ES2301106T3 - Metodo fluorimetrico para el seguimiento y la deteccion de la amplificacion de acidos nucleicos. - Google Patents
Metodo fluorimetrico para el seguimiento y la deteccion de la amplificacion de acidos nucleicos. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para detectar la amplificación de ácidos nucleicos en una muestra que comprende realizar la amplificación de ácidos nucleicos sobre un polinucleótido diana en presencia de (a) una polimerasa de ácidos nucleicos, (b) un cebador capaz de hibridar con dicho polinucleótido diana y (c) una sonda oligonucleotídica que es capaz de hibridar con dicho polinucleótido diana y que comprende una molécula donadora de fluorescencia y una molécula aceptora de fluorescencia, separadas en longitud por una distancia a la que la fluorescencia de la donadora es reducida por la aceptora, y una secuencia de cadena sencilla reconocida por una enzima de restricción que corta a dicha secuencia cuando está en forma de doble cadena, estando localizada dicha secuencia entre dicha molécula donadora y dicha molécula aceptora; aplicar dicha enzima de restricción al producto de amplificación de tal modo que se corta el producto de amplificación de doble cadena para liberar a la molécula aceptora de la molécula donadora y detectar una señal fluorescente a partir de la mezcla, donde la reacción de amplificación se efectúa usando nucleótidos modificados que son resistentes al corte por enzimas de restricción.
Description
Método fluorimétrico para el seguimiento y la
detección de la amplificación de ácidos nucleicos.
La presente invención proporciona un
procedimiento para detectar la amplificación de un polinucleótido
(a veces conocido como ácido polinucleico) diana, preferiblemente de
forma cuantitativa, y a sondas para usar en dichos
procedimientos.
Las técnicas conocidas de control de la PCR por
fluorescencia incluyen tanto técnicas con especificidad de cadena
como técnicas de agentes intercalantes de ADN genéricas que pueden
usarse en algunos dispositivos de termociclado de PCR de segunda
generación.
Los procedimientos genéricos utilizan colorantes
que se intercalan en el ADN que presentan una mayor fluorescencia
cuando están unidos a especies de ADN bicatenario. El aumento de la
fluorescencia debido a un aumento en la concentración volumétrica
del ADN durante las amplificaciones puede usarse para medir el
progreso de la reacción y para determinar el número de copias de la
molécula diana. Sin embargo, estos procedimientos sólo son
semiespecíficos de cadena ya que cualquier amplificación
inespecífica que se produzca generará un ADN bicatenario y, por lo
tanto, producirá un aumento de la señal.
Los procedimientos con especificidad de cadena
utilizan componentes de reacción polinucleotídicos adicionales para
controlar el progreso de las reacciones de amplificación. Estos
procedimientos usan la transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia (FRET) como base de la detección. Se marcan una o más
sondas polinucleotídicas con moléculas fluorescentes, una molécula
donadora y una molécula aceptora (a veces conocidas como molécula
indicadora y molécula inhibidora, respectivamente). La molécula
donadora se excita con una longitud de onda de luz específica para
la que normalmente presentará una longitud de onda de emisión de
fluorescencia. La molécula aceptora se excita mucho a la longitud
de onda de emisión, de tal modo que puede aceptar la energía de
emisión de la molécula donadora mediante transferencia de energía
por resonancia cuando están muy próximas (por ejemplo, en la misma
o en una molécula vecina). La base de la detección de FRET es
controlar los cambios en las longitudes de onda de emisión de las
moléculas donadora y aceptora. Existen dos tipos de sondas de FRET,
las que usan la hidrólisis de sondas polinucleotídicas para separar
la molécula donadora de la aceptora y las que usan la hibridación
para alterar la relación espacial entre las moléculas donadora y
aceptora.
Las sondas de hidrólisis están disponibles en el
mercado como sondas TaqMan^{TM}. Éstas consisten en
oligonucleótidos de ADN que están marcados con moléculas donadora y
aceptora. Las sondas se diseñan para unirse a una región específica
en una cadena de un producto de PCR. Después de la hibridación del
cebador de PCR con esta cadena, la enzima Taq extiende el
ADN con actividad polimerasa de 5' a 3'. La enzima Taq
también presenta actividad exonucleasa de 5' a 3'. Las sondas
TaqMan^{TM} están protegidas en su extremo 3' mediante
fosforilación para evitar que ceben la extensión de la Taq.
Si la sonda TaqMan^{TM} hibrida con la cadena de producto de tal
modo que una molécula de extensión de Taq también puede
hidrolizar la sonda, se libera la molécula donadora de la aceptora
como base de la detección.
Están disponibles sondas de hibridación de
varias formas. Las sondas "molecular beacons" son
oligonucleótidos que tienen secuencias 5' y 3' complementarias de
tal modo que forman bucles en horquilla. Los marcadores
fluorescentes terminales están muy próximos para que se produzca la
FRET cuando se forma la estructura en horquilla. Después de la
hibridación de las sondas "molecular beacons" con una secuencia
complementaria, los marcadores fluorescentes se separan de tal modo
que no se produce la FRET, como base de la detección. Una
modificación de dicho sistema en la que la sonda "molecular
beacon" está unida a un cebador de amplificación se describe en
Nucl. Acids. Res. (1997) 25, 12, 2516-2521.
Sin embargo, la señal generada por dichas
secuencias está limitada por la longitud de la sonda, ya que esta
constituye el factor limitante en la relación entre el nivel de
señal y las interferencias que se pueden conseguir. El documento
WO-A-9621144 y Ghosh et al.
describen procedimientos para el control de la fluorescencia de una
reacción de escisión por enzimas de restricción.
Los solicitantes han desarrollado un sistema que
permite una detección y/o un control preciso de ciertas reacciones,
incluyendo reacciones de amplificación.
La invención proporciona un procedimiento para
detectar la amplificación de ácidos nucleicos que comprende
realizar una amplificación de ácidos nucleicos de un polinucleótido
diana en presencia de (a) una polimerasa de ácidos nucleicos, (b)
un cebador capaz de hibridar con dicho polinucleótido diana y (c)
una sonda oligonucleotídica que es capaz de hibridar con dicho
polinucleótido diana y que comprende una molécula donadora de
fluorescencia, una molécula aceptora de fluorescencia y una
secuencia de cadena sencilla reconocida por una enzima de
restricción que corta en dicha secuencia cuando está en forma de
doble cadena, estando dicha secuencia localizada entre dicha
molécula donadora y dicha molécula aceptora; aplicar dicha enzima de
restricción al producto de amplificación de tal modo que se escinde
el producto de amplificación de doble cadena para liberar a la
molécula aceptora de la molécula donadora y detectar una señal
fluorescente a partir de la mezcla de reacción, realizándose la
reacción de amplificación usando nucleótidos modificados que son
resistentes al corte por enzimas de restricción.
El procedimiento puede usarse para detectar la
presencia de un polinucleótido diana en una muestra. Si en el
procedimiento de la invención se detecta amplificación, entonces el
polinucleótido diana está presente en la muestra para actuar como
plantilla.
Mediante el uso de una enzima de restricción
para liberar a la molécula donadora de la aceptora se evita el
retraso de tiempo que se produce, por ejemplo, cuando se requieren
múltiples reacciones de hidrólisis para efectuar la separación.
Además, la separación de la molécula aceptora
de la donadora no está tan limitada por la longitud de la sonda y,
por lo tanto, puede conseguirse una mejor relación entre la señal y
las interferencias.
El procedimiento de la invención puede usarse
para la detección de punto final, en el que la enzima se añade
después de la reacción de amplificación, o la enzima puede estar
presente durante toda la reacción de amplificación. Esto último
permite la posibilidad de controlar la reacción de amplificación en
tiempo real. Sin embargo, en algunos casos, los reactivos que
requiere la enzima para la digestión pueden inhibir la reacción de
amplificación. En estos casos, puede ser deseable la detección de
punto final en un tubo distinto.
La sonda oligonucleotídica puede diseñarse de
tal modo que incluya el sitio para la enzima de restricción dentro
de la región del amplicón. En este caso, la detección de la
amplificación se efectúa añadiendo la enzima de restricción a la
reacción después de su terminación. La enzima corta el producto de
amplificación entre la molécula donadora y la aceptora de la sonda,
liberando de este modo a la molécula donadora, que genera una señal
de punto final. Esto puede usarse para situaciones de PCR in
situ. Sin embargo, su uso depende de la presencia dentro del
amplicón de un sitio que hibride con la sonda. Además, puede no ser
posible el aislamiento total del amplicón de longitud completa
después de la detección de esta manera.
Como alternativa, la sonda puede unirse a un
cebador de amplificación. En dichos casos, tanto la molécula
aceptora como la donadora están presentes, preferiblemente, en una
región de no unión del cebador. Cuando el amplicón producido de
este modo experimenta un ciclo de extensión posterior bajo la
influencia del otro cebador, la reacción de extensión incluirá la
región completa de la sonda, haciendo de este modo que el sitio de
restricción sea bicatenario y, por lo tanto, susceptible de ser
cortado por la enzima de restricción.
Además, si la enzima de restricción está
presente durante toda la reacción de amplificación, puede
controlarse el progreso de la propia reacción de amplificación
puesto que las moléculas donadoras se liberarán en cantidades
proporcionales al número de amplicones presentes en la mezcla de
reacción en cada ciclo de la reacción de amplificación. Puede
observarse la acumulación de la señal de las moléculas donadoras y
usarse el aumento para calcular, por ejemplo, la cantidad de
polinucleótido diana presente en la muestra al comienzo, usando el
tipo de cálculos que se conocen bien en relación con el sistema
TaqMan^{TM}.
Las endonucleasas de restricción son enzimas
que se unen y escinden moléculas de ADN bicatenario en secuencias de
pares de bases específicas conocidas como sitios de restricción o
de reconocimiento. Existen tres tipos de enzimas de restricción.
Cada tipo tiene dos actividades enzimáticas específicas. Una ADN
metilasa y una endonucleasa catalizan la escisión y la separación
del ADN bicatenario.
Las enzimas de restricción de tipo I tienen
actividades metilasa y nucleasa dependiente de ATP en la misma
molécula. La metilación se produce en el sitio de reconocimiento y
la escisión se produce a cierta distancia del sitio de
reconocimiento cuando el ADN forma un bucle alrededor de la enzima
unida. Las enzimas de tipo I y III son similares. Las enzimas de
tipo III también tienen actividades metilasa y nucleasa en la misma
molécula. Sin embargo, las enzimas no requieren ATP y el sitio de
escisión está más próximo al sitio de reconocimiento. Las enzimas
de restricción de tipo II escinden en el sitio de reconocimiento.
Reconocen estructuras de cuatro o más nucleótidos de longitud. Cada
tipo de enzima escinde de forma diferente. La enzima puede escindir
ambas cadenas exactamente en el mismo sitio, formando extremos romos
en el ADN. Otras enzimas pueden escindir en posiciones simétricas
en cada cadena de ADN, produciendo fragmentos con salientes de
cadena sencilla o "extremos cohesivos". Pueden generar
fragmentos con salientes 3' y salientes 5'.
En el procedimiento de la invención puede usarse
cualquiera de las enzimas de restricción conocidas, particularmente
cuando éstas se añaden al final de cualquier reacción de
amplificación, con la única condición de que cuando deba
recuperarse un producto de reacción específico, éstas no contengan
sitios internos reconozidos por las enzimas. Las enzimas de
restricción que pueden resistir las condiciones que se emplean en la
reacción, por ejemplo, en la reacción de amplificación, son enzimas
termoestables.
Una enzima de restricción particularmente
adecuada para usar en el procedimiento de la invención es TaqI. Esta
enzima de restricción, como la TAQ polimerasa, se puede obtener de
Thermus aquaticus. Por lo tanto, resistirá las condiciones
que se encuentran durante el ciclado que se lleva a cabo en las
reacciones de amplificación, tales como la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Otra enzima de este tipo es la enzima de
restricción termoestable "PspG 1", (New England Biolabs). Esta
enzima se aísla de Pyrococcus sp. y reconoce la secuencia CCWGG,
cortando delante de la primera C. Su estabilidad es de 2 horas a
95ºC y resistirá 30 ciclos de PCR en bloque.
La reacción PCR es un procedimiento de
amplificación preferido en el contexto de la invención.
Convenientemente, el amplicón y/o la enzima de
restricción se seleccionan de tal modo que el sitio reconocido por
la enzima no aparezca en el amplicón. Si es necesario, pueden
aislarse, mutarse o modificarse por ingeniería genética enzimas de
restricción disponibles de tal modo que sean termoestables a las
temperaturas de reacción requeridas.
Convenientemente, la polimerasa de ácidos
nucleicos que se usa en el procedimiento de la invención es una
polimerasa termoestable tal como la TAQ polimerasa.
La sonda que se usa en el procedimiento de la
invención puede adoptar la forma de una sonda "molecular
beacon", de tal modo que adopte una forma de horquilla antes de
la hibridación con el polinucleótido diana. En este caso, la sonda
tiene secuencias complementarias en la región 5' y la región 3', de
tal modo que antes de unirse con la secuencia polinucleotídica
diana, la región 5' y la región 3' se unen entre sí. En este caso,
la restricción se localizará en una región no complementaria de la
sonda, de tal modo que permanezca en forma de cadena sencilla antes
de que la sonda hibride con la secuencia diana.
Convenientemente, la molécula donadora se
dispone en un extremo de la sonda y la aceptora en el otro extremo.
Por lo tanto, la molécula donadora puede disponerse en el extremo
5' de la sonda y la aceptora en el extremo 3' o viceversa. En dichos
casos, la disposición en forma de horquilla de la sonda
"molecular beacon" es particularmente eficaz, ya que las
moléculas donadora y aceptora se mantienen muy próximas antes de la
hibridación con la secuencia diana. Por lo tanto, se reduce el
riesgo de una señal de fondo no deseada de la molécula donadora.
Cuando se produce la hibridación de la sonda
con la secuencia diana, la horquilla se abre, separándose por lo
tanto espacialmente la molécula aceptora de la donadora y
generándose de este modo una señal. Sin embargo, en el caso de la
invención, la enzima de restricción cortará el híbrido
sonda-secuencia diana entre las moléculas donadora y
aceptora, separando por lo tanto adicionalmente estas unidades y
potenciando así la señal.
En todavía otra modificación de esto, la sonda
está unida en un extremo de la misma a un cebador de amplificación.
La sonda puede estar o no en forma de una horquilla. No obstante,
la región que contiene las moléculas donadora y aceptora debería
disponerse cadena arriba del extremo 3' del cebador. La extensión
del cebador da lugar a un amplicón que tiene la sonda unida en su
extremo 5'. Durante un ciclo de amplificación posterior, se forma
una cadena complementaria después de la unión del otro cebador de
amplificación con el extremo remoto del amplicón. Está cadena
complementaria se extenderá durante la extensión de la cadena, no
sólo por toda la longitud de la cadena diana, sino también a través
de la sonda, haciéndola de este modo bicatenaria y, por lo tanto,
susceptible al corte por la enzima de restricción.
La reacción de amplificación se efectúa usando
nucleótidos modificados que son resistentes al corte por enzimas de
restricción. Ejemplos de dichos nucleótidos son los nucleótidos
metilados. En este caso, la sonda que se usa en el proceso no
contendrá nucleótidos modificados. Esto significa que los amplicones
producidos en la reacción serán resistentes a la restricción.
No obstante, cuando la sonda hibrida con un
amplicón, será reconocida por la enzima de restricción que después
la cortaría en el sitio de restricción. Sin embargo, la cadena
complementaria no se cortará y, por lo tanto, el resultado es que el
ADN bicatenario está solamente "mellado". En la posterior
fusión de la sonda, las moléculas aceptora y donadora se separan,
generando de este modo una señal modificada que puede
detectarse.
Esta realización puede usarse en la detección
de punto final, en la que la enzima de restricción se añade al
término de la amplificación. Cuando se va a usar en el curso de la
reacción, por ejemplo, para controlar y/o cuantificar la
amplificación, sería necesario asegurar que la enzima de
restricción no corta la molécula diana (que generalmente no sería
resistente a la restricción) antes del comienzo de la
amplificación. Esto puede conseguirse de diversas formas. La
administración de la enzima de restricción puede retrasarse hasta
después de que se haya producido al menos la primera vuelta de
amplificación. Esto puede efectuarse automáticamente, por ejemplo,
usando las técnicas de "inicio caliente" en las que la enzima
polimerasa se mantiene separada del resto de la mezcla de reacción,
por ejemplo, usando una barrera de cera que se funde para liberar
la enzima sólo después de que se hayan alcanzado los niveles de
temperatura deseados. Pueden usarse procedimientos similares en el
ensayo de la invención para contener a la enzima de restricción
hasta que se requiera en el proceso. Como alternativa, pueden
emplearse otros medios de supresión de la reacción, por ejemplo,
incluyendo en la mezcla de reacción un anticuerpo contra la enzima
de restricción que inhiba su actividad pero que a su vez se
desnaturalice a la temperatura deseada o usando enzimas, en
particular enzimas modificadas, como se conocen en la técnica, tales
como TAQ Gold^{TM}, que requieren un calentamiento a un nivel
particular antes de se activen.
Cuando se usa esta realización de la invención,
la localización en la que la sonda se une con el amplicón es
irrelevante. La cadena del amplicón no se corta en ningún punto y,
por lo tanto, incluso si la sonda se localiza en una posición
central dentro del amplicón, no habrá pérdida de amplicón y, por lo
tanto, permanecerá disponible para usarlo como cadenas plantilla en
ciclos de amplificación posteriores.
Se conocen en la técnica combinaciones adecuadas
de moléculas donadoras y aceptoras. Por ejemplo, la molécula
donadora puede comprender un colorante de fluoresceína y la
molécula aceptora puede ser un colorante de ro-
damina.
damina.
Se conocen bien en la técnica condiciones
adecuadas en las que puede llevarse a cabo la reacción de
amplificación. Las condiciones óptimas pueden ser variables en cada
caso dependiendo del amplicón particular implicado, de la naturaleza
de los cebadores que se usen y de las enzimas que se empleen. Las
condiciones óptimas pueden ser determinadas en cada caso por un
experto. Las temperaturas de desnaturalización típicas son del
orden de 95ºC, las temperaturas de hibridación típicas son del
orden de 55ºC y las temperaturas de extensión son del orden
de 72ºC.
de 72ºC.
El procedimiento de la invención puede
adaptarse para usarlo en el control de calidad de enzimas cuando la
enzima es una endonucleasa de restricción. Actualmente, el control
de calidad de enzimas usa la actividad unitaria, que determina la
concentración con niveles específicos de enzima activa. Sin
embargo, si las enzimas van a usarse como enzimas de restricción en
el procedimiento de la invención, en el que se conoce la presencia o
cantidad de polinucleótido diana en la muestra, la calidad de la
enzima puede evaluarse por su capacidad para generar una señal
fluorescente que indica la separación de la señal de las sondas
fluorescentes, proporcionando una medida más precisa de la
actividad.
El uso de sondas oligonucleotídicas en los
procedimientos descritos anteriormente constituye un aspecto
adicional de la invención. En particular, estas sondas comprenderán
una molécula donadora y una molécula aceptora y un sitio para una
enzima de restricción que corta en una secuencia específica de ADN
bicatenario localizada entre dichas moléculas donadora y
aceptora.
Las sondas pueden incluir otras características
descritas anteriormente. Por ejemplo, la sonda puede estar en forma
de una sonda "molecular beacon", de tal modo que tenga
secuencias complementarias en la región 5' y la región 3' que se
unen entre sí.
Las moléculas donadoras adecuadas incluyen
colorante de fluoresceína, tal como fluoresceína, y la molécula
aceptora puede ser un colorante de rodamina u otro colorante, tal
como Cy5, pero puede usarse cualquier otra combinación de colorantes
que sea capaz de experimentar las interacciones de FRET.
Un aspecto adicional de la invención comprende
un kit para llevar a cabo un procedimiento como se ha descrito
anteriormente, comprendiendo dicho kit una sonda, como se ha
descrito anteriormente, y una enzima de restricción que sea capaz de
cortar dicha sonda entre las moléculas aceptora y donadora. El kit
comprende además uno o más nucleótidos modificados capaces de
generar una cadena de nucleótidos que sea resistente a las enzimas
de restricción, por ejemplo, nucleótidos metilados.
La invención se describirá particularmente a
continuación a modo de ejemplo con respecto a los dibujos
esquemáticos que la acompañan, en los que:
la Figura 1 ilustra una realización de la
invención;
la Figura 2 es un gráfico que muestra la
fluorescencia de una molécula donadora frente al tiempo en una
reacción PCR de acuerdo con la invención;
la Figura 3 es un gráfico de la relación entre
la fluorescencia del donador y la fluorescencia del aceptor en un
ensayo de PCR de punto final de la invención, en el que (A) y (B)
son reacciones positivas y (c) representa un control negativo;
la Figura 4 es un gráfico de la relación entre
la fluorescencia del aceptor y la fluorescencia del donador en un
ensayo de PCR de punto final de la invención, en el que (A) y (B)
son reacciones positivas y (c) representa un control negativo;
la Figura 5 es un gráfico que muestra la
fluorescencia del donador con el tiempo en un ensayo de PCR de punto
final de la invención, en el que (A) y (B) son reacciones positivas
y (c) representa un control negativo;
la Figura 6 es un gráfico que ilustra los
cambios en la fluorescencia del donador (A) y el aceptor (B) frente
al tiempo en presencia de una enzima de restricción que corta entre
éstos; y
la Figura 7 es un gráfico que ilustra que la
fluorescencia aumenta de forma acumulativa en el curso de la
reacción, dando lugar a la Figura 6.
En la realización que se ilustra en la Figura 1,
la reacción de amplificación se efectúa usando nucleótidos
modificados (11), tales como nucleótidos metilados. Como resultado,
las cadenas de amplicón (12) son resistentes a enzimas de
restricción, aunque la enzima reconocerá su sitio de restricción
(indicado mediante una flecha sombreada - 1D) cuando esté en forma
de doble cadena. Cuando la cadena de amplicón (12) hibrida con la
sonda, que no contiene nucleótidos modificados, el resultado será
una "mella" (13) en la sonda mientras que la cadena del
amplicón permanecerá intacta. En la fusión posterior (1F), las
moléculas donadora y aceptora se separarán permitiendo a la
molécula donadora generar una señal potenciada que puede
detectarse.
El corte con una enzima de restricción
proporciona un medio rápido y eficaz de separar la molécula aceptora
de la donadora, mejorando de este modo la velocidad de detección.
Además, asegurando la separación rápida y completa de la molécula
aceptora de la donadora, la relación entre la señal y las
interferencias se aumenta en comparación con la que puede obtenerse
usando la tecnología convencional de sondas "molecular
beacon".
El siguiente Ejemplo se proporciona a modo
ilustrativo.
Demostración
1
Se clonó un amplicón de 104 pares de bases del
gen de la anticoagulasa de Yersinia pestis en un vector
pBluescript SK (Stratagene) para formar una construcción de fagémido
pYP100ML. El pYP100ML se amplificó usando el cebador directo
YPPA155 de secuencia:
| dATGACGCAGAAACAGGAAGAAAGATCAGCC | (SEC ID Nº 1) y |
el cebador inverso YPP229R de secuencia:
| dGGTCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT | (SEC ID Nº 2). |
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de la reacción PCR fueron las
siguientes:
Cebadores 1 \muM de cada (concentración
final)
dNTP 200 \muM de cada (concentración
final)
TAQ 0,025 U/\mul concentración final
Tampón: albúmina de suero bovino 250 ng/\mul,
Tris 500 mM, pH 8,3, magnesio 20 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Después, la mezcla se sometió a 30 ciclos a las
siguientes condiciones:
Demostración
2
Se preparó una sonda (YPPAMP), marcada en el
extremo 5' con fluoresceína como donador y 10 pb cadena debajo de
la cual está el marcador Cy5 aceptor. La secuencia de la sonda es
5'T/CGAT/CCAGGXCAGAAATGAGTATGG
ATCCCAGGATAT 3', (SEC ID Nº 3)
ATCCCAGGATAT 3', (SEC ID Nº 3)
en la que X representa la posición de Cy5.
Esta sonda debería ser capaz de actuar como
cebador inverso en la reacción PCR descrita anteriormente. Entre
estas dos moléculas fluorescentes hay un sitio de restricción de
Taq 1 (TCGA), señalado con una "/" en la secuencia. El
extremo 3' no se ha fosforilado y, por lo tanto, puede extenderse en
la reacción PCR.
La endonucleasa Taq 1 (Sigma), una enzima
de tipo II, escinde el ADN bicatenario en esta región específica.
Al hacerlo, separaría el donador de fluoresceína del aceptor de Cy5
y esto constituye la base de la detección. La sonda se diseñó de
tal modo que se incluyeran nucleótidos adicionales en el extremo 5'
y el producto de pYP100ML resultante no se modificara. En este
caso, el amplicón no contiene sitios Taq 1.
Las moléculas donadora y aceptora se colocan lo
suficientemente próximas en la sonda para que se produzca la FRET.
Sin embargo, una vez que la enzima Taq 1 escinde el
amplicón, la donadora se libera y no se produce más FRET.
Después, se utilizó la sonda YPPAMP en una
reacción PCR que se había optimizado. La sonda YPPAMP a 2 \muM se
incluyó en una amplificación de pYP100ML usando un Perkin Elmer
9700. El programa fue de 30 ciclos de:
Los productos se analizaron mediante
electroforesis en gel de agarosa. La banda del producto demostró ser
más grande que el fragmento nativo de pYP100ML de 104 pb usando
electroforesis en gel de agarosa, sugiriendo que la sonda había
amplificado con éxito la diana.
Después, se repitió una reacción de
amplificación como se ha descrito en la Demostración 1 anterior
reemplazando el cebador inverso YPP229R con la sonda YPPAMP.
Después de la amplificación, se añadió la enzima
de restricción Taq 1 al producto de PCR junto con dNTP y
tampón de paleta negro (Sigma). El tampón de paleta negro (en
inglés "palette buffer black") contiene NaCl, que es
necesario para la actividad de la endonucleasa Taq 1. La
reacción se realizó en un ciclo de:
Este programa activa las actividades de escisión
de la endonucleasa que corta el extremo del fragmento. Se realizó
un control negativo sin enzima y los fragmentos se analizaron usando
electroforesis en gel. El patrón de bandas obtenido indicaba que se
había cortado el fragmento por la enzima de restricción.
Tanto las muestras cortadas por la enzima como
las de control se analizaron usando el fluorímetro. El producto de
PCR se diluyó de tal modo que la concentración de la sonda en la
reacción era de 0,1 \muM. A una concentración superior, la señal
de fluorescencia era demasiado intensa para los detectores del
LightCycler^{TM}. La señal fluorescente de la fluoresceína era
superior a la del Cy5 en las muestras de ensayo, sugiriendo que se
liberaba la fluoresceína y que el Cy5 no estaba lo bastante próximo
como para inhibir su energía fluorescente.
Las muestras de control tenían una lectura
fluorescente elevada para Cy5, sugiriendo que todavía se estaba
produciendo la FRET. Los resultados indicaban que la sonda
amplificada y la endonucleasa eran eficaces en la eliminación del
extremo del fragmento.
La sonda YPPAMP descrita anteriormente y la
endonucleasa Taq 1 se incluyeron en una reacción de
amplificación usando el LightCycler^{TM}. Se usó el programa
siguiente, 40 ciclos de:
Se aumenta el tiempo para la extensión de la
amplificación habitual de pYP100ML, de tal modo que la enzima tenga
tiempo para cortar el fragmento.
Se realizó una lectura de la fluorescencia una
vez por cada ciclo y los resultados se muestran en la Figura 2. A
medida que se amplifica el producto, la fluorescencia de la
fluoresceína aumentaba, sugiriendo que se estaban separando las
moléculas fluorescentes.
Para mejorar la señal, se usó la sonda YPPAMP a
0,5 \muM en dos reacciones de amplificación similares a las
descritas en el Ejemplo 2 sin Taq 1. De nuevo, se realizó un
control negativo en ausencia de ADN. El programa era el programa de
amplificación habitual para pYP100ML, 30 ciclos de:
Después de la amplificación por PCR se realizó
una digestión con el producto de PCR, Taq 1, dNTP y tampón de
paleta negro. El programa de digestión fue un ciclo de:
La Figura 3 muestra los resultados, expresados
como una relación entre la señal fluorescente de la fluoresceína y
de Cy5 (F1/F2) frente al tiempo. A medida que aumenta el tiempo, la
fluorescencia aumenta en las dos líneas superiores (A) y (B), que
son muestras positivas. Los resultados se muestran de nuevo en la
Figura 4 en forma de una relación de F1/1 frente al tiempo. Se
observa claramente un aumento continuo en la fluorescencia de la
fluoresceína a medida que la Taq 1 digiere el extremo del
fragmento, liberando la fluoresceína. Posiblemente debido a una
contaminación, la fluorescencia de la muestra negativa (línea C)
aumentó ligeramente, pero la fluorescencia era claramente muy
inferior a la de las muestras positivas. El amplicón de pYP100ML
está presente en el aire de alrededor y tan sólo es necesario un
amplicón del aire en una reacción para que se amplifique.
Cuando se expresa en forma de un gráfico de F2/1
frente al tiempo, (Figura 5), es evidente la disminución de la
fluorescencia a medida que se detiene la FRET entre la fluoresceína
y el Cy5.
Se digirió una muestra de la sonda YPPAMP
mediante Taq 1 durante un periodo de 60 minutos en las
condiciones descritas en el Ejemplo 3.
La Figura 6 muestra la fluorescencia a las
longitudes de onda del donador y del aceptor a medida que se corta
la sonda por la enzima de restricción a lo largo del tiempo.
Inicialmente, la sonda está intacta con una
elevada señal de Cy5 (B) y una baja señal de fluoresceína. Cuando se
corta la sonda, la señal de fluoresceína (A) aumenta a medida que
se libera de la sonda y se produce un descenso en la señal de Cy5 a
medida que las moléculas dejan de estar lo bastante próximas como
para que se produzca la FRET. La Figura 7 ilustra la fluorescencia
relativa a lo largo del tiempo de F1/F2 (fluoresceína/Cy5). Esto
demuestra un aumento continuo global, como resultado del corte de la
sonda.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- WO 9621144 A [0007]
- \bullet
- Nucl. Acids. Res., 1997, vol. 25 (12), 2516-2521 [0006].
Claims (25)
1. Procedimiento para detectar la amplificación
de ácidos nucleicos en una muestra que comprende realizar la
amplificación de ácidos nucleicos sobre un polinucleótido diana en
presencia de (a) una polimerasa de ácidos nucleicos, (b) un cebador
capaz de hibridar con dicho polinucleótido diana y (c) una sonda
oligonucleotídica que es capaz de hibridar con dicho polinucleótido
diana y que comprende una molécula donadora de fluorescencia y una
molécula aceptora de fluorescencia, separadas en longitud por una
distancia a la que la fluorescencia de la donadora es reducida por
la aceptora, y una secuencia de cadena sencilla reconocida por una
enzima de restricción que corta a dicha secuencia cuando está en
forma de doble cadena, estando localizada dicha secuencia entre
dicha molécula donadora y dicha molécula aceptora; aplicar dicha
enzima de restricción al producto de amplificación de tal modo que
se corta el producto de amplificación de doble cadena para liberar a
la molécula aceptora de la molécula donadora y detectar una señal
fluorescente a partir de la mezcla, donde la reacción de
amplificación se efectúa usando nucleótidos modificados que son
resistentes al corte por enzimas de restricción.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que los nucleótidos modificados son
nucleótidos metilados.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que se inhibe la
actuación de la enzima de restricción hasta que se haya realizado
la reacción de amplificación, de tal modo que al menos exista
cierto producto amplicón.
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que la enzima de restricción se mantiene
separada del resto de la mezcla de reacción hasta que se obtiene
cierto producto amplicón.
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que la enzima de restricción es contenida
por una barrera fundible.
6. Procedimiento de acuerdo con al
reivindicación 3, en el que la enzima de restricción se inhibe por
la presencia de un anticuerpo.
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que la enzima de restricción es una enzima
que se vuelve activa sólo con la exposición a temperaturas
particulares.
8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que dicha enzima de
restricción es Taq 1 o PspG1.
9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la polimerasa de ácidos
nucleicos es una polimerasa termoestable.
10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la sonda tiene
secuencias complementarias en las regiones 5' y 3', de tal modo que
antes de unirse a la secuencia polinucleotídica diana, la región 5'
y la región 3' se unen entre sí.
11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que dicha molécula donadora
comprende un colorante de fluoresceína.
12. Procedimiento con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicha molécula aceptora es
un colorante de rodamina o de Cy5.
13. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula donadora
está unida a un nucleótido en la región del extremo 3' de la sonda y
la molécula aceptora está unida en la región del extremo 5' de la
sonda.
14. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la molécula donadora
está unida a un nucleótido en la región del extremo 5' de la sonda y
la molécula aceptora está unida a un nucleótido en la región del
extremo 3' de la sonda.
15. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la reacción de
amplificación se efectúa mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
16. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la sonda está unida al
extremo 5' de un cebador de amplificación.
17. Uso de una sonda oligonucleotídica que
comprende una molécula donadora y una molécula aceptora y un sitio
para una enzima de restricción que corta en una secuencia específica
de ADN de doble cadena localizada entre dicha molécula donadora y
aceptora, en un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes.
18. Uso de acuerdo con la reivindicación 17, en
el que la sonda tiene secuencias complementarias en la región 5' y
en la región 3', de tal modo que antes de unirse con la secuencia
polinucleotídica diana, la región 5' y la región 3' se unen entre
sí.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 17 o
con la reivindicación 18, en el que dicha molécula donadora
comprende un colorante de fluoresceína y dicha molécula aceptora es
un colorante de rodamina o de Cy5.
20. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, en el que dicha molécula donadora, en la
sonda, está separada de dicha molécula aceptora por al menos 15
nucleótidos.
21. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, en el que la molécula donadora está unida
a un nucleótido en la región del extremo 3' de la sonda y la
molécula aceptora está unida a un nucleótido en la región del
extremo 5' de la sonda.
22. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, en el que la molécula donadora está unida
a un nucleótido en la región del extremo 5' de la sonda y la
molécula aceptora está unida a un nucleótido en la región del
extremo 3' de la sonda.
23. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 22, en el que dicha sonda oligonucleotídica
está unida al extremo 5' de un cebador de amplificación.
24. Kit para llevar a cabo un procedimiento de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, comprendiendo
dicho kit una sonda oligonucleotídica que es capaz de hibridar con
un polinucleótido diana y que comprende una molécula donadora de
fluorescencia, una molécula aceptora de fluorescencia y una
secuencia de cadena sencilla reconocida por una enzima de
restricción que corta en dicha secuencia cuando está en forma de
doble cadena, localizándose dicha secuencia entre dicha molécula
donadora y dicha molécula aceptora y una enzima de restricción que
es capaz de cortar dicha sonda entre las moléculas aceptora y
donadora y que comprende además un nucleótido modificado que es
capaz de generar una cadena de nucleótidos que es resistente a
enzimas de restricción.
25. Kit de acuerdo con la reivindicación 24, en
el que el nucleótido modificado comprende un nucleótido
metilado.
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