ES2294606T3 - Procedimiento para la produccion de nano y microcapsulas de proteinas de seda de araña. - Google Patents

Procedimiento para la produccion de nano y microcapsulas de proteinas de seda de araña. Download PDF

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Abstract

rocedimiento para producir nano y microcápsulas que comprende los pasos de: a)proporcionar proteínas de seda de araña; b)formar una solución o suspensión de las citadas proteínas en un disolvente adecuado; c)generar una emulsión de al menos dos fases, conteniendo la citada emulsión la solución o la suspensión formada en b) como primera fase y al menos una fase adicional, la cual es sustancialmente no miscible con la citada primera fase; d)formar un retículo de polímero de las proteínas de seda de araña en la interfase de al menos dos fases; e)separar de la emulsión el retículo de polímero de proteína generado en d)

Description

Procedimiento para la producción de nano y microcápsulas de proteínas de seda de araña.
La presente invención va dirigida a un procedimiento para la producción de nano y microcápsulas, a partir de proteínas de seda de araña. La invención se dirige adicionalmente a nano y microcápsulas obtenibles a través de este procedimiento, al igual que a composiciones alimenticias, cosméticas y farmacéuticas que contienen las mismas.
Las estructuras a pequeña escala resultan de gran interés como vesículas de transporte y como potenciales bloques de construcción para dispositivos futuros. Una de las tareas reside en ser capaz de encapsular reactivos o partículas a pequeña escala y permitir la liberación desencadenada del material encapsulado una vez colocado el mismo en una ubicación adecuada. Una solución para el citado problema reside en la utilización de vesículas químicas, denominadas también nanocápsulas. Las nano-cápsulas están diseñadas para liberar los reactivos tras ser expuestas a un desencadenante o estímulo externo. En esta búsqueda se plantean diversos problemas: el más importante es como construir las citadas nanocápsulas de una manera definida, alrededor de, por ejemplo, reactivos química o biológicamente activos.
Para dar satisfacción a estas necesidades, recientemente se han desarrollado nanocápsulas "híbridas", sensibles al estímulo. Las estructuras (vesículas y también micelos) son obtenidas a partir de auto-ensamblaje de, por ejemplo, copolímeros anfifilo-polibutadieno (PB)-b-poli (ácido glutámico)(PGA) di-bloque, los cuales presentan una conformación sensible al pH. La sensibilidad al pH puede ser utilizada para descargar las vesículas. Aquellos copolímeros PB-b-PGA que presentan un bloque hidrófobo reticulable y un bloque peptídico hidrófilo han sido sintetizados a través de la combinación de polimerización de apertura de anillo y aniónica (Chécot et al., 2002). La polidispersabilidad de los copolímeros es lo suficientemente pequeña como para obtener acumulados auto-ensamblados definidos. Por ejemplo, un copolímero PB40-b-PGA100, en presencia de agua forma vesículas bicapa cerradas denominadas polimersomas (Won et al., 1999). Una propiedad de las vesículas reside en el hecho de que las mismas responden a una variación del pH mediante el cambio en el tamaño (Figura 1). Esta transición debida a modificaciones en el pH resulta reversible y tan solo moderadamente sensible a la salinidad, dado que la misma no está basada en un simple efecto de hinchado de polielectrolito, sino en la naturaleza peptídica del bloque PGA (Figura 1). Estas vesículas resantan no tan solo capaces de encapsular compuestos de bajo peso molecular (tales como moléculas de disolvente, tales como fluoróforos (Chécot et al., 2003)), sino también de estabilizar nanopartículas más grandes. La desventaja de los citados sistemas reside en la parcial incompatibilidad con los sistemas biológicos, los cuales resultan habitualmente altamente sensibles a modificaciones drásticas en el pH, dado que las modificaciones en el pH pueden dar lugar a una pérdida en la actividad biológica de la muestra encapsulada.
La Figura 1 muestra, a afectos ilustrativos, (a) la dispersión dinámica de la luz del radio R_{H} hidrodinámico de peptosoma, en función de la concentración de NaCl y del pH. (b) la representación esquemática del peptosoma y su modificación en tamaño, en función del pH, debido a una transición de estructura secundaria desde tipo serpentín a tipo hélice-alfa. (b) la representación esquemática del peptosoma y su modificación de tamaño, en función del pH, debido a la transición desde la estructura secundaria de tipo serpentín a tipo hélice-alfa, en la parte peptídica.
Otro procedimiento establecido para encapsulación es el auto-ensamblado de partículas coloidales en la interfase aceite/agua. La fuerza motriz para el proceso de auto-ensamblado es la minimización de la energía superficial total -
por lo que pueden utilizarse una amplia variedad de partículas y disolventes. Las citadas emulsiones estabilizadas son bien conocidas como emulsiones Pickering. La estabilización o la reticulación de las partículas conduce a jaulas mecánicamente estables, las cuales pueden ser transferidas a la fase continua. Las ventajas de los así denominados coloidosomas residen en el control del encapsulante y en la facilidad para afinar la estabilidad mecánica y química de la corteza exterior. El auto-ensamblado de las partículas se traduce en una estructura casi cristalina y, por tanto, puede tener lugar la presencia de agujeros entre las partículas. Estos agujeros presentan un filtro selectivo por tamaño, el cual permite el control de la difusión a través de la membrana (Dinsmore et al, 2000). El proceso total puede ser llevado a cabo de una forma biocompatible. No obstante, las propias partículas coloidales no son necesariamente biocompatibles.
El documento US 6.303.150 describe nanocápsulas con paredes de base proteínica reticuladas. La proteína tiene que presentar efectos formadores de película y puede ser seleccionada de entre un grupo de proteínas animales o vegetales, como por ejemplo seda. Para la producción de las paredes de las cápsulas resulta necesaria la presencia de un agente reticulador.
El documento WO 02/47665 describe un procedimiento para la obtención de estructuras microscópicas elásticas selectivamente permeables, auto-ensambladas, identificadas como coloidosomas, las cuales presentan un tamaño de poro controlado, una porosidad y propiedades mecánicas ventajosas. El procedimiento comprende: (a) proporcionar partículas formadas a partir de un material biocompatible en un primer disolvente; (b) formar una emulsión mediante la adición de un primer fluido al citado primer disolvente, siendo la citada emulsión definida mediante gotitas del citado primer fluido rodeadas por el citado primer disolvente; (c) revestir la superficie de las citadas gotitas con las citadas partículas; y (d) estabilizar las citadas partículas sobre la citadas superficie de la citada gotita para formar coloidosomas que tienen un límite elástico de al menos aproximadamente 20 Pascales. El documento WO 02/47665 utiliza polímeros sintéticos biocompatibles para la producción de estos coloidosomas. Constituyen ejemplos de los mismos, poliestireno, polimetilmetacrilato, polialquilenos, sílice y combinaciones de los mismos. Las partículas a partir de las cuales tienen que obtenerse los coloidosomas son estabilizadas, por ejemplo, mediante aglomeración, reticulado químico y similares. No obstante, el procedimiento para la preparación de estos coloidosomas resulta comparativamente difícil y las partículas coloidales utilizadas pueden mostrar propiedades dañinas para aplicaciones in vivo, debido a su naturaleza artificial y no natural. La utilización de partículas coloidales limita también la banda de tamaño de las cortezas, dado que la utilización de coloides limita la bolsa de tamaño mínimo con agujeros definidos.
Por lo tanto, constituye un problema subyacente a la presente invención el proporcionar nano y microcápsulas que sean altamente biocompatibles y, por tanto, adecuadas para aplicaciones in vivo. Constituye otro problema de esta invención el obtener nano y microcápsulas que sean capaces de albergar diferentes tipos y cantidades variantes de agentes o de nutrientes eficaces, etc. Constituye un problema adicional subyacente en la presente invención el de proporcionar nano y microcápsulas que sean biodegradables, a saber, capaces de una liberación controlada de los citados agentes eficaces, etc, in vivo, por ejemplo, en aplicaciones tópicas o generalizadas.
Estos problemas son solucionados a través del contenido de las reivindicaciones independientes. Las realizaciones preferidas se mencionan en las reivindicaciones dependientes.
En la presente invención, de forma sorprendente, resultó que las proteínas de seda de araña pueden ser utilizadas como base para formar micro y nanocápsulas, las cuales pueden ser utilizadas para diversas aplicaciones in vivo. Resultó en particular que esto puede ser efectuado a través de un procedimiento mejorado para la producción de las citadas cápsulas, el cual evita la necesidad de utilizar pasos para unir o estabilizar las partículas a partir de las cuales se obtienen las cápsulas, a través de la adición de reticuladores de tipo químico o que requieren la aglomeración o situación similar, la cual podría tener efectos perjudiciales sobre los agentes que tienen que ser envasados en las citada micro y nano cápsulas.
Dado que las técnicas de encapsulación utilizadas más habitualmente (ver, por ejemplo, el documento WO 02/
47665) están basadas en partículas o macromoléculas no biológicas, los inventores desarrollaron un nuevo procedimiento de encapsulación estable basado en proteínas de seda de araña auto-ensamblantes. A diferencia de otras tecnologías de encapsulación, en el presente procedimiento, la naturaleza hidrófoba/hidrófila de la superficie de la emulsión no se utiliza tan solo para ensamblar partículas coloidales, sino que se utiliza también como fuerza motriz para la inmovilización del coloide a través de la coalescencia y la formación de entramado polimérico (estabilización). Este procedimiento representa no tan solo un procedimiento para la producción de nano y microcápsulas poliméricas obtenidas a partir de una nueva clase de coloides biocompatibles, sino que representa también un nuevo enfoque para la formación de entramados poliméricos utilizando proteínas. La gran ventaja de las nano y microcápsulas obtenidas a partir de este procedimiento es la biocompatibilidad y la funcionalidad impartida a las microcápsulas por las proteínas. Esto permite el control de los mecanismos de liberación a través de diversos medios: cambios en el pH, cambios en la temperatura o en la actividad de las proteasas.
Por ejemplo, las nano o microcápsulas podrían ser destruidas y sus ingredientes liberados química, física (por ejemplo, mediante fuerzas de corte) o biológicamente (a través de digestión proteolítica) in vivo.
El auto-ensamblado de las proteínas de seda de araña en la interfase fue obtenida mediante la introducción de la proteína en la fase acuosa de una emulsión agua/aceite (ver la Figura 2). La minimización de la energía superficial fue conduciendo las proteínas hacia la interfase e indujo una acumulación de los monómeros hacia un entramado polimérico denso (Figura 3).
Las bolsas/globos de araña formados a partir de este procedimiento son rellenados, por ejemplo, con los contenidos de la fase acuosa y pueden existir en disolventes orgánicos, alcoholes, al igual que en agua (Figura 3). Por lo tanto, se observa una estabilidad inesperada en entornos fuertemente variantes. En principio, resulta también posible el auto-ensamblado de proteínas en una superficie de emulsión inversa - encapsulando por tanto el contenido de la fase aceite (ver también más adelante).
Sorprendentemente, las bolsas/globos pueden ser rellenados con proteínas, reactivos químicos, partículas de escala del orden de nano y micrómetros, lo cual se muestra ejemplificado mediante el rellenado de las partículas con partículas de Dextrano fluorescentemente marcadas con (FITC) (Figura 4).
La impermeabilidad de la membrana y la estabilidad mecánica de las bolsas frente a las tensiones osmóticas son ambas relativamente elevadas, considerando el espesor de la membrana. Las imágenes de microscopía electrónica revelan que el grosor está comprendido entre 10 y 70 nm (Figura 5).
Se demostró el presente planteamiento mediante la utilización de proteínas de seda de araña sintéticas, en particular mediante la utilización de la secuencia sintética de C_{16} (Huemmerich et al., 2004) para crear una encapsulación biológica de los agentes activos.
En general, las sedas de araña son polímeros proteínicos que muestran propiedades físicas extraordinarias, pero existe todavía una información limitada acerca de la composición de las diversas sedas producidas por diferentes arañas (ver Scheibel, 2004). De entre los diferentes tipos de sedas de araña, las draglines procedentes de la tejedora esférica dorada Nephila clavipes y la araña de cruz de jardín Araneus diadematus son estudiadas con mayor intensidad. Las sedas dragline están generalmente compuestas por dos importantes proteínas y no está claro si proteínas adicionales desempeñan un papel significativo en el ensamblado de la seda y en la estructura final de la seda. Los dos principales componentes proteínicos de draglines procedentes de Araneus diadematus son ADF-3 y ADF-4 ( Araneus Diadematus Fibroin).
Los genes que codifican para proteínas tipo seda fueron generados utilizando una estrategia de clonado que estaba basada en la combinación de módulos de DNA sintéticos y secuencias genéticas auténticas, amplificadas mediante PCR (Huemmerich et al., 2004). Las proteínas de seda dragline ADF-3 y ADF-4 obtenidas a partir de la araña de jardín Areneus diadematus fueron elegidas como plantilla para las construcciones sintéticas. Una estrategia de clonado parecida permitió la combinación controlada de diferentes módulos de DNA sintéticos, al igual que los fragmentos de gen auténticos. Se diseñó un vector de clonado que comprendía una casette de clonado con un espaciador que actuaba como conservador de ubicación para los genes sintéticos (Huemmerich et al., 2004).
Con vistas a imitar la secuencia repetitiva de ADF-4, se ha diseñado una unidad de repetición conservada única, con vistas a obtener un módulo de consenso denominado C, el cual fue multimerizado para obtener la proteína repetitiva C_{16}, la cual fue utilizada como ejemplo en el enfoque proporcionado.
Existen diversas posibles aplicaciones para las bolsas/globos de seda de araña presentados, que van desde alimentos funcionales hasta aplicaciones cosméticas. Por ejemplo, la encapsulación en tecnología de alimentación podría ofrecer protección a determinados ingredientes, tales como vitaminas, frente a un entorno oxidante. En otra aplicación en tecnologías de alimentación, ingredientes tales como aceite de pescado podrían ser enmascarados en lo que hace referencia a su sabor. En aplicaciones farmacéuticas, la barrera de difusión de la corteza proteínica permite procedimientos de liberación lenta (controlada) para el material encapsulado. El diseño adicional de las cortezas de proteína podría dar lugar a un receptor de liberación definida, el cual libera el contenido tan solo después de activación utilizando determinadas proteasas u otros tipo de desencadenantes. En cosméticos, el transporte de ingredientes activos acuosos en la piel podría verse facilitado a través de las presentes bolsas/globos, después de la degradación lenta de la corteza proteínica, por ejemplo, a través de las proteasas de la piel. Además, para liberar el contenido tras exposición a la piel, puede utilizarse corte mecánico.
La presente invención en particular va dirigida a los siguientes aspectos y realizaciones:
Según un primer aspecto, la presente invención va dirigida a un procedimiento para la producción de nano y microcápsulas que comprende los pasos de:
a) proporcionar proteínas de seda de araña:
b) formar una solución o suspensión de las citadas proteínas en un disolvente adecuado;
c) generar una emulsión de al menos dos fases, conteniendo la citada emulsión la solución o suspensión formada en b) como primera fase y al menos una nueva fase, que es sustancialmente no miscible con la citada primera fase;
d) formar un retículo de polímero de las proteínas de seda de araña en la interfase de al menos dos fases;
e) separar de la emulsión la red de polímero de proteína generada en (d).
Tal y como se ha explicado anteriormente, de forma inesperada resultó que la formación de la red de polímero en el paso (d) no requiere la adición de ningún ingrediente adicional (por ejemplo, reticuladores) y no existe necesidad de pasos adicionales como la agrupación, reticulación, etc..
Debe hacerse notar que la expresión "proteína de seda de araña", tal y como se utiliza en el presente documento comprende no tan solo la totalidad de secuencias naturales sino la totalidad de secuencias artificiales o sintéticas que derivaron de las mismas.
Por consiguiente, las secuencias de seda de araña pueden ser derivadas a partir de secuencias que son denominadas "auténticas" en el presente documento. Este término significa que las secuencias de ácido nucleico subyacentes son aisladas a partir de su entorno natural sin llevar a cabo modificaciones sustanciales en la propia secuencia. La única modificación, cuya ocurrencia es aceptada, se produce cuando la secuencia de ácido nucleico auténtica es modificada con vistas a adaptar la citada secuencia a la expresión en un huésped, sin modificar la secuencia de aminoácidos. Las secuencias preferidas son NR3 (SEQ ID NO: 10, derivada de ADF-3) y NR4 (SEQ ID NO: 11; derivada de ADF-4). En ambas secuencias, para una traducción eficaz, el codon AGA (Arg), que es traducida raramente en E. coli, fue mutado a CGT (Arg) utilizando mutagénesis PCR.
Las secuencias auténticas no repetitivas son preferiblemente derivadas de la región amino-terminal no repetitiva (proteínas flageliformes) y/o la región carboxilo terminal no repetitiva (proteínas dragline y flageliformes) de una proteína de seda de araña de origen natural. Los ejemplos preferidos de estas proteínas serán indicados más adelante.
Según una nueva realización, las secuencias auténticas no repetitivas proceden de la región aminoterminal no repetitiva (proteínas flageliformes) y/o la región carboxi-terminal no repetitiva (proteínas dragline y flageliformes) de una proteína de seda de araña de origen natural.
Las secuencias auténticas preferidas de proteínas flageliformes son las secuencias de aminoácido y las secuencias de ácido nucleico de FlagN-NR (SEQ ID NO: 31 y 31) y FlagC-NR (SEQ ID Nos: 33 y 34).
Las proteínas de seda de araña recombinantes de la invención pueden ser generalmente derivadas a partir de proteínas dragline de araña, procedentes de la glándula ampollácea mayor de la araña y/o de proteínas derivadas de la glándula flageliforme.
Según una realización, las proteínas de seda de araña recombinantes (sintéticas/artificiales) que pueden ser utilizadas en la presente invención proceden generalmente de proteínas dragline de araña que proceden de la glándula ampollácea mayor de la araña y/o de las proteínas derivadas de la glándula flageliforme.
Resulta generalmente preferido seleccionar las secuencias flageliformes y/o dragline a partir de proteínas flageliformes o dragline de arañas de red esférica (Araneidae y Araneoids).
Más preferiblemente, las proteínas dragline y/o flageliformes proceden de una o más de las siguientes arañas: Arachnura higginsi, Araneus circulissparsus, Araneus diadematus, Argiope picta, Araña de jardín bandada (Argiope trifasciata), Araña de red dorada de Batik (Nephila antipodiana), Araña de tienda de Beccari (Cytophora beccarii), Araña que cae del pájaro (Celaenia excavata), Araña de púas blancas y negras (Gasteracantha kuhlii), Araña de jardín blanca y negra (Argiope aurantia), Araña Bolas (Ordgarius furcatus), Arañas Bolas-Araña magnífica (Ordgarius magnificus), Araña del marinero Brown (Neoscona náutica), Araña con patas de Brown (Neoscona rufofemorata), Araña de cabeza negra coronada (Zygiella calyptrata), Araña común de jardín (Parawixia dehaani), Araña de esfera común (Neoscona oxancensis), Araña de esfera con púas de tipo cangrejo (Gasteracantha cancriformis (elipsoides)), Araña con púas curvadas (Gasteracantha arcuata), Cyrtophora moluccensis, Cyrtophora parnasia, Dolophones conifera, Dolophones turrigera, Araña con púas de Doria (Gasterocantha doriae), Araña con púas de doble mancha (Gasterocantha mammosa), Araña de tienda de cola doble (Cyrtophora exanthematica), Aculeperia ceropegia, Eriophora pustulosa, Anepsion plana (Anepsion depressium), Araña joya de cuatro púas (Gasterocantha quadrispinosa), Araña de red esférica de jardín (Eriophora transmarina), Tejedora en esfera de Lchen gigante (Araneus bicentenarius), Araña de red dorada (Nephila maculata), Araña con púas de Hasselt (Gasteracantha hasseltii), Tegenaria atrica, Heurodes turrita, Araña ciclosa de isla (Cyclosa insulana), Araña joya o de púas (Astracantha minax), Araña de jardín de Kidney (Araneus mitificus), Araña de jardín de Laglaise (Eriovixia laglaisei), Araña ciclosa Long-Bellied (Cyclosa bífida), Araña Malabar (Nephilengys malabarensis), Araña de cruz de San Andrés multicoloreada (Argiope versicolor), Araña de tronco de árbol ornamental (Herenneia omatissima), Araña de cruz de San Andrés oval (Argiope aemula), Araña de tienda roja (Cyrtophora unicolor), Araña de tienda rusa (Cyrthophora hirta), Araña de cruz de San Andrés (Argiope keyserlingi), Acusilas Scarlet (Acusilas coccineus), Argiope de plata (Argiope argentata), Tejedora en esfera de espalda con púas (Gasteracantha cancriformis), Tejedora en esfera manchada (Neoscona domiciliourum), Cruz de San Andrés (Argiope aetheria), Araña Cruz de San Andrés (Argiope Keyserlingi), Araña de trozo de árbol (Poltys Illepidus), Araña triangular (Arkys clavatus), Araña triangular (Arkys lancearius), Araña de dos púas (Poecilopachys australasia), Nephila especies, por ejemplo, Nephila clavipes, Nephila senegalensis, Nephila madagascariensis y muchas más (para especies de araña adicionales, ver más adelante). Muy preferiblemente, las proteínas dragline son derivadas de Araneus diadematus y las proteínas flageliformes de Nephila clavipes.
En el contexto de esta invención, debe quedar claro que una proteína de seda de araña recombinante puede no tan solo comprender secuencias de proteína procedentes de una especie, sino también contener secuencias derivadas de diferentes especies de araña. Como ejemplo, la secuencia o las secuencias se proteína de seda de araña repetitivas sintéticas podrían proceder de una especie, la secuencia o las secuencias de proteína de seda de araña no repetitivas auténticas, de otra. Como ejemplo adicional, resulta también posible diseñar una proteína de seda de araña recombinante que contenga más de un tipo de secuencia repetitiva, en la que los diferentes tipos procedan de especies diferentes.
Según una realización preferida, la proteína dragline es ADF-3, ADF-4, MaSp I, MaSp II y la proteína flageliforme es FLAG. El término ADF-3/4 se utiliza en el contexto de proteínas MaSp producidas por Araneus diadematus (fibroina-3/-4 de Araneus diadematus). Ambas proteínas, ADF-3 y-4, pertenecen a la clase de proteínas MaSp II (espidroina II ampollácea mayor).
En una realización adicional, la secuencia de ácido nucleico proporcionada es ADF-3 (SEQ ID NO.1) y/o ADF-4 (SEQ ID NO: 2), o una variante de las mismas.
Debe destacarse el hecho de que en la invención se contemplan dos tipos diferentes de secuencias de codificación y de proteínas ADF-3 y ADF-4 (en el presente documento: secuencia de "tipo natural" y, en segundo lugar, una variante de las mismas, codificada por la SEQ ID NO: 1 (ADF-3) y 2 (ADF-4). Las secuencias de tipo natural ya fueron publicadas y se encuentran disponibles bajo los números de acceso U47855 y U47856 (SEQ ID NO: 8 y 9).
Nuevas proteínas de seda de araña, las cuales pueden ser utilizadas en esta invención (a saber, en solitario o en combinación con nuevas proteínas) y sus números de acceso a la base de datos son:
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espiridroina 2 [Araneus bicentenarius]gi|2911272
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proteína-1 de seda dragline de glándula ampollácea mayor [Araneus ventricosus]gi|27228957
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proteína-2 de seda dragline de glándula ampollácea mayor [Araneus ventricosus]gi|27228959 espidroina-1 ampollácea [Nephila madagascariensis]gi|13562006
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espidroina-1 ampollácea mayor [Nephila senegalensis]gi|13562010
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espidroina-1 ampollácea mayor [Latrodectus geométricus]gi|13561998
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espidroina-1 ampollácea mayor [Argiope trifasciata]gi|13561984
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espidroina-1 ampollácea mayor [Argiope aurantia]gi|13561976
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espidroina-2 de proteína de seda dragline [Nephila clavata]gi|16974791
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espidroina-2 ampollácea mayor [Nephila senegalensis]gi|13562012
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espidroina-2 ampollácea mayor [Nephila madagascariensis]gi|13562008
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espidroina-2 ampollácea mayor [Latrodectus geometricus]gi|13562002
Según otra realización preferida, la proteína flageliforme es SEQ ID NO. 6 (FlagN) y/o SEQ ID NO: 7 (Flag-C) o una de sus variantes.
No obstante, pueden también utilizarse secuencias flageliformes conocidas y publicadas, en particular las siguientes:
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cds parcial de proteína de seda flageliforme [Nephila clavipes]gi|2833646
-
cds parcial de proteína de seda flageliforme [Nephila clavipes]gi|2833648
En una realización preferida, la proteína de seda de araña recombinante comprende una o más secuencias repetitivas sintéticas que contienen una o más secuencias consensus que contienen polialanina. Esas secuencias polialanina pueden contener entre 6 y 9 restos alanina. Ver, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, que contiene diversos motivos polialanina de 6 restos alanina.
Preferiblemente, la polialanina que contiene la secuencia consensus procede de ADF-3 y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.3 (módulo A) o una de sus variantes. El módulo A contiene una polialanina que tiene 6 restos alanina. Una nueva polialanina preferida que contiene secuencia consenso, derivada de ADF-4, es el módulo C (SEQ ID NO: 5), que contiene 8 restos alanina.
Según una nueva realización preferida, en la proteína de seda recombinante de la invención, la secuencia repetitiva sintética procede de ADF-3 y comprende una o más repeticiones de la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:4 (módulo Q), o una de sus variantes.
En términos más generales, una secuencia repetitiva sintética puede también contener los motivos generales: GGX o GPGXX, a saber, regiones ricas en glicina. Tal y como se ha comentado anteriormente, estas regiones proporcionarán flexibilidad a la proteína y, por tanto, al hilo formado a partir de la proteína de seda de arana recombinante que contiene los citados motivos.
Debe destacarse el hecho de que los módulos específicos para la secuencia repetitiva sintética a utilizar en la presente invención pueden ser también combinados los unos con los otros, a saber, quedan también englobados por la presente invención los módulos (unidades de repetición) que combinan A y Q, Q y C, etc. Si bien el número de módulos que tiene que ser introducido en la proteína de seda de araña no está restringido, resulta preferido utilizar un número de módulos de la secuencia repetitiva sintética para cada una de las proteínas recombinantes que oscila preferiblemente entre 5 y 50 módulos, más preferiblemente entre 10 y 40 módulos y, muy preferiblemente, entre 15 y 35 módulos.
La secuencia repetitiva sintética comprende preferiblemente una o más de (AQ) y/o (QAQ) como unidades de repetición. De forma incluso más preferida, la secuencia de repetición sintética es (AQ)_{12}, (AQ)_{24}, (QAQ)_{8} ó (QAQ)_{16}.
Cuando la secuencia de repetición sinética procede de ADF-4, la misma puede preferiblemente comprender una o más repeticiones de la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 5 (módulo C) o una de sus variantes, tal y como se ha comentado anteriormente, en donde la secuencia repetitiva sintética global es C_{16} o C_{32}.
Las realizaciones preferidas para las proteínas de seda de araña recombinante completa de la invención son
(QAQ)_{8}NR_{3}, (QAQ)_{16}NR3, (AQ)_{12}NR3, (AQ)_{24}NR3, C_{16}NR4 y C_{32}NR4, a saber, proteínas que comprenden o están compuestas por las citadas secuencias.
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Debe destacarse el hecho de que la configuración indicada anteriormente para la secuencia repetitiva sintética (utilizando el sistema A, Q y C) se aplica también a la totalidad de unidades de repetición descritas anteriormente, por ejemplo, la totalidad de polialaninas que contienen secuencias pueden ser utilizadas como A y/o C y todas las secuencias ricas en glicina pueden ser utilizadas como Q.
Los módulos K (SEQ ID NO: 35 y 36), sp (SEQ ID NO:37 y 38), X (SEQ ID NO: 39 y 40) e Y (SEQ ID NO: 41 y 42) son nuevos módulos para secuencias de repetición sintéticas derivadas de secuencias flageliformes.
La secuencia de repetición sintética comprende también, preferiblemente, Y_{8}, Y_{16}, X_{8}, X_{16}, K_{8}, K_{16}.
Además, resulta también posible combinar aquellas secuencias derivadas de ADF-3, ADF-4 y Flag en una secuencia recombinante.
En la presente invención, resulta no obstante fuertemente preferido utilizar proteínas de seda de araña en el paso a), las cuales son seleccionadas a partir de o contienen secuencias del grupo de secuencias ADF-4 y derivados de las mismas, incluyendo C_{16}, C_{16}NR_{4}, C_{32} y/o C_{32}NR_{4}.
Según una nueva realización, el disolvente en (b) y/o los disolventes de al menos una nueva fase son seleccionados de entre el grupo que comprende disolventes hidrófilos, preferiblemente agua, alcoholes tipo etanol, glicerol, o disolventes lipófilos, preferiblemente aceites naturales, tales como aceites de planta o de origen animal, aceites sintéticos, tales como migliol, aceite de silicio, disolventes orgánicos, tales como hidrocarburos aromáticos, por ejemplo, tolueno, benceno, etc.
Debe destacarse el hecho de que una fase única puede contener también mas de un disolvente (a saber, una mezcla), en la medida en que los disolventes sean sustancialmente idénticos. La expresión "sustancialmente idénticos" significa que los disolventes tienen propiedades de solubilidad similares, formando de este modo únicamente una fase común. Por lo tanto, dentro de la expresión "sustancialmente idénticos" se incluyen disolventes en los cuales no se pueden observar fases separadas si los disolventes son mezclados. Como ejemplo, dos o más disolventes lipófilos pueden ser combinados en una fase, por ejemplo un aceite de planta (por ejemplo, aceite de oliva y aceite de ricino) y migliol y/o hexadecano. O, como alternativa, una fase hidrófila puede comprender dos o más componentes hidrófilos, por ejemplo, agua, glicerol y similares.
Tal y como se ha mencionado anteriormente, el único requisito es que el sistema de emulsión para la producción de las nano y microcápsulas de la invención tenga al menos dos fases, siendo las fases sustancialmente no miscibles.
En el paso (c) del presente procedimiento pueden utilizarse todos los tipos conocidos de emulsión, por ejemplo, emulsiones de tipo W/O (agua/aceite), O/W (aceite/agua), O/W/O (aceite/agua/aceite) o W/O/W (agua/aceite/agua). Estos tipos de emulsiones son bien conocidos en la técnica y para información adicional se hace referencia, por ejemplo, a "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición o a información adicional disponible.
Un procedimiento preferido para la formación de emulsiones de la presente invención se basa en la producción de una miniemulsión. Las miniemulsiones son dispersiones de gotitas de aceite estabilizadas críticamente con un tamaño entre 50 y 500 nm, preparadas a través de corte de un sistema que contiene aceite, agua, un tensioactivo y una sustancia hidrófoba. Las polimerizaciones en las citadas miniemulsiones, cuando se preparan con cuidado, dan lugar a partículas que tienen aproximadamente el mismo tamaño que las gotitas iniciales. Esto significa que la formulación adecuada de una miniemulsión suprime la coalescencia de las gotitas o la maduración de Ostwald. La preparación de las miniemulsiones se efectúa a través de dispositivos de corte elevado, tales como homogeneizadores a presión elevada y ultrasonidos. Se hace referencia a las diversas publicaciones de K. Landfester y colaboradores.
En el caso de una emulsión de tipo W/O (agua/aceite), la fase W (acousa)(hidrófila) forma las gotitas de emulsión y, en este caso, las proteínas de seda de araña están contenidas en la fase W (acuosa). La fase O (aceite) es la fase lipófila y forma la fase continua.
En el caso de una emulsión de tipo O/W (aceite/agua), la fase O (aceite) (lipófila) forma las gotitas de emulsión y, en este caso, las proteínas de seda de araña están contenidas en la fase O (aceite). La fase W (acuosa) es la fase hidrófila y forma la fase continua.
Los tensioactivos utilizados en las emulsiones mencionadas anteriormente pueden ser seleccionados a partir de aquellos compuestos que utilizaría un experto en la materia, en base al conocimiento disponible en el campo de las ciencias farmacéuticas y relacionadas. Una selección de ejemplos de tensioactivos para ser utilizados en la obtención de las presentes emulsiones incluye ésteres de ácidos de gliceroles, sorbitol y otros alcoholes multifuncionales, preferiblemente, monoestearato de glicerol, monolaurato de sorbitan, o monooleato de sorbitan; poloxaminas; éteres polioxietileno y ésteres de polioxietileno; triglicéridos etoxilados; fenoles etoxilados y difenoles etoxilados; sales metálicas de ácidos grasos, sales metálicas de sulfatos de alcohol graso, laurilsulfato sódico; y sales metálicas de sulfosuccinatos; polisorbatos, más preferiblemente polisorbato 20, 40, 60 y 80; poloxámeros, polietilenglicoles; y mezclas de las citadas sustancias.
No obstante, debe destacarse de forma explícita que la utilización de un tensioactivo no constituye una característica esencial de esta invención. El experto en la materia conoce sistemas de emulsión los cuales no requieren tensioactivos.
En una realización preferida de la presente invención, el disolvente utilizado en 1b) contiene adicionalmente uno o más agentes farmacéuticos, agentes cosméticos, artículos alimenticios o aditivos alimenticios. En otras palabras, los ingredientes adicionales estarán habitualmente presentes en la fase, la cual contiene también las proteínas de seda de araña. En este caso, uno o más ingredientes/agentes serán encapsulados en retículo de polímero que se forma en la fase de interfase.
Como alternativa, resulta también posible adicionar los agentes mencionados anteriormente a la fase continua, la cual no contiene las proteínas de seda de araña. En este caso, las nano y microcápsulas de la invención serán revestidas por los citados agentes.
Como alternativa adicional, los agentes pueden ser introducidos en las nano y microcápsulas de la invención, después de que han sido obtenidas a través del presente procedimiento.
Esto puede ser efectuado mediante el hinchado de la membrana con determinados disolventes y dejando que el encapsulante (agente eficaz) se difunda en el interior. El hinchamiento puede ser también efectuado a través de temperatura, presión y no tan solo mediante disolventes, sino utilizando también otros medios químicos (tales como agentes químicos, pH y otros).
Resulta también posible incorporar el encapsulante en la membrana. Este planteamiento puede proporcionar propiedades de liberación corregidas o mejoradas que las derivadas de la encapsulación del encapsulante en su interior.
El tipo de agente que es incorporado adicionalmente en las nano y microcápsulas de la invención no queda restringido de este modo.
Por ejemplo, el agente farmacéutico puede ser seleccionado a partir del grupo que comprende analgésicos; hipnóticos y sedantes; fármacos para el tratamiento de trastornos psiquiátricos, tales como depresión y esquizofrenia; anti-epilépticos y anti-convulsivos; fármacos para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y de Huntington, envejecimiento y la enfermedad de Alzheimer; fármacos dirigidos al tratamiento de traumatismos del CNS o ictus; fármacos para el tratamiento de la adicción y el abuso de fármacos; agentes de quimioterapia para el tratamiento de infecciones parasitarias y enfermedades provocadas por microbios; agentes inmunosupresores y fármacos anticancerígenos; sustancias para diagnóstico para uso en medicina; agentes inmunoactivos e inmunorreactivos; antibióticos; antiespasmódicos; antihistamínicos, productos antinausea; relajantes; estimulantes; dilatadores cerebrales; psicotrópicos; dilatadores y constrictores vasculares; anti-hipertensivos; fármacos para el tratamiento de la migraña; hipnóticos, agentes hiperglicémicos e hipoglicémicos, anti-asmáticos, agentes antivirales y mezclas de los
mismos.
Los artículos alimenticios y los aditivos alimenticios pueden ser seleccionados de entre el grupo que comprende vitaminas (ácido ascórbico, acetato de tocoferol y similares), minerales (por ejemplo, calcio, magnesio, potasio, sodio), elementos traza (selenio), extractos de origen natural, aceites naturales (aceite de pescado), etc.
Los agentes cosméticos pueden ser seleccionados, por ejemplo, a partir de acetato de tocoferol, aceites de origen natural o sintético, extractos de planta, agentes absorbentes de UV, desinfectantes, agentes anti-irritantes, repelentes.
Debe destacarse el hecho de que en el disolvente podrían encontrarse presentes agentes en forma disuelta, suspendida o sólida. En el último caso, se proporciona un núcleo sólido, el cual es revestido con las proteínas de seda de araña de la presente invención.
En una realización preferida, la separación de la red de polímero en el paso (e) se efectúa por medio de centrifugación o a través de destrucción de la emulsión formada en el paso (c) y la formación de una solución de una fase. No obstante, con vistas a separar las nano- y microcápsulas de la presente invención del sistema de emulsión, pueden utilizarse otros procedimientos.
La temperatura utilizada en los pasos (b)-(e) oscila entre 5 y 40ºC, preferiblemente entre 10 y 30ºC y, más preferiblemente a temperatura ambiente. El pH utilizado en los pasos (b)-(e) oscila entre 3 y 9, preferiblemente entre 5 y 8, más preferiblemente 7.
El tamaño de las gotitas de emulsión y de las nano y micropartículas derivadas de las misma está preferiblemente comprendido entre 10 nm y 20 \mum, preferiblemente entre 500 nm y 10 \mum, y muy preferiblemente de aproximadamente 5 \mum. El grosor de la pared de las nano y microcápsulas obtenidas está preferiblemente comprendido entre 5 y 100 nm, más preferiblemente entre 10 y 70 nm (ver por ejemplo la Fig. 5).
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona nano y micropartículas obtenibles a través del procedimiento descrito anteriormente.
Un tercer aspecto de la presente invención va dirigido a una composición farmacéutica que contiene nano y microcápsulas, tal y como se ha definido anteriormente, y uno o más soportes farmacéuticamente aceptables. Por lo tanto, los componentes activos de la presente invención son utilizados preferiblemente en la citada composición farmacéutica a dosis mezcladas con un soporte aceptable o un material soporte aceptable, a efectos de que la enfermedad pueda ser tratada, o por lo menos aliviada. La citada composición puede incluir (además del componente activo y del soporte) material de relleno, sales, tampones, estabilizadores, solubilizantes y otros materiales, los cuales resultan conocidos en el estado de la técnica.
El término "farmacéuticamente aceptable" se define como un material no tóxico, el cual no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del componente activo. La elección del soporte está en función de la aplicación.
La composición farmacéutica puede contener componentes adicionales que refuerzan la actividad del componente activo o que suplementan el tratamiento. Los citados componentes adicionales y/o los factores pueden formar parte de la composición farmacéutica, con vistas a lograr un efecto sinérgico o para minimizar efectos adversos o no queridos.
Técnicas para la formulación o la preparación y aplicación/medicación de los compuestos de la presente invención se publican en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, P.A., última edición (ver también lo indicado anteriormente). Una aplicación apropiada puede incluir, por ejemplo, aplicaciones orales, dérmicas o a través de vía transmucosa y parenterales, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intradérmicas e intramedulares, al igual que inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales o intranasales.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un producto cosmético o alimenticio que contiene nano y microcápsulas, tal y como se ha descrito anteriormente.
La invención se ilustra ahora adicionalmente por medio de las figuras que se acompañan, en las cuales:
La Figura 1 muestra (a) la dispersión dinámica de la luz del radio R_{H} hidrodinámico de peptosoma, en función de la concentración de NaCl y del pH. (b) Representación esquemática del peptosoma y de su cambio de tamaño en función del pH, debido a la transición de estructura secundaria de tipo serpentín a tipo hélice-alfa, en la parte del péptido.
- La Figura 2 constituye una ilustración esquemática del proceso de formación de la bolsa/globo de araña. (A) Una suspensión proteínica acuosa es emulsionada en tolueno. (B) La proteína se absorbe en la interfase agua-tolueno y se desnaturaliza formando un retículo polimérico (gravado). (C) Una vez adsorbido, el retículo proteínico puede ser transferido a agua, por medio de centrifugación. Las estructuras en bolsa/globo finales presentan agua en el interior y agua en el exterior. (D) Alternativamente, una vez adsorbido, el retículo proteínico puede ser transferido a una solución de una sola fase, a través de la adición de etanol.
- La Figura 3 muestra una imagen de bolsas/balones de araña en (A) tolueno/etanol (50:50) y (B) después de transferencia en agua.
- La Figura 4 constituye una imagen de bolsas/balones de araña rellenados con Dextrano marcado con FITC (Peso molecular 500 kDa), después de transferencia en la fase acuosa continua: (A) Imagen de campo brillante. (B) Imagen fuorescente.
- La Figura 5 muestra bolsas/globos de araña con imagen obtenida a través de SEM. El grosor de membrana ha sido determinado como situado por debajo de 70 nm.
Ejemplos Preparación proteínica
La solución proteínica, a partir de la cual se forman los globos de araña, fue preparada disolviendo primero la proteína de seda dragline recombinante de araña (C_{16}, ver Huemmerich et al., 2004), a una concentración de 10 mg/ml en tiocianato de guanidina 6M. La solución proteínica fue enfriada a 4ºC y la concentración de tiocianato de guanidina reducida por debajo de 1mM, mediante la dialización de la solución proteínica frente a tampón Tris 10 mM, pH 8,0, durante el transcurso de una noche, utilizando tubos de diálisis obtenidos en Carl Roth GmbH, con un corte de peso molecular de 14 kDa. Cualquier proteína no dispersada fue eliminada mediante centrifugación de la solución dializada por espacio de 30 minutos, a una fuerza de 100.000 xg, mientras la temperatura de la solución se mantenía a 4ºC. La concentración de proteína final fue determinada por medio de adsorción UV, utilizando el coeficiente de extinción de proteínas de 0,859, a una longitud de onda de 276 nm.
Formación de globo/bolsa
Las bolsas/globos de seda de araña fueron obtenidos mediante la emulsificación de 5 \mul de la suspensión de proteína dializada en 300 \mul de tolueno durante 90 segundos (Figura 2A). Durante la emulsificación, la proteína de seda se absorbe y modifica su conformación estructural en la superficie de las gotitas de emulsión, dando lugar a un retículo polimérico que encapsula las gotitas de emulsión (Figura 2B). Las bolsas/globos de seda de araña fueron obtenidas utilizando suspensiones proteínicas con concentraciones que oscilan entre 1 y 6 mg/ml y con tiempos de emulsificación tan cortos como 20 segundos. El tamaño de las bolsas/globos obtenidos depende del tamaño de las gotitas de emulsión.
Una vez formadas, las cortezas proteínicas que rodean las gotitas de emulsión fueron transferidas de la emulsión en dos fases hacia una solución de fase única. Dos procedimientos distintos resultan eficaces para efectuar la transferencia de las cortezas proteínicas. En el primer procedimiento, 300 \mul de agua fueron añadidos al tolueno para formar una subcapa acuosa. Las cortezas proteínicas que rodean a las gotitas de agua fueron centrifugadas desde la capa de tolueno hacia la subcapa acuosa, a una fuerza de 100 x g, durante un período de 4 minutos (Figura 2C). En el segundo procedimiento, se formó una solución de fase única mediante la adición de 300 \mul de etanol a la emulsión de dos fases, con vistas a solubilizar el tolueno y el agua (Figura 2D). Después de utilizar cualquiera de estos procedimientos para transferir las bolsas/globos a una solución de fase única, se investigaron las estructuras resultantes con un microscopio óptico (Figura 3).
La integridad de las cortezas proteínicas de tipo globo centrifugadas fue verificada mediante la adición del 0,5% en peso de Dextrano 500 kDa, marcado con FITC (Sigma-Aldrich) a la solución de proteína, con anterioridad a la emulsificación. Después de llevar a cabo la emulsificación y la centrifugación, las estructuras de tipo globo obtenidas continuaron hasta fluorescencia, indicando que la corteza proteínica de estas estructuras no resultaba rasgada durante la centrifugación (Figura 4).
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Referencias
Chécot F, Lecommandoux S, Gnanou Y, Klok HA (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41, 1339
Chécot F, Lecommandoux S, Klok HA, Gnanou Y (2003) Euro. Phys. J. E. 10,25
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Huemmerich D, Helsen CW, Quedzuweit S, Oschmann J, Rudolph R, Scheibel T (2004) Primary structure elements of spider dragline silks and their contribution to protein solubility. Biochemistry 43: 13604-12
Scheibel T (2004) Spider silks: recombinant synthesis, assembly, spinning and engineering of synthetic proteins, Microbial Cell Factories 3, 14.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citada por el solicitante se proporciona tan solo para conveniencia del lector. La misma no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha puesto un gran esmero a la hora de compilar las referencias, no puede descartarse la existencia de errores y la EPO no acepta ninguna responsabilidad en este sentido.
Documentos patente citados en la descripción
\bullet US 6303150 B [0006]
\bullet WO 0247665 A [0007] [0007] [0011]
Literatura no patente citada en la descripción
\bullet Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co [0080]
\bulletCHËCOT F; LECOMMANDOUX S; GNANOU Y; KLOK HA. Angew. Chem. Int. Ed., 2002, vol. 41, 1339 [0087]
\bulletCHËCOT F; LECOMMANDOUX S; GNANOU Y; KLOK HA; GNANOU Y. Euro Phys. J. E., 2003, vol 10, 25 [0087]
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\bullet Y. Y. WON; H. DAVIS; F. BATES. Science, 1999, vol. 283 960 [0087]
\bulletHUEMMERICH D; HELSEN CW; QUEDZUWEIT S; OSCHMANN J; RUDOLPH R; SCHEIBEL T. Primary structure elements of spider dragline silks and their contribution to protein solubility. Biochemistry, 2004, vol. 43, 13604-12 [0087]
\bulletSCHEIBEL T. Spider silks: recombinant synthesis, assembly, spinning and engineering of synthetic proteins. Microbial Cell Factories, 2004, vol 3, 14 [0087]
<110> Technische Universitaet Muenchen
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<120> Procedimiento para la producción de nano y microcápsulas
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<130> P19184
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<160> 55
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<170> Versión PatentIn 3.1
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<210> 1
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<211> 653
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<212> PRT
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<213> Araneus diadematus 
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<400> 1
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<211> 671
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<213> Araneus diadematus 
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<211> 24
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Módulo A (ADF-3)
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<223> Módulo C (ADF-4)
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<213> Nephila clavipes 
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<211> 907
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nephila clavipes 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
14
15
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 636
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Areneus diadematus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
18
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 410
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Areneus diadematus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
21
22
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NR3 (ADF-3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
24
25 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NR4 (ADF-4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
26
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1959
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Areneus diadematus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
28
29 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2013
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Araneus diadematus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
30
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 420
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NR3 (ADF-3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NR4 (ADF-4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2828
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nephila clavipes 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
34
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2724
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nephila clavipes 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
36
37
38 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatcgaggag gatccatggg acgaattcac ggctaatgaa agcttactgc ac 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agctgtgcag taagctttca ttagccgtga attcgtccca tggatcctcc tc 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
1000 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
1001 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccgggccag cagggcccgg gtcaacaggg tcctggccag caaggtccgg gccagcaggg 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgctggccc ggaccttgct ggccaggacc ctgttgaccc gggccctgct ggcccggacc 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
1002 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
1003 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaaaccat gggtgcggct tctgcagctg tatctg 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaagaagc tttcattagc cagcaagggc ttgagctaca gattg 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaaaccat gggagcatat ggcccatctc cttc 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaagaagc tttcattagc ctgaaagagc ttggctaatc atttg 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> tag T7
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
501 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FlagN-NR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
39
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 648
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FlagN-NR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
41
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FlagC-NR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
43 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 279
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FlagC-NR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
44 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo K
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
45 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo K
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
502 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo sp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
46 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo sp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
1004 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
1005 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtggcgctg gtggcgccgg tggcgcaggt ggctctggcg gtgcgggcgg ttcc 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo Y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
47 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo Y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaaaccat gggcgaaagc agcggaggcg at 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaagaagc tttcattagc ctgggctgta tggtcc 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaaaccat gggtgcttat tatcctagct cgc 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaagaagc tttcattagc cataagcgaa cattcttcct ac 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
1006 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
1007 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
1008 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
1009 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
1010 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
1011 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggcgctggt ggcgccggtg gcgcaggtgg ctctggcggt gcgggcggtt ccgg 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaaccgccc gcaccgccag agccacctgc gccaccggcg ccaccagcgc cacc 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector de clonado pAZL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
49
50
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Technische Universitaet Muenchen
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de producción de nano- y microcápsulas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P19184
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión PatentIn 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 653
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Araneus diadematus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
52
53
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Araneus diadematus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
55
56
57 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo A (ADF-3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
503 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Module Q (ADF-3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
504 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo C (ADF-4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
59 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 942
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nephila clavipes 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
60
61
62
63
64 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 907
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nephila clavipes 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
65
66
67
68 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 636
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Areneus diadematus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
69
70
71 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 410
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Areneus diadematus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
72
73
74 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NR3 (ADF-3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
75
76 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NR4 (ADF-4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
77 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1959
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Areneus diadematus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
78
79 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2013
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Areneus diadematus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
80
81 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 420
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NR3 (ADF-3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
82
83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NR4 (ADF-4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
84 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2828
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nephila clavipes 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
85
87 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2724
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nephila clavipes 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
88
89 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatcgaggag gatccatggg acgaattcac ggctaatgaa agcttactgc ac 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agctgtgcag taagctttca ttagccgtga attcgtccca tggatcctcc tc 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
1012 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 21
1013 
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<210> 22
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<211> 60
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 22
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tccgggccag cagggcccgg gtcaacaggg tcctggccag caaggtccgg gccagcaggg 
\hfill
60 
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<211> 60
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 23
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctgctggccc ggaccttgct ggccaggacc ctgttgaccc gggccctgct ggcccggacc 
\hfill
60 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 24
1014 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 105
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 25
1015 
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 36
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 26
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gaaaaaccat gggtgcggct tctgcagctg tatctg 
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36 
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador
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\hfill
45 
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<212> DNA
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gaaaaaccat gggagcatat ggcccatctc cttc 
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34 
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 29
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\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaagaagc tttcattagc ctgaaagagc ttggctaatc atttg 
\hfill
45 
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> T7 tag
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505 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 216
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> FlagN-NR
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90
91 
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FlagN-NR
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92
93 
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<211> 93
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> FlagC-NR
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> FlagC-NR
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<210> 35
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<211> 27
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Módulo K
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Módulo K
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506 
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Módulo sp
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo sp
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<400> 38
1016 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo X
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo X
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<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtggcgctg gtggcgccgg tggcgcaggt ggctctggcg gtgcgggcgg ttcc 
\hfill
54 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo Y
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<400> 41
98 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Módulo Y
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<400> 42
1018 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
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gaaaaaccat gggcgaaagc agcggaggcg at 
\hfill
32 
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<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
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gaaaagaagc tttcattagc ctgggctgta tggtcc 
\hfill
36 
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<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaaaccat gggtgcttat tatcctagct cgc 
\hfill
33 
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<211> 42
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
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<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaagaagc tttcattagc cataagcgaa cattcttcct ac 
\hfill
42 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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\vskip1.000000\baselineskip
1019 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 48
1020 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 49
1021 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
1022 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 51
1023 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
1024 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggcgctggt ggcgccggtg gcgcaggtgg ctctggcggt gcgggcggtt ccgg 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggaaccgccc gcaccgccag agccacctgc gccaccggcg ccaccagcgc cacc 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
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<211> 3238
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Vector de clonado pAZL
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<400> 55
99
100

Claims (13)

1. Procedimiento para producir nano y microcápsulas que comprende los pasos de:
a)
proporcionar proteínas de seda de araña;
b)
formar una solución o suspensión de las citadas proteínas en un disolvente adecuado;
c)
generar una emulsión de al menos dos fases, conteniendo la citada emulsión la solución o la suspensión formada en b) como primera fase y al menos una fase adicional, la cual es sustancialmente no miscible con la citada primera fase;
d)
formar un retículo de polímero de las proteínas de seda de araña en la interfase de al menos dos fases;
e)
separar de la emulsión el retículo de polímero de proteína generado en d)
2. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde las proteínas de seda de araña proporcionadas en a) son seleccionadas de entre el grupo de ADF-4 y derivados del mismo, incluyendo C16, C16NR4, C32, C32NR4.
3. Procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en donde el disolvente en b) y/o los disolventes de al menos una fase adicional son seleccionados de entre el grupo que comprende disolventes hidrófilos, preferiblemente agua y alcohol, o disolventes lipófilos, preferiblemente aceites naturales o aceites sintéticos.
4. Procedimiento de una o más de las reivindicaciones precedentes, en donde la emulsión formada en c) es de tipo W/O (agua/aceite), O/W (aceite/agua), O/W/O (aceite/agua/aceite) ó W/O/W (agua/aceite/agua).
5. Procedimiento de una o más de las reivindicaciones precedentes, en donde el disolvente utilizado en 1b) contiene además uno o más agentes farmacéuticos, agentes cosméticos, artículos alimenticios o aditivos alimenticios.
6. Procedimiento de la reivindicación 5, en donde el agente farmacéutico está presente en el disolvente en forma disuelta, suspendida o sólida.
7. Procedimiento de una o más de las reivindicaciones precedentes, en donde la separación del retículo de polímero en el paso e) se efectúa por medio de centrifugación o por medio de destrucción de la emulsión formada en el paso c) y formación de una solución de una fase.
8. Procedimiento de una o más de las reivindicaciones precedentes, en donde la temperatura utilizada en los pasos b)-e) está comprendida entre 5 y 40ºC, preferiblemente entre 10 y 30 y, más preferiblemente, temperatura ambiente y en donde el pH utilizado en los pasos b)-e) está comprendido entre 3 y 9, preferiblemente entre 5 y 8, más preferiblemente 7.
9. Procedimiento de una o más de las reivindicaciones precedentes, en donde el tamaño de las gotitas de emulsión y las nano y macropartículas derivadas de las mismas está comprendido entre 100 nm y 20 \mum, preferiblemente entre 500 nm y 10 \mum, muy preferiblemente es de aproximadamente 5 \mum.
10. Procedimiento de una o más de las reivindicaciones precedentes, en donde el grosor de la pared de las nano y microcápsulas obtenidas está comprendido entre 5 y 100 nm, preferiblemente entre 10 y 70 nm.
11. Nano y microcápsulas obtenibles a través del procedimiento de una o más de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Composición farmacéutica que contiene nano y microcápsulas de la reivindicación 11 y un soporte farmacéuticamente aceptable.
13. Producto cosmético o alimenticio que contiene nano y microcápsulas de la reivindicación 11.
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