se pueden utilizar
micropartículas sintéticas. Por ejemplo, en una realización, se
utilizan micropartículas de látex que están marcadas con un
colorante fluorescente o coloreado. Aunque se puede utilizar
cualquier micropartícula de látex en la presente invención, las
micropartículas de látex normalmente están formadas de poliestireno,
estirenos de butadieno, terpolímero de estireno
acrílico-vinilo, polimetilmetacrilato,
polietilmetacrilato, copolímero de
estireno-anhídrido maleico, acetato de polivinilo,
polivinilpiridina, polidivinilbenceno, polibutilenotereftalato,
acrilonitrilo, vinilcloruro-acrilatos y similares,
o un derivado aldehído, carboxilo, amino, hidroxilo o hidrazida de
los mismos. Otras micropartículas adecuadas pueden estar descritas
en las patentes de los EE.UU n.º 5.670.381 de Jou y otros, y n.º
5.252.459 de Tarcha y otros.
Algunos ejemplos comercialmente disponibles de
partículas fluorescentes adecuadas incluyen las microesferas
carboxiladas fluorescentes vendidas por Molecular Probes, Inc. con
los nombres comerciales "FluoSphere" (Red 580/605) y
"TransfluoSphere" (543/620), así como "Texas Red" y 5- y
6-carboxitetrametilrodamina, también vendidos por
Molecular Probes, Inc. Ejemplos disponibles comercialmente de
micropartículas de látex coloreadas adecuadas incluyen perlas de
látex carboxilado vendidas por Bang's Laboratory, Inc.
Cuando las sondas son partículas, tales como las
descritas anteriormente, el diámetro medio de las partículas puede
variar generalmente como se desee según factores tales como el tipo
de la partícula elegida, el tamaño de los poros de la membrana y la
composición de la membrana. Por ejemplo, en algunas realizaciones,
el diámetro medio de los marcadores particulados puede oscilar de
unas 0,01 micras a unas 1000 micras, en algunas realizaciones de
unas 0,01 micras a unas 100 micras y en algunas realizaciones de
unas 0,01 micras a unas 10 micras. En una realización particular,
las partículas tienen un diámetro medio de unas 0,1 a unas 2 micras.
Generalmente, las partículas tienen una forma sustancialmente
esférica, aunque otras formas que incluyen, pero sin limitarse a
ellas, láminas, bastoncillos, barras, formas irregulares, etc., son
adecuadas para su utilización en la presente invención. Como
apreciarán los expertos en la técnica, la composición, forma,
tamaño, y/o densidad de las partículas puede variar
ampliamente.
Se desea modificar las sondas de algún modo de
manera que se puedan unir más fácilmente al analito. Las sondas se
modifican con ciertos miembros de unión específicos que se adhieren
a éstas para formar conjugados de sondas. Los miembros de unión
específicos generalmente se refieren a un miembro de un par de unión
específico, es decir, dos moléculas diferentes donde una de las
moléculas se une química y/o físicamente a la segunda molécula. Por
ejemplo, los miembros de unión específicos inmunorreactivos pueden
incluir antígenos, haptenos, aptámeros, anticuerpos y complejos de
los mismos, incluidos los formados por métodos de ADN recombinante o
síntesis de péptidos. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo
monoclonal o policlonal, una proteína recombinante o una(s)
mezcla(s) o fragmento(s) de la misma, así como una
mezcla de un anticuerpo y otros miembros de unión específicos. Los
detalles de la preparación de tales anticuerpos y su adecuación para
ser utilizados como miembros de unión específicos son bien
conocidos por los expertos en la técnica. Otros pares de unión
específicos habituales incluyen, pero sin limitarse a ellos,
biotina y avidina, glúcidos y lectinas, secuencias nucleotídicas
complementarias (incluidas secuencias de ácidos nucleicos de sonda
y de captura utilizadas en los ensayos de hibridación de ADN para
detectar una secuencia de ácidos nucleicos deseada), secuencias
peptídicas complementarias incluidas las formadas por métodos
recombinantes, moléculas efectora y receptora, hormona y la proteína
de unión a la hormona, cofactores enzimáticos y enzimas,
inhibidores enzimáticos y enzimas, y similares. Además, los pares
de unión específicos pueden incluir miembros que son análogos del
miembro de unión específico original. Por ejemplo, un derivado o
fragmento del analito, es decir, un análogo del analito, se puede
utilizar a condición de que tenga al menos un epítopo en común con
el analito.
Los miembros de unión específicos se pueden unir
generalmente a las sondas utilizando cualquiera de una serie de
técnicas bien conocidas. Por ejemplo, la unión covalente de los
miembros de unión específicos a las sondas (por ejemplo,
micropartículas) se puede realizar utilizando grupos carboxílico,
amino, aldehído, bromoacetilo, yodoacetilo, tiol, epoxi y otros
grupos funcionales reactivos o de unión, así como radicales libres
residuales y cationes radicales, a través de los cuales se puede
realizar una reacción de acoplamiento a la proteína. También se
puede incorporar un grupo funcional de superficie como un comonómero
funcionalizado porque la superficie de la micropartícula puede
contener una concentración de grupos polares de superficie
relativamente elevada. Además, aunque las sondas de micropartículas
se funcionalizan a menudo después de la síntesis, en algunos casos,
tales como el poli(tiofenol), las micropartículas son capaces
de unirse covalentemente de manera directa con una proteína sin que
se necesite ninguna modificación más. Por ejemplo, en relación con
la figura 2, se ilustra una realización de la presente invención
para conjugar covalentemente una sonda. Tal y como se muestra, la
primera etapa de la conjugación es la activación de los grupos
carboxílicos sobre la superficie de la sonda utilizando
carbodiimida. En la segunda etapa, los grupos de ácido carboxílico
activados se hacen reaccionar con un grupo amino de un anticuerpo
para formar un enlace amida. La activación y/o el acoplamiento del
anticuerpo se puede producir en un tampón, tal como una disolución
salina tamponada con fosfato (PBS) (por ejemplo, pH de 7,2) o ácido
2-(N-morfolino)etano-sulfónico
(MES) (por ejemplo, pH de 5,3). Tal y como se muestra, las sondas
resultantes se pueden bloquear a continuación con etanolamina, por
ejemplo, para formar el conjugado de la sonda. Además de la unión
covalente, también se pueden utilizar en la presente invención otras
técnicas de acoplamiento, tales como la absorción física.
En relación de nuevo con la figura 1, el
dispositivo (20) también contiene la zona de detección/calibración
(31). La zona de detección/calibración (31) generalmente proporciona
una única región de detección/calibración diferenciada (por
ejemplo, línea, punto, etc.) de tal forma que un usuario puede
determinar con exactitud la concentración de un analito particular
dentro de una muestra a analizar en una localización a lo largo del
dispositivo. Por ejemplo, en la realización ilustrada, se utiliza
una única línea.
Además, la línea se puede disponer en una
dirección que es sustancialmente perpendicular al flujo de la
muestra a analizar a través del dispositivo (20). Asimismo, en
algunas realizaciones, la línea se puede disponer en una dirección
que es sustancialmente paralela al flujo de la muestra a analizar a
través del dispositivo (20).
La zona de detección/calibración (31) contiene
uno o más reactivos de captura polielectrolíticos inmovilizados que
son capaces de unirse a las sondas, tanto directa como
indirectamente (es decir, a un miembro de unión específico
conjugado con la sonda, a un analito que ha formado complejo con la
sonda, etc.). En algunas realizaciones, un primer reactivo de
captura inmovilizado se configura para que se una a las sondas de
detección, mientras que un segundo reactivo de captura se configura
para que se una a las sondas de calibración. El primer y el segundo
reactivos de captura inmovilizados pueden ser iguales o
diferentes.
Hablando en términos generales, se pueden
inmovilizar varios tipos de reactivos de captura dentro de la zona
de detección/calibración (31). Por ejemplo, en una realización, el
reactivo de captura puede ser idéntico a, o formarse a partir de,
la misma clase o categoría de materiales (por ejemplo, anticuerpos,
antígenos, análogos de los mismos y similares) como los miembros de
unión específicos utilizados para formar los conjugados de las
sondas. Así, en esta realización, el reactivo de captura puede
actuar como un sitio de unión estático para las sondas cuando se
unen a un analito. Específicamente, el analito, tal como un
anticuerpo, antígeno, etc., puede tener dos sitios de unión. Al
alcanzar la zona de detección/calibración (31) y pasar a través de
la almohadilla de conjugado (22), uno de estos sitios de unión es
ocupado por el miembro de unión específico conjugado a la sonda.
Sin embargo, el sitio de unión libre del analito se puede unir al
reactivo de captura inmovilizado.
En otra realización, el reactivo de captura
polielectrolítico inmovilizado puede ser un polielectrólito que se
une a las sondas, directa o indirectamente, mediante una interacción
iónica. Por ejemplo, el polielectrólito puede tener una carga
positiva o negativa neta, así como una carga neta que generalmente
es neutra. Algunos ejemplos adecuados de polielectrólitos que
tienen una carga positiva neta incluyen, pero sin limitarse a ellos,
polilisina (disponible comercialmente de
Sigma-Aldrich Chemical Co., Inc. de St. Louis,
Missouri), polietilenimina; poliaminas y/o poliamidoaminas
funcionalizadas con epiclorohidrina, tales como
poli(dimetilamina-co-epiclorohidrina);
cloruro de polidialildimetil-amonio; derivados
catiónicos de la celulosa, tales como los copolímeros de celulosa o
los derivados de celulosa injertados con un monómero hidrosoluble de
amonio cuaternario; y similares. En una realización particular, se
pueden utilizar CelQuat® SC-230M o
H-100 (disponibles de National Starch &
Chemical, Inc.), que son derivados celulósicos que contienen un
monómero hidrosoluble de amonio cuaternario. Aún más, algunos
ejemplos adecuados de polielectrólitos que tienen una carga negativa
neta incluyen, pero sin limitarse a ellos, ácidos poliacrílicos,
tales como el poli(sal sódica del ácido
etileno-co-metacrílico) y
similares. También se debe comprender que se pueden utilizar también
otros polielectrólitos en la presente invención, tales como
polielectrólitos anfipáticos (es decir, que tienen partes polares y
apolares). Por ejemplo, algunos ejemplos de polielectrólitos
anfipáticos adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos,
poli(yoduro de
estiril-b-N-metil-2-vinil-piridinio)
y poli(ácido estiril-b-acrílico),
ambos disponibles de Polymer Source, Inc. de Dorval, Canadá.
Aunque en general se puede utilizar cualquier
polielectrólito, el polielectrólito seleccionado para una aplicación
particular puede variar según la naturaleza de las sondas, los
miembros de unión específicos, el analito de interés, el tipo de
membrana porosa y similares. En particular, la carga distribuida de
un polielectrólito le permite unirse a sustancias que tienen una
carga opuesta. Así, por ejemplo, los polielectrólitos que tienen
una carga positiva neta a menudo están mejor equipados para unirse
con las sondas que están cargadas negativamente, mientras que los
polielectrólitos que tienen una carga negativa neta a menudo están
mejor equipados para unirse a las sondas que están cargadas
positivamente. Así, en tales casos, la interacción iónica entre
estas moléculas permite que se produzca la unión requerida dentro
de la zona de detección/calibración (31). No obstante, aunque la
interacción iónica se utiliza principalmente para lograr la unión
deseada, los polielectrólitos también se pueden unir con las sondas
que tienen una carga similar.
Ya que el polielectrólito está diseñado para
unirse a las sondas, normalmente se desea que el polielectrólito
esté inmovilizado sustancialmente de forma no difusiva por la
superficie de la membrana porosa (23). Así, los polielectrólitos se
pueden aplicar a la membrana porosa (23) de tal forma que los
polielectrólitos no difundan sustancialmente a la matriz de la
membrana porosa (23). En particular, los polielectrólitos forman
típicamente un enlace iónico y/o covalente con los grupos
funcionales presentes en la superficie de la membrana porosa (23)
de tal forma que permanecen inmovilizados en ella. Aunque no es
necesaria, la formación de enlaces covalentes entre el
polielectrólito y la membrana porosa (23) puede ser deseable para
inmovilizar de forma más permanente el polielectrólito en
ella.
ella.
Por ejemplo, en una realización, los monómeros
utilizados para formar el polielectrólito se forman primero en una
disolución y a continuación se aplican directamente a la membrana
porosa (23). Se pueden utilizar varios disolventes (por ejemplo,
disolventes orgánicos, agua, etc.) para formar la disolución. Una
vez aplicados, se inicia la polimerización de los monómeros
utilizando calor, radiación de haces de electrones, polimerización
de radicales libres y similares. En algunos casos, a medida que se
polimerizan los monómeros, éstos forman enlaces covalentes con
algunos grupos funcionales de la membrana porosa (23), por lo que se
inmoviliza en ella el polielectrólito resultante. Por ejemplo, en
una realización, un monómero de etilenoimina puede formar un enlace
covalente con un grupo carboxilo presente en la superficie de
algunas membranas porosas (por ejemplo, nitrocelulosa).
En otra realización, el polielectrólito se puede
formar antes de la aplicación a la membrana porosa (23). Si se
desea, el polielectrólito se puede formar primero en una disolución
utilizando disolventes orgánicos, agua y similares. Después, se
aplica la disolución polielectrolítica directamente a la membrana
porosa (23) y, luego, se seca. Una vez seca, el polielectrólito
puede, como se describió anteriormente, formar un enlace iónico con
algunos grupos funcionales presentes en la superficie de la membrana
porosa (23) que tienen una carga contraria al polielectrólito. Por
ejemplo, en una realización, la polietilenoimina cargada
positivamente puede formar un enlace iónico con grupos carboxilo
cargados negativamente en la superficie de algunas membranas
porosas (por ejemplo, nitrocelulosa).
Además, el polielectrólito también se puede
entrecruzar con la membrana porosa (23) utilizando varias técnicas
bien conocidas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las
poliaminas y/o poliamidoaminas funcionalizadas con epiclorohidrina
se pueden utilizar como un polielectrólito cargado positivamente
entrecruzable. Ejemplos de estas sustancias se describen en las
patentes de los EE.UU. n.º 3.700.623 de Keim; n.º 3.772.076 de Keim;
y n.º 4.537.657 de Keim, y se cree que son vendidos por Hercules,
Inc., Wilmington, Del. bajo la marca Kymene^{TM}. Por ejemplo,
Kymene^{TM} 450 y 2064 son compuestos de poliamina y/o de
poliamidoamina funcionalizada con epiclorohidrina que contienen
algunos anillos de epóxido y grupos de amonio cuaternarios que
pueden formar enlaces covalentes con los grupos carboxilo presentes
en algunos tipos de membranas porosas (por ejemplo, nitrocelulosa)
y entrecruzarse con el esqueleto de polímeros de la membrana porosa
cuando se tratan. En algunas realizaciones, la temperatura de
entrecruzamiento puede oscilar de unos 50ºC a unos 120ºC y el tiempo
de entrecruzamiento puede oscilar de unos 10 a unos 600
segundos.
Aunque se han descrito anteriormente diferentes
técnicas para inmovilizar polielectrólitos de manera que no
difundan por la membrana porosa (23), se debe entender que se puede
utilizar en la presente invención cualquier otra técnica para
inmovilizar compuestos polielectrolíticos, de manera que no
difundan. De hecho, los métodos antes mencionados sólo pretenden
ser ejemplos de las técnicas que se pueden utilizar en la presente
invención. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se pueden añadir
algunos compuestos a la disolución de polielectrólitos que pueden
inhibir sustancialmente la difusión de tales polielectrólitos en la
matriz de la membrana porosa (23).
En general, se pueden construir diferentes
dispositivos de ensayos de flujo continuo de acuerdo con la presente
invención. En este sentido, a continuación se describirán varias
realizaciones de la presente invención con más detalle. Sin
embargo, se debe entender que las realizaciones explicadas a
continuación son sólo ejemplares, y que la presente invención
también contempla otras realizaciones. Por ejemplo, en relación con
la figura 3, se muestra una realización particular en la que se
utilizan sondas (41) para la detección y sondas (43) para la
calibración. En esta realización, se aplican las sondas de detección
(41) a la almohadilla de conjugado (22) y, así, son capaces de
fluir a través del dispositivo (20) (tal como se indica mediante la
flecha direccional -L-) cuando se colocan en comunicación con la
muestra a analizar. Las sondas de detección (41) se conjugan con un
miembro de unión específico (90) para un analito (A) de forma que,
al entrar en contacto con el analito (A), las sondas (41) se unen a
éste para formar los complejos analito/sonda (49). A continuación,
los complejos analito/sonda (49) pueden fluir a través del
dispositivo (20) hasta que alcanzan la zona de detección/calibración
(31).
Dentro de la zona de detección/calibración (31)
está inmovilizado un reactivo de captura polielectrolítico (no
mostrado) para que se una a las sondas de calibración (43) mediante
una interacción iónica. En esta realización, las sondas de
calibración (43) se inmovilizan sobre el polielectrólito antes de
aplicar la muestra a analizar. Las sondas de calibración (43)
pueden incluir, por ejemplo, micropartículas de látex conjugadas con
un miembro de unión específico (91) (por ejemplo, anticuerpo,
antígeno, etc.). En la zona de detección/calibración (31), los
complejos analito/sonda (49) se pueden unir al miembro de unión
específico (91) de las sondas de calibración (43) para formar un
complejo sandwich (50). Cualquier sonda sin unir (41) fluirá a
través de la zona de detección/calibración (31). Si se desea, se
puede predeterminar la cantidad del reactivo de captura
polielectrolítico, de forma que la señal de calibración dentro de
la zona de detección/calibración (31) alcance todo su potencial
predeterminado para la intensidad de señal. Es decir, se
predetermina la cantidad de las sondas (43) que se depositan porque
la cantidad de polielectrólito empleado se ajusta a un nivel
predeterminado y conocido.
Una vez que se deja desarrollar completamente,
se puede utilizar el nivel de intensidad de las sondas (43) para
calibrar el nivel de intensidad de las sondas (41) en la zona de
detección/calibración (31) para determinar la cantidad del analito
presente en la muestra a analizar. Esta etapa de calibración se
puede producir visualmente, con ayuda de un dispositivo de lectura,
o utilizando otras técnicas. Por ejemplo, en una realización, se
pueden marcar las sondas (41) y (43) con compuestos fluorescentes
de tal forma que la intensidad de señal de las sondas (41) y (43)
se puede medir utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, en
una realización, las sondas (41) y (43) se pueden excitar con la
misma fuente externa. En esta realización, la fuente suministra
radiación a una longitud de onda de excitación, lo que provoca que
las sondas (41) emitan luz a una longitud de onda que es diferente
de la longitud de onda emitida por las sondas (43). Esto permite que
se pueda medir por separado la presencia de las sondas (41) y (43).
Alternativamente, las sondas (41) y (43) también se pueden medir
por separado utilizando fuentes externas distintas.
Hablando en términos generales, la fluorescencia
es el resultado de un procedimiento de tres etapas que se produce
en ciertos compuestos fluorescentes. En la primera etapa, se
suministra energía mediante una fuente externa, tal como una
lámpara incandescente o un láser, y es absorbida por el compuesto
fluorescente, lo que crea un estado excitado de singlete
electrónico. En la segunda etapa, el estado excitado perdura durante
un tiempo finito a lo largo del cual el compuesto fluorescente
sufre cambios conformacionales y también una multitud de
interacciones posibles con su entorno molecular. A lo largo de este
tiempo, la energía del estado excitado se disipa parcialmente, lo
que produce un estado relajado desde el que se origina la emisión de
la fluorescencia. La tercera etapa es la etapa de emisión de
fluorescencia, en la que se emite energía, lo que devuelve el
compuesto fluorescente a su estado basal. La energía emitida es
menor que su energía de excitación (luz o láser) y, por lo tanto,
de una longitud de onda mayor. Este cambio o diferencia en la
energía o longitud de onda permite que se detecte la energía de
emisión y que se aísle de la energía de excitación.
La detección de la fluorescencia generalmente
utiliza la filtración de la longitud de onda para aislar los
fotones de emisión de los fotones de excitación, y un detector que
registra los fotones de emisión y produce una lectura registrable,
normalmente como una señal eléctrica o una imagen fotográfica. En
general, hay cuatro tipos de detectores reconocidos:
espectrofluorímetros y lectores de microplacas; microscopios de
fluorescencia; escáneres de fluorescencia; y citómetros de flujo.
Un detector de fluorescencia adecuado para utilizarse con la
presente invención es un espectrofluorímetro FluoroLog III, que
vende SPEX Industries, Inc., de Edison, New Jersey.
Aunque no son necesarios, los criterios de
selección de pares de sondas de detección y calibración
particularmente deseados incluyen: 1) poco o ningún solapamiento
espectral de los espectros de absorción o los espectros de
fluorescencia, por lo que se pueden medir por separado las
intensidades de emisión; 2) ninguna transferencia de energía
fluorescente significativa entre las sondas de detección y de
calibración cuando se acercan mucho, de tal forma que emitan de
forma independiente, y 3) una longitud de onda de emisión
relativamente larga (por ejemplo, mayor de unos 600 nm) de tal
forma que la autofluorescencia de los líquidos biológicos tenga un
efecto mínimo sobre la medición de la fluorescencia.
Además, si se desea, también se puede utilizar
en la presente invención una técnica conocida como "detección de
la fluorescencia resuelta en el tiempo". La detección de la
fluorescencia resuelta en el tiempo se diseña para reducir las
señales de fondo desde la fuente de emisión o desde procedimientos
de dispersión (que son el resultado de dispersar la radiación de la
excitación) aprovechando las características de fluorescencia de
ciertas sustancias fluorescentes, tales como quelatos lantánidos de
europio [Eu(III)] y terbio [Tb (III)]. Tales quelatos pueden
mostrar una emisión de larga vida, de banda estrecha y virada al
rojo después de la excitación del quelato a longitudes de ondas
sustancialmente más cortas. Normalmente, el quelato posee una banda
de absorción ultravioleta fuerte debido a un cromóforo localizado
cerca del lantánido de la molécula.
Después de la absorción de luz por el cromóforo,
se puede transferir la energía de excitación desde el cromóforo
excitado al lantánido. A esto le sigue una emisión fluorescente
característica del lantánido. El uso de una excitación pulsada y
una detección puntual, combinadas con filtros de emisión de banda
estrecha, permite la detección específica de la fluorescencia sólo
del quelato de lantánido, rechazando la emisión de otras especies
presentes en la muestra que normalmente son de vida más corta o que
tienen una longitud de onda de emisión más corta. Otras técnicas
resueltas en el tiempo para medir la fluorescencia se describen en
las patentes de los EE.UU. n.º 5.585.279 de Davidson y n.º
5.637.509 de Hemmila y otros.
Con independencia de la técnica utilizada para
medir la intensidad de señal de las sondas (41) y (43), se ha
descubierto que el uso de una sola zona de detección/calibración
(31) puede permitir que se midan las sondas de detección y de
calibración (41) y (43) en la misma localización del dispositivo
(20). Este método de "una sola localización para la medición"
proporciona un enfoque sencillo y atractivo para los usuarios del
dispositivo de ensayos, particularmente los destinados a
aplicaciones ambulatorias o de laboratorio.
En la zona de detección/calibración (31) se
puede averiguar la cantidad del analito a partir de la intensidad
de la señal de las sondas de detección (41) que es calibrada por la
intensidad de la señal de las sondas de calibración (43).
Específicamente, se predetermina y se conoce la cantidad total de
las sondas (43) y, por lo tanto, se puede utilizar para propósitos
de calibración. Así, la cantidad del analito en la muestra a
analizar es directamente proporcional a I_{s} (intensidad de la
señal de las sondas -41-), mientras que la intensidad de la señal
de las sondas (43), I_{c}, debe permanecer relativamente constante
con independencia de la presencia del analito. Basándose en el
intervalo de intensidad en el que cae este valor calibrado, se puede
determinar el intervalo de concentración general para el analito.
Como resultado, se puede realizar la calibración y el ensayos de la
muestra en aproximadamente las mismas condiciones y al mismo tiempo,
lo que proporciona unos resultados cuantitativos y
semicuantitativos fiables, con un aumento de la sensibilidad.
Si se desea, la proporción de I_{s} respecto a
I_{c} se puede representar en una gráfica frente a la
concentración del analito para un intervalo de concentraciones de
analito conocidas para generar una curva de calibración. Para
determinar la cantidad de analito en una muestra a analizar
desconocida, la proporción de la señal se puede convertir entonces
en la concentración del analito de acuerdo con la curva de
calibración. Se debe señalar que se pueden representar gráficamente
relaciones matemáticas alternativas entre I_{s} e I_{c} frente
a la concentración del analito para generar la curva de calibración.
Por ejemplo, en una realización, se puede representar gráficamente
el valor de I_{s}/(I_{s}+I_{c}) frente a la concentración de
analito para generar la curva de calibración.
En relación con la figura 4, se muestra otra
realización en la que se utilizan sondas (41) para la detección y
sondas (43) para la calibración. Se aplican las sondas de detección
(41) a la almohadilla de conjugado (22) y son capaces de fluir a
través del dispositivo (20) (como se indica mediante la flecha
direccional -L-) cuando se colocan en comunicación con la muestra a
analizar. Las sondas de detección (41) se conjugan con un miembro
de unión específico (90) para un analito (A) de forma que, una vez
en contacto con el analito (A), las sondas (41) se unen a éste para
formar los complejos analito/sonda (49). A continuación, los
complejos analito/sonda (49) pueden fluir a través del dispositivo
(20) hasta que alcanzan la zona de detección/calibración (31). Las
sondas de calibración (43) están inmovilizadas dentro de la zona de
detección (31) mediante un reactivo de captura polielectrolítico.
Por ejemplo, las sondas de calibración (43) pueden incluir
micropartículas marcadas, polímeros o moléculas que se unen al
polielectrólito mediante una interacción iónica. Además, un miembro
de unión específico (91) (por ejemplo, anticuerpo, antígeno, etc.)
también se inmoviliza por separado dentro de la zona de
detección/calibración (31). Basándose en la naturaleza de las sondas
de detección (41), ni los complejos (49) ni las sondas sin unir
(41) se unen al reactivo de captura polielectrolítico. En cambio,
los complejos analito/sonda (49) se unen al miembro de unión
específico (91) para formar los complejos (50) y cualquier sonda
que no se une (41) fluye a través de la zona de
detección/calibración (31). Una vez que se deja desarrollar
completamente, la señal de intensidad I_{S} de las sondas (41) en
la zona de detección/calibración (31) se pueden determinar para
calcular la cantidad de analito presente en la muestra a analizar.
En esta realización, la cantidad del analito en la muestra a
analizar es directamente proporcional a I_{s}. Además, la señal
de intensidad I_{c} de las sondas de calibración (43) también se
puede utilizar para calibrar I_{s}. Por ejemplo, se puede
representar gráficamente la proporción de I_{S} respecto a I_{C}
frente a la concentración de analito para un intervalo de
concentraciones de analito conocidas para generar una curva de
calibración.
En relación con la figura 5, se muestra otra
realización más en la que se utilizan las sondas (41) para la
detección y las sondas (43) para la calibración. Se aplican las
sondas de detección (41) y las sondas de calibración (43) a la
almohadilla de conjugado (22) y, así, son capaces de fluir a través
del dispositivo (20) (como se indica mediante una flecha
direccional -L-) cuando se ponen en comunicación con la muestra a
analizar. Las sondas de detección (41) se conjugan con un miembro
de unión específico (90) para un analito (A) de forma que, al
entrar en contacto con el analito (A), las sondas (41) se unen a
éste para formar los complejos analito/sonda (49). A continuación,
los complejos analito/sonda (49) pueden fluir a través del
dispositivo (20) hasta que alcanzan la zona de
detección/calibración (31). Se inmoviliza un polielectrólito dentro
de la zona de detección/calibración (31) para la unión selectiva
con las sondas de calibración (43) (por ejemplo, micropartículas,
polímeros o moléculas marcadas) mediante una interacción iónica.
Específicamente, las sondas (43) pueden tener un tamaño más pequeño
que las sondas (41) de forma que llegan a la zona de
detección/calibración (31) antes que las sondas (41) y ocupan todos
los sitios de unión proporcionados por el polielectrólito.
Alternativamente, las cargas de las sondas (41)
y (43) pueden ser tales que sólo las sondas (43) se unan al
polielectrólito. En cualquier caso, un miembro de unión específico
(91) (por ejemplo, anticuerpo, antígeno, etc.) también está
inmovilizado por separado dentro de la zona de detección/calibración
(31). En la zona de detección/calibración (31), los complejos
analito/sonda (49) se pueden unir al miembro de unión específico
(91) para formar los complejos (50). Cualquier sonda sin unir (41)
fluirá a través de la zona de detección/calibración (31). Una vez
que se deja desarrollar totalmente, se puede determinar la señal de
intensidad I_{S} de las sondas (41) en la zona de
detección/calibración (31) para calcular la cantidad de analito
presente en la muestra a analizar. En esta realización, la cantidad
del analito en la muestra a analizar es directamente proporcional a
I_{S}. Además, la señal de intensidad I_{C} de las sondas de
calibración (43) también se puede utilizar para calibrar I_{S}.
Por ejemplo, se puede representar gráficamente la proporción de
I_{S} respecto a I_{C} frente a la concentración de analito
para un intervalo de concentraciones de analito conocidas para
generar una curva de calibración.
\newpage
En algunas realizaciones, el dispositivo (20)
puede contener zonas adicionales que facilitan la detección del
analito de interés. Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 6,
el dispositivo (20) puede contener una zona de captura (33) que
está colocada antes de la zona de detección/calibración (31). La
zona de captura (33) contiene un primer reactivo de captura que es
específico para las sondas de detección o de calibración. Por
ejemplo, en la realización ilustrada, las sondas de detección (41)
se aplican a la almohadilla de conjugado (22) y, así, son capaces
de fluir a través del dispositivo (20) cuando se pone en
comunicación con la muestra a analizar. Las sondas de detección
(41) se pueden conjugar con un miembro de unión específico (90) para
un analito (A) de forma que, durante el contacto con el analito
(A), las sondas (41) se unen a éste para formar complejos
analito/sonda (49). A continuación, los complejos analito/sonda (49)
pueden fluir a través del dispositivo (20) hasta que alcanzan la
zona de captura (33). Miembros de unión específicos (91), tales como
un anticuerpo o un antígeno que corresponde al analito (A), están
inmovilizados dentro de la zona de captura (33). Así, en la zona de
captura (33), los complejos analito/sonda (49) pueden unirse a
miembros de unión específicos (91) inmovilizados en éstos para
formar los complejos (50).
Cualquier sonda sin unir (41) fluirá entonces
hasta la zona de detección/calibración (31). En esta realización,
también está inmovilizado un segundo reactivo de captura (por
ejemplo, polielectrólito) dentro de la zona de
detección/calibración (31) que es capaz de unirse a cualquier sonda
sin unir (41) mediante una interacción iónica. Además, también se
pueden inmovilizar las sondas de calibración (43) en el segundo
reactivo de captura dentro de la zona de detección/calibración
(31). Por ejemplo, las sondas de calibración (43) pueden incluir
micropartículas de látex que también se unen al polielectrólito
mediante interacciones iónicas.
Una vez que se deja desarrollar completamente,
se puede determinar la señal de intensidad I_{S} de las sondas
(41) en la zona de detección/calibración (31) para calcular la
cantidad de analito presente en la muestra a analizar. En esta
realización, la cantidad de analito en la muestra a analizar es
inversamente proporcional a I_{S}. Además, la señal de intensidad
I_{C} de las sondas de calibración (43) también se puede utilizar
para calibrar I_{S}. Por ejemplo, se puede representar
gráficamente la proporción de I_{S} respecto a I_{C} frente a
la concentración de analito para un intervalo de concentraciones de
analito conocidas para generar una curva de calibración. Para
determinar la cantidad de analito en una muestra a analizar
desconocida, se puede convertir entonces la proporción de la señal
en una concentración de analito de acuerdo con la curva de
calibración. Se debe señalar que se pueden representar gráficamente
relaciones matemáticas alternativas entre I_{C} e I_{S} frente
a la concentración de analito para generar la curva de
calibración.
Aunque se han descrito anteriormente diferentes
realizaciones de configuraciones de ensayos, se debe entender que
un ensayo de la presente invención puede tener en general cualquier
configuración deseada, y que no necesita contener todos los
componentes descritos anteriormente. Además, también se pueden
utilizar en la presente invención otros componentes de ensayo bien
conocidos a los que no se hace referencia específicamente en la
presente memoria. Por ejemplo, se describen varias configuraciones
de ensayo en las patentes de EE.UU. n.º 5.395.754 de Lambotte y
otros, n.º 5.670.381 de Jou y otros, y n.º 6.194.220 de Malick y
otros. Además, también se debe entender que se pueden formar
también ensayos competitivos de acuerdo con la presente invención.
Las técnicas y las configuraciones de los ensayos competitivos son
bien conocidas por los expertos en la técnica.
Como ejemplo, el dispositivo de flujo continuo
(20) descrito más anteriormente e ilustrado en la figura 3 se puede
modificar fácilmente para formar un ensayo competitivo. En esta
realización, las sondas de detección (41) pueden ser un analito o
análogo de analito, mientras que las sondas de calibración (43)
pueden incluir, por ejemplo, micropartículas de látex conjugadas
con un miembro de unión específico para el analito de interés.
Cuando se aplica la muestra a analizar, las sondas de detección (41)
atraviesan la membrana porosa (23) hasta que alcanzan la zona de
detección/calibración (31). En la zona (31), las sondas de detección
(41) y cualquier analito (A) dentro de la muestra a analizar
compiten por los miembros de unión específicos (91) (por ejemplo,
anticuerpo, antígeno, etc.). Cualquier sonda sin unir (41) fluirá a
través de la zona de detección/calibración (31). En esta
realización, la cantidad de analito en la muestra a analizar es
inversamente proporcional a I_{S} (intensidad de la señal de las
sondas -41-). Si se desea, la proporción de I_{S} respecto a
I_{C} (intensidad de la señal de las sondas -43-) se puede
representar gráficamente frente a la concentración de analito en un
intervalo de concentraciones de analito conocidas para generar una
curva de calibración.
La presente invención se comprenderá mejor con
referencia a los ejemplos siguientes.
Se demostró la capacidad que tiene una zona de
detección/calibración interna de la presente invención para
calibrar un ensayos en sandwich. Inicialmente, las muestras de
membrana porosa HF120 se laminaron sobre las correspondientes
tarjetas de soporte que tienen una longitud de aproximadamente 30
cm. Las perlas fluorescentes (sondas de calibración) se obtuvieron
de Molecular Probes, Inc. y tenían un tamaño de partícula de 0,2
\mum y unas longitudes de onda de excitación/emisión de 505/515
nm. Se lavaron las perlas y se guardaron en tampón de
almacenamiento a un porcentaje en peso del 0,28%. Se mezclaron 40
\mul de la disolución de perlas fluorescentes con 10 \mul de
una disolución de polilisina y se depositaron en forma de tiras
sobre la membrana para formar una línea de detección/calibración.
El anticuerpo monoclonal CRP Mab 5804 que tenía una concentración de
2,36 mg/ml (obtenido de Biogenesis, Inc.) se inmovilizó sobre las
muestras de membrana porosa para formar una línea de captura. A
continuación, se secaron las muestras de la membrana durante 1 hora
a una temperatura de 37ºC. Se acopló una almohadilla de mechas de
fibra celulósica (Millipore Co.) a un extremo de la membrana y se
cortó en tiras de 4 mm.
Las muestras de medias tiras se colocaron en
diferentes micropocillos que contenían mezclas de perlas
fluorescentes (sondas de detección) y diferentes concentraciones
del antígeno CRP. La cantidad de las perlas fluorescentes era la
misma para cada mezcla, es decir, 4 \mug. Se formaron las perlas
fluorescentes de detección como se explica a continuación.
Inicialmente, se proporcionaron perlas de poliestireno que tienen
grupos funcionales carboxilo (obtenidos de Molecular Probes, Inc.).
Las perlas tenían un tamaño de partícula de 0,5 \mum y unas
longitudes de onda de excitación/emisión de 580/605 nm. Se lavaron
dos veces 100 \mul de las perlas de poliestireno (concentración
al 2%) con tampón MES y se separaron con una centrifugadora. Las
perlas sedimentadas se volvieron a suspender en 100 \mul de
tampón MES y se mezclaron con 50 \mul de tampón MES que tienen 4
mg de carbodiimida (de Polysciences, Inc.). Se hizo reaccionar la
mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos en un agitador. A
continuación, se lavaron las perlas activadas dos veces con un
tampón de borato. Se volvieron a suspender las perlas activadas en
200 \mul de tampón de borato y se mezclaron con 15 \mul de un
anticuerpo monoclonal de la proteína C reactiva (CRP Mab 5811 de
Biogenesis, Inc.) que tiene una concentración de 6,4 mg/ml. Se dejó
transcurrir la reacción durante una noche en un agitador a
temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de reacción
resultante se mezcló con 100 \mul de etanolamina durante 15
minutos con un agitador. Se desechó la disolución sobrenadante y se
lavaron las perlas dos veces con un tampón PBS y se guardaron a 4ºC
en un tampón de almacenamiento que contenía PBS a 0,1 M, NaCl a 0,15
M, BSA al 1%, glicerol al 5% y NaN_{3} al 0,1% para dar lugar a
perlas conjugadas de una concentración de 4 mg/ml.
A continuación, se midió la intensidad
fluorescente en la línea de detección/calibración utilizando un
espectrofluorímetro Fluorolog III (SPEX Industries, Inc., Edison,
NJ) con un modo de ángulo recto. Los resultados se muestran en la
tabla 1, donde I_{S} representa la intensidad de señal de las
sondas de detección en la línea de detección/calibración, e I_{C}
representa la intensidad de señal de las sondas de calibración en la
línea de detección/calibración.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como se pone de manifiesto a partir de los
resultados anteriores, cuando no había ningún analito presente en
la muestra, las sondas de detección en movimiento pasaron la línea
de captura y fueron capturadas sobre la línea de
detección/calibración. Cuando el analito estaba presente en la
muestra, las sondas de detección se acomplejaron con el analito y
se capturaron sobre la línea de captura, sin que ninguna sonda de
detección restante se capturara en la línea de
detección/calibración. Por lo tanto, la intensidad de las sondas de
detección (I_{S}) sobre la línea de detección/calibración fue
inversamente proporcional a la concentración de analito, mientras
que la intensidad (I_{C}) de las sondas de calibración en la línea
de detección/calibración permaneció relativamente constante para
las diferentes concentraciones de analitos, es decir,
aproximadamente 444 \pm 27. Se cree que las variaciones de la
I_{C} se deben a las distintas condiciones medioambientales del
ensayo y a la inestabilidad instrumental. Sin embargo, se espera
que la variación haya tenido un efecto similar sobre I_{S}. Por
lo tanto, se cree que I_{S}/I_{C} proporcionará un resultado más
exacto en este ejemplo.
Se demostró la capacidad de que una zona de
detección/calibración interna de la presente invención calibre un
ensayo de sandwich. Inicialmente, las muestras de membrana porosa HF
120 se extendieron sobre las correspondientes tarjetas de soporte
que tienen una longitud de aproximadamente 30 cm. A continuación, se
formaron polímeros fluorescentes (sondas de calibración) de la
siguiente forma. Inicialmente, se disolvieron 0,5 g de ácido
poliacrílico
(MW = 450.000, D.P. = 6250) en 20 ml de metanol. A la disolución, se le añadieron 3,8 mg de diciclohexilcarbodiimida (DCC) en 1 ml de metanol para activar el polímero de ácido poliacrílico. Se agitó la disolución resultante durante 30 minutos. Se fabricó una disolución de colorante fluorescente disolviendo 10 mg de 5-(y 6-)-((N-(5-aminopentil)amino)-carbonil)tetrametilrodamina (longitudes de onda de excitación/emisión de 544/590 nm, Molecular Probes, Inc.) en 1 ml de una disolución de metanol. Se añadió la disolución del colorante a la disolución del ácido poliacrílico activado y se agitó. Se continuó la reacción durante 24 horas a temperatura ambiente con la disolución envuelta en papel de aluminio. Después de parar la reacción, se añadió dietiléter para formar un precipitado. Se centrifugó el precipitado y se embebió en etanol para retirar cualquier colorante fluorescente sin reaccionar. Después de retirar la disolución de etanol, se secó al aire el gel rojo residual.
(MW = 450.000, D.P. = 6250) en 20 ml de metanol. A la disolución, se le añadieron 3,8 mg de diciclohexilcarbodiimida (DCC) en 1 ml de metanol para activar el polímero de ácido poliacrílico. Se agitó la disolución resultante durante 30 minutos. Se fabricó una disolución de colorante fluorescente disolviendo 10 mg de 5-(y 6-)-((N-(5-aminopentil)amino)-carbonil)tetrametilrodamina (longitudes de onda de excitación/emisión de 544/590 nm, Molecular Probes, Inc.) en 1 ml de una disolución de metanol. Se añadió la disolución del colorante a la disolución del ácido poliacrílico activado y se agitó. Se continuó la reacción durante 24 horas a temperatura ambiente con la disolución envuelta en papel de aluminio. Después de parar la reacción, se añadió dietiléter para formar un precipitado. Se centrifugó el precipitado y se embebió en etanol para retirar cualquier colorante fluorescente sin reaccionar. Después de retirar la disolución de etanol, se secó al aire el gel rojo residual.
Después, los polímeros fluorescentes (sondas de
calibración) descritos anteriormente se disolvieron en agua y se
mezclaron con CelQuat® 100-H (un derivado
polielectrolítico celulósico disponible de National Starch &
Chemical, Inc.). Esta mezcla se depositó en tiras sobre la membrana
para formar una línea de detección/calibración. El anticuerpo
monoclonal CRP Mab 5811 que tiene una concentración de 6,4 mg/ml
(obtenido de Biogenesis, Inc.) se inmovilizó sobre las muestras de
la membrana porosa para formar una línea de captura. A continuación,
se secaron las muestras de la membrana durante 1 hora a una
temperatura de 37ºC. Se acopló una almohadilla de mechas de fibra
celulósica (Millipore Co.) a un extremo de la membrana y se cortó en
tiras de 4 mm.
Las muestras de medias tiras se colocaron sobre
distintos micropocillos que contenían mezclas de perlas
fluorescentes (sondas de detección) y diferentes concentraciones
del antígeno CRP. La cantidad de las perlas fluorescentes (sondas
de detección) era la misma para cada mezcla, es decir, 4 \mug. Se
formaron las perlas fluorescentes (sondas de detección) como se
describe a continuación. Inicialmente, se proporcionaron perlas de
poliestireno que tenían grupos funcionales carboxilo (obtenidos de
Molecular Probes, Inc.). Las perlas tenían un tamaño de partícula
de 0,2 \mum y unas longitudes de onda de excitación/emisión de
505/515 nm. Cien microlitros de las perlas de poliestireno
(concentración del 2%) se lavaron dos veces con tampón MES y se
separaron con una microcentrifugadora. Se volvieron a suspender las
perlas sedimentadas en 200 \mul de tampón MES y se mezclaron con
20 \mul de tampón MES que contenía 4,8 mg de carbodiimida (de
Polysciences, Inc.). Se hizo reaccionar la mezcla a temperatura
ambiente durante 20 minutos en un agitador. A continuación, se
lavaron las perlas activadas dos veces con un tampón de borato. Se
resuspendieron las perlas activadas en 200 \mul de tampón borato
y se mezclaron con 90 \mul de un anticuerpo monoclonal contra la
proteína C reactiva (CRP Mab 5804 de Biogenesis, Inc.) que tiene
una concentración de 2,36 mg/ml. Se dejó reaccionar la mezcla
durante una noche sobre un agitador a temperatura ambiente. A
continuación, la mezcla de reacción resultante se mezcló con 100
\mul de etanolamina durante 15 minutos con un agitador. Se desechó
la disolución del sobrenadante y se lavaron las perlas dos veces
con tampón PBS y se guardó a 4ºC en un tampón de almacenamiento que
contenía PBS a 0,1 M, NaCl a 0,15 M, BSA al 1%, glicerol al 5% y
NaN_{3} al 0,1% para dar lugar a perlas conjugadas de una
concentración de 4 mg/ml.
Después se midió la intensidad de la
fluorescencia en la línea de detección/calibración utilizando un
espectrofluorímetro Fluorolog III (SPEX Industries, Inc., Edison,
NJ) con un modo de ángulo recto. Los resultados se muestran a
continuación en la tabla 2, donde I_{S} representa la intensidad
de señal de las sondas de detección en la línea de
detección/calibración, e I_{C} representa la intensidad de señal
de las sondas de calibración en la línea de
detección/calibración.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se pone de manifiesto a partir de los
resultados anteriores, cuando no había ningún analito en la muestra,
las sondas de detección en movimiento pasaron la línea de captura y
fueron capturadas sobre la línea de detección/calibración. Cuando
el analito estaba presente en la muestra, las sondas de detección se
acomplejaron con el analito y fueron capturadas sobre la línea de
captura, sin que ninguna de las sondas de detección restantes se
capturara en la línea de detección/calibración. Por lo tanto, la
intensidad de las sondas de detección (I_{S}) sobre la línea de
detección/calibración fue inversamente proporcional a la
concentración de analito, mientras que la intensidad (I_{C}) de
las sondas de calibración en la línea de detección/calibración
permaneció relativamente constante para diferentes concentraciones
de analito, es decir, aproximadamente 36 \pm 6. Se cree que las
variaciones de la I_{C} se deben a las distintas condiciones
medioambientales del ensayo y a la inestabilidad instrumental. Sin
embargo, se espera que la variación tenga un efecto similar sobre
I_{S}. Por lo tanto, se cree que I_{S}/I_{C} ha proporcionado
un resultado más exacto en este ejemplo.
Aunque se ha descrito la invención en detalle
con respecto a las realizaciones específicas de la misma, los
expertos en la técnica se darán cuenta de que, después de comprender
lo anterior, se pueden concebir fácilmente alteraciones,
variaciones y equivalentes de estas realizaciones. Por consiguiente,
el alcance de la presente invención se debe evaluar como el de las
reivindicaciones anexas.
Claims (20)
1. Dispositivo de ensayo de flujo continuo,
capaz de detectar la presencia o la cantidad de un analito que
reside en una muestra a analizar, comprendiendo dicho dispositivo de
ensayo de flujo continuo una membrana porosa, estando dicha
membrana porosa en comunicación con sondas de detección capaces de
generar una señal de detección y sondas de calibración capaces de
generar una señal de calibración, en el que se puede determinar la
cantidad del analito a partir de dicha señal de detección que está
calibrada por dicha señal de calibración, en el que dichas sondas
de detección, dichas sondas de calibración, o combinaciones de las
mismas están conjugadas a un miembro de unión específico para el
analito,
caracterizado el ensayo de flujo continuo
porque
dicha membrana porosa define una única zona de
detección/calibración dentro de la cual está inmovilizado un
reactivo de captura polielectrolítico que está configurado para
unirse directa o indirectamente a combinaciones de las sondas de
detección y las sondas de calibración, en el que dichas sondas de
detección son capaces de generar una señal de detección y dichas
sondas de calibración son capaces de generar una señal de
calibración mientras permanecen dentro de dicha zona de
detección/calibración, y en el que dicho polielectrólito tiene una
carga positiva neta y se selecciona entre el grupo que consiste en
polilisina, polietilenimina, poliaminas o poliamidoaminas
funcionalizadas con epiclorohidrina, cloruro de
polidialildimetilamonio, derivados catiónicos de la celulosa, y
combinaciones de los mismos, o dicho polielectrólito tiene una carga
negativa neta y es un ácido poliacrílico, o dicho polielectrólito
es anfipático.
2. Dispositivo de ensayo de flujo continuo, tal
como se define en la reivindicación 1, en el que dichas sondas de
detección y dichas sondas de calibración se seleccionan entre el
grupo que consiste en cromógenos, catalizadores, compuestos
fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos
fosforescentes, compuestos radiactivos, marcadores visuales
directos, liposomas y combinaciones de los mismos.
3. Dispositivo de flujo continuo, tal como se
define en la reivindicación 2, en el que dichas sondas de detección
y sondas de calibración son compuestos fluorescentes.
4. Dispositivo de ensayo de flujo continuo, tal
como se define en la reivindicación 1, en el que dichas sondas de
detección, dichas sondas de calibración, o combinaciones de las
mismas contienen micropartículas.
5. Dispositivo de flujo continuo, tal como se
define en la reivindicación 1, en el que un segundo reactivo de
captura está inmovilizado en dicha membrana porosa dentro de dicha
zona de detección/calibración que es un miembro de unión específico
para el analito.
6. Dispositivo de ensayo de flujo continuo, tal
como se define en la reivindicación 5, en el que dicho segundo
reactivo de captura está configurado para unirse directa o
indirectamente a dichas sondas de detección cuando se ponen en
contacto con éste.
7. Dispositivo de ensayo de flujo continuo, tal
como se define en la reivindicación 1, en el que dicha membrana
porosa define además una zona de captura ubicada delante de dicha
zona de detección/calibración dentro de la cual uno o más reactivos
de captura están inmovilizados, que están configurados para unirse
directa o indirectamente a dichas sondas de detección.
8. Dispositivo de ensayo de flujo continuo, tal
como se define en la reivindicación 7, en el que dicho reactivo de
captura de dicha zona de captura es un miembro de unión específico
para el analito.
9. Dispositivo de ensayo de flujo continuo, tal
como se define en la reivindicación 1, en el que el dispositivo es
un dispositivo de ensayo de tipo sandwich.
10. Dispositivo de ensayo de flujo continuo, tal
como se define en la reivindicación 1, en el que el dispositivo es
un dispositivo de ensayo de tipo competitivo.
11. Dispositivo de ensayo de flujo continuo, tal
como se define en las reivindicaciones 1 a 10, en el que el
reactivo de captura polielectrolítico está inmovilizado de manera
que no puede difundir.
12. Dispositivo de ensayo de flujo continuo, tal
como se define en la reivindicación 1, en el que la cantidad del
analito dentro de la muestra a analizar es proporcional a la
intensidad de la señal de detección dividida por la intensidad de
la señal de calibración.
13. Método para detectar la presencia o la
cantidad de un analito que reside en una muestra a analizar,
comprendiendo dicho método:
- i)
- proporcionar el dispositivo de ensayo de flujo continuo de acuerdo con la reivindicación 1;
- ii)
- poner en contacto una muestra a analizar que contiene el analito con dichas sondas de detección y dichas sondas de calibración;
- iii)
- medir la intensidad de la señal de detección y la intensidad de la señal de calibración generada dentro de dicha zona de detección/calibración; y
- iv)
- calibrar la intensidad de la señal de detección con la señal de calibración, en la que la cantidad del analito dentro de la muestra a analizar se determina a partir de dicha señal de detección que está calibrada mediante dicha señal de calibración.
14. Método, tal como se define en la
reivindicación 13, en el que dichas sondas de detección y dichas
sondas de calibración se seleccionan entre el grupo que consiste en
cromógenos, catalizadores, compuestos fluorescentes, compuestos
quimioluminiscentes, compuestos fosforescentes, compuestos
radiactivos, marcadores visuales directos, liposomas y
combinaciones de los mismos.
15. Método, tal como se define en la
reivindicación 14, en el que dichas sondas de detección y dichas
sondas de calibración son compuestos fluorescentes.
16. Método, tal como se define en la
reivindicación 15, que comprende además excitar dichas sondas de
detección y dichas sondas de calibración dentro de dicha zona de
detección/calibración, en el que la excitación causa que dichas
sondas de detección emitan la señal de detección y dichas sondas de
calibración emitan la señal de calibración.
17. Método, tal como se define en la
reivindicación 13, en el que se inmoviliza un segundo reactivo de
captura dentro de dicha zona de detección/calibración que es un
miembro de unión específico para el analito.
18. Método, tal como se define en la
reivindicación 17, en el que dicho segundo reactivo de captura está
configurado para unirse directa o indirectamente a dichas sondas de
detección cuando se ponen en contacto con éste.
19. Método, tal como se define en la
reivindicación 13, en el que dicha membrana porosa define además una
zona de captura ubicada delante de dicha zona de
detección/calibración dentro de la cual uno o más reactivos de
captura están inmovilizados y están configurados para unirse directa
o indirectamente a dichas sondas de detección.
20. Método, tal como se define en la
reivindicación 13, que comprende además la generación de una curva
de calibración al representar en una gráfica la intensidad de la
señal de detección calibrada por la intensidad de la señal de
calibración para numerosas concentraciones de analito
predeterminadas.
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