ES2297878T3 - Componente de la bromelaina. - Google Patents
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Abstract
Uso de ananaína o una mezcla de ananaína y comosaína para la fabricación de un medicamento para usar como un inmunosupresor.
Description
Componente de la bromelaína.
La presente invención se refiere a un componente
de la bromelaína. En particular, la invención se refiere al uso de
este componente de la bromelaína en medicina, en particular como un
agente anticancerígeno y un agente inmunosupresor.
La bromelaína del tallo (bromelaína) es el
nombre colectivo para las enzimas proteolíticas que se encuentran
en los tejidos de la planta Bromeliaceae. Es una mezcla de
diferentes restos derivados del tallo de la planta de la piña
(Ananas comosus). Se sabe que la bromelaína contiene al
menos cinco enzimas proteolíticas y también enzimas no
proteolíticas, que incluyen una fosfatasa ácida y una peroxidasa;
también puede contener actividad de amilasa y celulasa. Además se
encuentran otros componentes diferentes.
La bromelaína se ha usado previamente en el
tratamiento de una variedad de afecciones, incluyendo la
inflamación, y en particular se ha usado en el tratamiento de la
diarrea. El uso de la bromelaína en el tratamiento de la diarrea
infecciosa se describe en el documento
WO-A-9301800, donde se sugiere que
la bromelaína trabaja destruyendo los receptores intestinales para
patógenos por proteolisis, y en el documento
WO-A-8801506, que enseña que la
bromelaína separa los patógenos de los receptores intestinales.
Taussig y col., Planta Medica, 1985,
538-539 y Maurer y col., Planta Medica,
1988, 377-381 sugieren ambos que la bromelaína se
puede usar en la inhibición del crecimiento tumoral. Los documentos
US 5.223.406, DE-A4302060 y
JP-A-59225122 también enseñan el
uso de la bromelaína en el tratamiento del cáncer. El documento US
5.223.406 enseña que la bromelaína es capaz de inducir el factor de
necrosis tumoral (TNF), mientras que el documento
DE-A-4302060 enseña que la
bromelaína puede prevenir la metástasis por la modificación
estructural de la proteína de superficie tumoral CD44.
En el documento
WO-A-9400147, se describen
diferentes experimentos que demuestran que la enzimas proteolíticas
y en particular la bromelaína, pueden inhibir la secreción. La
solicitud también describe que la bromelaína puede reducir la
actividad de unión de la toxina y puede inhibir el efecto de
secreción de toxinas tales como la toxina lábil al calor (LT) y la
toxina del cólera (CT) y también toxinas como la toxina estable al
calor (ST). Esto es independiente del hecho de que la ST tiene un
modo de acción muy diferente de la LT y CT. Estas observaciones se
explicaban por el hecho de que un componente de la mezcla de
bromelaína, la proteasa de la bromelaína del tallo, parece que
puede modular las rutas de nucleótidos cíclicos y esto se discute
con más detalle en el documento
WO-A-9500169. Además, también se ha
demostrado que la bromelaína inhibe la secreción producida por la
ruta dependiente del
calcio.
calcio.
Los autores de la presente invención han
estudiado la variedad de efectos biológicos de la bromelaína, y en
particular, sus efectos en un modelo bien documentado de
transducción intracelular de señales, en concreto la señalización
por el receptor de células T (TCR)/CD3 y la producción de
IL-2. El significativo avance en los últimos años
ha conducido al entendimiento de los sucesos bioquímicos que se
producen después del acoplamiento del TCR (revisado por Cantrell,
Annu. Rev. Immunol. 14, 259-274, (1996)), y
por consiguiente la señalización por el TCR proporciona un modelo
excelente para la elucidación de los efectos de compuestos
biológicamente activos. La activación eficaz de las células T
requiere dos señales. La primera señal es generada por el complejo
de TCR/CD3 después de acoplamiento con el péptido antígeno
presentado por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC)
expresado en las células presentadoras de antígeno (APC) (Cantrell,
1996). La segunda, la señal coestimuladora, es generada por la
unión de los receptores CD28 a las células T con la familia B7 de
ligandos en las APC. Un elemento clave en la ruta de señalización
implicado en la transducción de señales iniciadas por el receptor
al núcleo, es la familia de las proteínas quinasas activadas por
mitógeno (MAPk). Las mejores estudiadas de estas quinasas son las
proteínas quinasas reguladas por señal extracelular
(ERK)-1 y ERK-2 (también
denominadas p44^{MAPk} y p42^{MAPk}, respectivamente). Las ERK
son serina/treonina quinasas que son activadas cuando se fosforilan
los restos de tirosina y treonina. In vitro, esta activación
se invierte si cualquiera de los restos se desfosforila. Un miembro
relativamente recién descubierto de la familia de MAPk son las
quinasas NH_{2}-terminales de
c-Jun (JNK) que existen como formas de 46 kDa y 55
kDa que también requieren la fosforilación para la activación. La
activación de la ERK depende de p56^{Lck} y del acoplamiento del
complejo TCR/CD3 a p21^{Ras}, con la posterior activación de la
cascada de quinasas Raf-1/MEK1/ERK. La activación de
JNK también requiere p21^{Ras}, así como señales generadas por
el receptor coestimulador CD28 que activa proteínas que se unen a
GTP (trifosfato de guanosina) (tales como Rac1 o Cdc42) que inducen
la cascada de quinasas PAK/MEKK/SEK/JNK. La ERK activada fosforila
Elk-1, que a su vez media la inducción de la
actividad de c-fos después de la fosforilación de
c-jun por JNK. c-fos y
c-jun activados se combinan para formar la proteína
AP-1 necesaria para la síntesis de la
IL-2. Los sucesos anteriores se resumen en la
figura 1. Todos los sucesos de señalización mencionados antes
requieren la fosforilación de tirosina, puesto que los inhibidores
de las proteínas tirosina quinasas (PTK) inhiben muchos sucesos
asociados con la estimulación del TCR, incluyendo la activación de
células T y la producción de IL-2.
En el documento
WO-A-9600082, se mostraba que la
bromelaína podía inhibir la fosforilación de tirosina y la
activación de ERK-2 en células T estimuladas por el
TCR, o con éster de forbol más ionóforo de calcio combinados.
Ahora se ha encontrado que asociado con la disminución de la
actividad de la ERK, la bromelaína disminuía la acumulación de ARNm
de IL-2, IL-4 e
IFN-y en células T estimuladas con éster de forbol
y ionóforo, pero no afectaba a la acumulación de ARNm de citoquinas
en las células estimuladas por el TCR. Estos datos sugieren la
existencia de una ruta independiente de ERK y activada por TCR
implicada en la producción de citoquinas en las células T.
A partir de la técnica anterior, está claro que
la bromelaína es una mezcla que tiene una variedad de efectos
fisiológicos diferentes. No se han caracterizado todos los
componentes de la mezcla de bromelaína, y por lo tanto, excepto la
proteasa de la bromelaína del tallo cuya actividad se ha descrito,
no está claro cuál de los componentes es responsable de cuáles de
los diferentes efectos de la bromelaína. Esto es, por supuesto, una
desventaja importante si la mezcla de bromelaína se va a
administrar como producto farmacéutico porque mientras un
componente de la bromelaína puede tener el efecto deseado, también
puede haber efectos secundarios indeseados procedentes de la acción
de algún otro componente de la mezcla de bromelaína.
Por lo tanto, sería beneficioso si se pudieran
aislar los componentes individuales de la bromelaína que dan lugar
a las actividades medicinales particulares y se pudieran
administrar por separado de modo que se disminuyera la posibilidad
de efectos secundarios. Ahora se ha identificado una fracción
activa de la bromelaína bruta que es la responsable de su capacidad
para inhibir la activación de la ERK, y por lo tanto bloquear la
ruta de la MAP quinasa. Aunque no es una proteína individual, esta
fracción consiste sólo en algunos componentes y por lo tanto se
reduce mucho la posibilidad de efectos secundarios cuando se
administra a pacientes comparado con la bromelaína bruta.
La fracción, que los autores de la invención han
designado CCS, se puede aislar de la mezcla de bromelaína por
procedimientos convencionales, por ejemplo por cromatografía. La
cromatografía de alto rendimiento (HPLC) es adecuada para este
propósito y se puede lograr una separación particularmente buena de
las proteínas de la bromelaína por cromatografía líquida rápida de
proteínas (FPLC^{TM}) usando un material de empaquetamiento de la
columna tal como S-sefarosa. Como se describirá con
más detalle en los ejemplos, la cromatografía en
S-sefarosa usando un gradiente lineal de cloruro
sódico de 0 a 0,8 M en tampón de acetato con 300 ml, la proteína de
la presente invención era el último pico doble de la columna.
La fracción de CCS contiene proteínas que tienen
pesos moleculares de aproximadamente 15,07 kDa, 25,85 kDa y 27,45
kDa determinados por SDS-PAGE, tiene puntos
isoeléctricos de 10,4 y 10,45 y se puede obtener por el siguiente
procedimiento:
i. se disuelve la bromelaína en tampón de
acetato a pH 5,0;
ii. se separan los componentes de la bromelaína
por cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo rápido en
S-Sefarosa eluyendo con un gradiente lineal de
cloruro sódico de 0 a 0,8 M en tampón de acetato con 300 ml.
iii. se recoge la fracción correspondiente al
pico doble final de la columna; y
iv. se aísla la proteína de la fracción recogida
en (iii).
Se ha encontrado que la fracción, denominada
CSS, tiene una serie de actividades potencialmente útiles.
Primero, se ha encontrado que bloquea la fosforilación de
ERK-2 y por lo tanto la cascada de la MAP quinasa.
Además, bloqueaba la producción de IL-2 y la
proliferación de células T CD4^{+}. Sin embargo, la CCS no afecta
a la proliferación de esplenocitos, lo cual sugiere que tiene un
modo de acción selectivo. La CCS también bloqueaba de forma
diferencial el crecimiento de líneas de células tumorales humanas
que incluyen tumores de ovario, pulmón, colon, melanoma y pecho. La
actividad diferente de la CCS contra las diferentes líneas
celulares sugiere que la CCS tiene un modo de acción selectivo y que
también puede actuar como agente anticancerígeno. El efecto
inhibidor de la CCS en ERK-2 depende de su
actividad protolítica, puesto que E-64, un
inhibidor selectivo de la cisteína proteasa, podría anular el
efecto de la CCS.
Aunque en el documento
WO-A-9724138 se expone que las
proteasas en general son capaces de disminuir la activación de la
MAP quinasa, ahora se ha encontrado que este no es el caso, puesto
que la tripsina no anula la señalización por las células T, y
realmente en otros estudios se ha mostrado que aumenta la
activación de la MAPk (Belham y col., 1996, Biochem. J., 320,
939-946). Se ha mostrado que la trombina, una
proteasa implicada en la cascada de coagulación de la sangre,
también aumenta la activación de la quinasa MAP
(Vouret-Craviari y col., 1993, Biochem. J.,
289, 209-214). Los autores de la invención
ahora han mostrado que otras proteasa contenidas en la mezcla de
bromelaína bruta no bloquean la activación de la ruta de la quinasa
MAP.
Es posible que los efectos de la CCS en la ruta
de la quinasa MAP en las células T sean mediados por los efectos
proteolíticos específicos en la superficie celular. Se sabe que la
bromelaína escinde la isoforma CD45 RA y separa selectivamente
otras moléculas de superficie de los PBMC humanos. La bromelaína
también separa parcialmente los CD4 de las superficies de las
células T. Puesto que CD45 y CD4 tienen una función estimuladora
obligada en la activación de las células T mediada por TCR, la CCS
puede interferir con la señalización por TCR afectando a estas
moléculas. Aunque está bien reconocida la importancia de CD45 y CD4
para la transducción de señales iniciada por TCR, se pueden eludir
los requisitos para la activación de células T mediante el uso de
éster de forbol y ionóforo de calcio. El uso de ésteres de forbol y
ionóforo combinados restaura la función normal de las células T que
se habían hecho refractarias a la estimulación por TCR por el uso
de inhibidores de la tirosina quinasa o que son deficientes en
CD45 o p56^{Lck}.
Sin embargo, en el presente estudio, los autores
de la invención han mostrado que no se restaura la función normal
de las células T pretratadas con la CCS cuando se tratan con PMA
más ionóforo. Por lo tanto, se cree que el efecto inhibidor de la
CCS en ERK-2 no es mediada por los efectos en CD45
o CD4 en las células T. Posiblemente la CCS afecta una molécula de
superficie todavía no identificada, que a su vez afecta a la ruta
de la quinasa MAP. Por lo tanto, se cree que el efecto inhibidor de
la CCS en la producción de citoquinas no es mediado por su efecto
en CD45 y CD4 en las células T. El efecto inhibidor de la CCS en la
transducción de señales por las células T no era debido a la
toxicidad del compuesto, puesto que la CCS no afectaba a la
viabilidad de los esplenocitos o células GA15. La viabilidad de las
células no era afectada de forma significativa por el cultivo en
presencia de CCS durante periodos de tiempo mayores de 48
horas.
Puesto que se ha mostrado que la fracción de CCS
de la bromelaína bruta bloquea la activación de la ruta de la
quinasa MAP y bloquea la activación de las células T, la CCS puede
ser útil en el tratamiento de enfermedades mediadas por células
T.
Además de su importancia para la producción de
IL-2 y activación de las células T, la ruta de la
quinasa MAP también es importante para la producción de factores de
crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF),
el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF) y el factor
de crecimiento de tipo insulina (IGF). Por lo tanto, la CCS
bloqueará la producción de estos y otros factores de crecimiento y
la producción de otras citoquinas tales como IL-4,
IFN-\gamma, GM-GSF y muchos
otros.
Además, como se ha mencionado antes brevemente,
es posible que la CCS se pueda usar en el tratamiento del
cáncer.
Por lo tanto, la CCS se puede usar en un
procedimiento para el tratamiento o prevención de enfermedades o
afecciones mediadas por:
i. activación de células T;
ii. activación de la ruta de la quinasa MAP;
o
iii. la producción de factores de crecimiento o
citoquinas;
o en el tratamiento o prevención del cáncer.
En otro análisis de la fracción de CCS de la
bromelaína, los autores de la presente invención han encontrado que
comprende más de un componente. La secuenciación de las proteínas
en la fracción mostró que consiste en las cisteína proteasas
ananaína y comosaína junto con otros componentes diferentes.
Por lo tanto, parece que tanto la ananaína como
la comosaína o una mezcla de ambas pueden ser responsables de la
actividad de la fracción de CCS de la bromelaína.
En un primer aspecto de la invención, se
proporciona el uso de ananaína o una mezcla de ananaína y comosaína
para la fabricación de un medicamento para usar como un
inmunosupresor.
Se puede usar la ananaína o una mezcla de
ananaína y comosaína para preparar un agente para el tratamiento o
prevención de enfermedades o afecciones mediadas por:
i. activación de células T;
ii. activación de la ruta de la quinasa MAP;
o
iii. la producción de factores de crecimiento o
citoquinas;
o en el tratamiento o prevención del cáncer.
En la solicitud anterior de los autores de la
invención WO-A-9600082 se discute la
inhibición de la cascada de la quinasa MAP por la bromelaína bruta.
Sin embargo, en ese momento, no se pudo determinar que componente
de la mezcla de bromelaína bruta era responsable de esta actividad,
aunque se especuló que podía ser la proteasa de la bromelaína del
tallo. Ahora se ha descubierto que además de bloquear las rutas de
nucleótidos cíclicas, la proteasa de la bromelaína del tallo tiene
alguna actividad contra la ruta de la quinasa MAP. Sin embargo, es
mucho menos eficaz en el bloqueo de la ruta de la quinasa MAP que
la fracción de CCS de la bromelaína. Realmente, ahora se ha
encontrado que la fracción de CCS de la bromelaína está en la
región de diez órdenes de magnitud más activa que la proteasa de la
bromelaína del tallo en el bloqueo de la activación de la quinasa
MAP.
La activación de la ruta de la quinasa MAP en
las células T para producir IL-2 y llevar a la
expansión clonal de las células T es un componente esencial en la
respuesta inmunitaria. La ausencia de este proceso puede tener
consecuencias mortales, como puede observarse en gente con SIDA o
mutaciones genéticas que dan como resultado defectos en las células
T. Sin embargo, la activación de las células T también puede llevar
a consecuencias perjudiciales. Por ejemplo, si se activan las
células T autorreactivas, pueden resultar enfermedades autoinmunes.
Por lo tanto, es posible que la ananaína o una mezcla de ananaína y
comosaína se puedan usar en el tratamiento de enfermedades
autoinmunes tales como la artritis reumatoide, diabetes mellitus de
tipo 1, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn y lupus.
Además, la activación de las células T
específica para tejidos injertados puede conducir al rechazo del
injerto o transplante, y por lo tanto la ananaína o una mezcla de
ananaína y comosaína también se pueden usar para prevenir esto.
La activación de las células T específicas de
alergeno también puede producir reacciones alérgicas. Se liberan de
las células citoquinas inflamatorias y otros productos celulares,
tales como la histamina, después de la exposición a alergenos. La
liberación de histamina y de citoquinas inflamatorias implica la
ruta de la quinasa MAP y por lo tanto el bloqueo de la ruta de la
quinasa MAP con ananaína o una mezcla de ananaína y comosaína es
posible que sea eficaz en el tratamiento de alergias.
Además, es posible usar la ananaína o una mezcla
de ananaína y comosaína, en la prevención del choque tóxico y
otras enfermedades mediadas por la sobreproducción de endotoxinas
bacterianas. El choque tóxico es mediado por la producción de
lipopolisacáridos (LPS) de las bacterias Gram negativas. Los LPS
desencadenan la producción de TNF-a e
interleuquina-1 por activación de la ruta de la
quinasa MAP en macrófagos. La secreción de estas citoquinas provoca
una cascada de producción de citoquinas de otras células del
sistema inmunitario (incluyendo células T), lo cual conduce a
leucocitosis, choque, coagulación intravascular y muerte.
Otro uso de la ananaína o una mezcla de ananaína
y comosaína, es la prevención de la muerte celular programada
(apoptosis). Este es un suceso especial por el que las células son
estimuladas a destruir su propio ADN y morir. Es un suceso esencial
en la mayoría de las respuestas inmunitarias (para prevenir la
acumulación de demasiadas células), pero también puede tener
consecuencias inmunosupresoras en algunos casos, tal como en la
infección por el VIH y en el envejecimiento, de modo que mueren
demasiadas células y no quedan suficientes para combatir la
infección (Perandones y col., 1993, J. Immunol., 151,
3521-3529). Debido a que el inicio de la apoptosis
depende de sucesos de señalización celular específicos, que
incluyen la activación de la ruta de la quinasa MAP, es posible que
la ananaína o una mezcla de ananaína y comosaína, sean eficaces en
el bloqueo de la apoptosis.
La activación continuada de células T durante la
enfermedad crónica también puede conducir a consecuencias
patológicas, como puede encontrarse en determinadas infecciones
crónicas de parásitos, tales como enfermedades de granulomas
crónicos tales como la lepra tuberculoide, esquistosomiasis y
leishmaniasis visceral.
Además, la invasión de parásitos y patógenos, y
su posterior supervivencia en las células, depende de que estos
organismos usen las rutas de señalización celulares del huésped
(Bliska y col., 1993, Cell, 73, 903-920). Por
ejemplo, se ha demostrado que la Salmonella fosforila la
quinasa MAP, lo cual permite que los macrófagos cojan las bacterias
por endocitosis (Galan y col., 1992, Nature, 357,
588-589). Después las bacterias proliferan y
destruyen la célula. Puesto que se ha mostrado que la ananaína o una
mezcla de ananaína y comosaína modifican las rutas de señalización
del huésped, y en particular inhiben la quinasa MAP, otra de sus
potenciales aplicaciones podría ser inhibir la invasión por
parásitos y patógenos y su supervivencia en células.
La ananaína o una mezcla de ananaína y comosaína
también se pueden usar para el tratamiento del cáncer, y realmente
se ha mostrado que la CCS puede bloquear el crecimiento de tumores
humanos in vitro. El mecanismo antitumoral de la acción de
la CCS sigue sin estar determinado, pero parece probable que sea un
resultado del bloqueo de la activación de la ruta de
ERK-2.
Como se ha mencionado antes, la activación de la
MAP quinasa depende de p21^{Ras} y Raf-1, que son
oncogenes importantes. Las proteínas de p21^{Ras} y
Raf-1 ayudan a transmitir señales de los receptores
de factores de crecimiento en la superficie de las células a las
quinasas MAP para estimular la proliferación o diferenciación
celulares. Los genes oncogénicos (o mutantes) p21^{Ras} y
Raf-1 producen proteínas defectuosas que han
adquirido independencia de los factores de crecimiento
suministrados externamente y, al mismo tiempo ya no pueden
responder a señales externas inhibidoras del crecimiento. Por lo
tanto, las proteínas mutantes de p21^{Ras} y
Raf-1 son persistentemente hiperactivas y su
actividad catalítica desenfrenada tiene un efecto perjudicial en el
control del crecimiento celular. Por lo tanto, los genes
oncogénicos p21^{Ras} y Raf-1 promueven el cáncer
y la formación de tumor mediante la alteración de los controles
normales de la proliferación y diferenciación celulares.
Aproximadamente 30% de los cánceres humanos tienen mutaciones en un
gen p21^{Ras}.
Dado que las señales transmitidas por
p21^{Ras} y Raf-1 se pueden bloquear a través de
la quinasa MAP, se espera que la ananaína o una mezcla de ananaína
y comosaína bloqueen el crecimiento del cáncer y tumores. La
fracción de proteínas de la presente invención será útil, por lo
tanto, para el tratamiento de muchos tipos diferentes de cáncer
incluyendo cánceres sólidos tales como cáncer de ovario, colon,
pecho o pulmón y melanoma, así como tumores no sólidos y
leucemia.
Normalmente la fracción de bromelaína se
formulará antes de la administración a pacientes, y por lo tanto en
otro aspecto de la invención se proporciona una composición
farmacéutica o veterinaria que comprende la ananaína o una mezcla
de ananaína y comosaína, junto con un excipiente aceptable en
farmacia o veterinaria.
La ananaína o una mezcla de ananaína y comosaína
se pueden administrar por una variedad de rutas que incluyen la
administración entérica, por ejemplo oral, nasal, bucal, tópica o
anal, o administración parenteral, por ejemplo por vías
intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal.
En muchos casos, puede preferirse la vía oral ya
que a menudo esta es la vía que los pacientes encuentran la más
aceptable. La vía oral puede ser particularmente útil si se
requieren muchas dosis de la proteína.
Cuando se elige la administración oral, puede
ser conveniente formular la ananaína o una mezcla de ananaína y
comosaína en una preparación con recubrimiento entérico con el fin
de ayudar a su supervivencia a través del estómago.
Alternativamente, se puede usar otra forma de dosificación de
administración oral, por ejemplo un jarabe, elixir o una cápsula de
gelatina dura o blanda, cualquiera de las cuales puede tener
recubrimiento enté-
rico.
rico.
Sin embargo, en determinadas circunstancias
puede ser más conveniente usar una vía parenteral. Para la
administración parenteral, la proteína se puede formular en agua
destilada u otro disolvente o agente de suspensión
farmacéuticamente aceptable.
La dosis adecuada de la ananaína o una mezcla de
ananaína y comosaína para administrar a un paciente la puede
determinar el médico. Sin embargo, como guía, una dosis adecuada
puede ser de aproximadamente 0,5 a 20 mg por kg de peso corporal. Se
espera que en la mayoría de los casos, la dosis sea de
aproximadamente 1 a 15 mg por kg de peso corporal y preferiblemente
de 1 a 10 mg por kg de peso corporal. Por lo tanto, para un hombre
que pesa aproximadamente 70 kg, una dosis típica sería de
aproximadamente 70 a 700 mg.
Ahora la invención se describirá con más detalle
con referencia a los siguientes ejemplos y a los dibujos en los
que:
la fig. 1 es una representación en diagrama de
los sucesos de transducción de señales asociados con la activación
de células T que conduce a la producción de
IL-2.
la fig. 2 es un perfil de elución ultravioleta
de la bromelaína bruta después de la cromatografía de intercambio
de cationes en medio de alto rendimiento de sefarosa SP.
la fig. 3 es una gráfica que muestra la
actividad proteolítica y el contenido de proteína de las
fracciones de bromelaína brutas, después de la cromatografía de
intercambio catiónico en medio de alto rendimiento de sefarosa
SP;
la fig. 4 es una SDS-PAGE de las
fracciones combinadas de la cromatografía de alto rendimiento en
sefarosa SP llevada a cabo en geles de gradiente de T
4-20%, en la que las calles 1 a 4 y 6 a 9 contienen
las proteínas CCT, CCV, CCX y CCZ y CCY, CCW, CCU y CCS
respectivamente y las calles 5 y 10 contienen los marcadores de
peso molecular.
la fig. 5 muestra el enfoque isoeléctrico de las
fracciones combinadas llevado a cabo en geles de gradiente de pH
3-11, en el que las calles 1, 11 y 12 muestran los
marcadores de IEF alto, y las calles 2 y 13 muestran la bromelaína
bruta y las calles 3 a 10 muestran las proteínas CCT, CCV, CCX,
CCZ, CCY, CCW, CCU y CCS, respectivamente.
la fig. 6 es una transferencia Western que usa
mAb antifosfotirosina que demuestra que la CCS reduce la
fosforilación de tirosina de la proteína p42 kDa
(ERK-2). Se trataron células Th0 con fracciones de
bromelaína (50 \mug/ml) durante 30 min, se lavaron y después se
estimularon con PMA (20 ng/ml) y ionóforo (1 \muM) combinados
durante 5 min. Las células no estimuladas sirvieron como controles.
Las células después se lisaron y los líquidos sobrenadantes
postnucleares se sometieron a SDS-PAGE y
transferencia Western. En esta figura los símbolos negros indican
proteínas fosforiladas por PMA más ionóforo combinados. Los
símbolos en blanco indican proteína ERK-2 reducida
por el tratamiento con CCS.
la fig. 7 es una transferencia Western que usa
mAB antifosfotirosina que demuestra que CCS aumenta la
fosforilación de tirosina de los sustratos proteicos. Se trataron
células Th0 con CCS, bromelaína bruta (Brom.), proteasa de
bromelaína del tallo (SBP) o fracción de CCT (50 \mug/ml) durante
30 min, se lavaron y después se estimularon con PMA (20 ng/ml) y
ionóforo (1 \muM) combinados durante 5 min. Las células no
estimuladas sirvieron como controles (Cont.). Después las células
se lisaron y los líquidos sobrenadantes postnucleares se
sometieron a SDS-PAGE y transferencia Western. En
esta figura los símbolos negros indican proteínas fosforiladas por
CCS pero no por otros tratamientos. Los símbolos en blanco indican
proteína fosfoproteínas reducidas por CCS y tratamiento con
bromelaína bruta.
la fig. 8 es una transferencia Western que usa
mAb antifosfotirosina que muestra que el efecto inhibidor de CCS
en ERK-2 depende de su actividad proteolítica y
ocurre de una forma dependiente de la dosis. Se trataron células
Th0 con CCS (0 a 25 \mug/ml) o CCS incubada con el inhibidor de
proteasa seleccionado, E-64, durante 30 min.
Después, las células se lavaron y después se estimularon con PMA
(20 ng/ml) y ionóforo (1 mM) combinados durante 5 min. Después las
células se lisaron y los líquidos sobrenadantes postnucleares se
sometieron a SDS-PAGE y transferencia Western. En
esta figura los símbolos negros indican proteínas fosforiladas por
CCS. Los símbolos en blanco indican fosfoproteína
ERK-2 inhibida por CCS activa pero no por CCS
inactivada.
\global\parskip0.900000\baselineskip
la fig. 9 es una inmunotransferencia que
confirma que la fosfoproteína de 42 kDa inhibida por la CCS es
ERK-2. Se trataron células Th0 con CCS (50
\mug/ml) durante 30 min, o no se trataron, se lavaron y después se
estimularon con PMA (20 ng/ml) y ionóforo (1 \muM) combinados
durante 5 min. Los lisatos celulares se inmunotransfirieron con mAb
anti-ERK-2.
la fig. 10 es una transferencia Western que usa
mAb anti-fosfotirosina que muestra que el mAB
anti-CD3\varepsilon cruzado induce la
fosforilación de tirosina de múltiples proteínas. Las células Th0
se estimularon con anti-CD3\varepsilon cruzado
durante 0 a 20 min. Después las células se lisaron y los líquidos
sobrenadantes postnucleares se sometieron a
SDS-PAGE y transferencia Western. Los símbolos
negros indican proteínas con tirosina fosforilada inducida
\hbox{por mAb anti-CD3 \varepsilon .}
la fig. 11 es una transferencia Western que usa
mAb anti-fosfotirosina que demuestra que la CCS
inhibe la fosforilación de tirosina en células T estimuladas por
TCR. Se trataron células Th0 con CCS (0 a 5 \mug/ml) durante 30
min, se lavaron y después se trataron con mAb
anti-CD3\varepsilon cruzado durante 5 min. Después
las células se lisaron y los líquidos sobrenadantes postnucleares
se sometieron a SDS-PAGE y transferencia Western.
En esta figura, los símbolos indican la fosforilación de tirosina
de ERK-2 inducida por mAb
anti-CD3\varepsilon, que es reducida por la
CCS.
la fig. 12 es una transferencia Western que usa
mAb anti-Raf-1 que muestra que la
CCS inhibe el cambio de movilidad de Raf-1. Se
trataron células Th0 con CCS (0 a 50 \mug/ml) durante 30 min, se
lavaron y después se estimularon con (A) PMA más ionóforo
combinados o (B) después mAb anti-CD3\varepsilon
cruzado durante 5 min. Después las células se lisaron y los
líquidos sobrenadantes postnucleares se sometieron a
SDS-PAGE y transferencia Western.
la fig. 13 son un par de gráficas que muestran
que la CCS disminuye la producción de IL-2 y la
proliferación en células T CD4^{+} purificadas. Las células T se
trataron con CCS (50 \mug/ml), se lavaron y después se cultivaron
en medio solo o con mAb anti-CD3\varepsilon
inmovilizado y mAb anti-CD28 soluble. (A) La
producción de IL-2 se determinó por ensayo de
CTL-L como se describe en el ejemplo 5. (B) La
proliferación se determinó por la incorporación
^{3}H-timidina. Las células T CD4^{+} cultivadas
en ausencia de mAb (estímulo) no produjeron IL-2
detectable y no proliferaron.
la fig. 14 son un par de gráficas que muestran
que la CCS disminuye la producción de I1-2 por los
esplenocitos pero no inhibe la proliferación de esplenocitos. Los
esplenocitos se trataron con CCS (50 \mug/ml), se lavaron y
después se cultivaron en medio solo o con mAb
anti-CD3\varepsilon inmovilizado. (A) La
producción de I1-2 se determinó por el ensayo de
CTL-L como se describe en el ejemplo 5. (B) La
proliferación se determinó por la incorporación de
^{3}H-timidina. Los esplenocitos cultivados en
ausencia de mAb (estímulo) no produjeron IL-2
detectable y no proliferaron.
la fig. 15 es una gráfica que muestra que la CCS
inhibe el crecimiento de células tumorales in vitro. Se
trataron líneas de células de cáncer con CCS (50, 10, 2,5, 1 y 0,25
\mug/ml) o agua como control. Después de 96 h de tratamiento, se
evaluó el efecto de la CCS en el crecimiento de las células
tumorales. Las columnas representan las concentraciones
inhibidoras de 50% (CI_{50} \mug/ml) de CCS (la cantidad de CCS
necesaria para inhibir 50% del crecimiento de las células
tumorales).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Reactivos La bromelaína (E.0 3.4.22.4;
actividad proteolítica, 1,541 nmol/min/mg) se obtuvo de Solvay Inc.
(Alemania). La sefarosa S de flujo rápido, Pharmalyte
3-10^{TM}, Ampholine 9-11^{TM},
Ready Mix IEF^{TM} (acrilamida, bisacrilamida) y marcadores IEFTM
se obtuvieron de Pharmacia Biotech. Los geles de acrilamida
premoldeados al 4-20% y los marcadores de peso
molecular de amplio intervalo se obtuvieron en
Bio-Rad Laboratories. Todos los demás reactivos
eran de calidad analítica y se obtuvieron de Sigma Chemical Co. o
de British Drug House.
La actividad proteolítica de la bromelaína se
determinó usando un ensayo basado en placa de microvaloración
interna usando el sustrato sintético
Z-Arg-Arg-pNA. Este
ensayo se basó en el descrito por Filippova y col. en Anal.
Biochem., 143, 293-297 (1984). El
sustrato era
Z-Arg-Arg-pNA como
describen Napper y col. en Biochem. J., 301,
727-735, (1994).
La proteína se midió usando un kit suministrado
por Bio-Rad que es un procedimiento modificado del
de Lowry y col. (J. Biol. Chem. (1951) 193,
265-275). Las muestras se compararon con patrones
de albúmina de suero bovino (0 a 1,5 mg/ml) preparados en solución
salina al 0,9% o en tampón de acetato 20 mM pH 5,0, según sea
adecuado.
Todos los pasos siguientes se llevaron a cabo a
temperatura ambiente (20 a 25ºC). Se preparó una solución de
bromelaína (30 mg/ml) disolviendo 450 mg de polvo en 15 ml de
tampón de acetato 20 mM (pH 5,0) que contenía EDTA de sodio 0,1 mM.
La solución se dispensó en tubos de microcentrífuga 10 x 1,5 ml, y
se centrifugaron a 13.000 x g durante 10 minutos para separar el
material insoluble. Los líquidos sobrenadantes transparentes se
combinaron y se usaron para la cromatografía.
Se preparó una columna de flujo rápido de
S-sefarosa empaquetando 25 ml de medio en una
columna XK 16/20^{TM} (Pharmacia Biotech) y se equilibró con
tampón de acetato 20 mM (pH 5,0) que contenía EDTA 0,1 mM en un
sistema FPLC^{TM} a 3 ml/min. Se inyectaron 5 ml de solución de
bromelaína en la columna. Se recogió la proteína no unida y la
columna se lavó con 100 ml de tampón de acetato. La proteína unida
a la columna se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,8 M
en tampón de acetato, con 300 ml. Se recogieron fracciones de 5 ml
a lo largo del gradiente y la figura 2 muestra un cromatograma de
UV típico de la bromelaína bruta obtenida de este
procedimiento.
Después, se analizaron en las fracciones la
proteína y la actividad proteolítica como se ha descrito antes y la
figura 3 muestra la actividad proteolítica contra el péptido
sintético
Z-Arg-Arg-pNA y el
contenido de proteína de las fracciones individuales. El perfil de
contenido de proteína refleja el del UV, como era de esperar, pero
la actividad proteolítica principal está confinada a los dos picos
principales que corresponden a los de la proteasa de la bromelaína
(SEP). Se observan actividades pequeñas en otras zonas del
cromatograma que pueden corresponder a otras proteasas distintas de
la SBP, tal como la última fracción de CCS que eluye, que contiene
ananaína y comosaína.
Se combinaron los picos principales
identificados del perfil UV de tres experimentos sucesivos y se
nombraron como se indica en la Tabla 1. Las fracciones combinadas
se usaron para la caracterización fisicoquímica. Las fracciones
combinadas se concentraron por ultrafiltración y se intercambiaron
con tampón usando columnas PD10 en solución salina isotónica (NaCl
al 0,9% en peso/vol). El contenido de proteína y la actividad de
Z-Arg-Arg-pNA se
calcularon antes de los ensayos biológicos y se muestran en la
Tabla 2.
Las fracciones combinadas se procesaron para el
análisis como se describe a continuación.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se determinaron la actividad proteolítica y el
contenido de proteína de las fracciones combinadas y las
concentraciones se ajustaron a aproximadamente 1,4 mg/ml de
proteína o 105 mmoles/min/ml de actividad de proteinasa usando una
celda agitada Filtron^{TM} que contenía una membrana de
ultrafiltración con corte de exclusión de peso molecular nominal de
10 kDa. Después las fracciones se intercambiaron con tampón usando
columnas PD10^{TM} (Pharmacia Biotech) en solución salina
isotónica (NaCl al 0,9% en peso/vol), se esterilizaron por
filtración (0,2 \mum) y se ajustaron para el contenido de
proteína o la actividad proteolítica. Después las muestras se
congelaron a -80ºC y se usaron en los estudios in vitro
descritos a continuación.
Las muestras combinadas de FPLC^{TM} se
analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en geles de
gradiente de T 4 a 20% premoldeado. Las muestras se prepararon para
la electroforesis por precipitación con ácido, en la que se
mezclaron 100 \mul con un volumen igual de ácido tricloroacético
(TCA) al 20% en peso/vol). La proteína precipitada se recogió por
centrifugación a 13.000 x g durante 10 min y se descartó el líquido
sobrenadante. El sedimento se lavó dos veces con 0,5 ml de éter
dietílico y se dejó secar al aire a temperatura ambiente. Después
los sedimentos se disolvieron en 300 \mul de tampón de muestra de
SDS-PAGE (Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8
que contenía glicerol al 10% en vol/vol, dodecilsulfato de sodio al
2% en p/vol y ditiotreitol 40 mM) y se calentó a 95ºC en un baño de
agua.
Los patrones de peso molecular de amplio
intervalo de SDS-PAGE diluidos 1:20 en tampón de
muestra de SDS-PAGE se trataron de forma similar y
se hicieron correr con las muestras. Los geles se hicieron correr
en un sistema de electroforesis mini Protean II^{TM} de acuerdo
con el protocolo de Bio-Rad a 240 V y hasta que el
frente de colorante alcanzaba el extremo del gel (30 a 45 min).
Después de la electroforesis, las proteínas
separadas se tiñeron toda la noche con mezcla orbital en una
solución de azul brillante coloidal G-250 al 0,075%
en peso/vol que contenía ácido fosfórico al 1,5% en vol/vol,
sulfato amónico al 11,25% en p/vol y metanol al 25% en vol/vol. Los
geles se destiñeron para obtener un fondo transparente, en una
solución de metanol al 25% en vol/vol y ácido acético al 10% en
vol/vol.
La pureza de las fracciones se muestra por
SDS-PAGE en la figura 4. Todas las fracciones
combinadas excepto la que fluye a través de la columna (CCT)
mostraron que la proteína principal presente tenía un peso
molecular aproximadamente entre 25-28 kDa. Esto
corresponde al peso molecular de las cisteína proteinasas aisladas
de la bromelaína por otros autores (Rowan y col., Methods in
Enzymology, (1994), 244, 555-568). La pureza de
las fracciones CCX, CCZ, CCY y CCW parece que es alta. Se pueden
observar componentes minoritarios de peso molecular menor en
algunas fracciones, en particular en las CCT, CCV, CCX y CCS. Las
fracciones combinadas CCU y CCS contienen un doblete entre
25-28 kDa; las cargas de gel más altas de las
fracciones CCX, CCZ, CCY y CCW significan que también pueden
encontrarse bandas dobles en estas fracciones. En la tabla 3 se
muestra un resumen de los componentes y sus pesos moleculares
calculados en las fracciones combinadas, determinados por
SDS-PAGE.
Las proteínas en las fracciones combinadas CCX,
CCZ, CCY+CCW y CCU se transfirieron sobre nitrocelulosa después de
SDS-PAGE por transferencia Western y se trataron con
sondas de antisuero de conejo contra proteasa de bromelaína del
tallo (SBP) purificada (no se muestran los resultados). Todas las
bandas de proteínas en estas fracciones combinadas fueron
reconocidas por anticuerpos en los sueros, lo que indicaba
proteínas inmunológicamente similares, probablemente pertenecientes
a la familia de enzimas de las cisteína proteinasas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones combinadas (0,5 a 1,0 mg/ml) se
diluyeron 1:3 con agua desionizada y se hicieron correr en geles de
gradiente de pH 3 a 11. Los geles se moldearon usando Ready Mix
IEF^{TM} para producir un gel de poliacrilamida de T 5,5% y C 3%,
que contenía glicerol al 10% en vol/vol, Pharmalyte
3-10^{TM} al 5,0% y Ampholine
9-11^{TM} al 2,5%. Brevemente, se cargaron 10
\mul de muestra y marcadores de pI alto en los geles después del
preenfoque a 700 V. La entrada de muestra era a 500 V durante 10
min, el enfoque era a 2500 V durante 1,5 horas y el estrechamiento
de banda a 3000 V durante 10 min. Después de la electroforesis las
proteínas se fijaron con una solución de TCA al 20% en p/vol
durante 30 min, se lavaron para desteñido durante 30 min para
eliminar el TCA y se tiñeron con azul brillante
G-250 como se ha descrito para la
SDS-PAGE (véase antes).
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 5 muestra que todas las fracciones
excepto la CCX contenían proteínas básicas con enfoque más allá del
marcador de pI 9,3. Las interacciones de carga localizadas con los
grupos funcionales del medio cromatográfico pueden explicar porque
las proteínas de pI 3,8 y 3,85 en CCX, se adsorbían en una resina
de intercambio catiónico a pH 5,0. La CCZ estaba presente como una
sola banda de pI 9,7, mientras que las fracciones combinadas CCY,
CCW y CCU contenían múltiples bandas de puntos isoeléctricos en el
intervalo de pH 9,5-9,8. Al menos parte de esta
heterogenicidad se puede explicar por la variación de los restos de
carbohidratos de una cadena principal común de la proteína de la
bromelaína del tallo. Los valores están de acuerdo con los
descritos en la bibliografía de pI 9,45-9,55 para
la bromelaína (Rowan y col., Methods in Enzymology, (1994),
244, 555-568). Las fracciones combinadas de
CCS contenían dos proteínas básicas de pI mayor que 10,25.
Calculados por extrapolación dan pI de 10,4 y 10,45. Estas
corresponden a la ananaína y comosaína y están de acuerdo con otros
cálculos (Rowan y col., véase antes) de pI mayores que 10. Los pI
de las proteínas en cada una de las fracciones combinadas se
resumen en la tabla 4.
Ejemplo
2
En un experimento separado, se hicieron correr
las fracciones combinadas de la bromelaína por
SDS-PAGE y se transfirieron como antes sobre una
membrana de PVDF. La membrana se tiñó con azul coomassie
R-250 al 0,025% en p/vol, se disolvieron en metanol
al 40% en vol/vol durante 10 min, seguido de desteñido en metanol
al 50% en vol/vol. La membrana se secó al aire a temperatura
ambiente y se llevó a cabo la secuenciación de los aminoácidos
NH_{2}-terminales de las proteínas teñidas.
Brevemente, se cortó la banda de proteína de la membrana y se puso
en el cartucho superior del secuenciador. El análisis de los
aminoácidos NH_{2}-terminales de los componentes
de la bromelaína se determinó por degradación de Edman usando un
secuenciador de fase gaseosa (Applied Biosystems) equipado con un
analizador de feniltiohidantoína-aminoácido en
línea. La Tabla 5 muestra los primeros 21 aminoácidos
NH_{2}-terminales de CCZ, CCX, proteasa de
bromelaína del tallo, ananaína y comosaína.
Todas las proteínas comparten homología de
secuencia. La ananaína y comosaína difieren en 2 de 20 aminoácidos
cuando se comparan con la proteasa de la bromelaína del tallo. CCZ
difiere en 8 de 21 aminoácidos cuando se comparan con la proteasa
de la bromelaína del tallo. CCZ difiere de la ananaína y comosaína
en 6 de los 20 aminoácidos. La comosaína difiere en 2 aminoácidos
de la ananaína. Aunque está claro que estas proteínas están
estructuralmente relacionadas, son todas distintas y muestran
divergencia entre ellas. Estas proteinasas también difieren en su
especificidad por el sustrato de proteinasa y su actividad
biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Anticuerpos. Los mAb
anti-CD3 cadena \varepsilon
(145-2C11) y los mAb anti-CD28
(PV-1) se adquirieron en Pharmingen (San Diego, CA)
y el Ab IgG anti-hámster de cabra en Sigma (Dorset,
Reino Unido). Los mAb anti-fosfotirosina de ratón
(4G10), mAB anti-MAPk R2 de ratón
(ERK-2) y mAb
anti-Raf-1 de ratón eran de UBI
(Lake Placid, NY). Los Ab IgG anti-conejo de cabra
y anti-ratón de cabra conjugados con peroxidasa de
rábano picante (HRP) eran de BioRad (Hemel Hemstead, Hertfordshire,
Reino Unido). La IgG MAPk fosfoespecífica policlonal de conejo que
reconoce las MAPk p44 y p42 con tirosina fosforilada eran de New
England BioLabs (Hitchin, Hertfordshire, Reino Unido).
Reactivos. El
12-miristato 13-acetato de forbol
(PMA) y el ionóforo de calcio A23187 se adquirieron en Sigma. La
bromelaína (E.0 3.4.22.4; actividad proteolítica, 1,541
nmol/min/mg) se obtuvo en Solvay Inc. (Alemania).
E-64
(L-trans-epoxisuccinil-leucilamido-(4-guanidino)butano,
un inhibidor de cisteína proteasa selectivo era de Sigma.
Células. El hibridoma de células T GA15
fue un regalo generoso de B. Fox (ImmuLogic Pharmaceutical
Corporation, Boston, MA). GA15 se generó por fusión del timoma
BW5147 con el clon Th2 F4 específico para KLH asociado con
I-A^{b}, y se mantuvieron como se ha descrito
previamente (Fox, 1993, Int. Immunol., 5,
323-330). GA15 presenta un fenotipo de célula
T_{h}0 puesto que producen IL-2,
IL-4 e IFN-\gamma después de
estimulación con el mAb anti-CD3\varepsilon
cruzado (Fox, 1993).
Las células (2 x 10^{7}) suspendidas en RPMI
1640 se trataron con CCS (1 a 50 \mug/ml) diluida en solución
salina (al 0,9% (p/vol)) durante 30 min a 37ºC. Las células
tratadas como control se trataron con un volumen igual de solución
salina (diluyente). Con concentraciones altas de CCS (50 ó 100
\mug/ml) se produjo agregación de células, como se había
observado previamente en estudios con bromelaína bruta. Después del
tratamiento, los agregados de células se dispersaron ligeramente
lavando las células 3 veces y después volviéndolas a suspender en
RPMI de nueva aportación. Las células se estimularon por la
superficie celular con mAb cruzado con el TCR
(anti-CD3\varepsilon), o directamente usando PMA
(20 ng/ml) y ionóforo (1 \muM) combinados durante los tiempos
indicados en las leyendas de las figuras y el texto.
La estimulación por el TCR se llevó a cabo
incubando primero las células T en hielo durante 30 min con mAb
anti-CD3\varepsilon (20 \mug/ml). Después se
separó el exceso de mAb lavando una vez a 4ºC y el mAb
anti-CD3\varepsilon se cruzó con IgG
anti-hámster de cabra (20 \mug/ml) a 37ºC. La
estimulación se terminó por la adición de tampón de lisis enfriado
con hielo (Tris 25 mM, pH 7,4, NaCl 75 mM, EDTA 2 mM, Triton
X-100 al 0,5%, ortovanadato de sodio 2 mM, fluoruro
de sodio 10 mM, pirofosfato de sodio 10 mM, leupeptina 74
\mug/ml, PMSF 749 \muM y aprotinina 74 \mug/ml) durante 30
min con rotación continua a 4ºC. Los lisatos se clarificaron
(14.000 x g durante 10 min) y se añadió un volumen igual de tampón
de muestra de SDS-PAGE 2X (Tris 50 mM, pH 7,
2-ME 700 mM, glicerol al 50% (vol/vol), SDS al 2%
(p/vol), azul de bromofenol al 0,01% (p/vol)) a los líquidos
sobrenadantes postnucleares. Las proteínas se solubilizaron a 100ºC
durante 5 min y se resolvieron por SDS-PAGE las
muestras que contenían 1 x 10^{6} equivalentes de células.
Las proteínas separadas se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad) que después se
bloquearon con albúmina de suero bovino al 5% (p/vol) (Sigma,
fracción V; BSA), Nonidet P-40^{TM} al 0,1% en
solución salina tamponada con Tris (NaCl 170 mM y Tris 50 mM, pH
7,4; TBS). Las inmunotransferencias se incubaron con los
anticuerpos adecuados como se indica en las leyendas de las
figuras. Los anticuerpos primarios se diluyeron en tampón de
dilución de anticuerpo compuesto de BSA al 0,5% (p/vol),
Tween-20 al 0,1% (vol/vol) en TBS a 4ºC durante 2 h
seguido de detección con el anticuerpo secundario adecuado
conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en tampón de
dilución de anticuerpo a 4ºC durante 1 h. Después de cada etapa de
incubación, las membranas se lavaron extensamente con
Tween-20 al 0,1% en TBS. La inmunorreactividad se
determinó usando el sistema de detección de quimioluminiscencia ECL
(Amersham Corp., Arlington Heights, IL).
Se usó un inhibidor específico de la cisteína
proteasa, E-64, para inactivar la actividad
proteolítica de CCS. Se incubó CCS (25 \mug/ml) diluido en
ditiotreitol 3 \muM, E-64 100 \muM, acetato de
sodio 60 mM (pH 5) durante 10 minutos a 30ºC. La CCS inactivada
después se dializó toda la noche en solución salina a 5ºC. Los
estudios anteriores con bromelaína bruta habían mostrado que estas
condiciones eran suficientes para inducir 99,5% de inactivación de
la actividad proteolítica cuando se ensayaba con el sustrato
Z-Arg-Arg-pNA (véase
antes). Las células T se trataron con CCS inactivada con
E-64 (25 \mug/ml) y se compararon con las células
T tratadas con control y no tratadas con CCS estimuladas con PMA
más ionóforo.
Se ha mostrado previamente que la bromelaína
bloquea la fosforilación de tirosina de ERK-2
después de estimulación de las células T con PMA más ionóforo de
calcio combinados (documento
WO-A-96/00082). La estimulación con
éster de forbol y ionóforo de las células T actúa de forma
sinérgica para reproducir muchas características de la estimulación
por TCR tales como la secreción de IL-2, expresión
del receptor de IL-2 y proliferación de células T
(Truneh y col., 1985, Nature, 313, 318-320;
Rayter y col., 1992, EMBO, 11, 4549-4556).
Los ésteres de forbol pueden mimetizar el desencadenamiento de
receptores de antígeno y eludir las proteína tirosina quinasas
inducidas por los TCR para activar ERK-2 mediante
una acción agonista directa en PKC y p21^{Ras}. El ionóforo de
calcio A23187 induce mayor liberación intracelular de Ca^{2+} y
por lo tanto mimetiza la acción de 1,4,5-trifosfato
de inositol (IP_{3}). Sin embargo, los ésteres de forbol y el
ionóforo estimulan las rutas de la PKC que no son controladas por
los TCR (Izquierdo y col., 1992, Mol. Cell. Biol., 12,
3305-3312) lo que sugiere rutas intracelulares
separadas en las células T, que regulan la función de las células
T. Por lo tanto, se investigó que fracción de la bromelaína podía
bloquear la señalización de las células T mediante la ruta
independiente de TCR examinando sus efectos en la fosforilación de
tirosina inducida por PMA y ionóforo.
La estimulación de las células T con ionóforo y
PMA combinados inducía la fosforilación de tirosina de varias
proteínas incluyendo las de alrededor de 100 kda, 85 kda, 42 kda y
38 kda. El tratamiento previo con CCS (50 \mug/ml) reducía la
fosforilación de tirosina de la proteína p42 kda y no inhibía
significativamente la fosforilación de ningún otro sustrato (figura
6). En dos experimentos, la CCS, pero no otra fracción, también
aumento la fosforilación de tirosina de las proteínas de alrededor
de 36 kda, 38 kda, 85 kda, 94 kda y 102 kda (figura 7 y figura
8).
La capacidad de la CCS para bloquear la
fosforilación de tirosina de la fosfoproteína de 42 kda dependía de
la dosis (fig. 8) y dependía de su actividad proteolítica, puesto
que E-64 anulaba completamente el efecto inhibidor
de la CCS en la fosforilación de p42 kda (fig. 8). El tratamiento
con E-64 de las células T no afectaba a la
señalización de las células T inducida por PMA y ionóforo.
Se sospechaba que la fosfoproteína de 42 kda
inhibida por CCS era la MAPk ERK-2, por lo que se
llevó a cabo el análisis de inmunotransferencia con mAb
anti-ERK-2 específico y anticuerpos
anti-fosfo MAPk, que detectan específicamente
ERK-1 y ERK-2 sólo cuando son
activadas catalíticamente por fosforilación en la Tyr204. La
inmunotransferencia de células tratadas con CCS que han sido
estimuladas con PMA más ionóforo, confirmaba que la fosfoproteína
p42 kda era realmente la ERK-2 (fig. 9).
Después se investigó el efecto de la CCS en la
transducción de señales mediada por TCR por evaluación de la
fosforilación de tirosina del sustrato de GA15 estimulada con mAB
anti-CD3\varepsilon cruzado. Las
inmunotransferencias de lisatos de GA15, usando mAb
antifosfotirosina específicos, pusieron de manifiesto mayor
fosforilación de tirosina de múltiples proteínas incluidas las de
alrededor de 120 kda, 100 kda, 85 kda, 76 kda, 70 kda, 42 kda y 40
kda, de acuerdo con las fosfoproteínas observadas en otras líneas
de células T después de la unión con TCR (June y col., 1990, J.
Immunol., 144, 1591-1599 y Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87, 7722-7726, revisado por Cantrell,
1996, Annu. Rev. Immunol., 14, 259-274) (fig.
10). Las proteínas fosforiladas en la tirosina se detectaron
fácilmente entre 2 y 5 min después de la estimulación y
permanecieron fosforiladas durante al menos 10 min (fig. 10). Las
células GA15 estimuladas con mAb anti-CD3 solo o Ab
cruzado, no inducían la fosforilación de tirosina de ningún
sustrato celular (no se muestran los datos). Otra vez, el
tratamiento previo con CCS de GA15 durante 30 min produjo una
reducción de la fosforilación de tirosina de proteínas de
ERK-2 inducida por TCR de una forma dependiente de
la dosis (fig. 11). La CCS no afectó de forma notable la
fosforilación de tirosina de otras fosfoproteínas inducidas por
TCR, lo que sugería que la CCS tiene un modo de acción
selectivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Raf-1 es un activador
inmediatamente corriente arriba de MEK-1 que activa
ERK-2. La activación de Raf-1
requiere la fosforilación en los restos de serina y treonina
específicos (Avruch y col., 1994, TIBS, 19,
279-283). Para investigar si la CCS afecta a
cualquier otro sustrato corriente arriba de ERK-2
en la cascada de la MAP quinasa, se investigó el efecto de la CCS
en Raf-1. Se trataron células T con CCS (0 a 50
\mug/ml) y después se estimularon con mAb
anti-CD3\varepsilon o PMA más ionóforo combinados
como se ha descrito antes. Los resultados muestran que la CCS
bloquea el cambio de movilidad de Raf-1, lo que
indica que bloquea su fosforilación de proteína y por lo tanto la
activación. Estos datos confirman que CCS tiene un efecto en la
cascada de la MAP quinasa (fig. 12) y que el efecto de CCS puede no
ser directamente en ERK-2, si no en sustratos
corriente arriba en la cascada de MAPk.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Células. Se aislaron esplenocitos de
ratones BALB/c hembra (6-8 semanas de edad) como se
ha descrito previamente en el documento
WO-A-96/00082. Se aislaron células T
CD4^{+} altamente purificadas de los esplenocitos usando la
separación de células activadas por magnetismo (MACS).
Las células T diluidas en RPMI se trataron con
CCS (50 \mug/ml) o solución salina a 37ºC durante 30 min, se
lavaron con RPMI de nueva aportación, y después se volvieron a
suspender en medio de cultivo. Las células T se estimularon para
producir RNAm de citoquina por
anti-CD3\varepsilon inmovilizado (4 \mug/ml) y
anti-CD28 soluble (10 \mug/ml). Los mAb
anti-CD3\varepsilon diluidos en PBS se
inmovilizaron en placas de microcultivo, de fondo plano, de 24
pocillos (Corning, Corning, NY) por incubación durante 16 h a 4ºC.
Después los pocillos se lavaron tres veces en PBS antes de añadir
los cultivos triplicados de esplenocitos o células T CD4^{+}
purificadas (2,5 - 5 x 10^{6} células por pocillo) que se
incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% húmedo durante 24 h. Se midieron
los niveles de Il-2 en el líquido sobrenadante del
cultivo usando el bioensayo CTL-L (Gillis y col.,
1978, J. Immunol., 120, 2027-2032).
Se trataron células T con CCS (50 \mug/ml)
durante 30 min, se lavaron en RPMI y después se estimularon con mAb
anti-CD3\varepsilon inmovilizado solo o mAb
anti-CD3\varepsilon más mAb
anti-CD28 combinados. Después las células se
cultivaron en placas de fondo plano de 96 pocillos (Nunc) con
10^{5} células por pocillo durante 36 h. Los cultivos se pulsaron
con [^{3}H]TdR 0,5 \muCi, 12 h antes de recogerlos en
filtros de fibra de vidrio.
La activación de p21^{Ras},
Raf-1, MEK-1 y ERK es esencial para
la inducción de la transcripción de IL-2 en células
T (Izquierdo y col., 1993, J. Exp. Med., 178, 1199).
La IL-2 es el factor de crecimiento de células T
autocrino principal que induce la proliferación de células T. Por
lo tanto se podía esperar que el defecto en la activación de ERK
demostrado aquí, inhibiera la producción de IL-2 y
la proliferación de células T. Por lo tanto, se investigó si CCS
podía tener un resultado funcional en la señalización de células T,
en concreto en la producción de IL-2 y la
proliferación en esplenocitos murinos y células T CD4^{+}
altamente purificadas. El tratamiento con CCS (50 \mug/ml) de
células T CD4^{+} purificadas redujo tanto la producción de
IL-2 como la proliferación cuando la ruta de la ERK
era estimulada con mAb anti-CD3\varepsilon (fig.
13a y 13b). CCS también bloqueaba la producción de
IL-2 por los esplenocitos, sin embargo no afectaba
a la proliferación de esplenocitos (fig. 14a y 14b), lo que sugería
que un componente en CCS todavía no identificado estaba actuando en
las poblaciones de células accesorias en los cultivos de
esplenocitos, tales como células B o macrófagos. La bromelaína
puede aumentar las señales coestimuladoras de las células T por
una acción en las células B. Independientemente del efecto putativo
de CCS en las células accesorias, los datos indican claramente que
CCS bloquea la producción de IL-2 y la
proliferación de células T CD4^{+} purificadas, lo que sugiere
que CCS bloquea la activación de las células T. La producción de
IL-2 y proliferación dependían de la estimulación
celular con anticuerpos anti-TCR puesto que no se
detectó citoquina en las células cultivadas en medios de cultivo
tisular solos (fig. 13 y 14).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Células. Las líneas de células tumorales
las proporcionaron L. Kelland (Institute of Cancer Research,
Sutton, Reino Unido) y eran las siguientes: de ovario
(SKOV-3, CH-1, A2780), colon (HT29,
BE, LOVO), pecho (MCF-7, MDA231, MDA361), pulmón
(A549, CORL23, MOR) y melanoma (G361, E008, SKMe124).
Los estudios los llevó a cabo L. Kelland
(Institute of Cancer Research, Sutton, Reino Unido). Se
tripsinizaron líneas celulares y se sembraron células viables
individuales en placas de microvaloración de 96 pocillos con una
densidad de 4 x 10^{3} células/pocillo en 160 \mul de medio de
crecimiento. Después de dejar toda la noche para la unión, se
añadió CCS a los pocillos por cuadruplicado en 40 \mul de medio
de crecimiento para dar un intervalo de concentraciones finales en
los pocillos de 50, 10, 2,5, 1 y 0,25 \mug/ml. Ocho pocillos
servían como control, pocillos no tratados. Se diluyó la CCS
inmediatamente antes de la adición a las células en agua estéril.
La exposición a CCS de las células fue durante 96 h, tras lo cual
se determinó el número de células en cada pocillo mediante tinción
con sulforrodamina B al 0,4% en ácido acético al 1% como se ha
descrito previamente (Kelland y col., 1993, Cancer Res., 53,
2581-2586). Después se calcularon las
concentraciones inhibidoras de 50% (valores de CI_{50} en
\mug/ml) a partir de las gráficas de concentración frente a la
absorbancia de control (%) (lectura a 540 nm).
p21^{Ras} y Raf-1 son
oncogenes importantes, que cuando mutan producen el crecimiento y
proliferación celulares incontrolados, conduciendo al cáncer.
Puesto que se ha demostrado que CCS puede bloquear los efectos de
la cascada de señalización de quinasas
p21^{Ra}/Raf-l/MEK1/ERK, se investigó si CCS
podía bloquear el crecimiento tumoral. El tratamiento con CCS de
células tumorales humanas dio como resultado una reducción en el
crecimiento de varias líneas celulares tumorales diferentes de
ovario, pulmón, colon, pecho y melanoma, in vitro (Fig. 15).
La CCS no afectó a todas las líneas celulares por igual, lo que
sugería que la CCS tiene una acción selectiva.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CORTECS (UK) LIMITED
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: FIRST FLOOR, OSPREY HOUSE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: LOWER SQUARE, ISLEWORTH
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MIDDLESEX
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: REINO UNIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP) : TW7 6BN
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: MYNOTT, Tracey Lehanne
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Imperial College of Science,
\hskip4.15cmTechnology & Medicine
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Dept of Biochemistry,
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Exhibition Road,
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Londres, Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): SW7 2AZ
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPONENTE DE LA BROMELAÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA EN EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.45cmNÚMERO DE SOLICITUD: WO PCT/GB98/00590
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Leu Pro Asp Ser Ile Asp Trp Arg Gln Lys
Gly Ala Val Thr Glu}
\sac{Val Lys Asn Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro G1n Ser Ile Asp Trp Arg Asp Tyr Gly
Ala Val Asn Glu Val}
\sac{Lys Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Tyr
Gly Ala Val Thr Ser}
\sac{Val Lys Asn Gln Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Ser Gly
Ala Val Thr Ser Val}
\sac{Lys Asn Gln Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asn Tyr Gly
Ala Val Thr Ser Val}
\sac{Lys Asn Gln Gly}
Claims (7)
1. Uso de ananaína o una mezcla de ananaína y
comosaína para la fabricación de un medicamento para usar como un
inmunosupresor.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad o
afección seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una enfermedad o afección mediadas por la
activación de células T;
(b) una enfermedad o afección mediadas por la
activación de la ruta de la MAP quinasa;
(c) una enfermedad o afección mediadas por la
producción de factores de crecimiento o citoquinas;
(d) un cáncer sensible al bloqueo de p21ras y
Raf-1 por la MAP quinasa;
(e) una enfermedad autoinmune;
(f) rechazo de injerto o transplante por un
huésped;
(g) una reacción alérgica;
(h) choque tóxico;
(i) apoptosis; y
(j) una infección de parásito o patógeno.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el medicamento es eficaz para al menos
uno de los siguientes casos:
(i) modular el crecimiento y proliferación
celulares;
(ii) inhibir la producción de factores de
crecimiento o citoquinas por las células;
(iii) inhibir la activación de la ruta de la MAP
quinasa; y
(iv) inhibir la activación de células T.
4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento está en una
forma adecuada para la administración entérica, oral, nasal, bucal,
tópica o anal.
5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el medicamento está en una forma
adecuada para la administración parenteral.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en
el que la administración parenteral se selecciona de administración
intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraperitoneal.
7. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en
el que el medicamento está en una forma adecuada para la
administración oral y comprende un recubrimiento entérico.
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