ES2293749B1 - Variante recombinante del alergeno frae 1 del polen de fresno "fraxinus excelsior", produccion en la levadura pichia pastoris y aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Variante recombinante del alergeno Frae1 del polen de fresno Fraxinus excelsior, producción en la levadura Pichia pastoris y aplicaciones. La invención consiste en la producción de la proteína Fra e 1, mediante tecnología recombinante en la levadura Pichia pastoris, que implica el uso de las secuencias nucleotídicas caracterizadas por SEQ ID NO: 1 y 2 o de otras secuencias nucleotídicas obtenidas por mutagénesis de la secuencia SEQ ID NO: 1 y 2. Para ello se ha aislado a partir de polen de Fraxinus excelsior, purificado y caracterizado un alergeno principal que es reconocido por más del 65 % de los pacientes alérgicos a esta fuente biológica. Se ha clonado y expresado el DNA recombinante que codifica el alergeno Fra e 1 de polen de fresno (Fraxinus excelsior). La proteína recombinante producida en la levadura (Pichia pastoris) se aísla con gran rendimiento, está correctamente plegada y exhibe propiedades inmunológicas equivalentes a las del alergeno natural por lo que tanto ella como las proteínas homólogas, las formas modificadas derivadas de ellas, los fragmentos derivados que contengan al menos un epítopo alergénico, pueden ser empleadas en protocolos de diagnosis e inmunoterapia.
Description
Variante recombinante del alergeno Frae1 del
polen de fresno "Fraxinus excelsior", producción en la
levadura Pichia pastoris y aplicaciones.
La presente invención, según se expresa en el
enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a uno de los
alergenos del polen de fresno (Fraxinus excelsior), la
proteína Frae1, y a epítopos alergénicos presentes en la proteína.
La invención también hace referencia a los DNAs recombinantes que
codifican tanto para la proteína completa como para fragmentos que
incluyen al menos un epítopo de la molécula. En concreto el objeto
de la invención consiste en la producción de la proteína Frae1,
mediante tecnología recombinante en la levadura Pichia
pastoris, que implica el uso de la secuencia nucleotídica
caracterizada por SEQ ID NO: 1 y 2 o de otras secuencias
nucleotídicas obtenidas por mutagénesis de la secuencia SEQ ID NO:
1 y 2.
La invención proporciona también un eficaz
método de aislamiento tanto para el alergeno recombinante como para
el natural obtenido a partir del polen de fresno.
La alergia tipo I es una enfermedad que afecta a
más del 20% de la población de los países industrializados (Kay,
A.B. (1997) Allergy and allergic diseases, Blackwell Science,
Oxford, UK). Esta afección es ocasionada por los alergenos,
presentes tanto en organismos y productos biológicos -alimentos,
ácaros, venenos de insectos, pólenes, hongos, epitelios de
mamíferos-. como en materiales de síntesis. En la mayor parte de
las fuentes masas moleculares comprendidas entre 5 y 70 kDa. Los
síntomas que se derivan de la alergia, tales como rinitis,
conjuntivitis, o asma, son provocados por la liberación de
mediadores celulares, como la histamina, desde basófilos y
mastocitos, células del sistema inmune. Dicha liberación viene
inducida por el entrecruzamiento de anticuerpos IgEs unidos a los
receptores de alta afinidad Fc\varepsilonRI, los cuales se
encuentran a su vez anclados a basófilos y mastocitos. El
entrecruzamiento de las IgE es provocado por la unión del
correspondiente alergeno, o un fragmento suyo, a través de un
epítopo IgE (contenido en dicho alergeno, o en su fragmento). La
terapia que actualmente se viene utilizando para tratar la alergia
implica la hiposensibilización del paciente mediante la
administración por vía parental u oral de dosis adecuadas del
propio alergeno, o alergoides relacionados. En la práctica
totalidad de los casos se administra un extracto alergénico
obtenido, mediante una mínima manipulación, de la fuente biológica
natural, lo que implica a una mezcla muy compleja de proteínas y
otras sustancias, en la cual, el alergeno -o alergenos- puede
representar una parte ínfima del producto total utilizado.
En efecto, en la actualidad, los protocolos
utilizados para la diagnosis de casos de alergia y su posterior
inmunoterapia implican el uso de extractos alergénicos que
frecuentemente no están caracterizados, ni siquiera estandarizados
respecto a los alergenos más importantes que pueden contener. A
menudo, su administración no proporciona una diagnosis completa,
sobre todo cuando la hipersensibilidad del paciente se refiere a
alergenos presentes en baja concentración en dichos extractos
(Valenta, R.; Lidholm, J.; Niederberger, V.; Hayek, B.; Kraft, D.
and Grondlund, H. (1999) Clin. Exp. Allergy 29,
896-904). Por otro lado, la inmunoterapia realizada
con estas preparaciones es frecuentemente ineficaz y origina en
ocasiones efectos secundarios indeseables que pueden llegar a ser
más graves que la propia afección alérgica que se pretende
resolver. Una alternativa a la utilización de estos extractos es la
preparación de mezclas de los alergenos más significativos,
obtenidos por aislamiento de su fuente natural (Rodríguez, R.;
Villalba, M.; Monsalve, R.I. and Batanero, E. (2001) Int. Arch.
Allergy Immunol. 125, 185-195). Sin embargo, esta
vía presenta dos importantes barreras. Por un lado, implica un buen
conocimiento de los componentes alergénicos del material que
provoca la alergia, al menos de todos sus alergenos principales, y
este dato, frecuentemente, no está disponible. Por otro lado, el
proceso de aislamiento de los alergenos conocidos, a partir del
material biológico, es a menudo difícil y no proporciona las
cantidades necesarias o la calidad requerida para un posterior
empleo, debido fundamentalmente a los bajos niveles en los cuales
se encuentra. Todos estos problemas se acentúan cuando el material
alergénico es el polen de una especie vegetal. La gran cantidad de
pigmentos, carbohidratos, lípidos y componentes insolubles hacen
muy difícil su manipulación. Ni que decir tiene que su
disponibilidad es, además, muy reducida y de alto coste económico,
debido a la dificultad de su recolección. Por todo lo expuesto, se
hace necesario el diseño de procedimientos para la producción de
alergenos a utilizar en los protocolos de diagnosis e inmunoterapia
de la alergia. La producción de DNA recombinante se prevé como la
forma más reproducible y eficaz de obtención de polipéptidos
alergénicos bien definidos, no sólo para uso clínico, sino incluso
para investigación.
Producción del alergeno recombinante de
Fraxinus excelsior Frae1 en la levadura Pichia
pastoris, y sistema de aislamiento y purificación.
La presente invención se refiere al método de
aislamiento utilizado para la purificación, a partir del polen de
fresno (Fraxinus excelsior), del alergeno Frae1 -un alergeno
del polen de fresno de creciente importancia clínica sobre todo en
determinadas áreas geográficas, alcanzando una prevalencia del 65%
en los pacientes alérgicos al polen de fresno en algunas regiones
en Centro Europa (Hemmer W, Focke M, Wantke F, Gotz M, Jarisch R,
Jager S, Gotz M. Allergy (2000) 55 (10), 923-30-.
Más específicamente comprende la obtención, mediante clonación, de
moléculas de DNA recombinante que codifican polipéptidos con las
mismas o similares propiedades antigénicas que el alergeno
procedente del polen de fresno, o bien polipéptidos que posean al
menos un epítopo del alergeno Frae1. La invención incluye también
la secuencia completa del cDNA del alergeno Frae1 y la secuencia
completa deducida del alergeno.
El procedimiento objeto de la invención, permite
llevar a cabo la purificación del alergeno Frae1 del polen de
fresno a partir de un extracto proteico de polen de fresno mediante
dos etapas cromatográficas, cromatografías de penetrabilidad y
HPLC, según se describe detalladamente más adelante.
La invención dispone de secuencias
polinucleotídicas de DNA que hibridan, en condiciones restrictivas,
con las descritas antes, o bien son derivadas de ellas por
degeneración del código genético o mutagénesis.
El procedimiento de clonación del alergeno
recombinante de Fraxinus excelsior Frae1, incluye vectores de
clonación y células huésped que contienen una secuencia de
nucleótidos como las descritas en SEQ ID NO: 1 y 2, codificante de
Frae1 o fragmentos suyos.
De esta manera se obtiene la secuencia
nucleotídica que codifica al alergeno completo y aquellos
fragmentos nucleotídicos que poseen, al menos, una secuencia que
codifica un determinante antigénico del alergeno Frae1 de
fresno.
Estos polipéptidos pueden contener la secuencia
antigénica unida a otros polipéptidos de distinto origen o
naturaleza(por ejemplo como proteínas de fusión), haber sido
sintetizados químicamente o haber sido obtenidos mediante
digestiones proteolíticas y modificados química o
enzimáticamente.
La inserción de dicha secuencia en vectores de
expresión en organismos hospedadores eucarióticos permite disponer
de construcciones recombinantes que pueden utilizarse para la
producción del alergeno recombinante.
Una vez producida la molécula polipeptídica con
actividad antigénica de Frae1 en medio de crecimiento mínimo, ésta
es aislada del medio extracelular del cultivo en forma soluble
mediante cromatografía de intercambio aniónico, de penetrabilidad y
HPLC.
Los productos recombinantes obtenidos mediante
el procedimiento objeto de la invención presentan la capacidad de
unión de anticuerpos IgE del suero de pacientes alérgicos a fresno,
sensibles a Frae1.
Finalmente, con el procedimiento objeto de la
invención, se dispone de Frae1 inmunológicamente activo, además de
fragmentos antigénicos y alergénicos de este alergeno, que sirven
para ser incorporados en las pruebas "in vivo" e
"in vitro" a realizar para la fiel diagnosis de la
hipersensibilidad a este polen, y a otros pólenes relacionados
filogenéticamente con él. También podrán ser empleados en las
preparaciones de alergenos que se utilicen para llevar a cabo la
inmunoterapia correspondiente para el tratamiento de la alergia al
polen de fresno.
Para el diagnóstico y la terapia de la alergia
al polen de fresno se utilizan actualmente extractos proteicos
obtenidos a partir del polen. Esto implica una escasa
reproducibilidad y un alto contenido en moléculas contaminantes, de
origen proteico y no proteico, que pueden originar efectos
secundarios adversos en los pacientes tratados. El disponer de
moléculas homogéneas obtenidas por las técnicas del DNA
recombinante, en cantidades ilimitadas, perfectamente
cuantificables y estandarizadas, rebajaría considerablemente todos
los inconvenientes citados. Esta tecnología permite disponer de
esas moléculas y, además, de péptidos o formas modificadas de las
mismas que contienen al menos uno de los epítopos alergénicos.
La invención se acompaña de 3 figuras que con
carácter ilustrativo representan lo siguiente:
Figura 1.- Purificación de Frae1 natural (nFra).
El extracto de polen de fresno obtenido como se describe a
continuación fue aplicado a la primera columna de Sephadex
G-75 y las fracciones correspondientes a moléculas
de masa molecular aproximada de 20 kDa fueron reunidas,
liofilizadas y aplicadas a la segunda columna de fase reversa
C-18(HPLC) usando un gradiente de
acetonitrilo en 0.1% TFA. Las distintas fracciones de nFrae1 con
distinto grado de glicosilación obtenidas en la cromatografía en
HPLC aplicadas en PAGE-SDS e inmunoteñidas con
sueros de pacientes alérgicos a fresno (A), con anticuerpo
policlonal (B) y con la lectina Concanavalina A (C).
Figura 2.- PAGE-SDS de
nFrae1(1 \mug/pocillo) e inmunotransferencia en membranas
de nitrocelulosa teñidas con 17 sueros individuales alérgicos a
fresno.
Figura 3.- PAGE-SDS de Frae1
recombinante (rFra) (1 \mug/pocillo) e inmunotransferencia a
membranas de nitrocelulosa incubadas con 11 sueros individuales
alérgicos a fresno.
La presente invención se refiere a un DNA
recombinante que codifica epítopos del alergeno de Fraxinus
excelsior Fra e 1, a la producción recombinante, en la levadura
Pichia pastoris, de los polipéptidos codificados por dicho
DNA y al aislamiento del alergeno natural procedente del polen de
fresno. También se refiere a la aplicación de ambas moléculas al
diagnóstico y terapia de este desorden inmunológico.
Un modo de realización preferente se ha llevado
a cabo mediante las siguientes fases:
Se aisló el RNA total a partir del polen de
fresno siguiendo el protocolo publicado por Ullrich y col.
[Science 196, 1313-1318, 1977]. En este aislamiento
se partió de 0.5 g de polen de fresno que se homogeneizó en un
tampón 0.1 M de Tris-HC1, pH 7.5 que contenía
tiocianato de guanidinio 4M, laurilsarcosinato sódico al 0.5 % y
2-mercaptoetanol 0.14 M, mediante un homogeneizador
Polytron. Se centrifugó esta suspensión a 5000 xg a 20ºC en una
centrífuga Sorvall. Posteriormente se sometió al sobrenadante a una
centrifugación en gradiente de CsCl 5.7 M en 0.01 M EDTA a 40.000
rpm en un rotor SW 60 (Beckman) durante 12 horas. Con estos últimos
se introdujo una etapa inicial adicional en la que fueron macerados
en presencia de nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino y
homogéneo. A partir de 5 \mug de RNA total se llevó a cabo la
síntesis del cDNA utilizando el "kit" SMART II de síntesis de
cDNA (Clontech).
En el procedimiento de clonación del alergeno
recombinante de Fraxinus excelsior Frae1, se llevó a cabo la
obtención de la secuencia N-terminal mediante
Degradación de Edman de la proteína para poder diseñar el
oligonucleótido con el que llevar a cabo el clonaje de su DNA.
Tras la secuenciación, se utilizó la secuencia
(EDVPQ) para diseñar el oligonucleótido degenerado ("sense"),
5'-GARGAYGTNCCNCAR-3' que fue
utilizado, junto con el primer inespecífico UPM:
5'-CTAATACGACTCAC
TATAGGGC-3' y utilizando el cDNA como molde, para amplificar por PCR la secuencia codificante (1-145) y no codificante 3' correspondientes al cDNA de Frae1. La clonación de su cDNA en el sistema TOPO TA cloning (Invitrogen) permitió la obtención de la secuencia de nucleótidos codificante completa y la secuencia 3' no codificante. El molde y los cebadores de las reacciones de PCR fueron disueltos en una mezcla de PCR estándar (2501 \muM de dNTPs, tampón estándar y 50 pmoles de los cebadores). Después de una primera etapa de desnaturalización a 95ºC durante 5 min, se llevaron a cabo 30 ciclos a temperaturas de hibridación de 40ºC en la primera etapa y 68ºC en la segunda en presencia de Advantage DNA polimerasa II(Clontech). La reacción se sometió a electroforesis en geles de agarosa al 1.5% y los fragmentos de DNA fueron purificados usando el Magic PCR Prep kit (Promega) e insertados en el plásmido pCR2.1 linearizado y con una T terminal en los extremos 5'. Con esta construcción se transformaron células competentes TOP10 según el protocolo del TOPO TA cloning kit (Invitrogen), a continuación se seleccionaron los recombinantes y se llevó a cabo la secuenciación de algunos de los clones seleccionados, obteniéndose secuencias de este alérgeno como las caracterizadas por SEQ ID NO: 1 y 2.
TATAGGGC-3' y utilizando el cDNA como molde, para amplificar por PCR la secuencia codificante (1-145) y no codificante 3' correspondientes al cDNA de Frae1. La clonación de su cDNA en el sistema TOPO TA cloning (Invitrogen) permitió la obtención de la secuencia de nucleótidos codificante completa y la secuencia 3' no codificante. El molde y los cebadores de las reacciones de PCR fueron disueltos en una mezcla de PCR estándar (2501 \muM de dNTPs, tampón estándar y 50 pmoles de los cebadores). Después de una primera etapa de desnaturalización a 95ºC durante 5 min, se llevaron a cabo 30 ciclos a temperaturas de hibridación de 40ºC en la primera etapa y 68ºC en la segunda en presencia de Advantage DNA polimerasa II(Clontech). La reacción se sometió a electroforesis en geles de agarosa al 1.5% y los fragmentos de DNA fueron purificados usando el Magic PCR Prep kit (Promega) e insertados en el plásmido pCR2.1 linearizado y con una T terminal en los extremos 5'. Con esta construcción se transformaron células competentes TOP10 según el protocolo del TOPO TA cloning kit (Invitrogen), a continuación se seleccionaron los recombinantes y se llevó a cabo la secuenciación de algunos de los clones seleccionados, obteniéndose secuencias de este alérgeno como las caracterizadas por SEQ ID NO: 1 y 2.
Para la producción de la forma recombinante de
esta proteína, la secuencia codificante de DNA fue amplificada
mediante PCR utilizando cebadores no degenerados específicos del
N-terminal (5' cgtctcgagaaaaGAGGATGTGCCA
CAC 3') y C-terminal (5' cggaattcTCACATGTTGGGCGGGTA 3') y el fragmento obtenido fue ligado al plásmido de expresión pPICZ\alpha-A (Invitrogen Corp.). Las células utilizadas fueron de la cepa KM71 de Pichia pastoris. La inducción se llevó a cabo por metanol al 0.5% durante tres días, creciendo las células a 30ºC en medio mínimo de crecimiento de levadura. Las células se sedimentaron centrifugando a 5000 xg, se recogieron los sobrenadantes y una muestra de los mismos se aplicó en un gel de poliacrilamida al 15% en presencia de SDS. Una banda glicosilada de 20 kDa, acompañada en ocasiones con una minoritaria de 18 kDa que corresponde con la forma no glicosilada de la proteína, fue detectada mediante tinción de los geles con Azul de Coomassie. La proteína es reconocida por sueros de pacientes alérgicos específicos de Frae1 natural (dilución 1:10). La purificación de las proteínas se llevó a cabo mediante la liofilización del medio extracelular de la levadura y la aplicación de dos etapas cromatográficas, una de intercambio iónico en DEAE-celulosa y una de penetrabilidad en Sephadex G-75, obteniéndose tras esta última el alergeno con un grado de pureza del 99%. Se llevaron a cabo con ellas estudios de caracterización estructural (espectros de dicroismo en el UV lejano, espectrometría de masas) e inmunológica (con sueros individuales de pacientes alérgicos) y en todos los casos las proteínas recombinantes se comportaron de manera equivalente a la del alergeno natural.
CAC 3') y C-terminal (5' cggaattcTCACATGTTGGGCGGGTA 3') y el fragmento obtenido fue ligado al plásmido de expresión pPICZ\alpha-A (Invitrogen Corp.). Las células utilizadas fueron de la cepa KM71 de Pichia pastoris. La inducción se llevó a cabo por metanol al 0.5% durante tres días, creciendo las células a 30ºC en medio mínimo de crecimiento de levadura. Las células se sedimentaron centrifugando a 5000 xg, se recogieron los sobrenadantes y una muestra de los mismos se aplicó en un gel de poliacrilamida al 15% en presencia de SDS. Una banda glicosilada de 20 kDa, acompañada en ocasiones con una minoritaria de 18 kDa que corresponde con la forma no glicosilada de la proteína, fue detectada mediante tinción de los geles con Azul de Coomassie. La proteína es reconocida por sueros de pacientes alérgicos específicos de Frae1 natural (dilución 1:10). La purificación de las proteínas se llevó a cabo mediante la liofilización del medio extracelular de la levadura y la aplicación de dos etapas cromatográficas, una de intercambio iónico en DEAE-celulosa y una de penetrabilidad en Sephadex G-75, obteniéndose tras esta última el alergeno con un grado de pureza del 99%. Se llevaron a cabo con ellas estudios de caracterización estructural (espectros de dicroismo en el UV lejano, espectrometría de masas) e inmunológica (con sueros individuales de pacientes alérgicos) y en todos los casos las proteínas recombinantes se comportaron de manera equivalente a la del alergeno natural.
El alergeno Frae1 ha sido purificado a partir de
extracto proteico de polen de fresno, obtenido por homogeneización
de 3 g de polen en bicarbonato amónico 50 mM pH 8.0 durante 3 horas
a T ambiente. Dicho extracto fue aplicado a una columna de Sephadex
G-75. Las fracciones que contenían la proteína
fueron aplicadas a una columna de fase reversa C-18
en HPLC con un gradiente de acetonitrilo (0-60%) en
TFA al 0.1%. En dicha cromatografía se aislan cinco diferentes
fracciones que contienen a nFrae1 con distinto grado de
glicosilación (figura 1).
La invención cubre el uso de Frae1 recombinante
en diagnóstico, "in vivo" mediante pruebas cutáneas o
"in vitro" mediante técnicas de inmunodetección (ELISA,
RAST), permitiendo precisar qué alergenos son los responsables de
la sintomatología clínica de un individuo y reducir así el número
de moléculas necesarias para su inmunoterapia. Se origina, por
tanto, una inmunoterapia personalizada.
<110> Universidad Complutense de
Madrid
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Variante recombinante del alergeno
Frae1 del polen de fresno Fraxinus excelsior, producción en
la levadura Pichia pastoris y aplicaciones.
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 435
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<212> DNA
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<213> Fraxinus excelsior
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(435)
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\vskip0.400000\baselineskip
<300>
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<308>
\vskip0.400000\baselineskip
<309> 2002 07 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 435
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<212> DNA
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<213> Fraxinus excelsior
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<221> CDS
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<222> (1)...(435)
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Fraxinus excelsior
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<300>
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<308>
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<309> 2002 07 1
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 145
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<212> PRT
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<213> Fraxinus excelsior
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<400> 4
Claims (18)
1. Moléculas de DNA recombinante
caracterizadas por SEQ ID NO: 1 que codifican un polipéptido
con actividad alergénica y que poseen, al menos, un epítopo
alergénico común con el alergeno Frae1 de Fraxinus
excelsior.
2. Moléculas de DNA recombinante, o
modificaciones de las mismas, según reivindicación 1, que codifican
polipéptidos con, al menos, un epítopo de Frae1 en su estructura,
unido a un polipéptido adicional, o modificado química o
enzimáticamente.
3. Moléculas de DNA recombinante
caracterizadas por hibridar en condiciones fuertemente
restrictivas con la secuencia descrita en SEQ ID NO: 1.
4. Moléculas de DNA recombinante obtenidas a
partir de la SEQ ID NO: 1 y 2, conteniendo una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad alergénica
idéntica o reducida (hipoalergénica) con respecto a Frae1 de
Fraxinus excelsior.
5. Polipéptido recombinante correspondiente al
alergeno Frae1 de Fraxinus excelsior, o fragmentos de dicho
polipéptido, según reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por
la secuencia dada en SEQ ID NO: 3 y 4 que presentan la
antigenicidad de, al menos, un epítopo de Frae1.
6. Polipéptidos que posean una secuencia de
aminoácidos según reivindicación 5, y que presenten una
alergenicidad atenuada.
7. Polipéptidos o fragmentos de dichos
polipéptidos de polen de Fraxinus excelsior con, al menos,
un epítopo de Frae1, según reivindicaciones anteriores, que se
produzcan recombinantes unidos a un polipéptido adicional.
8. Polipéptidos de polen de Fraxinus
excelsior, según reivindicaciones 5, 6, 7, que estén
modificados química o enzimáticamente.
9. Un vector de expresión eucariota, y
preferentemente pPICZ\alpha-A, que contenga las
secuencias caracterizadas por SEQ ID NO: 1 y 2 según
reivindicaciones 1, 2, 3 y 4 cuya expresión dé lugar a la
producción de los polipéptidos caracterizados por SEQ ID NO:
2 según reivindicaciones 5, 6, 7 y 8.
10. Un organismo hospedador eucariota,
preferentemente la levadura Pichia pastoris, transformado
con la construcción formada según reivindicación 9.
11. Un método para producir las formas
recombinantes correspondientes a las secuencias polipeptídicas
descritas en las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8, en el sistema
eucariótico de levadura Pichia pastoris, y preferentemente
de la cepa KM71, crecidas en medio rico, caracterizado por
una cromatografía de intercambio iónico en
DEAE-celulosa, una de penetrabilidad en Sephadex
G-75.
12. Un método para producir formas recombinantes
según reivindicación 11 en el que se adiciona una cromatografía en
una columna C-18 de fase reversa de HPLC.
13. Un método para el aislamiento del alergeno
Frae1 a partir del polen de Fraxinus excelsior utilizando una
cromatografía de penetrabilidad en Sephadex G-75 y
una columna de fase reversa nucleosil C-18 de
HPLC.
14. Utilización de los péptidos de las
reivindicaciones 5-8 para preparar un medicamento
útil en el tratamiento de alergias.
15. Utilización de las moléculas según
reivindicaciones 1-8 en el diagnóstico "in
vitro" de la alergia.
16. Aplicación de las moléculas recombinantes de
las reivindicaciones 1-8 para el diseño de vacunas
destinadas a la inmunoterapia de la alergia.
17. Aplicación de las moléculas recombinantes de
las reivindicaciones 1-4 para producir péptidos,
según reivindicaciones 5-8, que contengan al menos
un epítopo T alergénico, capaces de actuar como vacunas.
18. Aplicación de las moléculas recombinantes de
las reivindicaciones 1-4 en la producción de
isoformas recombinantes hipoalergénicas que tengan disminuída o
anulada su unión a IgE para el tratamiento de alergias.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200301353A ES2293749B1 (es) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | Variante recombinante del alergeno frae 1 del polen de fresno "fraxinus excelsior", produccion en la levadura pichia pastoris y aplicaciones. |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200301353A ES2293749B1 (es) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | Variante recombinante del alergeno frae 1 del polen de fresno "fraxinus excelsior", produccion en la levadura pichia pastoris y aplicaciones. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2293749A1 ES2293749A1 (es) | 2008-03-16 |
| ES2293749B1 true ES2293749B1 (es) | 2009-03-16 |
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ID=39166458
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| ES200301353A Expired - Fee Related ES2293749B1 (es) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | Variante recombinante del alergeno frae 1 del polen de fresno "fraxinus excelsior", produccion en la levadura pichia pastoris y aplicaciones. |
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| ES (1) | ES2293749B1 (es) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002012503A1 (es) * | 2000-07-28 | 2002-02-14 | Universidad Complutense De Madrid | Producción en la levadura pichia pastoris y sistema de purificación del alergeno recombinante de olea europaea olee 1 para uso en diagnosis y tratamiento de alergias |
-
2003
- 2003-06-06 ES ES200301353A patent/ES2293749B1/es not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002012503A1 (es) * | 2000-07-28 | 2002-02-14 | Universidad Complutense De Madrid | Producción en la levadura pichia pastoris y sistema de purificación del alergeno recombinante de olea europaea olee 1 para uso en diagnosis y tratamiento de alergias |
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