ES2296285T3 - Serin proteasas altamente alcalinas. - Google Patents

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ES2296285T3 ES93917602T ES93917602T ES2296285T3 ES 2296285 T3 ES2296285 T3 ES 2296285T3 ES 93917602 T ES93917602 T ES 93917602T ES 93917602 T ES93917602 T ES 93917602T ES 2296285 T3 ES2296285 T3 ES 2296285T3
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Leonardus Johannes Sofie Marie Mulleners
Onno Misset
Jan Metske Van Der Laan
Franciscus Josephus Cornelius Van Gastel
Cornelis Petrus Broekhuizen
Erik Jan Baas
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Abstract

SE PROPORCIONAN NUEVAS PROTEASAS DE SERINA MUTANTES PB92 O SUBTILISINA 309 QUE TIENEN MUTACIONES ESPECIFICAS, DANDO COMO RESULTADO UN RENDIMIENTO AL LAVADO SORPRENDENTEMENTE MEJOR O UNA ESTABILIDAD AL ALMACENAMIENTO MEJORADA CON UN RENDIMIENTO AL LAVADO SIMILAR O INCLUSO MEJOR. ESTOS MUTANTES PB92 O SULBTILISINA 309 INCLUYEN MUTACIONES EN LAS POSICIONES 60, 87, 97, 99, 102, 116, 117, 126, 127, 128, 130, 133, 134, 154, 156, 158, 159, 160, 164, 169, 175, 180, 182, 193, 197, 198, 203, 211 Y 216. LAS NUEVAS PROTEASAS, POR ELLO, SON MUY ADECUADAS PARA USO EN DIFERENTES TIPOS DE DETERGENTES, ESTEN O NO EN CONJUNCION CON OTRAS ENZIMAS, POR EJEMPLO, AMILASAS, CELULASAS Y LIPASAS. REALIZACIONES PREFERIDAS SON LOS MUTANTES PB92 O SUBTILISINA 309 QUE TIENEN UNA MUTACION EN LA POSICION 102 Y EN PARTICULAR AQUELLAS QUE TIENEN AL MENOS OTRA MUTACION COMPLEMENTARIA.

Description

Serín proteasas altamente alcalinas.
Campo técnico
El presente invento se refiere a nuevos mutantes de serín proteasas altamente alcalinas que tiene propiedades mejoradas para usar en detergentes. Estas propiedades incluyen capacidad de eliminar manchas mejorada en composiciones de detergentes para la ropa, capacidad mejorada de eliminar manchas a temperaturas de lavado bajas, estabilidad mejorada en detergentes para la ropa tras el almacenamiento y estabilidad mejorada en la espuma de jabón preparada de los detergentes.
Antecedentes del invento
El uso de los aditivos enzimáticos, en particular las enzimas proteolíticas, en las composiciones de detergentes para permitir la eliminación de manchas de base proteica, ha sido ampliamente documentado. Véase por ejemplo las Solicitudes de Patente Europea publicadas EP-A-0220921 y EP-A-0232269, números de Patente norteamericanas 4.480.037 y Re 30.602, y el articulo "Production of Microbial Enzymes", Microbial Tecnology, vol. 1 (1979) 281-311, Academic Press.
Las composiciones de detergente, que son aplicadas para la limpieza de superficies duras, limpieza de letrinas, lavado de platos y lavandería, pueden estar en forma de polvo, líquido o pasta. Los detergentes de lavandería están generalmente divididos en dos grandes grupos, líquidos y polvos.
Las enzimas proteolíticas son generalmente difíciles de combinar con las composiciones de los detergentes. Deben estar estables y activas durante su aplicación, por ejemplo al eliminar las manchas proteináceas de los tejidos durante el lavado a temperaturas que oscilan entre alrededor de 10ºC hasta por encima de 60ºC. Además deben ser estables durante períodos prolongados de tiempo durante el almacenamiento en el producto detergente. Por consiguiente, las enzimas tienen que ser estables y funcionales en presencia de los agentes secuestrantes, tensioactivos, de alcalinidad alta, a menudo agentes blanqueadores, y temperatura elevada.
Como no existen ni detergentes de lavandería universales ni condiciones de lavado universal (pH, temperatura, concentración de espuma, dureza del agua) que sean usadas por todo el mundo, las demandas en enzimas pueden variar en el tipo de detergente en el que son usadas y en las condiciones de lavado.
Un grupo comercialmente importante de proteasas es el de las así llamadas proteasas altamente alcalinas, derivadas de los bacilos alcalófilos. El producto MAXACAL® de proteasas altamente alcalinas disponible comercialmente (Gist-brocades/IBIS) contiene la serín proteasa "PB92", derivada del Bacillus novo sp. PB92 (véase la patente norteamericana de número de referencia 30.602). Su secuencia aminoacídica está descrita en los documentos de patente EP-A-0283075 y EP-A-0284126. También la SAVINASE® (Novo-Nordisk) es un miembro de este grupo. La SAVINASE contiene la enzima "Subtilisin 309", que es un derivado de una cepa del bacilo NCIB 10147 (patente norteamericana número 3.723.750). Su secuencia aminoacídica está descrita en el documento de patente WO 89/06279, en el que la cepa es referida como Bacillus lentus. Las secuencias aminoacídicas de estas dos proteasas parecen diferir sólo en la posición 85 (tomando la numeración del residuo de la proteasa PB92, que corresponde a la posición 87 en la numeración BPN), en la que la PB92 tiene un asparagina ("N") en el código aminoacídico de una letra) y "Subtilisin 309" una serina ("S").
Puesto que la proteasa PB92 es activa en eliminar manchas a valores de pH alcalinos, es usada comúnmente como un aditivo de detergentes, junto con los ingredientes de detergente tal como tensioactivos, agentes de consistencia y agentes oxidantes. Los últimos agentes son usados en su mayoría en forma de polvos. Los aditivos de detergentes pueden contener también otras enzimas, por ejemplo amilasas, celulasas y/o lipasas, mientras sean compatibles con la proteasa. La proteasa PB92 tiene una alta eficacia eliminando manchas comparada con otras proteasas, tales como las "clásicas" subtilisinas que son bien conocidas en la técnica. Esto significa que menos proteasa PB92 es necesaria para obtener el mismo rendimiento de lavado. La sensibilidad a la oxidación es un inconveniente importante de la proteasa PB92 y todas las serín proteasas conocidas usadas para su aplicación en detergentes. Originalmente las proteasas alcalinas comercialmente disponibles como el MAXACAL® fueron desarrolladas para su aplicación en detergentes a temperaturas potenciadas en el intervalo 40-60ºC. Sin embargo, hoy en día, debido al creciente énfasis en la economía, hay una tendencia actual para cambiar a temperaturas más bajas. Como consecuencia el menor rendimiento de lavado a temperaturas reducidas, por ejemplo 15-25ºC, es una desventaja importante de las proteasas alcalinas comercialmente existentes.
Hay varias maneras para obtener nuevas enzimas para la aplicación que se pretende designar, que son todas conocidas por los profesionales expertos en la técnica. La modificación de las enzimas existentes mediante ingeniería de proteínas es probablemente el método más popular y eficaz hoy en día.
La manera más específica de obtener enzimas modificadas es la mutagénesis dirigida, permitiendo la sustitución específica de uno o más aminoácidos por cualquier otro aminoácido deseado. El documento de patente EP-A-0130756 ejemplifica el uso de ésta técnica para generar genes de proteasa mutantes que pueden ser expresados para dar enzimas proteolíticas modificadas. Un método muy eficaz es la mutagénesis dirigida mediada por oligonucleótidos, que permite un número de mutaciones diferentes a ser introducidas en una parte especifica de una secuencia de ADN usando una preparación de oligonucleótidos sintéticos.
Para un resumen exhaustivo de las diversas composiciones de detergentes y enzimas, sus formas físicas, las condiciones en las que las enzimas tienen que encontrarse para un funcionamiento óptimo, los problemas y las limitaciones de las enzimas disponibles actualmente para el uso en las composiciones de las enzimas de los detergentes, la preparación y el cribado de las proteasas mutantes, etc., se puede hacer referencia al documento de patente EP-A-0328229, el cual está incorporado aquí mediante referencia.
El documento de patente WO 89/06279 reivindica los mutantes inter alia de la proteasa "Subtilisin 309", en el que uno o más residuos en las posiciones siguientes son sustituidos (tomando la numeración de residuos BPN' original): 6, 9, 11-12, 19, 25, 36-38, 53-59, 67, 71, 89, 104, 111, 115, 120, 121-122, 124, 128, 131, 140, 153-166, 168, 169-170, 172, 175, 180, 182, 186, 187, 191, 194, 195, 199, 218, 219, 222, 226, 234-238, 241, 260-262, 265, 268, o 275. El numero de ejemplos en esta referencia que describen los mutantes que han sido hechos y ensayados está restringido solamente a ocho, al tiempo que no más de 4 posiciones estaban implicadas. Estos mutantes son: S153A, G195D, G195E, N218S, [G195E M222A], [G195E M222C], M222A y M222C.
El documento de patente EPA-A-0328229 describe y reivindica las proteasas mutantes inter alia que tienen al menos un 70% de homología con la secuencia de aminoácidos de la serín proteasa y difiere por lo menos en un residuo de aminoácidos en el sitio seleccionado correspondiente a 32, 33, 48-54, 58-62, 94-107, 116-118, 123-134, 150, 152-156, 158-161, 164, 166, 169, 175-186, 197, 198, y 203-216, 235, 243 y 259 en dicha serín proteasa PB92, y teniendo un rendimiento mejorado de lavado y/o estabilidad relativa mejorada para dicha serín proteasa PB92. Esta referencia es ejemplificada por 69 mutantes, en los que están implicadas 17 posiciones. El documento de patente EP 0405901 también se refiere a las composiciones de detergentes enzimáticos y describe las enzimas, producidas por genes mutantes para un número de proteasas subtilisinas y que expresan los genes mutados en un hospedante adecuado, que exhibe un rendimiento de lavado mejorado.
A pesar del progreso que parece haber sido hecho en los últimos años, hay un continuo interés en el desarrollo de nuevas enzimas proteolíticas con propiedades mejoradas que las hacen más atractivas para el uso en los detergentes. Estas propiedades pueden incluir, pero no están limitadas a, un mejor rendimiento de lavado, una capacidad de eliminación de manchas mejorada a temperatura de lavado baja, estabilidad mejorada tras el almacenamiento, o estabilidad mejorada mientras son usadas.
Resumen del invento
En uno de los aspectos el presente invento proporciona una nueva proteasa serín mutante PB92 o Subtilisin 309 que tiene mutaciones especificas, dando como resultado propiedades mejoradas considerablemente que las hacen muy adecuadas para la aplicación en los detergentes, especialmente en los detergentes de lavandería. Estos mutantes PB92 o Subtilisin 309 incluyen mutaciones en las posiciones 60, 87, 97, 99, 102, 116, 117, 126, 127, 128, 130, 133, 134, 154, 156, 158, 159, 160, 164, 166, 169, 175, 180, 182, 193, 197, 198, 203, 211, 212, y 216.
En una realización preferida del invento se proporcionan mutantes PB92 y Subtilisin 309 que tienen una mutación en la posición 102, preferiblemente en combinación con al menos una mutación adicional. De estos, los mutantes PB92 [S99G, V102N] y [V102N, N198G] son más preferidos.
En otro aspecto el invento proporciona nuevas composiciones de detergentes enzimáticos, que comprende un producto enzimático proteolítico que contiene al menos una de tales enzimas proteolíticas mutantes, que están o no en conjunción con otras enzimas, por ejemplo las amilasas, celulasas y lipasas.
Descripción detallada del invento
Por el término "propiedades mejoradas", como se usa en esta especificación en conexión con "las proteasas mutantes", los autores quieren decir enzimas proteolíticas con rendimiento de lavado mejorado o estabilidad mejorada que conserva el rendimiento de lavado, relativo a la proteasa de tipo silvestre correspondiente.
El término "rendimiento de lavado" de las proteasas mutantes es definido en esta especificación como contribución de una proteasa mutante a la limpieza de lavandería adicional al efecto de la composición del detergente sin la enzima bajo las condiciones de lavado relevantes.
El término "condiciones de lavado relevante" es usado para indicar las condiciones, temperatura de lavado, particularmente tiempo, mecanismos de lavado, concentración de espuma de jabón, tipo de detergente y dureza del agua, realmente usadas en los hogares en un segmento del mercado de detergentes.
El término "rendimiento de lavado mejorado" es usado para indicar que el rendimiento de lavado de una proteasa mutante, en base al peso, es al menos mayor que el 100% relativo a la proteasa de tipo silvestre correspondiente bajo condiciones de lavado relevantes.
El término "rendimiento de lavado retenido" es usado para indicar que el rendimiento de lavado de una proteasa mutante, en base al peso, es al menos del 80% relativo a la proteasa de tipo silvestre correspondiente en condiciones de lavado relevantes.
El término "estabilidad mejorada" es usado par indicar una mejor estabilidad de las enzimas proteolíticas mutantes en los detergentes de lavandería durante el almacenamiento y/o en su estabilidad en la espuma de jabón, que incluye estabilidad frente a agentes oxidantes, agentes secuestrantes, autolisis, tensioactivos y alta alcalinidad, relativa a la enzima de tipo silvestre correspondiente.
El documento de patente EP-A-0328229 describe un método en el que la preparación de las proteasas mutantes es combinada con un procedimiento de selección eficaz en el rendimiento de estas proteasas. El sistema de ensayo está basado en la eliminación de las manchas sensibles a la proteasa de las muestras de tela de ensayo en un equipo de lavado o tergotómetro imitando las condiciones de lavado relevantes. Las muestras de tela adecuadas son, por ejemplo, las muestras de tela EMPA disponibles comercialmente (Eidgenössische Material Prüfungs und Versuch Anstalt, St. Gallen, Switzerland) manchadas artificialmente con manchas proteináceas. Las manchas relevantes en las muestras de tejido para el ensayo de las proteasas incluyen sangre, hierba, chocolate y otras manchas proteináceas. La referencia también describe que en este sistema de ensayo otros factores relevantes, tales como la composición del detergente, la concentración de espuma de jabón, la dureza del agua, los mecanismos de lavado, el tiempo, el pH y la temperatura, son controlados de tal manera que las condiciones típicas para la aplicación en el hogar en un cierto segmento del mercado puedan ser imitadas.
El rendimiento de lavado de las proteasas es medido convenientemente por su capacidad para eliminar ciertas manchas representativas bajo las condiciones de ensayo apropiadas. Esta capacidad puede ser determinada adecuadamente mediante medidas de reflectancia en los tejidos de ensayo, después de lavar con y sin enzimas en equipos de lavado launderómetro o tergotómetro. El sistema de ensayo de aplicación en laboratorio según el invento es representativo de la aplicación en el hogar cuando se usa en proteasas que han sido modificadas mediante mutagénesis de ADN.
Para practicar el presente invento esencialmente el mismo método puede ser usado para la preparación, cribado y selección de enzimas mutantes adicionales derivadas de las enzimas de tipo silvestre que son producidas por bacilos alcalófilos. Los mutantes preferidos son aquellos codificados por un gen derivado de un gen de tipo silvestre que codifica la serín proteasa PB92 o la serín proteasa Subtilisin 309 y que muestra propiedades mejoradas en las condiciones de ensayo mencionadas anteriormente. También los genes que codifican serín proteasas íntimamente relacionadas, que tienen preferiblemente una homología mayor de alrededor del 70%, particularmente mayor de alrededor del 90%, son muy adecuados.
Quedará claro que o bien la mutagénesis dirigida ayudada por oligonucleótidos o la mutagénesis aleatoria dirigida a una región pueden ser usadas o cualquier otro método adecuado para la generación eficaz de mutaciones en el gen proteasa de elección.
De acuerdo con el invento, diversos mutantes fueron obtenidos con unas propiedades mejoradas no esperadas, es decir, un rendimiento de lavado considerablemente más alto, capacidad mejorada de eliminar manchas a baja temperatura de lavado, o mejorar considerablemente la estabilidad del almacenamiento con un rendimiento de lavado similar o incluso mejor. Estas mejoras fueron sorprendentes, puesto que no fueron sugeridas por, ni pudieron ser derivadas durante el aprendizaje obtenido a partir del documento de patente EP-A-328229 y otra técnica anterior, tanto solas como tomadas juntos.
El presente invento proporciona por tanto una proteasa mutante para el uso en detergentes que comprenden:
Teniendo una homología mayor del 90% bien con la secuencia aminoacídica de la serín proteasa PB92 que tiene la secuencia aminoacídica:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\newpage
o la secuencia aminoacídica de la serín proteasa Subtilisin 309 que tiene la secuencia aminoacídica:
2
en la que el residuo aminoacídico en el sitio correspondiente a la posición V102 en dicha serín proteasa PB92 o dicha serín proteasa Subtilisin 309 es cambiado a A, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T o Y, teniendo un el rendimiento de lavado mejorado y/o estabilidad relativa mejorada a dicha serín proteasa PB92 o a dicha serín proteasa Subtilisin 309 siendo dicho rendimiento de lavado mejorado determinado en un sistema de lavado que tiene las siguientes características: detergente IEC-zeolita Formulación abril 1988 5,6 g/l; volumen de espuma de jabón por 200 ml de vaso de precipitado; 30ºC de temperatura; 20 min de tiempo; 1,4 g/l perborato NA tetrahidratado; TAED 210 mg/l; 10 x 10 cm de muestra de tejido limpio 2 EMPA 221; 15 bolas de acero inoxidable (phi 6 mm); Ca^{2+} 2 mM; 0,7 mM Mg^{2+}; 0 mM NaCO_{3}; y 2 EMPA 116 o 2 EMPA 117 o 2 CFT As-3 CACAO 5 x 5 cm de muestras de tejido.
Un grupo preferido de proteasa mutante según el invento son aquellos mutantes de proteasa PB92 o Subtilisin 309 que difieren por lo menos en una de las siguientes mutaciones: [S99G, V102I], [S99G, V102L], [S99G, V102N], [V102A], [V102A, M2165], [V102E], [V102G], [V102H], [V102I], [V102I, G116V, S126V, P127M], [V102I, G116V, S126V, P127M], [V102I, S130G], [V102L], [V102L, G116V, S126V, P127M], [V102L, S130G], [V102L, M216F], [V102L, M215S], [V102M], [V102N], [V102N, R164Y], [V102N, N198G], [V102N, N197T, N196G], [V102N, N198G, Y203W], [V102N, Y203W], [V102N, L211E], [V102N, M216X, en la que X es cualquier aminoácido excepto M], [V102N, M216S], [V102P], [V102P, M216S], [V102Q], [V102Q, M216S], [V102S], [V102S, M216S], [V102T] y [V102Y].
Teniendo el rendimiento de lavado mejorado y/o la estabilidad relativa mejorado de dicha serín proteasa PB92 o de dicha serín proteasa Subtilisin 309 siendo dicho rendimiento de lavado mejorado determinado en un sistema de lavado que tiene las siguientes características: detergente IEC- zeolita. Formulación abril 1988 5.6 g/l; 200 ml de volumen de espuma de jabón por vaso de precipitado; 30ºC de temperatura; 30 min de tiempo; 1,4 g/l perborato NA tetrahidratado; TAED 210 mg/l; 10 x 10 cm de muestra de tejido limpio 2 EMPA 221; 15 bolas de acero inoxidable (phi 6 mm); 2 mM Ca^{2+}; 0,7 mM Mg^{2+}; 0 mM NaCO_{3}; y 2 EMPA 116 o 2 EMPA 117 o 2 CFT As-3 CACAO 5 x 5 cm de muestras de tejido.
Preferiblemente, las proteasas mutantes según el presente invento están en forma sustancialmente pura.
Ciertas proteasas mutantes nuevas muestran una resistencia a la oxidación considerablemente mejorada, en la que su rendimiento de lavado es también mejor y en muchos casos significativamente mejor que el rendimiento de lavado de la proteasa de tipo silvestre correspondiente. Estas enzimas mutantes tienen en común que la metionina ("M") en la posición 216 es sustituida por otro aminoácido, preferiblemente serina ("S") o glutamina ("Q"). También la sustitución por fenilalanina ("F") o alanina ("A") es adecuada. Sustituciones adicionales incluyen las posiciones 60, 99, 102, 116, 127, 128, 130, 154, 156, 158, 197, 198, 203, 211 y 212: las enzimas preferidas son las M216S y M216Q mutantes que están además sustituidas en la posición 102 o en una o más de las posiciones 116, 126, 127, y 128. También las mutantes M216S y M216Q con sustituciones en las posiciones 197, 198 y 203 son de particular interés. Los mutantes preferidos son [N60E, M216S], [S99G, M216S], [V102A, M216S], [V102L, M216S], [V102N, M216S], [V102P, M216S], [V102Q, M216S], [V102S, M216S], [G116V, S126L, P127Q, S128A, M216S], [G116V, S126N, P127S, S128A, M216S], [G116V, S126R, P127Q, S128D, M216S], [P127E, S128T, M216S], [V197T, M216S], [N198G, M216S], [Y203W, M216S], [L211E, M216S], [G116V, S126N, P127S, S128A, M216Q], [S126M, P127A, S128G, M216Q], [V102L, M216F].
Se debería notar que el documento de patente EP-A-0328229 describe la estabilidad de oxidación mejorada con el rendimiento de lavado retenido de ciertos mutantes M216S y M216Q del PB92 y similar a la serín proteasa altamente alcalinas. Sin embargo esta referencia no muestra ni sugiere que los mutantes "216" del PB92 o Subtilisin 309 con las mutaciones definidas anteriormente resultarían tan siquiera en un rendimiento de lavado significativamente mejorado. En otro aspecto del invento ciertas proteasas mutantes nuevas que generalmente no son resistentes a la oxidación, muestran un rendimiento de lavado considerablemente mejorado. Estas enzimas mutantes tienen sustituciones en la posición 102. Las mutantes preferidas son aquellas que tienen al menos dos modificaciones. Estas modificaciones incluyen las posiciones: 102 combinadas con al menos una de las mutaciones adicionales en una posición seleccionada del grupo que comprende las posiciones 87, 97, 116, 117, 126, 127, 128, 130, 133, 134, 154, 156, 158, 159, 160, 164, 166, 169, 175, 180, 182, 193, 197, 198, 203, 211 o 212, preferiblemente con al menos una de las mutaciones adicionales en una posición seleccionada del grupo que comprende las posiciones 130, 164, 197, 198, 203 o 211. Los mutantes preferidos son [S99G, V102N], [S99G, V102L], [S99G, V102I], [V102I, S130G], [V102L, S130G], [V102N, R164Y], [V102N, N198G], [V102N, N197T, N198G], [V102N, N198G, Y203W], [V102N, Y203W], [V102N, L211E], [V102I, G116V, S126V, P127M], [V102L, G116V, S126V, P127M]. Los mutantes particularmente preferidos son [S99G, V102N] y [V102N, N198G]. Ciertas proteasas mutantes nuevas PB92 y Subtilisin 309 muestran una actividad inesperada en las manchas de cacao, que no eran predecibles de ninguna manera por la técnica anterior. Dichas proteasas mutantes tienen una o más sustituciones en las posiciones 102, 116, 117, 126, 127, 128, 133, 154, 156, 158, 159, 160, 164, 197, 198, 203, 211 y 216. Los mutantes preferidos son aquellos que tienen al menos dos modificaciones de estas posiciones definidas. Estas modificaciones incluyen las posiciones: 102 combinada con al menos una mutación adicional en una posición seleccionada del grupo que comprende las posiciones 164 o 211; 127 combinada con al menos una mutación adicional en una posición seleccionada del grupo que comprende las posiciones 203 ó 211; 154 y 160; 158 y 159. Además, estas modificaciones incluyen la posición M216S y M216Q combinada con al menos unas mutación adicional en la posición 102 ó 211. Los mutantes preferidos son: [V102N, R164Y], [V102N, L211E], [V102N, N198G], [P127E, Y203W], [P127E, L211E], [S154G, S160G], [S154D, S160G], [S158E, I159L], [M216S, V102Q], [M216S, L211E]. Además las mutaciones preferidas son las mutaciones PB92 M216S con las sustituciones adicionales V102Q y L211E.
Ciertas nuevas proteasas mutantes PB92 y Subtilisin 309 muestran una capacidad mejorada eliminando manchas a temperaturas bajas de lavado, por ejemplo, alrededor de 20ºC. Estos mutantes tienen usualmente una o más sustituciones en la enzima PB92 o Subtilisin 309 en la posición 99, 102, 116, 126, 127, 128, 130, 160, 197, 198 y 203. Los mutantes preferidos son aquellos que tienen al menos dos modificaciones fuera de estas posiciones definidas. Estas modificaciones incluyen las posiciones: 99, combinada con al menos una mutación adicional en las posiciones 102 ó 130, preferiblemente con una mutación en la posición 130; 102 combinada con al menos una mutación adicional seleccionada del grupo que comprende las posiciones 197, 198, ó 203, preferiblemente con al menos una mutación adicional en las posiciones 99 ó 198, más preferiblemente con una mutación adicional en las posiciones 99 ó 198; 126 combinada con al menos una mutación adicional en las posiciones 116, 127, 128 ó 160, preferiblemente 126 combinada con 127. Las mutaciones preferidas son [S99G, S130G], [S99G, V102N], [S99G, V102I], [V102N, N198G], [V102N, Y203W], [V102N, V197I, N198G], [S126V, P127M], [S126F, P127N], [G116V, S126V, P127M, S160D], [G116V, S126L, P127Q, S128A, S160D].
Las mutaciones útiles pueden ser hechas también por combinación de una de las mutaciones o del grupo de mutaciones descritas en esta especificación. Además, es posible combinar mutaciones útiles como se describe aquí con las mutaciones en otros sitios, que pueden o no pueden causar un cambio sustancial en las propiedades de la enzima.
Para ilustrar la importancia de la aproximación usada en este invento para obtener nuevas proteasas adecuadas para la aplicación en los detergentes de lavandería, es decir usando un ensayo de aplicación de lavandería representativo como criterio de selección primaria, los resultados de los ensayos de rendimiento de lavado de las proteasas PB92 mutante fueron comparadas con parámetros bioquímicos como se determina habitualmente en la proteína bioquímica y en la investigación enzimológica. Estos resultados permiten la conclusión que cualquier relación entre los parámetros que determinan la afinidad para los sustratos definidos y cinéticos de la reacción proteolítica y el rendimiento de lavado está ausente.
Por tanto, también es posible combinar dos o más mutaciones con diferentes propiedades en un producto enzimático o en el mismo proceso de lavado. Tal combinación puede o no tener un efecto sinérgico.
El invento comprende también el uso de una o más enzimas proteolíticas mutantes, como se define aquí anteriormente, en una composición de detergente o en un proceso de lavado. Dicha composición de detergente puede también contener una o más enzimas, por ejemplo amilasa, celulasa o lipasa que podrían ser compatibles con la proteasa o las proteasas de elección. La selección de la mejor combinación de las enzimas depende normalmente de los requerimientos y necesidades del consumidor, pero generalmente no requiere conocimientos del invento.
Finalmente, quedará claro que por deleción o inserción de los aminoácidos en la cadena polipeptídica de la proteasa, bien creadas artificialmente por mutagénesis o de modo natural homólogas a la proteasa PB92 o Subtilisin 309, la numeración de los aminoácidos podría cambiar. Sin embargo, se puede entender que las posiciones homólogas a las posiciones aminoacídicas de la proteasa PB92 o Subtilisin 309 estarán cubiertas por el alcance de las reivindicaciones.
Las proteasas mutantes según el invento pueden ser hechas esencialmente en la misma manera como se describe en el documento de patente EP-A-0328229. También, la preparación de los genes que codifican las proteasas mutantes deseadas, la clonación y expresión de dichos genes, la elección de un hospedante adecuado, las condiciones de fermentación, recuperación, purificación, barrido y selección de las enzimas, etc. son esencialmente las mismas como se describe en el documento de patente EP-A-0328229 y están bien dentro de los conocimientos de un trabajador normal.
Los siguientes ejemplos son ofrecidos a modo de ilustración y no a modo de limitación.
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Sección experimental
Los materiales y métodos que incluyen la construcción de las mutaciones, la producción de las mutaciones, purificación, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) usando resina de intercambio catiónico y columna de filtración de gel, electroforesis en gel de poliacrilamida, valoración del sitio activo y determinación de los parámetros cinéticos son similares o idénticos a los descritos en el documento de patente EP-A-0328229, excepto cuando se indica lo contrario. Las mutaciones que están marcadas en los ejemplos con la extensión ^{+DTT} fueron purificadas y almacenadas en presencia de ditiotreitol 2 mM (DTT).
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Ejemplo 1
El rendimiento de lavado de diversos mutantes de proteasa PB92 fue determinado en un ensayo de lavado desarrollado especialmente que está descrito en detalle en el documento de patente EP-A-0328229. Además del tripolifosfato sódico (STPP) que contiene detergente en polvo IEC-STPP en este ejemplo también fue usado un detergente en polvo que no contiene fosfatos (IEC-zeolita). Las características típicas de ambos sistemas de ensayo que fueron aplicados para ensayar el rendimiento de lavado de los mutantes de proteasa nuevos se resumen a continuación:
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El detergente en polvo IEC-STPP (detergente de ensayo IEC Tipo I, Formulación mayo de 1976) y el detergente en polvo IEC-zeolita (Formulación Abril de 1988) fueron adquiridos de EFK-Testgewebe GmbH, Adlerstraße 44, D-4150, Krefeld, Alemania. El rendimiento en el cacao fue medido en muestras de tela CFT AS-3 (adquiridas de CFT, Center For Test Materials, PO Box 120, Vlaardingen, Holanda). Dos mutantes, E87S y E87Q, fueron ensayados en el sistema IEC-STPP en 10 g/l de STPP/lejía que contenían detergente en polvo como se indica en la Tabla II. Además, medidas de rendimiento en 4 g/l fueron hechas en el sistema IEC-STPP que fue modificado ligeramente (indicado como ADE+ en las tablas): en lugar de 40ºC, 30 minutos y Ca^{2+} 2 mM, los ensayos de rendimiento de lavado fueron llevados a cabo a 30ºC durante 20 minutos en presencia de Ca^{2+} 5 mM. Además, 2 muestras de tela EMPA 221 y 15 bolas de acero inoxidable con un diámetro de 6 mm fueron incluidas.
Los resultados se resumen en las tablas que se acompañan I, II, III.
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Ejemplo 2
Para determinar el rendimiento de lavado de algunos mutantes de proteasa PB92 nuevos en condiciones de baja actividad detergente para imitar las condiciones de U.S. típicamente, el rendimiento de lavado fue determinado en un ensayo de lavado similar al ensayo descrito en el Ejemplo 1, pero con algunas modificaciones. Las características principales del ensayo se resumen a continuación:
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La composición del detergente A es como sigue:
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Antes de añadir la proteasa PB92 o mutantes de la misma, el pH del alcohol de lavado fue ajustado a 10,2. Los resultados se muestran en la Tabla IV.
Además, el rendimiento de lavado de algunos de los mutantes fue determinado a baja temperatura. Los resultados a 20ºC se muestran en la Tabla IV. Todos los mutantes que se muestran actúan significativamente mejor a 20ºC que los de tipo salvaje en estas condiciones. Sorprendentemente algunos de los mutantes, tales como [V102N, S99G], [V102N], [G116V, S126V, P127M, S160D] muestran un rendimiento de lavado mejor a 20ºC que a 30ºC. Esto es contrario a lo que se esperaba del comportamiento del tipo salvaje PB92: el rendimiento de lavado del PB92 disminuye tras la disminución de la temperatura de lavado. Esto sugiere que la aproximación de los autores para mejorar el rendimiento de lavado de una proteasa alcalina por ingeniería específica de sitio puede también cambiar la temperatura a la que estas proteasas muestran un rendimiento óptimo.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA IV Rendimiento de lavado de los nuevos mutantes PB92 a temperaturas diferentes
16
En todos los experimentos el rendimiento de lavado fue determinado relativo a la proteasa de tipo salvaje PB92. Además del detergente A antes mencionado, el rendimiento de lavado fue también determinado en varios detergentes comerciales en U.S. Los resultados de lavado fueron similares.
Todas las publicaciones (incluyendo las solicitudes de patente) mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel técnico de los expertos en la técnica a la que este invento pertenece. Todas las publicaciones están aquí incorporadas por referencia al mismo grado como si cada publicación individual fuera indicada específicamente e individualmente al ser incorporada por referencia.
Aunque el invento precedente ha sido descrito con algún detalle por medio de ilustración y ejemplo con propósitos de claridad de entendimiento, será aparente para cualquiera con conocimientos generales en la técnica que muchos cambios y modificaciones pueden ser hechos al mismo sin salirse del espíritu o ámbito de las reivindicaciones anexas.

Claims (10)

1. Una proteasa mutante para el uso en detergentes que tiene una homología mayor del 90% con bien la secuencia aminoacídica de la serín proteasa PB92 que tiene la secuencia aminoacídica:
17
o bien la secuencia aminoacídica de la serín proteasa Subtilisin 309 que tiene la secuencia aminoacídica:
18
en la que el residuo aminoacídico en un sitio seleccionado que corresponde a la posición V102 en dicha serín proteasa PB92 o en dicha serín proteasa Subtilisin 309 es cambiado por A, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, o Y,
que ha mejorado el rendimiento de lavado relativo a dicha serín proteasa PB92 o a dicha serín proteasa Subtilisin 309, siendo dicho rendimiento de lavado mejorado determinado en un sistema de lavado que tiene las siguientes características: detergente IEC-zeolita Formulación de Abril de 1988 5,6 g/l; 200 ml Volumen de espuma por vaso de precipitados (ml); temperatura 30ºC; tiempo 30 min; Na-perborato tetrahidratado 1,4 g/l; TAED 210 mg/l; 2 EMPA 221 10 x 10 cm muestra de tela limpia; 15 bolas de acero inoxidable (ø6 mm); Ca^{2+} 2 mM; Mg^{2+} 0,7 mM; NaCO_{3} 0 mM; y 2 EMPA 116 o 2 EMPA 117 o 2 CFT As-3 CACAO 5 x 5 cm de muestras de tela;
2. Una proteasa mutante según la reivindicación 1, que difiere de dicha serín proteasa PB92 o de dicha serín proteasa Subtilisin 309 en al menos una de las siguientes mutaciones:
[S99G, V102I], [S99G, VI02L], [S99G, V102N], [V102A], [V102A, M2165], [V102E], [V102G], [V102H], [V102I], [V102I, G116V, S126V, P127M], [V102I, G116V, S126V, P127M], [V102I, S130G] [V102L], [V102L, G116V, S126V, P127M], [V102L, S130G], [V102L, M216F], [V102L, M216S], `V102M], [V102N][V102N,R164Y], [V102N, N198G], [V102N, N197T, N198G], [V102N,M216X, en la que X es cualquier aminoácido excepto M), [V102N, M216S], [V102P], [V102P, M216S], [V102Q], [V102Q, M216S], [V102S], [V102S, M216S][V102T], Y [V102Y].
3. Una proteasa mutante PB92 de acuerdo con la reivindicación 1, la cual tiene una mutación en el aminoácido 102 y en al menos otra posición aminoacídica.
4. Una proteasa mutante PB92 según la reivindicación 3, la cual es seleccionada a partir del grupo que consiste en [V102N, N198G].
5. Una proteasa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que está en forma sustancialmente pura.
6. Una secuencia de ADN que codifica una proteasa mutante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Un método para preparar una proteasa mutante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende:
el crecimiento de una cepa de microorganismo hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteasa mutante a partir de la cual dicha proteasa mutante es producida, y la recuperación de dicha proteasa mutante.
8. Un aditivo detergente que comprende una o más proteasas mutantes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y, si se desea, una o más enzimas seleccionadas a partir del grupo que consiste en amilasas, celulasas y lipasas.
9. Una composición detergente que comprende una o más proteasas mutantes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y , si se desea, una o más enzimas seleccionadas a partir del grupo que consiste en amilasas, celulasas y lipasas.
10. El uso de una proteasa mutantes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en un proceso de lavado a una temperatura preferiblemente en el intervalo de entre alrededor 15ºC hasta alrededor de 45ºC.
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