ES2319341T3 - Fragmentos tolerogenicos de alergenos naturales. - Google Patents

Abstract

Método para producir un extracto proveedor de tolerancia aplicado a un individuo con el fin de proporcionar tolerancia contra el material alergénico, dicho método comprende: a) la extracción del material de la fuente alergénica b) la eliminación de material con una masa molecular inferior a 3,5 kDa, dando lugar a la fracción HMW-N, opcionalmente liofilizando HMW-N c) la eliminación de taninas y melanoidinas que están conectadas físicamente al material alérgeno en HMW-N de la fracción, dando lugar así a la fracción libre HMW-D despigmentada de taninas y melanoidinas libres y taninas y melanoidinas no conjugadas, opcionalmente liofilizando HMW-D d) la oxidación de HMW-D, suministrando así la fracción HMW-Dox, e) la degradación de la proteína presente en la fracción HMW-Dox produciendo así fragmentos con una masa molecular entre 1 y 10 kDa, dicho producto de la fase e) siendo Fb-D.

Description

Fragmentos tolerogénicos de alérgenos naturales.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para el seccionamiento enzimático controlado de proteínas activas alergénicas purificadas y despigmentadas de materiales de fuentes internas y externas, dicho proceso produce fragmentos de alérgenos que retienen los epítopos que estimulan los linfocitos T naturales, pero que están desprovistos de los epítopos de células B de unión a la IgE y los agentes activadores del complemento. La invención se refiere también a los nuevos productos farmacéuticos. Estos fragmentos de alérgenos no presentan las desventajas de extractos alergénicos convencionales para la inmunoterapia y pueden ser usados de modo seguro para inducir un estado de anergia específica de las células T y una tolerancia inmunológica en personas alérgicas.

Antecedentes generales

Extractos acuosos de varios substratos medioambientales como el polvo doméstico, los restos epiteliales mudados en la epidermis de animales, los granos de polen de las plantas, malas hierbas, arbustos, y otros materiales se utilizan ampliamente para diagnósticos de enfermedades alérgicas in vivo e in vitro como el asma bronquial, rinitis vasomotora y polinosis en seres humanos con predisposición, llamados pacientes "atópicos". Ya desde los primeros informes clínicos realizados por Noon y Freeman en 1911, estos extractos fueron aplicados también para el tratamiento de las enfermedades alérgicas atópicas en un régimen de inyecciones subcutáneas para la "desensibilización", "hiposensibilización" o "inmunoterapia" de estas dolencias. Basándose en la observación de que los componentes alergénicos causantes y predominantes en los extractos comprenden estructuras de esqueleto de proteína en la gama de peso molecular de 10 - 70 kDa, se ha convertido en una práctica habitual en el proceso de fabricación de extractos alergénicos tratar mediante diálisis o ultrafiltración los extractos acuosos a través de membranas de corte nominal de 10 kDa a fin de eliminar los componentes de menor importancia con un tamaño molecular inferior a 10 kDa, reteniendo de este modo las proteínas antigénicas polivalentes en el rango de 10-100 kDa para mejorar la calidad de los extractos alergénicos en la aplicación clínica. En algunos casos, se elige un límite de corte inferior de 3 kDa o 5 kDa.

Según teorías recientes, la exposición a alérgenos medioambientales en el hombre causa la formación de anticuerpos específicos de alérgenos de isotipos IgG y IgE. Dentro de un contexto inmunológico, los alérgenos pueden considerarse, por tanto, como anticuerpos IgG comunes que inducen antígenos extraños dotados de la propiedad auxiliar - bien debido a características moleculares especiales o a la presencia simultánea en extractos alergénicos de moduladores apropiados - para promover adicionalmente la biosíntesis de anticuerpos del tipo IgE. Anteriormente, dichos antígenos se denominaron más apropiadamente "alérgenos atópicos" [1]. Los seres humanos llamados "atópicos", genéticamente predispuestos, son más propensos en este aspecto a desarrollar respuestas con niveles elevados de anticuerpos IgE alérgeno- específicos. Después de la fase de inducción inicial o de "sensibilización", el contacto reanudado con el alérgeno se considera que conduce a la formación local de complejos de alérgenos- anticuerpos (IgE), máximos responsables de los síntomas de la enfermedad. Más particularmente, es la interacción de alérgenos con su anticuerpos sésiles específicos de tipo IgE unidos a receptores de IgE-(e) en membranas celulares (es decir, en mastocitos o leucocitos basófilos) que están considerados para desencadenar la secuencia de eventos bioquímicos conduciendo eventualmente a la liberación de mediadores responsables de los síntomas manifestados clínicamente en la alergia. Se han descrito multitud de enfoques a fin de reducir el riesgo de reacciones secundarias anafilácticas durante la inmunoterapia. Recientemente, se publicó PCT/EP96/01733 (Noviembre 7, 1996) que revelaba una nueva composición farmacéutica para usarse en terapias de desensibilización de pacientes alergénicos. Esta composición comprende tirosina y un alérgeno polimerizado. Ya en los años ochenta se presentaron otros enfoques, pero se consideraron inadecuados. GB-A-1,492,973 describe un coprecipitado de tirosina y un alérgeno modificado por un agente provocando entrecruzamiento intramolecular. EP-A-0.367.306 describe un proceso de preparación de alérgenos polimerizados suministrando también la reticulación, dando como resultado supuestamente una alergenicidad reducida. En otra publicación anterior EP-B-0.038.154 que fue publicada en el año 1981 se describe el tratamiento de un alérgeno con polisarcosina a fin de reducir su alergenicidad. Particularmente, según la publicación la polisarcosina se utiliza con un peso molecular de 2.000-12.000. Este documento también se refiere a la patente de Reino Unido 1.282.163 que describe una forma de terapia mejorada donde la alergenicidad de un alérgeno se reduce por el tratamiento con glutaraldehído, que es sugerido como retención de la capacidad para obtener anticuerpos de bloqueo pero que expone la alergenicidad reducida, por lo que es más adecuado para la terapia de desensibilización. Un enfoque alternativo fue proporcionado en la patente de Reino Unido número 1.578.348, donde se declara que los conjugados de polietilenglicol y alérgeno son capaces de provocar el efecto terapéutico deseado de supresión de la producción de IgE específica del alérgeno. Estos materiales están declarados como no alergénicos ni inmunogénicos. Para la inmunoterapia prevista de enfermedades alérgicas mediante fragmentos de alérgenos tolerogénicos, los productos seleccionados deberían ser cercanamente similares a los epítopos de células T naturales generados dentro de las llamadas "células presentadoras de antígenos" (APCs) por hidrolasas ácidas y otras enzimas bajo condiciones fisiológicas. Este enfoque particular se ha tomado de la técnica anterior de la patente estadounidense 4,469,667 y la patente europea EP 0113712 B1 (véase también Ref. 6 y 7). Tales elementos naturales incluyen posibles estructuras químicas hapténicas unidas a péptidos y pueden imitarse en el laboratorio sometiendo los componentes de extracto alergénico a un seccionamiento proteolítico bajo condiciones controladas. Una de las muchas vías de investigación en este campo sugiere que el tratamiento de la alergia en las personas debería ser realizado usando derivados de alérgenos que no inducen anticuerpos IgE específicos, es decir derivados de alérgenos desprovistos de los llamados "epítopos de células B" que se unen a la IgE.

Otras publicaciones ([12], WO94/06821) revelan un proceso para obtener fragmentos de proteínas alergénicas. No obstante, no se ha realizado ninguna fase de oxidación. El documento XP002071094 evalua el consumo del complemento hemolítico en un extracto de polen. No se describe ningún proceso de purificación.

Así, durante los últimos veinte años se han propuesto numerosas vías diferentes para proporcionar composiciones para la desensibilización, es decir, reduciendo la alergenicidad. Un esfuerzo considerable se ha destinado a abordar el problema de diversas maneras, hasta ahora con poco resultado. Con el fin de conseguir una mejor comprensión de los requisitos para el tratamiento, es esencial valorar lo que ocurre en realidad durante la inducción o estimulación de una respuesta alérgica.

La inducción de una respuesta inmunitaria a antígenos extraños requiere la cooperación de varias categorías de células, es decir, en la forma más simple, las llamadas "células presentadoras de antígeno" (APC) y las poblaciones de linfocitos T y B. La primera señal, es decir, entre las APC y los linfocitos T, está compuesta de fragmentos de péptidos antigénicos que aumentan durante el tratamiento intracelular (por seccionamiento proteolítico) de un antígeno extraño interiorizado por APCs, p. ej. macrófagos. Los fragmentos antigénicos (extraños) (también conocidos como "ettopos de células T") son reciclados posteriormente en las membranas externas de las APC, donde luego se exponen en forma de ligandos asociados con antígenos de Clase II unidos a la membrana del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC). De entre las poblaciones de linfocitos T(colaboradores) (células Th1 y Th2) que reconocen dichos epítopos de células T en las APC y cooperan por sí mismos con los linfocitos B que secretan inmunoglobulina, la activación de clones de células Th2 alérgeno-específicos está considerada particularmente para ejercitar un papel fundamental en el desarrollo de las enfermedades atópicas en humanos. A diferencia de las células Th1, las células Th2 activadas por contacto con APC los epítopos de células T apropiadas en su superficie producen un gran número de las interleuquinas 4 (IL-4) y 5 (IL-5), que pueden actuar, entre otras, como señales de citoquina promoviendo la biosíntesis IgE a través de linfocitos B o células de plasma. Basándose en esto, una teoría contemporánea de alergia (atópica) "tipo I inmediato" determina que en los seres humanos atópicos una preponderancia relativa de los linfocitos Th2 sobre los del tipo Th1 se produce como resultado del aumento de la sínteis IgE y que, por tanto, la terapia activa debería tener como objetivo restablecer el equilibrio de la actividad de las células T alérgeno-específicas de Th2>Th1 a Th1\geqTh2. La manipulación deliberada de clones de células T alérgeno-específicas por medio de epítopos de células T derivados de moléculas alergénicas sugiere de ese modo un posible nuevo enfoque para el éxito de la inmunoterapia, con la restricción de que tales epítopos no debe unir, ni inducir anticuerpos de IgE [2,3] alérgeno-específicos. Sin embargo, los últimos ensayos clínicos con algunos epítopos de péptidos de células T sintéticos estructuralmente definidos a partir de la secuencia de aminoácidos de los antígenos seleccionados de unión a IgE, que provienen de la clonación molecular y de la tecnología recombinante, no han logrado alcanzar hasta ahora los efectos beneficiosos deseados [4,5] de modo que esta vía tomada más recientemente no parece conducir a resultados.

Sin desear ceñirse a la teoría, parece bien establecido que la interacción entre APCs y las células Th requiere factores coestimuladores que implican diferentes receptores de membrana. También es evidente que si sólo tiene lugar la primera señal, es decir, el reconocimiento de epítopos de células T, puede producirse la anergia de las células T. Después de una fase inicial de estimulación estas células Th2 se hacen insensibles a la estimulación posterior por APCs inducidas por alérgenos. Por lo tanto, la anergia de las células T puede ser inducida en clones de células Th2 alérgeno-específicos, después de la estimulación con péptidos derivados de alérgenos. Tales células Th anérgicas impiden proporcionar ayuda a las células B productoras de IgE, conduciendo así a la regulación a la baja de los niveles de IgE. Existen algunos datos clínicos preliminares que sostienen la idea de que la presentación o la administración de dosis supra-óptimas de epítopos de células T preformados compatibles con MHC puede inducir, en ausencia de señales coestimuladoras y quizás incluso en el estado inmunológico preexistente, la anergia de células T y la tolerancia inmunológica [6,7].

Se sabe que los extractos de materiales de fuentes alergénicas individuales contienen una gran variedad de diferentes alérgenos de proteínas de unión a IgE. Además, cualquier alérgeno de proteína individual de una única fuente puede presentar una gran variedad de epítopos de células T que no se unen a IgE. En vista de la abundancia de epítopos activadores de células T y de la dificultad de seleccionar los péptidos tolerogénicos apropiados entre ellos, sería razonable asumir que la inmunoterapia de amplio espectro eficaz con epítopos de células T puede lograrse mejor con colecciones de fragmentos que no se unen a IgE de la biblioteca natural de alérgenos en el material de la fuente, en lugar de con algunos péptidos sintéticos seleccionados o incluso alérgenos recombinantes. Esto resulta aún más sorprendente en el contexto de la probable naturaleza química de los epítopos dominantes. Una opinión actual mantiene que los epítopos de células T son péptidos de la secuencia de aminoácidos lineal que pueden producirse sintéticamente una vez sean identificados. No obstante, este punto de vista niega completamente que los alérgenos de origen natural lleven a menudo cadenas laterales post-traduccionales formadas por carbohidratos u otros compuestos orgánicos conjugados químicamente al esqueleto de la proteína. Este tipo de estructuras conjugadas químicamente o "haptenos" representan a menudo sitios inmunodominantes que son retenidos en fragmentos de alérgenos producidos enzimáticamente, pero que están carecen de péptidos sintéticos o de transcritos de alérgenos recombinantes. Y, finalmente, la ciencia y la tecnología de los alérgenos se mantienen completamente en silencio con respecto a la cuestión práctica más importante, es decir, las interacciones químicas y físicas que tienen lugar en los numerosos componentes en extractos alergénicos sin refinar, dando lugar a productos de degradación y a la formación de complejos moleculares no fisiológicos. Por estas razones, en combinación con la falta de resultados prácticos de las composiciones descritas anteriormente, se adoptó un enfoque alternativo para desarrollar preparaciones más apropiadas para el tratamiento de las alergias.

Antecedentes de la invención

Anteriormente se ha asumido, como se hace normalmente, que el sistema inmunitario se encarga de los alérgenos de igual manera que lo hace con los antígenos extraños comunes. No obstante, esta presunción no explica por qué los alérgenos, a diferencia de los antígenos de proteínas comunes, inducen la formación de anticuerpos IgE específicos en colaboración con los anticuerpos IgG ni tampoco ayuda a entender por qué sólo un pequeño segmento de la población humana (los individuos "atópicos") no sólo producen niveles elevados de anticuerpos IgE, sino que también es propenso a desarrollar enfermedades alérgicas manifestas clínicamente. Obviamente, otros factores deben ser considerados antes de diseñar los preparados de alérgenos o fragmentos de alérgenos más adecuados para contrarregular el(los) patomecanismo(s) de la enfermedad alérgica. Uno de estos factores concierne al sistema de complemento y su activación por componentes de extractos alergénicos.

Los extractos acuosos de materiales de fuentes alergénicas "internas" son conocidos desde hace tiempo para consumir el complemento hemolítico (huC) en suero humano in vitro [8]. Estudios químicos de varios extractos alergénicos han revelado la presencia casi universal de productos de descomposición orgánicos, que incluyen >10 kDa productos reactivos del tipo Maillard de proteínas o péptidos con carbohidratos (es decir, melanoidinas), al igual que (eu-)melaninas solubles en extractos de polvo doméstico y caspa de animales. Estos ingredientes han demostrado ser responsables de la activación del complemento y parcialmente también de las reacciones positivas en la piel in vivo en individuos alérgicos atópicos. Por otro lado, en extractos acuosos de alérgenos "externos" típicos como los pólenes de las plantas, los agentes principales implicados en la activación del complemento han sido identificados recientemente por los inventores por ser taninas condensadas o hidrolizables libres de o adsorbidas por proteínas, o flavonoides y otros polifenoles conjugados en una densidad mayor a las moléculas portadoras de proteínas en forma de haptenos. Los productos de degradación de melanoidina, melanina o tanina por ellos mismos fueron ya descritos en 1983 como no inmunogénicos, aunque pueden presentarse ellos mismos en asociación física con los antígenos de proteínas en los extractos, de ese modo dando lugar a la inducción preferencial de anticuerpos de la clase IgE [9].

El mecanismo de activación del complemento no mediado por anticuerpos por medio de estos componentes particulares de extractos alergénicos implica los componentes Cl, C4, C2, y en condiciones especiales C3 de la ruta clásica. Así, la activación local de complemento para compuestos de modulación en extractos alergénicos pueden llevar a la generación de la anafilotoxina C3a que libera histamina potente y el fragmento C3b, un factor esencial en la regulación del sistema inmunitario celular. Además, se ha demostrado que el complemento en el suero de individuos "atópicos" tiende a ser más sensible frente a factores activadores que los observados en los sueros de personas de control saludables [8].

Hemos observado de forma imprevista que la presencia de taninas y melanoidinas en extractos alergénicos son capaces de activar el sistema del complemento incluso en ausencia de antígenos. Por lo tanto, estos agentes presentan verdaderamente propiedades de adyuvantes mediante la generación de factores de complemento como C3b (polivalente), que proporcionan las "segundas" señales apropiadas para la proliferación de linfocitos B y la estimulación de síntesis de anticuerpos. El citado receptor CD21 de membrana externa de C3b en células B por sí mismo es un ligando para la lectina CD23 en los linfocitos B, que a su vez ha sido reconocido como un receptor (Fc) de IgE de baja afinidad. Aunque los detalles de la cadena de células T/células B e interacciones del receptor de complemento están alejados del objetivo de este documento, parece evidente que los estímulos para la síntesis de anticuerpos alérgeno específico IgE y para la activación del complemento de un alérgeno no específico podrían estar estrechamente enlazados [10]. Puesto que la producción elevada de IgE antialérgena se considera generalmente que desencadena reacciones alérgicas manifestadas clínicamente, entonces se concluye que los agentes activadores del complemento CD21 y CD23 en extractos alergénicos destinados a la inmunoterapia y la inducción de tolerancia son indeseables y deben ser eliminados en la medida de lo posible antes de que se produzca una inducción exitosa de la anergia de células T. El conocimiento de este requisito previo y su aplicación práctica es completamente nuevo y sin precedentes en la técnica anterior.

El reconocimiento de al menos dos grupos funcionalmente diferentes de compuestos orgánicos en los extractos alergénicos, es decir, por un lado taninas y melanoidinas (o "adyuvantes") activadores del sistema de complemento, que actúan de forma sinérgica con componentes de (glico)proteínas por otro lado, representa un nuevo y gran avance inesperado en la comprensión de enfermedades alérgicas mediadas por IgE en los seres humanos, que tiene repercusiones tecnológicas importantes para el diseño y la producción de nuevos medicamentos. De ello se deduce, por ejemplo, que para la producción de composiciones de epítopos de células T tolerogénicas que no conducen a la inducción de anticuerpos IgE, la materia prima alergénica debe ser desprovista en la medida de lo posible de factores activadores del complemento.

Aparte de sus propiedades activadoras del complemento, las taninas y melanoidinas ejercen otros efectos indeseables. Estos compuestos adsorben fuertemente la mayoría de las proteínas por interacciones múltiples de unión de hidrógeno e hidrofóbicas, protegiendo así a las proteínas del ataque enzimático. Por el contrario, las taninas y las melanoidinas inhiben una gran variedad de enzimas que operan a valores de pH fisiológicos neutros o ligeramente alcalinos, incluyendo las serino proteinasas tripsina, quimiotripsina y calicreína [11]. Puesto que las fuerzas físicas implicadas en la interacción tanina/melanoidina - proteína descendieron reversiblemente a cero en los valores de pH por debajo de 2.5, la proteinasa elegida para la producción enzimática de los epítopos de células T de macromuléculas alergénicas es la enzima gástrica pepsina con actividad óptima de pH 2. Con este valor de pH, las taninas y melanoidinas (que tienen un tamaño molecular máximo de aproximadamente 5 kDa) se separan de las proteínas y pueden ser eliminadas por diálisis o ultrafiltración. Por consiguiente, es absolutamente vital que el proceso de digestión enzimática con pepsina para la fragmentación de alérgeno esté precedido por una fase de diálisis de medio ácido (pH inferior a 2.5) en ausencia de enzimas para eliminar las taninas y/o melanoidinas interfirientes sin que afecte a las estructuras de proteínas alergénicas. En caso de que estas sustancias polihidroxílicas activadoras de complemento no se eliminaran antes del proceso de digestión péptica, volverían a asociarse con los péptidos de células T tras la neutralización y las volverían indisponibles en el producto farmacéutico final. La materia prima candidata para la fragmentación enzimática puede, por tanto, comprender los alérgenos "despigmentados" preparados a pH 2 en ausencia de enzima y descritos detalladamente en la patente europea número EP 0 662 080 B1. Las taninas y/o melanoidinas pueden ser eliminadas en una fase de diálisis a través de membranas de 5 kDa.

Como se detalla en EP 0 662 080 B1, el proceso de despigmentación de proteínas alergénicas en solución diluida de ácido clorhídrico o sulfúrico a pH 2.0 \pm 0.1 elimina una proporción considerable (15-60% en peso, dependiendo del material de la fuente) de los componentes disueltos >10 kDa en extractos alergénicos por diálisis o ultrafiltración directamente del medio ácido a través de membranas de corte de 10 kDa. Por tanto, el tamaño molecular de los componentes desorbidos está en un intervalo inferior a 10 kDa, incluyendo las taninas naturales, (eu)melaninas y melanoidinas que poseen normalmente una masa molecular de alrededor de 5 kDa. Si esta fase de diálisis de ácido preventiva no se aplica antes de la fase de digestión, p. ej. una fase de digestión con pepsina añadida, como no fue incorporado en los procedimientos descritos en en patente estadounidense 4,469, 667 y patente europea EP 0113712 B1, la neutralización de la solución acídica en el caso de la pepsina después de la hidrólisis a pH 2 causará la reasociación de complejos de péptidos-taninas como se ha mencionado anteriormente, protegiendo así a los epítopos de células T deseados del reconocimiento posterior por el sistema inmune celular. Si no se eliminan las taninas y las melanoidinas antes de la digestión enzimática, la potencia activadora de complemento del producto final quedará inafectada y llevará a la estimulación indeseada de la síntesis de IgE después de la aplicación humana.

A pesar de un proceso de despigmentación ejecutado correctamente, las estructuras polifenólicas y las de tipo Maillard unidas químicamente pueden ser a menudo identificadas de forma química y espectroscópica, incluso en proteínas alergénicas despigmentadas adecuadamente [12]. Tales derivados polifenólicos y de carbohidratos conjugados forman una parte íntegra de la estructura molecular de los alérgenos de proteínas y no pueden ser eliminados en medio ácido. De hecho, se ha demostrado que tales cadenas laterales no proteínicas pueden, incluso como haptenos, formar parte de los sitios de epítopos de células B reconocidos por los anticuerpos IgE y IgG específicos, como se describe en la patente estadounidense 5,384,395 y la patente europea EP A 0,387,952. De hecho, la eliminación de taninas y melanoidinas absorbidas físicamente por el proceso de despigmentación de EP 0 662 080 B1 ayuda a desenmascarar estas estructuras hapténicas conjugadas de proteínas, que en la mayoría de los alérgenos dan lugar a un ligero aumento en la unión de anticuerpos IgE específicos. Por otro lado, la distribución hapténica y la densidad en el portador de antígenos de proteínas puede ser tal que las preparaciones despigmentadas (HMW-D) >10 kDa particulares no pueden ser fácilmente hidrolizadas enzimáticamente, como se ha informado de los alérgenos del polen de la Parietaria judaica [12]. A diferencia de lo que ha sido implicado en la patente europea EP 0113712 B1, la facilidad de digestión enzimática por la pepsina resultó ser diferente entre las diferentes preparaciones de alérgenos despigmentados >10 kDa, lo que significa que las condiciones de la hidrólisis enzimática deben adaptarse dependiendo de la fuente de alérgeno. Como se muestra en los ejemplos de la figura 1 de la solicitud de patente dependiente, el nivel de apariencia de los grupos amino libres de péptidos determinados con un reactivo de ninhidrina durante la digestión de pepsina muestra de hecho marcadas variaciones entre las distintas preparaciones de polen alergénico.

Las estructuras hapténicas dominantes se encuentran incorporadas en los esqueletos de proteínas alergénicas, que o bien pertenecen al grupo de los flavonoides polihidroxílicos y otros polifenoles, que bajo condiciones oxidantes forman fuertes enlaces de tioéter con residuos de cisteína en la macromolécula de proteína, o bien representan productos de reordenamiento químico de hexosas o pentosas enlazadas a los grupos e-amino de cadenas laterales de lisina [1]. Tanto las estructuras hapténicas enlazadas a S y a N(e) absorben la luz ultravioleta en el rango de 300-350 nm, donde la absorción de la proteína pura es insignificante. Como se ilustra en los ejemplos de la figura 2, una relación inversa se observa, de hecho, entre la densidad de hapteno aproximada por espectroscopia de UV y el nivel de digestión de los complejos de hapteno-proteína alergénicos por pepsina, según está medido en términos de grupos amino libres reactivos a la ninhidrina liberados.

En algunos casos de preparaciones de HMW-D altamente resistentes a la pepsina, se puede observar por métodos electroforéticos que, a pesar de la escasez de grupos amino libres liberados (fig.1), es, sin embargo, evidente la fragmentación por la pérdida de ingredientes de proteínas detectables. En el ejemplo del polen de Parietaria, la fragmentación bien cortada puede también ser demostrada por la pérdida de potencia activadora del complemento, pero no de la unión de IgE, en los fragmentos enzimáticos (Fb-D) por un factor de al menos 100. En vista de las fuertes propiedades de reducción de elementos estructurales del azúcar del polifenol o de la lisina, la oxidación es un requisito previo esencial para la plena eliminación de la unión de IgE y sitios activadores del complemento. La oxidación de preparaciones HMW-D antes de la fragmentación se realiza usando una variedad de agentes químicos, p. ej., con sales de peryodato (véase más adelante). No obstante, con el fin de proteger los epítopos de células T de posibles carbohidratos, el método de elección es la oxidación mediante irradiación ultravioleta, que ha sido mostrada para disminuir tanto el activador del complemento como las potencias de unión de IgE (13). En el caso de las preparaciones HMW-D del polen de algunas malezas, árboles y hierbas una fase de oxidación suplementaria puede ser introducida, por tanto, después de la despigmentación pero antes de la fragmentación (véase más adelante).

La fragmentación enzimática y los procedimientos de oxidación según la invención son aplicables a todos los ambientes alergénicos conocidos, materiales internos y externos, incluidos los ácaros, insectos, mohos, el polen de las familias de las hierbas, malas hierbas y árboles, polvos orgánicos en entornos profesionales, etc. Estos materiales pueden ser extraídos y sometidos a un proceso de despigmentación, tal como se describe p. ej. en EP 0 662 080 B1. La siguiente elección correcta de las condiciones de fragmentación (preoxidación, proporción de enzima a sustrato, periodo de hidrólisis enzimática, etc.) para obtener la degradación proteolítica de la materia alergénica en el extracto puede depender de la verificación experimental preliminar debido a la naturaleza del material de la fuente. Tal elección es una cuestión rutinaria para un experto en la materia y puede llevarse a cabo sin excesivo esfuerzo.

La preparación propuesta de los epítopos de células T naturales sigue una serie de fases que son ejemplificadas en el procedimiento descrito en el ejemplo. En términos generales el método según la invención es un método para producir un extracto proveedor de tolerancia aplicado a un individuo con el fin de proporcionar tolerancia contra el material alergénico, dicho método comprendiendo:

a)

la extracción del material de la fuente alergénica

b)

la eliminación de material con una masa molecular inferior a 3,5 kDa, dando lugar así la fracción HMW-N, opcionalmente liofilizando HMW-N

c)

la eliminación de las taninas y melanoidinas que están físicamente conectadas al material alérgeno en HMW-N de la fracción, dando así la fracción libre despigmentada HMW-D de taninas y melanoidinas libres y taninas y melanoidinas no conjugadas, opcionalmente liofilizando HMW-D

d)

la oxidación de HMW-D, suministrando de este modo la fracción HMW-Dox,

e)

la degradación de la proteína presente en la fracción HMW-Dox produciendo así fragmentos con una masa molecular entre 1 y 10 kDa, dicho producto de la fase d) siendo Fb-D, las operaciones de las fases a-d son ejecutadas de manera conocida per se para dichas fases.

La invención también comprende un extracto de material de la fuente alergénica comprendiendo fragmentos de alérgenos que conservan sus epítopos estimuladores de linfocitos T naturales pero sin epítopos de unión de IgE, como máximo desprovistos de agentes activadores del complemento, y seguros para el uso como composiciones para inducir un estado de anergia específica de células T y tolerancia inmunológica en seres humanos alérgicos. El extracto según la invención puede ser derivado de fuentes alergénicas seleccionadas de un medio conocido, materiales alergénicos internos o externos, incluyendo los insectos, ácaros, mohos, polen de hierbas, malas hierbas, flores, arbustos o árboles y de materiales alergénicos en los entornos profesionales.

Preferiblemente tal extracto es uno donde la potencia de unión de IgE de los fragmentos de alérgeno expresados como la cantidad de material liofilizado requerido para el 50% de inhibición de la unión de IgE bajo condiciones de ensayo estándares es al menos 100 veces inferior a la de un extracto no tratado en el mismo disolvente y bajo las mismas condiciones. De forma alternativa o en combinación con el extracto mencionado según la invención es uno donde la potencia activadora del complemento de los fragmentos de alérgeno expresados por ejemplo como la cantidad de material liofilizado para provocar una pérdida del 50% de complemento hemolítico humano, es al menos 100 veces inferior que el de un extracto no tratado en el mismo disolvente y bajo las mismas condiciones.

El extracto según la invención en cualquiera de las formas de realización mencionadas arriba puede ser uno, donde el índice de estimulación de linfocitos T de los fragmentos de alérgeno sea un 50-150% respecto al de un extracto no tratado en el mismo disolvente y bajo las mismas condiciones. En particular, el extracto según la invención es uno donde los fragmentos de alérgeno poseen una masa molecular entre 1 kDa y 10 kDa, según lo determinado por diálisis de una solución acuosa de pH 7.0 a través de las membranas de tales valores de corte nominales. El extracto según la invención está desprovisto de taninas, melanoidinas y otros pigmentos libres y/o adsorbidos por la proteína.

Resumidamente, una preparación obtenible según el método de la invención como se describe recae también en el campo de la invención. Según la invención tal preparación estará disponible de manera adecuada en una forma de dosificación aceptable farmacéuticamente para la aplicación a seres humanos y/o animales.

Según la invención el uso de una preparación como componente activo de un medicamento para el tratamiento de un individuo alérgico con el objetivo de inducir tolerancia a la sustancia natural alergénica de la cual es derivada la preparación, se considera también una forma de realización adecuada de la invención.

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Ejemplo que ilustra la extracción, despigmentación y fragmentación en un proceso según la invención A. Preparación de HMW-N

Los materiales de la fuente alergénica seca como el polvo del polen de las plantas, caspa de animales, los cultivos gastados de ácaros o los cuerpos secos de ácaros limpios u otros cuerpos de insecto son suspendidos en una solución de tampón fosfato pH 7.0 de 0,01 M, conteniendo 0,15 M de NaCl (PBS). La extracción se realiza dos veces sin dejar de agitarse en un lugar frío a +4ºC, es decir, en la primera realización durante 4h, donde se vuelve a extraer el residuo tras la centrifugación durante 18 h y se centrifuga. Los extractos combinados se ponen en tratamiento de diálisis en 5 volúmenes de agua destilada usando un sistema Pellicon® equipado con membranas de corte nominal del 0 kDa (Ref: Millipore®, PLBC 000 05). El retenido dializado >10 kDa se seca posteriormente mediante liofilización para obtener >10 kDa del producto alérgeno bruto HMW-N. En determinados casos, es decir donde se conoce la existencia de alérgenos "menores" inferiores a 10 kDa, las membranas de 10 kDa pueden ser sustituidas por placas de diálisis de 3,5 kDa.

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B. Preparación de HMW-D

Los detalles del procedimiento de despigmentación están establecidos en EP 0 662 080 B1. Brevemente, el producto liofilizado HMW-N apartado A) es disuelto a temperatura ambiente en agua destilada a una concentración de 10 mg/ml. A esta solución se le añade a temperatura ambiente y con agitación constante 2 N de HCl y 0.1 N de HCl acercándose al punto de referencia, con el fin de disminuir el pH hasta 2.0 \pm 0.1; se continúa agitando durante al menos 15 minutos. Las sustancias cromofóricas o "pigmentos" desorbidas en el medio ácido de HMW-N se eliminan después por diálisis o ultrafiltración repetidas en un lugar frío a 4ºC durante al menos 17 h contra diferentes cambios de agua destilada a través de membranas de corte de 10 kDa, donde el pH de la solución de retenido de >10 kDa aumenta a aproximadamente 3.5. Después de una diálisis exhaustiva, la solución de retenido se lleva a pH 7.0 \pm 0.1, mediante la adición de 1,0 - 0,1 N de NaOH. La solución neutralizada se centrifuga finalmente, se pasa a través de un filtro estéril de 0.2 \mum y se seca mediante liofilización para obtener el producto alergénico despigmentado HMW-D.

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C. Preparación de HMW-Dox

En un prototipo de procedimiento, una muestra de HMW-D liofilizada se disuelve en 0.05 M (50 mM) de sodio meta-peryodato a pH 5.3 sin dejar de agitar durante 1 h a temperatura ambiente. La solución se pasa después a través de una pequeña columna de Sephadex® G25 en agua destilada y las primeras fracciones de eluato provenientes de la columna son agrupadas y liofilizadas para obtener la preparación oxidada HMW-Dox. La potencia de las preparaciones oxidadas es determinada en comparación con los productos originales HMW-D por medio del consumo del complemento hemolítico y por inhibición de la unión de anticuerpos IgE específicos según las técnicas establecidas. Un ejemplo para el caso de HMW-D de polen de Parietaria judaica se observa en la Tabla I. Para evitar la contaminación con productos químicos residuales o productos de fisura indeseada, se debería, no obstante, dar preferencia a la oxidación de HMW-D en solución acuosa por irradiación con luz ultravioleta como se describe en la técnica anterior (13).

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D. Preparación de fragmentos enzimáticos Fb-D

En el procedimiento propuesto para obtener los péptidos de epítopos de células T naturales o péptidos de haptenos derivados de la digestión de la proteína, las materias primas son las preparaciones despigmentadas obtenidas de HMW-D según los procesos descritos en el apartado B) y en la patente europea EP 0 662 080 B1 o HMW-Dox descrito en el apartado C). El procedimiento para obtener los fragmentos enzimáticos Fb-D de ambas materias primas es idéntico y se detalla a continuación.

El material liofilizado despigmentado HMW-D (o HMW-Dox) es disuelto en 10 volúmenes de agua bidestilada y puesto en un recipiente de doble pared que permite la circulación del agua a 37 \pm 1ºC a través de la pared externa e interna mediante una bomba peristáltica durante el periodo de digestión. A esta solución se añade con una agitación constante 2 N de HCl para llevar el pH a aproximadamente 2.5. La enzima proteolítica pepsina en la forma inmovilizada asociada al 4% de Sepharose® (Sepharose-pepsin, Sigma Chemical Co., St.Louis, EEUU, Ref. cat. P-3286) se añade después en forma de polvo seco en una proporción de 4 unidades de actividad de pepsina por mg de HMW-D (es decir, aproximadamente 1:5 de enzima/sustrato p/p o difeferente, dependiendo de la fuente alergénica). La suspensión es ajustada luego a pH 2.0 \pm 0.1. mediante la adición por goteo de 0.1 N de HCl y se continua agitando durante al menos 6 horas a 37 \pm 1ºC, manteniendo el valor de pH de la mezcla a 2.0 \pm 0.1 por control automático de pH-stat. Al final del periodo de digestión, la mezcla es neutralizada a pH 7.0 con 2.0 N-0.1 N de NaOH y luego filtrado a través de una membrana 0.4 pM para eliminar las partículas enzimáticas. A continuación se añade agua destilada para dar el doble de volumen final que el de la solución original, seguido de diálisis en un sistema de flujo tangencial Minitan® equipado con una membrana de filtro millipore de 10 kDa. El líquido externo (tamaño molecular M<10 kDa) es recogido y el fluido interno que contiene los endofragmentos Fa-D >10 kDa es descartado. Para fines de ilustración algunos detalles analíticos de los endofragmentos Fa-D >10 kDa, ampliamente compuestos por heteropolisacáridos, están provistos en la Tabla I del presente documento. El material M<10 kDa es ciclado a través de otra fase de diálisis Minitan usando una membrana de 1 kDa, donde el retenido >1 kDa se mantiene y el líquido externo se descarta. La solución de retenido es finalmente pasada por un filtro estéril a través de membranas de filtro de 0,22 pM y liofilizadas para proporcionar el producto de fragmento deseado 1 kDa >Fb-D<10 kDa.

Los rendimientos y características espectroscópicas de las materias primas HMW-N, las preparaciones intermedias HMW-D (o HMW-Dox), los indigeridos (ampliamente >10 kDa heteropolisacáridos) por productos Fa-D y los productos finales deseados Fb-D se muestran colectivamente por una serie de materiales de fuentes alergénicas representados en la Tabla II.

Control de proceso

El progreso de digestión enzimático es vigilado por la liberación de grupos amino libres. En intervalos regulares durante el proceso de hidrólisis enzimática, las muestras de 0,5 ml son retiradas de las mezclas de pepsina/proteína, ajustadas a una concentración final de 0,5 mg/ml en el tampón de acetato sódico pH 5.5 de 4 N y después calentadas durante 15 min a 100ºC con 50 \mul del 2% de ninhidrina en acetato de metilcellosolve tamponado. Tras el enfriamiento, la absorbencia es leída en 541 nm frente a un blanco reactivo. Ejemplos representativos de curvas de digestión cinética basadas en la liberación de grupos amino libres se ilustran colectivamente en la figura 1.

Como se observa en la figura 1, la liberación de grupos amino libres detectables con algunas preparaciones alergénicas puede ser muy baja (p. ej., Parietaria, Artemisia, Ambrosía). No obstante, esta necesidad no significa que la fragmentación bajo la influencia de pepsina no se realice porque, a excepción del polen de Parietaria Judaica [12], los fragmentos enzimáticos Fb-D de estos productos alergénicos tienen que perder un grado considerable de su capacidad de unión para anticuerpos IgE específicos, es decir, sus epítopos de células B (Tabla II). Se puede asumir que el reactivo de ninhidrina puede a veces ser bloqueado por cadenas laterales de péptidos polifenólicos. No obstante, el punto importante en el control del producto es que los productos del fragmento final Fb-D deben ser seleccionados para la pérdida de la unión de IgE y la potencia activadora del complemento, junto con las propiedades no disminuidas que estimulan las células T.

Control del producto final Unión de anticuerpos IqE alérgeno específicos

La capacidad in vitro de los productos finales de Fb-D para combinar con anticuerpos de clase IgE específicos es controlada por cualquiera de los procedimientos de inhibición establecidos, usando los sueros de pacientes alérgicos específicamente sensibilizados. La potencia de los fragmentos de unión IgE, expresada como la cantidad de material seco para provocar el 50% de inhibición de la unión bajo condiciones de ensayo estándares, debe ser al menos 100 veces inferior a aquella de la preparación HMW-D o HMW-Dox del progenitor bajo condiciones idénticas, es decir, una reducción igual o inferior al 1% con respecto a la materia prima antes de la fragmentación. Algunos datos representativos obtenidos con las preparaciones no oxidadas de HMW-D se ilustran colectivamente en la tabla III.

Activación del complemento

La capacidad in vitro de los productos finales Fb-D para activar el sistema del complemento es establecida por ensayos hemoliticos o inmunoensayos enzimáticos, según procedimientos publicados (8,13). La potencia activadora del complemento de los fragmentos, expresada por ejemplo como la cantidad de material seco para provocar una pérdida del 50% de complemento hemolítico, debe ser al menos 100 veces inferior a aquella de la preparación HMW-D o HMW-Dox progenitora evaluada bajo condiciones idénticas, es decir, una reducción igual o inferior al 1% de la potencia de la materia prima antes de la fragmentación.

Estimulación de células T

Para verificar la aplicabilidad de los productos finales Fb-D como preparaciones viables que retienen los epítopos esenciales de células T, los fragmentos Fb-D son examinados para su capacidad para inducir proliferación de linfocitos T aislados de la sangre de pacientes específicamente alérgicos según procedimientos inmunológicos establecidos. El índice de estimulación de células T de los fragmentos finales debería situarse entre el 50-150% con respecto a la preparación HMW-D progenitora. La figura 3 resume algunos datos representativos acerca de los fragmentos pépticos Fb-D obtenidos por la fragmentación de una preparación HMW-D aislada de cultivos de ácaros tropicales Blomia tropicales altamente alergénicos.

Metodologías variadas

Todos los productos finales Fb-D son sometidos rutinariamente a procedimientos de control adicionales, por ejemplo por isoelectroenfoque en gel de poliacrilamida presente en Ampholines® en la gama de pH 3-10, que en contraste con las preparaciones HMW-D progenitoras no revela ninguna banda constituyente detectable con las manchas de proteína habitual. La separación electroforética en geles de poliacrilamida que usan dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en presencia de tricina (N-2-hidroxi-1.1.bis[hidroximetiletil]glicina) revela modelos de distribución de bandas de tinción Coomassie Blue que son totalmente distintos de aquellos observados con las preparaciones HMW-D progenitoras y que pueden ser usadas para verificar la reproductibilidad del proceso de producción.

Una catalogación de datos analíticos para algunas preparaciones alergénicas representativas se muestran en las Tablas II y III.

Patentes

* Compuestos tóxicos primarios o alérgenos, que pueden ser aislados de material vegetal al igual que métodos para su preparación y aplicación. Inventor: Berrens, L. Número de patente europea A 0,387,952. Concedida en 1995.

* Método para el aislamiento de compuestos tóxicos primarios o alérgenos de material vegetal. Inventor: Berrens, L. Patente estadounidense 5,384,395. Fecha de patente: 24-01-1995

* Proceso para la purificación de extractos acuosos que contienen proteínas alergénicemente activas, extractos obtenibles según este proceso al igual que su uso. Inventor: Berrens L. Número de patente europea EP 0 662 080 B1, fecha de concesión: 5-02-1997. Fecha de solicitud: 21-09-1992.

* Fracción inmunosupresora de polen de polipéptidos activos. Michael JG, Pesce AJ (inventores). Patente estadounidense 4,338,297, fechada 06-07-1982. Fecha de solicitud: 14-04-1980.

* Fracción inmunosupresora de polen de polipéptidos activos. Michael JG, Pesce AJ (inventores). Patente Europea EP 0113712 B1, basada en solicitud Internacional número PCT/US82/00886, fecha de solicitud 30-06-1982, fecha de publicación del documento de patente 15-03-1989.

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TABLA I

1

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TABLA II Análisis de fragmentos alergénicos pépticos

2

3

Los fragmentos Fb-D de 1 kDa < M < 10 kDa comprenden los productos finales deseados.

TABLA II Análisis de fragmentos alergénicos pépticos

4

5

Los fragmentos Fb-D de 1 kDa < M < 10 kDa comprenden los productos finales deseados.

TABLA III

6

Leyendas de las figuras

figura 1: cinética de la liberación de grupos amino libres ninhidrina-reactivos de una serie representativa de preparaciones alergénicas HMW-D hidrolizadas enzimáticamente por pepsina. Condiciones: véase en el texto.

figura 2: relación inversa entre la digestibilidad de preparaciones HMW-D de polen por pepsina (es decir, la ninhidrina adquiere color después de 6 h de hidrólisis a 37ºC y pH 2), y los coeficientes de extinción E(1%, 1 cm) a 325 nm tomados de los espectros ultravioleta en 0,01 M tampón de fosfato pH 7.0.

figura 3: Proliferación de células T en cultivos de linfocitos periféricos (incorporación de timidina radiactiva, unidades relativas) de la sangre de (a) pacientes específicamente alérgicos y (b) controles de salud negativos en la prueba de piel sobre la estimulación por la preparación despigmentada HMW-D y los fragmentos Fb-D preparados a partir de extractos de Blomia tropicalis.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

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Documentos de patente citados en la descripción

EP 9601733 W, 1996 [0003]

GB 1492973 A [0003]

EP 0367306 A [0003]

EP 0038154 B [0003]

GB 1282163 A [0003]

GB 1578348 A [0003]

US 4469667 A [0003] [0015]

EP 0113712 B1 [0003] [0015] [0016] [0038]

WO 9406821 A [0004]

EP 0662080 B1 [0014] [0015] [0016] [0019] [0026] [0028] [0038]

US 5384395 A [0016] [0038]

EP 0387952 A [0016] [0038]

US 4338297 A, Michael JG, Pesce AJ, 1980 [0038]

US 8200886 W, 1982 [0038]

Bibligrafía distinta de patentes citada en la descripción

\bulletBERRENS L. The Chemistry of Atopic Allergens. Monographs in Allergy, 1971, vol. 7, [0039]

\bullet Immunological Intervention Strategies in Allergy. Biochem Soc Trans 1997. vol. 25, 383-403 [0039]

\bullet VAN NEERVEN RJJ; EBNER C; YSSEL H; KAPSENBERG ML; LAMB JR. T-cell responses to allergens: epitope-specificity and clinical relevance. Immunology Today, 1996, vol. 17, 526-32 [0039]

\bulletSIMONS FER; IMADA M; LI Y.; WATSON WTA; HAYGLASS KT. Fel d 1 peptides: Effect on skin tests and cytokine synthesis in cat-allergic human subjects. Int Immunology, 1996, vol. 8, 1937-45 [0039]

\bulletNICODEMUS C; PHILIP G; JONES N; HIRANI S; NORMAN P. Integrated clinical experience with tolerogenic peptides. Int Arch Allergy Immunol, 1997, vol. 113, 326-8 [0039]

\bulletLITWIN A; PESCE A; MICHAEL JG. Regulation of the immune response to allergens by immunosuppressive allergenic fragments. I. Peptide fragments of honeybee venom phospholipase A2. Int Arch Allergy Appl Immunol, 1988, vol. 87, 361-6 [0039]

\bulletLITWIN A; PESCE AJ; FISCHER T; MICHAEL M; MICHAEL JG. Regulation of the human immune response to ragweed pollen by immunotherapy. A controlled trial comparing the effect of immunosuppressive peptic fragments of short ragweed with standard treatment. Clin Exp Allergy, 1991, vol. 21, 457-65 [0039]

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\bulletSUTTON BJ; GOULD HJ. The human IgE network. Nature, 1993, vol. 366, 421-8 [0039]

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\bulletBERRENS L; HÉNOCQ E; RADERMECKER M. Photoinactivated allergens. I. Preparation, physicochemical and biological properties. Clin Allergy, 1973, vol. 3, 449-59 [0039]

Claims (15)

1. Método para producir un extracto proveedor de tolerancia aplicado a un individuo con el fin de proporcionar tolerancia contra el material alergénico, dicho método comprende:

a) la extracción del material de la fuente alergénica

b) la eliminación de material con una masa molecular inferior a 3,5 kDa, dando lugar a la fracción HMW-N, opcionalmente liofilizando HMW-N

c) la eliminación de taninas y melanoidinas que están conectadas físicamente al material alérgeno en HMW-N de la fracción, dando lugar así a la fracción libre HMW-D despigmentada de taninas y melanoidinas libres y taninas y melanoidinas no conjugadas, opcionalmente liofilizando HMW-D

d) la oxidación de HMW-D, suministrando así la fracción HMW-Dox,

e) la degradación de la proteína presente en la fracción HMW-Dox produciendo así fragmentos con una masa molecular entre 1 y 10 kDa, dicho producto de la fase e) siendo Fb-D.

2. Método según la reivindicación 1, donde el material de la fuente alergénica es seleccionado de material interno y externo de un entorno alergénico incluidos insectos, ácaros, mohos, polen de hierbas, malas hierbas, flores, arbustos y árboles, polvos orgánicos en medios ocupacionales.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, donde la fase a) comprende la suspensión del material de la fuente alergénica en tampón fosfato, seguido de diálisis contra agua destilada usando una membrana semipermeable con un límite de corte de 3,5 kDa en la fase b).

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la fase b) comprende la eliminación de material con una masa molecular inferior a 10 kDa, cuando los alérgenos denominados "menores" con PM por debajo de 10 kDa son conocidos por estar ausentes en el material de la fuente alergénica, dando lugar así a la fracción HMW-N.

5. Método según la reivindicación 4, donde la fase a) comprende la suspensión del material de la fuente alergénica en tampón fosfato, seguido de la extracción contra agua destilada usando diálisis con un corte de 10 kDa en la fase b).

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la fase c) comprende una fase de despigmentación donde el pH es reducido a un nivel por debajo de 2.5, seguido de una fase para asegurar la eliminación de taninas libres, melanoidinas y otros pigmentos, suministrando así una preparación HMW-D desprovista de tales compuestos por diálisis usando al menos una membrana semipermeable de un valor de corte de tamaño molecuar específico.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la fase c) comprende una fase de despigmentación donde el pH es reducido a un nivel inferior a 2.5 seguido de una fase suficiente para asegurar la eliminación de la fracción resultante con taninas y melanoidinas libres suministrando así una preparación HMW-D libre de taninas y melanoidinas libres por diálisis sobre una membrana con un límite de corte de 10 kDa, reteniendo así la fracción con una masa molecular inferior a 10 kDa.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la fase c) comprende una fase final de ajuste de la solución HMW-D a un valor de pH neutro.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la fase e) comprende la degradación enzimática de la proteína.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la fase e) comprende la degradación proteolítica con pepsina, donde las condiciones de la fragmentación correcta son elegidas según la variación dependiendo de la naturaleza del material de la fuente y la pepsina seleccionada.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la fase e) comprende la degradación proteolítica con la pepsina de proteinasa ácida.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la fase e) comprende el seccionamiento proteolítico por pepsina, seguido de la retención de una fracción con masa molecular inferior a 10 kDa, como puede ser obtenido por diálisis sobre una membrana con un corte de 10 kDa.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la fase de oxidación se obtiene mediante irradiación de la solución HMW-D con luz ultravioleta.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde la fase de oxidación comprende el tratamiento de HMW-D con metaperyodato de sodio seguido de la purificación para eliminar el exceso de oxidante por tamizado molecular.

15. Extracto obtenible por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para el uso como un componente activo de un medicamento para el tratamiento de un individuo alérgico, con el objetivo de inducir la tolerancia a la sustancia alergénica natural, de la cual se deriva la preparación.