ES2294018T3

ES2294018T3 - Compuestos y metodos para el tratamiento y diagnostico de la infeccion con clamidias.

Info

Publication number: ES2294018T3
Application number: ES01959114T
Authority: ES
Inventors: Steven P. Fling; Yasir A. W. Skeiky; Peter Probst; Ajay Bhatia
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 2000-07-20
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2008-04-01
Anticipated expiration: 2021-07-20
Also published as: AU2001280702B8; AU8070201A; EP1307564A2; IL153904A0; US20040234536A1; US20080317772A1; HUP0400477A2; HK1067381A1; US7462357B2; CN1489628A; WO2002008267A3; IL153904A; CZ2003480A3; PL209107B1; US20120114684A1; ATE373092T1; NO20030252L; US20110142872A1; US20090028887A1; KR20030016423A

Abstract

Una composición que comprende: (a) un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431, o una variante de la misma que tiene al menos un 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de SEQ ID NO: 431; o (b) un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a); para emplear en la estimulación de una respuesta inmune en un paciente.

Description

Compuestos y métodos para el tratamiento y diagnóstico de la infección con clamidias.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a la detección y al tratamiento de la infección con clamidias. En particular, la invención se refiere a composiciones que comprenden polipéptidos que comprenden un antígeno de Chlamydia y al uso de tales polipéptidos para el serodiagnóstico y el tratamiento de la infección con clamidias.

Antecedentes de la invención

Las clamidias son agentes patógenos bacterianos intracelulares que son responsables de una amplia variedad importante de infecciones humanas y animales. Chlamydia trachomatis es una de las causas más comunes de las enfermedades de transmisión sexual y puede conducir a la enfermedad inflamatoria pélvica (PID) que puede producir obstrucción tubárica y esterilidad. La Chlamydia trachomatis puede tener también un papel importante en la esterilidad masculina. En 1990, el coste del tratamiento de la PID en los EE.UU. se estimaba que eran 4 billones de dólares. El tracoma, debido a la infección ocular con Chlamydia trachomatis, es la causa principal de ceguera que puede prevenirse a nivel mundial. Chlamydia pneumonia es una de las causas principales de infecciones agudas de las vías respiratorias en humanos y también se cree que tiene un papel en la patogénesis de la aterosclerosis y, en particular, en la enfermedad coronaria. Se ha observado que los individuos con un título elevado de anticuerpos contra Chlamydia pneumonia, tienen al menos dos veces más probabilidad de contraer la enfermedad coronaria que los individuos seronegativos. Las infecciones con clamidia constituyen, por tanto, un problema sanitario importante, tanto en los EE.UU. como a escala mundial.

La infección con clamidias es frecuentemente asintomática. Por ejemplo, cuando una mujer busca atención médica debido a PID, puede haber tenido lugar ya un daño irreversible, dando como resultado la esterilidad. Por ello continua siendo necesario en la técnica la búsqueda de vacunas mejoradas y composiciones farmacéuticas para la prevención y el tratamiento de las infecciones con clamidia. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona adicionalmente otras ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona composiciones para la terapia de la infección con clamidias. En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden polipéptidos que comprenden un antígeno de
Chlamydia que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 431, o una variante de dicho antígeno que tenga al menos un 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de SEQ ID NO: 431, para emplear en la estimulación de una respuesta inmune en un paciente y para uso en el tratamiento o la prevención de la infección con clamidias. Ciertas variantes son inmunógenas, de modo que la capacidad de la variante para reaccionar con los antisueros específicos del antígeno no disminuye sustancialmente. En ciertas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID
NO: 407.

La presente invención proporciona adicionalmente composiciones que comprenden polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431, para uso en la estimulación de una respuesta inmune en un paciente y para emplear en el tratamiento o la prevención de la infección con clamidias, por ejemplo, la composición comprende un polinucleótido que comprende o que consta de la secuencia de SEQ ID NO: 407.

En otro aspecto, la presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431 o, alternativamente, un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431 y un antígeno de clamidia conocido, así como polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión, junto con un vehículo fisiológicamente aceptable o un agente inmunoestimulante para uso como composiciones farmacéuticas y como vacunas de la misma.

En otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o varios polipéptidos de clamidia que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431, p. ej., un polipéptido según SEQ ID NO: 431 o una molécula de polinucleótido que codifica dicho polipéptido, tal como un polinucleótido según SEQ ID NO: 407 y un vehículo fisiológicamente aceptable. La invención también proporciona vacunas para fines profilácticos y terapéuticos que comprenden uno o varios polipéptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431 y un agente inmunoestimulante, tal y como se define en esta memoria, junto con vacunas que comprenden una o varias secuencias de polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos y un agente inmunoestimulante.

También se proporciona el uso de (a) un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431; o (b) un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a); en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la infección con clamidias.

También se proporciona el uso de (a) un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431; o (b) un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a); para la detección de una infección con clamidias en un paciente.

Adicionalmente, se proporciona el uso de (a) un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431; o (b) un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a); en la fabricación de un equipo de reactivos para diagnóstico para detectar la infección con clamidias en un paciente.

Identificadores de secuencia

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ADN determinada para el clon de C. trachomatis 1-B1-66.

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de ADN determinada para el clon de C. trachomatis 10-C10-31.

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos prevista para 1-B1-66.

SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos prevista para 10-C10-31.

SEQ ID NO: 31 es la secuencia de aminoácidos para un péptido de consenso de 10meros procedente de CtC7.8-12 y CtC7.8-13.

SEQ ID NO: 39 es la secuencia de aminoácidos para el péptido CtSwib 52-67 procedente de C. trachomatis LGV II.

SEQ ID NO: 56 es la secuencia de ADN determinada para el clon de C. trachomatis LGV II, 14-H1-4, que comparte homología con el gen antioxidante específico de tiol, CT603.

SEQ ID NO: 57 es la secuencia de ADN determinada para el clon de C. trachomatis LGV II, 12-G3-83, que comparte homología con la proteína hipotética CT622.

SEQ ID NO: 59 es la secuencia de ADN determinada para el clon de C. trachomatis LGV II, 11-H4-28, que comparte homología con el gen dnaK, CT396.

SEQ ID NO: 60 es la secuencia de ADN determinada para el clon de C. trachomatis LGV II, 11-H3-68 que comparte homología parcial con la proteína virulenta P6P6-D y con el gen ribosómico L1, CT318.

SEQ ID NO: 62 es la secuencia de ADN determinada para el clon de C. trachomatis LGV II, 11-G10-46, que comparte homología con la proteína hipotética CT610.

SEQ ID NO: 87 es la secuencia de ADN determinada para el clon de C. trachomatis LGV II, 15-H2-76, que comparte homología parcial con los genes pmpD y SycE, y con el ORF CT089.

SEQ ID NO: 110 es la secuencia de ADN determinada para el clon de C. trachomatis LGV II, 21-G12-60 que contiene los marcos de lectura parcialmente abiertos para las proteínas hipotéticas CT875, CT229 y CT228.

SEQ ID NO: 111 es la secuencia de ADN determinada para el clon de C. trachomatis LGV II, 22-B3-53 que comparte homología con el ORF CT110 de GroEL.

SEQ ID NO: 114 es la secuencia de ADN determinada para el clon de C. trachomatis LGV II, 17-C10-31 que comparte homología parcial con el ORF CT858.

SEQ ID NO: 115 es la secuencia de ADN determinada para el clon de C. trachomatis LGV II, 21-C7-8 que comparte homología con el gen similar a dnaK.

SEQ ID NO: 407 muestra la secuencia de ADN serovar D de longitud completa del gen de Chlamydia trachomatis CT858.

SEQ ID NO: 431 muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa de serovar D del gen de Chlamydia trachomatis CT858.

Descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra los títulos del isotipo del anticuerpo en ratones C57B1/6, inmunizados con la proteína SWIB de C. trachomatis.

La Fig. 2 muestra las respuestas proliferativas de los linfocitos T específicos de Chlamydia en esplenocitos procedentes de ratones C3H inmunizados con la proteína SWIB de C. trachomatis.

La Fig. 3 muestra las respuestas proliferativas de SWIB específica de C. trachomatis, de una línea de linfocitos T primarios (TCT-10 EB) procedente de un donante asintomático.

La Fig. 4 ilustra la identificación de epítopos de linfocitos T en SWIB de C. trachomatis, con una línea de linfocitos T específicos del antígeno (TCL-10 EB).

Descripción detallada de la invención

Tal y como se ha indicado anteriormente, la presente invención se dirige directamente a composiciones para el tratamiento de la infección con clamidias. En un aspecto, las composiciones de la invención objeto incluyen polipéptidos que comprenden el antígeno de clamidia de la SEQ ID NO: 431 o una variante del mismo que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431.

Tal y como se emplea en esta memoria, el término "polipéptido" engloba cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo las proteínas de longitud completa (es decir, antígenos), en donde los residuos de aminoácidos están enlazados por enlaces peptídicos covalentes. Por tanto, un polipéptido que comprende una porción inmunógena de un antígeno, puede consistir completamente en la porción inmunógena o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales se pueden obtener a partir del antígeno natural de clamidia o pueden ser heterólogas, y tales secuencias pueden ser (pero no necesariamente) inmunógenas.

El término "polinucleótido(s)" tal y como se emplea en esta memoria, significa un polímero monocatenario o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos o de ribonucleótidos e incluye las moléculas de ADN y de ARN correspondientes, incluyendo las moléculas de ARNHn y ARNm tanto de la cadena codificante como de la no codificante y abarca el ADNc, el ADN genómico y el ADN recombinante, así como polinucleótidos sintetizados de forma completa o parcial. Una molécula de ARNHn contiene intrones y se corresponde con una molécula de ADN de forma generalmente biunívoca. Una molécula de ARNm se corresponde con una molécula de ARNHn y un ADN a partir del cual se han escindido los intrones. Un polinucleótido puede consistir en un gen completo o en cualquier porción del mismo. Los polinucleótidos no codificantes funcionales pueden comprender un fragmento del polinucleótido correspondiente y la definición de "polinucleótido" incluye, por tanto, todos los fragmentos no codificantes funcionales de este tipo.

Los polipéptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431, se pueden emplear generalmente de forma aislada o combinados, para detectar la infección con clamidias en un paciente.

Las composiciones y los usos de la presente invención también incluyen variantes de polipéptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431 y polinucleótidos que codifican tales moléculas de polipéptidos. Tales variantes pueden incluir, sin estar limitadas a las mismas, variantes alélicas presentes en la naturaleza de las secuencias de la invención. En particular, las variantes pueden incluir otros serovares de clamidia, tales como los serovares D, E y F, así como algunos serovares LGV que comparten homología con las moléculas de polipéptidos y de polinucleótidos descritas en esta memoria. Preferentemente, los homólogos serovares muestran 95-99% de homología con la(s) secuencia(s) de polipéptidos correspondiente(s), descrita(s) en esta memoria.

Un polipéptido "variante", tal y como se emplea en esta memoria, es un polipéptido que difiere del polipéptido expuesto, sólo por sustituciones y/o modificaciones conservadoras, de modo que las propiedades antigénicas del polipéptido se mantengan. En una realización preferida, los polipéptidos variantes difieren de una secuencia identificada por sustitución, deleción o adición de cinco aminoácidos o menos. Tales variantes se pueden identificar generalmente modificando la secuencia de polipéptidos de referencia y evaluando las propiedades antigénicas del polipéptido modificado, empleando, por ejemplo, los procedimientos representativos descritos en esta memoria. Con otras palabras, la capacidad de una variante para reaccionar con antisueros específicos de antígeno, se puede mejorar o permanecer sin cambios, en relación con la proteína natural, o puede disminuir en menos de 50% y preferentemente menos de 20%, en relación con la proteína natural. Tales variantes se pueden identificar generalmente modificando la secuencia del polipéptido de referencia y evaluando la reactividad del polipéptido modificado con anticuerpos específicos del antígeno o antisueros, tal y como se describe en esta memoria. Las variantes preferidas incluyen aquellas en las que se ha escindido una o varias porciones, tales como la secuencia líder N-terminal o el dominio transmembranal. Otras variantes preferidas incluyen variantes en las que se ha escindido una porción pequeña (p. ej., 1-30 aminoácidos, preferentemente 5-15 aminoácidos) del extremo N- y/o C-terminal de la proteína madura.

Tal y como se emplea en esta memoria, una "sustitución conservadora" es una sustitución en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de modo que un experto en la técnica de la química de péptidos, esperará que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido, permanezcan sustancialmente invariables. Las sustituciones de aminoácidos se pueden realizar generalmente basándose en la similitud de la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen la lisina y la arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares sin carga que tienen unos valores de hidrofilicidad similares, incluyen la leucina, la isoleucina y la valina; la glicina y la alanina; la asparagina y la glutamina; y la serina, la treonina, la fenilalanina y la tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservadores incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante puede contener también o alternativamente, cambios no conservadores. En una realización preferida, los polipéptidos variantes difieren de una secuencia natural por la sustitución, la deleción o la adición de 5 aminoácidos o menos. Las variantes se pueden modificar también (o alternativamente), por ejemplo, por deleción o adición de aminoácidos que tienen una mínima influencia en la inmunogenicidad, en la estructura secundaria y en la naturaleza hidropática del polipéptido. Las variantes pueden contener también, o alternativamente, otras modificaciones que incluyen la deleción o la adición de aminoácidos que tienen una mínima influencia sobre las propiedades antigénicas, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido se puede conjugar con una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína que dirige de forma cotransduccional o post-transduccional la transferencia de la proteína. El polipéptido también se puede conjugar con un enlazador o con otra secuencia para facilitar la síntesis, la purificación o la identificación del polipéptido (p. ej., poli-His) o para mejorar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido se puede conjugar con una región Fc de inmunoglobulina.

Una "variante" de polinucleótido es una secuencia que difiere de la secuencia de nucleótidos expuesta, por tener una o varias deleciones, sustituciones o adiciones de nucleótidos, de modo que la inmunogenicidad del polipéptido codificado no disminuye en relación con la proteína natural. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipéptido codificado se puede determinar generalmente tal y como se describe en esta memoria. Tales modificaciones se pueden introducir fácilmente empleando técnicas de mutagénesis convencional, tales como la mutagénesis específica del sitio, dirigida al oligonucleótido, tal y como describen, por ejemplo, Adelman y col. (DNA, 2:183, 1983). Las variantes de nucleótidos pueden ser variantes alélicas presentes en la naturaleza, tal y como se describen posteriormente, o variantes no presentes en la naturaleza.

Dos secuencias de nucleótidos o de polinucleótidos se dice que son "idénticas", si la secuencia de nucleótidos o de residuos de aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para obtener una correspondencia máxima, tal y como se describe más abajo. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente comparando las secuencias con una ventana de comparación, para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación" tal y como se emplea en esta memoria, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, generalmente de 30 hasta aproximadamente 75, de 40 hasta aproximadamente 50, en el que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia que tiene el mismo número de posiciones contiguas, después de alinear las dos secuencias de forma óptima.

Una alineación óptima de las secuencias a comparar se puede realizar empleando el programa Megalign en la serie Lasergene de programas para bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, WI), empleando parámetros definidos. Este programa incluye diversos esquemas de alineación, descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) "A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships". En Dayhoff, M.O. (compilador) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, vol. 5, supl. 3, págs. 345-358; Hein J. (1990) "Unified Approach to Alignment and Phylogenes", págs. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M. (1989) "Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer", CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W. (1989) "Optimal alignments in linear space", CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor. 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) "The neighbor joining method. A new method for reconstructing phylogenetic trees". Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R. (1973) "Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy", Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J. (1983) "Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

Alternativamente, la alineación óptima de secuencias para comparar se puede realizar mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, mediante el algoritmo de alineación por identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante la búsqueda por métodos de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444, mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de programas de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG) 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección.

Un ejemplo ilustrativo de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de la secuencia y la similitud de la secuencia, son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que describen Altschul y col. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol.. 215:403-410, respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 se pueden emplear, por ejemplo, con los parámetros descritos en esta memoria, para determinar el porcentaje de identidad de la secuencia para los polinucleótidos y los polipéptidos de la invención. El programa para realizar los análisis con BLAST está a disposición pública a través del Centro Nacional para Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). En un ejemplo ilustrativo, las puntuaciones acumuladas se pueden calcular empleando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para una pareja de residuos emparejados; siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos desemparejados; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, una matriz de puntuación se puede utilizar para calcular la puntuación acumulada. Una extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se mantiene cuando: la puntuación acumulada de la alineación disminuye en una cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulada se dirige hacia cero o menos, debido a la acumulación de una o de varias alineaciones con residuos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de una secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST, W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) emplea por defecto una longitud de palabra (W) de 11 y una expectación (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase, Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) alineaciones (B) de 50, expectación (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas cadenas.

Preferentemente, el "porcentaje de identidad de la secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene al menos 20 posiciones, en donde la porción del polinucleótido o de la secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) del 20 porciento o menores, generalmente 5 a 15 porciento o 10 a 12 porciento, cuando se comparan con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en el que aparecen bases de ácidos nucleicos o de residuos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias, para obtener el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicar los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de la secuencia.

Por tanto, la presente invención proporciona composiciones y usos implicados y secuencias de polipéptidos (y secuencias de polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos) que tienen una identidad sustancial con las secuencias descritas en esta memoria, por ejemplo, las que comprenden al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o superior, de identidad de la secuencia, comparada con la longitud total de la secuencia de referencia, empleando los métodos descritos en esta memoria, (p. ej., análisis BLAST que emplea parámetros convencionales, tal y como se describen a continuación). Un experto en la técnica reconocerá que estos valores se pueden ajustar de forma adecuada para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de polinucleótidos, teniendo en cuenta la degeneración del código genético, la similitud de aminoácidos, la localización del marco de lectura y similares.

Los polinucleótidos para emplear en la presente invención, sin tener en cuenta la longitud de la secuencia codificadora misma, se pueden combinar con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios adicionales para enzimas de restricción, sitios de clonación múltiple y otros segmentos codificadores y similares, de modo que su longitud completa pueda variar considerablemente. Por ello se contempla que se puede emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando limitada preferentemente la longitud total por la comodidad de la preparación y el uso en el protocolo de ADN recombinante previsto. Por ejemplo, segmentos ilustrativos de ADN con longitudes totales de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5000, aproximadamente 3000, aproximadamente 2000 pares de bases de longitud y similares (incluyendo todas las longitudes intermedias) se consideran útiles en muchas aplicaciones de esta invención.

Las variantes de polinucleótidos incluyen alelos de los genes que codifican la secuencia de nucleótidos expuestas en esta memoria. Tal y como se emplea en esta memoria, un "alelo" o una "secuencia alélica", es una forma alternativa del gen que puede ser el resultado de al menos una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos. Los alelos pueden dar como resultado ARNm o polipéptidos alterados cuya estructura o función puede estar alterada o no estarlo. Cualquier gen dado puede tener una o varias formas alélicas, o no tener ninguna. Los cambios mutacionales comunes que producen alelos, se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede tener lugar de forma aislada o junto con los otros, una o varias veces en una secuencia dada.

En general, los antígenos de clamidia y las secuencias de polinucleótidos que codifican tales antígenos, se pueden preparar empleando cualquiera entre una variedad de procedimientos. Por ejemplo, moléculas de polinucleótidos que codifican antígenos de clamidia se pueden aislar a partir de una genoteca de expresión genómica o de ADNc de clamidia, escrutando con una línea de linfocitos T específica de clamidia, tal y como se describe a continuación, y secuenciar empleando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Adicionalmente, se puede identificar un polinucleótido, tal y como se describe con más detalle a continuación, escrutando una micromatriz de ADNc, en busca de expresión asociada con clamidias (es decir, que sea al menos dos veces superior en células infectadas con clamidias que en las células testigo, tal y como se determina empleando un ensayo representativo, proporcionado en esta memoria). Tales escrutinios se pueden realizar empleando una micromatriz de Synteni (Palo Alto, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (y esencialmente tal y como describen Schena y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 y Heller y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155, 1977). Alternativamente, los polipéptidos se pueden amplificar a partir de ADNc preparado de células que expresan las proteínas descritas en esta memoria. Tales polinucleótidos se pueden amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para este fin, se pueden diseñar cebadores específicos de la secuencia, basándose en las secuencias proporcionadas en esta memoria, y se pueden comprar o sintetizar.

Los antígenos se pueden producir por recombinación, tal y como se describe más abajo, insertando una secuencia de polinucleótido que codifica el antígeno en un vector de expresión y expresar el antígeno en un hospedador adecuado. Los antígenos se pueden evaluar frente a una propiedad deseada, tal como la capacidad para reaccionar con sueros obtenidos partir de un individuo infectado con clamidias, tal y como se describe en esta memoria, y se pueden secuenciar empleando, por ejemplo, técnicas químicas tradicionales de Edman. Véase, Edman y Berg, Eur. J. Biochem. 80:116-132, 1967.

Las secuencias de polinucleótidos que codifican antígenos también se pueden obtener escrutando una genoteca adecuada de ADNc o de ADN genómico de clamidia, en busca de secuencias de polinucleótidos que se hibriden con oligonucleótidos degenerados, obtenidos a partir de secuencias parciales de aminoácidos de antígenos aislados. Las secuencias de oligonucleótidos degenerados para uso en dicho escrutinio, se pueden diseñar y sintetizar, y el escrutinio se puede realizar tal y como se describe (por ejemplo) en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (y las referencias citadas en la misma). También se puede emplear la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleando los oligonucleótidos anteriores en métodos bien conocidos en la técnica, para aislar una sonda de ácido nucleico procedente de una genoteca de ADNc o genómica. El escrutinio de la genoteca se puede realizar a continuación empleando la sonda aislada.

Una porción amplificada se puede emplear para aislar un gen de longitud completa a partir de una genoteca adecuada (p. ej., una genoteca de ADNc de clamidia) empleando técnicas bien conocidas. En dichas técnicas, una genoteca (de ADNc o genómica) se escruta empleando una o varias sondas o cebadores de polinucleótidos adecuados para la amplificación. Preferentemente, una genoteca se selecciona por el tamaño para que incluya moléculas mayores. Las genotecas cebadas al azar también se pueden preferir para identificar regiones 5' y aguas arriba de los genes. Las genotecas genómicas se prefieren para obtener intrones y secuencias que se extienden en 5'.

Para las técnicas de hibridación, se puede marcar una secuencia parcial (p. ej., mediante traslado de muesca o marcando el extremo con ^{32}P) empleando técnicas bien conocidas. Una genoteca bacteriana o de bacteriófagos se escruta a continuación hibridando filtros que contienen colonias bacterianas desnaturalizadas (o césped que contiene placas de fagos) con la sonda marcada (véase, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Las colonias o las placas que se hibridan se seleccionan y se expanden y el ADN se aísla para un análisis posterior. Los clones de ADNc se pueden analizar para determinar la cantidad de secuencia adicional, por ejemplo, mediante PCR empleando un cebador procedente de la secuencia parcial y un cebador procedente del vector. Los mapas de restricción y las secuencias parciales se pueden generar para identificar uno o varios de los clones solapantes. La secuencia completa se puede determinar a continuación empleando técnicas convencionales, que pueden implicar la generación de una serie de clones por deleción. Las secuencias solapantes resultantes se ensamblan a continuación en una sola secuencia contigua. Se puede generar una molécula de ADNc de longitud completa, ligando los fragmentos adecuados, empleando técnicas bien conocidas.

Alternativamente, existen numerosas técnicas de amplificación para obtener una secuencia codificadora de longitud completa, a partir de una secuencia de ADNc parcial. En tales técnicas, la amplificación se realiza generalmente mediante PCR. Se puede emplear cualquiera entre una variedad de equipos de reactivos disponibles comercialmente para realizar la etapa de amplificación. Los cebadores se pueden diseñar empleando métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Mullis y col., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; Erlich, compilador, PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989) también se pueden emplear y programas bien conocidos en la técnica. Los cebadores tienen preferentemente 22-30 nucleótidos de longitud, tienen un contenido en GC de al menos 50% y se aparean con la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68ºC hasta 72ºC. La región amplificada se puede secuenciar tal y como se ha descrito anteriormente y las secuencias solapantes se ensamblan en una secuencia colindante.

Una técnica de amplificación de este tipo es la PCR inversa (véase, Triglia y col., Nucl. Acids Res. 16:8186,1988) que emplea enzimas de restricción para generar un fragmento en la región conocida del gen. El fragmento se circulariza a continuación mediante ligación intramolecular y se emplea como molde para la PCR con cebadores divergentes obtenidos a partir de la región conocida. En un acercamiento alternativo, las secuencias adyacentes a una secuencia parcial, se pueden recoger mediante amplificación con un cebador hasta obtener una secuencia enlazadora y un cebador específico de una región conocida. Las secuencias amplificadas se someten típicamente a una segunda ronda de amplificación con el mismo cebador enlazador y un segundo cebador, específico de la región conocida. Una variación de este procedimiento, que emplea dos cebadores que inician la extensión en direcciones opuestas desde la secuencia conocida, se describe en el documento WO 96/38591. Técnicas adicionales incluyen la PCR de captura (Lagerstrom y col., PCR Methods Applic. 1:11-19, 1991) y la PCR de desplazamiento (Parker y col., Nucl. Acids Res. 19:3055-60, 1991).
La amplificación mediada por transcripción o TMA es otro método que se puede utilizar para amplificar el ADN, el ARNr o el ARNm, tal y como se describe en el documento de patente nº PCT/US91/03184. Este método autocatalítico e isotérmico sin PCR, emplea dos cebadores y dos enzimas: la polimerasa de ARN y la transcriptasa inversa. Un cebador contiene una secuencia promotora para la polimerasa de ARN. En la primera amplificación, el cebador promotor se hibrida con al ARNr diana en un sitio definido. La transcriptasa inversa crea una copia en ADN del ARNr diana, mediante la extensión desde el extremo 3' del cebador promotor. El ARN en el complejo resultante se degrada y un segundo cebador se une a la copia de ADN. Se sintetiza una nueva cadena de ADN desde el extremo del cebador mediante transcriptasa inversa, creando un ADN bicatenario. La polimerasa de ARN reconoce la secuencia del promotor en el molde de ADN e inicia la transcripción. Cada uno de los amplicones de ARN sintetizados recientemente vuelve a entrar en el proceso TMA y sirve como molde para una nueva ronda de replicaciones, hasta la expansión exponencial del amplicón de ARN. Otros métodos que emplean la amplificación también se pueden emplear para obtener una secuencia de ADNc de longitud completa.

En ciertos casos, es posible obtener una secuencia de ADNc de longitud completa mediante el análisis de las secuencias proporcionadas en una base de datos de marcadores de secuencias expresados (EST), tal como la disponible en GenBank. Las búsquedas de ESTs solapantes se puede realizar generalmente empleando programas bien conocidos (p. ej., búsquedas con NCBI BLAST), y estos ESTs se pueden utilizar para generar una secuencia contigua de longitud completa. Las secuencias de ADNc de longitud completa también se pueden obtener mediante análisis de los fragmentos genómicos.

Las variantes de polinucleótidos se pueden preparar generalmente por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo la síntesis química, por ejemplo, mediante síntesis química con fosforamidita en fase sólida. También se pueden introducir modificaciones en la secuencia de polinucleótidos empleando técnicas convenciones de mutagénesis, tales como la mutagénesis dirigida al oligonucleótido, específica del sitio (véase, Adelman y col., DNA 2:183, 1983). Alternativamente, las moléculas de ARN se pueden generar mediante transcripción in vitro o in vivo de las secuencias de ADN que codifican una proteína de clamidia, o una porción de la misma, con la condición de que el ADN se incorpore en un vector con un promotor adecuado para la polimerasa de ARN (tal como T7 o SP6). Ciertas porciones se pueden utilizar para preparar un polipéptido codificado, tal y como se describe en esta memoria. Además, o alternativamente, se puede administrar una porción a un paciente de modo que el polipéptido codificado se genere in vivo (p. ej., transfectando células presentadoras de antígeno, tales como las células dendríticas, con una estructura artificial de ADNc que codifica un polipéptido de clamidia, y administrando las células transfectadas al paciente).

Una porción de una secuencia complementaria a una secuencia codificadora (es decir, un polinucleótido no codificante) también se puede utilizar como sonda o para modular la expresión génica. Las estructuras artificiales de ADNc que se pueden transcribir en ARN no codificante, también se pueden introducir en células de tejidos para facilitar la producción de ARN no codificante. Un polinucleótido no codificante se puede emplear, tal y como se describe en esta memoria, para inhibir la expresión de una proteína de clamidia. La tecnología no codificante se puede utilizar para controlar la expresión génica a través de la formación de una triple hélice que compromete la capacidad de la doble hélice para abrirse lo suficiente para que tenga lugar la unión de las polimerasas, los factores de transcripción o las moléculas reguladoras (véase, Gee y col., en Huber y Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY; 1994)). Alternativamente, una molécula no codificante se puede diseñar para que se hibride con una región control de un gen (p. ej., promotora, potenciadora o un sitio de iniciación de la transcripción), y bloquee la transcripción del gen; o para bloquear la traducción inhibiendo la unión de un transcrito a los ribosomas.

Una porción de una secuencia codificadora o de una secuencia complementaria, también se puede diseñar como una sonda o un cebador para detectar la expresión génica. Las sondas se pueden marcar con una variedad de grupos informadores, tales como radionucleidos y enzimas, y preferentemente tienen una longitud de al menos 10 nucleótidos, más preferentemente al menos 20 nucleótidos y aún más preferible al menos 30 nucleótidos de longitud. Los cebadores, tal y como se ha indicado anteriormente, tienen preferentemente 22-30 nucleótidos de longitud.

Cualquier polinucleótido se puede modificar adicionalmente para incrementar la estabilidad in vivo. Las modificaciones posibles incluyen, sin estar limitadas a las mismas, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3'; el uso de fosforotioato o de 2' O-metilo más que enlaces con fosfodiesterasas en el esqueleto; y/o la inclusión de bases no tradicionales, tales como inosina, queosina y wybutosina, así como formas modificadas con acetilo, metilo, tio y otras formas modificadas de adenina, histidina, guanina, timina y uridina.

Las secuencias de nucleótidos tal y como se describen en esta memoria se pueden unir a una variedad de otras secuencias de nucleótidos empleando técnicas de ADN recombinante establecidas. Por ejemplo, un polinucleótido se puede clonar en cualquiera de una variedad de vectores de clonación, que incluyen plásmidos, fagémidos, derivados del fago lambda y cósmidos. Los vectores de interés particular incluyen los vectores de expresión, los vectores de replicación, los vectores de generación de sondas y los vectores de secuenciación. En general, un vector contendrá un origen de replicación funcional en al menos un organismo, sitios convenientes de endonucleasas de restricción y uno o varios marcadores seleccionables. Otros elementos dependerán del uso deseado y serán evidentes para los expertos en la técnica.

Los polipéptidos sintéticos que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, se pueden generar empleando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales polipéptidos se pueden sintetizar empleando cualquiera de las técnicas en fase sólida a disposición comercial, tales como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en donde los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. El equipamiento para la síntesis automática de polipéptidos, está a disposición comercial con el proveedor Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA, y se puede manejar según las instrucciones del fabricante.

Las porciones inmunógenas de antígenos de clamidia se pueden preparar e identificar usando técnicas bien conocidas, tales como las resumidas por Paul, Fundamental Immunology, 3ª ed., Raven Press, 1993, págs. 243-247 y las referencias citadas en el mismo. Tales técnicas incluyen el escrutinio de porciones de polipéptidos del antígeno natural en busca de propiedades inmunógenas. Los ELISAs representativos descritos en esta memoria se pueden emplear generalmente en estos escrutinios. Una porción inmunógena de un polipéptido es una porción que en dichos ensayos representativos, genera una señal en dichos ensayos que es sustancialmente similar a la generada por el antígeno de longitud completa. Con otras palabras, una porción inmunógena de un antígeno de clamidia, genera al menos aproximadamente 20% y preferentemente aproximadamente 100% de la señal inducida por el antígeno de longitud completa en un ELISA modelo, tal y como se describe en esta memoria.

Las porciones y otras variantes de los antígenos de clamidia se pueden generar por medios sintéticos o recombinantes. Las variantes de un antígeno natural se pueden preparar generalmente empleando técnicas de mutagénesis convencionales, tales como la mutagénesis específica del sitio, dirigida a oligonucleótidos. Las secciones de la secuencia de polinucleótidos también se pueden escindir empleando técnicas convencionales que permiten la preparación de polipéptidos truncados.

Los polipéptidos recombinantes que contienen porciones y/o variantes de un antígeno natural se pueden preparar fácilmente a partir de una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido, empleando una variedad de técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el material sobrenadante procedente de sistemas adecuados de hospedador/vector que secretan proteína recombinante en el medio de cultivo, se puede concentrar en primer lugar usando un filtro disponible comercialmente. Después de la concentración, el material concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada, tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Finalmente, se pueden emplear una o varias etapas de HPLC para purificar adicionalmente una proteína recombinante.

Cualquiera entre una variedad de vectores de expresión conocidos por los expertos en la técnica, se puede emplear para expresar polipéptidos recombinantes tal y como se describe en esta memoria. La expresión se puede conseguir en cualquier célula hospedadora adecuada que se haya transformado o transfectado con un vector de expresión que contiene una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido recombinante. Las células hospedadoras adecuada incluyen las células procariotas, la levadura y las células eucariotas superiores. Preferentemente, las células hospedadoras empleadas son E. coli, levadura o líneas celulares de mamífero, tales como COS o CHO. Las secuencias de ADN expresadas de esta manera pueden codificar antígenos presentes en la naturaleza, porciones de antígenos presentes en la naturaleza u otras variantes de los mismos.

En general, independientemente del método de preparación, los polipéptidos descritos en esta memoria se preparan de forma aislada, sustancialmente pura. Preferentemente, los polipéptidos tienen al menos aproximadamente 80% de pureza, más preferentemente al menos aproximadamente 90% de pureza y lo más preferible al menos aproximadamente 99% de pureza.

En ciertas realizaciones específicas, un polipéptido puede ser una proteína de fusión que comprende múltiples polipéptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431, o que comprende al menos un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431 y una secuencia no relacionada, tal como una proteína conocida de clamidia. Un partícipe de la fusión puede ayudar, por ejemplo, proporcionando epítopos de linfocitos T coadyuvantes (un partícipe inmunológico de la fusión), preferentemente, epítopos de linfocitos T coadyuvantes o puede ayudar en la expresión de la proteína (un potenciador de la expresión) con rendimientos superiores a los de la proteína recombinante natural. Ciertos partícipes preferidos de la fusión son partícipes de la fusión inmunológicos y que mejoran la expresión. Otros partícipes de la fusión se pueden seleccionar de modo que se incrementa la solubilidad de la proteína o para permitir que la proteína se dirija a compartimentos intracelulares deseados. Aún otros partícipes de la fusión incluyen marcadores de la afinidad que facilitan la purificación de la proteína. Una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de une en la presente invención, se puede construir empleando técnicas de ADN recombinante para ensamblar secuencias de ADN separadas que codifican, por ejemplo, el primer y el segundo polipéptidos en un vector de expresión adecuado. El extremo 3' de una secuencia de ADN que codifica el primer polipéptido se liga, con o sin enlazador peptídico, con el extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido, de modo que los marcos de lectura de las secuencias están en fase para permitir la traducción del ARNm de las dos secuencias de ADN en una única proteína de fusión que mantiene la actividad biológica del primer y del segundo polipéptido.

Una secuencia peptídica enlazadora se puede emplear para separar el primer y el segundo polipéptido con una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en su estructura secundaria y terciaria. Una secuencia peptídica enlazadora tal, se incorpora en la proteína de fusión empleando métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Las secuencias peptídicas enlazadoras adecuadas se pueden escoger basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pueda interaccionar con epítopos funcionales sobre el primer y el segundo polipéptido; y (3) la falta de residuos hidrófobos o cargados que puedan reaccionar con los epítopos polipeptídicos funcionales. Las secuencias enlazadoras peptídicas preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala también se pueden emplear en la secuencia enlazadora. Las secuencias de aminoácidos que se pueden emplear de forma útil como enlazadores incluyen las descritas en Maratea y col., Gene 40:39-46, 1985; Murphy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8562, 1986; el documento de patente de EE.UU. nº 4.935.233 y el documento de patente de EE.UU. nº 4.751.180. La secuencia enlazadora puede tener desde 1 hasta aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Como alternativa al uso de una secuencia peptídica enlazadora (si se desea), se pueden utilizar regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales (si están presentes) en el primer y el segundo polipéptido, para separar los dominios funcionales y evitar el impedimento estérico.

Las secuencias de ADN ligadas están ligadas funcionalmente con elementos reguladores adecuados de la transcripción y de la traducción. Los elementos reguladores responsables de la expresión de ADN se localizan sólo 5' de la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De forma similar, los codones de detención requeridos para las señales de terminación finales de la traducción y de la transcripción sólo están presentes 3' de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido señal.

También se proporcionan composiciones que comprenden proteínas de fusión que comprenden un polipéptido que contiene la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431 junto con una proteína inmunógena no relacionada. Preferentemente, la proteína inmunógena es capaz de producir una respuesta de llamada. Ejemplos de tales proteínas incluyen las proteínas del tétanos, la tuberculosis y la hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute y col., New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997).

En las realizaciones preferidas, un partícipe inmunológico de la fusión se obtiene a partir de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gram negativa Haemophilus influenzae tipo B (documento WO 91/18926). Preferentemente, un derivado de la proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (p. ej., los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales) y un derivado de la proteína D se puede lipidar. En ciertas realizaciones preferidas, los 109 residuos primeros de un partícipe de la fusión con lipoproteína D, se incluye en el extremo N-terminal para proporcionar al polipéptido epítopos adicionales exógenos de linfocitos T y para incrementar el nivel de expresión en E. coli (actuando de este modo como un potenciador de la expresión). La cola de lípidos asegura una presentación optima del antígeno a las células presentadoras de antígeno. Otros partícipes de la fusión incluyen la proteína no estructural procedente del virus de la gripe, NS1 (hemoaglutinina). Típicamente, se emplean los 81 aminoácidos N-terminales, aunque se pueden emplear diferentes fragmentos que incluyen epítopos de linfocitos T coadyuvantes.

En otra realización, el partícipe inmunológico de la fusión es la proteína conocida como LYTA o una porción de la misma (preferentemente una porción C-terminal). LYTA se obtiene a partir de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una amidasa de N-acetil-L-alanina, conocida como amidasa LYTA (codificada por el genLytA; Gene 43:265-292, 1986). LYTA es una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en el esqueleto de peptidoglicanos. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad con la colina o con algún análogo de la colina, tal como DEAE. Esta propiedad se puede explotar para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli, útiles para la expresión de las proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de las proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el extremo amino (véase, Biotechnology 10:795-798, 1992). En una realización preferida, una porción repetida de LYTA se puede incorporar en una proteína de fusión. Se ha encontrado una porción repetida en la región C-terminal que comienza en el residuo 178. Una porción repetida particularmente preferida incorpora los residuos 188-305.

El polinucleótido Ra12 obtenido a partir de Mycobacterium tuberculosis se puede enlazar con un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431. Las composiciones de Ra12 y los métodos para su uso en la mejora de la expresión de secuencias heterólogas de polinucleótidos, se describe en el documento de solicitud de patente de EE.UU. 60/158.585. Resumiendo, Ra12 hace referencia a una región de polinucleótido que es una subsecuencia de un ácido nucleico MTB32A de Mycobacterium tuberculosis. MTB32A es una proteasa de serina con 32 kD de peso molecular, codificada por un gen en cepas virulentas y no virulentas de M. tuberculosis. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de MTB32A ha sido descrita (documento de solicitud de patente de EE.UU. 60/158.585; véase también, Skeiky y col., Infection and Immun. (1999) 67:3998-4007. En una realización, el polipéptido Ra12 empleado en la producción de polipéptidos de fusión comprende un fragmento C-terminal de la secuencia codificadora de MTB32A que es eficaz para mejorar la expresión y/o la inmunogenicidad de polipéptidos antigénicos heterólogos de clamidia, con los que se fusiona. El polipéptido Ra12 también se puede corresponder con un fragmento C-terminal de aproximadamente 14 kD de MTB32A que comprende algunos o todos los residuos de aminoácidos desde 192 hasta 323 de MTB32A.

Los ácidos nucleicos recombinantes que codifican un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido Ra12 y un polipéptido heterólogo de clamidia, que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431, se pueden construir fácilmente mediante técnicas convencionales de ingeniería genética. Los ácidos nucleicos recombinantes se construyen de modo que, preferentemente, una secuencia de polinucleótidos de Ra12 se localiza 5' de una secuencia heteróloga seleccionada entre polinucleótidos de clamidia. También puede ser adecuado situar una secuencia de polinucleótido de Ra12, 3' de una secuencia heteróloga seleccionada de polinucleótidos o insertar una secuencia heteróloga de polinucleótido en un sitio dentro de una secuencia de polinucleótidos de Ra12.

Además, cualquier polinucleótido adecuado que codifica Ra12 o una porción o una variante del mismo, se puede utilizar para construir polinucleótidos recombinantes de fusión que comprenden Ra12 y uno o varios polinucleótidos de clamidia que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431. Los polinucleótidos de Ra12 preferidos comprenden generalmente al menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 100 nucleótidos, al menos aproximadamente 200 nucleótidos o al menos aproximadamente 300 nucleótidos que codifican una porción de un polipéptido de Ra12.

Los polinucleótidos de Ra12 pueden comprender una secuencia natural (es decir, una secuencia endógena que codifica un polipéptido Ra12 o una porción del mismo) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes del polinucleótido de Ra12 pueden contener una o varias sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de modo que la actividad biológica del polipéptido de fusión codificado no disminuya sustancialmente, en comparación con un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de Ra12 natural. Las variantes muestran preferentemente al menos aproximadamente 70% de identidad, más preferentemente al menos aproximadamente 80% de identidad y lo más preferible al menos aproximadamente 90% de identidad con una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de Ra12 natural o una porción del mismo.

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden uno o varios de los polipéptidos anteriores o proteínas de fusión (o polinucleótidos que dichos polipéptidos o proteínas de fusión) para inducir una inmunidad protectora frente a la infección con clamidias en un paciente. Tal y como se emplea en esta memoria, un "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferentemente un ser humano. Un paciente puede estar afectado por una enfermedad o puede estar exento de una enfermedad y/o infección detectables. Es decir, la inmunidad protectora se puede inducir para evitar o tratar una infección con clamidias.

En este aspecto, el polipéptido, la proteína de fusión o la molécula de polinucleótido está presente generalmente en una composición farmacéutica o una vacuna. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o varios polipéptidos, pudiendo contener cada uno de ellos una o varias de las secuencias anteriores (o variantes de las mismas) y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o varios de los polipéptidos anteriores y un agente inmunoestimulante, tal como un coadyuvante o un liposoma (dentro del cual se incorpora el polipéptido). Tales composiciones farmacéuticas y vacunas también pueden contener otros antígenos de clamidia, incorporados en una combinación de polipéptidos o presentes en un polipéptido separado.

Alternativamente, una vacuna puede contener polinucleótidos que codifican uno o varios polipéptidos o proteínas de fusión, tal y como se ha descrito anteriormente, de modo que el polipéptido se genera in situ. En dichas vacunas, los polinucleótidos pueden estar presentes en cualquiera entre una variedad de sistemas de entrega, conocidos en la técnica, que incluyen los sistemas de expresión de ácidos nucleicos, los sistemas de expresión bacteriana y vírica. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos adecuados, contienen las secuencias de polinucleótidos necesarias para la expresión en el paciente (tal como un promotor y una señal de terminación adecuada). Los sistemas de entrega bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guérin) que expresa el polipéptido en su superficie celular. En una realización preferida, los polinucleótidos se pueden introducir empleando un sistema de expresión vírica (p. ej., virus vaccinia u otro poxvirus, retrovirus o adenovirus) que puede implicar el uso de un virus no patógeno (defectuoso). Las técnicas para incorporar polinucleótidos en tales sistemas de expresión son bien conocidas por los expertos en la materia. Los polinucleótidos también se pueden administrar como vectores plasmídicos "desnudos", tal y como se describen, por ejemplo, en Ulmer y col., Science 259:1745-1749, 1993, y revisado por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Las técnicas para incorporar el ADN en tales vectores son bien conocidas por los expertos en la materia. Un vector retrovírico se puede transferir adicionalmente o puede incorporar un gen de un marcador seleccionable (para ayudar en la identificación o en la selección de las células transducidas) y/o un resto diana, tal como un gen que codifica un ligando para un receptor sobre una célula diana específica, para que el vector se convierta en una diana específica. La dirección hacia la diana se puede realizar también empleando un anticuerpo, por métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Otras formulaciones para fines terapéuticos incluyen los sistemas de dispersión coloidal, tal como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite-en-agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido para uso como vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de membrana artificial). La absorción de polinucleótidos desnudos se puede incrementar incorporando los polinucleótidos en perlas biodegradables y/o sobre las mismas, las cuales se transportan eficazmente dentro de las células. La preparación y el uso de tales sistemas es bien conocido en la técnica.

En un aspecto relacionado, una vacuna de polinucleótido tal y como se ha descrito anteriormente se puede administrar de forma simultánea o secuencialmente a un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431 o un antígeno conocido de clamidia. Por ejemplo, a la administración de polinucleótidos que codifican un polipéptido de la presente invención, tanto de forma "desnuda" como en un sistema de entrega, tal y como se ha descrito anteriormente, puede seguir la administración de un antígeno para mejorar el efecto inmunoprotector de la vacuna.

En ciertos aspectos, los polipéptidos y/o los polinucleótidos se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas o en composiciones inmunógenas (es decir, vacunas). Las composiciones farmacéuticas comprenden uno o varios de dichos compuestos y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o varios de tales compuestos y un agente inmunoestimulante. Un agente inmunoestimulante puede ser cualquier sustancia que mejore o potencie una respuesta inmune frente a un antígeno exógeno. Ejemplos de agentes inmunoestimulantes incluyen los coadyuvantes, las microesferas biodegradables (p. ej., poli(lactato-co-glicolato) y los liposomas (dentro de los cuales se incorpora el compuesto; véase, p. ej., Fullerton, documento de patente de EE.UU. nº 4.235.877). La preparación de vacunas se describe en general, por ejemplo, en M.F. Powell y M.J. Newman, compiladores, "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press (NY, 1995). Las composiciones farmacéuticas y las vacunas dentro del alcance de la presente invención, también pueden contener otros compuestos que pueden ser biológicamente activos o inactivos. Por ejemplo, una o varias porciones inmunógenas de otros antígenos de clamidia, pueden estar presentes, incorporadas en un polipéptido de fusión o como un compuesto separado, dentro de la composición o la
vacuna.

Una composición farmacéutica o una vacuna puede contener ADN que codifica uno o varios de los polipéptidos, tal y como se ha descrito anteriormente, de modo que se genera el polipéptido in situ. Tal y como se ha indicado anteriormente, el ADN puede estar presente dentro de cualquiera entre una variedad de sistemas de entrega conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen sistemas de expresión de ácido nucleico, sistemas de expresión bacteriana y vírica. Numerosas técnicas de entrega de genes son bien conocidas en la técnica, tales como las descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, y las referencias citadas en la misma. Los sistemas de expresión adecuados de ácidos nucleicos contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en el paciente (tales como un promotor adecuado y una señal de terminación). Los sistemas de entrega bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guérin) que expresa una porción inmunógena del polipéptido sobre su superficie celular o que secreta dicho epítopo.

En una realización preferida, el ADN se puede introducir empleando un sistema de expresión vírica (p. ej., el virus vaccinia u otros poxvirus, retrovirus, adenovirus, baculovirus, togavirus, bacteriófagos y similares) los cuales implican frecuentemente el uso de un virus competente para la replicación que no sea patógeno (defectuoso).

Por ejemplo, muchos vectores de expresión vírica se obtienen a partir de virus de la familia retroviridae. Esta familia incluye los virus de la leucemia de múrido, los virus de tumor de mama de ratón, los espumavirus humanos, el virus del sarcoma de Rous y los virus de la inmunodeficiencia que incluyen a humanos, simios y felinos. Las consideraciones sobre cuándo se diseñan vectores de expresión retrovíricos, se exponen en Comstock y col. (1997).

Kim y col., (1998) han desarrollado vectores de expresión vírica excelentes, basados en el virus de la leucemia de múrido (MLV). Al crear los vectores MLV, Kim y col. observaron que la secuencia gag completa junto con la región inmediatamente aguas arriba, se podía delecionar sin afectar significativamente al empaquetamiento vírico o a la expresión génica. Además, se encontró que casi toda la región U3 se podía sustituir por el promotor inmediatamente más próximo del citomegalovirus humano, sin efectos deletéreos. Adicionalmente, los sitios de MCR y los sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) se podían añadir sin producir efectos adversos. Basándose en estas observaciones, Kim y col. han diseñado una serie de vectores de expresión basados en MLV que comprenden una o varias de las características descritas anteriormente.

A medida que se va conociendo más sobre los espumavirus humanos (HFV), se han descubierto características de HFV que son favorables para su uso como un vector de expresión. Estas características incluyen la expresión de pol por corte y empalme y el inicio de la traducción en un codón de iniciación definido. Otros aspectos de los vectores de expresión vírica de HFV están revisados por Bodem y col. (1997).

Murakami y col. (1977) describen vectores de retrovirus aviar competentes para la replicación y basados en el virus del sarcoma de Rous (RSV), IR1 y IR2, para expresar un gen heterólogo a alto nivel. En estos vectores, los IRES obtenidos a partir del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) se insertaron entre el gen env y el gen heterólogo. El vector IR1 mantiene el sitio de corte y empalme-aceptor que está presente aguas abajo del gen env, mientras que el vector IR2 carece del mismo. Murakami y col. han observado un alto nivel de expresión de algunos genes heterólogos diferentes en estos vectores.

Recientemente, se ha desarrollado una cantidad de vectores de expresión retrovíricos basados en lentivirus. Kafri y col. (1997) han observado una expresión sostenida de los genes entregados directamente en el hígado y en el músculo, a través de un vector de expresión basado en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Un beneficio del sistema es la capacidad inherente del VIH para transducir células que no se dividen. Debido a que los virus de Kafri y col. están seudotipificados con glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSVG), se pueden transducir en una amplia gama de tejidos y tipos celulares.

Se ha desarrollado un gran número de vectores de expresión basados en adenovirus, debido principalmente a las ventajas ofrecidas por estos vectores en las aplicaciones de la terapia génica. Los vectores de expresión en adenovirus y los métodos que emplean tales vectores son el objeto de numerosas patentes en EE.UU., que incluyen los documentos de patentes de EE.UU. nº 5.698.202, nº 5.616.326, nº 5.585.362 y nº 5.518.913.

Las estructuras artificiales adicionales de adenovirus se describen en Khatri y col. (1997) y Tomanin y col. (1997). Khatri y col. describen nuevos vectores de expresión en adenovirus ovinos y su capacidad para infectar células de riñón de conejo y el turbinato nasal bovino, así como una serie de tipos celulares humanos que incluyen los fibroblastos pulmonares y del prepucio así como líneas celulares de hígado, próstata, mama, colon y retinales. Tomanin y col. describen vectores de expresión adenovíricos que contienen el gen de la polimerasa de ARN T7. Cuando se introducen en células que contienen un gen heterólogo ligado funcionalmente con un promotor de T7, los vectores eran capaces de dirigir la expresión génica desde el promotor de T7. Los autores sugieren que este sistema puede ser útil para la clonación y la expresión de genes que codifican proteínas citotóxicas.

Los poxvirus se emplean generalmente para la expresión de genes heterólogos en células de mamífero. A lo largo de los años, los vectores se han mejorado para permitir una alta expresión del gen heterólogo y simplificar la integración de múltiples genes heterólogos en una sola molécula. En un esfuerzo por disminuir los efectos citopáticos e incrementar la seguridad, están recibiendo una atención especial un mutante del virus vaccinia y otros poxvirus que contraen una infección abortiva en células de mamífero (Oertli y col., 1997). El uso de poxvirus como vectores de expresión ha sido revisado por Carroll y Moss (1977).

Los vectores de expresión de togavirus que incluyen vectores de expresión de alfavirus se han empleado para estudiar la estructura y la función de las proteínas y para fines de producción de proteínas. Las características atractivas de los vectores de expresión de togavirus son la expresión génica rápida y eficaz, una amplia gama de hospedadores y genomas de ARN (Huang, 1996). También en vacunas recombinantes que se basan en vectores de expresión de alfavirus, se ha observado que inducen una fuerte respuesta inmune humoral y celular con una buena memoria inmunológica y efectos protectores (Tubulekas y col., 1997). Los vectores de expresión de alfavirus y su uso se describen, por ejemplo, en Lundstrom (1997).

En un estudio, Li y Garoff (1996) empleaban vectores de expresión del virus Semliki Forest (SFV) para expresar genes retrovíricos y para producir partículas retrovíricas en células BHK-21. Las partículas producidas por este método tenían actividad proteasa y transcriptasa inversa y eran infecciosas. Además, no se pudieron detectar virus coadyuvantes en el material vírico. Por tanto, este sistema tiene características que son interesantes para su uso en protocolos de terapia génica.

Los vectores de expresión de baculovirus se han empleado tradicionalmente para expresar proteínas heterólogas en células de insectos. Ejemplos de proteínas incluyen los receptores de la quimioquina de mamíferos (Wang y col., 1997, proteínas informadoras tales como la proteína verde fluorescente (Wu y col., 1997) y las proteínas de fusión FLAG (Wu y col., 1997; Koh y col., 1997). Recientes avances en la tecnología de vectores de expresión de baculovirus, que incluyen su uso en vectores que muestran viriones y la expresión en células de mamíferos, han sido revisados por Possee (1997). Otras revisiones sobre vectores de expresión de baculovirus incluyen Jones y Morikawa (1996) y O'Reilly (1997).

Otros sistemas de expresión vírica adecuados se describen, por ejemplo, en Fisher-Hoch y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner y col., Vaccine 8:17-21, 1990; documentos de patentes de EE.UU. nº 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; documentos WO 89/01973; documento de patente de EE.UU. nº 4.777.127; GB 2.200.651; EP 0.354.242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld y col., Science 252:431-434, 1991; Kolls y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzmán y col., Circulation 88:2838-2848, 1993; y Guzmán y col., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993. Las técnicas para incorporar ADN en tales sistemas de expresión son bien conocidas por los expertos en la materia. En otros sistemas, el ADN se puede introducir como ADN "desnudo", tal y como se describe, por ejemplo, en Ulmer y col., Science 259:1745-1749, 1993 y revisado por Cohen, Science 259:1961-1962, 1993. La absorción de ADN desnudo se puede incrementar revistiendo perlas biodegradables con el ADN, que se transportan eficazmente dentro de las células.

Es evidente que una vacuna puede comprender un componente de polinucleótido y/o de polipéptido, según se desee. También será evidente que una vacuna puede contener sales farmacéuticamente aceptables de los polinucleótidos y/o de los polipéptidos. Tales sales se pueden preparar a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables que incluyen bases orgánicas (p. ej., sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoácidos básicos) y bases inorgánicas (p. ej., sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio). Aunque se puede emplear cualquier vehículo adecuado conocido por los expertos en la técnica en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención se pueden formular para cualquier modo adecuado de administración, que incluyen por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, tal como con una inyección subcutánea, el vehículo comprende preferentemente agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. Las microesferas biodegradables (p. ej., poli(lactato-co-glicolato)), también se pueden emplear como vehículos para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en los documentos de patentes de EE.UU. nº 4.897.268 y 5.075.109.

Tales composiciones también pueden comprender tampones (p. ej., solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), carbohidratos (p. ej., glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostatos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, coadyuvantes (p. ej., hidróxido de aluminio), solutos que vuelven la formulación isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes. Alternativamente, las composiciones de la presente invención se pueden formular como un liofilizado. Los compuestos también se pueden encapsular dentro de liposomas empleando tecnología bien conocida.

Cualquiera entre una variedad de agentes inmunoestimulantes se puede emplear en las vacunas de esta invención. Por ejemplo, se puede incluir un coadyuvante. La mayoría de los coadyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno de un catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral y un estimulador de respuestas inmunes, tal como el lípido A, proteínas derivadas de Bortadella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Los coadyuvantes adecuados se encuentran a disposición comercial como, por ejemplo, coadyuvante incompleto de Freund y el coadyuvante completo (Difco Laboratories, Detroit, MI); el coadyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (Smithkline Beecham, Philadelphia, PA); sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados de forma aniónica o catiónica; polifosfazenos; microesferas biodegradables; monofosforil-lípido A y Quil A. Citoquinas, tales como GM-CSF o interleuquina-2, -7 o -12, también se pueden utilizar como coadyuvantes.

Entre las vacunas proporcionadas en esta memoria, bajos circunstancias seleccionadas, la composición del coadyuvante se puede diseñar para que induzca una respuesta inmune predominantemente del tipo Th1 o del tipo Th2. Niveles elevados de citoquinas de tipo Th1 (p. ej., IFN-\gamma, TNF-\alpha, IL-2 y IL-12) tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunes mediadas por células, frente a un antígeno administrado. Por el contrario, niveles elevados de citoquinas de tipo Th2 (p. ej., IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales. Después de aplicar una vacuna, tal y como se proporciona en esta memoria, un paciente padecerá una respuesta inmune que incluye respuestas de tipo Th1 y Th2. En una realización preferida, en la que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citoquinas de tipo Th1 se incrementará hasta un grado superior al nivel de citoquinas de tipo Th2. Los niveles de estas citoquinas se pueden determinar fácilmente empleando ensayos convencionales. Para una revisión de las familias de citoquinas, véase Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.

Los coadyuvantes preferidos para emplear en la producción de una respuesta predominantemente de tipo Th1, incluyen por ejemplo, una combinación de lípido A monofosforilado, preferentemente lípido A monofosforilado 3-de-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Los coadyuvantes de MPL se encuentran en Corixa Corporation (Seattle, WA; véanse los documentos de patentes de EE.UU. nº 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente de tipo Th1. Tales oligonucleótidos son bien conocidos y están descritos, por ejemplo, en el documento WO 96/02555 y WO 99/33488. Las secuencias de ADN inmunoestimuladoras también están descritas, por ejemplo, por Sato y col., Science 273:352, 1996. Otro coadyuvante preferido es una saponina, preferentemente QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), que se puede utilizar de forma aislada o junto con otros coadyuvantes. Por ejemplo, un sistema mejorado implica la combinación de un lípido A monofosforilado y un derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y 3D-MPL, tal y como se describe en el documento WO 94/00153 o una composición con menos capacidad de producir una reacción en donde QS21 se enfría rápidamente con colesterol, tal y como se describe en el documento WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión de aceite-en-agua y tocoferol. Una formulación de coadyuvante particularmente potente que implica a QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite-en-agua, se describe en el documento WO 95/17210.

Otros coadyuvantes preferidos incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), la serie SBAS de coadyuvantes (p. ej., SBAS-2 o SBAS-4, disponibles en SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Corixa Corporation; Seattle, WA), RC-529 (Corixa Corporation; Seattle, WA) y otros 4-fosfatos de aminoalquil-gluocosaminida (AGPs), tales como los descritos en el documento de solicitud de patente de EE.UU. pendiente de tramitación, nº de serie 08/853.826 y 09/074.720.

Cualquier vacuna proporcionada en esta memoria se puede preparar empleando métodos bien conocidos, que dan como resultado una combinación de antígeno, agente inmunoestimulante y un vehículo adecuado o excipiente. Las composiciones descritas en esta memoria se pueden administrar como parte de una formulación de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula, una esponja o un gel (compuesto de polisacáridos, por ejemplo) que realiza una liberación lenta del compuesto después de la administración). Tales formulaciones se pueden preparar generalmente empleando tecnología bien conocida (véase, p. ej., Coombes y col., Vaccine 14:1429-1438, 1996) y administrar, por ejemplo, mediante implantación oral, rectal o subcutánea, o por implantación en el sitio diana deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un polipéptido, un polinucleótido o un anticuerpo disperso en una matriz vehículo y/o o estar contenidas dentro de un depósito rodeado por una membrana que controla la velocidad.

Los vehículos para uso dentro de tales formulaciones son biocompatibles y también pueden ser biodegradables; preferentemente la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. Tales vehículos incluyen micropartículas de poli(lactato-co-glicolato), así como poliacrilato, látex, almidón, celulosa y dextrano. Otros vehículos de liberación retardada incluyen biovectores supramoleculares que comprenden un núcleo hidrófilo no líquido (p. ej., un polisacárido o un oligosacárido reticulado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico, tal como un fosfolípido (véanse, p. ej., los documentos de patente de EE.UU. nº 5.151.254 y las solicitudes PCT WO 94/20078, WO 94/23701 y WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenida en una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, la tasa y la duración esperada de la liberación y la naturaleza del estado que se va a tratar o prevenir.

Cualquiera entre una variedad de vehículos de entrega se puede emplear con las composiciones farmacéuticas y las vacunas para facilitar la producción de una respuesta inmune específica del antígeno que se dirige a las células infectadas con clamidia.

Las vías y la frecuencia de la administración de las composiciones farmacéuticas y las vacunas, así como las dosificaciones, variarán de individuo a individuo. En general, las composiciones farmacéuticas y las vacunas se pueden administrar mediante inyección (p. ej., intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), por vía intranasal (p. ej., por aspiración) o por vía oral. Se pueden administrar entre 1 a 3 dosis durante un periodo de 1-36 semanas. Preferentemente, se administran 3 dosis a intervalos de 3-4 meses, y las vacunas de refuerzo se pueden poner periódicamente a continuación. Pueden ser adecuados protocolos alternativos para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de polipéptido o de ADN que, cuando se administra tal y como se ha descrito anteriormente, es capaz de producir una respuesta inmune en un paciente inmunizado para proteger al paciente de la infección con clamidias, durante al menos 1-2 años. En general, la cantidad de polipéptido presente en una dosis (o producido in situ por el ADN en una dosis) se encuentra en el intervalo desde aproximadamente 1 pg hasta aproximadamente 100 mg por kg de hospedador, típicamente, desde aproximadamente 10 pg hasta aproximadamente 1 mg y preferentemente desde aproximadamente 100 pg hasta aproximadamente 1 \mug. El tamaño de la dosis adecuada variará con el tamaño del paciente, pero típicamente estará en el intervalo desde aproximadamente 0,1 ml hasta aproximadamente 5 ml.

Aunque se puede emplear cualquier vehículo adecuado conocido por los expertos en la técnica, en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo varía dependiendo del modo de administración. Para la administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el vehículo comprende preferentemente agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. Las microesferas biodegradables (p. ej., poli(lactato-co-glicolato) también se pueden emplear como vehículos para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Las microesferas biodegradables se describen, por ejemplo, en los documentos de patentes de EE.UU. nº 4.897.268 y 5.075.109.

En general, una dosificación adecuada y un régimen de tratamiento proporcionan el(los) compuesto(s) activo(s) en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico. Dicha respuesta se puede vigilar estableciendo un resultado clínico mejorado en pacientes tratados, comparados con los pacientes no tratados. Los incrementos en las respuestas inmunes preexistentes frente a una proteína de clamidia, se correlacionan generalmente con un resultado clínico mejorado. Tales respuestas inmunes se pueden evaluar generalmente empleando ensayos convencionales de proliferación, citotoxicidad o con citoquinas, que se pueden realizar empleando muestras obtenidas a partir de un paciente antes y después del tratamiento.

La infección con clamidias se puede detectar en una muestra biológica empleando uno o varios polipéptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431, tanto de forma aislada como en combinación. Para una mayor claridad, el término "polipéptido" se empleará cuando se describan métodos de diagnóstico. Sin embargo, está claro para un experto en la técnica que las proteínas de fusión también se pueden emplear en tales métodos.

Tal y como se emplea en esta memoria, una "muestra biológica" es cualquier muestra que contiene anticuerpos, obtenida a partir de un paciente. Preferentemente, la muestra es sangre completa, esputo, suero, plasma, saliva, fluido cerebroespinal u orina. Más preferentemente, la muestra es una muestra de sangre, suero o plasma, obtenida a partir de un paciente. Los polipéptidos se emplean en un ensayo, tal y como se describe posteriormente, para determinar la presencia o la ausencia de anticuerpos para el(los) polipéptido(s) en la muestra, en relación con un valor de punto de corte predeterminado. La presencia de tales anticuerpos indica una previa sensibilización a los antígenos de clamidia, que puede ser indicativa de una infección con clamidias.

Se conocen en la técnica una variedad de formatos ensayos que emplean uno o varios polipéptidos para detectar anticuerpos en una muestra. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En una realización preferida, el ensayo implica el uso de un polipéptido inmovilizado sobre un soporte sólido, para unirse al anticuerpo y retirarlo de la muestra. El anticuerpo unido se puede detectar a continuación empleando un reactivo de detección que contiene un grupo informador. Los reactivos de detección adecuados incluyen anticuerpos que se unen al complejo anticuerpo/polipéptido y al polipéptido libre marcado con un grupo informador (p. ej., en un ensayo de semi-competencia). Alternativamente, se puede utilizar un ensayo de competencia en el que un anticuerpo que se une al polipéptido, se marca con un grupo informador y se permite la unión con el antígeno inmovilizado, después de incubar el antígeno con la muestra. El grado con el que los componentes de la muestra inhiben la unión del anticuerpo marcado con el polipéptido, es indicativo de la reactividad de la muestra con el polipéptido inmovilizado.

El soporte sólido puede ser cualquier material sólido conocido por los expertos en la técnica, al cual se puede fijar el antígeno. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocillo de ensayo en una placa de microtitulación o una membrana de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte también puede ser una perla o un disco, tal como material de vidrio, fibra de vidrio, de látex o de plástico, tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo). El soporte también puede ser una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, tal como los descritos, por ejemplo, en el documento de patente de EE.UU. nº 5.359.681.

Los polipéptidos se pueden unir al soporte sólido empleando una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la materia. En el contexto de la presente invención, el término "unido" se refiere tanto a una asociación no covalente, tal como adsorción, como a una fijación covalente (que puede ser un enlace directo entre el antígeno y los grupos funcionales en el soporte o puede ser un enlace a través de un agente de reticulación). Se prefiere la unión por adsorción a un pocillo en una placa de microtitulación o a una membrana. En esos casos, se puede conseguir la adsorción poniendo en contacto el polipéptido, en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante un periodo de tiempo adecuado. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero típicamente está entre aproximadamente 1 hora y 1 día. En general, la puesta en contacto de un pocillo de una placa de microtitulación de plástico (tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo)) con una cantidad de polipéptido en el intervalo desde aproximadamente 10 ng hasta aproximadamente 1 \mug, y preferentemente aproximadamente 100 ng, es suficiente para que se una una cantidad adecuada de
antígeno.

La fijación covalente del polipéptido a un soporte sólido se puede conseguir generalmente haciendo reaccionar en primer lugar el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará con el soporte y con un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, sobre el polipéptido. Por ejemplo, el polipéptido se puede unir a soportes que tienen un revestimiento adecuado de polímero, empleando benzoquinona o por condensación de un grupo aldehído sobre el soporte con una amina y un hidrógeno activo sobre el polipéptido (véase, p. ej., Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, en A12-13).

El ensayo para diagnóstico puede ser una prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA). Esta prueba se puede realizar poniendo en contacto en primer lugar un antígeno polipeptídico que se ha inmovilizado sobre un soporte sólido, generalmente el pocillo de una placa de microtitulación, con la muestra, de modo que los anticuerpos del polipéptido en la muestra se puedan unir al polipéptido inmovilizado. La muestra no unida se retira a continuación del polipéptido inmovilizado y se añade un reactivo de detección capaz de unirse al complejo anticuerpo-polipéptido inmovilizado. La cantidad de reactivo de detección que permanece unido al soporte sólido, se determina a continuación empleando un método adecuado para el reactivo de detección específico.

Más específicamente, una vez que se ha inmovilizado el polipéptido sobre el soporte tal y como se ha descrito anteriormente, los sitios restantes de unión a proteínas sobre el soporte se bloquean típicamente. Se puede emplear cualquier agente de bloqueo adecuado conocido por los expertos en la técnica, tal como seroalbúmina bovina (BSA) o Tween 20® (Sigma Chemical, St. Louis, MO). El polipéptido inmovilizado se incuba a continuación con la muestra y se permite que el anticuerpo se una al antígeno. La muestra se puede diluir con un diluyente adecuado, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la incubación. En general, un tiempo de contacto adecuado (es decir, tiempo de incubación) es el periodo de tiempo suficiente para detectar la presencia de anticuerpo dentro de una muestra infectada con HGE. Preferentemente, el tiempo de contacto suficiente para conseguir un nivel de unión que sea al menos 95% del conseguido en equilibrio entre anticuerpo unido y no unido. Un experto ordinario en la técnica reconocerá que el tiempo necesario para conseguir equilibrio se puede determinar fácilmente sometiendo a ensayo el nivel de unión que tiene lugar durante un periodo de tiempo. A temperatura ambiente, un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos es generalmente suficiente.

La muestra no unida se puede retirar a continuación lavando el soporte sólido con un tampón adecuado, tal como PBS que contiene 0,1% de Tween 20®. El reactivo de detección se puede añadir a continuación al soporte sólido. Un reactivo de detección adecuado es cualquier compuesto que se une con el complejo inmovilizado de anticuerpo-polipéptido y que se puede detectar mediante cualquiera entre una variedad de medios conocidos entre los expertos en la técnica. Preferentemente, el reactivo de detección contiene un agente de ligación (tal como, por ejemplo, la Proteína A, la Proteína G, inmunoglobulina, lectina o antígeno libre) conjugado con un grupo informador. Los grupos informadores preferidos incluyen enzimas (tales como peroxidasa de rábano picante), sustratos, cofactores, inhibidores, colorantes, radionucleidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes y biotina. La conjugación del agente de ligación con el grupo informador se puede conseguir empleando métodos convencionales, conocidos por los expertos en la técnica. Los agentes de ligación comunes también se pueden adquirir conjugados con una variedad de grupos informadores procedentes de muchas fuentes comerciales (p. ej., Zymed Laboratories, San Francisco, CA y Pierce, Rockford, IL).

El reactivo de detección se incuba a continuación con el complejo de anticuerpo-polipéptido inmovilizado, durante un tiempo suficiente para detectar el anticuerpo unido. Un periodo de tiempo adecuado se puede determinar generalmente a partir de las instrucciones del fabricante o sometiendo a ensayo el nivel de unión que tiene lugar durante un periodo de tiempo. El reactivo de detección no unido se elimina a continuación y el reactivo de detección unido se detecta empleando el grupo informador. El método empleado para detectar el grupo informador depende de la naturaleza del grupo informador. Para los grupos radiactivos, los métodos de recuento del centelleo o la autorradiografía son generalmente adecuados. Los métodos espectroscópicos se pueden utilizar para detectar colorantes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina se puede detectar empleando avidina acoplada a un grupo informador diferente (generalmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos informadores enzimáticos se pueden detectar generalmente por la adición de sustrato (generalmente durante un periodo de tiempo específico), seguido de análisis espectroscópico u otro análisis de los productos de la reacción.

Para determinar la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-clamidia en la muestra, la señal detectada a partir del grupo informador que permanece unido al soporte sólido, se compara generalmente con una señal que se corresponde con un valor de punto de corte predeterminado. En una realización preferida, el valor de punto de corte es la señal promedio obtenida cuando el antígeno inmovilizado se incuba con muestras procedentes de un paciente no infectado. En general, una muestra que genera una señal que es tres desviaciones estándar superior al valor de punto de corte predeterminado, se considera positiva para infección con clamidias. En una realización preferida alternativa, el valor del punto de corte se determina empleando una Curva de Operación Característica del Receptor (ROC), de acuerdo con el método de Sackett y col., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown y col., 1985, págs. 106-107. Resumiendo, en esta realización, el valor de punto de corte se puede determinar a partir de una representación gráfica de pares de tasas de positivos verdaderos (es decir, la sensibilidad) y de tasas de falsos positivos (100% de especificidad) que se corresponden con cada valor posible del punto de corte para el resultado del ensayo diagnóstico. El valor del punto de corte sobre el gráfico que es el más cercano a la esquina superior a mano izquierda (es decir, el valor que incluye el área mayor) es el valor de punto de corte más exacto y una muestra que genera una señal que es superior al valor de punto de corte determinado por este método, se puede considerar positiva. Alternativamente, el valor de punto de corte se puede desviar a la izquierda a lo largo del gráfico para disminuir la tasa de falsos positivos, o hacia la derecha para disminuir la tasa de falsos negativos. En general, una muestra que genera una señal que es superior al valor de punto de corte determinado por este método, se considera positiva para la infección con clamidias.

Otros ensayos diagnósticos se pueden realizar en formato de flujo a través o formato de ensayo de tira, en donde el antígeno se inmoviliza sobre una membrana, tal como nitrocelulosa. En el ensayo de flujo a través, los anticuerpos en la muestra se unen al polipéptido inmovilizado cuando la muestra pasa a través de la membrana. Un reactivo de detección (p. ej., proteína A-oro coloidal) se une entonces al complejo anticuerpo-polipéptido cuando la solución que contiene el reactivo de detección fluye a través de la membrana. La detección del reactivo de detección unido se puede realizar a continuación tal y como se ha descrito anteriormente. En el formato de ensayo de tira, un extremo de la membrana a la que se ha unido el polipéptido se sumerge en una solución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a través de una región que contiene el reactivo de detección y hacia el área del polipéptido inmovilizado. La concentración del reactivo de detección en el polipéptido, indica la presencia de anticuerpos anti-clamidia en la muestra. Típicamente, la concentración del reactivo de detección en ese sitio genera un patrón, tal como una línea, que se puede visualizar. La ausencia de dicho patrón indica un resultado negativo. En general, la cantidad de polipéptido inmovilizado sobre la membrana se selecciona para generar un patrón visualmente discernible, cuando la muestra biológica contiene un nivel de anticuerpos que sea suficiente para generar una señal positiva en un ELISA, tal y como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, la cantidad de polipéptido inmovilizado sobre la membrana está en el intervalo desde aproximadamente 25 ng hasta aproximadamente 1 \mug, y más preferentemente desde aproximadamente 50 ng hasta aproximadamente 500 ng. Dichos ensayos se pueden realizar típicamente con una cantidad muy pequeña (p. ej., una gota) de suero o de sangre del paciente.

Ciertamente, existen numerosos protocolos de ensayos que son adecuados para el uso con polipéptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431. Las descripciones anteriores sólo pretenden ser aclaratorias. Un ejemplo de un protocolo de ensayo alternativo que se puede emplear de forma útil en dichos métodos es una transferencia de tipo Western, en donde las proteínas presentes en una muestra biológica se separan sobre un gel, antes de la exposición a un agente de unión. Tales técnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Los reactivos de diagnóstico pueden comprender también secuencias de ADN que codifican uno o varios polipéptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 431.

Los siguientes Ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no como una vía de limitación.

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Ejemplo metodológico 1

Inducción de la proliferación de linfocitos T y de la producción de interferón-\gamma mediante antígenos de Chlamydia trachomatis

La capacidad de los antígenos de Chlamydia trachomatis recombinantes para inducir la proliferación de linfocitos T y la producción de interferón-\gamma, se determina del modo siguiente.

Las proteínas se inducen mediante IPTG y se purifican mediante cromatografía de afinidad en Ni-NTA agarosa (Webb y col., J. Immunology 157:5034-5041, 1996). Los polipéptidos purificados se escrutan a continuación para estudiar su capacidad de inducir la proliferación de linfocitos T en preparaciones de PBMC. Las PBMCs procedentes de pacientes con C. trachomatis así como procedentes de donantes normales cuyos linfocitos T son conocidos por proliferar como respuesta a los antígenos de clamidia, se cultivan en un medio que comprende RPMI 1640 suplementado con 10% de suero humano reunido y 50 \mug/ml de gentamicina. Los polipéptidos purificados se añaden por duplicado a concentraciones de 0,5 hasta 10 \mug/ml. Después de seis días de cultivo en placas de 96 pocillos de fondo plano, en un volumen de 200 \mul, se retiran 50 \mul de medio de cada pocillo para la determinación de los niveles de IFN-\gamma, tal y como se describe a continuación. Las placas se someten a impulsos con 1 \muCi/pocillo de timidina tritiada durante 18 horas adicionales, se recolectan y se determina la absorción de tritio empleando un contador de centelleo de gases. Las fracciones que tienen como resultado una proliferación en ambos replicados, que es tres veces superior a la proliferación observada en células cultivadas en medio de forma aislada, se consideran positivas.

El IFN-\gamma se mide empleando una prueba inmunoabsorción enzimática (ELISA). Las placas de ELISA se revisten con un anticuerpo monoclonal de ratón, dirigido al IFN-\gamma humano (PharMingen, San Diego, CA) en PBS durante cuatro horas a temperatura ambiente. Los pocillos se bloquean a continuación con PBS que contiene 5% (P/V) de leche en polvo desnatada, durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan seis veces en PBS/0,2% de Tween-20 y las muestras diluidas 1:2 en medio de cultivo en las placas de ELISA, se incuban durante una noche a temperatura ambiente. Las placas se lavan de nuevo y se añade a cada pocillo un suero de IFN-\gamma policlonal de conejo anti-humano, diluido 1:3000 en PBS/10% de suero de cabra normal. Las placas se incuban a continuación durante dos horas a temperatura ambiente, se lavan y se añade IgG anti-conejo acoplada a peroxidasa de rábano picante (Sigma Chemical So., St. Louis, MO), con una dilución 1:2000 en PBS/5% de leche en polvo desnatada. Después de dos horas adicionales de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavan y se añade sustrato TMB. La reacción se detiene después de 20 min con ácido sulfúrico 1 N. La densidad óptica se determina a 450 nm empleando 570 nm como longitud de onda de referencia. Las fracciones que se obtienen como resultado en ambos replicados que proporcionan una DO dos veces superior a la DO media de las células cultivadas sólo en medio, más 3 desviaciones estándar, se consideran positivas.

Empleando la metodología anterior, se observó que la proteína recombinante 1B1-66 (SEQ ID NO: 5) induce una respuesta proliferativa y la producción de IFN-\gamma en una línea de linfocitos T específica de clamidias, empleada para escrutar una genoteca genómica de C. trachomatis LGVII.

Ejemplo metodológico 2

Generación de respuestas de anticuerpos y de linfocitos T en ratones inmunizados con antígenos de clamidia

Los estudios de la inmunogenicidad se realizaron para determinar las respuestas de anticuerpos y de linfocitos T CD4+ en ratones inmunizados con proteínas SWIB o S13 purificadas, formuladas con coadyuvante Montanide, o inmunizaciones basadas en ADN con vectores de expresión pcDNA-3 que contienen las secuencias de ADN para SWIB o S13. SWIB también se denomina clon 1-B1-66 (SEQ ID NO: 1, con la secuencia de aminoácidos correspondiente proporcionada en SEQ ID NO: 5) y la proteína ribosómica S13 también se denomina clon 10-C10-31 (SEQ ID NO: 4, con la secuencia de aminoácidos correspondiente proporcionada en SEQ ID NO: 12). En el primer experimento, grupos de tres ratones C57BL/6 se inmunizaron dos veces y se vigilaron las respuestas de anticuerpos y de linfocitos T CD4+. Las inmunizaciones con ADN eran intradérmicas en la base de la cola y las inmunizaciones con polipéptido se administraron por vía subcutánea. Los resultados de los ensayos convencionales de incorporación de ^{3}H en células de bazo procedentes de ratones inmunizados, muestran una fuerte respuesta proliferativa en el grupo inmunizado con polipéptido SWIB recombinante purificado (SEQ ID NO: 5). Un análisis posterior mediante ensayos de inducción con citoquinas, tal y como se ha descrito previamente, mostró que el grupo inmunizado con el polipéptido SWIB, producía una respuesta medible de IFN-\gamma e IL-4. Se realizaron ensayos posteriores basados en ELISA para determinar la respuesta del isotipo predominante del anticuerpo en el grupo experimental inmunizado con el polipéptido SWIB. La Fig. 1
ilustra que el grupo inmunizado con SWIB proporcionaba una respuesta humoral que era predominantemente IgGI.

En un segundo experimento, los ratones C3H fueron inmunizados tres veces con 10 \mug de proteína SWIB purificada (también denominada clon 1-B1-66, SEQ ID NO: 5) formulada en PBS o Montanide, a intervalos de tres semanas y se recolectaron dos semanas después de la tercera inmunización. Los títulos de anticuerpos dirigidos contra la proteína SWIB, se determinaron por técnicas convencionales basadas en ELISA, mostrando que la proteína SWIB formulada con el coadyuvante Montanide inducía una fuerte respuesta inmune humoral. Las respuestas proliferativas de linfocitos T se determinaron por un ensayo basado en XTT (Scudiero y col., Cancer Research, 1988, 48:4827). Tal y como se muestra en la Fig. 2, los esplenocitos de ratones inmunizados con el polipéptido SWIB más Montanide, producían una respuesta proliferativa específica del antígeno. Además, la capacidad de los esplenocitos procedentes de animales inmunizados para secretar IFN-\gamma como respuesta al polipéptido SWIB recombinante soluble, se determinó empleando el ensayo de inducción con citoquinas, descrito previamente. Los esplenocitos de todos los animales en el grupo inmunizado con el polipéptido SWIB, formulado con el coadyuvante Montanide, secretaban IFN-\gamma como respuesta a la exposición al antígeno SWIB de clamidia, mostrando una respuesta inmune específica de clamidia.

En otro experimento, ratones C3H fueron inmunizados en tres momentos por separado en la base de la cola, con 10 \mug de SWIB purificado o con proteína S13 (C. trachomatis, proteína SWIB, clon 1-B1-66, SEQ ID NO: 5 y proteína S13, clon 10-C10-31, SEQ ID NO: 4) formulados con el coadyuvante SBAS2 (SmithKline Beecham, Londres, Inglaterra). Los títulos de los anticuerpos específicos del antígeno se midieron con ELISA, mostrando que ambos polipéptidos inducían una fuerte respuesta de IgG, estando los títulos en el intervalo de 1 x 10^{-4} hasta 1 x 10^{-5}.

Los componentes IgG1 e IgG2a de esta respuesta estaban presentes en cantidades casi iguales. Las respuestas proliferativas de linfocitos T, específicas del antígeno, determinadas por ensayos de incorporación de ^{3}H convencionales, sobre células de bazo aisladas a partir de ratones inmunizados, eran bastante fuertes para SWIB (50.000 cpm por encima del testigo negativo) e incluso más fuertes para S13 (100.000 cpm por encima del control negativo). La producción de IFN\gamma se sometió a ensayo mediante técnicas convencionales de ELISA a partir de material sobrenadante de un cultivo proliferativo. La estimulación de nuevo in vitro del cultivo con proteína S13 inducía altos niveles de producción de IFN\gamma, aproximadamente 25 ng/ml frente a 2 ng/ml para el testigo negativo. La estimulación de nuevo con la proteína SWIB también inducía IFN\gamma pero en menor grado.

En un experimento relacionado, se inmunizaron ratones C3H en tres momentos por separado con 10 \mug de proteína purificada SWIB o S13 (C. trachomatis, proteína SWIB, clon 1-B1-66, SEQ ID NO: 5 y proteína S13, clon 10-C10-31, SEQ ID NO: 4) mezclados con 10 \mug de toxina colérica. La inmunización de la mucosa fue a través de inoculación intranasal. Las respuestas del anticuerpo específico del antígeno se determinaron por técnicas convencionales de ELISA. Los anticuerpos de IgG específicos del antígeno estaban presentes en la sangre de ratones inmunizados con SWIB, con títulos en el intervalo desde 1 x 10^{-3} hasta 1 x 10^{-4}, pero no eran detectables en los animales inmunizados con S13. Las respuestas de los linfocitos T específicos del antígeno procedentes de esplenocitos aislados, tal y como se midió por la producción de IFN\gamma, proporcionaban resultados similares a los descritos inmediatamente arriba, para la inmunización sistémica.

Un estudio animal se realizó para determinar la inmunogenicidad del epítopo de CTL serovar LGVII CT529, definido por el péptido de consenso de 10 meros CT529 (CSFIGGITYL - SEQ ID NO: 31) que se identificó como un epítopo de CTL restringido a H2-Kd. Ratones BALB/c (3 ratones por grupo) fueron inmunizados tres veces con 25 \mug de péptido combinado con diversos coadyuvantes. El péptido se administró sistémicamente en la base de la cola en SBAS-7 o SBAS-2'' del sistema de coadyuvantes de SKB (SmithKline Beecham, Londres, Inglaterra) o en Montanide. El péptido se administró también intranasalmente mezclado con 10 \mug de toxina colérica (CT). Los ratones sin tratar se emplearon como testigo. Cuatro semanas después de la tercera inmunización, las células del bazo se estimularon de nuevo con células blásticas-LPS sometidas a impulsos con 10 \mug/ml del péptido de consenso de 10 meros CT529, con tres efectores diferentes para las proporciones de LPS-células blásticas: 6, 1,5 y 0,4 en 1 x 10^{6} células/ml. Después de 2 reestimulaciones, las células efectoras se sometieron a ensayo para estudiar su capacidad para lisar células P815 sometidas a impulsos peptídicos, empleando un ensayo de liberación de cromo convencional. Un péptido no relevante procedente de la ovoalbúmina de huevo de pollo, se empleó como testigo negativo. Los resultados muestran que se había producido una respuesta inmune significativa frente al péptido de consenso de 10 meros CT529 y que los linfocitos T específicos del antígeno, capaces de lisar dianas sometidas a impulsos con péptidos, se producían como respuesta a la inmunización con el péptido. Específicamente, las actividades líticas específicas del antígeno se encontraron en el grupo del coadyuvante SBAS-7 y CT, mientras que Montanide y SABS-2'' fracasaban como coadyuvantes de la inmunización del epítopo de CTL.

Ejemplo 3 Respuestas inmunes de líneas de linfocitos T y PBMC humanos frente a antígenos de clamidia

Los ejemplos proporcionados en esta memoria sugieren que existe una población de donantes sanos entre la población general que han sido infectados con C. trachomatis y han generado una respuesta inmune protectora que controla la infección con C. trachomatis. Estos donantes permanecían clínicamente asintomáticos y eran seronegativos para C. trachomatis. Para caracterizar las respuestas inmunes de donantes normales frente a los antígenos de clamidia que se habían identificado por clonación de la expresión de CD4, se sometieron a ensayo PBMC obtenidas a partir de 12 donantes sanos frente a un panel de antígenos recombinantes de clamidia que incluían C. trachomatis-SWIB, C. pneumoniae-SWIB y C. trachomatis-S13, C. pneumoniae-S13. Los datos se resumen en la Tabla I a continuación. Todos los donantes eran seronegativos para C. trachomatis mientras que 6/12 tenían un título positivo para C. pneumoniae. Empleando un índice de estimulación >4 como respuesta positiva, 11/12 de los individuos respondían a los cuerpos elementales de C. trachomatis y 12/12 respondían a los cuerpos elementales de C. pneumoniae. Un donante, AD104, respondía a la proteína recombinante S13 de C. pneumoniae pero no a la proteína S13 recombinante de C. trachomatis, indicando una respuesta específica de C. pneumoniae. Tres de los 12 donantes tenían una respuesta específica de C. trachomatis-SWIB pero no de C. pneumoniae-SWIB, confirmando una infección con C. trachomatis. C. trachomatis-S13 y C. pneumoniae-S13 producían una respuesta en 8/12 donantes, sugiriendo una infección con clamidias. Estos datos muestran la capacidad de SWIB y de S13 para producir una respuesta de los linfocitos T en PBMC de individuos normales del estudio.

TABLA I

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En una primera serie de experimentos, las líneas de linfocitos T se generaron a partir de un individuo hembra sano (CT-10) con una historia de exposición genital a C. trachomatis, estimulando los linfocitos T con cuerpos elementales de C. trachomatis LGV II, tal y como se ha descrito previamente. Aunque el individuo del estudio estaba expuesto a C. trachomatis, no se seroconvirtió y no desarrolló síntomas clínicos, sugiriendo que el donante CT-10 había desarrollado una respuesta inmune protectora frente a C. trachomatis. Tal y como se muestra en la Fig. 3, una línea de linfocitos T primaria específica de clamidias, obtenida a partir del donante CT-10, respondía a SWIB de C. trachomatis pero no a las proteínas recombinantes SWIB de C. pneumoniae, confirmando la exposición de CT-10 a C. trachomatis. El cartografiado de epítopos de la respuesta de los linfocitos T a SWIB de C. trachomatis, mostraba que este donante respondía al mismo epítopo de Ct-SWIB 52-67 (SEQ ID NO: 39) que la línea de linfocitos T TCL-8, tal y como se muestra en al Fig. 4.

Se generaron líneas adicionales de linfocitos T, tal y como se ha descrito anteriormente para diversos pacientes con C. trachomatis. Un resumen del perfil clínico de los pacientes y de las respuestas proliferativas frente a diversos cuerpos elementales de C. trachomatis y de C. pneumoniae y a proteínas recombinantes, se sintetizan en la Tabla II del modo siguiente:

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3

4

Empleando el panel de individuos asintomáticos del estudio (tal y como se han definido anteriormente) y pacientes con C. trachomatis, tal y como se resumen en las Tablas I y II, se realizó un estudio global de las respuestas inmunes de PBMC derivadas de los dos grupos. Brevemente, las células PBMC procedentes de pacientes con C. pneumoniae así como procedentes de donantes normales, se cultivaron en medio que comprendía RPMI 1640 suplementado con 10% de suero humano reunido y 50 \mug/ml de gentamicina. Los polipéptidos purificados, un panel de antígenos recombinantes de clamidia que incluyen SWIB y S13 de C. trachomatis y de C. pneumonia, así como IpdA y TSA de C. trachomatis, se añadieron por duplicado a concentraciones de 0,5 hasta 10 \mug/ml. Después de cultivar durante seis días en placas de 96 pocillos de fondo redondo, en un volumen de 200 \mul, se retiraron 50 \mul de medio de cada pocillo para determinar los niveles de IFN-\gamma, tal y como se describe más abajo. Las placas se sometieron a continuación a impulsos con 1 \muCi/pocillo de timidina tritiada durante otras 18 horas, se recogieron y se determinó la absorción de tritio, empleando un contador de centelleo de gas. Las fracciones que daban como resultado en ambos replicados una proliferación tres veces superior que la proliferación observada en las células cultivadas únicamente en medio, se consideraron positivas.

Las respuestas proliferativas frente a los antígenos recombinantes de clamidia, mostraban que la mayoría de los donantes asintomáticos y de los pacientes con C. trachomatis reconocían el antígeno S13 de C. trachomatis (8/12) y una mayoría de los pacientes con C. trachomatis reconocía el antígeno S13 de C. pneumoniae (8/12), con 4/12 donantes asintomáticos que también reconocían el antígeno S13 de C. pneumoniae. También seis de doce pacientes con C. trachomatis y cuatro de los doce donantes asintomáticos, proporcionaban una respuesta proliferativa frente al antígeno IpdA de C. trachomatis. Estos resultados muestran que el antígeno S13 de C. trachomatis y de C. pneumoniae, el antígeno Swib de C. trachomatis y el antígeno IpdA de C. trachomatis son reconocidos por los donantes asintomáticos, indicando que estos antígenos eran reconocidos durante la exposición a clamidias y se producía una respuesta inmune frente a los mismos. Esto implica que estos antígenos pueden tener una función en la asignación de una inmunidad protectora a un hospedador humano. Además, el antígeno S13 de C. trachomatis y de C. pneumoniae es reconocido igual de bien por los pacientes con C. trachomatis, indicando que puede haber más epítopos compartidos entre C. trachomatis y C. pneumoniae en la proteína S13. La Tabla III resume los resultados de estos estudios.

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TABLA III

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Se inició una serie de estudios para determinar la repuesta inmune celular a corto plazo para líneas de linfocitos T generadas a partir de donantes asintomáticos y pacientes con C. trachomatis. Las respuestas inmunes celulares se midieron con ensayos de proliferación convencionales e IFN-\gamma. Específicamente, la mayoría de los antígenos estaba en forma de clon aislado de E. coli que expresaban antígenos de clamidia, aunque algunas proteínas recombinantes también se emplearon en los ensayos. Los clones de E. coli aislados se titularon sobre células dendríticas obtenidas a partir de 1 x 10^{4} monocitos y después de dos horas, el cultivo se lavó y se añadieron 2,5 x 10^{4} linfocitos T. El ensayo en el que se empleaban las proteínas recombinantes se realizó tal y como se ha descrito previamente. La proliferación se determinó al cabo de cuatro días con impulsos de ^{3}H-tritiada convencionales durante las últimas 18 horas. La inducción del IFN-\gamma se determinó a partir del material sobrenadante del cultivo, recolectado después de estar cuatro días empleando ensayos ELISA, tal y como se ha descrito anteriormente. Los resultados muestran que todos los antígenos de C. trachomatis sometidos a ensayo, excepto el de C.t. -Swib, producían una respuesta proliferativa en una o en varias líneas de linfocitos T diferentes, procedentes de pacientes con C. trachomatis. Además, las respuestas proliferativas se producían en pacientes con C. trachomatis y en donantes asintomáticos para los genes siguientes de clamidia, CT622, groEL, pmpD, CT610 y rS13.

El clon 12G3-83 también contiene secuencias de CT734 y CT764, además de CT622 y por ello estas secuencias génicas pueden tener también epítopos inmunorreactivos. De forma similar, el clon 21G12-60 contiene secuencias de los genes CT229 y CT228 de proteínas hipotéticas, además de CT875; y 15H2-76 también contiene secuencias de CT812 y de CT088, así como homología compartida con el gen sycE. El clon 11H3-61 también contiene secuencias que comparten homología con la proteína virulenta PGP6-D.

TABLA IV

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Ejemplo metodológico 4

Estudios de protección que emplean antígenos de clamidia 1. SWIB

Los estudios de protección se realizaron en ratones para determinar si la inmunización con antígenos de clamidia puede impactar sobre la enfermedad del tracto genital, que sea el resultado de una inoculación de clamidias. Se emplearon dos modelos; un modelo de inoculación intravaginal que emplea un material aislado de humanos que contiene una cepa de Chlamydia psittaci (MTW447) y un modelo de inoculación intrauterina que implica un material aislado de humanos identificado como Chlamydia trachomatis, serovar F (cepa NI1). Ambas cepas inducen la inflamación del tracto genital superior, el cual se parece a la endometritis y salpingitis causadas por Chlamydia trachomatis en mujeres. En el primer experimento, ratones C3H (4 ratones por grupo) se inmunizaron tres veces con 100 \mug del vector de expresión pcDNA-3 que contiene ADN de SWIB de C. trachomatis (SEQ ID NO: 1, con la secuencia de aminoácidos correspondiente proporcionada en SEQ ID NO: 5). Las inoculaciones eran en la base de la cola para una inmunización sistémica. Dos semanas después de la última inmunización, los animales se trataron con progesterona y se infectaron a través de la vagina o por inyección del inóculo en el útero. Dos semanas después de la infección, se sacrificaron los ratones y se seccionaron los tractos genitales, se tiñeron y se examinó la histopatología. Los niveles de inflamación se puntuaron (desde + para muy suave, hasta +++++ para muy grave). Las puntuaciones atribuidas a cada oviducto/ovario por separado se sumaron y se dividieron por el número de órganos examinados para obtener una puntuación promedio de la inflamación para el grupo. En el modelo de inoculación uterina, los animales inmunizados como testigos negativos que recibían un vector vacío mostraban una inflamación compatible con una puntuación media de la inflamación del ovario/oviducto de 6,12, en contraposición con la puntuación 2,62 para el grupo inmunizado con ADN. En el modelo de inoculación vaginal e infección ascendente, los ratones inmunizados como controles negativos tenían una puntuación media de la inflamación del ovario/oviducto de 8,37 frente a 5,00 del grupo inmunizado con ADN. También en un modelo posterior, los ratones vacunados no mostraban signos de oclusión tubárica, mientras que los grupos vacunados como testigos negativos tenían células inflamatorias en el lumen del oviducto.

En un segundo experimento, ratones C3H (4 ratones por grupo) se inmunizaron tres veces con 50 \mug del vector de expresión pcDNA-3 que contiene ADN de SWIB de C. trachomatis (SEQ ID NO: 1, con la secuencia de aminoácidos correspondiente proporcionada en SEQ ID NO: 5) encapsulado en microesferas copoliméricas de ácido láctico y glicólico (PLG); las inmunizaciones se realizaron por vía intraperitoneal. Dos semanas después de la última inmunización, se trató a los animales con progesterona y se infectaron por inoculación de C. psittaci en la vagina. Dos semanas después de la infección, se sacrificaron los ratones y se seccionaron los tractos genitales, se tiñeron y se estudió la histopatología. Se puntuó el nivel de inflamación tal y como se ha descrito anteriormente. Las puntuaciones atribuidas a cada oviducto/ovario por separado, se sumaron y se dividieron entre el número de órganos examinados para obtener una media de la inflamación para el grupo. Los animales inmunizados como controles negativos que recibían el vector vacío encapsulado en PLG, mostraban una inflamación compatible con una puntuación media de la inflamación del ovario/oviducto de 7,28, frente a 5,71 para el grupo inmunizado con ADN encapsulado en PLG, la inflamación en el peritoneo era 1,75 en el grupo vacunado frente a 3,75 para el grupo testigo.

En un tercer experimento, ratones C3H (4 ratones por grupo) se inmunizaron tres veces con 10 \mug de proteína recombinante purificada, SWIB (SEQ ID NO: 1, con la secuencia de aminoácidos correspondiente proporcionada en SEQ ID NO: 5) o S13 (SEQ ID NO: 4, con la secuencia de aminoácidos correspondiente proporcionada en SEQ ID NO: 12) mezclada con toxina colérica (CT); la preparación se administró por vía intranasal después de anestesiar con un volumen de 20 \mul. Dos semanas después de la última inmunización, se trató a los animales con progesterona y se infectaron por inoculación vaginal de C. psittaci o mediante inyección de serovar F de C. trachomatis en el útero. Dos semanas después de la infección, se sacrificaron los ratones y se seccionaron los tractos genitales, se tiñeron y se estudió la histopatología. Se puntuó el grado de inflamación tal y como se ha descrito anteriormente. Las puntuaciones atribuidas a cada oviducto/ovario por separado, se sumaron y se dividieron entre el número de órganos examinados para obtener una puntuación media de la inflamación para el grupo. En el modelo de inoculación uterina, los animales inmunizados como controles negativos que recibían sólo la toxina colérica, mostraban una puntuación media de la inflamación del ovario/oviducto de 4,25 (sólo se analizaron 2 ratones; los otros 2 murieron) frente a 5,00 para el grupo inmunizado con toxina colérica más S13 y 1,00 para el grupo de toxina colérica más SWIB. Los animales infectados sin tratar tenían una puntuación media de la inflamación del ovario/oviducto de 7. En el modelo de inoculación vaginal e infección ascendente, los ratones inmunizados como testigos negativos tenían una puntuación media de la inflamación del ovario/oviducto de 7,37 frente a 6,75 para el grupo inmunizado con la toxina colérica más S13 y 5,37 para el grupo inmunizado con toxina colérica más SWIB. Los animales infectados sin tratar tenían una puntuación media de la inflamación del ovario/oviducto de 8.

Estos tres experimentos descritos anteriormente sugieren que se puede obtener una protección específica de SWIB. Este efecto protector está más marcado en el modelo de infección homóloga, pero sigue estando presente en una infección con estimulación heteróloga con C. psittaci.

2. CT529/Cap1

CT529/Cap1 se identificó previamente como un producto de clamidia que estimula los CTL CD8+. En este ejemplo, intentamos confirmar que la inmunización con Cap1 debería ser protectora en un modelo animal de infección con clamidias.

Para generar virus vaccinia recombinante para suministrar un fragmento inmunógeno de Cap1, un fragmento de ADN que contiene una secuencia Kozak modificada y los pares de bases 319-530 del gen cap1 (CT529), se amplificó a partir de ADN genómico de C. trachomatis L2, empleando PCR y se ligó en pSC11ss (Earl PL, Koenig S, Moss B (1991), "Biological and immunological properties of human inmmunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein: analysis of proteins with truncations and deletions expressed by recombinant vaccinia viruses". J. Virol. 65:31-41). El ADN se digirió con Sail y StuI. La porción del gen cap1 ligado en pSC11ss codifica los aminoácidos 107-176 de la proteína Cap1, que contiene el epítopo CTL identificado previamente, de los aminoácidos 139-147. El plásmido resultante se empleó para transfectar células CV-1 (ATCC nº CCL-70; Jensen FC y col. (1964) "Infection of human and simian tissue cultures with Rous Sarcoma Virus", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 52:53-59) que se infectaron posteriormente con virus vaccinia de tipo silvestre. La recombinación homóloga entre el virus de tipo silvestre y el ADN plasmídico generaba virus vaccinia recombinantes que se habían seleccionado basándose en la expresión de beta-galactosidasa y en la inactivación de la quinasa de timidina, tal y como se ha descrito previamente (Chakrabarti y col. Mol. Cell Biol. 1985, 5(12):3403-9). El virus recombinante se purificó en placa tres veces y se tituló después de crecer en células humanas TK-143B. Las preparaciones víricas se trataron con volúmenes iguales de 0,25 mg/ml de tripsina durante 30 min a 37ºC y se diluyeron en PBS, antes de la inmunización de los ratones. Grupos de 5 ratones se emplearon para todos los grupos experimentales y de testigos. Los datos presentados a continuación son representativos de tres experimentos independientes.

Un grupo de ratones se inmunizó con 10^{6} virus vaccinia recombinantes, por vía i.p. y se les permitió recuperarse durante 3 semanas. Los grupos de testigos negativos se inmunizaron sólo con tampón o con virus vaccinia de tipo silvestre. Como testigo positivo se infectó un grupo de ratones por vía i.v. con 10^{6} i.f.u. de C. trachomatis. Los organismos proporcionados en el grupo de testigos positivos, se había mostrado previamente que se eliminaban en 2 semanas. Al cabo de 3 semanas, los animales de cada uno de los grupos se estimularon por vía i.v. con 10^{6} i.f.u. de C. trachomatis. Tres días después de la estimulación, los ratones se sacrificaron y se determinó el número de i.f.u. por bazo.

El número promedio de organismos encontrados en el bazo de animales inmunizados con el virus vaccinia que expresaba Cap1 (7,1 x 10^{4}), era 2,6 veces menor (p<0,01; análisis de la suma de rangos de Wilcoxon) que el de los animales en los grupos testigos, inmunizados con tampón (1,8 x 10^{5}) o con virus vaccinia de tipo silvestre (1,9 x 10^{5}). Los animales en el grupo positivo tenían 77 veces menos organismos (2,4 x 10^{3}) por bazo que los animales en los grupos de testigos negativos (p<0,01; análisis de la suma de rangos de Wilcoxon). Estos datos muestran que la inmunización con un fragmento inmunógeno de Cap1 puede proporcionar un nivel estadísticamente significativo de protección frente a la infección con C. trachomatis.

<110> Corixa Corporation

\hskip1cm Fling, Steven P.

\hskip1cm Skeiky, Yasir A. W.

\hskip1cm Probst, Peter

\hskip1cm Bhatia, Ajay

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<120> COMPUESTOS Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO Y DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN CON CLAMIDIAS

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<130> 210121.46902PC

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<140> PCT

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<141> 2001-07-20

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<160> 18

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<170> FastSEQ para Version de Windows 3.0/4.0

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<210> 1

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<211> 481

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<212> ADN

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<213> Chlamydia trachomatis

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<400> 1

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7

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<210> 4

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<211> 555

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<212> ADN

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<213> Chlamydia trachomatis

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<400> 4

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8

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<210> 5

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<211> 86

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<212> PRT

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<213> Chlamydia trachomatis

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<400> 5

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9

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<210> 12

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<211> 122

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<212> PRT

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<213> Chlamydia trachomatis

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<400> 12

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10

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<210> 31

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Obtenido en laboratorio

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<400> 31

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\sa{Cys Ser Phe Ile Gly Gly Ile Thr Tyr Leu}

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<210> 39

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Obtenido en laboratorio

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<400> 39

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\sa{Lys Arg Asn Ile Asn Pro Asp Asp Lys Leu Ala Lys Val Phe Gly Thr}

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<210> 56

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<211> 829

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<212> ADN

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<213> Chlamydia trachomatis

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<400> 56

11

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<210> 57

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<211> 1537

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<212> ADN

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<213> Chlamydia trachomatis

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<400> 57

12

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<210> 59

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<211> 552

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<212> ADN

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<213> Chlamydia trachomatis

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<400> 59

13

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<210> 60

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<211> 1180

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<212> ADN

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<213> Chlamydia trachomatis

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<400> 60

14

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<210> 62

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<211> 688

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<212> ADN

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<213> Chlamydia trachomatis

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 62

15

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<210> 87

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<211> 3031

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<212> ADN

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<213> Chlamydia

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<400> 87

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16

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<210> 110

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<211> 1461

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<212> ADN

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<213> Chlamydia

\newpage

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<400> 110

17

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<210> 111

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<211> 267

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<212> ADN

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<213> Chlamydia

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<400> 111

18

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<210> 114

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<211> 976

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<212> ADN

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<213> Chlamydia

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<400> 114

19

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<210> 115

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<211> 995

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<212> ADN

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<213> Chlamydia

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<400> 115

20

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<210> 407

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<211> 1827

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<212> ADN

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<213> Serovar D de Chlamydia trachomatis

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<400> 407

21

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<210> 431

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<211> 609

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<212> PRT

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<213> Serovar D de Chlamydia trachomatis

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<400> 431

22

23

Claims

1. Una composición que comprende:

(a): un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431, o una variante de la misma que tiene al menos un 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de SEQ ID NO: 431; o

(b): un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a); para emplear en la estimulación de una respuesta inmune en un paciente.

2. Una composición que comprende:

(a): un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos un 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de SEQ ID NO: 431; o

(b): un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a); para emplear en el tratamiento o la prevención de una infección con clamidias.

3. Una composición según la reivindicación 1 o 2, que comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos un 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de SEQ ID NO: 431.

4. Una composición según la reivindicación 3, que comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431.

5. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un polipéptido que es un polipéptido de fusión.

6. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un polipéptido que consta de la secuencia de SEQ ID NO:431 o una variante de la misma que tiene al menos un 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de SEQ ID NO: 431.

7. Una composición según la reivindicación 1 o 2, que comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 407.

8. Una composición según la reivindicación 7, que comprende un polinucleótido que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 407.

9. Una composición farmacéutica que comprende una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Una vacuna que comprende una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un agente inmunoestimulante.

11. Uso de (a) un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431 o una variante de la misma que tiene al menos un 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de SEQ ID NO: 431; o de (b) un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a); en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección con clamidias.

12. Uso de (a) un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431, o una variante de la misma que tiene al menos un 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de SEQ ID NO: 431; o de (b) un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a); para la detección de una infección con clamidias en un paciente.

13. Uso de (a) un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 431, o una variante de la misma que tiene al menos un 90% de identidad de la secuencia con la misma, tal y como se determina comparando las dos secuencias alineadas de forma óptima con una ventana de comparación que tiene la longitud completa de SEQ ID NO: 431, o de (b) un polinucleótido que codifica el polipéptido de (a); en la fabricación de un equipo de reactivos para diagnóstico para detectar una infección con clamidias en un paciente.