ES2299657T3 - Procedimiento para la determinacion de la actividad terapeutica de un fragmento de mbp. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento destinado a predecir la eficacia terapéutica del tratamiento de un paciente de esclerosis múltiple con un péptido de fórmula: Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr que comprende la selección in vitro del paciente de esclerosis múltiple para determinar la presencia del haplotipo (HLA)-DR2 del antígeno leucocitario, en el que la presencia del haplotipo HLA-DR2 predice la eficacia terapéutica del tratamiento con el péptido.
Description
Procedimiento para la determinación de la
actividad terapéutica de un fragmento de MBP.
La presente invención se refiere en general a
polipéptidos seleccionados y a su utilización en la inmunoregulación
de los anticuerpos contra la proteína básica de la mielina humana.
La presente invención se refiere asimismo en general a
procedimientos de utilización de estos péptidos en el tratamiento de
la esclerosis múltiple.
La esclerosis múltiples (MS) es una enfermedad
de desmielinización multifocal del sistema nervioso central (CNS)
humano asociada a inflamación. El incremento en la síntesis
intra-barrera-hematoencefálica
(intra-BBB) de IgG es un marcador de MS
[Tourtelotte, W.W., J. Neurol. Sci.
10:279-304 (1970); Link, H., and Tibbling, G.,
Scand. J. Clin. Lab. Invest. 37:397-401
(1977); Tourtelotte, W.W. and Ma, B., Neurology
28:76-83 (1978); Walsh, J.M., and Tourtelotte,
W.W., In: Hallpike, J.F., Adams, C.W.M. and Tourtelotte, W.W., eds.
Multiple sclerosis. Baltimore. Willians & Wilkins,
1982:275-358; and Warren, K.G., and Catz, L. Ann.
Neurol. 17:475-480, (1985)].
La síntesis de IgG en la BBB es generalmente
elevada en los pacientes de MS clínicamente definidos [Schumacher,
G.A., Beebe, G., Kibler R.E., et al., Ann. NY Acad. Sci.
15:266-272 (1965)] con enfermedad activa o
inactiva. No se conoce la especificidad de la mayoría de la IgG del
CNS. Mientras una pequeña proporción tiene actividad antivírica o
reacciona contra antígenos del cerebro, ácidos nucleicos,
eritrocitos o antígenos de la musculatura lisa, la parte no
específica podría representar la activación policlonal de las
células B [Tourtelotte, W.W. and Ma, B., Neurology
28:76-83 (1978)]. Durante la última década ha
habido un considerable interés en el estudio de los anticuerpos
contra las proteínas específicas de la mielina.
Después de la detección los complejos inmunes
circulantes que contienen proteína básica de la mielina (MBP) como
su componente antigénico (Dasgupta, M.K., Catz, I. Warren, K.G.
et al., Can. J. Neurol. Sci., 10:239-243
(1983)], se observaron títulos incrementados de anticuerpos contra
MBP (anti-MBP) en el fluido cerebroespinal (CSF) de
los pacientes con formas activas de MS [Warren, K.G. and Catz, I.,
Ann. Neurol., 209:20-25 (1986)].
Clínicamente, la MS se caracteriza por fases de actividad de la
enfermedad tales como recaídas agudas o progresión crónica y por
fases de remisión clínica. La MS activa se encuentra asociada con
incrementos en el nivel de anti-MBP producida
intratecalmente [Warren, K.G., y Catz, I. Ann. Neurol.
209:20-25 (1986) and Catz, I. and Warren, K.G.,
Can. J. Neurol. Sci., 13:21-24 (1986)]. Estos
anticuerpos se encuentran predominantemente en forma libre (F)
durante las recaídas agudas y predominantemente en forma unida (B)
cuando la enfermedad es insidiosamente progresiva [Warren, K.G. and
Catz, I., Ann. Neurol. 209:20-25 (1986)].
Durante las recaídas agudas, los títulos de
anti-MBP del CSF se correlacionan con la actividad
de la enfermedad [Warren, K.G. and Catz., I., Ann. Neurol.,
21:183-187 (1987)]. Los niveles de
anti-MBP también estuvieron amplificados en los
pacientes con un primer ataque de neuritis oftálmica en la mayoría
de los pacientes que experimentan un primer ataque de MS [Warren,
K.G., Catz, I., and Bauer, C., Ann. Neurol.,
23:297-299 (1988); Warren, K.G. and Catz. I.,
J. Neurol. Sci. 91:143-151 (1989)].
Los estudios cinéticos longitudinales de los
niveles de anti-MBP de CSF en pacientes que entran
en la fase de recuperación siguiente a una recaída aguda,
demuestran una caída gradual del título de anti-MBP
F comparable al incremento progresivo de la fracción B [Warren,
K.G. and Catz, I., J. Neurol. Sci.,
91:143-151 (1989); Warren, K.G. and Catz, I.,
J. Neurol. Sci. 88:185-194 (1988)]. En la
fase de remisión, la anti-MBP de CSF puede hacerse
indetectable lo que sugiere una neutralización de
anti-MBP asociada con la fase inactiva de MS
[Warren, K.G. and Catz, I., J. Neurol. Sci.,
88:185-194 (1988)]. Por el contrario la MS
crónica progresiva caracterizada por la persistencia de a un nivel
incrementado de anti-MBP durante largos períodos de
tiempo estuvo asociada con la inhibición de la neutralización de
anti-MBP [Warren, K.G. and Catz, I., J. Neurol.
Sci., 88:185-194 (1988)]. Recientemente una
cascada de anticuerpos a la proteína básica de la mielina,
identificada en la fracción de IgG purificada a partir del CSF de
pacientes con MS, contuvo anticuerpos anti-MBP, que
neutralizaron los anti-MBP y anticuerpos que
inhibieron la neutralización de anti-MBP [Warren,
K.G. y Catz, I., J. Neurol. Sci., 96:19-27
(1990)].
La investigación anterior ha demostrado desde el
punto de vista de las células-B autoinmunes que
existen por lo menos dos formas diferentes de MS, teniendo la
mayoría de los pacientes autoanticuerpos a la proteína básica de la
mielina (anti-MBP) y un número inferior que tienen
anticuerpos a la proteína proteolipídica (anti-PLP)
[Warren, K.G. et al., Ann. Neurol.,
35:280-289 (1994)]. En la MS asociada a
anti-MBP, las recaídas agudas se encuentran
asociadas a elevadas proporciones (superiores a 1) de
anti-MBP Libre (F)/Unido (B), mientras que la fase
crónica progresiva se caracteriza por proporciones de F/B de
anti-MBP iguales o inferiores a 1, y los pacientes
en remisión ocasionalmente muestran títulos ligeramente elevados de
anti-MBP B [Warrren, K.G. and Catz, I., J.
Neurol. Sci., 88:185-194
(1989)].
(1989)].
Se ha demostrado que algunas de las células T
proliferantes en los pacientes de MS están dirigidos contra MBP
(Allegretta et al., Science, 247:718-721
(1990)] y que las células T humanas pueden reconocer múltiples
epitopos en la molécula [Richert et al., J. Neuroimmun.,
23:55-66 (1989)]. La MBP también parece ser
capaz de activar algunas de las células T sin la implicación de las
células presentadoras de antígenos [Altman et al., Eur. J.
Immuno., 17:1635-1640 (1987)]. Es posible que
las células T puedan reconocer pequeños péptidos de la MPB sin la
necesidad de procesamiento intracelular, simplemente por su
capacidad de unirse a los principales antígenos de
histocompatibilidad de clase II en la superficie de las células
presentadoras.
Ya que la encéfalo mielitis alérgica
experimental (EAE), un modelo animal aceptado de MS, se puede
inducir mediante la inoculación en los roedores susceptibles de MBP
o PLP junto con adyuvante completo de Freund, el proceso de
desmielinización en la MS puede tener un mecanismo autoinmune
[Fritz, R.B. et al., J. Immunol.,
130:1024-1026 (1983); Trotter, J.L., et
al., J. Neurol. Sci., 79:173-188 (1987)].
Desde el punto de vista de los autoanticuerpos de las células B, el
epitopo de la MBP diana del proceso de la enfermedad ha sido
localizad en la proximidad de la secuencia
tri-prolílica (residuos
-99-100-101-) en una zona entre los
residuos 80 y 100 [Warren, K.G., et al., Ann. Neurol.,
35:280-289 (1994)]. Este epítopo de las células
B se solapa con el epítopo inmunodominante de las células T
reactivas a MBP, que se encuentra en las lesiones cerebrales de MS
[Oksenberg, J.R., et al., Nature, 362:68-70
(1993)].
Estudios anteriores han demostrado que el
anti-MBP se neutraliza por MBP. Sin embargo, los
intentos previos de tratar la MS mediante la administración
intramuscular o subcutánea de MBP heteróloga no han tenido éxito
[Campbell, B., Vogel., R.J., Fisher,, E. and Lorenz, R., Arch.
Neurol., 29:10-15 (1973); Gonsette, R.E.,
Delmotte, P., and Demonty, L., J. Neurol.,
216:27-31 (1977) y Romine, J.S. and Salk, J.,
En: Hallpike, J.F., Adams, C.W.M. and Tourtelotte, W.W., eds.
Multiple sclerosis. Baltimore, Williams & Wilkins,
1982:621-630)]. El problema con la utilización de
MBP nativa es doble. En primer lugar, la proteína se prepara a
partir de muestras de cerebros humanos y en consecuencia, existe el
peligro potencial de que puedan existir neurovirus latentes en la
muestra. En segundo lugar, aunque la MBP soluble generalmente no es
un soluble un inmunógeno, es posible que cundo se administra a
individuos con un sistema inmune alterado, la MBP soluble pueda
actuar como antígeno e inducir la producción de anticuerpos contra
la MBP.
En consecuencia, la presente invención determina
si la anti-MBP purificada de CSF de pacientes de MS
se puede neutralizar mediante péptidos solubles seleccionados de la
MPB humana (h-MBP). Para ello, se utilizaron
péptidos sintéticos solubles que cubren la longitud total de la
h-MBP con el fin de determinar el posible rango de
epítopos en la h-MBP que neutraliza el
anti-MBP obtenido de estos pacientes. Por
consiguiente, los péptidos solubles seleccionados, que demuestren
neutralización de anti-MBP, se pueden utilizar con
el fin de tratar la MS con mayor eficacia que con la molécula
total. Estos péptidos solubles se producen sintéticamente y como
tales no presentan la amenaza potencial de neurovirus. Además,
debido a su pequeño tamaño, estos péptidos podrían no actuar como
inmunógenos. Por consiguiente, la utilización de péptidos
seleccionados como tratamiento contra la MS, superaría los
problemas identificados con la utilización de la proteína
nativa.
Además, el péptido utilizado asociado con la
presente invención se investigó con el fin de determinar su
efectividad para unirse o modular la producción de
anti-MBP de MS in vivo.
El documento WO 96/12737 da a conocer péptidos
aislados y combinaciones de péptidos derivados de
auto-antígenos de la mielina que comprenden MBP que
son adecuados en el tratamiento de la esclerosis múltiple.
El documento WO 93/21222 da a conocer péptidos
de la proteína básica de la mielina humana y en particular
secuencias de aminoácidos que comprenden los epitopos
inmunodominantes de la proteína básica de la mielina humana.
También se dan a conocer procedimientos destinados a suprimir la
respuesta inmune mediante la administración de péptidos de la
proteína básica de la mielina humana.
El documento WO 93/08212 da a conocer péptidos
sintéticos, que son sustancialmente homólogos en secuencia a parte
de la secuencia de aminoácidos de la proteína de la mielina humana.
Estos péptidos comprenden longitudes de entre aproximadamente 8
residuos de aminoácido y aproximadamente 25 residuos de aminoácido y
corresponden a la secuencia de aminoácidos de la proteína básica de
la mielina humana (h-MBP) desde aproximadamente el
residuo de aminoácido 61 hasta aproximadamente el residuo 106.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido utilizado en asociación con la
presente invención es sustancialmente homólogo en secuencia a parte
de la secuencia de aminoácidos de la proteína básica de la mielina
humana. Este péptido es capaz de neutralizar o modular la producción
de anti-MBP.
Según la presente invención se proporciona un
procedimiento destinado a predecir la eficacia terapéutica del
tratamiento de los pacientes de esclerosis múltiple con un péptido
de fórmula:
Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr
que comprende la selección in
vitro de la presencia del haplotipo (HLA)-DR2
del antígeno leucocitario humano en pacientes de esclerosis
múltiple, en el que la presencia del haplotipo
HLA-DR2 es predictiva de la eficacia terapéutica del
tratamiento con el
péptido.
\newpage
Los ejemplos de péptidos que no se utilizan en
asociación con la presente invención se seleccionan de entre:
\vskip1.000000\baselineskip
MBP75-95
Lis Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val
Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
\vskip1.000000\baselineskip
MBP64-78
Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys
Ser His Gly
\vskip1.000000\baselineskip
MBP61-75
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu
Pro Gln Lys
\vskip1.000000\baselineskip
MBP69-83
Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr
Gln Asp Glu
\vskip1.000000\baselineskip
MBP80-97
Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys
Asn Ile Val Thr Pro Arg
\vskip1.000000\baselineskip
MBP91-106
Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser
Gln Gly Lys Gly
\vskip1.000000\baselineskip
MBP84-93
Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile
\vskip1.000000\baselineskip
MBP85-94
Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val
\vskip1.000000\baselineskip
MBP86-95
Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
\vskip1.000000\baselineskip
MBP87-96
Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de identificarlos,
MBP82-98 y MBP(82-98) se
utilizan en la presente memoria para indicar los péptidos
(utilizados en asociación con la presente invención):
Asp Glu Asn Pro
Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg
Thr
La Fig. 1 Muestra la localización de 18 péptidos
sintéticos (números pequeños) en relación a la moléculas de MBP
humana intacta. Los péptidos se representan mediante barras
verticales colocadas al lado de su correspondiente región en la
molécula de MBP. Los números grandes representan el residuo de
aminoácido en la MBP humana.
La Fig.2 Muestra las curvas de inhibición de
anti-MBP, purificada de un conjunto de 10 pacientes
diferentes de esclerosis múltiple, mediante MBP humana y péptidos de
MBP.
La Fig. 3 Muestra la neutralización de
anti-MBP aislada de un paciente individual de
esclerosis múltiple mediante la MBP humana y los péptidos
MBP80-97; MBP91-106 y
MBP75-95.
La Fig. 4 Seguimiento de los títulos de
anti-MBP de CSF en pacientes con MS crónica
progresiva:
Los niveles de anti-MBP F
(libre) y B (unido) se mantuvieron persistentemente elevados cuando
se muestrearon 26 veces durante un período de 11 años entre 1983 y
1993.
cpm: cuentas por minuto
Unidades de
radioactividad = (cpm de la muestra - cpm del blanco)/(cpm totales -
cpm del
blanco)
Círculos abiertos: anti-MBP
unida (B) determinada después de la hidrólisis ácida de los
complejos inmunes del CSF.
Círculos cerrados: anti-MBP
libre (F)
La Fig. 5 Pacientes control: Niveles de
anti-MBP de CSF en 2 "controles de tiempo"
(1F56, Fig. 5A y 3M66, Fig. 5B) y 2 "controles de tiempo de
disolución salina" (4M45, Fig. 5C y 5M59, Fig. 5D). En los 4
pacientes la anti-MBP F y B se mantuvo
constantemente elevada al nivel basal cuando se muestreó el CSF cada
30 minutos durante las 2 primeras horas así como 24 horas más tarde.
Los símbolos son como en la Fig. 4.
La Fig. 6 - Estudios de péptidos entre
pacientes: los niveles de anti-MBP de CSF en un
grupo de 4 pacientes (10F38, Fig. 6A; 13F43, Fig. 6C; 5M59, Fig. 6D
y 3M66, Fig. 6G) que recibieron cantidades crecientes (1, 2,5, 5 y
10 mg respectivamente) de un péptido sintético control
MBP35-58 no enlazante y un grupo apareado de otros 4
pacientes de MS (6F53, Fig. 6B; 8M41, Fig. 6D; 4M45, Fig. 6F y 1F56,
Fig. 6H) que recibieron cantidades crecientes (1, 2,5, 5 y 10 mg
respectivamente) del péptido sintético MBP75-95 que
se une a anti-MBP. Anti-MBP F de CSF
se unió de modo dosis-dependiente al péptido
MBP75-95 y no reaccionó con el péptido
MBP35-58. Anti-MBP unido permaneció
virtualmente inafectado.
La Fig. 7 - Estudios intrapaciente de péptidos:
cuando los pacientes de MS fueron "controles de tiempo" (1F56,
Fig. 7C y 3M66, Fig. 7D) o "controles de
tiempo-disolución salina" (5M59, Fig. 7A y 4M45,
Fig. 7B), o cuando recibieron el péptido control no enlazante
MBP35-58 (5M59 y 3M66) sus niveles de
anti-MBP F y B permanecieron inafectados. Por el
contrario, cuando los mismos pacientes 4M45, 1F56 y 3M66 más tarde
recibieron 5-10 mg del péptido
MBP75-95 que se une a anti-MBP, su
anti-MBP F se hizo indetectable durante un período
de hasta 7 días y regresó al nivel basal entre 10 y 21 días.
La Fig. 8 - Inyecciones intratecales repetidas
de péptido sintético: un paciente MS crónica progresiva recibió 10
inyecciones semanales de 10 mg MBP75-95 inoculado
directamente en el CSF; los títulos de anti-MBP F y
B se midieron antes (círculos) y 30 minutos después (cuadrados) de
cada inoculación. Anti-MBP F (círculos y cuadrados
cerrados) se volvió indetectable durante el período de 10 semanas
mientras que el anticuerpo B permaneció esencialmente sin cambiar
(círculos y cuadrados abiertos).
La Fig. 9 - Administración intravenosa de
péptidos sintéticos: Los niveles en CSF de anti-MBP
después de una sola inyección intravenosa de 500 mg de
MBP75-95; tanto los niveles de
anti-MBP F como los de B declinaron
significativamente cuando se ensayaron a los 10, 16 y 30 días
después de la inyección. Los símbolos son como en la Figura 4.
La Fig. 10 - Refinamientos adicionales del
epítopo MBP para anti-MBP de MS utilizando un
conjunto de 41 decapéptidos que cubre una zona comprendida entre los
residuos 61 y 110.
\vskip1.000000\baselineskip
- Las barras representan el porcentaje de
inhibición = 100 - unidades de radioactividad.
- MBP y péptido MBP75-95 se
utilizaron como controles positivos y produjeron una inhibición
completa (100%) tanto de anticuerpo F como B.
- Los péptidos MBP51 -60 y MPB
111-120 se utilizaron como controles negativos y
produjeron una inhibición insignificante (0-10%) de
anti-MBP F y B.
- Los decapéptidos MBP84-93,
MBP85-94, MPB86-95 y
MBP87-96 que producen la inhibición máxima (90 -
100%) tanto de anticuerpo F como B están muy asociados con el
epítopo MBP.
- Línea de puntos: límite de confianza del 95%
del ensayo de inhibición.
La Fig. 11a muestra anti-MBP de
CSF libre (F) -\bullet y unido (B) \circ en un paciente con
neuritis óptica unilateral que recibió dos inyecciones intratecales
(it#1 y it#2) de 50 mg de pMPB86-95, separadas por 4
semanas, w = número de semanas.
La Fig. 11b muestra los niveles de
anti-MBP de CSF libre (F) -\bullet y unido (B)
\circ en un paciente con neuritis óptica unilateral completa que
recibió múltiples inyecciones intratecales (it#1, it#2, ig#3, it#4,
e it#5) de 50 mg de pMBP82-98 durante la primera
semana de recaída.
La Fig. 11c muestra los niveles de
anti-MBP de CSF libre (F) -\bullet y unido (B)
\circ en un paciente de pseudoaterosis que recibió 5 inyecciones
intratecales (it#1, it#2, it#3, it#4 e it#5) de 50 mg de
pMBP82-98.
La Fig. 11d muestra los niveles de
anti-MBP de CSF libre (F) -\bullet y unido (B)
\circ en un paciente con MS recurrente-progresiva
que recibió 4 inyecciones intratecales (it#1, it#2, it#3 e it#4) de
50 mg de pMPB86-95 cada 2 a 3 días durante la
primera semana de recaída y una inyección intravenosa (IV) de 400 mg
de pMPB86-95 cuando la enfermedad reentró en la fase
progresiva.
La Fig. 12 muestra los niveles de
anti-MBP de CSF unido y libre en un paciente con
recaída polisintomática que recibió un total de 7 inyecciones
intratecales de 50 mg de pMPB86-95. No se obtuvo
muestra de CSF a los 30 minutos después de it#2; se obtuvo una
muestra de CSF 24 horas más tarde. Los símbolos son como en la
Figura 11.
La Fig. 13 muestra los niveles de
anti-MBP de CSF libre y unido en un paciente de MS
progresiva-recurrente que recibió tanto inyecciones
intratecales (it#1, it#2 e it#3) como intravenosas (IV#1 e IV#2) de
pMPB86-95. No se obtuvo muestra de CSF antes o
después de it#2. Los símbolos son como en la Fig. 11.
La Fig. 14 muestra los niveles de
anti-MBP de CSF libre y unido en un paciente de MS
progresiva-recurrente que recibió inyecciones
intravenosas (IV#1, IV#2 e IV#3) e inyecciones intratecales (it#1 a
it#9) de pMPB86-95 y pMPB82-98. Los
símbolos son como en la Fig. 11.
La Fig. 15 muestra el intento de evitar futuras
recaídas en un paciente de MS progresiva-recurrente
que recibió dos inyecciones intravenosas (IV#1 y IV#2) de 400 mg de
pMPB86-95 y pMPB82-98. No se obtuvo
muestra de CSF durante la primera recaída, 3 meses después de IV#1.
La velocidad natural de recaída se representa en la parte superior
mediante flechas que corresponden al mes del ataque. La zona
enmarcada representa el tiempo del experimento. Los símbolos son
como en la Fig. 11.
La Fig. 16 muestra los intentos de evitar
futuras recaídas en un paciente de MS
progresiva-recurrente que recibió dos inyecciones
intratecales (it#1 e it#2) y una inyección intravenosa (IV) de
pMPB86-95. \blacksquare dosis intravenosa elevada
de metilprednisolona. La velocidad de recaída natural se representa
en la parte superior mediante flechas que corresponden al mes del
ataque. La zona enmarcada representa el tiempo del experimento. Los
símbolos son como en la
Fig. 11.
Fig. 11.
La Fig. 17 muestra el efecto de la
administración intratecal e intravenosa de péptido de MBP
específicos a autoanticuerpos del CSF de un paciente de MS
crónica-progresiva; en la que en la Fig. 17a se
inyectó pMBP75-95 directamente en el CSF (2,5 mg en
5 ml de disolución salina) y se midieron los autoanticuerpos
específicos a MBP mediante un radioinmunoensayo en fase sólida a
diferentes puntos de tiempo (0,5 horas a 7 días después de la
inyección). Las inyecciones de péptido produjeron la neutralización
transitoria de anti-MBP libre (círculos cerrados)
pero no afectó anti-MBP unido (círculos abiertos).
Los autoanticuerpos no fueron detectables a 1 y 2 horas y empezaron
a regresar a los niveles basales entre las 12 y 24 horas después de
la inyección. Se hicieron observaciones semejantes en otros siete
pacientes de MS crónica-progresiva. En la Fig. 17b,
13 meses después de la inyección intratecal de péptido mostrada en
la Fig. 17a, se inyectaron intravenosamente 500 mg de
pMBP75-95 en 50 ml de disolución salina y se
midieron los autoanticuerpos a MBP en el CSF durante un período de 3
meses (media \pm desviación estándar).
La Fig. 18 muestra una composición de los
niveles de anti-MBP en el CSF en 13 pacientes de MS
crónica-progresiva a los que se les suministró una
inyección intravenosa (IV#1 de entre 5 y 6 mg/kg de peso corporal
(256-500 mg en disolución salina normal) de
pMBP75-92 (2 pacientes) o pMBP86-95
(11 pacientes); se determinó tanto anti-MBP libre
como unido (círculos abiertos y cerrados, respectivamente). Los
niveles de autoanticuerpos fueron bajos o indetectables entre 1 y 4
meses después de IV#1, cuando empezaron a regresar al nivel basal.
Entre 6 y 10 meses después
de IV#1, todos los pacientes recibieron una segunda inyección intravenosa de pMBP82-98 de la misma dosis (IV#2).
de IV#1, todos los pacientes recibieron una segunda inyección intravenosa de pMBP82-98 de la misma dosis (IV#2).
La presente invención está dirigida a un péptido
seleccionado utilizado en asociación con el procedimiento de la
presente invención que es homólogo en secuencia a una parte de la
secuencia de aminoácidos de la proteína básica de la mielina.
Basándose en trabajos adicionales relacionados a
la presente invención, basados en los ensayos de inhibición
competitiva, utilizando una serie de 41 decapéptidos, se refinó el
epítopo de MBP para la anti-MBP de la MS y se
localizó en una zona comprendida entre el aminoácido 86 y el
aminoácido 95. Con base en el nivel superior de inhibición, (igual
o superior al 95%) de anti-MBP B, el epítopo de MBP
para anti-MBP para la MS se encuentra entre el
aminoácido 86 y el aminoácido 95. La región común más pequeña de los
decapéptido efectivos se encuentra entre el aminoácido 87 y el
93.
\global\parskip0.850000\baselineskip
Los 7 aminoácidos que comprenden las posiciones
87 a 93 probablemente no serían suficientemente grandes como para
unirse a anti-MBP efectivamente.
El péptido utilizado en asociación con el
procedimiento de la presente invención se puede preparar de acuerdo
con los procedimientos aceptados de síntesis de polipéptidos.
También se encuentran incluidos en el ámbito del término
"péptido" los péptidos producidos mediante tecnología de ADN
recombinante. Conocida la secuencia del péptido seleccionado, tal
como se da a conocer en la presente invención, se encuentra dentro
del ámbito de la presente invención determinar la secuencia de ADN
adecuada, que codifique la secuencia de aminoácidos seleccionada.
La secuencia de ADN adecuada se puede producir mediante
procedimientos convencionales conocidos de síntesis de secuencias
de ADN. Las secuencias de ADN así producidas se pueden entonces
clonar en vehículos de clonaje apropiados y utilizadas con el fin
de transformar una célula huésped adecuada para producir el péptido
recombinante. Todos los procedimientos referidos anteriormente son
convencionales y bien conocidos por los expertos en la materia.
Los ejemplos de péptidos que no se utilizan en
asociación con la presente invención se seleccionan de entre el
grupo constituido por:
MBP61-75
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu
Pro Gln Lys
\vskip1.000000\baselineskip
MBP64-78
Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys
Ser His Gly
\vskip1.000000\baselineskip
MBP69-83
Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr
Gln Asp Glu
\vskip1.000000\baselineskip
MBP75-95
Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val
Val His Phe Phe Lys Asn Ile
Val Thr
\vskip1.000000\baselineskip
MBP80-97
Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys
Asn Ile Val Thr Pro Arg
\vskip1.000000\baselineskip
MBP91-106
Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser
Gln Gly Lys Gly
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos de péptidos que no se utilizan en
asociación con la presente invención se seleccionan de entre:
MBP84-93
Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile
\vskip1.000000\baselineskip
MBP85-94
Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val
\vskip1.000000\baselineskip
MBP86-95
Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
\vskip1.000000\baselineskip
MBP87-96
Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro
\global\parskip1.000000\baselineskip
El péptido MBP82-98 utilizado en
asociación con el procedimiento de la presente invención tiene una
solubilidad mejorada sobre la de los demás péptidos dados a conocer
no utilizados en asociación con la presente invención, debido a los
5 residuos hidrófilos adicionales en el péptido.
La función potencial de anti-MBP
en la patogénesis de la MS continúa siendo explorada. Los títulos
incrementados de anti-MBP en los paciente con MS
activa fueron reportados inicialmente por Panitch et al.,
(Panitch, H.S., Hooper, C.S. and Johnson, K.P., Arch. Neurol.,
37:206-209 (1980)] que utilizaron un
radioinmunoensayo en fase sólida con MBP de cobaya. Los pacientes
de MS aguda generalmente tienen anti-MBP libre
incrementado, mientras que muchos pacientes en remisión clínica
pueden tener niveles indetectables de anti-MBP.
Durante la fase de transición de una recaída aguda a la remisión,
los títulos de anti-MBP libre disminuyen
progresivamente durante semanas o meses, mientras que la fracción
unida del anticuerpo aumenta en comparación a su nivel inicial. En
otros pacientes en remisión, es posible observar títulos bajos de
anti-MBP libre y unido, generalmente con
proporciones F/B por debajo de la unidad. Lo que sugiere que el
anticuerpo(s) anti-MBP neutralizante está
unido a anti-MBP. Ocasionalmente, los pacientes que
se ajustan al criterio de MS definitivamente clínica o los
pacientes que padecen MS neuropatológicamente confirmada, tienen
anti-MBP indetectable durante la fase activa de la
enfermedad. Es posible que tales pacientes tengan anticuerpos a
otras proteínas de la mielina. La ausencia de un escenario con
anticuerpo específico no niega la importancia potencial de
anti-MBP en el mecanismo de la desmielinización en
la mayoría de los
pacientes de MS.
pacientes de MS.
Recientemente, se ha observado una cascada de
anticuerpos a la MBP en la fracción de IgG purificada a partir del
CSF de MS [Warren, K.G. and Catz, I., J. Neurol. Sci.,
96:19-27 (1990)]. En asociación con enfermedad
activa hay anticuerpos primarios a MBP tanto forma libre como unida:
en los pacientes en recaída aguda la proporción F/B es superior a 1
y es inferiores a 1 en los pacientes con enfermedad crónica
progresiva [Warren, K.G. and Catz, I., Ann. Neurol.,
209:20-25 (1986); Catz, I. and Warren, K.G.,
Can. J. Neurol. Sci., 13:21-24 (1986);
Warren, K.G. and Catz, I., Ann. Neurol.,
21:183-187 (1987)]. Los anticuerpos secundarios
que neutralizan el anti-MBP aparecen cuando la
enfermedad se hace inactiva. Los anticuerpos terciarios que inhiben
la neutralización de anti-MBP se encuentran
presentes cuando la enfermedad es crónicamente progresiva y fracasa
en hacerse inactiva. El hecho de que una cascada de anticuerpos a
MBP se encuentre asociada a las distintas fases de MS sugiere su
posible importancia vis-a-vie la
historia natural de la enfermedad.
Aunque se puede detectar
anti-MBP en los pacientes de CSF con MS activa, su
función en la patogénesis de la desmielinización todavía se debe
confirmar. La implicación de anti-MBP en el
mecanismo de MS se puede determinar mejor mediante su regulación
negativa, in vivo, quizás mediante la administración de
péptidos seleccionados y el seguimiento del curso clínico de la
enfermedad. Si anti-MBP es (son) el único anticuerpo
primario asociado con la desmielinización en la MS, podría ser
posible bloquear este proceso mediante la administración intratecal,
y/o intravenosa, de los péptidos de MBP seleccionados que regulasen
negativamente el anti-MBP y promocionasen la
tolerancia a MBP in situ. Otras proteínas de la mielina
humana podrían estar también implicadas en la desmielinización en
MS y en consecuencia, está comprendido en el ámbito de la presente
invención utilizar péptidos sustancialmente homólogos en secuencia
a parte de la secuencia de aminoácidos de esta u otras proteínas con
el fin de regular negativamente los correspondientes anticuerpos.
Aunque los intentos anteriores de tratar la MS mediante la
administración intramuscular o subcutánea de MBP heteróloga no han
tenido éxito [Campbell, b., Vogel, R.J., Fisher, E. and Lorenz, R.,
Arch. Neurol., 29:10-15 (1973); Gonsette,
R.E., Delmotte, P. and Demonty, L. J. Neurol.
216:27-31 (1977); Romine, J.S. and Salk, J., En:
Hallpike, J.F., Adams, C.W.M. and Tourtelotte, W.W., eds., Multiple
sclerosis. Baltimore. Willians & Wilkins,
1982:621-630], la administración intratecal y/o
intravenosa del péptido de MBP que neutraliza o regula negativamente
la producción de anti-MBP, según la presente
invención, ha demostrado resultados más
beneficiosos.
beneficiosos.
El modelo animal de MS, la encefalomielitis
alérgica experimental (EAE), es una enfermedad desmielinizante
mediada por las células T. La EAE se puede disminuir mediante la
inoculación intraperitoneal de los animales afectados con péptidos
sintéticos de MBP [Gaur, A. et al., Science,
258:1491-1494 (1992)]. Además, la
administración de dosis elevadas de péptidos de MBP eliminó las
células T autoreactivas y eliminó los signos clínicos y patológicos
de EAE en ratones [Critchfield, J. M. et al., Science,
263:1139-1143 (1994)]. Incluso la
administración oral de MBP moduló la EAE mediante la inducción de
tolerancia periférica [Chen, W. et al., Science,
265:1237-1240 (1994)]. Puede ser necesaria la
combinación de antígenos de la mielina o péptidos sintéticos de
tales antígenos administrada por vía intratecal y/o intravenosa con
el fin de modular las células T, las células B y los macrófagos
implicados en la destrucción de la mielina en los pacientes de
MS.
Aunque la presente invención se describe en
detalle haciendo particular referencia a las formas de realización
preferidas de la misma, los siguientes ejemplos, se proporcionan a
título ilustrativo y no limitativo de la presente invención.
\newpage
(Ejemplo de
referencia)
La Figura 1 muestra la localización de 18
péptidos de la h-MBP utilizados en este estudio en
relación a la molécula intacta de MBP. La MBP nativa se aisló de
tejido de cerebro no MS [Diebler, G.E., Martenson, R.E., Kies,
M.W., Prep. Biochem., 2:139-165 (1972)] y se
purificó todavía más mediante filtración por gel y cromatografía
líquida de elevada presión en fase invertida (HPLC). Se verificó la
pureza de las preparaciones finales de antígeno mediante
electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida.
Solamente las preparaciones que migraron con un peso molecular de
18,5 KD se utilizaron en los estudios posteriores. La MBP purificada
se utilizó en una cromatografía de afinidad específica por el
antígeno, en los estudios de neutralización y en radioimunoensayos
de anti-MBP en fase sólida.
Se sintetizaron 18 péptidos que cubren la
longitud de h-MBP y comprenden entre 8 y 25 residuos
de aminoácidos mediante el procedimiento Fmoc tal como se describió
anteriormente [Groome, N.P., Dawkes, A., Barry, R. et al., J.
Neuroimmun.,19:305-315 (1988)]. La pureza de los
péptidos se comprobó mediante HPLC de fase invertida con una
columna C18 y un gradiente de agua/acetonitrilo (0,1% TFA). También
se realizó un análisis de aminoácidos de los péptidos utilizando
análisis estándar. Muchos de los péptidos utilizados en este estudio
comprendieron un residuo de cisteína no natural ya que se hicieron
funcionar como inmunógenos junto con adyuvante de Freund. Es poco
probable que esto afecte los presentes descubrimientos.
El fluido cerebroespinal (CSF) se obtuvo dentro
de una semana del inicio de los síntomas en 35 pacientes con
recaídas de MS aguda y los niveles de IgG se determinaron mediante
nefelometría. Las muestras de CSF utilizadas en este estudio se
seleccionaron para que tuviesen niveles iniciales absolutos de IgG
elevados (> 0,080 g/l) y títulos amplificados de
anti-MBP (proporción F/B > 1,0). Todos los
pacientes de MS tuvieron enfermedad definida clínicamente).
La IgG se purificó a partir de CSF concentrado
de pacientes con MS aguda mediante cromatografía de afinidad en
Proteína-A Sepharosa (Pharmacía^{TM}) tal como se
describió anteriormente [Warren, K.G. and Catz, I., J. Neurol.
Sci., 96:19-27 (1990)]. La pureza de cada
preparación de IgG se comprobó mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida y enfoque isoelectrico. Cuando niveles elevados de
anti-MBP derivados de IgG purificada se absorbieron
a cero con MBP, el sobrenadante de la post-absorción
contuvo IgG residual lo que indica que la anti-MBP
representa solamente una fracción de la IgG elevada.
La MBP purificada se acopló a Sepharosa 4B
(Pharmacía^{TM}) activada con CNBr según las instrucciones del
fabricante. Se utilizó IgG purificada de CSF con niveles
incrementados de anti-MBP de 35 pacientes con
recaídas de MS aguda con el fin de aislar anti-MBP
mediante cromatografía de afinidad en MBP-Sepharosa
[Warren, K.G. and Catz, I., J. Neurol. Sci.,
103:90-96 (1991)]. Las muestras de
anti-MBP purificadas se compararon con la fuente
inicial de IgG mediante electroforesis en geles de poliacrilamida.
Cuando se absorbieron a cero las muestras de
anti-MBP purificada con MBP, los sobrenadantes post
absorción no contuvieron IgG residual lo que indica la pureza del
anti-MBP.
Se incubaron cantidades constantes de
anti-MBP (15 unidades de unión de radioactividad que
corresponden a 100 con el fin de ampliar la escala = %0) con
cantidades crecientes de h-MBP (0 a 1000 ng) o con
péptidos individuales de MBP (0 a 10.000 ng) en un ensayo en fase
líquida y después de 1,5 horas de incubación, los niveles de
anti-MBP libre se determinaron en todas las mezclas.
En los experimentos de neutralización se utilizó el
anti-MBP aislado de 7 pacientes de MS individuales o
el anti-MBP acumulado de 10 pacientes de MS
diferentes. Como controles negativos de antígeno (rango: 10 a 1000
ng) se utilizó histona de timo de ternera y albúmina de suero
humano. Se utilizó un anticuerpo monoclonal (MAb) al péptido
MBP64-78 y un antisuero policlonal de conejo al
péptido MBP1-8 como controles positivos de
anticuerpo [Groome, N., Harland, J. and Dawkes, A., Neurochem.
Int., 7:309-317 (1985); Barry, R., Payton, M.,
and Groome, N., Neurochem. Int. 2:291-300
(1991)]. Otro anticuerpo monoclonal de ratón al epítopo
45-50 se utilizó como control negativo de
anticuerpo.
Los niveles de anti-MBP se
determinaron mediante un radioinmunoensayo en fase sólida con MBP
humana [Warren, K.G. and Catz, I., Ann. Neurol.,
209:20-25 (1986); Warren, K.G. and Catz, I.,
Ann.Neurol. 21:183-187 (1987); Warren, K.G.
and Catz, I., J. Neurol. Sci., 91:143-151
(1989)]. Los niveles de anti-MBP libre se midieron
en todas las fracciones de cromatografía de afinidad y en todas las
mezclas de neutralización. Todas las muestras individuales se
corrieron por cuadruplicado utilizando el mismo material yodado con
el fin de minimizar la variabilidad entre ensayos.
El anti-MBP purificado se
neutralizó por completo mediante MBP y los péptidos
MBP80-97, MBP91-106 y
MBP75-95 y fue parcialmente neutralizado mediante
los péptidos MBP64-78, MBP69-83 y
MBP61-75 (Tabla I y Figura 2). Los 12 péptidos
restantes no neutralizaron el anti-MBP purificado y
sus curvas cinéticas cayeron en la zona sombreada mostrada en la
Figura 2. La histona de timo bovino y la albúmina de suero humano no
reaccionaron con el anti-MBP purificado incluso a
concentraciones tan elevadas como 1000 ng. El MAb contra el péptido
MBP64-78 solamente fue inhibido por el péptido
MBP64-78 y el MAb contra el péptido MBP
1-8 solamente fue inhibido por el péptido
MBP1-8. El MAb contra el péptido MBP
45-50 no reaccionó con MBP o con ningún otro péptido
(para la claridad de la figura, no se ilustra los datos control).
Las muestras control demuestran la validez de la estrategia de
neutralización ya que cada anticuerpo control fue neutralizado
completamente mediante el péptido esperado y por ninguno de los
demás. Esto muestra que incluso a las elevadas concentraciones de
péptido (10.000 ng) se observó especificidad de reconocimiento.
El anti-MBP purificado a partir
de 7 pacientes individuales de MS se neutralizó por completo con
h-MBP y los péptidos MBP80-97,
MBP91-106 y MBP75-95 (ver la Figura
3 como un Ejemplo ilustrativo). Debido a la limitada cantidad de
anticuerpo obtenido de un paciente individual de MS, el
anti-MBP no se hizo reaccionar con el resto de los
15 péptidos restantes.
Tal como se advirtió anteriormente, el
anti-MBP se neutralizó con péptidos que cubrieron
entre el residuo de aminoácido 61 hasta aproximadamente el residuo
de aminoácido 106. los péptidos que no neutralizan el
anti-MBP cubren tanto los extremos amino
(aproximadamente los residuos 1 a 63) como carboxilo
(aproximadamente los residuos 117 a 162) de la
h-MBP. Parece que los péptidos de diferentes
regiones que no se solapan de la MBP neutralizan el mismo
anticuerpo(s). Esto se puede explicar si los anticuerpos
reconocen un epítopo (ensamblado) discontinuo que comprende los
aminoácidos de las diferentes regiones. Anteriormente Hruby et
al [Hruby, S., Alvord, E.C., Groome, N.P., et al., Molec.
Immunol. 24:1359-1364 (1987)] que describieron
un fenómeno semejante, que demostraron que un anticuerpo monoclonal
de rata con una epítopo principal en la secuencia
112-121 de la MBP tenía una reacción fuerte con otro
epítopo en el péptido 39-91. Esto es más probable
que la posibilidad de que el anticuerpo tenga reacción cruzada con
otra secuencia completamente diferente que no forma un epítopo
discontinuo [Hruby, S., Alvord, E.C., Martenson, R.E. et al., J.
Neurochem. 44:637-650 (1985)]. Los datos de
neutralización se podrían explicar por la capacidad de los péptidos
de diferentes secciones de la MBP para ocupar el hueco de unión del
anticuerpo mediante la interacción con diferentes cadenas laterales
de aminoácidos del anticuerpo. Esta explicación concuerda con la
observación de que los péptidos que producen una completa
inhibición (MBP80-97), MBP91-106 y
MBP75-95 son aproximadamente 100 veces menos
efectivos por mol en producir inhibición que la MBP intacta. Según
la hipótesis anteriormente mencionada, esto podría ser debido a que
cada clon del péptido alcanzase la energía de enlace del epítopo
original de la MBP.
(Ejemplo de
referencia)
Los pacientes que participaron en el proyecto de
investigación fueron observados en la Multiple Sclerosis Patient
Care and Research Clinic de la Universidad de Alberta, en Edmonton,
Canadá. Los pacientes fueron diagnosticados con esclerosis múltiple
clínicamente definida mediante el criterio de Schumacher (1965)
confirmada mediante imagen de resonancia magnética de los cerebros
y el perfil inmunoquímico del CSF. Con el fin de ilustrar que en la
MS crónica progresiva el anti-MBP fue
persistentemente elevado durante largos períodos de tiempo, meses a
años, los pacientes recibieron punciones lumbares repetidas con
monitorización de anti-MBP F y B. En un paciente
con MS crónica progresiva, se observó que el autoanticuerpo
permaneció persistentemente elevado durante períodos tan largos
como 11 años y que no tuvo lugar el declive espontáneo de los
niveles de anti-MBP (Fig. 4 es un Ejemplo
ilustrativo).
Con el fin de determinar que los niveles
inicialmente elevados de anti-MBP del CSF
permanecieron relativamente constantes durante 24 horas, se
muestreó repetidamente cada 30 minutos durante un período de 2
horades el CSF de 2 pacientes (1F56 y 3M66) así como también 24
horas más tarde con seguimiento del anti-MBP F y B
(Fig. 5A y 5B, respectivamente). Los pacientes 1F56 y 3M66
sirvieron como "controles de tiempo". Los niveles de
anti-MBP F y B permanecieron constantemente elevados
cuando se muestreó el CSF cada 30 minutos durante 2 horas así como
también 24 horas más tarde.
Además se determinó semejantemente el efecto de
inocular 5 cc de disolución salina normal en el CSF en otros 2
pacientes (4M45 y 5M59; Fig. 5C y 5D, respectivamente). Estos
pacientes sirvieron como "controles de tiempo, disolución
salina". Cuando se inyectaron 5 cc de disolución salina normal
intratecalmente, los niveles de anti-MBP F y B
permanecieron elevados, a los niveles basales, cuando se muestreó el
CSF tal como anteriormente, demostrando que el "efecto de
dilución" sobre el anti-MBP fue despreciable.
Los niveles de anti-MBP se
determinaron mediante un radioinmunoensayo en fase sólida con
pocillos microtiter Immulon recubiertos de MPB humana. Los pocillos
microtiter Immulon se recubrieron con 100 \mul de 10 \mug/ml de
MBP (1 \mug/pocillo) y se incubaron durante la noche a 37ºC.
Después de bloquear con albúmina de suero bovino (BSA) y 3 lavados
con agua, los pocillos se almacenaron a temperatura ambiente. Las
muestras de 100 \mul de CSF o extracto de tejido diluidos a 0,010
gm de IgG/l (con 0,01 M disolución salina tamponada con Barbitol
(BBS) pH 6,9-7,1, 0,5% BSA y 0,05% Tween 20) se
incubaron en pocillos recubiertos de MBP durante entre 1 y 2 horas
a temperatura ambiente. Después de 5 lavados con tampón (con 0,01 M
BBS, 0,5 BSA y 0,05% Tween 20), los pocillos se incubaron con
IgG-Fc específica, de cabra contra ratón (en 0,01 M
BBS, 0,05% Tween 20, 0,5% BSA) durante 1 hora a temperatura
ambiente y a continuación se enjuagó como anteriormente. Finalmente,
se añadió ^{125}I-proteína A (o
^{125}I-proteína G) y se incubó durante 1 hora a
temperatura ambiente. Cuando se utilizó ^{125}I proteína G como
trazador, se reemplazó BSA por ovoalbúmina en el tampón y para
bloquear. Después de 3 lavados finales con agua los pocillos se
contaron individualmente. Los resultados se expresan como
radioactividad definida como: (cuentas de muestra - cuentas de
blanco)/(cuentas totales de radioactividad - cuentas del blanco).
Se contaron por decuplicado todas las muestras y el tiempo de
contaje fue de 10 minutos con el fin de recoger > 10.000 cuenta
en cualquiera de las muestras positivas.
Antes de ser ensayadas todas las muestras de CSF
y/o tejido se diluyeron a una concentración final de IgG de 0,010
g/l. El anti-MBP F se detectó directamente en el CSF
o en los extractos de tejido mientras que los niveles de anticuerpo
B se determinaron después de la hidrólisis ácida del los complejos
inmunes con tampón de glicina HCl a pH 2,2. La unión no específica
se realizó para cada muestra en pocillos no recubiertos. Con el fin
de detectar epítopos, primero se hicieron reaccionar péptidos
sintéticos con anticuerpo purificado en un ensayo competitivo en
fase líquida y a continuación se determinó el
anti-MBP en todos los sobrenadantes resultantes
mediante radioinmunoensayo. Los resultados de los ensayos de enlace
competitivo y los radioinmunoensayos se expresaron como porcentajes
de inhibición de péptido sintético definido como 100 - unidades de
radioactividad. Las muestras se realizaron por decuplicado y se
contaron durante 10 minutos cada una en un contador Minigamma
LKB1275. Se utilizó un combinado de anti-MBP
purificado de tejidos a 5 diluciones preestablecidas como controles
positivos. Se utilizó un combinado de CSF de pacientes con
enfermedades no neurológicas como control negativo. La
reproducibilidad en los ensayos fue de entre el 3 y 5% y la
variación entre ensayos fue inferior al 7%.
La persistencia del anti-MBP del
CSF a un nivel elevado y constante en los pacientes que participaron
como controles (control de tiempo y control de dilución) permitió la
siguiente etapa de esta investigación.
Se realizó un experimento de Fase 1 con el fin
de determinar el efecto del péptido sintético
MBP75-95 sobre los títulos de
anti-MBP F y B de CSF. A continuación de la
aprobación por parte del Research Ethics Board de la Universidad de
Alberta, este proyecto se realizó en pacientes con MS clínicamente
definida [Shumacher et al., Ann. N.Y. Acad. Sci.,
122:552-568 (1965)], gravemente disminuidos y
con enfermedad avanzad progresiva. Una vez obtenido el
consentimiento informado, 14 pacientes se hicieron voluntarios para
el estudio; 8 pacientes se seleccionaron con base en su título
inicial de anti-MBP F en el CSF (por encima de 8
unidades de radioactividad) (Tabla 2) para recibir una inyección
intratecal de péptido MBP75-95 que se unió a
anti-MBP in vitro o un péptido control no
enlazante MBP35-58 [Warren and Catz, 1993b]. El
experimento se realizó de modo doble ciego con el fin de que ni los
investigadores ni los pacientes tuviesen conocimiento de la
naturaleza del inóculo. Todos los péptidos se codificaron con un
número de 7 dígitos generados al azar por un médico independiente.
Los péptidos apareados se disolvieron en 5 cc de disolución salina
normal y mediante una punción lumbar se administraron en dosis
crecientes de 1, 2, 2,5 y 10 mg. Se muestreó el CSF antes de la
inyección (basal), a intervalos de 30 minutos durante 2 horas
después de la inyección, 24 horas más tarde y a continuación a
intervalos semanales durante entre 3 y 4 semanas hasta que los
niveles de anti-MBP regresaron al nivel basal. Se
determinó la cuenta de células, los niveles de proteína total,
glucosa, IgG y albúmina en todas las muestras de CSF obtenidas. Los
niveles de anti-MBP F y B se determinaron mediante
radioinmunoensayo, tal como se describió anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla 2: Datos clínicos y niveles de
anti-MBP en CSF de 14 pacientes de MS crónica
progresiva voluntarios para participar en un estudio de
investigación de Fase 1 de 1 inyección intratecal de péptidos de MBP
sintéticos. Debido a que fueron necesarios niveles inicialmente
elevados de anti-MBP F (> 8 unidades de
radioactividad) fue necesario, con el fin de alcanzar un cambio
post inyección significativo, solamente se seleccionaron 8 de los 14
pacientes para el estudio.
Todos los péptidos utilizados en este estudio se
sintetizaron bajo el código de "producto bien fabricado" (GMP)
utilizando el procedimiento Fmoc
(9-fluorenilmetoxicarbonil) de Procyon Inc. (London,
Ontario, Canada).
La pureza de los péptidos se comprobó mediante
cromatografía líquida de presión elevada en fase invertida mediante
una columna C18 y un gradiente de agua - acetonitrilo con 0,1% TFA.
La espectroscopia de masas y el análisis de aminoácidos se
realizaron mediante procedimientos estándar. Antes de la inoculación
se comprobó la pirogenicidad de todos los péptidos (Vancouver
General Hospital, Vancouver, Canada), la esterilidad (Provincial
Laboratory for Public Health for Northern Alberta, Edmonton, Canada)
y la toxicidad aguda (Health Sciences Laboratory Animal Services,
University of Alberta, Edmonton, Canada) y se declararon
"adecuados para la administración a seres humanos". Las
cantidades apropiadas de péptidos sintéticos codificados se
disolvieron en 5 cc de disolución salina normal estéril (0,9%
inyecciones de cloruro sódico USP, no pirogénica, Baxter Corp.,
Toronto, Canada), se filtraron dos veces a través de unidades de
filtro esterilizador de 0,22 \mum (Millex-GX,
Millipore Corp., Bedford, MA, USA) y se administraron en el CSF
mediante una punción lumbar.
\newpage
Los pacientes 6F53, 8M41, 4M45 y 1F56 recibieron
el péptido sintético MBP75-95 capaz de unirse al
anti-MBP in vitro y los pacientes 10F36,
13F43, 5M59 y 3M66 recibieron un péptido sintético no enlazante
MBP35-58 "control" en cantidades crecientes de
1, 2,5, 5 y 10 mg respectivamente (Fig. 6). En el paciente 6F53
(Fig. 6B) que recibió 1 mg de MBP75-95 a 75%, se
observó una disminución del 75% en anti-MBP F
seguida de su regreso inmediato al nivel basal; el paciente 8M41
(Fig. 6D) que recibió 2,5 mg de MBP75-95 mostró una
total neutralización-de enlace de
anti-MBP F seguida de su regreso al nivel basal en
24 horas; en el paciente 4M45 (Fig. 6F) que recibió 5 mg de
MBP75-95, se produjo una completa y precipitosa
neutralización-del enlace de
anti-MBP F que persistió durante 7 días, habiendo
regresado a su valor inicial cuando se muestreó 21 días más tarde;
el paciente 1F56 (Fig. 6H) recibió 10 mg de
MBP75-95 que también produjo la neutralización
completa-del enlace de anti-MBP F
que persistió durante 7 días y regresó al valor basal cuando se
muestreó 14 y 28 días más tarde. Los niveles unidos de
anti-MBP no se alteraron significativamente mediante
la inoculación intratecal de MBP75-95. En los
pacientes 10F38, 13F43, 5M59 y 3M66 que recibieron 1, 2,5, 5 y 10 mg
de péptido no enlazante MBP35-58 "control",
los niveles de anti-MBP F y B en el CSF
permanecieron sin cambiar desde el elevado nivel basal inicial
durante las 24 horas del experimento (Fig. 6A, 6C, 6E y 6G,
respectivamente). Los parámetros tradicionales de inflamación del
CSF en la MS, tales como la cuenta de células, los niveles absolutos
de proteína total, IgG y albúmina, enlace oligoclonal, índice IgG y
síntesis de IgG en el CNS permanecieron sin cambio antes y después
de la administración del péptido.
Se realizaron experimentos intrapaciente con el
fin de minimizar la variabilidad interpaciente. En el paciente 5M59
que fue o un "control de tiempo" o recibió 5 mg del péptido no
enlazante MBP35-58, los niveles de
anti-MBP F permanecieron elevados al nivel basal
durante los dos experimentos (Fig. 7A). El paciente 4M45 fue
inicialmente un "control de diluyente" y dos meses más tarde
recibió 5 mg de MBP75-95. Su
anti-MBP F permaneció constantemente elevado en
todas las muestras recogidas durante el experimento "diluyente"
y se hizo indetectable después de la administración de
MBP75-95 (Fig. 7B). Se obtuvieron resultados
semejantes en el paciente 1F56 que tuvo niveles de anticuerpo F
persistentemente elevados durante un experimento "control de
tiempo" y después de la administración de 10 mg de
MBP75-95 su anti-MBP F se hizo
indetectable (Fig. 7C). Se realizó un estudio completo en el
paciente 3M66. Los niveles de su anti-MBP F fueron
persistentemente elevados durante un experimento "control de
tiempo" o cuando se administraron 10 mg de
MBP35-58; sin embargo, cuando se inyectaron 10 mg de
MBP75-95, el anti-MBP F fue
neutralizado por completo y permaneció indetectable durante 7 días
(Fig. 7d).
Después de determinar que el péptido
MBP75-95 neutralizó el anti-MBP F
in vivo durante períodos superiores a 7 días, se eligió
inocular repetidamente 10 mg de MBP75-95 en el
fluido espinal a intervalos semanales de 10 semanas. Este
experimento se realizó en 3 pacientes diferentes de MS crónica
progresiva que no habían participado en el proyecto de inyección de
un solo péptido y que fueron voluntarios para este estudio. Se
determinó anti-MBP F y B entre 1 y 2 semanas antes
de la primera inoculación, antes y 30 minutos después de dada una de
las 10 inyecciones y otra vez 1 mes después de la última inyección.
Las cuentas de células, proteína total, glucosa, niveles de IgG y
albúmina se determinaron en todos los CSFs obtenidos antes cada una
de las 10 inyecciones. Antes de la primera y después de la última
inyección se obtuvo sangre y se analizó para determinar
electrolitos, creatinina, enzimas cardíacos y hepáticos y el panel
hematológico.
Cuando los pacientes de MS con enfermedad
crónica progresiva recibieron inyecciones intratecales repetidas de
10 mg de MBP75-95 a intervalos semanales, durante
períodos de hasta 10 semanas, su inicialmente elevado
anti-MBP F fue indetectable mientras se administró
el péptido; cuando se dejó de administra el péptido, el
anti-MBP F volvió a los niveles basales en 1 mes
(Fig. 8). Los títulos de anticuerpo B permanecieron constantemente
elevados durante el experimento lo que sugiere que en estos
pacientes la síntesis de anti-MBP continua y la
administración intratecal de péptido produce solamente un "efecto
secante" del anti-MBP F.
Los pacientes que recibieron o una sola
inyección de péptido sintético o repetidas inyecciones semanales
tuvieron esclerosis múltiples crónica progresiva con un avanzado
grado de invalidez neurológica. Ninguno de estos pacientes reportó
empeoramiento de sus síntomas neurológicos o exacerbación de la MS
después de la administración intratecal del péptido y no se
desarrollo una respuesta celular en el CSF. Los pacientes de MS que
recibieron inoculaciones repetidas de MBP75-95 han
sido seguidos para detectar complicaciones sistémicas, comprendiendo
cambios en electrolitos así como también disfunciones cardíacas,
hepáticas, renales y cambios hematológicos y no tuvo lugar
complicación adversa alguna.
No se observaron efectos adversos.
A continuación de determinar que la
administración intratecal del péptido MBP75-95
produjo la completa neutralización de enlace de
anti-MBP F sin cambio en los niveles de anticuerpo
B, se decidió determinar el efecto de la administración intravenosa
del mismo péptido sobre los títulos de anti-MBP F y
B en el CSF; Se disolvieron 500 mg de MBP75-95 en
100 cc de disolución salina normal y se inyectaron intravenosamente
durante 30 minutos en el paciente 8M41 con seguimiento del
anti-MBP del CSF cada 30 minutos durante las
primeras 2 horas, 18 horas más tarde así como a los 10, 16 y 30
días más tarde. Se obtuvo sangre antes de la inyección así como
entre 16 y 30 días después y se analizaron los electrolitos,
creatinina, enzimas cardíacos y hepáticos y el panel hematológico.
El fluido espinal se siguió para determinar la cuenta de células,
proteína total, glucosa, niveles de IgG y albúmina, No se observaron
efectos adversos.
Tal como se muestra en la Fig. 8, la
administración intravenosa de 500 mg de MBP75-95 no
produjo cambio alguno en los títulos de los niveles de
anti-MBP F y B del CSF en las primeras 2 horas. Se
observó una disminución del 30% en el anti-MBP F
del CSF 18 horas más tarde. Cuando se re-muestreó
10, 16 y 30 días más tarde tanto anti-MBP F como B
habían disminuido de su nivel inicial de 11 unidades de
radioactividad a 4, 2 y 1 unidades de radioactividad,
respectivamente.
Una observación repetida en todos los pacientes
tratados intratecalmente con MBP75-95 fue la
persistencia de niveles elevados de anticuerpo unido, mientras que
el anti-MBP F se hizo indetectable en un modo
dependiente de la dosis. Esto sugiere que la síntesis de
autoanticuerpos a MBP permanece activa durante y a continuación de
la administración intratecal de MBP75-95. Como
consecuencia de esta observación, se administró
MBP75-95 intravenosamente a un paciente que
anteriormente recibió una sola inyección intratecal del péptido.
Después de de la administración intravenosa los niveles de
anti-MBP F como B en el CSF mostraron una
disminución significativa cuando se monitorizaron durante períodos
de hasta 1 mes. La disminución de los niveles de
anti-MBP F y B en el CSF después de la
administración intravenosa de MBP75-95 sugiere que
esta ruta de administración produce regulación negativa del proceso
inflamatorio autoinmune responsable de la síntesis de
anti-MBP. En un estudio de seguimiento hasta la
fecha los niveles de anti-MBP empezaron a aumentar
entre 4 y 6 meses después de la primera inyección intravenosa; una
segunda inyección intravenosa del mismo péptido (amplificador)
produjo la regulación negativa de la síntesis de
anti-MBP de hasta 2 años en aproximadamente 70
pacientes diferentes con MS crónica progresiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de localizar todavía más el epítopo
de MBP para el anti-MBP de MS,
anti-MBP F y B purificado mediante cromatografía de
afinidad del CSF y de tejido cerebral de MS [Warren, K.B. et al.,
Ann. Neurol. 35:280:289 (1994)] se hicieron reaccionar en
ensayos de inhibición competitiva con 41 péptidos sintéticos
consecutivos de MBP de la misma longitud (cada uno de ellos de 10
residuos y solapándose en 9 con los adyacentes) cubriendo la zona
entre los residuos 61 y 110 de la MBP humana. El péptido(s)
que produjo máxima inhibición se consideró ser el más asociado al
lugar de unión con el anticuerpo.
La máxima inhibición (\geq 80%) tanto del
anti-MBP F como del B purificados de tejido cerebral
de MS (Fig. 10) se produjo mediante cuatro decapéptidos, a saber
MBP84-93, MBP85-94,
MBP86-95 y MBP87-96 lo que sugiere
que el epítopo de la MBP para el anti-MBP de la MS
se encuentra entre los residuos 84 y 96. La zona mínima de residuos
de aminoácidos comunes se encuentra entre los residuos 87 y 93. El
anti-MBP B tuvo un rango más restringido que el
anticuerpo F.
La función de los anticuerpos
anti-MBP en la patogénesis de desmielinización en la
MS no se ha descubierto y solamente se puede determinar mediante la
modulación del anti-MBP en vivo seguido de la
observación de los resultados clínicos y patológicos. Por ejemplo,
durante una recaída de MS aguda, cuando la proporción de los
anticuerpos F/B es superior a la unidad se podría inocular
intratecalmente un péptido que se conoce que se une al
anti-MBP F, con el fin de que se una al anticuerpo
libre circulante y termine los efectos clínicos de la recaída
aguda; podrían ser necesarias administraciones semanales hasta que
tenga lugar la remisión. En los pacientes de MS con enfermedad
crónica progresiva y recaídas agudas superpuestas, podría ser
necesaria la administración intratecal además de la administración
intravenosa con el fin de regular negativamente los mecanismos
inflamatorios que producen anti-MBP.
\vskip1.000000\baselineskip
(Ejemplo de
referencia)
Las recaídas de MS se encuentran asociadas a
proporciones de anti-MBP F/B superiores a 1,0 debido
al nivel superior de anticuerpo libre sobre el unido en el CSF.
Generalmente, durante un período de 3 meses, a medida que la
recaída entra en la siguiente fase de recuperación/remisión, los
niveles de anti-MBP F decrecen gradualmente, y
cuando la remisión biológica es completa, anti-MBP F
y B en el CSF generalmente se hacen indetectables.
Los pacientes que participaron en los siguientes
ejemplos tuvieron MS con recaída-remitente o
recaída-progresiva.
En este y los siguientes Ejemplos se utilizó
tanto el pMBP86-95 como el
pMBP82-96. PMBP86-95 es muy poco
soluble en disolución salina normal ya que contiene 4 residuos
hidrófilos y 6 residuos hidrófobos. Por otra parte,
pMBP82-96 tiene una solubilidad normal en disolución
salina, como resultado de los 5 residuos hidrófilos adicionales.
Se estudiaron 2 pacientes con el fin de
determinar la dosis adecuada de pMBP86-95 o
pMBP82-98 administrados intratecalmente, que reduce
inmediatamente el anti-MBP F a un nivel
indetectable. Un paciente sufrió una recaída aguda con ataxia en el
paso y desequilibrio troncal. Al comienzo del ataque, este paciente
recibió una sola inyección intratecal de 10 mg de
pMBP86-95; los niveles de anti-MBP F
y B se midieron antes y 1 hora después de la inyección y 5 veces
más durante los siguientes 3 meses. Esta dosis suprimió el
anti-MBP F solo parcialmente y la curva de
recuperación del anticuerpo siguió de cerca el curso natural; este
paciente continuó teniendo paraparesis espástica progresiva y
ataxia. Se concluyó que una sola inyección intratecal de 10 mg de
pMPB86-95 no era adecuada para suprimir
completamente el anti-MBP F y alterar su velocidad
de recuperación natural.
En el otro paciente, una mujer de 18 años, con
neuritis oftálmica aguda que recibió una sola inyección intratecal
de 50 mg de pMBP86-95, se midieron los niveles de
anticuerpo F y B antes y 30 minutos después de la inyección.
Treinta minutos después de la inyección el anticuerpo F se hizo
indetectable. El paciente no estuvo de acuerdo con punciones
lumbares posteriores. Se concluyó que son necesarias dosis
superiores a 50 mg con el fin de enlazar y neutralizar el
anti-MBP F en el CSF durante por lo menos 30
minutos.
(Ejemplo de
referencia)
En este ejemplo se determinó la frecuencia y
duración de la administración de pMBP que debería mantener bajo o
indetectable el nivel de anticuerpo F durante un período de tiempo
más largo. Los 4 pacientes estudiados en este grupo recibieron
péptidos sintéticos en una semana después del comienzo de un
ataque.
Los dos primeros pacientes tuvieron ataques
agudos de neuritis oftálmica unilateral. Uno de estos pacientes
(Figura 11a) recibió intratecalmente dos inyecciones de 50 mg de
pMBP86-95 (it#1, it#2) separadas por 4 semanas.
Después de cada inyección el anti-MBP F se hizo
indetectable en 1 hora. Cuando se midió 1 semana después de la
primera inyección el anti-MBP F estaba elevado, y 4
semanas más tarde el anticuerpo F era significativamente elevado.
En ese momento el pacienta recibió una segunda inyección intratecal
(it#2) y el anti-MBP F se hizo indetectable después
de 30 minutos pero no se siguió más allá de las 24 horas. Se
concluyó que esta frecuencia era inadecuada y que podrían
necesitarse múltiples inyecciones durante la primera semana después
de un ataque con el fin de mantener niveles despreciables de
anticuerpo.
El segundo paciente con neuritis oftálmica
unilateral completa recibió múltiples inyecciones de péptido
intratecales de 50 mg de pMBP82-98 durante la
primera semana de su ataque: 4 inyecciones diarias (Figura 11b:
it#1, it#2, it#3, it#4) y un quinta inyección (it#5) una semana más
tarde. El perfil de anti-MBP de este paciente mostró
un continuo, rápido declive durante un período de 7 días. Más
importantemente, 7 semanas y 6 meses después de it#5, los niveles
de su anti-MBP en el CSF permanecieron indetectables
y el paciente no experimentó recurrencia de la neuritis oftálmica u
otro tipo de recaída de MS. Además, se recuperó por completo de la
ceguera unilateral secundara a la neuritis oftálmica.
A continuación se administró el mismo protocolo
de inyecciones intratecales diarias de 50 mg de
pMBP82-98 a los pacientes de MS con diferentes
tipos de recaída mono-sintomática. La Figura 11c
ilustra el perfil de anti-MBP de un paciente con
pseudoaterosis aguda de la mano izquierda, que recibió 5 inyecciones
intratecales diarias de 50 mg de pMBP82-98 (it#1,
it#2, it#3, it#4, it#5) en la segunda semana del ataque. Los niveles
de anticuerpo F declinaron hasta un valor indetectable en 4 días y
permanecieron indetectables cuando se ensayaron 11 días y un mes
más tarde. Este paciente recuperó consistentemente la función de su
mano izquierda de modo que pudo conducir su motocicleta y tocar la
guitarra.
El último paciente tuvo un ataque agudo de
hemiplejía lateral izquierda superpuesto a una MS crónica
progresiva. Este recibió 4 inyecciones intratecales de 50 mg de
pMBP86-95 cada 2 o 3 días. Se midió el
anti-MBP antes y 30 minutos después de cada
inyección (Fig. 11d: it#1, it#2, it#3, it#4) y 10 días después de la
primera inyección. Los niveles inicialmente elevados de
anti-MBP F se hicieron indetectables en 7 días, a
los que el paciente volvió clínica y bioquímicamente a su estado
inicial crónico progresivo, y poco después recibió intravenosamente
400 mg de pMBP86-95. Esto suprimió el nivel de su
anticuerpo unido durante 4 meses después de la inyección i.v.. Sin
embargo, después de la última punción lumbar a los 8,5 meses después
de la inyección intravenosa, la enfermedad había regresado al patrón
crónico progresivo tanto clínica como bioquímicamente.
(Ejemplo de
referencia)
Los mismos péptidos de MBP se inyectaron en
pacientes con ataques polisintomáticos con afección de diferentes
zonas del CNS. Este grupo comprendió 3 pacientes: uno con enfermedad
remitente con recaídas y dos con enfermedad progresiva con
recaídas.
El primer paciente tuvo múltiples exacerbaciones
polisintomáticas graves. Durante la primera semana de la recaída
recibió 3 inyecciones de 50 mg de pMBP86-95 en los
días 1, 3 y 7 (Fig. 12: it#1, it#2 e it#3). Se midió el
anti-MBP antes de cada inyección y 30 minutos
después. Después de recibir estas 3 inyecciones el
anti-MBP F quedó suprimido a niveles casi
indetectables. Cuando se midió un mes más tarde, el
anti-MBP F había subido y a los 1,5 meses, la
recaída era otra vez clínicamente activa y confirmada
bioquímicamente. En el momento en el que el paciente recibió un
segundo grupo de 4 inyecciones intratecales de 50 mg de
pMBP86-95 los días 45, 48, 49 y 50 de la recaída
(it#4, it#5, it#6 e it#7). El anti-MBP se midió
antes y 30 minutos después de cada inyección y 3 veces más durante
los 2 meses siguientes. Una vez más, se suprimió el
anti-MBP F durante por lo menos 2 semanas, pero el
paciente recayó de nuevo y en ese momento su nivel de anticuerpo F
regresó a los niveles iniciales anteriores a la recaída. Se requiere
claramente una administración intratecal más sostenida del péptido
sintético, con el fin de mantener niveles bajos/indetectables de
anti-MBP F durante períodos de tiempo más
largos.
El segundo paciente tenía MS progresiva
recurrente (Fig. 13). Inicialmente en la forma progresiva (F = B),
recibió 500 mg de pMBP86-95 intravenosamente
((IV#1). Aunque los niveles de anticuerpos F y B disminuyeron algo
después de 1 mes, a las 9 semanas después de la inyección i.v., el
paciente experimentó una recaída clínica polisintomática asociada
con un nivel de anti-MBP F muy incrementado. En este
momento, recibió 3 inyecciones intratecales de 50 mg de
pMBP86-95 (it#1, it#2 e it#3) en los días 1, 3 y 12
de la recaída y se midió el anti-MBP antes, 30
minutos, 24 horas después de la primera y tercera inyección. Cuando
se examinó un mes más tarde, el paciente había regresado a su
estatus inicial clínico y bioquímico de paraparesis espástica
progresiva cuando, en 2 semanas, recibió una segunda inyección
intravenosa de 500 mg de pMBP86-95 (IV#2). Hasta la
fecha los niveles de anti-MBP F y B seguidos
serialmente durante los siguientes 26 meses permanecieron suprimidos
en comparación con los niveles basales. Su capacidad para mantenerse
de pié y andar mejoró sustancialmente.
El último paciente en este grupo con MS,
inicialmente en la fase progresiva (F = B), (Fig. 14), recibió 500
mg de pMBP86-95 intravenosamente (IV#1). Se midió el
anti-MBP del CSF después de 9 días, y después
mensualmente durante 2 meses y 4,5 meses después de IV#1. Después
de esta inyección, los niveles de anti-MBP F y B se
suprimieron durante 2 meses; 4,5 meses después de IV#1, el paciente
se quejó de debilidad creciente, confirmada clínica y
bioquímicamente mediante un incremento de los niveles de anticuerpo
compatible con enfermedad crónica progresiva. En los meses
siguientes recibió una segunda inyección intravenosa de 500 mg de
pMBP82-98 (IV#2). El análisis de las muestras de
CSF extraídas justo antes de la segunda inyección, fue sugestivo de
un patrón de recaída aguda (F > B), y al día siguiente, el
paciente desarrollo diplopia aguda debida a una paresis del rectus
lateral izquierdo. En este momento estaba claramente experimentando
clínica y bioquímicamente una recaída aguda, que persistió durante
los siguientes 4,5 meses y se caracterizó por un grave desequilibrio
de la postura y paso, debilidad de las piernas y visión doble. En
un esfuerzo para disminuir su elevado anti-MBP F,
este paciente recibió dos tratamientos intratecales de
pMBP82-98. Durante el primer tratamiento iniciado
4,5 meses después del comienzo de la recaída, recibió 50 mg de
pMBP82-98, diariamente durante 5 días (it#1, it#2,
it#3, it#4 e it#5) y los niveles de anti-MBP
medidos antes y 30 minutos después de cada inyección permanecieron
razonablemente elevados. Ya que la recaída persistía y era
gravemente debilitante, se decidió administrar un segundo
tratamiento adicional con una dosis de péptido más elevada y con
mayor frecuencia, y el paciente recibió 100 mg de
pMBP82-98 dos veces diarias durante dos días (día 19
y 20:it#6, it#7, it#7, it#8 e it#9). Se midió el
anti-MBP antes y 30 minutos después de cada
inyección. Después de este incremento en dosis y frecuencia, el
anti-MBP F se redujo a niveles despreciables y
cuando se ensayó una semana más tarde (día 28) su perfil CSF fue
compatible con una enfermedad lentamente progresiva
(ant-MBP F/B = 1). En este momento el paciente
recibió una tercera inyección intravenosa de 500 mg de
pMBP82-98 (IV#3) que no produjo una regulación
negativa adicional de la producción de anti-MBP.
\vskip1.000000\baselineskip
(Ejemplo de
referencia)
Dos pacientes con MS
recurrente-progresiva, que había sufrido recaídas
frecuentes se inyectaron intravenosamente, con
pMBP86-95 o pMBP82-98 con el fin de
determinar si esta ruta de administración evitaría futuros
ataques.
El primer paciente estaba experimentando entre 2
y 3 recaídas por año durante 4 años, que producían una paraparesis
espástica progresiva en etapas (Fig. 15). Recibió dos inyecciones
intravenosas separadas por 6 meses, una de 400 mg de
pMBP86-95 (IV#1) y la segunda de 400 mg de
pMBP82-98 (IV#2); el seguimiento clínico y el
análisis del CSF se realizó mensualmente. La Figura 15 muestra los
niveles de anti-MBP durante un período de 9 meses
(área superior enmarcada). La primera inyección intravenosa regulo
negativamente la síntesis de anti-MBP durante 2
meses. Durante el tercer mes post inyección, este paciente
experimento una recaída clínica; desgraciadamente no se obtuvo el
CSF en ese momento. Durante los siguientes 2 a 3 meses, después de
la resolución de la recaída la enfermedad entró en una fase
progresiva crónica, este paciente recibió la segunda inyección
intravenosa (IV#2). Los niveles de anti-MBP en el
CSF se suprimieron durante 2 meses pero 3 meses después de la
segunda inyección, el paciente sufrió otra recaída asociada con un
anti-MBP F notablemente elevado. De modo semejante
a la velocidad de recaída que sufrió en los 4 años anteriores, este
paciente continuó experimentando entre 2 y 3 recaídas por año a
pesar de recibir dos inyecciones intravenosas de
pMBP86-95 y pMBP82-98.
Un segundo paciente (Fig. 16) que experimentó
entre 1 y 4 recaídas agudas por año durante los 10 años anteriores
(escala superior) estuvo gravemente inválido, parapléjico y
confinado a una silla de ruedas. Durante el onceavo año el paciente
experimentó de nuevo 4 recaídas (área superior enmarcada), a pesar
de recibir péptidos sintéticos de MBP intratecalmente e
intravenosamente. Durante la primera recaída, después de recibir dos
inyecciones intratecales de 50 mg de pMBP86-95 el
día 1 y el día 6 (it#1, it#2) su nivel de anti-MBP F
se redujo sustancialmente; el día 6 también recibió 300 mg
intravenosos de pMBP86-95 (IV) que a continuación
suprimió tanto el anticuerpo F como el B durante los siguientes 3
meses. Cuatro meses después de la inyección intravenosa, este
paciente experimentó otra recaída clínica que continuó empeorando
con el tiempo: los niveles de anticuerpo en el CSF eran muy
elevados, y 6,5 meses después de la inyección IV el paciente recibió
un tratamiento de 4 inyecciones diarias de 50 mg de
pMBP82-98 (it#3, it#3, it#5 e it#6), que fracasaron
en reducir los niveles de anticuerpo F y no resolvieron la recaída
clínica.
\vskip1.000000\baselineskip
(Ejemplo de
referencia)
En estudios iniciales, se administraron péptidos
sintéticos de MBP a 8 pacientes de MS crónica progresiva. Los
pacientes recibieron intratecalmente o un péptido de MBP enlazante
MBP(75-95) o un péptido control no enlazante
MBP (35-58) en dosis crecientes desde 1 a 10 mg en 5
ml de disolución salina; los 4 pacientes que inicialmente
recibieron el péptido control no enlazante
(MBP35-58) recibieron después el péptido enlazante
MBP(75-95).
La inyección de
MBP(75-95) en el CSF produjo una
neutralización transitoria de los anticuerpos F específicos de MBP;
los autoanticuerpos de MBP unidos no fueron afectados. La duración
del efecto fue de 1 hora (1 mg de péptido), 24 horas (2,5 mg de
péptido) o 7 días (5-10 mg de péptido). Ya que el
efecto de la administración intratecal de péptido fue incompleto
(el anti-MBP B permaneció elevado) y de una vida
relativamente corta, esta vía de administración se comparó con la
inyección intravenosa. Contrariamente a la administración
intratecal, tanto los autoanticuerpos a MBP libres como unidos se
hicieron indetectables un mes después de una sola inyección
intravenosa de 500 mg de MBP(75-95) y
permaneció a un nivel bajo durante 3 meses y después de una
inyección de amplificación durante hasta 26 meses (Fig. 17). Se
hicieron observaciones semejantes hasta la fecha en aproximadamente
70 pacientes con MS crónica progresiva que fueron inyectados
intravenosamente con péptidos de MBP enlazantes tales como
MBP75-95, MBP86-95,
MBP82-98. Se eligió una dosis de 500 mg (5 mg/kg
peso corporal) en entre 10 y 50 ml de disolución salina normal,
debido al mayor volumen de la sangre en comparación con el CSF
(factor 15) y la rápida eliminación de péptidos de la corriente
sanguínea a través de los riñones; no se administraron
intratecalmente dosis de péptido correspondientes a las dosis
administradas intravenosamente debido a que su volumen no se podría
administrar en el CSF. En resumen, la administración intratecal, en
el rango de dosis ensayado en estos pacientes, produjo un efecto
"absorbente" transitorio del anti-MBP F
solamente, contrariamente a la inyección intravenosa que reguló
negativamente la síntesis de anti-MBP, una sola
inyección indujo tolerancia de larga duración.
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(Ejemplo de
referencia)
Sobre la base de estos resultados, se examinó la
cinética de la tolerancia a MBP hasta la fecha en 70 pacientes de
MS crónica progresiva que se siguieron durante un período de 2 años
después de múltiples inyecciones intravenosas de
MBP(75-95), MBP(86-95)
o MBP(82-98). Los péptidos se dosificaron a
entre 5 y 6 mg/kg de peso corporal (256 a 500 mg) y se inyectaron
intravenosamente en entre 10 y 50 ml de disolución salina. Antes de
la administración intravenosa de los péptidos, los 13 pacientes
tuvieron niveles elevados de anticuerpos a MBP tanto de libres como
de unidos en el CSF (Fig. 18, Tabla 3). Un mes después de la
administración de los péptidos, los anticuerpos específicos a MBP
se hicieron esencialmente indetectables y permanecieron a un nivel
bajo generalmente entre 3 y 4 meses, tiempo en el que los niveles
de anticuerpo comenzaron a subir de nuevo; algunos regresando a los
niveles iniciales a los 8 meses. Entre 6 y 8 meses después de IV#1,
todos los pacientes recibieron una inyección de amplificación
(IV#2) de entre 275 y 500 mg (5 a 6 mg/kg de peso corporal) de
MBP(82-98) en 10 ml de disolución salina
(IV#2). El péptido más largo elegido para la segunda inyección fue
más soluble y se pudo disolver y administra en un volumen menor. En
este grupo, en conjunto, los niveles de anti-MBP en
el CSF disminuyeron dramáticamente en entre 6 semanas y 2 meses
desde la inyección y permanecieron indetectables durante un período
de tiempo más largo (hasta 26 meses). De entre todo el grupo de
aproximadamente 70 pacientes, uno fue incapaz de completar el
estudio debido a una embolia pulmonar y siguiente terapia
anticoagulante que impidió posteriores punciones lumbares y otro se
excluyo del seguimiento debido a haber recibido una dosis elevada
de corticoesteroides. Individualmente, de los aproximadamente 70
pacientes, aproximadamente 63 tuvieron niveles de
anti-MBP indetectables, entre 18 y 26 meses después
de la inyección de amplificación.
Los haplotipos HLA-DR de los
pacientes de MS se determinaron mediante tipaje molecular del ADN
genómico (Tabla 3). Cuatro de los 11 pacientes que completaron el
estudio fueron portadores del haplotipo DR2 asociado a la
enfermedad (DRB1*1501 o DRB1*15021); todos estos pacientes tuvieron
niveles de autoanticuerpos bajos o indetectables un año después de
la inyección intravenosa de péptidos de MBP. El péptido de MBP se
une con igual afinidad al HLA-DR2 y es
inmunodominante para las células T específicas a MBP restringidas a
HLA-DR2. HLA-DR4 (DRB1*0401) y
HLA-DR7 (DRB1*0701) se unen al péptido MBP que se
administró; no se han realizado estudios de enlace para las
moléculas DR del paciente k(M) (DRB1*0407, DRB1*0801). El
péptido MBP no se une a HLA-DR3 (DRB1*03011); 2
pacientes que tuvieron anti-MBP elevado al final del
estudio eran portadores del haplotipo DRB1*03011 (Tabla 3). Estos
datos indican que la duración de la tolerancia a MBP depende del
haplotipo HLA-DR del paciente. La tolerancia puede
ser más prolongada cuando se hacen tolerantes tanto las células T
como las B específicas a MBP.
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Haplotipo HLA-DR de 11 pacientes
de MS que completaron 1 año de seguimiento constituyen la inyección
intravenosa de péptido (IV#2). Todos los pacientes con haplotipo
HLA-DR2 (DRB1*1501 o DRB1*15021) tuvieron niveles
bajos de autoanticuerpos un año después de IV#2.
\vskip1.000000\baselineskip
La vía óptima de administración de péptido se
investigó todavía más mediante inyecciones subcutáneas de
MBP(82-98) en disolución salina en un grupo
de 33 pacientes de MS. En 26 pacientes de MS, cantidades crecientes
(1-100 mg) en una sola inyección subcutánea de
MBP(82-98) no afectó los niveles de
autoanticuerpos a MBP en el CSF (datos no mostrados); ocho de estos
pacientes a continuación recibieron una inyección intravenosa de
péptido y en dos meses los niveles de anticuerpo en el CSF se
hicieron indetectables (Tabla 4A). En cinco pacientes, una dosis
total entre 900 y 1000 mg (5 x 100 mg, diaria durante 5 días
consecutivos, seguido de otra inyección subcutánea de 400 o 500 mg)
solamente produjo una modesta disminución de los niveles de
anticuerpo a MBP en el CSF (Tabla 4B). Con el fin de examinar si un
diferente programa de administración sería más efectivo, dos
pacientes recibieron dos inyecciones subcutáneas de 250 mg de
MBP(82-98) separadas por un mes (Tabla 4C).
Otra vez, los niveles de autoanticuerpos no fueron afectados. En
conjunto, estos datos demuestran que solamente la administración
intravenosa del péptido de MBP induce una tolerancia de larga
duración a MBP a las dosis de péptido ensayadas en este estudio.
A. Ocho pacientes recibieron una sola inyección
subcutánea de MBP(82-98)
(5-100 mg en 1-5 ml disolución
salina) que no tuvo efecto sobre los niveles de autoanticuerpos a
MBP. Por el contrario, una sola inyección intravenosa
(400-500 mg) del mismo péptido administrado 4,5 a 8
meses más tarde produjo niveles de autoanticuerpo en el CSF
indetectables.
B. Las inyecciones subcutáneas repetidas de
dosis elevada de MBP(82-98) (100 mg/día
durante 5 días consecutivos) tuvieron un efecto modesto en los
niveles de anticuerpo a MBP en el CSF; una dosis adicional elevada
(400 a 500 mg) de MBP(82-98) administrada
subcutáneamente dos semanas después del primer conjunto de
inyecciones no redujo más los niveles de autoanticuerpos.
C. Dos inyecciones subcutáneas de dosis elevada
de MBP(82-98) (2 x 250 mg, intervalo de un
mes) no tuvieron efecto sobre los autoanticuerpos a MBP en el CSF.
Todo junto, estos datos demuestran que solamente la vía intravenosa
de administración es efectiva para inducir tolerancia a MBP.
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<110> Los gobernantes de la Universidad de
Alberta
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la determinación
de la actividad terapéutica de un fragmento de MBP
\vskip1.000000\baselineskip
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<160> 1
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<170> PatentIn versión 3,1
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<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (3)
1. Procedimiento destinado a predecir la
eficacia terapéutica del tratamiento de un paciente de esclerosis
múltiple con un péptido de fórmula:
Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr
que comprende la selección in
vitro del paciente de esclerosis múltiple para determinar la
presencia del haplotipo (HLA)-DR2 del antígeno
leucocitario, en el que la presencia del haplotipo
HLA-DR2 predice la eficacia terapéutica del
tratamiento con el
péptido.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el haplotipo HLA-DR2 comprende DRB1*1501
o
DRB1*15021.
DRB1*15021.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el paciente sufre esclerosis múltiple
crónica progresiva.
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