ES2304642T3 - Tratamiento de enfermedades neurodegenerativas por medio del uso de inhibidores de scd4. - Google Patents
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Abstract
El uso de un inhibidor de SCD4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, en donde se selecciona al inhibidor del grupo que consiste de oligonucleótidos antisentido, siARN y ribozimas, y en donde el inhibidor modula la actividad de la gama secretasa y/o de la beta secretasa.
Description
Tratamiento de enfermedades neurodegenerativas
por medio del uso de inhibidores de SCD4.
La presente invención se relaciona con el papel
de SCD4 en el procesamiento de APP y el uso de inhibidores de SCD4
en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
La enfermedad de Alzheimer es una condición
crónica que afecta a millones de personas en todo el mundo.
Los cerebros de aquellos que sufren de la
enfermedad de Alzheimer muestran una patología característica de
lesiones neuropatológicas prominentes, tal como los ovillos
neurofibrilares (NFTs) inicialmente intracelulares, y las placas
seniles extracelulares ricas en amiloide. Estas lesiones están
asociadas con pérdida masiva de poblaciones de neuronas del CNS y
su progreso acompaña la demencia clínica asociada con AD. El
componente principal de las placas de amiloide son los péptidos
beta amiloide (A-beta, Abeta o A\beta) de
diferentes longitudes. Una variante del mismo que es el
A\beta-42-péptido
(Abeta-42) es el principal agente causante de la
formación de amiloide. Otra variante es el
A\beta-40-péptido
(Abeta-40). El beta amiloide es el producto
proteolítico de una proteína precursora, proteína precursora beta
amiloide (beta-APP o APP). APP es una proteína
trans-membrana tipo I que es secuencialmente
escindida por diferentes proteasas asociadas a la membrana. La
primera escisión de APP se presenta por una o dos proteasas,
alfa-secretasa o beta-secretasa. La
alfa secretasa es una metaloproteasa cuya actividad es más
probablemente proveída por una o por una combinación de las
proteínas ADAM10 y ADAM17. La escisión por
alfa-secretasa produce la formación de péptidos
amiloide y por lo tanto se hace referencia a no amiloidogénicos. En
contraste, la escisión de APP por beta-secretasa es
un prerrequisito para la formación posterior de péptidos amiloide.
Esta secretasa, también denominada BACE1 (enzima de escisión de APP
en el sitio beta), es una proteína transmembrana tipo I que contiene
actividad de aspartil proteasa (descrita en detalle más abajo).
La actividad de la
beta-secretasa (BACE) escinde a APP en el
ectodominio, dando como resultado el vertimiento de la APPb soluble
secretada, y en un fragmento transmembrana
C-terminal de 99 residuos (APP-C99).
Vassar y colaboradores (Science 286, 735-741)
clonaron una proteasa aspártica transmembrana que tenía las
características de la beta-secretasa postulada de
APP, que ellos llamaron BACE1. Los cultivos corticales primarios y
de cerebro de ratones inactivados para BACE1 no mostraron actividad
detectable de beta-secretasa, y cultivos corticales
primarios de ratones inactivados para BACE produjeron mucho menos
beta-amiloide de APP. Esto sugiere que BACE1, en
lugar de su parálogo BACE2, es la beta-secretasa
principal para la APP, BACE1 es una proteína de 501 aminoácidos que
contiene un péptido señal de 21-aa seguido por una
extensión de un dominio proproteína de 22 a 45 aa. Alternativamente
existen formas empalmadas,
BACE-1-457 y
BACE-1-476. El dominio extracelular
de la proteína madura es seguido por un domino transmembrana
predicho y una cola C-terminal citosólica corta de
24 aa. Está predicho que BACE1 es una proteína transmembrana tipo 1
con el sitio activo sobre el lado extracelular de la membrana,
donde la beta-secretasa escinde a APP y a otros
posibles sustratos aún no identificados. Aunque BACE1 es claramente
una enzima clave requerida para el procesamiento de APP dentro de
A-beta, evidencia reciente sugiere sustratos y
funciones potenciales adicionales de BACE1 (J. Biol. Chem. 279,
10542-10550). Hasta la fecha, no se han descrito
proteínas que interactúen con BACE1 con funciones reguladoras o
moduladoras.
El fragmento de APP generado por escisión de
BACE1, APP-C99, es un sustrato para la actividad de
la gama-secretasa, que escinde a
APP-C99 dentro del plano de la membrana en un
péptido A-beta (tal como el péptido amiloidogénico
A\beta1-42), y en el fragmento
C-terminal llamado dominio intracelular de la APP
(AICD) (Annu Rev Cell Dev. Biol 19, 25-51). La
actividad de la gama-secretasa reside dentro de un
complejo multiproteína con al menos cuatro subunidades distintas.
La primera subunidad que fue descubierta fue la presenilina (Proc
Natl Acad Sci USA 94, 8208-13). Otros componentes
conocidos de la proteína del complejo con la
beta-secretasa son Pen-2, Nicastrina
y Aph-1a.
A pesar del progreso reciente en eventos
moleculares de delineación causantes de la etiología de la
enfermedad de Alzheimer, no se han desarrollado hasta ahora
terapias que modifiquen la enfermedad. Con este fin, la industria
se ha esforzado en identificar compuestos adecuados de plomo para
la inhibición de BACE1. Además, se ha reconocido que existe un
número creciente de sustratos alternativos de
gama-secretasa, más notablemente la proteína Notch.
Consecuentemente, la inhibición de la gama-secretasa
es probablemente la que causa efectos secundarios con base en el
mecanismo. Las drogas de última generación (por ejemplo,
Aricept®/donepezil) intentan lograr una mejora temporal de las
funciones cognitivas por medio de la inhibición de la
acetilcolinesterasa, que resulta en niveles más altos del
neurotransmisor acetilcolina en el cerebro. Estas terapias no son
adecuadas para etapas más avanzadas de la enfermedad, ellas no
tratan la patología subyacente de la enfermedad, y ellas no
detienen el progreso de la enfermedad.
Por lo tanto, existe una necesidad no satisfecha
para la identificación de nuevos objetivos que permitan nuevas
estrategias moleculares para el tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer. Además, existe una fuerte necesidad por nuevos
compuestos terapéuticos que modifiquen los procesos moleculares
anteriormente mencionados por medio del reconocimiento de dichos
objetivos nuevos.
En un primer aspecto, la invención provee el uso
de un inhibidor de SCD4 para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, en
donde el inhibidor se selecciona del grupo que consiste de
oligonucleótidos antisentido, ARNsi y ribozimas, y en donde el
inhibidor modula la actividad de la gama secretasa y/o de la beta
secretasa.
En el contexto de la presente invención,
utilizando ensayos funcionales, sorprendentemente se ha encontrado
que SCD4 es un nuevo objetivo que permite nuevas terapias para el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
La identificación de SCD4 como una molécula
objetivo clave, posibilita el uso de moléculas que interactúan con
SCD4 para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Esto es
mostrado especialmente en la sección de los Ejemplos (más abajo)
donde se demuestra que ARNsi dirigido contra SCD4 resulta en una
secreción/generación disminuida o atenuada de
Abeta-42.
En el contexto de la presente invención, una
"molécula que interactúa con SCD4" es una molécula que se
enlaza al menos temporalmente a SCD4 y que modula preferiblemente
la actividad de SCD4.
La estearoil-CoA desaturasa
(SCD) es la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis de
ácidos grasos monoinsaturados. Existen al menos cuatro isoenzimas
en el ratón (SCD1 a SCD4). La enzima convierte al estearato (y
palmitato) en ácido grasos monoinsaturados (principalmente -oleato;
C18:1).
En humanos, parece que existen únicamente dos
genes ortólogos SCD (SCD1 y SCD4). La SCD4 humana (ver Fig. 3,
también conocida como Proteína Hipotética FLJ21032) es similar a
SCD1 en una extensión de la secuencia que contiene al dominio
catalítico, pero es de otro modo muy distinta. La SCD4 se localiza
sobre el cromosoma 4q21.3.
Evidencia reciente sugiere que la SCD4 humana es
una enzima específica del cerebro en fetos humanos y que el gen se
rompe en una familia con labio leporino (Beiraghi S, Zhou M,
Talmadge CB, Went-Sumegi N, Davis JR, Huang D, Saal
H, Seemayer TA, Sumegi J (2003) Identification and characterization
of a novel gene disrupted by a pericentric inversion
inv(4)(p13.1q21.1) in a family with cleft lip. Gene.
309(1):11-21) in a family with cleft lip,
Gene, 309(1):11-21). Sin embargo, Beiraghi y
colaboradores no encontraron expresión de SCD4 en ningún tejido
humano adulto.
En contraste, en el contexto de la presente
invención, se encontró que SCD4 es fuertemente expresada en niveles
mucho más altos en cerebro de adulto humano que en cualquier otro
tejido analizado (ver Fig. 1).
De acuerdo con la presente invención, la
expresión "SCD4" no significa únicamente la proteína como la
mostrada en la Fig. 3, sino también un derivado funcionalmente
activo de la misma, o un fragmento funcionalmente activo de la
misma, o un homólogo de la misma, o una variante codificada por un
ácido nucleico que hibrida al ácido nucleico que codifica a dicha
proteína bajo condiciones de baja rigurosidad. Preferiblemente,
estas condiciones de baja rigurosidad incluyen hibridación en un
amortiguador que contiene formamida al 35%, 5X SSC,
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP al 0,02%,
BSA al 0,02%, 100 \mug/ml de AND desnaturalizado de esperma de
salmón, y sulfato de dextrano al 10% (p/v) durante
18-20 horas a 40ºC, lavando en un amortiguador que
consta de 2X SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5
mM, y SDS al 0,1% durante 1-5 horas a 55ºC, y
lavando en un amortiguador que consiste de 2X SSC,
Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, y SDS al 0.1%
durante 1,5 horas a 60ºC.
Generalmente, el término "funcionalmente
activo" como se lo utiliza aquí se refiere a un polipéptido,
especialmente un fragmento o derivado, que tiene funciones
estructurales, reguladoras o bioquímicas de la proteína de acuerdo
a la modalidad con la cual este polipéptido, especialmente fragmento
o derivado, está relacionado.
En el caso de SCD4, un derivado funcionalmente
activo significa preferiblemente un derivado que ejerce
esencialmente la misma actividad que SCD4, por ejemplo que
convierte estearato (y palmitato) en ácidos grasos monoinsaturados
(principalmente oleato; C18:1) y/o que es capaz de jugar un papel
similar al de SCD4 en la secreción de Abeta-42.
La actividad de SCD4 (como la actividad de la
Delta-9 desaturasa) así como de un derivado
funcionalmente activo del mismo, puede ser medida como se describe
en Obukowicz MG y colaboradores, The Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics (JPET) 287:157-166
(1998).
De acuerdo con la presente invención, el término
"actividad" como se lo utiliza aquí, se refiere a la función
de una molécula en su sentido más amplio. Esto incluye generalmente,
pero no se limita a, funciones biológicas, bioquímicas, físicas o
químicas de la molécula. Incluye por ejemplo la actividad
enzimática, la habilidad para interactuar con otras moléculas y la
habilidad para activar, facilitar, estabilizar, inhibir, suprimir o
desestabilizar la función de otras moléculas, estabilidad, habilidad
para localizar en ciertos sitios subcelulares. Cuando sea
aplicable, dicho término también se relaciona con la disminución o
atenuación de la secreción de Abeta-42 si la
molécula es inhibida.
De acuerdo con la presente invención, los
términos "derivados" o "análogos" de SCD4 o
"variantes" como se los utiliza aquí incluyen preferiblemente,
pero no se limitan a, moléculas que contienen regiones que son
sustancialmente homólogas a la SCD4, en diferentes modalidades, pero
al menos 70%, 80%, 90%, 95% ó 99% de identidad sobre una secuencia
de aminoácidos de idéntico tamaño, o cuando se compara con una
secuencia alineada en la cual la alineación es hecha por un
programa de homología por computador conocido en el estado del arte,
o cuyo ácido nucleico de codificación es capaz de hibridar a una
secuencia que codifica a la proteína bajo condiciones no rigurosas,
moderadamente rigurosas o rigurosas. El dominio catalítico puede ser
más altamente conservado que una región no catalítica de la
proteína. Por lo tanto, los porcentajes de identidad anteriores
pueden ser superiores si se escoge una región que comprende,
particularmente que consiste de, parte o la totalidad del dominio
catalítico (por ejemplo, 85%, 90%, 95% ó 99%), o puede ser menor, si
se escoge una región que no contiene al dominio catalítico (por
ejemplo, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%). Esto significa, una proteína que
es el resultado de una modificación de la proteína de ocurrencia
natural, por sustituciones de aminoácidos, supresiones y adiciones,
respectivamente, cuyos derivados exhiben aún la función biológica de
proteína de ocurrencia natural aunque no necesariamente en el mismo
grado. La función biológica de tales proteínas puede ser examinada
por ejemplo por medio de ensayos in vitro adecuados
disponibles como los proveídos en la invención.
El término "fragmento" como se lo utiliza
aquí se refiere a un polipéptido de al menos 10, 20, 30, 40 ó 50
aminoácidos de la proteína, particularmente SCD4, de acuerdo a la
modalidad. En modalidades específicas, tales fragmentos no son
superiores a 35, 100 ó 200 aminoácidos.
El término "gen" como se lo utiliza aquí se
refiere a un ácido nucleico que contiene un marco de lectura abierta
que codifica a un polipéptido de, si no se establece otra cosa la
presente invención, incluyendo tanto secuencias del exón como
opcionalmente del intrón.
Los términos "homólogo" o "productos
génicos homólogos" como se los utiliza aquí significan una
proteína en otras especies, preferiblemente mamíferos, que realizan
la misma función biológica que la proteína descrita aquí, en
particular SCD4. Tales homólogos son también llamados "productos
génicos ortólogos". El algoritmo para la detección de los pares
génicos ortólogos de humanos y de mamíferos o de otras especies
utiliza el genoma completo de estos organismos. Primero, los
mejores aciertos en la formación de parejas se recuperan,
utilizando una alineación completa de Smith-Waterman
de proteínas predichas. Para mejorar más la confiabilidad, estas
parejas se agrupan con los mejores aciertos en la formación de
parejas que involucran proteínas de Drosophila melanogaster
y C. elegans. Tal análisis se suministra, por ejemplo en
Nature, 2001, 409:860-921. Los homólogos de las
proteínas de acuerdo con la invención pueden ser bien sea aislados
con base en la homología de secuencia de los genes que codifican a
las proteínas proveídas aquí para los genes con los genes de otras
especies por clonación del gen respectivo aplicando tecnología
convencional y expresando la proteína de tal gen, o por medio de
otros métodos adecuados comúnmente conocidos en el
arte.
arte.
De acuerdo con la presente invención, el término
"inhibidor de SCD4" se refiere a una molécula que interactúa
con SCD4 siendo un compuesto químico o bioquímico que
preferiblemente inhibe o reduce la actividad de SCD4. Esto puede
ocurrir, por ejemplo, a través de la supresión de la expresión del
gen correspondiente. La expresión del gen se puede medir por medio
de RT-PCR o del análisis de Western blot. Además,
esto puede ocurrir a través de la inhibición de la actividad, por
ejemplo por enlazamiento a SCD4.
Los ejemplos de tales inhibidores de SCD4 son
proteínas de enlazamiento o péptidos de enlazamiento dirigidos
contra SCD4, en particular contra el sitio activo de SCD4, y ácidos
nucleicos dirigidos contra el gen de SCD4.
El término "ácidos nucleicos contra SCD4"
se refiere a ADN o ARN monocatenarios o bicatenarios, o una
modificación o derivado de los mismos que, por ejemplo, inhiben la
expresión del gen de SCD4 o la actividad de SCD4 e incluye, sin
limitación, ácidos nucleicos antisentido, aptámeros, los siARN (los
ARN de interferencia pequeña) y ribozimas.
El inhibidor se puede seleccionar del grupo que
consiste de anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, si ARN,
moléculas de bajo peso molecular (LMW), péptidos de enlazamiento,
aptámeros, ribozimas y péptido miméticos.
Las LMW son moléculas que no son proteínas,
péptidos, anticuerpos o ácidos nucleicos, y que exhiben un peso
molecular menor a 5.000 Da, preferiblemente menor a 2.000 Da, más
preferiblemente menor a 500 Da. Tales LMW pueden ser identificadas
en procedimientos de Alto Rendimiento partiendo de las
bibliotecas.
Estos ácidos nucleicos pueden ser administrados
directamente a una célula, o pueden ser producidos intracelularmente
por transcripción de secuencias exógenas introducidas.
Un ácido nucleico "antisentido" como se lo
utiliza aquí se refiere a un ácido nucleico capaz de hibridar a una
porción específica de una secuencia de ARN que codifica a una
proteína (preferiblemente ARNm) en virtud de alguna
complementariedad de la secuencia. El ácido nucleico antisentido
puede ser complementario a una región de codificación y/o de no
codificación de un ARNm. Tales ácidos nucleicos antisentido que
inhiben la expresión o la actividad de la proteína tienen utilidad
como agentes terapéuticos, y pueden ser utilizados en el
tratamiento o la prevención de trastornos como los descritos
aquí.
Los ácidos nucleicos antisentido son de al menos
seis nucleótidos y son preferiblemente oligonucleótidos en el rango
desde 6 hasta aproximadamente 200 nucleótidos. En aspectos
específicos, el oligonucleótido es de al menos 10 nucleótidos, al
menos 15 nucleótidos, al menos 100 nucleótidos, o al menos 200
nucleótidos.
Los ácidos nucleicos, por ejemplo, los ácidos
nucleicos antisentido o los siARN, pueden ser sintetizados
químicamente, por ejemplo de acuerdo con el método del fosfodiéster
(ver, por ejemplo, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical
Reviews, 90, 543-584). Los aptámeros son ácidos
nucleicos que se enlazan con alta afinidad a un polipéptido, aquí
SCD4. Los aptámeros se pueden aislar por medio de métodos de
selección tales como SELEX (ver, por ejemplo Jayasena (1999) Clin.
Chem., 45, 1628-50; Klug y Famulok (1994) M. Mol.
Biol. Rep., 20, 97-107; la patentes estadounidense
No. 5.582.981) a partir de un gran fondo común de diferentes
moléculas monocatenarias de ARN. Los aptámeros pueden ser
sintetizados y seleccionados también en su forma de imagen
especular, por ejemplo como el L-ribonucleótido
(Nolte y colaboradores, (1996) Nat. Biotechnol., 14,
1116-9; Klussmann y colaboradores, (1996) Nat.
Biotechnol., 14, 1112-5). Las formas que han sido
aisladas en esta forma disfrutan de la ventaja de que no son
degradadas por ribonucleasas de ocurrencia y, por lo tanto, poseen
una mayor estabilidad.
Los ácidos nucleicos pueden ser degradados por
endonucleasas o exonucleasas, en particular ADNasas y ARNasas que
pueden ser encontradas en la célula. Es, por lo tanto, conveniente
modificar los ácidos nucleicos con el propósito de estabilizarlos
contra la degradación, asegurando así que se mantenga una alta
concentración del ácido nucleico en la célula durante un largo
período de tiempo (Beigelman y colaboradores, (1995) Nucleic Acids
Res. 23:3989-94; WO 95/11910; WO 98/37240; WO
97/29116). Típicamente, tal estabilización puede ser obtenida por
medio de la introducción de uno o más grupos de fósforo dentro del
nucleótido o por medio de la introducción de uno o más
internucleótidos no fosforados.
Los internucleótidos modificados adecuados están
compilados en Uhlmann y Peyman (1990), ver más arriba (ver también
Beigelman y colaboradores, (1995) Nucleic Acids Res.
23:3989-94; WO 95/11910; WO 98/37240; WO 97/29116).
Los radicales fosfato internucleótido modificados y/o los puentes no
fosforados en un ácido nucleico que pueden ser empleados en uno de
los usos de acuerdo con la invención contienen, por ejemplo, metil
fosfonato, fosforotioato, fosforoamidato, fosforoditioato y/o
ésteres de fosfato, mientras que los análogos internucleótido no
fosforados contienen, por ejemplo, puentes de siloxano, puentes de
carbonato, carboximetil ésteres, puentes de acetamida y/o puentes
de tioéter. También es la intención que esta modificación mejore la
durabilidad de una composición farmacéutica que puede ser empleada
en uno de los usos de acuerdo con la invención. En general, se puede
modificar el oligonucleótido en la fracción de la base, en la
fracción del azúcar, o en la columna vertebral de fosfato. El
oligonucleótido puede incluir otros grupos añadidos tales como
péptidos, agentes que facilitan el transporte a través de la
membrana celular (ver, por ejemplo, Letsinger y colaboradores, 1989,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre y
colaboradores, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:648-652; Publicación Internacional de Patente
No. WO 88/09810) o una barrera hematoencefálica (ver, por ejemplo,
la Publicación Internacional de Patente No. WO 89/10134), agentes
de escisión activados para hibridación (ver, por ejemplo, Krol y
colaboradores, 1988, BioTechniques 6:958-976), o
agentes de intercalación (ver, por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res.
5:539-549).
En detalle, los oligonucleótidos antisentido
pueden comprender al menos una fracción de una base modificada que
se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a,
5-fluorouracilo, 5-bromouracilo,
5-clorouracilo, 5-iodouracilo,
hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina,
5-(carboxihidroxilmetil)uracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tio-uridina,
5-carboximetilaminometil-uracilo,
dihidrouracilo, D-galactosilqueosina, inosina,
N6-isopenteniladenine,
1-metilguanine, 1-metilinosine,
2,2-dimetilguanine, 2-metiladenine,
2-metilguanine, 3-metilcitosine,
5-metilcitosine, N6-adenina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metoxiaminometil-2-tiouracilo,
D-manosilqueosina,
5N-metoxicarboximetiluracilo,
5-metoxiuracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
ácido uracil-5-oxiacético (v),
wibutoxosina, pseudouracilo, queosina,
2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, ácido
uracil-5-oxiacético metiléster,
ácido uracil-5-oxiacético (v),
5-metil-2-tiouracilo,
3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo,
(acp3)w,
y 2,6-diaminopurina.
y 2,6-diaminopurina.
En otra modalidad, el oligonucleótido comprende
al menos una fracción modificada de azúcar seleccionada del grupo
que incluye, pero no se limita a, arabinosa,
2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosa.
El uso de ácidos nucleicos antisentido adecuados
es descrito adicionalmente por ejemplo en Zheng y Kemeny (1995)
Clin. Exp. Immunol., 100, 380-2; Nellen y
Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sci., 18,
419-23, Stein (1992) Leukemia, 6,
697-74 o Yacyshyn, B. R. y colaboradores, (1998)
Gastroenterology, 114, 1142).
En aún otra modalidad, el oligonucleótido es un
oligonucleótido 2-a-anomérico. Un
oligonucleótido a-anomérico forma híbridos
bicatenarios específicos con ARN complementario en el cual,
contrario a las unidades \beta usuales, las hebras corren
paralelas entre sí (Gautier y colaboradores, 1987, Nucl. Acids Res.
15:6625-6641).
El oligonucleótido puede estar conjugado con
otra molécula, por ejemplo, un péptido, un agente de entrelazamiento
activado para hibridación, un agente de transporte, un agente de
escisión activado para hibridación, etc.
A través de toda la invención, los
oligonucleótidos de la invención pueden ser sintetizados por medio
de métodos estándar conocidos en el arte, por ejemplo, por medio
del uso de un sintetizador automatizado de ADN (tal como los que se
encuentran disponibles comercialmente de Biosearch, Applied
Biosystems, etc.). Como ejemplos, se pueden sintetizar los
oligonucleótidos fosforotioato por medio del método de Stein y
colaboradores, (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209), se pueden
preparar los oligonucleótidos metilfosfonato por medio del uso de
soportes poliméricos con vidrio poroso controlado (Sarin y
colaboradores, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:7448-7451), etc.
En una modalidad específica, los
oligonucleótidos antisentido comprenden a los ARN catalíticos, o
ribozimas (ver, por ejemplo, la Publicación Internacional de
Patente No. WO 90/11364; Sarver y colaboradores, 1990, Science
247:1222-1225). En otra modalidad, el
oligonucleótido es un
2'-0-metilribonucleótido (Inoue y
colaboradores, 1987, Nucl. Acids Res.
15:6131-6148), o un análogo quimérico de
ARN-DNA (Inoue y colaboradores, 1987, FEBS Lett.
215:327-330).
En una modalidad alternativa, los ácidos
nucleótidos antisentido de la invención son producidos
intracelularmente por transcripción de una secuencia endógena. Por
ejemplo, se puede introducir un vector in vivo para que sea
recogido por una célula, dentro de cuya célula se transcribe el
vector o una porción del mismo, produciendo un ácido nucleico
antisentido (ARN) de la invención. Tal vector contendría una
secuencia que codifica a la proteína. Tal vector puede permanecer
episomal, o llegar a integrase cromosomalmente, siempre y cuando
pueda ser transcrito para producir el ARN antisentido deseado.
Tales vectores se pueden construir por medio de métodos estándar en
el arte de tecnología de ADN recombinante. Los vectores pueden ser
plásmidos, virales, u otros conocidos en el arte que son capaces de
replicación y expresión en células de mamífero. La expresión de las
secuencias que codifican a los ARN antisentido puede ser por medio
de cualquier promotor conocido en el arte para actuar en células de
mamífero, preferiblemente en células de humano. Tales promotores
pueden ser inducibles o constitutivos. Tales promotores incluyen,
pero no se limitan a, la región promotora temprana SV40 (Bernoist y
Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor
contenido en la repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma
de Rous (Yamamoto y colaboradores, 1980, Cell
22:787-797), el promotor de la timidina quinasa de
herpes (Wagner y colaboradores, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen
de metalotioneina (Brinster y colaboradores, 1982, Nature
296:39-42), etc.
Los ácidos nucleicos antisentido de la invención
comprenden una secuencia complementaria al menos a una porción de
un transcrito de ARN de un gen que codifica para una proteína,
preferiblemente un gen humano, más preferiblemente el gen de SCD4
humano. Sin embargo, la complementariedad absoluta, aunque
preferida, no es requerida. Una secuencia "complementaria al
menos a una porción de un ARN", como la mencionada aquí,
significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para
ser capaz de hibridar con el ARN, formando un doblete estable; en
el caso de ácidos nucleicos antisentido bicatenarios, se puede
analizar de este modo una hebra sencilla del doblete de ADN, o se
puede ensayar la formación del triplete. La habilidad para hibridar
dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud
del ácido nucleico antisentido. Generalmente, entre mayor la
hibridación del ácido nucleico, mayor la falta de concordancias de
las bases que puede contener un ARN y formar aún un doblete estable
(o triplete, según sea el caso). Alguien entrenado en el arte puede
determinar un grado tolerable de falta de concordancia por medio
del uso de procedimientos estándar para determinar el punto de
fusión del complejo hibridado.
La producción y el uso de los siARN como
herramientas para interferencia de ARN en el proceso para reducir
la expresión o para desactivar la expresión del gen, aquí la
expresión del gen para SCD4, es por ejemplo descrita en Elbashir,
S. M. y colaboradores, (2001) Genes Dev., 15, 188 o Elbashir, S. M.
y colaboradores, (2001) Nature, 411, 494. Preferiblemente, los
siARN exhiben una longitud de menos de 30 nucleótidos, en donde el
tramo de identidad del ramal sentido del siARN es preferiblemente
al menos de 19 nucleótidos.
Los ribozimas son también herramientas adecuadas
para inhibir la traducción de ácidos nucleicos, aquí el gen para
SCD4, ya que ellos son capaces de enlazar específicamente y cortar
los ARNm. Ellos son descritos, por ejemplo en Amarzguioui y
colaboradores, (1998) Cell. Mol. Life Sci., 54,
1175-202; Vaish y colaboradores, (1998) Nucleic
Acids Res., 26, 5237-42; Persidis (1997) Nat.
Biotechnol., 15, 921-2 o Couture y Stinchcomb
(1996) Trends Genet., 12,
510-5.
510-5.
Las composiciones farmacéuticas de la invención,
que contienen una cantidad efectiva de ácido nucleico en un
portador farmacéuticamente aceptable, pueden ser administradas a un
paciente que tiene una enfermedad o trastorno que es de un tipo que
expresa o sobreexpresa SCD4.
La cantidad de ácido nucleico que será efectiva
en el tratamiento de un trastorno o condición particular dependerá
de la naturaleza del trastorno o condición, y se puede determinar
por medio de técnicas clínicas estándar. Donde sea posible, es
deseable determinar la citotoxicidad del ácido nucleico in
vitro, y luego en sistemas útiles de modelos animales, antes de
probarlo y utilizarlo en humanos.
En una modalidad específica, se administran
composiciones farmacéuticas que contienen ácidos nucleicos a través
de liposomas, micropartículas, o microcápsulas. En diferentes
modalidades de la invención, puede ser útil usar tales
composiciones para lograr una liberación sostenida de los ácidos
nucleicos. En una modalidad específica, puede ser deseable utilizar
liposomas dirigidos a través de anticuerpos a tipos de células
identificables específicas del sistema nervioso central (Leonetti y
colaboradores, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
87:2448-2451; Renneisen y colaboradores, 1990, J.
Biol. Chem. 265:16337-16342).
El término "proteína de enlazamiento" o
"péptido de enlazamiento" se refiere a una clase de proteínas o
de péptidos que enlazan e inhiben a SCD4, e incluyen, sin
limitación, anticuerpos monoclonales o policlonales, fragmentos de
anticuerpo y armazones de proteína dirigidos contra SCD4.
De acuerdo con la presente invención, el término
anticuerpo o fragmento de anticuerpo se entiende que significan
también anticuerpos o partes de enlazamiento de antígeno de los
mismos, que han sido preparados en forma recombinante y, en caso de
ser apropiado, modificados, tal como anticuerpos quiméricos,
anticuerpos humanizados, anticuerpos multifuncionales, anticuerpos
biespecíficos u oligoespecíficos, anticuerpos monocatenarios y
fragmentos F(ab) o F(ab)_{2} (ver, por
ejemplo, EP-B1-0 368 684, las
patentes estadounidenses Nos. 4.816.567, 4.816.397, WO 88/01649, WO
93/06213 o WO 98/24884), preferiblemente producidos con la ayuda de
una biblioteca de expresión de FAB.
Como una alternativa a los anticuerpos clásicos,
también es posible, por ejemplo, utilizar armazones de proteína
contra SCD4, por ejemplo anticalinas que están basadas en lipocalina
(Beste y colaboradores, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96,
1898-1903). Los sitios naturales de enlazamiento del
ligando de las lipocalinas, por ejemplo la proteína de enlazamiento
de retinol o la proteína de enlazamiento de bilina, pueden ser
alterados, por ejemplo por medio de una metodología de un "diseño
de proteína combinatoria", en tal forma que ellos enlazan a
haptenos seleccionados, aquí a SCD4 (Skerra, 2000, Biochim. Biophys.
Acta, 1482, 337-50). Otros armazones conocidos de
proteína se sabe que son alternativas a los anticuerpos para
reconocimiento molecular (Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13,
167-187).
El procedimiento para preparar un anticuerpo o
fragmento de anticuerpo se efectúa de acuerdo con métodos que son
bien conocidos para una persona capacitada, por ejemplo, por medio
de inmunización de un mamífero, por ejemplo un conejo, con SCD4,
donde sea apropiado en presencia de, por ejemplo, adyuvante de
Freund y/o geles de hidróxido de aluminio (ver, por ejemplo,
Diamond, B.A. y colaboradores,(1981) The New England Journal of
Medicine: 1344-1349). Los anticuerpos policlonales
que se forman en el animal como resultado de una reacción
inmunológica pueden ser aislados posteriormente de la sangre
utilizando métodos conocidos y, por ejemplo, purificados por medio
de cromatografía en columna. Los anticuerpos monoclonales se pueden
preparar, por ejemplo, de acuerdo con el método conocido de Winter
& Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349,
293-299).
En detalle, los anticuerpos policlonales se
pueden preparar como se describió anteriormente por medio de
inmunización de un sujeto adecuado con un polipéptido como
inmunógeno. Las composiciones preferidas de anticuerpo policlonal
son aquellas que han sido seleccionadas por anticuerpos dirigidos
contra un polipéptido o polipéptidos de la invención. Las
preparaciones preferidas de anticuerpo policlonal son aquellas que
contienen únicamente anticuerpos dirigidos contra un polipéptido o
polipéptidos dados. Las composiciones particularmente preferidas de
inmunógeno son aquellas que no contienen otras proteínas humanas
tales como, por ejemplo, composiciones de inmunógeno elaboradas
utilizando células huésped no humanas para expresión recombinante de
un polipéptido de la invención. De tal forma, el único epítopo o
epítopos humanos reconocidos por las composiciones resultantes de
anticuerpo surgidas contra este inmunógeno estarán presentes como
parte de un polipéptido o polipéptidos de la invención.
El título del anticuerpo en el sujeto inmunizado
puede ser monitoreado durante el tiempo por medio de técnicas
estándar, tales como con el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
(ELISA) utilizando un polipéptido inmovilizado. Si se desea, las
moléculas de anticuerpo se pueden aislar del mamífero (por ejemplo,
de la sangre) y purificadas luego por medio de técnicas conocidas,
tales como cromatografía sobre proteína A para obtener la fracción
de IgG. Alternativamente, se pueden seleccionar los anticuerpos
específicos para una proteína o polipéptido de la invención (por
ejemplo, parcialmente purificados) o purificados, por ejemplo, por
cromatografía de afinidad. Por ejemplo, se produce una proteína
expresada y purificada en forma recombinante (o parcialmente
purificada) de la invención como se describe aquí, y se la acopla
en forma covalente o no covalente a un soporte sólido tal como, por
ejemplo, una columna de cromatografía. La columna puede ser
utilizada entonces para purificación de anticuerpos por afinidad,
específica para las proteínas de la invención a partir de una
muestra que contiene anticuerpos dirigidos contra un gran número de
epítopos diferentes, con lo cual se genera una composición de
anticuerpo sustancialmente purificada, esto es, una que esté
sustancialmente libre de anticuerpos contaminantes. Por una
composición sustancialmente purificada de anticuerpo se entiende, en
este contexto, que la muestra de anticuerpo contiene a lo sumo
únicamente 30% (en peso seco) de anticuerpos contaminantes dirigidos
contra epítopos diferentes a aquellos sobre la proteína o
polipéptido deseado de la invención, y preferiblemente a lo sumo
20%, aún más preferiblemente a lo sumo 10%, y lo más preferible a lo
sumo 5% (en peso seco) de la muestra es de anticuerpos
contaminantes. Una composición de anticuerpo purificada significa
que al menos el 99% de los anticuerpos en la composición están
dirigidos contra la proteína o polipéptido deseado de la
invención.
En un momento apropiado después de la
inmunización, por ejemplo, cuando los títulos del anticuerpo
específico son más altos, se pueden obtener las células que
producen anticuerpo del individuo y utilizarlas para preparar
anticuerpos monoclonales por medio de técnicas estándar, ales como
la técnica del hibridoma originalmente descrita por Kohler and
Milstein, 1975, Nature 256:495-497, la técnica de
hibridoma de célula B humana (Kozbor y colaboradores, 1983,
Immunol. Today 4:72), la técnica de hibridoma de EBV (Cole y
colaboradores, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan
R. Liss, Inc., pp. 77-96) a las técnicas trioma. La
tecnología para la producción de hibridomas (ver, generalmente,
Current Protocols in Immunology 1994, Coligan y colaboradores,
(eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Las células de
hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención son
detectadas por selección de los sobrenadantes del cultivo de
hibridoma para anticuerpos que se enlacen al polipéptido de
interés, por ejemplo, utilizando un ensayo estándar de ELISA.
Como una alternativa para la preparación de
hibridomas que segregan anticuerpo monoclonal, se puede identificar
y aislar un anticuerpo monoclonal dirigido contra un polipéptido de
la invención seleccionando una biblioteca de inmunoglobulina
combinatorial recombinante (por ejemplo, una biblioteca de
anticuerpo desplegada en el fago) con el polipéptido de interés.
Los kits para generación y muestreo de bibliotecas desplegadas en el
fago se encuentran comercialmente disponibles (por ejemplo, el
Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catálogo No.
27-9400-01; y el Stratagene SurfZAP
Phage Display Kit, Catálogo No. 240612). Adicionalmente, se pueden
encontrar ejemplos de métodos y reactivos particularmente asequibles
para uso en la generación y selección de de una biblioteca
desplegada en el anticuerpo, por ejemplo, la patente estadounidense
No. 5.223.409; la publicación PCT No. WO 92/18619; la publicación
PCT No. WO 91/17271; la publicación PCT No. WO 92/20791; la
publicación PCT No. WO 92/15679; la publicación PCT No. WO 93/01288;
la publicación PCT No. WO 92/01047; la publicación PCT No. WO
92/09690; la publicación PCT No. WO 90/02809; Fuchs y colaboradores,
1991, Bio/Technology 9:1370-1372; Hay y
colaboradores, 1992, Hum. Antibod. Hybridomas
3:81-85; Huse y colaboradores, 1989, Science
246:1275-1281; Griffiths y colaboradores, 1993, EMBO
J. 12:725-734.
Adicionalmente, los anticuerpos recombinantes,
tales como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados,
que contienen tanto porciones humanas como no humanas, que pueden
ser elaborados utilizando técnicas estándar de ADN recombinante,
están dentro del alcance de la invención. Un anticuerpo quimérico es
una molécula en la cual diferentes porciones se derivan de
diferentes especies animales, tal como aquellos que tienen una
región variable derivada de mAb de múrido y una región constante de
inmunoglobulina humana. (Ver, por ejemplo, Cabilly y colaboradores,
patente estadounidense No. 4.816.567; y Boss y colaboradores,
patente estadounidense No. 4.816.397, que se incorporan aquí como
referencia en su totalidad). Los anticuerpos humanizados son
moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o más
regiones de determinación complementaria (CDR) de las especies no
humanas y de una región marco de una molécula de inmunoglobulina
humana. (Ver, por ejemplo, Queen, patente estadounidense No.
5.585.089, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad).
Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden ser
producidos por medio de técnicas de ADN recombinante conocidas en
el estado del arte, por ejemplo, utilizando los métodos descritos en
la publicación PCT No. WO 87/02671; la solicitud de patente europea
184.187; la solicitud de patente europea 171.496; la solicitud de
patente europea 173.494; la publicación PCT No. WO 86/01533; la
patente estadounidense No. 4.816.567; la solicitud de patente
europea 125.023; Better y colaboradores, 1988, Science
240:1041-1043; Liu y colaboradores, 1987, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu y
colaboradores, 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun
y colaboradores, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:214-218; Nishimura y colaboradores, 1987, Canc.
Res. 47:999-1005; Wood y colaboradores, 1985,
Nature 314:446-449; y Shaw y colaboradores, 1988, J.
Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, 1985,
Science 229: 1202-1207; Oi y colaboradores, 1986,
Bio/Techniques 4:214; la patente estadounidense No. 5.225.539;
Jones y colaboradores, 1986, Nature 321:552-525;
Verhoeyan y colaboradores, 1988, Science 239:1534; y Beidler y
colaboradores, 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos son
particularmente deseables para tratamiento terapéutico de pacientes
humanos. Tales anticuerpos pueden ser producidos, por ejemplo,
utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes
que codifican cadenas pesada y liviana de inmunoglobulina endógena,
pero que pueden expresar genes que codifican una cadena liviana y
pesada humana. Los ratones transgénicos se inmunizan en forma normal
con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción de un
polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos
contra el antígeno se pueden obtener utilizando tecnología
convencional de hibridoma. Los transgenes para inmunoglobulina
humana albergados por los ratones transgénicos se reorganizan
durante la diferenciación de la célula B, y posteriormente sufren
activación de clase inmutación somática. De esta forma, utilizando
tal técnica, es posible producir anticuerpos terapéuticamente útiles
de IgG, IgA e IgE. Para un vistazo general de esta tecnología para
la producción de anticuerpos humanos, ver Lonberg y Huszar, 1995,
Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para una discusión
detallada de esta tecnología para la producción de anticuerpos
humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para la
producción de tales anticuerpos, ver, por ejemplo, la patente
estadounidense No. 5.625.126; la patente estadounidense No.
5.633.425; la patente estadounidense No. 5.569.825; la patente
estadounidense No. 5.661.016; y la patente estadounidense No.
5.545.806. Además, se pude involucrar a compañías tales como
Abgenix, Inc. (Freemont, CA), para proveer anticuerpos humanos
dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando tecnología
similar a aquella anteriormente.
Se pueden generar anticuerpos completamente
humanos que reconocen a un epítopo seleccionado utilizando una
técnica denominada como "selección guiada". En esta
metodología, se utiliza un anticuerpo monoclonal no humano
seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de múrido, para guiar la
selección de un anticuerpo completamente humano en el
reconocimiento del mismo epítopo. (Jespers y colaboradores, 1994,
Bio/technology 12:899-903).
Se pueden generar fragmentos de anticuerpo que
contienen los idiotipos de una proteína, en particular SCD4, por
medio de técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, tales
fragmentos incluyen, pero sin limitarse a, el fragmento
F(ab')_{2} que puede ser producido por medio de digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; el fragmento Fab' que puede ser generado por medio de la reducción de los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2}; el fragmento Fab que puede ser generado por medio de tratamiento del anticuerpo molecular con papaína y un agente de reducción; y fragmentos Fv.
F(ab')_{2} que puede ser producido por medio de digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; el fragmento Fab' que puede ser generado por medio de la reducción de los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2}; el fragmento Fab que puede ser generado por medio de tratamiento del anticuerpo molecular con papaína y un agente de reducción; y fragmentos Fv.
En la producción de anticuerpos, la selección
del anticuerpo deseado se puede logar por medio de técnicas
conocidas en el arte, por ejemplo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas). Para seleccionar anticuerpos específicos para un
dominio particular de la proteína, o un derivado del mismo, uno
puede ensayar hibridomas generados por un producto que enlaza al
fragmento de la proteína, o a un derivado del mismo, que contiene a
dicho dominio.
Los anticuerpos anteriores se pueden utilizar en
métodos conocidos en el arte relacionados con la localización y/o
cuantificación de la proteína o proteínas dadas, por ejemplo, para
la obtención de imágenes de estas proteínas, midiendo los niveles
de las mismas en muestras fisiológicamente apropiadas (por medio de
inmunoensayo), en métodos de diagnóstico, etc. Esto es cierto
también para un derivado, u homólogo del mismo de SCD4.
En una modalidad preferida, el inhibidor de SCD4
es un siARN con la secuencia:
- AGUACUCAGAGACGGAUGC
Como se explicó anteriormente, sorprendentemente
se ha encontrado en el contexto de la presente invención que SCD4
disminuye o atenúa la secreción de Abeta-42. De este
modo, regula directa o indirectamente la actividad de la
beta-secretasa y/o de la
gama-secretasa. Por lo tanto, el inhibidor modula la
actividad de la beta-secretasa y/o de la
gama-secretasa. En el contexto de la presente
invención, la "modulación de la actividad de la gama secretasa
y/o de la beta secretasa" significa que la actividad se reduce en
tal forma que se reduce o no se forma producto (inhibición parcial
o completa) o que la enzima respectiva produce un producto diferente
(en el caso de gama secretasa, por ejemplo,
Abeta-40 en vez de Abeta-42) o que
las cantidades relativas de los productos son diferentes (en el
caso de la gama secretasa, por ejemplo, más Abeta-40
que Abeta-42).
A lo largo de toda la invención, el término
"modulación de la actividad de la gama secretasa y/o de la beta
secretasa" incluye que la actividad de la enzima es modulada
directamente o indirectamente. Esto significa que el modulador de
SCD4 puede o bien enlazarse también directamente a la enzima o, más
preferiblemente, puede ejercer una influencia sobre SCD4 que a su
vez, por ejemplo, por medio de interacciones
proteína-proteína o por transducción de señal o a
través de metabolitos pequeños, modula la actividad de la
enzima.
Además, está incluido que el modulador modula ya
sea a la gama secretasa o a la beta secretasa o la actividad de
ambas enzimas.
A lo largo de toda la invención, se prefiere que
el modulador de la beta secretasa inhiba la actividad de la beta
secretasa ya sea completamente o parcialmente.
Con respecto al modulador de la actividad de la
gama secretasa, se prefiere que este modulador inhiba la actividad
de la gama secretasa. Sin embargo, también se prefiere que la
actividad de la gama secretasa sea cambiada en una forma tal que
más Abeta-40 y/o Abeta-38 sea
producida en vez de Abeta-42.
La actividad de la gama secretasa se puede
medir, por ejemplo, determinado el procesamiento de APP, por
ejemplo, determinando si se produce Abeta-40 o
Abeta-42 (ver la sección de los Ejemplos, más
abajo).
Para medir la actividad de BACE1, se pueden
analizar los cambios de la relación entre los fragmentos
C-terminales alfa y beta de APP por medio de
Western blotting (Blasko y colaboradores, J Neural Transm 111, 523);
los ejemplos adicionales de los ensayos de la actividad de BACE1
incluyen pero no se limitan a: el uso de un péptido donante de una
enzima ciclizada que contiene un sitio de escisión de BACE1 para
reconstituir y medir la actividad reportera de la
beta-galactosidasa (Naqvi y colaboradores, J Biomol
Screen. 9, 398); el uso de sustratos de péptidos fluorimétricos
apagados y de mediciones de fluorescencia (Andrau y colaboradores,
J.Biol Chem 278, 25859); el uso de ensayos basados en la célula que
utilizan proteínas quiméricas recombinantes, en las cuales una
enzima (tal como la fosfatasa alcalina) es enlazada a través de una
sección de aminoácidos, que contienen la secuencia de
reconocimiento de BACE1, a una proteína residente de Golgi (Oh y
colaboradores, Anal Biochem, 323, 7); ensayos basados en la
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET)
(Kennedy y colaboradores, Anal Biochen 319, 49); un sistema de
selección de crecimiento celular en levadura (Luthi y
colaboradores, Biochim Biophys Acta 1620, 167).
Preferiblemente, la enfermedad neurodegenerativa
es la enfermedad de Alzheimer.
Se describe que la molécula que interactúa con
SCD4 puede ser utilizada para preparar una composición
farmacéutica.
Por lo tanto, la invención describe
composiciones farmacéuticas, que pueden ser administradas a sujetos
en una cantidad efectiva. En un aspecto preferido, la composición
terapéutica está sustancialmente purificada. El sujeto es
preferiblemente un animal, incluyendo, pero sin limitarse a,
animales tales como vacas, cerdos, caballos, gallinas, gatos,
perros, etc., y es preferiblemente un mamífero, y más
preferiblemente humanos. En una modalidad específica, el sujeto es
un mamífero no humano.
Se conocen diferentes sistemas de aplicación y
pueden ser utilizados para administrar un compuesto terapéutico,
por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, y
microcápsulas; el uso de células recombinantes capaces de expresar
al compuesto terapéutico, el uso de endocitosis mediada por el
receptor (por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem.
262:4429-4432); una construcción de un ácido
nucleico terapéutico como parte de un vector retroviral o de otro
vector, etc. Los métodos de introducción incluyen, pero no se
limitan a, las rutas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal,
intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, y oral. Los
compuestos se pueden administrar por medio de cualquier ruta
conveniente, por ejemplo por medio de infusión, por inyección de
bolo, por absorción a través de recubrimientos mucosos y cutáneos
(por ejemplo, de la mucosa oral, rectal, e intestinal, etc.) y se
pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos.
La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser
deseable introducir las composiciones farmacéuticas en el sistema
nervioso central por cualquier ruta adecuada, incluyendo inyección
intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede
ser facilitada por un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a
un recipiente, tal como un recipiente Ommaya. También se puede
emplear administración pulmonar, por ejemplo, por medio del uso de
un inhalador o de un nebulizador, y la formulación con un agente
formador de aerosol.
En una modalidad específica, puede ser deseable
administrar las composiciones farmacéuticas en forma local al área
que requiere del tratamiento. Esto se puede lograr por ejemplo, pero
no como una limitación, por medio de infusión local durante una
cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un apósito para
heridas después de una cirugía, por medio de una inyección, por
medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un
implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso, o
gelatinoso, incluidas membranas, tal como membranas Silastic® (de
silicona y plástico), o fibras. En una modalidad, la administración
puede hacerse por medio de inyección directa en el sitio (o sitio
anterior) de un tumor maligno o neoplásico o tejido
preneoplásico.
En otra modalidad, se puede administrar el
compuesto terapéutico en una vesícula, en particular un liposoma
(Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat y
colaboradores, 1989, En: Liposomes in the Therapy of Infectious
Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler, eds.,
Liss, New York, páginas 353-365;
Lopez-Berestein, igual que la referencia anterior,
páginas 317-327; ver generalmente igual que la
referencia anterior).
En aún otra modalidad, se puede administrar el
compuesto terapéutico a través de un sistema de liberación
controlada. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (Langer,
ver más arriba; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.
14:201-240; Buchwald y colaboradores, 1980, Surgery
88:507-516; Saudek y colaboradores, 1989, N. Engl.
J. Med. 321:574-579). En otra modalidad, se pueden
utilizar materials poliméricos (Medical Applications of Controlled
Release, Langer and Wise, eds., CRC Press, Boca Raton, Florida,
1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and
Performance, Smolen and Ball, eds., Wiley, New York, 1984; Ranger y
Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levy y
colaboradores, 1985, Science 228:190-192; During y
colaboradores, 1989, Ann. Neurol. 25:351-356; Howard
y colaboradores, 1989, J. Neurosurg. 71:858-863).
En aún otra modalidad, se puede colocar un sistema de liberación
controlada en cercanías del objetivo terapéutico, esto es, el
cerebro, requiriendo así únicamente una fracción de la dosis
sistémica (por ejemplo, Goodson, 1984, En: Medical Applications of
Controlled Release, ver más arriba, Vol. 2, páginas
115-138). Otros sistemas de liberación controlada
son discutidos por Langer (1990, Science
249:1527-1533).
En una modalidad específica en donde el
compuesto terapéutico es un ácido nucleico, que codifica
preferiblemente una proteína terapéutica, se puede administrar el
ácido nucleico in vivo para promover la expresión de su
proteína codificada, construyéndola como parte de un vector
apropiado de expresión de ácido nucleico y administrándola para que
se vuelva intracelular, por ejemplo, por medio del uso de un vector
retroviral (patente estadounidense No. 4.980.286), o por medio de
inyección directa, o por medio del uso de bombardeo de
micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic,
Dupont), o por recubrimiento del mismo con lípidos, receptores de
la superficie de la célula o agentes de transfección, o
administrándolo en unión con un péptido del tipo de secuencia
homeótica que es conocido por entrar al núcleo (por ejemplo, Joliot
y colaboradores, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:1864-1868), etc. Alternativamente, se puede
introducir un ácido nucleico terapéutico intracelularmente e
incorporarlo por medio de recombinación homóloga dentro del ADN de
la célula huésped para expresión.
En general, las composiciones farmacéuticas
comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición
terapéutica, y un portador farmacéuticamente aceptable. En una
modalidad específica, el término "farmacéuticamente aceptable"
significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o
de un estado o el listado en la U.S. Pharmacopeia u otras
farmacopeas generalmente reconocidas para uso en animales, y más
particularmente, en humanos. El término "portador" se refiere
a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se
administra el compuesto terapéutico. Tales portadores terapéuticos
pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos
aquellos de origen en el petróleo, origen animal, vegetal o
sintético, incluyendo, pero sin limitarse a, aceite de cacahuate,
aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El
agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se
administra en forma oral. Una solución salina y dextrosa acuosa son
portadores preferidos cuando la composición farmacéutica es
administrada en forma intravenosa. Las soluciones salinas y la
dextrosa acuosa y las soluciones de glicerol se emplean
preferiblemente como portadores líquidos para soluciones
inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen
almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz,
harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de
glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol,
propileno, glicol, agua, etanol y similares.
La composición, si se desea, puede contener
también cantidades menores de agentes de humectación y emulgentes,
o agentes amortiguadores de pH. Estas composiciones pueden tomar la
forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, píldoras,
cápsulas, polvos, formulaciones de liberación continuada y
similares. La composición se puede formular como un supositorio,
con aglomerantes tradicionales y portadores tales como
triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores
estándar tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de
magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio de grado
farmacéutico, etc. Ejemplos de los portadores farmacéuticamente
aceptables son descritos en "Remington's Pharmaceutical
Sciences" por E.W. Martin. Tales composiciones contendrán una
cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto terapéutico,
preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad
adecuada de portador para proveer la forma para una administración
apropiada al paciente. La formulación debe satisfacer la forma de
administración.
La composición puede ser formulada, de acuerdo
con procedimientos de rutina, como una composición farmacéutica
adaptada para administración intravenosa a seres humanos.
Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son
soluciones en amortiguador acuoso isotónico estéril. Cuando sea
necesario, la composición puede incluir también un agente de
solubilización y un anestésico local tal como lidocaína para
disminuir el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, se
suministran los ingredientes o bien separadamente o en forma
mezclada en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un
polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un
contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta o bolsita
que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se
va administrar en infusión, puede ser dispensada con una botella de
infusión que contiene agua o solución salina estéril grado
farmacéutico. Cuando la composición se administra por medio de
inyección, se la puede proveer agua estéril o solución salina para
inyección para que los ingredientes puedan ser mezclados antes de
su administración.
Los compuestos terapéuticos se pueden formular
como formas neutras o en forma de sales. Las sales farmacéuticamente
aceptables incluyen a aquellas formadas con grupos carboxilo libres
tal como aquellos derivados de los ácidos clorhídrico, fosfórico,
acético, oxálico, tartárico, etc., a aquellas formadas con grupos
amino libres tal como aquellas derivadas de isopropilamina,
trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina,
procaína, etc., y aquellas derivadas de hidróxidos de sodio,
potasio, amonio, calcio y férricos, etc.
La cantidad del compuesto terapéutico que será
efectiva en el tratamiento de un trastorno particular o condición,
dependerá de la naturaleza del trastorno o condición, y se puede
determinar por medio de técnicas clínicas estándar. Además, los
ensayos in vitro pueden opcionalmente ser empleados para
ayudar a identificar rangos óptimos de dosificación. La dosis
precisa que se va a emplear en la formulación dependerá de la ruta
de administración, y de seriedad de la enfermedad o el trastorno, y
se deberá decidir de acuerdo con el juicio del médico y de las
circunstancias de cada paciente. Sin embargo, los rangos adecuados
de las dosis para administración intravenosa están generalmente
alrededor de 20-500 microgramos de compuesto activo
por kilogramos de peso corporal. Los rangos adecuados de las dosis
para administración intranasal están generalmente alrededor de 0,01
pg/kg de peso corporal hasta 1 mg/kg de peso corporal. Las dosis
efectivas se pueden extrapolar a partir de las curvas de respuesta
a las dosis derivadas de sistemas de prueba de modelos animales o
in vitro.
Los supositorios generalmente contienen
ingrediente activo en el rango de 0,5% a 10% en peso; las
formulaciones orales contienen preferiblemente de 10% a 95% de
ingrediente activo.
La invención también describe un paquete o kit
farmacéutico que contiene uno o más contenedores llenos con uno o
más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la
invención. Opcionalmente asociado con tal(es)
contenedor(es) puede haber una información en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de compuestos farmacéuticos o productos biológicos, dicha información reflejando la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, el uso o la venta para administración en humanos.
contenedor(es) puede haber una información en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de compuestos farmacéuticos o productos biológicos, dicha información reflejando la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, el uso o la venta para administración en humanos.
Los kits pueden contener también vectores de
expresión SCD4 o un péptido o polipéptido de interacción o de
enlazamiento que puede ser utilizado para expresar SCD4 o al
respectivo péptido o polipéptido de interacción o de enlazamiento.
Tal kit contiene preferiblemente también los amortiguadores y
reactivos requeridos. Opcionalmente asociado con tal(es)
contenedor(es) pueden estar las instrucciones para uso del
kit y/o una información en la forma prescrita por una agencia
gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de
compuestos farmacéuticos o productos biológicos, cuya información
refleja la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, el
uso o la venta para administración en humanos.
La invención describe además un método de
tratamiento, en donde una cantidad efectiva de una molécula que
interactúa con SCD4 o de un inhibidor o de una composición
farmacéutica, es administrada a un sujeto que sufre de una
enfermedad neurodegenerativa, preferiblemente enfermedad de
Alzheimer.
Con respecto a este método, todas las
modalidades dadas anteriormente aplican para el uso de la
invención.
La invención se relaciona además con un método
para identificar un modulador de gama secretasa y/o un modulador de
beta secretasa, que comprende las siguientes etapas:
- a.
- identificar una molécula que interactúa con SCD4 determinando si un compuesto de prueba dado es una molécula que interactúa con SCD4,
- b.
- determinar si la molécula que interactúa con SCD4 de la etapa a) es capaz de modular la actividad de la gama secretasa o la actividad de la beta secretasa.
En una modalidad preferida de la invención, en
la etapa a) el compuesto de prueba es puesto en contacto con SCD4 y
se determina la interacción de SCD4 con el compuesto de prueba.
Preferiblemente, se mide si la molécula candidata se enlaza a
SCD4.
El método de la invención se lleva a cabo
preferiblemente en el contexto de un ensayo de alta producción.
Tales ensayos son conocidos por una persona capacitada en el
arte.
Las moléculas candidatas o de prueba para ser
seleccionadas pueden ser suministradas como mezclas de un número
limitado de compuestos especificados, o como bibliotecas de
compuestos, bibliotecas de péptidos y similares. Los
agentes/moléculas que van a ser seleccionados pueden incluir también
todas las formas de antisuero, ácidos nucleicos antisentido, etc.,
que pueden modular la actividad o la expresión de SCD4. Los ejemplos
de moléculas candidatas y de bibliotecas para selección se exponen
más abajo.
\newpage
La selección de bibliotecas se puede lograr por
medio de cualquiera entre una variedad de métodos comúnmente
conocidos. Ver, por ejemplo, las siguientes referencias, que
divulgan la selección de bibliotecas de péptidos: Parmley y Smith.
1989. Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218; Scott y
Smith. 1990. Science 249:386-390; Fowlkes y
colaboradores. 1992. BioTechniques 13:422-427;
Oldenburg y colaboradores. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:5393-5397; Yu y colaboradores. 1994. Cell
76:933-945; Staudt y colaboradores. 1988. Science
241:577-580; Bock y colaboradores. 1992. Nature
355:564-566; Tuerk y colaboradores. 1992. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellington y
colaboradores. 1992. Nature 355:850-852; patente
estadounidense No. 5.096.815, patente estadounidense No. 5.223.409,
y patente estadounidense No. 5.198.346, todas de Ladner y
colaboradores; Rebar y Pabo. 1993. Science
263:671-673; y publicación internacional de patente
No. WO 94/18318.
En una modalidad específica, la selección se
puede llevar a cabo poniendo en contacto a los miembros de la
biblioteca con una SCD4 inmovilizada sobre una fase sólida, y
cosechar estos miembros de la biblioteca que se enlazan a la
proteína (o ácido nucleico de codificación o derivado). Los ejemplos
de tales métodos de selección, llamadas técnicas de "criba",
son descritas a manera de ejemplo en Parmley y Smith, 1988, Gene
73:305-318; Fowlkes y colaboradores, 1992,
BioTechniques 13:422-427; publicación internacional
de patente No. WO 94/18318; y en las referencias citadas aquí
anteriormente.
En una modalidad específica, los fragmentos y/o
los análogos de SCD4, especialmente peptidomiméticos, se seleccionan
por la actividad como inhibidores competitivos o no competitivos de
la presencia de SCD4 (por ejemplo, expresión o estabilidad de SCD4)
o, particularmente, la actividad de SCD4 en la célula.
En una modalidad, los agentes que modulan (esto
es, que inhiben o activan) la actividad de SCD4 se pueden
seleccionar utilizando un ensayo de secreción de
Abeta-42, en donde se seleccionan los agentes por su
habilidad para modular la actividad de SCD4 bajo condiciones
acuosas, o fisiológicas, en las cuales SCD4 es activa en ausencia
del agente que va a ser analizado. Preferiblemente, los agentes
candidatos son agentes que interactúan con, o que se enlazan a
SCD4. Los agentes que interfieren con la secreción de
Abeta-42 se identifican como inhibidores de la
actividad de SCD4. Los agentes que promueven la secreción de
Abeta-42 se identifican como activadores de
SCD4.
Preferiblemente, se puede utilizar un
procedimiento en dos etapas que involucra (a) identificar
moduladores en un ensayo de actividad de SCD4 (por ejemplo, un
ensayo que mide la actividad de la Delta-9
desaturasa de SCD4, por ejemplo, como se describe en Obukowicz MG y
colaboradores, ver más arriba), y (b) analizar los moduladores para
disminuir o atenuar la actividad de Abeta-42.
Los métodos para selección, particularmente los
métodos para selección de agentes que se enlazan a SCD4, pueden
involucrar la marcación de SCD4 con radioligandos (por ejemplo,
^{125}I o ^{3}H), ligandos magnéticos (por ejemplo, gránulos
paramagnéticos unidos en forma covalente a acetato de fotobiotina),
ligandos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína o rodamina),
ligandos de enzimas (por ejemplo, luciferasa o
\beta-galactosidasa). Los reactantes que se
enlazan en solución pueden ser aislados luego por medio de una de
muchas técnicas conocidas en el arte, incluyendo, pero sin
limitarse a, coinmunoprecipitación de la proteína marcada utilizando
antisuero contra el compañero de enlazamiento no marcado (o
compañero de enlazamiento marcado con un marcador distinguible de
aquel utilizado sobre la segunda proteína marcada), cromatografía de
inmunoafinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, y
centrifugación en gradiente de densidad. En una modalidad, el
compañero de enlazamiento marcado es un fragmento pequeño o
peptidomimético que no es retenido por un filtro comercialmente
disponible. Después del enlazamiento, la especie marcada es luego
incapaz de pasar a través del filtro, permitiendo un ensayo simple
de enlazamiento.
Se utilizan métodos comúnmente conocidos en el
arte para marcar al menos a una de las proteínas o polipéptidos.
Los métodos adecuados de marcación incluyen, pero no se limitan a,
radiomarcación por incorporación de aminoácidos radiomarcados, por
ejemplo, ^{3}H-leucina o
^{35}S-metianina, marcando en forma radioactiva
por medio de yodación posterior a la traducción con ^{125}I o
^{131}I utilizando el método de la cloramina T, reactivos de
Bolton-Hunter, etc., o marcando con ^{32}P
utilizando fosforilasa y fósforo inorgánico marcado en forma
radioactiva, marcación de biotina con acetato de fotobiotina y
exposición a una lámpara de rayos ultravioleta, etc. En los casos
en donde se moviliza a uno de los compañeros de enlazamiento, por
ejemplo, como se describe más abajo, se marca la especie libre.
Cuando ninguna de las especies que interactúan se inmoviliza, cada
una puede ser marcada con un marcador distinguible de tal manera
que el aislamiento de ambos compañeros pueda ser seguido para
permitir una cuantificación más precisa, y para distinguir la
formación, por ejemplo, de enlazamiento homomérico a partir de
enlazamiento heteromérico. Se proveen métodos que utilizan proteínas
accesorias que se enlazan a uno de los compañeros modificados para
mejorar la sensibilidad de la detección, incrementan la estabilidad
del enlazamiento, etc.
Los mismos métodos de marcación que se
describieron anteriormente pueden ser utilizados también para
marcar, por ejemplo, a la APP, Abeta-40 o
Abeta-42, por ejemplo para determinar la cantidad de
Abeta-40 o Abeta-42 secretadas en un
ensayo de secreción de Abeta.
Las condiciones típicas para enlazamiento, por
ejemplo, pero no como una limitante, son en una solución salina
acuosa de NaCl 10-250 mM, Tris-HCl
5-50 mM, pH 5-8, y Triton
X-100 al 0,5% u otro detergente que mejore la
especificidad de la interacción. Se pueden añadir queladores
metálicos y/o cationes divalentes para mejorar el enlazamiento y/o
reducir la proteólisis. Las temperaturas de reacción pueden incluir
4, 10, 15, 22, 25, 35 ó 42 grados Celsius, y el período de
incubación es típicamente al menos de 15 segundos, pero se prefieren
períodos más largos para permitir que ocurra el equilibrio del
enlazamiento. Se puede ensayar un enlazamiento particular
utilizando ensayos de enlazamiento de proteína rutinarios para
determinar las condiciones óptimas de enlazamiento para un
enlazamiento reproducible.
Los parámetros físicos de enlazamiento se pueden
analizar por cuantificación del enlazamiento utilizando métodos de
ensayo específicos para el marcador utilizado, por ejemplo, recuento
de centelleo líquido para detección de la radioactividad, actividad
de la enzima para fracciones marcadas con la enzima, etc. Se
analizan luego los resultados de la reacción utilizando el análisis
de Scatchard, el análisis de Hill, y otros métodos comúnmente
conocidos en el estado del arte (ver, por ejemplo, Proteins,
Structures, and Molecular Principles, 2nd Edition (1993) Creighton,
Ed., W.H. Freeman and Company, New York).
En una segunda metodología común para los
ensayos de enlazamiento, se inmoviliza sobre un filtro una de las
especies de enlazamiento, en un pozo de una placa de
microtitulación, en un tubo de ensayo, a una matriz de
cromatografía, etc., ya sea en forma covalente o no covalente. Las
proteínas pueden ser inmovilizadas en forma covalente utilizando un
método conocido en el estado del arte, por ejemplo, pero sin
limitarse a, el método de Kadonaga y Tjian, 1986, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83:5889-5893, esto es, enlazamiento a un
sustrato derivado de bromuro de cianógeno tal como
CNBr-Sefarosa 4B (Pharmacia). Cuando sea necesario,
el uso de espaciadores puede reducir el impedimento estérico por
parte del sustrato. La unión no covalente de proteínas a un sustrato
incluye, pero no se limita a, la unión de una proteína a una
superficie cargada, enlazamiento con anticuerpos específicos,
enlazamiento a una tercera proteína de interacción no relacionada,
etc.
Se proveen ensayos de los agentes (incluidos los
extractos celulares o una reserva de biblioteca) que compiten por
el enlazamiento de una molécula dada a SCD4 para la selección de
competidores, reforzadores, o agentes con características de
enlazamiento específicamente deseadas (por ejemplo, afinidad más
alta o más baja) comparadas con un compañero de enlazamiento dado.
Nuevamente, o bien la molécula o SCD4 pueden ser marcadas por
cualquier medio (por ejemplo, aquellos medios descritos
anteriormente).
En modalidades específicas, los agentes de
bloqueo para inhibir el enlazamiento no específico de reactivos con
otras proteínas, o pérdidas de absorción de los reactivos con
plásticos, matrices de inmovilización, etc., están incluidos en la
mezcla de ensayo. Los agentes de bloqueo incluyen, pero no están
restringidos a albúmina de suero bovino, caseína, leche
desengrasada seca, reactivo de Denhardt, Ficoll,
polivinilpirrolidina, detergentes no iónicos (NP40, Triton
X-100, Tween 20, Tween 80, etc.), detergentes
iónicos (por ejemplo, SDS, LDS, etc.), polietilén glicol, etc. Las
concentraciones de los agentes de bloqueo apropiados permiten
enlazamiento específico.
Después de llevar a cabo el enlazamiento, se
remueve el agente marcado no enlazado en el sobrenadante, y la
proteína inmovilizada (o, si es aplicable, el agente inmovilizado)
que retiene a cualquier agente marcado, enlazado, es lavada
extensivamente. La cantidad de marcador enlazado es cuantificada
luego utilizando métodos estándar en el arte para detectar al
marcador, como se describió más arriba.
En otras modalidades específicas, se puede
llevar a cabo la selección de moduladores de la proteína como se
dispuso aquí, por medio de la unión de aquellos y/o de los
anticuerpos como se dispuso aquí con un portador sólido.
La preparación de tal disposición que contiene
diferentes tipos de proteínas (incluyendo anticuerpos) es bien
conocida en el arte y es clara para una persona capacitada en el
arte (ver, por ejemplo, Ekins y colaboradores, 1989, J. Pharm.
Biomed. Anal. 7:155-168; Mitchell y colaboradores
2002, Nature Biotechnol. 20:225-229; Petricoin y
colaboradores, 2002, Lancet 359:572-577; Templin y
colaboradores, 2001, Trends Biotechnol. 20:160-166;
Wilson y Nock, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol.
6:81-85; Lee y colaboradores, 2002 Science
295:1702-1705; MacBeath y Schreiber, 2000, Science
289:1760; Blawas y Reichert, 1998, Biomaterials 19:595; Kane y
colaboradores, 1999, Biomaterials 20:2363; Chen y colaboradores,
1997, Science 276:1425; Vaugham y colaboradores, 1996, Nature
Biotechnol. 14:309-314; Mahler y colaboradores,
1997, Immunotechnology 3:31-43; Roberts y
colaboradores, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol.
3:268-273; Nord y colaboradores, 1997, Nature
Biotechnol. 15:772-777; Nord y colaboradores, 2001,
Eur. J. Biochem. 268:4269-4277; Brody y Gold, 2000,
Rev. Mol. Biotechnol. 74:5-13; Karlstroem y Nygren,
2001, Anal. Biochem. 295:22-30; Nelson y
colaboradores, 2000, Electrophoresis 21:1155-1163;
Honore y colaboradores, 2001, Expert Rev. Mol. Diagn.
3:265-274; Albala, 2001, Expert Rev. Mol. Diagn.
2:145-152, Figeys y Pinto, 2001, Electrophoresis 2:
208-216 y las referencias en las publicaciones
enlistadas aquí).
Las proteínas u otros agentes se pueden unir a
un ordenamiento por diferentes medios como será evidente para una
persona capacitada en el arte. Las proteínas se pueden añadir por
ejemplo a la disposición a través de una marca TAP (como se
describe en WO/0009716 y en Rigaut y colaboradores, 1999, Nature
Biotechnol. 10:1030-1032) después de la etapa de
purificación o por medio de otro esquema de purificación adecuado
como será evidente para una persona capacitada en el arte.
Opcionalmente, se pueden llevar a cabo ensayos
funcionales como será evidente para una persona capacitada en el
arte, algunos de los cuales se suministran como ejemplos aquí, para
chequear la integridad de la proteína enlazada a la matriz.
Opcionalmente, la unión de las proteínas o del
anticuerpo como se reseño anteriormente puede ser monitoreada
adicionalmente por medio de métodos diferentes evidentes para una
persona capacitada en el arte. Aquellos incluyen, pero no se
limitan a resonancia del plasmón de superficie (ver, por ejemplo,
McDonnel, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 5:572-577;
Lee, 2001, Trends Biotechnol. 19:217-222; Weinberger
y colaboradores, 2000, 1:395-416; Pearson y
colaboradores, 2000, Ann. Clin. Biochem. 37:119-145;
Vely y colaboradores, 2000, Methods Mol. Biol.
121:313-321; Slepak, 2000, J. Mol Recognit.
13:20-26.
Los ejemplos de ensayos útiles para medir la
producción de péptidos Abeta-40 y
Abeta-42 por medio de ELISA incluyen, pero no se
limitan a, aquellos descritos en Vassar R y colaboradores, 1999,
Science, 286:735-41.
Los ejemplos de ensayos útiles para medir la
producción de fragmentos de APP C-terminal en líneas
de células o en animales transgénicos por medio de Western Blot
incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Yan R y
colaboradores, 1999, Nature, 402:533-7.
Los ejemplos de ensayos útiles para medir la
actividad proteolítica de beta o gama secretasas hacia los
fragmentos bacterialmente expresados de APP in vitro (por
ejemplo, por medio de la modificación de la expresión de proteínas
SCD4 en células por medio de ARNi (siARN)) y/o de plásmidos que
codifican a la proteína SCD4 incluyen, pero no se limitan a,
aquellos descritos en Tian G y colaboradores, 2002, J Biol Chem,
277:31499-505.
Los ejemplos de ensayos útiles para medir la
transactivación de un gen reportero conducido por Gal4 (por ejemplo,
por la modificación de la expresión de SCD4 por medio de ARNi
(siARN) y/o de plásmidos que codifican a la proteína SCD4,
incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Cao X y
colaboradores, 2001, Science, 293:115-20.
Cualquier molécula conocida en el estado del
arte puede ser analizada por su habilidad para ser una molécula que
interactúa o un inhibidor de acuerdo con la presente invención. Las
moléculas candidatas pueden ser directamente suministradas a una
célula que expresa a la SCD4, o, en el caso de proteínas candidatas,
pueden ser suministradas proveyendo sus ácidos nucleicos
codificadores bajo condiciones en las cuales los ácidos nucleicos se
expresan en forma recombinante para producir la proteína
candidata.
El método de la invención es ideal para
seleccionar bibliotecas químicas para moléculas que modulan, por
ejemplo, inhiben, antagonizan, o agonizan, la cantidad de actividad
de la proteína, en particular de SCD4. Las bibliotecas químicas
pueden ser bibliotecas de péptidos, bibliotecas de peptidomiméticos,
bibliotecas sintetizadas químicamente, recombinantes, por ejemplo,
bibliotecas desplegadas por fagos y bibliotecas basadas en la
traducción in vitro, otras bibliotecas orgánicas sintéticas
que no peptídicas, etc.
Se encuentran disponibles comercialmente
ejemplos de bibliotecas de diferentes fuentes (ArQule,
Tripos/PanLabs, Chem-Design, Pharmacopoeia). En
algunos casos, estas bibliotecas químicas se generan utilizando
estrategias de combinación que codifican la identidad de cada
miembro de la biblioteca sobre un sustrato al cual se une el
compuesto miembro, permitiendo así la identificación directa e
inmediata de una molécula que es un modulador efectivo, De esta
forma, en muchas metodologías de combinación, la posición sobre una
placa de un compuesto especifica esa composición del compuesto.
También, en un ejemplo, una posición en una placa única puede tener
de 1-20 químicos que pueden ser seleccionados por
medio de la administración a un pozo que contiene las interacciones
de interés. De esta forma, si se detecta modulación, se pueden
ensayar reservas más y más pequeñas de pares que interactúan para
la modulación de la actividad. Por medio de tales métodos, se pueden
seleccionar muchas moléculas candidatas.
Se conocen una gran diversidad de bibliotecas
adecuadas para uso en el estado del arte y se las puede utilizar
para proveer compuestos que son ensayados de acuerdo con la presente
invención. Alternativamente, se pueden construir bibliotecas
utilizando métodos estándar. Las bibliotecas químicas (sintéticas),
bibliotecas de expresión recombinante, o bibliotecas con base en
polisomas son ejemplos típicos de bibliotecas que pueden ser
utilizadas.
Las bibliotecas pueden ser encogidas o
semirrígidas (teniendo algún grado de rigidez estructural), o lineal
o no encogida. La biblioteca puede ser una biblioteca de expresión
genómica o un ADNc, una biblioteca aleatoria de expresión de
péptidos, o una biblioteca aleatoria de péptidos sintetizada
químicamente, o una biblioteca que no es de péptidos. Las
bibliotecas de expresión se introducen dentro de las células en las
cuales ocurre el ensayo, donde los ácidos nucleicos de la
biblioteca se expresan para producir sus proteínas codificadas.
En una modalidad, las bibliotecas de péptidos
que pueden ser utilizadas en la presente invención pueden ser
bibliotecas que son químicamente sintetizadas in vitro. Los
ejemplos de tales bibliotecas se encuentran en Houghten y
colaboradores, 1991, Nature 354:84-86, que describe
mezclas de hexapéptidos libres en los cuales el primero y segundo
residuos en cada péptido fueron individual y específicamente
definidos; Lam y colaboradores, 1991, Nature
354:82-84, que describen una metodología "un
granulo, un péptido" en la cual un esquema de síntesis de
división en fase sólida produjo una biblioteca de péptidos en la
cual cada gránulo en el compendio había inmovilizado sobre ella una
secuencia aleatoria única de residuos de aminoácidos; Medynski,
1994, Bio/Technology 12:709-710, que describe
métodos de síntesis de división y de síntesis T-bag;
y Gallop y colaboradores, 1994, J. Med. Chem.
37:1233-1251. Simplemente a manera de otros
ejemplos, se puede preparar una biblioteca de combinación para uso,
de acuerdo con los métodos de Ohlmeyer y colaboradores, 1993, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erb y
colaboradores, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:11422-11426; Houghten y colaboradores, 1992,
Biotechniques 13:412; Jayawickreme y colaboradores, 1994, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91: 1614-1618; o Salmon y
colaboradores, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:11708-11712. La publicación PCT No. WO 93/20242 y
Brenner y Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:5381-5383 describen "bibliotecas químicas
codificadas de combinación", que contienen identificadores de
oligonucleótidos para cada miembro de la biblioteca química de
polímeros.
En una modalidad preferida, la biblioteca
seleccionada es una biblioteca de expresión biológica que es una
biblioteca de péptidos aleatorios expresados en fago, donde los
péptidos aleatorios están encerrados (por ejemplo, en virtud de
tener enlaces disulfuro).
Además, en forma más general, también se pueden
utilizar bibliotecas orgánicas diversas estructuralmente encerradas
(por ejemplo, no peptídicas). A manera de ejemplo, se puede utilizar
una biblioteca de benzodiazepina (ver, por ejemplo, Bunin y
colaboradores, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:4708-4712).
Las bibliotecas conformacionalmente encerradas
que pueden ser utilizadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas
que contienen residuos invariables de cisteína los cuales, en un
ambiente oxidante, se entrelazan por medio de enlaces disulfuro
para formar cistinas, péptidos modificados (por ejemplo, el flúor,
los metales, los marcadores isotópicos, están fosforilados, etc.),
péptidos que contienen uno o más aminoácidos de ocurrencia no
natural, estructuras no peptídicas, y péptidos que contienen una
fracción significativa de ácido carboxiglutámico.
Se pueden utilizar también las bibliotecas no
peptídicas, por ejemplo, derivados de péptido (por ejemplo, que
contienen uno o más aminoácidos de ocurrencia no natural). Un
ejemplo de estas son las bibliotecas de peptoides (Simon y
colaboradores, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:9367-9371). Los peptoides son polímeros de
aminoácidos no naturales que tienen cadenas laterales de ocurrencia
natural unidas no al carbono \alpha sino al nitrógeno del grupo
amino de la cadena principal. Ya que los peptoides no son degradados
fácilmente por enzimas digestivas humanas, se adaptan
convenientemente más fácilmente para ser utilizados como drogas.
Otro ejemplo de una biblioteca que puede ser utilizada, en la cual
las funciones amida en los péptidos han sido permetiladas para
generar una biblioteca de combinación quími-
camente transformada, es descrita por Ostresh y colaboradores, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142).
camente transformada, es descrita por Ostresh y colaboradores, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142).
Los miembros de las bibliotecas de péptidos que
pueden ser seleccionados de acuerdo con la invención no están
limitados para contener los 20 aminoácidos de ocurrencia natural. En
particular, las bibliotecas sintetizadas químicamente y las
bibliotecas con base en polisomas permiten el uso de aminoácidos
además de los 20 aminoácidos de ocurrencia natural (por su
inclusión en el reservorio precursor de aminoácidos utilizados en la
producción de la biblioteca). En modalidades específicas, los
miembros de la biblioteca contienen uno o más aminoácidos no
naturales o no clásicos o péptidos cíclicos. Los aminoácidos no
clásicos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros D de los
aminoácidos comunes, ácido amino isobutírico, ácido
4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino
butírico; -Abu, -Ahx, ácido 6-amino hexanóico; Aib,
ácido 2-amino isobutírico; ácido
3-amino propiónico; ornitina; norleucina;
norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cistéico,
t-butilglicina, t-butilalanina,
fenilglicina, ciclohexilalanina, \beta-alanina,
aminoácidos de diseño tales como \beta-metil
aminoácidos, C-metil aminoácidos,
N-metil aminoácidos, fluoroaminoácidos y análogos de
aminoácidos en general. Además, los aminoácidos pueden ser D
(dextrorrotatorios) o L (levorrotatorios).
En una modalidad específica, fragmentos y/o
análogos de proteínas de la invención, especialmente
peptidomiméticos, son seleccionados por su actividad como
inhibidores competitivos o no competitivos de la expresión o
actividad de SCD4 (por ejemplo, estabilidad).
En otra modalidad de la presente invención, se
puede utilizar química de combinación para identificar moduladores
de SCD4. La química de combinación es capaz de crear bibliotecas que
contienen cientos de miles de compuestos, muchos de los cuales
pueden ser estructuralmente similares. Mientras que los programas de
selección de alta producción son capaces de seleccionar estas
vastas bibliotecas por afinidad con objetivos conocidos, se han
desarrollado nuevas metodologías que logran bibliotecas de menor
dimensión pero que proveen máxima diversidad química. (Ver, por
ejemplo, Matter, 1997, J. Med. Chem.
40:1219-1229).
Un método de química de combinación, huella
digital de afinidad, ha sido utilizado anteriormente para analizar
una biblioteca discreta de moléculas pequeñas para afinidades de
enlazamiento para un panel definido de proteínas. Las huellas
digitales obtenidas por la selección se utilizan para predecir la
afinidad de los miembros individuales de la biblioteca para otras
proteínas o receptores de interés, en particular de SCD4. Se
comparan las huellas digitales con las huellas digitales obtenidas
a partir de otros compuestos conocidos por reaccionar con la
proteína de interés para predecir si el compuesto de la biblioteca
puede reaccionar en forma similar. Por ejemplo, en vez de analizar
cada ligando en una gran biblioteca por interacción con una
proteína, se podrían analizar únicamente aquellos ligandos que
tienen una huella digital similar a otros compuestos que se sabe
que tienen esa actividad (Ver, por ejemplo, Kauvar y colaboradores,
1995, Chem. Biol. 2:107-118; Kauvar, 1995, Affinity
fingerprinting, Pharmaceutical Manufacturing International.
8:25-28; y Kauvar, Toxic-Chemical
Detection by Pattern Recognition in New Frontiers in Agrochemical
Immunoassay, Kurtz, Stanker y Skerritt (eds), 1995, AOAC:Washington,
D.C., 305-312).
Kay y colaboradores (1993, Gene
128:59-65) divulgaron un método de construcción de
bibliotecas de péptidos que codifican péptidos de secuencia
completamente aleatoria que son tan largas como aquellas de
cualquiera de las bibliotecas convencionales anteriores. Las
bibliotecas divulgadas por Kay y colaboradores codifican péptidos
sintéticos totalmente aleatorios aproximadamente mayores a 20
aminoácidos en longitud. Tales bibliotecas pueden ser
convenientemente seleccionadas para identificar moduladores de
proteínas. (Ver también la patente estadounidense No.
5.498.538 fechada el 12 de marzo de 1996; y la publicación PCT No. WO 94/18318 fechada el 18 de agosto de 1994).
5.498.538 fechada el 12 de marzo de 1996; y la publicación PCT No. WO 94/18318 fechada el 18 de agosto de 1994).
Una revisión integral de diferentes tipos de
bibliotecas de péptidos pueden ser encontradas en Gallop y
colaboradores, 1994, J. Med. Chem. 37:1233-1251.
En una modalidad preferida, la interacción de
los compuestos de prueba con SCD4 resulta en una inhibición de la
actividad de SCD4.
De acuerdo con una modalidad preferida, en la
etapa b) se mide la habilidad de la gama secretasa para escindir a
la APP. Esta se puede medir como se indicó más arriba.
De acuerdo con otra modalidad preferida, en la
etapa b) se mide la habilidad de la molécula que interactúa con
SCD4 para disminuir o atenuar la secreción de
Abeta-42.
Además, la invención también describe un método
para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de
enfermedades degenerativas, preferiblemente la enfermedad de
Alzheimer, que comprende las siguientes etapas:
- a)
- identificar un modulador de la gama secretasa y/o un modulador de la beta secretasa, preferiblemente un inhibidor, de acuerdo con el método de la invención, y
- b)
- formular al modulador de la gema secretasa y/o de la beta secretasa, preferiblemente un inhibidor, para una composición farmacéutica.
Con respecto a la composición farmacéutica,
todas las modalidades como se indicó anteriormente también aplican
aquí. Este método puede comprender además la etapa de mezclar la
molécula identificada con un portador farmacéuticamente aceptable
como se explicó anteriormente.
La invención también describe una composición
farmacéutica que contiene un inhibidor de SCD4 como se definió
anteriormente.
Además, la invención también describe una
composición farmacéutica obtenible por medio del método anterior
para la preparación de una composición farmacéutica.
La invención también describe la composición
farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa
tal como la enfermedad de Alzheimer y trastornos neurodegenerativos
relacionados.
La invención también describe un método para el
tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa,
preferiblemente la enfermedad de Alzheimer, que comprende la
administración a un sujeto que necesite de tal tratamiento o
prevención de una cantidad terapéuticamente efectiva de una
composición farmacéutica como la descrita anteriormente.
Con respecto a ese método, todas las modalidades
como las descritas anteriormente aplican también para el uso de la
invención.
La invención también se relaciona con el uso de
un inhibidor de SCD4 para la modulación, preferiblemente la
inhibición de la actividad in vitro de la beta secretasa y/o
de la gama secretasa, en donde el inhibidor es seleccionado del
grupo que consiste oligonucleótidos antisentido, siARN y ribozimas.
Por ejemplo, está incluido dentro de la presente invención,
modular, preferiblemente inhibir la actividad de la beta secretasa
y/o de la gama secretasa en cultivos celulares por medio del
inhibidor de SCD4. Todas las modalidades con respecto al inhibidor
de SCD4 como se describió anteriormente, también aplican a este uso
de la invención.
La invención se ilustra adicionalmente, pero no
está limitada de ninguna manera por las siguientes figuras y
ejemplos:
Fig.
1
SCD4 es muy altamente expresada en cerebro
humano. Se transcribieron en forma inversa 5 \mug de ARN total de
diferentes fuentes de tejido humano (Clontech). Se utilizaron
cantidades iguales de los ADNc de cada tejido e iniciadores
específicos de SCD4 para la determinación de niveles de expresión
relativos de SCD4 por medio de PCR cuantitativo. Se llevaron a cabo
tres experimentos independientes y se normalizaron todos los valores
para un ARN humano de referencia (Stratagene).
Fig.
2
La desactivación mediada por siARN de la
expresión de SCD4 atenúa la secreción de
A\beta1-42.
(Panel izquierdo) Los siARN dirigidos contra
BACE1, SCD4 o Luc3 fueron transfectados dentro de células H4 de
neuroglioma que sobreexpresan APPsw mutante. 48 horas después de la
transfección se removió el medio de crecimiento y se incubaron las
células durante la noche en medio libre de suero. Se recolectaron
los sobrenadantes y se determinaron los niveles de
A\beta1-42 por medio de ELISA (Innogenetics). Se
realizaron al menos tres experimentos independientes por
duplicado.
\newpage
(Panel derecho) El siARN dirigido contra SCD4
reduce específicamente los niveles de ARNm. Se preparó ARN total a
partir de células H4/APPsw con siARN dirigido o bien contra Luc3 o
contra SCD4. Después de la transcripción inversa, se determinaron
las cantidades relativas de transcritos de SCD4 por medio de PCR
cuantitativa. Se llevaron a cabo al menos dos experimentos
independientes.
Fig.
3
Secuencia de aminoácidos de SCD4 humana
(SCD4/Proteína Hipotética FL J21032), descrita en código de una
letra.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos se refieren a todas las
modalidades de la invención y especialmente a modalidades como las
reivindicadas en las reivindicaciones.
Para evaluar si SCD4 califica como un objetivo
potencial para AD, investigamos si se expresó en cerebro humano.
Con ese fin, determinamos sus niveles de expresión en diferentes
tejidos por medio de la transcripción inversa de la reacción en
cadena de la polimerasa (RT-PCR). En resumen En
resumen, se transcribieron en forma inversa 5 \mug de ARN total
de diferentes fuentes de tejido humano (Clontech) utilizando
procedimientos estándar. Se utilizaron cantidades iguales de los
ADNc de cada tejido e iniciadores específicos de SCD4 para la
determinación de los niveles de expresión relativa de SCD4 por
medio de la PCR siguiendo las instrucciones del fabricante. Se
normalizaron todos los valores con un ARN humano de referencia
(Stratagene).
Se empleó una estrategia de perturbación de la
expresión del gen ARNi para la validación funcional de SCD4 como un
efector del procesamiento de APP: Unos siARN dirigidos contra
SCD-4 así como unos siARN dirigidos contra BACE1 o
dentro de Luc3, fueron transfectados dentro de células de
neuroblastoma SKNBE2 o células de neuroglioma H4. Los siARN para
SCD-4 humanas fueron sintetizados por Dharmacon
Research Inc.
La secuencia del siARN utilizada para
SCD-4 es: AGUACUCAGAGACGGAUGC.
La transfección de células
SK-N-BE2 se realizó utilizando
LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del
fabricante. En resumen, se sembraron las células con una densidad de
1,0 x 10^{4} células en un volumen final de 85 \mul por placa
de 96 pozos, 12 a 16 horas antes de la transfección. Se mezclaron 25
nM de los siARN con 8 \mul de amortiguador
Opti-MEM (Gibco) y 60 ng de ADN portador, y se
incubó la mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de
la adición a las células. 16 y 48 horas después de la transfección
se reemplazó el medio con 100 \mul ó 200 \mul de medio de
crecimiento con o sin suero, respectivamente. 72 horas después de
la transfección, se cosecharon 100 \mul de sobrenadantes para el
ELISA de A\beta42. El ensayo se llevó a cabo siguiendo las
instrucciones del fabricante (Innogenetics).
La transfección de células H4 se llevó a cabo
utilizando RNAiFect (Qiagen) siguiendo las instrucciones del
fabricante. En resumen, se sembraron las células con una densidad de
1,0 x 10^{4} células en un volumen final de 100 \mul por placa
de 96 pozos, 12 a 16 horas antes de la transfección. Se mezclaron
270 nM (0,375 \mug) de los siARN con 25 \mul de amortiguador
EC-R y 2,3 \mul de RNAiFect y se incubó durante 15
minutos a temperatura ambiente antes de la adición a las células.
Se reemplazó el medio sobre las células con 75 \mul de medio de
crecimiento fresco. 5 horas después de la transfección, se lavaron
las células una vez con medio de crecimiento y se añadieron 100
\mul para cultivo adicional. 48 horas después de la transfección
se reemplazó con 200 \mul de medio de crecimiento libre de suero.
72 horas después de la transfección se cosecharon 100 \mul de
sobrenadantes para el ELISA de A\beta42. El ensayo se llevó a cabo
siguiendo las instrucciones del fabricante (Innogenetics).
La eficiencia de la inactivación de los siARN se
evaluó con el nivel de proteína por medio de la cotransfección de
los siARN y los vectores de expresión correspondientes de ADNc
etiquetados con TAP, o por medio del uso de líneas celulares que
expresan en forma estable a la respectiva proteína etiquetada de
interés. 48 horas después de la transfección, se prepararon
extractos, se separaron las proteínas por medio de
SDS-PAGE y se las transfirió a nitrocelulosa. Los
Western blot se probaron con anticuerpos dirigidos contra el
marcador y la tubulina.
Nos hemos percatado de que semejante a los siARN
dirigidos contra el efector conocido del procesamiento de APP,
BACE1, el siARN dirigido a SCD-4 provocó una
atenuación significativa de la secreción de
A\beta1-42, mientras que el siARN de Luc3 no tuvo
efecto.
De esta forma, pudimos mostrar que
SCD-4 juega un papel funcional en el procesamiento
de APP. Se observó que por medio de la inhibición de
SCD-4, se podría reducir la producción del péptido
A\beta1-42.
Confirmamos que los SiARN de
SCD-4 realmente interfirieron con la expresión de la
desaturasa sobre el nivel de ARNm por medio del análisis de la
RT-PCR como se describió anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Adaptado para la medición de la actividad
SCD-4 a partir de: (Obukowicz MG, Raz A, Pyla PD,
Rico JG, Wendling JM, Needleman P (1998a) Identification and
characterization of a novel delta6/delta5 fatty acid desaturase
inhibitor as a potential anti-inflammatory agent.
Biochem. Pharmacol. 1;55(7): 1045-58;
Obukowicz MG, Welsch DJ, Salsgiver WJ,
Martin-Berger CL, Chinn KS, Duffin KL, Raz A,
Needleman P (1998b) Novel, selective delta6 or delta5 fatty acid
desaturase inhibitors as anti-inflammatory agents in
mice. J. Pharmacol. Exp. Ther.
287(1):157-66).
Las membranas microsomales de rata se obtienen
por medio de procedimientos estándar de fraccionamiento
bioquímico.
En una placa de 48 pozos se mezclan los
siguientes componentes: a) 150 \mul de amortiguador/cofactores
(sacarosa 250 mM, KC1 150 mM, NaF 40 mM, ATP 1,3 mM, 1 mg/ml de
MgCl_{2} * 5 H_{2}0, glutationa reducida 1,5 mM, CoA reducida
60 \muM, nicotinamida 330 \muM, 670 \mug/ml de NADH, fosfato
de sodio 100 mM, pH 7.4); b) 50 \mul de microsomas de hígado de
rata (\sim500 \mug de proteína total); c) 2,2 \mul de
compuesto de prueba (patrón de DMSO; concentración final 1% de
DMSO); d) 20 \mul (0,05 \muCi) Sustratos de Ácido Graso con
^{14}C.
El ensayo permite la medición simultánea de la
actividad de SCD1 y SCD4 (desaturasa D9). El sustrato para estas
actividades enzimáticas es ácido esteárico (^{14}C18:0).
Se incuban las muestras a 37ºC durante 1 hora, y
luego se detienen las reacciones y se hidrolizan los enlaces éster
del ácido graso por medio de incubación con 200 \mul de KOH 2,5N
en metanol:agua (4:1) durante 4 h a 65ºC. Se protonan los ácidos
grasos libres con 280 \mul de ácido fórmico y se extrae dentro de
la fase orgánica (700 \mul de hexano). Se analizan 200 \mul de
la capa de hexano sobre places de cromatografía en capa delgada de
AgNO_{3} (TLC). Las placas se secan durante la noche y se
cuantifica la actividad por medio de del formador de imágenes en
pantalla de fósforo. Como una alternativa al análisis por TLC, la
separación de las muestras podría lograrse por medio de HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utiliza una línea celular que expresa altos
niveles de SCD4. Se adaptan las células al crecimiento en un medio
adecuado libre de suero que contiene sustratos de SCD4 (tal como
ácido esteárico 10 \muM /BSA libre de ácido graso 15 \muM).
Para medir la actividad de SCD4 se siembran 2 x 10^{5} células por
placa de 48 pozos y luego se incuba en un medio que contiene 10
\muM de un sustrato adecuado (tal como ácido esteárico
(^{14}C18:0)). Para determinar el metabolismo del ácido graso, se
lava la capa celular con PBS y se añaden 200 \mul de KOH 2,5 N en
metanol:agua (4:1). Se procesan adicionalmente las muestras como se
describió anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo utiliza ésteres de acil CoA graso
tritiados en posiciones específicas en un formato de ensayo
microsomal (ver más arriba). El método detecta la liberación de
agua tritiada y elude el requerimiento de análisis por TLC o HPLC
de ácidos grasos marcados con ^{14}C.
En resumen, se mezclan los siguientes
componentes (volumen total: 100 \mul): 2 \mul de acil CoA graso
no marcado 1,5 mM; 1 \mul de acil CoA graso tritiado, 10 \mul de
NADH 20 mM, compuestos a partir del patrón de DMSO, 67 \mul de
amortiguador de fosfato 100 mM, pH 7,2. Se añaden 80 \mul de esta
mezcla a 20 \mul de microsomas (\sim20 \mug de proteína
total) y se le permite proseguir a la reacción durante
5-30 min a temperatura ambiente. Se añaden 10
\mul de ácido perclórico al 6% para detener la reacción. Para
sedimentar el sustrato tritiado no utilizado, se someten las
muestras a agitación tipo vórtice con 100 \mul de suspensión de
carbón vegetal y se centrifuga a 13.000 rpm durante 10 min a 4ºC.
Se analizan 400 \mul del sobrenadante en un contador de centelleo
líquido.
\newpage
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (6)
1. El uso de un inhibidor de SCD4 para la
preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de
la enfermedad de Alzheimer, en donde se selecciona al inhibidor del
grupo que consiste de oligonucleótidos antisentido, siARN y
ribozimas, y en donde el inhibidor modula la actividad de la gama
secretasa y/o de la beta secretasa.
2. Un método para identificación de un modulador
de gama secretasa y/o de beta secretasa, que comprende las
siguientes etapas:
- a.
- identificar una molécula que interactúa con SCD4 determinando sí un compuesto de prueba dado es una molécula que interactúa con SCD4,
- b.
- determinar si la molécula que interactúa con SCD4 de la etapa a) es capaz de modular la actividad de la gama secretasa y/o de la beta secretasa.
3. El método de la reivindicación 2, en donde en
la etapa a) se pone en contacto al compuesto de prueba con SCD4 y
se determina la interacción de SCD4 con el compuesto de prueba.
4. El método de la reivindicación 3, en donde la
interacción del compuesto de prueba con SCD4 resulta en una
inhibición de la actividad de SCD4.
5. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, en donde en la etapa b) se mide la habilidad
de la gama secretasa y/o de la beta secretasa para escindir a
APP.
6. El uso de un inhibidor de SCD4 para la
modulación de la actividad in vitro de la beta secretasa y/o
de la gama secretasa, en donde se selecciona al inhibidor del grupo
que consiste de oligonucleótidos antisentido, siARN, y
ribozimas.
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