UA60331C2 - Спосіб лікування розсіяного склерозу - Google Patents

Abstract

Описано спосіб лікування розсіяного склерозу шляхом введення хворому внутрішньовенно, внутрішньооболонково або у комбінації ефективної кількості фрагмента пептида основного мієлінового білка за формулою Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lle Val Thr Pro Arg Thr, включаючи заміни або делеції в цьому фрагменті.

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується деяких поліпептидів і їх використання для імунорегуляції антитіл до мієлінового 2 основного білка людини. Винахід також стосується нових фармацевтичних композицій, що містять згадані поліпептиди, і способу використання цих поліпептидів для лікування розсіяного склерозу.

Розсіяний склероз (М5) - це багатоосередкове демієлінізаційне захворювання центральної нервової системи (ЦНС) людини, пов'язане із запаленням. Ознакою розсіяного склерозу є підвищений синтез дсС в межах гематоенцефалічного бар'єру (іпіга-ВВВ) (ТоигіеіоцЦе, МУ.МУ., 9У. МецйгоЇ! Зсі 10: 279-304, 1970; ГіпК, Н. Апа 70 Тірріїпо, б. Зсапа. 9. Сіп. гар Іпмеві 37: 397-401, 1977; ТоцпеюоЦе, МУ. МУ. апа Ма, В., Мецгоіоду 28: 76-83, 1978; УУаївй, У. М. апа ТошцгіеіюоЦе, МУЛМУ., Іп: Наїйріке, У. Р. Адате, С. МУ. М. апа ТоцгіеіоЦНе, МУ. МУ., еав.

Мийіріе Зсіеговізв. Вайітоге. ММШіатве 5 УМіКіп5, 1982: 275-358; апа МУаітеп. К. б., апа Са, 1. Апп Мешгої 17: 475-480, 1985).

Вироблення ІдсС в межах ВВВ, в основному, підвищується у пацієнтів із клінічно визначеним фактом захворювання на розсіяний склероз (Зспитаснпег, с.А., Веере, О., Кіріег К.Е., ей а. Апп ММ Асай Зсі 15: 266-272, 1965) як у випадку активної, так і прихованої форми захворювання. Специфічність більшості Ід ЦнНеС невідома. Тоді як невеличка їхня частина має антивірусну активність або вступає у взаємодію з антигенами мозку, нуклеїновими кислотами, еритроцитами або антигенами гладкої мускулатури, інші неспецифічні дО можуть бути задіяні в поліклональній активації В-клітин (Тоигіеойе, УУ.МУ., апа Ма, В., Мепгоіоду 28: 76-83, 1978). Протягом останнього десятиліття спостерігається значний інтерес до вивчення антитіл, специфічних до мієлінових білків.

Слідом за виявленням імунних комплексів, що циркулюють, які містять мієліновий основний білок (МБР) у якості антигенного компонента (ЮОаздиріа, М. К. Саї;, І, МУатеп, К. О., еї а), Сап. 9. МеийгоїЇї. Зсі. 10: 239-243, 1983), були виявлені підвищені титри антитіл до МВР (апіі-МВР) у спинномозковій рідині (СЕ) хворих с з активною формою розсіяного склерозу (УМаттеп, К. б., апа Саїт, І. Апп Меицго! 209: 20-25, 1986). Клінічна Ге) картина характеризується фазами активного захворювання, такими як гострі рецидиви або хронічний плин, і фазами клінічної ремісії Для активної форми розсіяного склерозу характерні підвищені рівні внутрішньооболонкових анти-МВР (УУаїтеп, К. О., апа Саї7, І, Апп Мейго! 209: 20-25, 1986, апа Саїл, І., апа

МУагтеп, К. б., Сап у. Мецйго! Зсі. 13: 21-24, 1986). Ці антитіла виявляються переважно у вільній (Р) формі під -- час гострих рецидивів і переважно у зв'язаній (В) формі - коли хвороба непомітно прогресує (Умаїтеп, К. 0., со апа Саїл, І., Апп Мешйгої 209: 20-25, 1986). Під час гострих рецидивів титри анти-МВР у спинномозковій рідині відповідають активному розвитку захворювання (УУагтеп, К. б., апа Саїт, І., Апп Меицгої 21: 183-187, 1987). Ше

Рівні анти-МВР також підвищуються у хворих із першими приступами оптичного невриту й у більшості хворихіз «3 початковими стадіями розсіяного склерозу (МУагтеп, К. О., Сай, І, апа Вацег, С., Апп МеицгоЇ! 23: 297-299, 325 1988; УУаїтеп, К., б., апа Сай, І., У Мешгої! 5сі. 91:143-151,1989). ке,

Тривалі дослідження кінетики рівнів антитіл до МВР у С5Е у пацієнтів, що знаходяться на стадії видужання після гострого рецидиву, показали поступове падіння титрів анти-МВР у вільній ЕЕ формі з відповідним пропорційним підвищенням В фракцій, тобто анти-МВР у зв'язаній формі (УУагтеп,К.о., апа Саї?, І., 9. Меиго). «

Зсі. 91: 143-151, 1989; МУУатеп,К.б., апа Саї», І., 9. МеигоЇ. Зсі. 88: 185-194, 1988). На стадії ремісії З анти-МВР у СЕ можуть не виявлятися, що дозволяє припустити, що нейтралізація анти-МВР зв'язана з с неактивною стадією захворювання М (Ууаїтеп, К. б., апа Сай, І., У. Мешго! 5сі. 88: 185-194, 1988). Навпаки,

Із» М5, що хронічно прогресує і характеризується постійним збільшенням вироблення анти-МВР протягом тривалого часу, зв'язаний з інгібуванням нейтралізації анти-МВР (УУагтеп, К. 0., апа Саїл, І., У. Мешго! 5бві. 88: 185-194, 1988). Нещодавно в Ідб-фракцм, отриманої у СЗЕ хворих на М5, були ідентифіковані антитіла до основного мієлінового білка і, у тому числі, анти-МВР, антитіла, що нейтралізують анти-МВР, і антитіла, що

Ме гальмують нейтралізацію анти-МВР (У/аїтеп, К. б., апа Саї?, І., У. Мешгої! Зсі. 96: 19-27, 1990). ав | Попередні дослідження авторів винаходу з урахуванням даних щодо В-клітинних аутоантитіл показують, що існують принаймні дві різні форми М5, які відрізняються одна від одної: перша - в тих випадках, коли у о більшості хворих виробляються аутоантитіла до мієлінового основного білка (анти-МВР), і друга, коли у меншого со 20 числа хворих виробляються антитіла до білка протеоліпідної природи (анти-РІ Р) (У/атеп, К. 0., еї аї.,. Апп щ Месшго! 35; 280-289, 1994). При тій формі захворювання (М5), для котрої характерною є наявність анти-МВР, "7 гострі рецидиви супроводжуються збільшенням співвідношення вільних (РЕ) і зв'язаних (В) анти-МВР, тоді як фаза, що хронічно прогресує, характеризується більш низьким співвідношенням Б/В анти-МВР, а хворі на стадії ремісії рідко мають злегка підвищені титри анти-МВР (Уаїтеп, К. б. апа Саїя, І., 9). Мецшгої! Зсі. 88: 185-194, 1989). 29 Було показано, що частина Т-клітин, що проліферують, у хворих на розсіяний склероз спрямована до МВР

ГФ) (АПедгеца еї аїЇ, Зсіепсе, 718-721, 1990) і що Т-клітини людини можуть пізнавати множинні епітопи на молекулі (Кіспегі еї аї., У. Мейгоїттип 23, 55-66, 1989). МВР, очевидно, також здібний до активації деяких о Т-клітин без залучення клітин, що антигенпрезентують (АМтап еї аї., Еиг. у). Іттипої. 17, 1635-1640, 1987).

Схоже на те, що невеличкі пептиди МВР можуть розпізнаватися Т-клітинами без внутрішньоклітинного 60 процесування просто за рахунок їх спроможності зв'язувати антигени основного комплексу гістосумісності класу

ІЇ на поверхні клітин, що презентують.

Оскільки експериментальний алергічний енцефаломієліт (ЕАЕ), визнаний моделлю М5 на тваринах, може бути індукований уведенням чутливим гризунам як МВР, так і РІ Р у сполученні з повним ад'ювантом Фрейнда, процес демієлінізації при М5, можливо, має аутоїмунний механізм (Рг, К. В. еї аї., У). Іттипої., 130, бо 1024-1024, 1983; ТтоЧег, 9. |. еф а, 9. МецгоЇ сі. 79, 173-188, 1987). Беручи до уваги дані щодо

В-клітинних аутоантитіл, епітоп МВР, на який "націлене" захворювання, локалізований поблизу від три-пролілової послідовності (залишки -99-100-101-) на ділянці між 80-м і 100-м залишками (У/агтеп, К. ., еї аі., Апп. Мейгоії. 35: 280-289, 1994). Цей В-клітинний епітоп частково перекриває імунодомінантний епітоп

Т-клітин, активних стосовно МВР, що виявлені на ділянках мозку, уражених М5 (ОКзепбего, 9. К. еї а!., Майиге, 362, 68-70, 1993).

Попередні дослідження показали, що анти-МВР нейтралізуються МВР. Проте, попередні спроби лікування розсіяного склерозу внутрішньом'язовим або підшкірним уведенням гетерологічних МВР не привели до успіху (Сатррьеїї, В., Модеї, К. 9., Рівпег, Е. апа Іогепл, К., Агсй. МеицйгоЇ. 29: 10-15, 1973; СопзеЦе, МК. Е., 70 ОеїтоЧНе, Р. апа ЮОетопіу, Ї, У Мецго! 216: 27-31, 1977; апа Котіпе, У. 5. апа заїК, 9., Іп: Наїріке, 9. Р.,

Адатв, С. МУ. М. апа ТоцгіеіоЧЦе, МУ. МУ., едз. Мийіріе зсіеговіз. Вайітоге, МУШіатве 5 УМіКіпв, 1982: 621-630).

Проблема використання нативного МБР має дві сторони. Білок одержують із зразків мозку людини, і тому існує потенційна небезпека, що в ньому є наявними латентні нейровіруси. Крім того, незважаючи на те, що, як правило, МВР не є імуногенним, при введенні пацієнтам із порушеною імунною системою МВР може виявляти себе як антиген і викликати вироблення антитіл до МВР.

Відповідно до вищевикладеного даний винахід спрямований на вирішення питання: чи можуть анти-МВР, виділені із СЕ хворих на М5 на стадії гострого рецидиву нейтралізуватися певними пептидами МВР людини (-МВР). З цією метою синтетичні пептиди, що відповідають повній довжині А-МВР, використовували для визначення можливої епітопної області на Н-МВР, що нейтралізує анти-МВР, отримані від цих хворих. Отже, обрані пептиди, що нейтралізують анти-МВР, можуть використовуватися для лікування розсіяного склерозу більш ефективно, ніж МВР повної довжини. Ці пептиди отримані штучним шляхом і тому не несуть потенційної загрози, зв'язаної з нейровірусамі. Крім того, у зв'язку з малим розміром ці пептиди не виявляють себе в якості імуногенів. Отже, використання зазначених пептидів як засобу лікування розсіяного склерозу допоможе вирішити проблеми, що виникають при використанні нативного білка. с

Крім того, пептиди, отримані відповідно до даного винаходу, є об'єктом досліджень з метою визначення ефективності їх зв'язування або модуляції вироблення анти-МВР розсіяного склерозу іп мімо. і)

Відповідно до винаходу заявлено пептиди, послідовність яких, в основному, є гомологічною частині амінокислотної послідовності мієлінового основного білка людини. Ці пептиди спроможні нейтралізувати або модулювати вироблення анти-МВР. Відповідно до даного винаходу заявляються пептиди, які описуються «- зо формулою:

ВиМа!-Нів-Рне-Рпе-І ув-Азп-це-К о, о та їх солі, де Ку; і Ко незалежно один від одного вибрані з групи, що включає водень, гідрокси, залишок с амінокислоти і залишок поліпептиду, причому К.; і Ко не є воднем або гідроксилом одночасно. Пептид може містити заміщення, делеції або додатки, причому його функція нейтралізації або модулювання вироблення о анти-МВР зберігається. «о

Приклади зазначених пептидів:

МВР7Б-95

Гуз бег Ніз Су Агу Тиг СіІп Авр Си Авп Рго Маї Маї Ніз Рпе Рпе Гуз Азп Пе Ма! ТАиг

МвРБ4-78 «

Аа Агу ТНг Аа Ніз Туг Су Зег І еи Рго Сіп | уз Зег Нів СУ з с МВРБ1-75

Нів Нів Рго Аїа Аго ТПг Аїа Ніз Туг Су 5ег І еи Рго СіІп І ув ;» МВРЗ9-83

Туг Су Зег еи Рго Сп І ув бег Нів СіІу Ага ТАиг СІп Авзр СШ

МВРє80-97

Ге» Тиг СіІп Авр Си Авп Рго Маї Маї Ніз Ре Рне І уз Авп Іе Маї Тиг Рго Ага

МВРО1-106 о Гуз Азп ЇІе Маї! ТАг Рго Аг Тиг Рго Рго Рго 5ег Сп Оу І уз СІУ оо МвРєВ84-93

Авп-Рго-МаІ-МаІ-Нів-Рпе-РНе-ІЇ уз-Авп-Іе о МВРВБ-94 шк Рго-МаІ-МаІ-Ніз-Рпе-Рпе-І уг-Азп-Пе-Маї

МвРєЗ86-95

МаїІ-МаІ-Ніз-Рпе-РПе-ІЇ уз-Авп-Пе-МаІ-Тиг 5Б МвРєВ87-96

Ма!-Ніз-Рпе-РПе-І уз-Авп-Пе-МаІ-Тиг-Рго іФ) МВРВ82-98 ка Авр-СІш-Авп-Рго-МаІ-МаІ-Ніз-Рпе-РПе-Ї уз-Авп-Пе-МаІ- Тиг-Рго-Ага-Тиг

Далі, відповідно до даного винаходу, заявлена фармацевтична композиція, що містить у якості активного бо інгредієнта пептид із числа описаних вище, індивідуально, або в комбінації, в суміші з фармацевтичне прийнятним носієм.

Крім того, відповідно до даного винаходу заявляється спосіб лікування розсіяного склерозу, що передбачає введення ефективної кількості пептиду з числа описаних вище, як індивідуально, так і в комбінації для ефективної нейтралізації або модулювання вироблення антитіл до МВР людини. 65 На Фіг. 1 показана локалізація вісімнадцяти синтетичних пептидів по відношенню до інтактної молекули МВР людини. Пептиди мають вигляд вертикальних смуг і розміщені після відповідної їм ділянки на молекулі МВР.

Шкала показує амінокислотні залишки на молекулі МВР людини.

На Фіг. 2 показані криві інгібування антитіл до МВР, очищених і отриманих від 10 різних хворих на розсіяний склероз, при введенні МВР людини і МВР-пептидів.

На Фіг. З показана нейтралізація анти-МВР, отриманих від одного хворого на розсіяний склероз МВР людини і пептидами МВРЗ80-97, МВРО1-106 і МВР 75-95.

Фіг. 4: тривалий моніторинг титрів анти-МВР у спинномозковій рідині пацієнта, хворого на хронічний прогресуючий розсіяний склероз: рівні Е (вільних) і В (зв'язаних) анти-МВР були стабільно підвищеними при дослідженні 26-и проб протягом 7/0. 11-річного періоду з 1983 по 1993 р. срт: кількість зчитувань на хвилину й . й срт зразка - срит Біаик одиниці радіоактив ності -0- - --ю - - - - Я - - - - - - - срт загапьне - срт Біанк - о - зв'язані (В) анти-МВР, визначені після кислотного гідролізу імунних комплексів у СОР. -7- вільні (Є) анти-МВР.

Фіг. 5: контрольні хворі: рівні анти-МВР С5Е у 2 тимчасових контрольних пацієнтів (156, Фіг. 5А і З3М66,

Фіг. 58) і у 2 тимчасових контрольних пацієнтів при використанні фізіологічного розчину. У всіх чотирьох хворих рівень Е і В анти-МВР залишився стійко підвищеним відносно базового рівня, коли СЗЕ відбиралася для аналізу кожні ЗО хвилин протягом перших двох годин, так само, як і 24 години пізніше. Позначення використані такі самі, як на Фіг. 4.

Фіг. 6: порівняльні дослідження пептидів від різних хворих; рівні анти-МВР у спинномозковій рідині в групі з чотирьох хворих (1038, Фіг. ба; 1343, Фіг. 6С; 5М59, Фіг. 60; і ЗМ66, Фіг. 60), що одержали збільшені кількості (1, 2,5, 5 і 10 мг відповідно) незв'язаного контрольного синтетичного пептиду МВРЗ35-58 і в групі з чотирьох інших хворих (6Е5З3, Фіг. 6В; 8М41, Фіг. 60; і 4М45, Фіг. бЕ; і 156, Фіг. б6Н), які Ге! одержували підвищені кількості (1, 2,5, 5 і 10 мг відповідно) анти-МВР, що зв'язують синтетичний пептид о

МВР7Б-95. С5Е Є анти-МВР були зв'язані в дозозалежному співвідношенні пептидом МВР7Б5-95, і вони не вступали у взаємодію з пептидом МВРЗБ-58. Зв'язані анти-МВР залишалися фактично нереакційноспроможними.

Фіг. 7: порівняльні дослідження пептидів від різних хворих, коли хворі на М5 піддавалися тимчасовому ч контролю (1Е56, Фіг. 7С і ЗМ66, Фіг. 70) або тимчасовому контролю при використанні фізіологічного розчину (5М59, Фіг. 7А і 4М45, Фіг. 7В), а також, коли вони одержували незв'язаний контрольний пептид МВР35-58 (5М59 о і ЗМб66), рівні їх Е анти-МВР їі В анти-МВР залишалися постійно незмінними. | навпаки, коли ті ж хворі 4АМ45, Гео) 156 і ЗМ66 пізніше одержали 5-10 мг анти-МВР, зв'язаних із пептидом МВР 75-95, їх Е анти-МВР переставали виявлятися протягом періоду до 7 днів і поверталися на рівень базової лінії між 10 и 21 днем. о

Фіг. 8: повторювані внутрішньошкіряні ін'єкції синтетичного пептиду: хворий на хронічно прогресуючий М5 (Се) одержував 10 щотижневих ін'єкцій по їОмг МВР75-95 безпосередньо в спинномозкову рідину; титри Е їі В анти-МВР вимірювали до ін'єкції (позначено кружками) і через 30 хвилин після ін'єкції (позначені квадратами).

Вільні Е анти-МВР (заштриховані квадрати і кружки) ставали такими, що не визначалися протягом 10 тижнів, « незважаючи на те, що рівень зв'язаних В антитіл залишався практично незмінним (незаштриховані квадрати і 470 кружки). - с Фіг 9. Внутрішньовенне введення синтетичного пептиду: рівні анти-МВР у спинномозковій рідині а відповідають одній внутрішньовенній ін'єкції ХбО0мг МВР 75-95; рівні зв'язаних В і вільних Е анти-МВР суттєво ,» знижуються під час досліджень через 10, 16 і 30 днів після ін'єкції. Позначення використані такі самі, як на Фіг. 4.

Фіг. 10. Подальше вивчення МВР епітопу для анти-МВР М5 із використанням групи з 41 декапептиду, що перекривають ділянки між 61 і 110 залишками. (22) Опис: о - смуги позначають відсоток інгібування - 100 - одиниці радіоактивності; - МВР і пептид МВР 75-95 були використані в якості позитивного контролю і забезпечили 10095 інгібування як (95) вільних ЕК, так і зв'язаних В антитіл; с 50 - пептиди МВРБ1-60 і МВР 111-120 були використані в якості негативного контролю і привели до незначного інгібування (0-1095) зв'язаних В і вільних Е анти-МВР; - - декапептиди МВР84-93, МВР85-94, МВРОЗ6-95 і МВР87-96, що забезпечили максимальне інгібування (90-100905) як вільних РЕ, так і зв'язаних В антитіл, тісно асоціюються з МВР епітопом; - пунктирна лінія позначає 9595-й достовірний інтервал дослідження з інгібування.

На Фіг. 11а наведені кількості вільних (Б)-еПі зв'язаних (8)-о анти-МВР у СЕ хворого з одностороннім

Ге! оптичним невритом, якому були зроблені дві внутрішньооболонкові ін'єкції (1 і 22) 5О0мг рМвРОЗ6-95 з інтервалом 4 тижні; м - число тижнів. ко На Фіг. 11 5 наведені кількості вільних (РЕ)-е і зв'язаних (8В)-о анти-МВР у С5Е хворого з повним одностороннім оптичним невритом, якому були зроблені численні внутрішньооболонкові ін'єкції (М, 2, ЯЗ, 4 і 5) 60 БОмМг РМВРВ2-98 у перший тиждень рецидиву.

На Фіг. 11с наведені кількості вільних (Р)-е і зв'язаних (В)-о анти-МВР у СЗЕ хворого на псевдоатероз, якому було зроблено п'ять щоденних внутрішньооболонкових ін'єкцій (ТЯ, 2, КЗ, 84 і 25) 5Омг рМВР82-98.

На Фіг. 114 наведені кількості вільних (Р)-е і зв'язаних (8В)-о анти-МВР у СЗЕ хворого на розсіяний склероз, що рецидивне прогресує, якому було зроблено чотири внутрішньооболонкові ін'єкції (Я, йЯЖ2, З їі їй) бо Б5Омг рМВРЗ86-95 через кожні 2-3 дні в перший тиждень рецидиву й одна внутрішньовенна ін'єкція (ІМ) 400мг рмМвРЗБ-95, коли захворювання вступило в прогресуючу фазу.

На Фіг. 12 наведені кількості вільних і зв'язаних анти-МВР у С5Е хворого з полісимптоматичним рецидивом, якому було зроблено всього сім внутрішньооболонкових ін'єкцій ХОмг рМвВРЗ86-95. Через 30 хвилин після йЯ2

Зразок СЗЕ не брали; його взяли через 24 години. Позначення використані такі самі, як на Фіг. 11.

На Фіг. 13 наведені кількості вільних і зв'язаних анти-МВР у С5Е хворого на розсіяний склероз, що рецидивно прогресує, якому були зроблені як внутрішньооболонкові (І, йЖ2 і й23), так і внутрішньовенні ін'єкції (ІМ'Я! ї ІМЯ2) рМвВРЗ6-95. До і після йЖ2 зразок С5Е не брали. Позначення використані такі самі, як на Фіг. 11. 70 На Фіг. 14 наведені кількості вільних і зв'язаних анти-МВР у С5Е хворого на розсіяний склероз, що рецидивно прогресує, якому були зроблені як внутрішньовенні (ІМ'Я!Ї, ІМЯЖ2 і М'ЯЗ), так і внутрішньооболонкові (від ЇНИ до їЇ29) ін'єкції РМВР86-95 і рМВР82-98. Позначення використані такі самі, як на Фіг. 11.

На Фіг. 15 відображена спроба запобігти наступним рецидивам у хворого на розсіяний склероз, що рецидивно прогресує, якому були проведені дві внутрішньовенні ін'єкції (ІМЯ! і ІМя2) 400мг рМмвРОЗБ-95 і 7/5 РМВРВ2-98. Під час першого рецидиву, через З місяця після ІМ'Я зразок СЗЕ не брали. Природна частота рецидивів відображена угорі стрілками, що відповідають місяцям рецидиву. Квадратом відзначено час експерименту. Позначення використані такі самі, як на Фіг.11.

На Фіг. 16 відображена спроба запобігти наступним рецидивам у хворого на розсіяний склероз, що рецидивно прогресує, якому були зроблені дві внутрішньооболонкові (1 і 22) і одна внутрішньовенна (ІМ) 2о ін'єкції рМВРЗ6-95. »К - внутрішньовенне уведення великої дози метил преднізолону. Природна частота рецидивів відображена угорі стрілками, що відповідають місяцям рецидиву. Квадратом відзначено час експерименту. Позначення використані такі самі, як на Фіг. 11.

На Фіг. 17 показаний ефект внутрішньооболонкового і внутрішньовенного введення пептиду, який він справляє на кількість МВР-специфічних аутоантитіл у СЕ хворого на хронічний прогресуючий розсіяний сч об склероз. В експерименті, ілюстрованому на Фіг. 17а, РМВР 75-95 уводили прямо в СЗЕ (2,5мг у змл фізіологічного розчину), і МВР-специфічні аутоантитіла визначали шляхом твердофазного радіоімунологічного тесту через різні і) інтервали часу (від 0,5 години до 7 днів після ін'єкції). Ін'єкції пептиду приводили до тимчасової нейтралізації вільних анти-МВР (зафарбовані кружки), але не робили впливу на зв'язані анти-МВР (незафарбовані кружки). Аутоантитіла не можна було виявити через 1 і 2 години, а їх кількість починала «- зо повертатися до вихідного значення між 12 і 24 годинами після ін'єкції. Аналогічні спостереження були зроблені із сімома іншими хворими на хронічний прогресуючий розсіяний склероз. На Фіг.17Ь можна бачити, що через 13 о місяців після внутрішньооболонкового введення, відображеного на Фіг. 17а, хворому було внутрішньовенне с введено 500мг рРМВР75-95 у 5Омл фізіологічного розчину, і МВР-специфічні аутоантитіла в С5Е визначали протягом З місяців (середнє значення «т стандартне відхилення). о

На Фіг. 18 наведені рівні анти-МВР у СЗЕ тринадцятьох хворих на хронічний прогресуючий розсіяний склероз, «о яким робили внутрішньовенні ін'єкції (ІМЯ! 5-бмг/кг ваги тіла (256-500мг у фізіологічному розчині) РМВР 75-95 (2 хворих ) або рМвР8Б6-95 (11 хворих); визначали як вільні, так і зв'язані анти-МВР (зафарбовані і незафарбовані кружки, відповідно). Рівень аутоантитіл у проміжку 1-4 місяців після ІМЯ! був низьким або таким, що не виявлявся, а потім повертався до вихідних значень. У проміжку 6-10 місяців після ЇМЖ 1 усім « хворим проводили другу внутрішньовенну ін'єкцію РМВР82-98 тією самою дозою (ІМЯ). з с Даний винахід стосується пептидів, амінокислотна послідовність яких практично гомологічна частини амінокислотної послідовності мієлінового основного білка людини. Термін "практично гомологічна" означає, що з невеличкі розходження між амінокислотною послідовністю мієлінового основного білка людини і пептидами можуть існувати за умов, що пептиди з невеличкими розходженнями в амінокислотній послідовності спроможні функціонувати відповідно до їх первісно властивого призначення, тобто спроможні нейтралізувати або

Ге» модулювати вироблення антитіл проти мієлінового основного білка людини (анти-МВР). Дані тут роз'яснення роблять очевидним для фахівця той факт, що емпірично невеликі варіації в амінокислотній послідовності о зазначених пептидів можуть бути зроблені без шкоди для їх функції. 2) На основі іншої роботи, пов'язаної з даним винаходом, а також на основі тестів з конкурентного інгібування при використанні серії з 41 декапептиду, був уточнений епітоп МВР, що зв'язує анти-МВР при о розсіяному склерозі. Він був локалізований на ділянці між амінокислотою 86 і амінокислотою 95. Виходячи з

Кк найвищого рівня інгібування В анти-МВР (рівного або більшого 9590), епітоп МВР, що зв'язує анти-МВР, можна локалізувати між амінокислотою 86 і амінокислотою 95. Найменша загальна ділянка ефективних декапептидів знаходиться між амінокислотами 87 і 93. Таким чином, відповідно до даного винаходу, пептиди можуть бути ов представлені такою формулою:

Е:Маї!-Ніз-Ріпе-Рпе-І уз-Азп-Пе-К»

Ф) і його солей, при тому, що КК; і Ко незалежно один від одного вибрані з групи, що включає у себе водень, ка гідрокси, амінокислотний залишок і поліпептидний залишок; при тому, що Ку; і Ко не є одночасно воднем або гідроксилом. во Сім амінокислот, що відповідають положенням із 87 до 93, очевидно, е недостатньо великими, щоб ефективно зв'язувати анти-МВР. Таким чином, К. і Ко не повинні бути одночасно воднем або гідроксилом.

Коли К. і Ко» є амінокислотою, ця амінокислота може бути вибрана серед природних амінокислот. Кі і Ко не обмежуються амінокислотами, що зустрічаються "вище" або "нижче" МаІ87 і Пе93 в основному білку мієліну людини, як показано в послідовності ЗЕС ІЮО Мо:1. Можуть бути проведені різноманітні модифікації, які б5 Включають заміни, додатки або делеції, як "вище", так і "нижче" послідовностей Ку. і Ко. Крім того, модифікації, які включають заміни, додатки або делеції, можуть бути здійснені в послідовності

-МаІ-Ніз-Рпе-РПе-І уз-Авзп-Пе- при тому, що отримані в такий спосіб пептиди спроможні виконувати потрібну функцію, тобто нейтралізувати або модулювати утворення антитіл до основного білка мієліну.

Термін "залишок поліпептиду" або "поліпептидний залишок" означає поліпептиди різноманітного розміру,

ВКЛЮЧНО білки або їх фрагменти. Як зазначено вище, коли К. і Ко є поліпептидним залишком, Ку і Ко» не обмежуються пептидами, що зустрічаються "вище" або "нижче" Ма/!87 і Пе93 в основному білку мієліну людини.

Можуть бути використані будь-які поліпептидні залишки.

В одному із варіантів здійснення винаходу Кі може бути пептидом, вибраним із групи пептидів, що варіюють у межах від амінокислотного залишку 61 до амінокислотного залишку 86 послідовності з«ЕО ІЮ Мо:/1. Довжина /о зазначеного пептиду може варіювати від одного амінокислотного залишку до 26 амінокислотних залишків.

В іншому варіанті здійснення винаходу Ко може бути пептидом, вибраним із групи пептидів, що варіюють у межах від амінокислотного залишку 94 до амінокислотного залишку 106 послідовності «ЕС ІЮО Мо:1. Довжина зазначеного пептиду може становити від одного амінокислотного залишку до 13 амінокислотних залишків.

Кі і/або Ко можуть бути повторами послідовності -МаІ-Ніз-Рпе-РНе-І уз-Азп-Пе або її модифікаціями, /5 Включаючи заміщення, доповнення або делеції. Таким чином, пептид може містити численні повтори сайта зв'язування анти-МВР (епітопу).

Сполуки, заявлені згідно з даним винаходом, можуть бути отримані відповідно до загальноприйнятих і добре відомих методів синтезу поліпептидів. Під терміном "пептид' розуміють пептиди, отримані із природних мієлінових основних білків людини в результаті контрольованого гідролізу, який здійснюється до утворення 2о пептидів за даним винаходом. Це поняття також включає у себе пептиди, отримані за допомогою технології рекомбінантних ДНК. З урахуванням відомої послідовності заявлених пептидів до об'єму даного винаходу включене також установлення відповідної послідовності ДНК, що кодує заявлену амінокислотну послідовність.

Відповідна послідовність ДНК може бути отримана при використанні загальноприйнятих, добре відомих методів синтезу ДНК послідовностей. Отримані в такий спосіб послідовності ДНК можуть бути клоновані у відповідних сч ов векторах, що клонують, і використані для трансформації підхожої клітини-хазяїна з метою одержання рекомбінантного пептиду. Всі викладені вище підходи є загальноприйнятими і добре відомими для фахівців у і) даній галузі.

Пептиди, заявлені відповідно до даного винаходу, в основному гомологічні за своєю амінокислотною послідовністю частині амінокислотної послідовності мієлінового основного білка людини. Поняття "частина «- зо амінокислотної послідовності" означає, що послідовність може бути будь-якої довжини за умови, що вона є достатньо довгою для того, щоб нейтралізувати або модулювати вироблення антитіл до МВР, але має не таку ме) довжину, що призводить до відомих проблем при використанні пептидів іп мімо для лікування розсіяного с склерозу. В одному з прикладів практичного втілення даного винаходу описані пептиди, що містять приблизно від 10 до 25 амінокислотних залишків. Якщо заявлені пептиди використовуються як частина білків злиття, о загальний розмір пептиду може бути набагато більше. со

Відповідно до одного варіанта здійснення винаходу було встановлено, що заявлені пептиди, які відповідають значною мірою амінокислотній послідовності людського МВР, ефективні відносно нейтралізації і модулювання вироблення анти-МВР. Ці пептиди відповідають амінокислотній послідовності людського МВР в інтервалі від 61 до 106 амінокислотного залишку. В одному з прикладів ці пептиди відповідають ділянці 75-106 амінокислотної « послідовності людського МВР, коли пептиди використовуються для нейтралізації вільних анти-МВР. У з с наступному прикладі ці пептиди відповідають ділянці 82-99 амінокислотної послідовності людського МВР, коли пептиди використовуються для нейтралізації і модулювання вироблення зв'язаних анти-МВР. Тому вибираються з пептиди, що складаються з 10-25 амінокислотних залишків, із суцільної амінокислотної послідовності в межах послідовності, показаної нижче (амінокислотні залишки 5ЕСО ІЮ МО:1), за умови, що зазначена послідовність

Може нейтралізувати або модулювати вироблення антитіл до мієлінового основного білка людини. б Амінокислотні залишки 61-106 5ЕО ІЮ МО:1 61 о Нів Ніз Рго Аа Агу Тпг Аа Ніз Туг СІу бег Геи Рго Сіп І ув бег Ніз Су Агуд Тиг біп Авр Сім Авп Рго Маї 2) Маї Ніз Ріпе Рпне Гуз Авп ЇІе Маї Тиг Рго Аго ТАиг Рго Рго Рго Зег біп Сіу Гуз СІу 106 і Нижче наведені приклади пептидів, вибраних із групи, що включає у себе: ке МВРБ1-75 (амінокислотні залишки 61-75 ЗЕО ІЮ МО:1)

Нів Нів Рго Аїа Аго ТПг Аїа Ніз Туг Су 5ег І еи Рго Сіп І уз

МВРБбА-78 (амінокислотні залишки 64-78 ЗЕО ІЮ МО:1)

Аа Агу ТНг Аа Ніз Туг Су Зег І еи Рго Сіп | уз Зег Нів СУ

МВРБО-83 (амінокислотні залишки 69-83 5БЕО ІЮ МО:1)

Ф) Туг Су Зег еи Рго Сп І ув бег Нів СіІу Ага ТАиг СІп Авзр СШ ка МВР?7Б-95 (амінокислотні залишки 75-95 5ЕО ІЮ МО:1)

Гуз бег Ніз Су Агу Тиг СіІп Авр Си Авп Рго Маї Маї Ніз Рпе Рпе Гуз Азп Пе Ма! ТАиг 60 МВРВО-97 (амінокислотні залишки 80-97 5ЕО ІЮ МО:1)

Тиг СіІп Авр Си Авп Рго Маї Маї Ніз Рпе РНе уз Авп Не Маї ТНг Рго Ага

МВРО1-106 (амінокислотні залишки 91-106 ЗЕО ІЮ МО 1)

Гуз Азп Не Маї Тиг Рго Аго ТАг Рго Рго Рго Зег Сп Су Гуз СУ

Один із аспектів даного винаходу стосується пептидів, представлених формулою: 65 Е:Маї!-Ніз-Ріпе-Рпе-І уз-Азп-Пе-К» і їх солей, де К; і Ко незалежно один від одного вибрані з групи, яка включає у себе водень, гідрокси,

залишок амінокислоти і залишок поліпептиду за умови, що К/ Ко не є одночасно воднем або гідроксилом.

Пептид може містити заміщення, додатки або делеції за умови зберігання пептидом своєї властивості нейтралізувати або модулювати вироблення антитіл проти МВР людини.

Нижче наведені приклади пептидів, вибраних із групи, яка включає у себе:

МвРєВ84-93

Авп-Рго-МаІ-МаІ-Нів-Рпе-РПе-ІЇ уз-Авп-Пе

МвРєВ85-94

Рго-МаІ-МаІ-Ніз-Рпе-РНе-І увз-Авп-Пе-Маї 70 МвРєЗ86-95

МаїІ-МаІ-Ніз-Рпе-РПе-Ї уз-Авп-ІПе-Маїі-Тиг

МвРєВ87-96

Ма!-Ніз-Рпе-РПе-І уз-Авп-Пе-МаІ-Тиг-Рго

МвРєВ82-98

Авр-СІш-Авп-Рго-МаІ-МаІ-Ніз-Рпе-РПе-Ї уз-Авп-Пе-МаІ- Тиг-Рго-Ага-Тиг

У силу наявності п'ятьох додаткових гідрофільних залишків пептид МВРЗ82-98 має підвищену розчинність порівняно з іншими пептидами, заявленими в даному винаході. Таким чином, використання даного пептиду є кращим у порівнянні з іншими запропонованими пептидами.

Продовжує досліджуватися можлива роль анти-МВР у патогенезі розсіяного склерозу. Про підвищені титри го анти-МВР у хворих на активну форму розсіяного склерозу вперше повідомили Рапіїсп еї аі. (Рапісп, Н. 5.,

Ноорег, С. 5., апа допйпзоп, К. Р. Агсй Мецго! 37: 206-209, 1980), які застосовували твердофазний радіоїмунологічний аналіз із МВР морської свинки. Пацієнти з гострим рецидивом захворювання, як правило, мали підвищений вміст анти-МВР, в основному, у вільній формі, тоді як деякі хворі в стадії клінічної ремісії могли мати рівні анти-МВР, що не виявлялися. Під час перехідного періоду від гострої дози до ремісії титри сч 2гв Вільних анти-МВР прогресивно знижувалися за період від кількох тижнів до кількох місяців, у той час як рівень зв'язаних антитіл був приблизно таким самим, як початковий. У інших хворих на стадії ремісії можна було і) спостерігати низькі титри вільних і зв'язаних анти-МВР, як правило, зі співвідношенням Р/В, меншим за 1. Це дозволяє припустити, що антитіло (антитіла), що нейтралізують анти-МВР, зв'язуються з анти-МВР. Іноді хворі, які точно відповідали критеріям розсіяного склерозу, що клінічно визначається, а також хворі на «- зо нейропатологічно виявлений розсіяний склероз, мали рівень анти-МВР, який не визначається у період активної стадії захворювання. Можливо, такі пацієнти мають антитіла до інших мієлінових білків. Відсутність схеми і вироблення специфічних антитіл не зменшує потенційної можливої ролі анти-МВР у механізмі демієлінізації у с більшості хворих на розсіяний склероз.

Нещодавно різноманітні антитіла проти МВР були знайдені у Фракції ІдО, виділеної зі спинномозкової рідини о зв Хворих на розсіяний склероз (УУагтеп, К. с. апа Саї?, І., 9. Меийгої. Зсі. 96:19-27, 1990). Первинні антитіла «о до МВР як у вільній, так і зв'язаній формі виявилися пов'язаними з активною фазою захворювання: Б/В 2» 1 у пацієнтів із гострою формою і « 1 у пацієнтів із хронічно прогресуючою формою розсіяного склерозу (УМаїтеп, К.

С. апа Саїй, І, Апп. МецгоІЇ. 209: 20-25, 1986; Саї;», І, апа МУатеп, К. б. Сап 9. МеийгоїЇ. сі. 13: 21-24, 1986; апа УУагтеп, К. б. апа Саїт, І., Апп. МейгоїЇ. 21: 183-187, 1987). Вторинні антитіла, що нейтралізують « анти-МВР, з'являються, коли захворювання переходить у неактивну форму. Третинні антитіла, що інгібують з с нейтралізацію анти-МВР, виявляються, коли захворювання стає хронічно прогресуючим і переходить у неактивну форму. Той факт, що каскад антитіл до МВР асоційований із фазами М5, дозволяє припустити, що ;» утворення таких антитіл, можливо, грає важливу роль у розвитку даного захворювання.

Незважаючи на те, що анти-МВР можуть бути визначені у С5Е хворих на активну форму М5, їх головна роль

У патогенезі демієлінізації залишається непідтвердженою. Участь анти-МВР у механізмі розвитку розсіяного

Ге» склерозу (М5) найкраще може бути встановлена їх нейтралізацію іп мімо, можливо, при введенні заявлених пептидів і моніторингом клінічного плину захворювання. Якщо анти-МВР є тільки первинними антитілами, о зв'язаними з демієлінізацією при розсіяному склерозі (М5), то, мабуть, можна блокувати демієлінізацію 2) внутрішньооболонковим і/або внутрішньовенним, і/або оральним уведенням заявлених МВР пептидів, які б нейтралізували анти-МВР і забезпечили б толерантність до МВР іп зйи. Інші мієлінові білки людини, можливо, о також беруть участь у демієлінізації при розсіяному склерозі (М5) і, відповідно до цього, в об'єм даного

Кк винаходу включене використання пептидів, значною мірою гомологічних за амінокислотною послідовністю частині амінокислотної послідовності вищезгаданих інших мієлінових білків, для того, щоб нейтралізувати відповідні антитіла. Незважаючи на те, що попередні спроби лікування розсіяного склерозу (М5) в Внутрішньом'язовим або підшкірним уведенням гетерологічного МВР не виявилися повною мірою успішними (Сатрреї, В., Модеї, МК. у., Рівпег, Е. апа Гогепл, К., Агсй. МеигоЇ. 29; 10-15, 1973; СоцизеЦе, К. Е,, (Ф) ОеїтоНе, Р. апа Оетопіу, Ї. У Меийгої 216: 27-31, 1977; апа Котіпе, 9). 5. апа заїк; ., іп: Наїріке, У, РЕ., ка Адатв, С. МУ. М. апа ТоцгіеіоЧЦе, МУ. МУ., едз. Мийіріе Зсіеговів. Вайітоге, МУШіате 5 УМіКіпе5, 1982: 621-630), внутрішньооболонкове і/або внутрішньовенне введення МВР пептидів, що нейтралізують або модулюють во вироблення анти-МВР, відповідно до винаходу, продемонструвало більш успішні результати.

Моделлю М5 на тваринах є експериментальний алергічний енцефаломієліт (ЕАЕ), який являє собою опосередковане Т-клітинами захворювання, що демієлінізує. Симптоми ЕАЕ можуть бути скориговані введенням мишам синтетичних пептидів МВР (заштг, А. еї аї., 5сіепсе, 258, 1491-1494, 1992). Більш того, уведення високих доз МВР, делетувало аутореактивні Т-клітини й анулювало клінічні і патологічні симптоми ЕАЕ у мишей 65 (Стісптеїй, 9. М. еї аї., Зсіепсе, 263, 1139-1143, 1994). Навіть оральне введення МВР модулювало плин ЕАЕ за рахунок індукції периферичної толерантності (Спеп, МУ. еї аІ.. 5сіепсе, 265, 1237-1240, 1394). Нещодавно на підставі парних пробних експериментів було висловлене припущення, що толерантність може бути індукована у хворих М5 оральним уведенням мієлінових антигенів (УУеіпег, Н. Ї. ей а). Зсіепсе 259, 1321-1324, 1993).

Комбінація мієлінових антигенів і синтетичних пептидів цих антигенів, введена оральним і/або внутрішньовенним, і/або внутрішньооболонковим шляхом, можливо, необхідна для модулювання Т-клітин,

В-клітин і макрофагів, що беруть участь у деструкції мієліну у хворих на розсіяний склероз (М5).

Відповідно до цього, винахід також стосується фармацевтичної композиції, яка містить у якості активного інгредієнта пептид, описаний вище, окремо або в композиції, в суміші з фармацевтично прийнятним носієм. У якості прикладу добре відомого фармацевтично прийнятного носія можна назвати фізіологічний розчин. 70 Пептиди, заявлені в даному винаході, можуть призначатися людям для лікування або модулювання М5.

Терапевтична доза для внутрішньовенного і/або орального введення при лікуванні М5 може складати приблизно від 1,0мг на кг ваги тіла до 10,0мг на кг ваги тіла. Якщо уведення здійснюється внутрішньооболонковим шляхом, то доза може становити приблизно від 1 до 1Омг. В одному з прикладів практичного втілення даного винаходу пептид уводиться чи то внутрішньовенним, чи то внутрішньооболонковим шляхом, чи то їхньою комбінацією. Якщо потрібно, пептиди можуть призначатися як одноразовою дозою, так і послідовно декількома дозами.

Відповідно до даного винаходу, внутрішньовенне введення пептиду знижує кількість як вільних, так і зв'язаних анти-МВР антитіл; внутрішньооболонкове уведення пептиду виявилося ефективним тільки для нейтралізації або модулювання вільних анти-МВР антитіл.

В одному із варіантів здійснення даного винаходу було показано, що послідовне внутрішньооболонкове введення пептидів МВР може знижувати кількість вільних анти-МВР антитіл і підтримувати її на низькому рівні протягом місяців після ін'єкції пептидів хворим, що страждають на моносимптоматичні рецидиви. В одному з прикладів, відповідно до даного варіанта здійснення винаходу, ХОмг пептиду МВР уводили хворому щоденно протягом чотирьох - п'яти днів. Відповідно до іншого прикладу, може бути введена додаткова доза через один чи с ов два тижні після початкових ін'єкцій.

Поряд із наданим вище детальним описом кращих варіантів здійснення даного винаходу, нижче наведені і) приклади його практичного втілення, які мають виключено ілюстративний характер і в жодній мірі не обмежують його об'єму.

Приклад 1 Нейтралізація іп міго антитіл до МВР людини «- зо На Фіг. 1 показане розміщення 18 пептидів людського МВР, що використовувалися у цьому експерименті, по відношенню до молекули інтактного МВР. Нативний МВР був виділений із тканини мозку, не ураженого розсіяним о склерозом (М5) (Оіеріег, б. Е., Магепзоп, К. Е., Кіез, МУ. МУ. Ргер Віоспет 2: 139-165, 1972), і далі очищений с гель-фільтрацією. Кінцеві антигенні препарати були перевірені на чистоту ЗО5-злектрофорезом у поліакриламідному гелі. У подальших дослідженнях використовувалися лише ті препарати, які мігрували при о молекулярній масі 18,5кКД. Очищений МВР був використаний в антиген-специфічній афінній хроматографії, у со експериментах з нейтралізації й у твердофазному радіоімунологічному дослідженні при використанні анти-МВР.

Було синтезовано вісімнадцять пептидів, що покривають у сумі всю протяжність П-МВР і містять від 8 до 25 амінокислотних залишків. Синтез проводили за методом Егпос, як описано раніше (Стооте, М.Р., ЮОам/Кев, А.,

Вату, К. еї аї., У. Мейгоіїттип. 19:305-315, 1988). Ступінь чистоти кожного препарату пептиду перевіряли « обернено-фазовою НРІС на колонці С18 і градієнтом вода/ацетонітрил (0,196 ТЕА). Амінокислотний аналіз -птв) с пептидів проводили з використанням стандартних методів. Багато із використаних у даному дослідженні пептидів містили неприродний залишок цистеїну, оскільки в сполученні з ад'ювантом Фрейнда вони повинні були ;» діяти як імуногени. Малоймовірно, щоб ця обставина вплинула на отримані результати.

Цереброспинальну рідину (ЦСЖ) одержували протягом тижня з моменту появи симптомів у 35 хворих із гострими рецидивами розсіяного склерозу. Вміст ДО в ЦСЖ визначали шляхом нефелометрії. Використані в

Ге» даному експерименті зразки ЦСЖ були відібрані так, щоб у вихідному стані містити велику кількість Ід (20,080 г/л) і підвищені титри анти-МВР (співвідношення Р/В21,0). У всіх хворих розсіяний склероз був підтверджений о клінічно. 2) Ід8о виділяли з концентрованої ЦСЖ хворих на гострий розсіяний склероз шляхом афінної хроматографії на білок А-сефароза (РНагтасіатм), як описано раніше (УУатеп, КЗ. апа Саї;, !., У. Меийгої. збі. о 96:19-27,1990). Ступінь чистоти кожного препарату дО перевіряли злектрофорезом у поліакриламідному гелі та - М ізоелектрофокусировкою. Коли зразки анти-МВР з очищених препаратів (40 адсорбували до нуля з МВР, тоді супернатанти після адсорбції не містили залишкових дО, що свідчило про те, що анти-МВР були представлені лише у фракції "збільшених" Ід.

Очищений МВР кон'юговали з СМВг-активованою Сефарозою 4В (РІагтасіатм) відповідно до інструкцій виробника. Очищені Ід із ЦСЖ 35 хворих з гострими рецидивами розсіяного склерозу, що містили підвищені о кількості анти-МВР, були використані для виділення анти-МВР афінною хроматографією на МВР-Сефарозі ко (Уатеп, К.О. апа Саїг, І., У. Меийгої. Зсі. 103:90-96, 1991).

Очищені зразки анти-МВР порівнювали з вихідними (дО шляхом злектрофорезу у поліакриламідному гелі. 60 Коли очищені зразки анти-МВР адсорбували до нуля з МВР, тоді після адсорбції супернатанти не містили залишкових дос, що свідчило про частоту анти-МВР.

Однакові кількості анти-МВР (15 одиниць зв'язування радіоактивності, що відповідало 100 при установці на шкалі -900) інкубували зі зростаючими кількостями п-МВР (0-100Онг) або індивідуальними пептидами МВР (0-10,00Онг) в рідиннофазному тесті і після 1,5 години інкубації у всіх сумішах визначали кількість вільних 65 анти-МВР. У дослідженнях з нейтралізації використовували анти-МВР, отримані від 7 окремих хворих, і змішані анти-МВР, отримані від 10 різних хворих. У якості негативних антигенних контрольних препаратів використовували гістон тимусу теляти і людський сироватковий альбумін (в інтервалі 10-100Онг). Одне моноклональне антитіло (МКА) до пептиду МВРб4-78 і поліклональну кролячу антисироватку до пептиду МВР 1-8 використовували в якості позитивних антитільних контрольних препаратів (Сгооте, М., Нагіапа, 9. апа Оам/Кев,

А., Мейгоспет. Іпї 7:309-317,1985; Вагу, К., Рауїоп, М, апа Сгооте, М.. Меигоспет. Іпі. 2:291-300, 1991). У якості негативного антитільного контрольного препарату використовували інше мишаче моноклональне антитіло до епітопу 45-50.

Рівні анти-МВР визначали у твердофазному радіоімунологічному тесті з МВР людини (Умаїтеп, К.О. апа Саї?х,

І, Апп. Меийгої. 209:20-25, 1986; МУагтеп, К.С. апа Сай, І. Апп. Меийгої. 210:183-187, 1987; МУатеп, К.О. апа /о Чаїх, І, У. Мецйгої. Зсі. 91:143-151, 1989). В усіх фракціях, отриманих після афінної хроматографії, а також у всіх нейтралізаційних сумішах визначали кількості вільних анти-МВР. Всі індивідуальні зразки тестували чотири рази з використанням одного йодованого матеріалу з тим, щоб звести до мінімуму розходження між тестами.

Очищені анти-МВР були цілком нейтралізовані МВР і пептидами МВР8О-97, МВРО1-106, і МВР 75-95 і були /5 частково нейтралізовані пептидами МВРб4-78, МВРбО-83 і МВРб1-75 (Табл. 1 і Фіг. 2). Інші 12 пептидів, що залишилися, не нейтралізували очищені анти-МВР, і їх кінетичні криві показують спад у межах заштрихованої області, див. Фіг. 2. Гістон тимусу теляти й альбумін сироватки людини не реагували з очищеними анти-МВР навіть при концентраціях вище 100Онг. Клон 26 інгібувався тільки пептидом МВРб4-78. К 155 інгібувався тільки пептидом МВР 1-8. Клон 16 не реагував ні з МВР, ні з іншими пептидами (для чистоти зображення дані контролю 2о не наведені). Контрольні зразки показують обгрунтованість підходу стосовно нейтралізації, тому що кожне контрольне антитіло було абсолютно нейтралізовано вибраним пептидом і ніякими іншими. Це показує, що специфічність взаємодії має місце навіть при високих концентраціях пептидів (1000ООнг). сч зв о з 1150 ую 011 вели 01150 - в» 7 в 0111 Фо сук | со о зв Ф ув ч и тю я с ве 00100 . рю г» Ся 00110 сумелео//

І шле (є) ж повна нейтралізація; т часткова нейтралізація; («в | - незначна нейтралізація о Анти-МВР, отримані від 7 різних хворих були цілком нейтралізовані МВР людини і пептидами МВРЗВО-97,

Га 20 МВРО1-106 і МВР 75-95 (див. Фіг. З як ілюстрацію). Оскільки отримана від окремих пацієнтів кількість антитіл була обмеженою, анти-МВР не піддавали реакції з 15 пептидами, що залишились. "-ь Як зазначено вище, анти-МВР були нейтралізовані пептидами, що відповідають ділянці між 661-106 амінокислотних залишків. Пептиди, що не нейтралізували анти-МВР, охоплюють аміно-кінцеву (приблизно від 1 до 63 залишку) і карбокси-кінцеву (приблизно від 117 до 162 залишку) ділянки МВР людини. Очевидно, пептиди від різних ділянок МВР, що не перекриваються, нейтралізують одні й ті самі антитіла. Це може пояснюватися

ГФ) тим, що антитіла пізнають переривчастий епітоп, що містить аміногрупи різних ділянок. Подібний факт раніше спостерігали Грабі та ін. (НгиБру, 5., Аїмога, Е. С., Сгооте, М. Р. еї аЇ.,, Моїес. Іттип. 24: 1359-1364, ді 1987), який показав, що щуряче моноклональне антитіло має основний епітоп у послідовності МВР112-171 Її, в той же час, сильну перехресну реактивність з іншим епітопом 39-91. Це більш імовірно, ніж те, що антитіло має 60 перехресну реактивність по відношенню до двох, цілком різних послідовностей, які не утворюють переривчастого епітопу (НгибБу, 5., АЇмога, Е. С., Мапеизоп МК. Е. еї аїЇ.,, У. Меигоспет 44: 637-650, 1985).

Дані з нейтралізації можуть бути пояснені спроможністю пептидів, що відповідають різним ділянкам МВР, частково займати область антитіла, що зв'язує, взаємодіючи з різноманітними амінокислотами в бічних ланцюгах. Це пояснення підтверджується тим спостереженням" що пептиди, які забезпечують повне інгібування бо (МВРВО-97, МВРО1-106 і МВР75-95), приблизно в 100 разів менш ефективні у молярному відношенні, ніж інтактний МВР. Якщо виходити з вищевикладеної гіпотези, то причиною цього може бути те, що не кожний пептидний клон спроможний досягти енергії зв'язування з оригінальним епітопом МВР.

Приклад 2 Нейтралізація або модулювання іп мімо утворення антитіл до МВР людини

Відбір хворих і контрольні дослідження

Хворі, яких було відібрано для проведення даних досліджень, перебували під наглядом в клініці з доглядання і дослідження хворих на розсіяний склероз при Альбертському Університеті, Едмонтон, Канада.

Пацієнти були продіагностовані як хворі на розсіяний склероз за критерієм Шумахера (1965) із підтвердженням діагнозу за допомогою магнітно-резонансного методу одержання зображення мозку й імунохімічних профілей 7/0 бпинномозкової рідини (СЕ). Для ілюстрації того, що при хронічно прогресуючому розсіяному склерозі рівень анти-МВР стійко підвищений протягом тривалих періодів часу від місяців до кількох років, у хворих повторно брали пункції СЗЕ поперекового відділу з контролем вільних і зв'язаних анти-МВР. У хворих на хронічно прогресуюче захворювання М5 рівень аутоантитіл залишається стійко підвищеним протягом 11 років, і спонтанного спаду рівня анти-МВР не відбувається (див. у якості прикладу Фіг. 14).

Для підтвердження того, що підвищені у початковому стані рівні анти-МВР у С5Е залишалися порівняно постійними протягом 24 годин, у двох хворих (1Е56 і ЗМб66) брали зразки С5Е кожні 30 хвилин протягом 2 годин так само, як 24 години пізніше із контролюванням вільної зв'язаної форм анти-МВР (Фіг. 5А і 5В відповідно).

Хворі 156 і 3Мбб були в якості тимчасових контрольних об'єктів. Рівні вільних і зв'язаних анти-МВР в дослідженнях СЗЕ незмінно залишалися підвищеними при взятті проб кожні ЗО хвилин протягом 2 годин так 2о само, як і через 24 години.

Подібним чином був визначений також ефект уведення 5см З фізіологічного розчину в СЗЕ двом іншим хворим (4М45 і 5М59) (Фіг. 5С и 5Д відповідно). Ці хворі були тимчасовими контрольними об'єктами із фізіологічним розчином. При введенні 5см? фізіологічного розчину внутрішньооболонковим шляхом рівні Е і В анти-МВР залишалися підвищеними порівняно з базовим рівнем, коли зразки С5Е досліджувалися так, як Ге! описано вище, підтверджуючи таким чином, що "ефект розрідження" стосовно титрів анти-МВР був незначним. о

Рівні анти-МВР визначали шляхом твердофазного радіоіїмунологічного аналізу з МВР людини, адсорбованим у лунках планшета для мікротитрування "Іммулон". Лунки покривали ї0О0мкл МВР у концентрації 1Омкг/мл (Імкг/лунку) і інкубували протягом ночі при 37"С. Після нанесення ВЗА і трикратного відмивання водою, планшети витримувалися при кімнатній температурі. Зразки (10О0мкл) С5Е або екстракту тканини, розчинені в -- 0,010г ІдС/л (0,01М РВ5 буфер, 0,0595 Твін 20), інкубували в МВР-покритих комірках протягом 1-2 годин при кімнатній температурі. Після п'ятьох відмивань буфером (0,01 М РВ5, 0,0595 Твін 20) комірки інкубували з со антитілами кози до ІдсС-Ес кролика (0,01М РВ5, 0,0595 Твин 20, 0,595 ВЗА) протягом 1 години при кімнатній со температурі і потім відмивали, як описано вище. Нарешті, добавляли мічений 729| - протеїн А (або 1251 -протеїн о

С) і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Коли в якості мітки використовували 122І-протеїн

Зо (з, ВЗА у буфері для досліджень і для процедури виснаження заміняли на овальбумін. Після трикратного ісе) завершального відмивання водою кожну лунку обраховували індивідуально. Результати, виражені в одиницях радіоактивності, представлені таким чином: (зчитування зразка - зчитування контрольного об'єкта) х (зчитування загальної радіоактивності - зчитування контрольного об'єкта). Всі зразки досліджували в 10 « повторах, а час зчитування складав 10 хвилин для того, щоб зареєструвати » 10000 зчитувань для кожного позитивного зразка. З с Перед дослідженням усі зразки СЗЕ і/або зразки тканини розводили до кінцевої концентрації Ід 0,010Ог/л. "» Вільні Е анти-МВР визначали безпосередньо в С5Е або тканинному екстракті, тоді як рівні зв'язаних антитіл " визначали після кислотного гідролізу імунних комплексів. Неспецифічне зв'язування спостерігалося для кожного зразка в непокритих лунках. З метою локалізації епітопу синтетичні пептиди спочатку піддавали взаємодії з очищеними антитілами в рідиннофазовому конкурентному дослідженні, після чого анти-МВР визначали за

Ме. допомогою радіоіїмунологічного аналізу у всіх кінцевих сумішах. Результати аналізів конкурентного зв'язування о і радіоїмунологічного аналізу виражали через 95 інгібування синтетичного пептиду, визначений як 100 одиниць радіоактивності. Проби досліджувалися в 10 повторах і обраховувалися протягом 10 хвилин на лічильнику о ІЇКвВ1275 Міпідатта. Об'єднані виділені з тканини анти-МВР використовувалися в 5 попередньо приготовлених 2) 20 розведеннях у якості позитивних контрольних зразків. СЗЕ, зібрана від хворих на неневрологічні розлади, служила у якості негативних контрольних зразків. Відтворюваність досліджень складала від З9о до 595, а розкид -З даних становив менше 7905.

Наступним етапом досліджень стало визначення константи підвищених рівнів анти-МВР у С5Е у контрольних експериментах. 59 Контрольний "сліпий" експеримент фази І із дубльованим пептидом - внутрішньооболонкова ін'єкція

ГФ) Була проведена фаза 1 експерименту з визначення дії синтетичного пептиду МВР75-95 на титри Е і В анти-МВР у С5Р. Після затвердження в Науковій раді з етиці при Альбертському університеті проект був о здійснений за участю хворих із клінічно встановленим діагнозом М5 (Зспитаснег еї аї,, Апп. МУ Асай. зоі., 122, 552-568, 1965), важкохворих інвалідів із сильно прогресуючим захворюванням. Чотирнадцять хворих 60 погодилися добровільно брати участь у цьому дослідженні; 8 хворих були відібрані з початкового титру Е анти-МВР у СЗЕ (близько 8 одиниць радіоактивності) (Табл. 2) для одержання однієї внутрішньооболонкової ін'єкції або пептидів МВР75-95, що зв'язують анти-МВР іп міго, або контрольного пептиду МВРЗ35-58, що не зв'язує, (УМаітеп апа Саї;, 1993 р). Експеримент проводили за методом подвійного "сліпого" варіанта, коли ні дослідники, ні випробувані не знали природи речовини, що вводилася. Всі пептиди були закодовані сімома бо наугад вибраними однозначними номерами стороннім лікарем. Парні пептиди, розчинені в 5 см? фізіологічного розчину і введені в С5Е шляхом поперекової пункції, використовувалися зі зростаючими дозами (1, 2,5, 5 і 10 мг). СЗЕ досліджувалася до ін'єкції (базова лінія), із ЗО хвилинними інтервалами протягом 2 годин після ін'єкції, 24 години пізніше і потім із граничним інтервалом протягом 3-4 тижнів доти, поки рівні анти-МВР не повернулися до базового (вихідного) значення. Підрахунок клітин, визначення загального білка, глюкози, рівнів

Іо й альбуміну були зроблені для всіх зразків СОР. Рівні вільних і зв'язаних анти-МВР визначали за допомогою радіоїмуноанализу, як описано вище. а вії нин: ни ние Сх В НО т ПО т ПО НН ів вм 01111108 вжвадимея 10800000 в 00117009 вади |000110010910 ж м 800 вав 10009002 ме 01117611 вима 10016013 01110500 вла /10500000001000лаксм 011мка 11711114 бпаратарвавтаюя 81111117 11111111 у

В Табл. 2 наведені клінічні дані і рівні анти-МВР у С5Е у 14 хворих на хронічно прогресуючий М5, що дали згоду брати участь у фазі 1 наукових досліджень, які передбачають внутрішньооболонкову однократну ін'єкцію синтетичних пептидів МВР, Оскільки вихідний рівень вільних Е анти-МВР (78 одиниць радіоактивності) повинен о/р був бути високим, щоб одержати суттєву постін'єкційну зміну, для досліджень було відібрано лише 8 із 14 хворих. о

Всі пептиди, які використовувались в даних дослідженнях синтезувалися під кодом "продукт гарної якості" со (ОМР) на основі Елос (9-метоксикарбоніл) за методом Ргосуоп Іпс. (Ї. Опіагіо, Сапада). Чистоту пептидів контролювали за допомогою рідинної зворотно-фазової хроматографії на колонці С 18 з водо-ацетонітрильним -

Зз5 градієнтом, що включає 0,195 ТХУ. Мас-спектроскопія й амінокислотний аналіз проводилися за стандартними Ге) методиками. Перед уведенням усі пептиди тестувались на пірогенність (Ванкуверский Генеральний госпіталь,

Ванкувер, Канада), стерильність (місцева лабораторія Суспільної Охорони Здоров'я Північної Альберти,

Едмонтон, Канада) і гостру токсичність (Службова Лабораторія медичних досліджень Альбертського університету, Канада), Було показано, що вони "придатні" для введення людям. Відповідні кількості закодованих « синтетичних пептидів розчиняли в 5 см З стерильного фізіологічного розчину (0,995 Масі, ін'єкція ОБР, - с апірогенний, Вахіег Согр, Тогопіо, Сапада) фільтрували 2 рази крізь мембрану, що стерилізує, із розміром пор ц 0,22мкм (МіШех-ОХ, МійПіроге Согр., Ведгога, МА, ОА) і вводили в СЕ шляхом поперекової ін'єкції. ,» Порівняльні (серед пацієнтів) дослідження пептидів

Хворі 6ЕЗ33, 8М41, 4М45 і 156 одержували синтетичний пептид МВР75-95, спроможний зв'язувати анти-МВР іп міго, а пацієнти ТОЕЗ36, 1343, 5М59 і ЗМ6б одержували "контрольний" синтетичний пептид, що не зв'язує,

Ге») МВРЗБ-58 зі зростаючими дозами 1, 2,5, 5 і 1Омг відповідно (Фіг. 6). У хворого 6Е53 (Фіг. 68), що одержав 1мг

МВР 75-95, спостерігалося 75956 зменшення вільних анти-МВР із негайним поверненням їх до вихідного рівня; у («в) й . , я ри : хворого 8МА1 (Фіг. 60), що одержав 2,5 мг МВР 75-95, спостерігалося повне зв'язування з нейтралізацією вільних (95) анти-МВР, після чого, Через 24 години їх рівень повертався до вихідного; у хворого 4М45 (Фіг. 6Е), якому ввели БбБмг МВР7Б-95, відбулися різке і повне зв'язування з нейтралізацією вільних анти-МВР, що о продовжувалося протягом 7 днів із поверненням до вихідного рівня через 21 день; у хворого 1Е56 (Фіг. 6Н), - М якому ввели 10 мг МВР75-95, також відбулося повне зв'язування з нейтралізацією вільних анти-МВР, що продовжувалося протягом 7 днів, після чого рівень антитіл повернувся до вихідних значень протягом 14-28 днів.

Рівні зв'язаних анти-МВР несуттєво змінювалися при однократному внутрішньооболонковому введенні

МВР7Б-95. У хворих 1038, 13Р43, 5М59 і ЗМб66, яким було введено відповідно 1, 2,5, 5 і 10мг контрольного пептиду МВРЗ5-58, що не зв'язує, рівні вільних і зв'язаних антитіл у С5Е залишалися зміненими відносно

ІФ) вихідного протягом 24 годин експерименту (Фіг. бА, 6С, бЕ і 6 відповідно). Традиційні С5ЗЕ-параметри ко запалення при МБ, такі, як зчитування клітин, абсолютні рівні загального білка, ІдсС й альбуміну, олігоклональне зв'язування, індекс Ідс і синтез (ДО в СМ5, залишалися незмінними до і після введення пептиду. 60 Порівняльні дослідження пептидів при введенні одному пацієнту Ці дослідження проводилися для того, щоб звести до мінімуму варіації результатів, отриманих в дослідженнях декількох хворих. У хворого 5М59, якому вводили або фізіологічний розчин (тимчасовий контроль) або 5мг пептиду МВР35-58, що не зв'язує, рівні вільних анти-МВР залишалися підвищеними відносно вихідного рівня в обох експериментах (Фіг. 7А). Хворому 4М45 спочатку вводили фізіологічний розчин (тимчасовий контроль), а двома місяцями пізніше йому ввели 5мг 65 МВР7Б-95. Рівні вільних анти-МВР у хворих запишалися стійко підвищеними у всіх зразках, зібраних під час контрольного експерименту, і стали такими, що не виявлялися, після введення МВР75-95 (Фіг. 7Б). Подібні результати були отримані й у хворої 156, що мала стійко підвищені рівні вільних антитіл протягом контрольного експерименту, а після введення 10 мг МВР7Б-95 її вільні анти-МВР стали такими, що не виявлялися (Фіг. 7С). Повне дослідження було проведено з хворим ЗМб66. У нього рівні вільних анти-МВР були стійко підвищеними протягом контрольного експерименту, а також при введенні ї0мг МВРЗ35-58; проте, коли йому було введено 10мг МВР 75-95, вільні анти-МВР стали цілком нейтралізовані і не виявлялися протягом 7 днів (Фіг. 70).

Повторне введення синтетичного пептиду МВР 75-95

Після встановлення того, що пептид МВР75-95 нейтралізує вільні анти-МВР іп мімо протягом періоду, 70 більшого за 7 діб, було прийняте рішення про повторне введення ї0мг МВР75-95 у спинномозкову рідину щотижня протягом 10 тижнів. Цей експеримент був проведений за участю трьох хворих на прогресуючий М5, що не брали участь в експерименті з однократного введення пептидів і дали згоду на це дослідження. Вільні і зв'язані анти-МВР визначалися за 1-2 тижні до першого введення, до і після ЗО хвилин після кожної ін'єкції і знову через 1 і 2 місяця після останньої ін'єкції. Зчитування клітин, загальний білок, глюкозу, ДО й альбумін визначали у всіх зразках С5Е, отриманих перед кожною із 10 ін'єкцій. Перед першою і після останньої ін'єкції відбирали кров і аналізували вміст електролітів, креатиніну, ферментів серця і печінки і гематологічні показники.

Коли хворі на хронічно прогресуючу форму М5 одержували повторні внутрішньооболонкові ін'єкції 1Омг

МВР7Б-95 із однотижневим інтервалом (протягом періоду до 10 тижнів), спочатку високий рівень вільних 2о анти-МВР міг ставати таким, що не виявлявся, поки вводився пептид; коли пептид припиняли вводити, рівень вільних анти-МВР повертався на вихідний протягом 1 місяця (Фіг. 8). Титри зв'язаних антитіл запишалися постійно високими в ході всього експерименту, засвідчуючи те, що у даних хворих синтез анти-МВР продовжувався, і внутрішньооболонкове введення пептиду давало на вільні антитіла анти-МВР лише ефект "стирання". сч

Хворі, що брали участь у цих дослідженнях і одержували чи то одноразові ін'єкції синтетичних пептидів, чи то повторювані щотижня ін'єкції, мали хронічно прогресуючий розсіяний склероз із підвищеним ступенем і) неврологічних ушкоджень. Жодний із цих хворих не повідомив про погіршення неврологічних симптомів або про загострення хвороби М5, що стали результатом внутрішньооболонкового введення пептидів, і клітинна реакція в

СЗЕ не розвивалася. Хворі, що одержували повторні введення МВР 75-95, піддавалися контролю щодо розвитку - п зр Можливих соматичних ускладнень, включаючи зміни електролітів, а також дисфункцію серця, печінки, нирок і гематологічні зміни. При цьому жодних небажаних ускладнень не було виявлено. і,

Внутрішньовенне ведення МВР 75-95 с

Після встановлення того факту, що внутрішньооболонкове введення пептиду МВР75-95 приводить до зв'язування вільних анти-МВР без зміни рівня зв'язаних антитіл, було вирішено визначити вплив о внутрішньовенного введення того ж пептиду на титри в С5Е вільних і зв'язаних анти-МВР. Для цього 500мг «о

МВР7Б5-95 розчиняли в 100см? фізіологічного розчину і через 30 хвилин уводили внутрішньовенне хворому 8М4А1 при постійному контролі анти-МВР у С5Е кожні 30 хвилин протягом перших двох годин, через 18 годин, а також через 10, 16 ії 30 днів. Кров відбирали перед ін'єкцією, а також Через 16 і 30 днів, і аналізували на « утримання електролітів, креатиніну серцевих і печінкових ферментів і гематологічні показники. У 70 спинномозковій рідині визначали кількість клітин, загальний білок, глюкозу, вміст дО й альбуміну. Ніяких - с негативних ефектів не спостерігалося. ц Як показано на Фіг. 8, внутрішньовенне введення 500мг МВР75-95 не дає ніяких змін у рівнях титрів "» зв'язаних і вільних анти-МВР у СЗЕ протягом перших двох годин; 3095 падіння рівня вільних анти-МВР у СЕ спостерігалося через 18 годин. Коли С5Е повторно піддавалася аналізу через 10, 16 і ЗО днів, рівні вільних і зв'язаних анти-МВР опускалися нижче вихідного - з 11 одиниць радісактивності до 4, 2 і 1 одиниць відповідно.

Ге») При повторних спостереженнях у пацієнтів із внутрішньооболонковими ін'єкціями МВР часто спостерігалася стійкість підвищених рівнів зв'язаних антитіл, тоді як вільні анти-МВР після внутрішньооболонкової ін'єкції о МВР7Б-95 були такими, що не виявлялися. Це свідчить про те, що запальний процес, викликаний оз аутоантитілами проти МВР, залишається активним під час і після внутрішньооболонкового введення МВР 75-95.

Для підтвердження цього спостереження МВР75-95 було введено внутрішньовенне пацієнту, що попередньо о одержав внутрішньооболонкову ін'єкцію пептиду. - М Після внутрішньовенного введення рівні як вільних, так і зв'язаних антитіл у С5Е значно знижувалися при спостереженні протягом місяця. Зниження як вільних, так і зв'язаних антитіл С5Е після внутрішньовенного введення МВР75-95 означає, що має місце знижувальна регуляція аутоїмунного запального процесу,

Відповідального за синтез анти-МВР. Подальші спостереження показали, що рівень анти-МВР почав зростати через 4-6 місяців після першого внутрішньовенного введення. Друге внутрішньовенне введення того ж пептиду

Ф, виробило низьку регуляцію синтезу анти-МВР терміном до 2 років у приблизно 70 різних хворих на хронічний ко прогресуючий М5.

МВР епітоп для анти-МВР при М5 во Для визначення локалізації МВР епітопу для анти-МВР при МЗ5 вільні і зв'язані анти-МВР, очищені афінною хроматографією із СЕ і тканини мозку хворих на М5 (УУаітеп К. 0., еї аІ., Апп. МеийгоїЇ. 35, 280-283, 1994), піддавали взаємодії в дослідженнях з конкурентного інгібування зі 41 послідовним синтетичним пептидом МВР однакової довжини (кожний пептид складався з 10 залишків і перекривав сусідній на 9 залишків), що займав ділянку між 61 і 110 залишками МВР людини. Було встановлено, що пептид(и), які забезпечують максимальне 65 інгібування, найбільш міцно з'єднуються з антиген-зв'язувальною областю антитіла.

Максимальне інгібування (18090) очищених вільних і зв'язаних анти-МВР із тканини мозку хворого на розсіяний склероз (Фіг. 10) забезпечувалося чотирма декапептидами, позначеними як МВР84-93, МВР85-94,

МВРУ8б6-95 і МВР87-96, дозволяючи припустити, що епітоп МВР для анти-МВР локалізований між 84 і 96 залишками. Мінімальна ділянка загальних амінокислотних залишків знаходиться між 87 і 93 залишком. Зв'язані антитіла мають більш обмежену спрямованість, ніж вільні антитіла.

Значення антитіл проти анти-МВР у патогенезі демієлінізації при розсіяному склерозі ще не встановлене і може бути визначене лише модулюванням анти-МВР іп мімо і послідовним спостереженням за клінічними і патологічними проявами. Наприклад, під час гострих стадій М5, коли співвідношення вільних і зв'язаних антитіл становить вище 1, пептид, що відомий як такий, що зв'язує вільні анти-МВР, може бути введений 70 внутрішньооболонково для того, щоб зв'язати вільно антитіла, що вільно циркулюють, і скоригувати клінічні симптоми гострого рецидиву; щотижневе введення може бути необхідним до настання ремісії. Для пацієнтів із хронічно прогресуючим захворюванням внутрішньовенне введення пептиду, так само як і внутрішньооболонкове ведення, може бути необхідним для регулювання механізмів запалення, що викликані анти-МВР.

ПРИКЛАД З

Відповідне дозування для внутрішньооболонкового введення РМВР86-95 або рМвВР82-98 хворим із гострими рецидивами

Для рецидивів розсіяного склерозу характерні значення Б/В анти-МВР більші за 1,0, оскільки в С5Е переважають вільні антитіла. Зазвичай протягом трьох місяців по мірі переходу рецидиву в наступну фазу видужання/ремісії, рівень Е анти-МВР поступово знижується і з настанням повної біологічної ремісії Є і В анти-МВР стають такими, що не виявляються в С5Е.

У хворих, які брали участь в експериментах, описаних у наступних Прикладах, діагностували рецидивно-зворотний або рецидивно-прогресуючий розсіяні склерози.

У даному і наступних Прикладах застосовували РМВР86-95 або рМвВРє 82-98.

Пептид рМВРЗ86-95 дуже слабко розчинювався у фізіологічному розчині, оскільки містив чотири гідрофільних і сч ов Шість гідрофобних залишків. З іншого боку, пептид рМВР82-98 мав підвищену розчинність у фізіологічному розчині, оскільки містив п'ять додаткових гідрофільних залишків. (8)

В експериментах, які мають метою визначити відповідні дозування для внутрішньооболонкового введення рмМвРВ6-95 або рМвРЗ82-98, що негайно знижували 6 кількість Е анти-МВР до такого рівня, що не виявляється, брали участь двоє хворих. У одного хворого був гострий рецидив атаксії з втратою рівноваги. З початком -п зо рецидиву цьому хворому була зроблена одинична внутрішньооболонкова ін'єкція 1Омг рМвВР86-95; кількість Е і В антитіл визначали до ін'єкції і через 1 годину після ін'єкції а також ще 5 разів протягом наступних З о місяців. Застосоване дозування РМВРУЗ6-95 придушувало Е анти-МВР лише частково, і крива відновлення рівня с антитіл була близькою до природної; у цього хворого продовжувалися прогресуючі спастичні парапарези й атаксія. Був зроблений висновок про те, що одинична внутрішньооболонкова ін'єкція ТОмг рРМВРУ86-95 не є о

Зз5 достатньою для повного придушення Е анти-МВР і зміни природної швидкості видужання. «о

У іншого хворого, 18-річної жінки з гострим оптичним невритом, якій робили одиничну внутрішньооболонкову ін'єкцію 5Омг рМВРЗб-95, кількість Б і В антитіл визначали до ін'єкції і через ЗО хвилин після ін'єкції.

Через 30 хвилин після ін'єкції вільні антитіла не виявлялися. Хвора не погодилася на наступні поперекові пункції. Був зроблений висновок, що для зв'язування і нейтралізації Е анти-МВР у СЗЕ на термін не менше 30 «

ХВИЛИН потрібна доза не менш, ніж 50 мг рМВР86-95. з с ПРИКЛАД 4

Частота і тривалість уведень хворим із моносимптоматичними рецидивами ;» У даному експерименті визначали частоту і тривалість уведень РМВР, що потребуються для підтримки низького або такого, що не виявляється, рівня вільних антитіл протягом тривалого часу. Чотири пацієнти, які приймали участь у даному експерименті, одержували синтетичні пептиди протягом першого тижня рецидиву.

Ге» У перших двох хворих були рецидиви гострого одностороннього оптичного невриту. Одному з них (фіг. 11 а) було проведено дві внутрішньооболонкові ін'єкції бХОмг рМВРЗ86-95 (ЇНИ, йЖ2) з інтервалом чотири тижні. Після о кожної ін'єкції вільні Е анти-МВР ставали такими, що не виявлялися протягом 1 години. Через тиждень після оо першої ін'єкції рівень Е анти-МВР був підвищений, а через 4 тижні рівень Е анти-МВР був дуже високий. В цей 5р Момент хворому була зроблена друга внутрішньооболонкова ін'єкція (22), і Е анти-МВР стали такими, що не о виявлялися протягом 30 хвилин. Протягом наступних 24 годин їх рівень не контролювали. Був зроблений

Кк висновок, що вибрана частота є недостатньою і що для підтримки незначного рівня антитіл можуть знадобитися багатократні ін'єкції протягом першого тижня рецидиву.

Другому хворому з повним одностороннім оптичним невритом проводили множинні внутрішньооболонкові дво ін'єКцїї 50мг рМВРЗ2-98 протягом першого тижня рецидиву: чотири щоденні ін'єкції (фіг. 110: Я, 2,

НЙАЗ, 4) ії п'яту ін'єкцію (Й5) через тиждень. Профіль анти-МВР у даного хворого показав упевнене і

Ф) швидке зниження протягом семиденного періоду. Важливо, що і через 7 тижнів, і 6 місяців рівень анти-МВР у ка С5Е даного хворого залишався таким, що не виявлявся, і хворий не відчував рецидивів оптичного невриту та будь-яких інших рецидивів розсіяного склерозу. Крім того, одностороння сліпота, що була вторинною відносно бр невриту, була цілком усунута.

Та ж сама схема щоденних внутрішньооболонкових ін'єкцій ХОмг рМВвВР82-98 була застосована до хворих на розсіяний склероз із різноманітними типами моносимптоматичних рецидивів. На Фіг. 11е показано профіль анти-МВР у хворого з гострим псевдоатетозом лівої руки, якому були зроблені п'ять щоденних внутрішньооболонкових ін'єкцій 50 мг рМВРВ82-98 (Й, 2, З, 4, ЙЖ5) протягом другого тижня 65 рецидиву. Рівень вільних антитіл знизився до такого, що не виявлявся, протягом 4 днів і залишався таким на 11 день і через місяць. Функція лівої руки у хворого відновилася настільки, що він знову зміг водити мотоцикл і грати на гітарі.

У останнього хворого з даної групи був приступ гострої лівосторонньої геміплегії, ускладненої на хронічний прогресуючий розсіяний склероз. Йому було зроблено чотири внутрішньооболонкові ін'єкції 5Омг рРМВРВ82-98 (ЇЙ, 2, З, й4, ййЖ5) з інтервалами 2-3 дні. Кількість анти-МВР визначали до і через 30 хвилин після кожної ін'єкції (Фіг. 1714: Й, їй2, З, 84), а також через 10 днів після першої ін'єкції.

У вихідному стані підвищений рівень вільних антитіл знизився до такого, що не виявлявся, протягом 7 днів, після чого хворий за своїми клінічними та біохімічними параметрами повернувся у вихідний прогресуючий стан, і незабаром після цього хворому було введено внутрішньовенно 400мг рРМВРОЗ6-95. Після цієї ін'єкції рівень /о зв'язаних антитіл залишався зниженим протягом 4 місяців. Проте, після останньої поперекової пункції, проведеної через 8,5 місяців після внутрішньовенної ін'єкції, захворювання повернулося до свого хронічного прогресуючого перебігу як клінічно, так і біохімічне.

ПРИКЛАД 5

Частота і тривалість уведень пептидів хворим із полісимптоматичними рецидивами

Ті ж самі МВР-пептиди потім уводили хворим із полісимптоматичними рецидивами, при яких порушеними є різноманітні області центральної нервової системи. У цю групу входили три пацієнти: один зі зворотно-рецидивною і два зі зворотно-прогресивною формами захворювання.

У першого хворого - жінки - був гострий полісимптоматичний рецидив. У перший тиждень рецидиву їй було проведено три ін'єкції 5Омг рМВРУЗЄБб-95 у дні 1, З і 7 (Фіг. 12: БМ, 2 і ййЗ3). Кількість анти-МВР 2о визначали до і через 30 хвилин після кожної ін'єкції. Після цих трьох ін'єкцій вільні анти-МВР були придушені до рівнів, що майже не виявлялися. Зроблений через місяць аналіз показав зростання кількості вільних анти-МВР, а через 1,5 місяця наступив новий рецидив, який був підтверджений клінічно і біохімічно. У цей час хворій був проведений другий курс із чотирьох внутрішньооболонкових ін'єкцій ХОмг рРМВРЗ6-95 у дні 45, 48, 49 і 50 рецидиву (4, 5, йЯб і 87). Кількість анти-МВР визначали до і через ЗО хвилин після кожної сч ов Ін'єкції, і ще три рази протягом наступних двох місяців. Знову ж Е анти-МВР були придушені щонайменше на два тижні, але у хворої знову наступив рецидив, і рівень вільних антитіл при цьому повернувся до вихідного і) дорецидивного значення. Очевидно, необхідно більш тривале внутрішньооболонкове введення синтетичного пептиду для того, щоб підтримувати Е анти-МВР на низьких рівнях або таких, що не виявляються.

У другого хворого був зворотно-прогресуючий розсіяний склероз (фіг. 13). «- зо Коли хворий знаходився в прогресивній фазі (Е-В), йому була зроблена внутрішньовенна ін'єкція 500мг рМВРЗБ-95 (ІМ'Я). При тому, що кількості вільних і зв'язаних антитіл залишалися зниженими протягом місяця, о через 9 тижнів у хворого наступив полісимптоматичний клінічний рецидив, який характеризувався надзвичайно (се підвищеним рівнем Е анти-МВР. У цей час йому були проведені три внутрішньооболонкові ін'єкції 5Омг рРМВРОУЗБ-95 (Я, йй2 і З) у 1, З ії 12 дні рецидиву, а кількість анти-МВР визначали до першої і третьої о ін'єкцій і через 30 хвилин і 24 години після них. Обстеження через місяць показало, що хворий повернувся до «о вихідного клінічного і біохімічного статусу прогресуючого спастичного парапарезу. Потім через 2 тижні йому була зроблена друга внутрішньовенна ін'єкція Х00мг рРМВР86-95 (ІМЯ2). У порівнянні з вихідними рівнями його здатність стояти і ходити значно поліпшилася.

Останньому хворому з даної групи, який знаходився в прогресивній фазі (Е-В), (фіг. 14), була зроблена « Внутрішньовенна ін'єкція 500мг рМВРЗ6-95 (ІМЯ). Рівень анти-МВР у СЗЕ визначали через 9 днів, потім з с щомісяця протягом двох місяців і через 4, 5 місяців після (МЯ1). Після цієї ін'єкції рівні вільних і зв'язаних анти-МВР залишалися зниженими протягом 2 місяців; через 4, 5 місяців після ІМЯ! хворий став ;» скаржитися на зростаючу слабість, що було підтверджено клінічно і біохімічне підвищеними рівнями антитіл, характерними для хронічного прогресуючого захворювання. Протягом наступного місяця хворому була проведена друга внутрішньовенна ін'єкція 500мг рРМВР82-98 (ІМЯ2). Аналіз зразка СЗЕ, узятого перед другою

Ге» ін'єкцією, свідчив про гострий характер рецидиву (Е»2В), і наступного дня у хворого розвилася гостра диплопія через лівосторонній парез прямої кишки. У цей час хворий явно знаходився в стані клінічного і біохімічного о рецидиву, що продовжувався більше 4,5 місяців і характеризувався втратою рівноваги, слабістю в ногах і 2) двоїнням в очах. Для того щоб знизити рівень Е анти-МВР, хворому було проведено два курси внутрішньооболонкових ін'єкцій рРМВР82-98. У ході першого курсу, початого через 4-5 місяців після початку о рецидиву, хворому вводили 50мг РМВР82-98 щодня протягом 5 днів (Й, 2, З, 4 і йБ5), а кількість як анти-МВР, що визначалася перед кожною ін'єкцією і через ЗО хвилин після неї, залишалася підвищеною.

Оскільки рецидив не припинявся, а гострота стану хворого не знімалася, було вирішено провести другий курс із більш високими дозами пептиду і більшою частотою введення. Хворому робили по дві ін'єкції їЇ00мг рМВР82-98 ов на день протягом двох днів (дні 19 і 20: їйб, КУ, йЯ8 і йЖ9). Кількість анти-МВР визначали перед кожною ін'єкцією і через 30 хвилин після неї. По завершенні другого курсу ін'єкцій Є анти-МВР були знижені до

Ф) надзвичайно малих значень, і при перевірці Через тиждень (28 день) профіль СЗЕ у даного хворого був ка характерним для повільно прогресуючого захворювання (Р/В анти МВР - 1,0). У цей час хворому була зроблена третя внутрішньовенна ін'єкція 5Х00мг РМВР82-98 (МЯЗ), яка більше не знизила утворення анти-МВР. 60 ПРИКЛАД 6

Внутрішньовенне введення пептидів МВР для запобігання наступних рецидивів

Двом хворим она зворотно-прогресуючий розсіяний склероз із частими рецидивами проводили внутрішньовенні ін'єкції РМВР86-95 або рМвВР82-98 для того, щоб визначити при якому з способів уведення вдасться запобігти наступним рецидивам. 65 У першого хворого (жінки) рецидиви наступали 2-3 рази на рік протягом 4 років, що призводило до поступової прогресії спастичного парапарезу (Фіг. 15). Хворій були зроблені дві внутрішньовенні ін'єкції з інтервалом 6 місяців, одна 400мг рРМВРЗ6-95 (ІМЯ!) і друга 400мг рМвВР82-98 (ІМЯ2); клінічне обстеження й аналіз С5Е проводили щомісяця. На Фіг. 15 представлено рівні анти-МВР, що спостерігалися протягом 9 місяців (верхня частина в рамці). Перша внутрішньовенна ін'єкція привела до придушення синтезу анти-МВР на 2 місяці.

На третій місяць після ін'єкції у хворої наступив клінічний рецидив; на жаль, зразок С5Е у цей момент узятий не був. Протягом наступних 2-3 місяців після того, як рецидив припинився і захворювання перейшло в хронічну прогресуючу фазу, хворій була зроблена друга внутрішньовенна ін'єкція (ІМ22). Рівень анти-МВР у С5Е знову були знижений на 2 місяці, але через три місяці, після другої ін'єкції, у хворої наступив рецидив, пов'язаний зі значним підвищенням Е анти-МВР. Подібно частоті рецидивів, характерній для 4 попередніх років, у даної 7/о хворої спостерігалися 2-3 рецидиви на рік, незважаючи на дві внутрішньовенні ін'єкції РМВР 86-95 ї РМВР 82-98.

Друга хвора (фіг. 16), яка переносила від 1 до 4 рецидивів на рік протягом 10 років (верхня шкала), страждала на параплегію і була прикута до інвалідного крісла. Протягом одинадцятого року хвора знову перенесла 4 рецидиви (верхня частина в рамці), хоча й одержувала внутрішньооболонкові і внутрішньовенні ін'єкції синтетичних пептидів МБР. У ході першого рецидиву, після двох внутрішньооболонкових ін'єкцій 5Омг рМВРУ8Б6-95 в 1-й і 6-й дні (І, йй2 відповідно) рівень Е анти-МВР у неї значно понизився; на 6 день їй також була зроблена внутрішньовенна ін'єкція ЗОО0мг рРМВРЗ6-95 (ІМ), що викликало придушення як В, такі Е анти-МВР на наступні три місяці. Через чотири місяці після внутрішньовенної ін'єкції у хворої наступив клінічний рецидив, який із часом загострювався: рівень антитіл у С5Е був різко підвищений. Через 6,5 місяців після внутрішньовенних ін'єкцій (ІМ) хворій провели курс із чотирьох щоденних ін'єкцій ХО0мг рМВР82-98 (йЗ, 2о МА, ІНК і ПАб), котрими також не вдалося понизити рівень вільних антитіл і зняти клінічний рецидив.

ПРИКЛАД 7

Порівняння різноманітних способів уведення пептиду

На початкових етапах експерименту синтетичні пептиди МВР уводили восьми хворим на прогресуючий хронічний розсіяний склероз. Хворим внутрішньооболонковим шляхом вводили МВР-зв'язуючий пептид сч МВР7Б-95 та контрольний незв'язуючий пептид МВРЗ35-58 у дозах, що збільшувались від 1 до 10 мгу 5 мл фізіологічного розчину; чотирьом хворим, котрим спочатку уводили контрольний незв'язуючий пептид МВР35-58, і) пізніше уводили зв'язуючий пептид МВР 75-95.

Уведення МВР75-95 у С5Е приводило до тимчасової нейтралізації вілоних МВР-специфічних антитіл; впливу на зв'язані антитіла при цьому не спостерігалося. Тривалість ефекту становила приблизно 1 годину (1мг «- зо пептиду), 24 години (2,5мг пептиду) або 7 днів (5-1Омг пептиду). Оскільки ефект внутрішньооболонкового введення пептиду був неповним (рівень В анти-МВР залишався підвищеним) і порівняно нетривалим, цей спосіб о уведення порівняли з внутрішньовенним уведенням. На відміну від внутрішньооболонкових ін'єкцій, через місяць с після одноразової внутрішньовенної ін'єкції як вільні, так і зв'язані анти-МВР були такими, що не виявлялися, і їх рівні залишалися низькими протягом З місяців, а після бустерної ін'єкції - на термін до 26 місяців (Фіг. о 17). На сьогодні аналогічні спостереження були проведені приблизно над 70 хворими на хронічний прогресуючий «о розсіяний склероз, котрим внутрішньовенне вводили такі МВР-зв'язуючі пептиди, як МВР75-95, МВРО86-95 та

МВРВ2-98. Була вибрана доза 50Омг (мг/кг ваги тіла) у 10-5Омл фізіологічного розчину через більший обсяг крові порівняно з СЕ (чинник 15) і швидкого виведення пептидів із кровотоку нирками; дози пептидів, що відповідають уведеним внутрішньовенно, внутрішньооболонково не вводили, оскільки такий обсяг не може бути « 70 введений у СЗРЕ. Таким чином, можна зробити висновок, що внутрішньооболонкове введення пептидів у дозах, у с перевірених на даних хворих, приводило до тимчасового ефекту "стирання" лише стосовно Е анти-МВР; на відміну від цього, внутрішньовенні ін'єкції придушували синтез анти-МВР. Однократна внутрішньовенна ін'єкція ;» індукувала тривалу толерантність.

ПРИКЛАД 8

Тривалість толерантності після внутрішньовенного введення пептиду МВР

Ге» З урахуванням отриманих результатів було здійснене дослідження кинетики толерантності щодо МВР, і на сьогодні отримані дані приблизно по 70 хворих, що перебували під наглядом протягом 2 років після численних о внутрішньовенних ін'єкцій МВР75-95, МВРУЗЄБ6-95 або МВРВ82-98. Дози пептиду складали 5-бмг/кг ваги тіла 2) (275-500 мг) і уводилися внутрішньовенно в 10-50мл фізіологічного розчину. До внутрішньовенних уведень 5р пептиду у всіх 13 хворих відзначені високі рівні вільних і зв'язаних анти-МВР антитіл у СЗЕ (Фіг. 18, Таблиця о 3). Через місяць після введення пептиду МВР-специфічні антитіла були такими, що практично не виявлялися, і їх як рівень зазвичай залишався низьким протягом 3-4 місяців, після чого починав збільшуватися; у деяких хворих через 8 місяців цей рівень повертався до вихідного. У термін 6-10 місяців після (ІМЯ) усім хворим проводили бустерну ін'єкцію (ІМЯ22) 275-500мг (5-бмг/кг ваги тіла) рМВР(82-98) у 1Омл фізіологічного розчину (ІМЯ).

Більш довгий пептид, вибраний для другої ін'єкції, був більш розчинним і тому міг вводитися в меншому обсязі розчину. В цілому у даній групі рівень анти-МВР у С5Е різко знижувався протягом періоду від 6 тижнів до 2

Ф) місяців із моменту ін'єкції і залишався таким, що не виявлявся, протягом тривалого часу (до 26 місяців). З ка усієї групи приблизно із 70-и хворих один хворий не зміг завершити експеримент через легеневий тромб і наступне лікування антикоагулянтами, що виключало поперекові пункції, а інший був виключений із дослідної бо Групи, оскільки одержував внутрішньовенне великі дози кортикостероїдів. Із приблизно 70-и хворих у 63 хворих через 18-26 місяців після бустерної ін'єкції анти-МВР були такими, що не виявлялися.

ПРИКЛАД 9

Стійка толерантність у хворих із гаплотипом НІ А-ОК2

Гаплотипьі НГА-ОК хворих на розсіяний склероз визначали молекулярним типируванням геномної ДНК 65 (Таблиця 3). У чотирьох з одинадцятьох хворих, що брали участь в експерименті, було відзначене захворювання, пов'язане з гаплотипом ЮОК2 (0ОКВ171501 або ОКВ1715021); у всіх цих хворих відзначені низькі або такі, що не виявлялися, рівні аутоантитіл протягом одного року після другої внутрішньовенної ін'єкції пептиду МВР. Пептид МВР зв'язувався НІ А-ОК2 із високою афінністю і був імунодомінантним для

НГА-ОВ2-рестрицированих МВР-специфічних Т-клітин. НГ А-ОК4 (ОКВРО4О1) ії НГА-ОК7 (ОКВ170701) зв'язували введений пептид МВР; дослідження зв'язування не було виконано по відношенню до молекул ОК хворого КІМ) (окКв170407, ОКВ170801). Пептид МВР не зв'язувався НІ А-ОКЗ (ОКВ 1703011); два пацієнти, у яких наприкінці експерименту були відзначені високі рівні анти-МВР, мали гаплотип ОКВ 1703011 (Таблиця 3). Наведені результати показують, що тривалість толерантності до МВР залежить від гаплотипу хворого. Толерантність може бути більш тривалою, коли толерантними є як Т, так і В МВР-специфічні клітини. ів сч о

Наведено гаплотипи 11 хворих на розсіяний склероз, які пройшли обстеження через 1 рік із моменту другої «-- зо Внутрішньовенної ін'єкції пептиду (ІМЯ). У всіх чотирьох хворих із гаплотипом НГА-ОК2 (ОКВ171501 або

ОКВІ1715021) рівень аутоантитіл залишався низьким протягом року після (ІМЯ). о

ПРИКЛАД 10 со

Підшкірні ін'єкції пептиду не індукують толерантності

Провели дослідження оптимального способу введення пептиду на групі з 33 хворих на розсіяний склероз о

Зз5 шляхом підшкірних ін'єкцій МВР82-98 у фізіологічному розчині. У 26 хворих одноразова підшкірна ін'єкція Ге) зростаючих кількостей (від 1 до 1000мг) МВР82-98 не впливала на рівень аутоантитіл у СЗЕ (дані не наведені); восьми хворим із групи була згодом зроблена внутрішньовенна ін'єкція пептиду, і протягом двох місяців кількості аутоантитіл у С5Е залишалися такими, що не виявлялися (Таблиця 4А). У п'ятьох інших хворих сумарна доза 900-100Омг (5 х 500мг щодня протягом п'ятьох днів, а потім ще одна підшкірна ін'єкція 400 або « збОмг) приводила лише до помірного зниження рівня анти-МВР аутоантитіл у СЗЕ (Таблиця 4В). Для того щоб шщ с перевірити чи не виявиться інший графік уведень більш ефективним, двом хворим були зроблені по дві підшкірні й ін'єкції 250мг МВР82-98 з інтервалом один місяць (Таблиця 4С). У цьому випадку також рівень аутоантитіл не «» змінився. Сукупність наведених результатів показує, що лише внутрішньовенне введення пептиду МВР індукує тривалу толератнтность до МВР при використанні тих доз пептиду, що були застосовані в даному експерименті.

Ф

Код хворого |Доза РМВР (82-98), Вихідне Через 6-7 Час, що Вихідне |Доза рМВР (82-98), Через 2 |Через 4

Ф

ЕР 15 двифмелогом! 6 езев, о 4ою ломи тя то) (95) ваза змувві ввовавя вію во

Фо ж 17777971 виовоутм ви) 80веівв)вю 03030) -х лег 17111 дееломлов ез) 6 лося! бо Би м) ям 759000 повлознитм 60075 яю) 00во 0 вв в 17000 ялоявіви ва) вв тата) юю хм | 0100 дев та ев) 45 97901 вою ао тет о ям 17771лоол ве ва оєном 45 овіяи!) во соте вв з 60 підшкір значення тижнів (міс) підшкір тижнів

ІН вому 0100зобахво 0 (веови ве ві 00001030 б5 ОС(Е) 100/4 х 5 46|48|2,7 11,9 0,5 БОО 3,012,8 ве 1 обахво т4|вв|зл|38| 5.1.0 ряря, берюдю 111110 (в вія» 46001010 3028,

Середнє 121,7. 14123 0,7 відхилення нн нн их В У ЕТ д

А. У восьми хворих одноразові підшкірні ін'єкції МВР(82-98) (5-100мг у 1-5мл фізіологічного розчину) не вплинули на рівень МВР аутоантитіп. Навпаки, одноразова внутрішньовенна ін'єкція (400-50Омг) того ж самого пептиду, зроблена через 4,5-8 місяців, привела до того, що аутоантитіла з СЕ були такими, що не виявлялися.

В. Повторні підшкірні ін'єкції великих доз МВР(82-98) (100мг/день протягом п'ятьох послідовних днів) справили незначний ефект на рівні анти-МВР у ЦСЖ; додаткове уведення великої дози (400 або 500мг)

МВР(82-98), зроблене підшкірно через два тижні після першої серії ін'єкцій, не знизила далі рівня аутоантитіл.

С. Дві підшкірні ін'єкції великих доз МВР(82-98) (2х25О0мг, з інтервалом 1 місяць) не вплинули на кількість аутоантитіл проти МВР у С5БЕ.

Сукупність наведених даних свідчить про те, що лише внутрішньовенний спосіб введення є ефективним для індукції толератності до МВР.

У кращі варіанти здійснення винаходу можуть бути введені модифікації, які не порушують сутності й обсягу винаходу, визначені в наступній формулі. с щі 6)

Claims (6)

Формула винаходу

1. Спосіб лікування розсіяного склерозу у хворого, який відрізняється введенням даному хворому ефективної - кількості пептиду за формулою: Авр Си Авзп Рго Маї Ма! Ніз Рпе Рпне Гуз Авп Іе Маї Тиг Рго Ага ТАг; включно с заміни або делеції в даному пептиді за умов, що дані заміни або делеції дають пептид, здатний нейтралізувати або модулювати утворення антитіл до мієлінового основного білка, у суміші з фармацевтично прийнятним (зе) носієм. о

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що пептид уводять внутрішньовенно, внутрішньооболонково або обома шляхами. (Се)

3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що пептид уводять внутрішньовенно дозою в межах від 1 мг/кг ваги тіла до 10 мг/кг ваги тіла.

4. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що пептид уводять внутрішньооболонково дозою в межах від 1 мг « до 100 мг.

5. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що пептид уводять щодня протягом чотирьох або п'яти днів. -

с

6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що приблизно через один тиждень після першої ін'єкції вводять "з додаткову дозу пептиду. п (о) («в) (95) (95) - іме) 60 б5