ES2347320T3 - Hidrolizados proteicos enriquecidos en peptidos que tienen un resto de prolina carboxi terminal. - Google Patents

Hidrolizados proteicos enriquecidos en peptidos que tienen un resto de prolina carboxi terminal. Download PDF

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Abstract

Un hidrolizado de proteínas que comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos (%) que poseen una prolina carboxi terminal es más de dos veces la fracción molar (%) de prolina en el sustrato proteico usado para generar el hidrolizado.

Description

Hidrolizados proteicos enriquecidos en péptidos que tienen un resto de prolina carboxi terminal.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a hidrolizados de proteínas, a un método para producir los hidrolizados y al uso de estos hidrolizados.
Antecedentes de la invención
Los hidrolizados enzimáticos de leche de vaca o fracciones de leche de vaca tienen aplicación limitada solamente a la industria alimentaria. No obstante, estos hidrolizados ocupan interesantes nichos en el mercado, según se evidencia por el gran volumen de bibliografía que describe y reivindica procesos optimizados para obtener tales hidrolizados. La leche o las fracciones de leche son sometidas a enzimas que tienen actividad proteolítica, para producir los hidrolizados principalmente para minimizar la alergenicidad del producto, facilitar la absorción gastrointestinal ofreciendo un concentrado fácilmente asimilable, y para estabilizar las proteínas en productos ácidos frente a la precipitación durante periodos prolongados de almacenamiento.
Aunque reducir el peso molecular de las proteínas de la leche es una práctica comúnmente aceptada para producir estos efectos beneficiosos, la hidrólisis enzimática de las proteínas de la leche tiene desventajas. Los aspectos negativos de incubar la leche con enzimas incluyen la digestión proteolítica incompleta, un sabor amargo cada vez mayor hasta la disminución de la longitud de los fragmentos de péptidos, rendimientos disminuidos del producto final debido a los requisitos de las etapas de purificación, y cambios de sabor desagradables causados por altos niveles de aminoácidos libres.
La degradación uniforme y completa de todas las fracciones de la leche vía incubación con endoproteasas es frecuentemente difícil de obtener. Por ejemplo, la beta-lactoglobulina es conocida por ser una proteasa resistente y la digestión parcial de esta molécula puede conducir a reacciones inmunogénicas inesperadamente fuertes para fórmulas para lactantes, así como las visibles precipitaciones de proteínas en productos tales como las bebidas ácidas para deportistas. Para garantizar la ausencia de proteínas inapropiadamente digeridas en un hidrolizado de proteínas, generalmente se requiere una etapa de ultrafiltración final para la eliminación, a partir del hidrolizado, de cualesquiera fragmentos peptídicos grandes que quedan. La etapa indispensable de eliminar del hidrolizado estos fragmentos proteicos parcialmente digeridos reduce inevitablemente el rendimiento del producto de la digestión final, aumentando de ese modo los costes de producción.
La antigenicidad de las proteínas puede ser superada digiriendo las proteínas hasta péptidos que tengan solamente 8-10 restos de aminoácidos, pero los péptidos creados por tal amplia digestión proteolítica pueden ser muy amargos. La explicación general para este fenómeno es que los péptidos más pequeños con un alto contenido de aminoácidos hidrófobos promueven sabores amargos. La naturaleza de la materia prima proteica usada, el tipo de enzimas proteolíticas usadas para la digestión y la longitud de los péptidos obtenidos determinan en gran medida el grado de amargor asociado con el hidrolizado final. Por ejemplo, se sabe que la caseína, la cual contiene muchos aminoácidos hidrófobos, genera hidrolizados mucho más amargos que las proteínas del suero.
En operaciones industriales, el desamargado de los hidrolizados de proteínas es llevado a cabo mediante la eliminación selectiva de los péptidos amargos usando carbono activado o adsorción a resina hidrófoba. La reducción concomitante del rendimiento durante tales etapas de eliminación incrementa el coste del producto final. Además, este proceso tiene un impacto negativo sobre el valor nutricional del producto final, ya que varios aminoácidos nutricionalmente indispensables pueden perderse debido a su naturaleza hidrófoba, incluyendo triptófano, leucina, fenilalanina e isoleucina. Así, desamargar por esta vía es propenso a producir hidrolizados deficientes en estos aminoácidos nutricionalmente importantes.
El desamargado también se puede lograr sometiendo a los hidrolizados a exopeptidasas. En este enfoque, los aminoácidos amino terminales y carboxi terminales son liberados a partir de péptidos en un intento de reducir su hidrofobia global. La exposición de los péptidos a exoproteasas no selectivas desafortunadamente da como resultado la liberación de cantidades incontrolables de aminoácidos libres en el hidrolizado final. El calentamiento subsiguiente de tales hidrolizados que contienen aminoácidos libres, según se requiere para la esterilización o el secado por pulverización, genera frecuentemente sabores desabridos vía reacciones de Maillard. Además, los altos niveles de aminoácidos libres creados por las exoproteasas pueden incrementar el valor osmótico del producto hidrolizado final hasta niveles que puedan causar diarrea osmótica.
Por lo tanto, la producción de hidrolizados de proteínas representa un compromiso entre los pros y los contras de la digestión proteolítica. La práctica actual es optimizar la digestión enzimática de sustratos de proteínas para los requisitos particulares de una categoría de productos. Por ejemplo, los hidrolizados de proteínas destinados a lactantes verdaderamente alérgicos requieren una amplia digestión proteolítica, seguida de una rigurosa eliminación de cualesquiera fragmentos peptídicos de gran peso molecular que queden. Por el contrario, los productos diseñados para adultos, quienes raramente exhiben alergias a la leche bovina, típicamente contienen hidrolizados en los cuales la longitud media de los 
\hbox{péptidos se incrementa para
minimizar la posibilidad de  sabores rancios y maximizar el
rendimiento del producto.}
Todas las principales proteínas de la leche, tales como beta-caseína, beta-lactoglobulina y alfa-lactoalbilmina, así como las fracciones de proteína vegetal obtenidas a partir de, por ejemplo, aislados de soja, proteínas de arroz y gluten de trigo, son considerados compuestos antigénicos importantes. De este modo, la digestión enzimática de estas proteínas de leche y cereales hasta pesos moleculares por debajo de 3000 Da es considerada importante para minimizar la alergenicidad. La fracción de beta-lactoglobulina en suero es especialmente considerada como un importante alérgeno porque esta proteína no está presente en la leche humana y se ha probado que la digestión proteolítica de la beta-lactoglobulina es difícil. Las fórmulas para lactantes que contienen hidrolizados de proteínas que son ampliamente hidrolizadas contienen típicamente altos niveles de aminoácidos libres, los cuales son indicativos de sabor subóptimo y elevadas osmolalidades. Evaluaciones recientes de productos para fórmulas para lactantes hidrolizados, actualmente comercializados, han mostrado que la mayoría de ellos aún contienen materiales inmunogénicos a base de suero. Esta observación indica que se continúa demandando nuevas mezclas enzimáticas que conduzcan a hidrolizados mejorados a más bajo coste.
Los hidrolizados de proteínas en productos destinados a consumidores con necesidades no médicas, por ejemplo atletas, o personas con una dieta para adelgazar, deben ser personalizados para proporcionar características de buen sabor. Bajo estas circunstancias, la alta palatabilidad así como los aspectos físico-químicos, tales como solubilidad bajo condiciones ácidas, son de importancia primordial. Productos en esta categoría, incluyendo los jugos de frutas fortificados y las bebidas para deportistas, se centran, entre otros, en la suplementación con arginina y glutamina para mejorar la salud del consumidor. Las bebidas para deportistas, por ejemplo, sirven para mejorar la resistencia física y la recuperación de un atleta después del ejercicio prolongado de alta intensidad. Fuentes de proteínas de cereal ricas en glutamina, como el gluten de trigo, o fuentes de proteínas ricas en arginina, como la proteína del arroz y los aislados de soja, han sido consideradas como alternativas a las proteínas de la leche para satisfacer las necesidades de suplementación de productos ácidos relacionados con la salud. Sin embargo, tales proteínas de cereal, particularmente el gluten de trigo, muestran solubilidades muy pobres a valores de pH más ácidos, es decir, aquellos por encima de 4, significando que los hidrolizados de gluten completamente solubles son difíciles de obtener.
Debido a la influencia negativa sobre el coste del producto y la calidad asociada con la hidrólisis de proteína, en publicaciones anteriores se han descrito diversas mezclas de enzimas dirigidas a mejorar las características del hidrolizado y reducir los costes de producción. Ejemplos incluyen el documento EP 321 603, que se refiere al uso de endoproteasas derivadas de animales, como tripsina, quimiotripsina y pancreatina, y los documentos EP 325 986 y WO 96/13174, que favorecen el uso de endoproteasas obtenidas a partir de especies de Bacillus o Aspergillus. Se han descrito varias exoproteasas que son capaces de desamargar mezclas de péptidos. Mientras que, por ejemplo, el documento EP 0223 560 se refiere al uso de una endoproteasa específica, específica para prolina, el documento WO 96/13174 se refiere a una mezcla de aminopeptidasas y carboxipeptidasas para este fin.
Un número de publicaciones enseñan los efectos beneficiosos de las endoproteasas específicas para prolina en combinación con diversas exopeptidasas para producir hidrolizados de proteínas los cuales tienen perfiles de amargor relativamente bajos. Por ejemplo, la patente japonesa JP02039896 se refiere al uso de una endoproteasa específica de prolina combinada con una dipeptidil-carboxipeptidasa para generar preparaciones de péptidos de bajo peso molecular. La degradación de oligopéptidos ricos en prolina por tres hidrolasas de péptidos específicas para prolina es descrita como esencial para acelerar la maduración de quesos sin amargor. (Journal of Dairy Science, 77 (2) 385-392 (1994)). Más específicamente, en el documento JP5015314 se describe el efecto de desamargado de la endoproteasa específica de prolina en combinación con una carboxipeptidasa. El documento JP5015314 describe una preparación enzimática bruta obtenida a partir de Aspergillus oryzae que muestra, además de una actividad proteolítica no específica general, pequeñas cantidades de una actividad carboxipeptidasa y endoproteasa específica de prolina. De acuerdo con el documento JP5015314, los restos de prolina presentes en los términos carboxi de los péptidos provocan sabores amargos y son indeseables. La incubación de la proteína de haba de soja con una mezcla enzimática de carboxipeptidasa y endoproteasa específica de prolina produjo un hidrolizado que fue significativamente menos amargo que un hidrolizado de haba de soja obtenido con una preparación de proteasas carente de la combinación de una carboxipeptidasa y endoproteasa específica de prolina.
Colectivamente, el estado de la técnica sugiere fuertemente que la liberación, mediada por exopeptidasas, de los restos de aminoácidos hidrófobos carboxi terminales (o amino terminales) a partir de los péptidos es esencial para desamargar significativamente los hidrolizados de péptidos. Asimismo, las referencias que se refieren específicamente a endoproteasas específicas para prolina para desamargar enseñan que la función de esta actividad es exponer los restos de prolina hidrófobos para permitir su eliminación subsiguiente por una carboxipeptidasa. La implicación de esta hipótesis es que la actividad de eliminar el sabor amargo que tienen las endoproteasas específicas para prolina está ligada con la eliminación eficiente de los restos de prolina carboxi terminales, más que la creación de péptidos que posean tales restos de prolina carboxi terminales.
Kuwahara et al. (Plant and Cell Physiology, vol. 31, nº 3, 1995, páginas 435-439) describen que una proteína de 18 kDa de PS II de la espinaca es escindida en el enlace Pro-12-Leu-13 por la prolil endoproteinasa de la espinaca.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un hidrolizado de proteínas el cual comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos (%) que poseen una prolina carboxi terminal es más de dos veces mayor que la fracción molar (%) de prolina en el sustrato de proteína usado para generar el hidrolizado.
Preferiblemente, el hidrolizado de la invención es:
-
un hidrolizado de suero que comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos que poseen una prolina carboxi terminal es al menos 8%, preferiblemente al menos 15%, más preferiblemente de 30 a 70%;
-
un hidrolizado de caseína que comprende péptidos en el que la fracción molar que poseen una prolina carboxi terminal es al menos 25%, preferiblemente al menos 30% y más preferiblemente menos de 70%;
-
un hidrolizado de soja que comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos que poseen una prolina carboxi terminal es al menos 20%, preferiblemente de 30 a 70%;
-
un hidrolizado de gluten que comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos que poseen una prolina carboxi terminal es al menos 20%, preferiblemente al menos 30%, ventajosamente menos de 70%; o
-
un hidrolizado de cebada que comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos que poseen una prolina carboxi terminal es al menos 20%, preferiblemente al menos 30%, ventajosamente menos de 70%.
La presente invención además proporciona una endoproteasa específica de prolina seleccionada del grupo que consiste en:
(a)
un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 40% con los aminoácidos 1 a 526 de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma;
(b)
un polipéptido que es codificado por un polinucleótido el cual se hibrida en condiciones de baja restricción con (i) la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 1 o un fragmento de la misma, que es al menos 80% o 90% idéntico alrededor de 60, preferiblemente alrededor de 100 nucleótidos, más preferiblemente al menos 90% idéntico alrededor de 200 nucleótidos, o (ii) una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia de ácido nucleico de SEC IC NO: 1
y una molécula de ADN que codifica la endopeptidasa.
La presente invención también proporciona:
-
el uso de un hidrolizado de proteínas de la invención en un alimento o bebida;
-
el uso de una endoproteasa específica de prolina de acuerdo con la invención;
-
un método para producir enzimáticamente un hidrolizado de proteínas a partir de un sustrato de proteínas, en el que el sustrato de proteínas es incubado con una endoproteasa específica de prolina para producir un hidrolizado de proteínas enriquecido que comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos (%) que poseen una prolina carboxi terminal es más de dos veces mayor que la fracción molar (%) de prolina en el sustrato de proteína usado para generar el hidrolizado;
-
una composición enzimática que comprende una endoproteasa específica de prolina de la invención, siendo capaz la composición de producir un hidrolizado de proteínas que comprende péptidos, en la que la fracción molar de péptidos (%) que poseen una prolina carboxi terminal es al menos dos veces la fracción molar (%) de prolina en la proteína o un hidrolizado de la invención, con lo que la endoproteasa específica de prolina tiene un peso molecular de 66,6 kDalton, un IEP de ph 4,2 y pH óptimo de 5,0; y
-
un alimento que comprende un hidrolizado de proteínas de la invención u obtenible por un método de la invención.
Descripción detallada de la invención
Se ha mostrado que una alta incidencia de restos de prolina en el extremo carboxi terminal de los péptidos se puede correlacionar con un bajo amargor. Más aún, se ha demostrado que la deseada alta incidencia de restos de prolina carboxi terminales sólo se puede lograr con altas concentraciones de una endoproteasa específica de prolina, es decir, concentraciones que excedieron la actividad especificada en el documento JP 5015314 en varios órdenes de magnitud y además en ausencia de una carboxipeptidasa.
Desde un punto de vista económico, la implicación de esta observación es que existe una clara necesidad de medios mejorados para producir endoproteasas específicas para prolina en altas cantidades y en forma relativamente pura. Una forma preferida de hacer esto es por la vía de la sobreproducción de tal endoproteasa específica de prolina, usando técnicas de ADN recombinante. Como muchos productos alimenticios son ácidos, y las incubaciones enzimáticas a largo plazo bajo circunstancias industriales no estériles requieren condiciones de incubación ácidas para prevenir la contaminación microbiana, una forma más preferida para hacer esto es por la vía de la sobreproducción de una endoproteasa específica de prolina estable a ácidos usando técnicas de ADN recombinante. Una forma particularmente preferida de hacer esto es vía la sobreproducción de una endoproteasa específica de prolina derivada de Aspergillus, y una forma muy preferida de hacer esto es vía la sobreproducción de una endopeptidasa específica para prolina derivada de Aspergillus niger. Para permitir esta última ruta, es esencial la información de secuencia única de una endoproteasa específica de prolina derivada de Aspergillus. Más preferible, tiene que estar disponible la secuencia nucleotídica completa del gen codificante.
Una vez que la nueva enzima está disponible en una forma relativamente pura, se preveen otras nuevas y sorprendentes aplicaciones, las cuales tienen ventajas técnicas y económicas. Una nueva aplicación podría ser la creación de hidrolizados no amargos a partir de sustratos proteicos con composiciones de aminoácidos inusuales. Tales composiciones de aminoácidos inusuales pueden ofrecer serios beneficios en ciertas aplicaciones alimentarias. Ejemplos son el aislado de proteína de maíz o gluten de trigo o caseína con altos niveles de restos de aminoácidos hidrófobos presentes. Hasta ahora tales sustratos no fueron de uso práctico debido a sus reprobables sabores amargos generados con la hidrólisis usando métodos de la técnica anterior. Usando los métodos de hidrólisis de acuerdo con la invención, hay disponibles nuevos hidrolizados no amargos a usar en nutrición clínica y en lactantes, en dietas terapéuticas así como en dietas de consumidores y nutrición de deportistas. Aparte de tales nuevos hidrolizados, también se contemplan aplicaciones que aprovechan el efecto reductor del amargor de las endoproteasas específicas para prolina ácidas como tales. Por ejemplo, la incorporación de la endopeptidasa en productos alimenticios proteicos que involucran un paso de fermentación, tal como en los quesos o el yogurt, para suprimir el amargor, el cual puede desarrollarse con el envejecimiento. También en productos alimenticios proteicos que requieren tratamiento con proteasas, tal como la producción de quesos modificados por enzimas, o la producción de hidrolizados de proteínas para la industria del sabor, la incorporación de la enzima de acuerdo con la invención ayudará a suprimir el amargor.
Además, también se investigan los beneficios no directamente relacionados con la supresión del sabor amargo. Una de tales nuevas aplicaciones es la incubación de la enzima con proteínas alimentarias para reducir su alergenicidad. Varias proteínas alimentarias contienen subfracciones altamente alergénicas, tales como el gluten de trigo, que contiene prolaminas con secuencias peptídicas ricas en prolina. Estas proteínas se pueden someter a la nueva enzima para mitigar su antigenicidad. Otra nueva aplicación es la incorporación de la enzima en todos los tipos de masas, ya que se ha observado que esto retarda el enranciamiento de los panes obtenidos. Otra nueva aplicación es el uso de la endoproteasa específica de prolina para generar péptidos ricos en prolina. Tales péptidos ricos en prolina son aditivos deseables para diversos productos alimenticios o nutracéuticos, ya que se han visto implicados en la acción anoréxica, en efectos fibrinolítico y antitrombótico e hipertensivo, en la protección de la mucosa gástrica, así como la prevención de artritis reumatoide.
Otra sorprendente aplicación es la adición de la nueva enzima al alimento de animales, para mejorar la utilización de proteínas. Por ejemplo, la adición de la enzima conduce a mejorar la digestibilidad de secuencias ricas en prolina difíciles de digerir presentes en los proteínas alimentarias, así como para tasas de conversión mejoradas de proteínas vegetales baratas disponibles que contienen altos niveles de polifenoles.
En aún otra nueva aplicación, la enzima es usada en la elaboración de cerveza. Las proteínas de cebada son ricas en secuencias ricas en prolina, y sus proteínas de cereal en forma no malteada son extremadamente difíciles de degradar en los aminoácidos libres requeridos para crear un mosto de cerveza fermentable apropiado. Muy sorprendentemente, la incorporación de la nueva enzima en el proceso de maceración ha mostrado estimular la liberación de aminoácidos de la cebada molida pero no malteada, de manera que se obtiene un mosto de cerveza mucho más rico. En una forma similar se puede mejorar la fermentación de cerveza a partir de pastas que contienen una alta proporción de otros cereales baratos y localmente disponibles, tales como, por ejemplo, el sorgo.
En la mayoría de estas nuevas aplicaciones, la endoproteasa específica de prolina debería exhibir preferiblemente un espectro de actividad con un óptimo pH ácido.
Para superar los problemas mencionados anteriormente, la invención demuestra que la actividad de una endoproteasa específica de prolina, aislada, purificada, sola, es decir, sin la actividad concomitante o subsiguiente sustancial de una enzima exoproteolítica, es suficiente para desamargar significativamente un hidrolizado de proteínas. Por lo tanto, la endoproteasa específica de prolina puede comprender al menos 5 unidades por gramo de proteína de la preparación enzimática de la invención, preferiblemente 10 u/g, más preferiblemente 25 u/g, e incluso más preferiblemente 50 u/g. Además, estudios conducidos de acuerdo con la invención demuestran que la actividad de una endoproteasa específica de prolina, aislada y purificada, sola, queriendo decir sin la actividad concomitante o subsiguiente de una enzima exoproteolítica, es suficiente para disminuir significativamente el nivel de inmunogenicidad global de los hidrolizados de proteína, así como para incrementar significativamente su solubilidad global bajo condiciones ácidas. Los hidrolizados producidos de acuerdo con la invención están enriquecidos en péptidos que tienen un resto de prolina carboxi terminal.
Una realización de la presente invención proporciona una mezcla enzimática que comprende una endoproteasa específica de prolina, aislada y purificada, para la producción con alto rendimiento de hidrolizados de proteínas que tienen sustancialmente bajo amargor y bajas propiedades alergénicas, sin la producción concomitante de niveles sustanciales de aminoácidos libres. Esta mezcla enzimática es apropiada para preparar hidrolizados de diversas fracciones de proteínas. En particular, un sustrato proteico, tal como una proteína de la leche, puede ser incubado con una endoproteasa específica de prolina, aislada y purificada, y una subtilisina, para producir un hidrolizado de proteínas enriquecido en fragmentos de péptidos que tienen una prolina carboxi terminal. El término "enriquecido" quiere decir que al menos 8% de los fragmentos de péptidos en el producto hidrolizado de la escisión enzimática posee un resto de prolina carboxi terminal.
La presente invención proporciona un hidrolizado de proteínas obtenido hidrolizando una proteína la cual comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos (%) que posee una prolina carboxi terminal es al menos dos veces la fracción molar (%) de prolina en el sustrato de proteína usado para producir el hidrolizado.
La longitud promedio de los péptidos en los hidrolizados es en general de 3 a 9 aminoácidos.
Los hidrolizados preferidos de acuerdo con la invención son: un hidrolizado de suero que comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos que posee una prolina carboxi terminal es al menos 8%, preferiblemente al menos 15%, más preferiblemente de 30 a 70%, un hidrolizado de caseína el cual comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos que lleva una prolina carboxi terminal es al menos 25%, preferiblemente de 30 a 70%, y un hidrolizado de soja que comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos que lleva una prolina carboxi terminal es al menos 20%, preferiblemente de 30 a 70%.
Por péptidos o fragmentos de péptidos se entiende péptidos con masas moleculares de 400 a 2000 Dalton. Estos péptidos se pueden analizar de acuerdo con el análisis de LC/MC como se describe en la sección de "Materiales y Métodos".
En general, en la producción de hidrolizados de proteínas de la invención, el sustrato de proteínas se hidroliza sustancialmente, ventajosamente al menos el 50%. Preferiblemente, al menos 10% del sustrato de proteínas se convierte en péptidos que tienen masas moleculares de 400 a 2000 Dalton. Más preferiblemente, de 20 a 90% e incluso más preferiblemente de 30 a 80% del sustrato de proteínas se convierte en tales péptidos.
En otra realización de la invención, un sustrato de proteína se puede incubar con una mezcla enzimática que comprende una endoproteasa específica de prolina, aislada y purificada, una serina endoproteasa o una metalo endoproteasa y una carboxipeptidasa para producir un hidrolizado de proteínas enriquecido en fragmentos de péptidos que tienen una prolina carboxi terminal.
La mezcla enzimática de la invención es particularmente adecuada para uso en la producción de hidrolizados de proteínas destinados a saborizar e incrementar en nutrientes las bebidas para deportistas y las bebidas basadas en jugos, ya que la mezcla de péptidos hidrolizados resultante combina un perfil muy bajo de amargor con excelente solubilidad bajo las condiciones prevalentemente ácidas de tales bebidas. La mezcla enzimática de la invención se caracteriza porque contiene al menos una endoproteasa, por ejemplo una serina proteasa o una metalo endoproteasa, junto con una endoproteasa específica para serina (E.C. 3.4..21.26), para proporcionar un hidrolizado primario. Más específicamente, la invención se refiere a una endoproteasa específica de prolina, aislada, purificada, y una mezcla enzimática de serina proteasa o metalo proteasa capaz de producir un hidrolizado de proteínas que comprende fragmentos de péptidos, en el que al menos 8%, preferiblemente al menos 15%, más preferiblemente de 30 a 70% de dichos fragmentos de péptidos tiene una prolina carboxi terminal.
Otra realización de la invención es un hidrolizado de proteínas enriquecido con un contenido relativamente alto de péptidos que contienen prolina como el resto de aminoácido carboxi terminal. Tales hidrolizados enriquecidos pueden comprender al menos 8%, preferiblemente al menos 15%, más preferiblemente de 30 a 70% de fragmentos de péptidos que tienen un resto de prolina carboxi terminal. Puesto que las preparaciones enzimáticas típicamente usadas en la génesis de los hidrolizados de proteínas no son capaces de generar péptidos que produzcan restos de prolina en los términos carboxi, los hidrolizados de proteínas que son relativamente ricos en tales péptidos son
novedosos.
Sustratos para la hidrólisis por una mezcla enzimática de la invención incluyen leche entera, leche desnatada, caseína ácida, caseína de cuajo, productos de suero ácidos o productos de suero de quesos. Muy sorprendentemente, la endoproteasa específica de prolina derivada de Aspergillus no solamente escinde en el lado del carboxilo terminal de los restos de prolina, sino también en el lado carboxi terminal de restos de hidroxiprolina, lo cual hace a otras proteínas animales basadas en colágeno, tales como la gelatina, así como los huesos o espinas de pescado que contienen alimentos residuales, sustratos interesantes para la enzima. Más aún, sustratos vegetales como el gluten de trigo, la cebada molida y las fracciones de proteínas obtenidas a partir de, por ejemplo, soja, arroz o maíz son sustratos apropiados. Hidrolizados de proteínas de la leche producidos de acuerdo con la invención se pueden usar con o sin etapas de filtración o purificación adicionales en diversas especialidades alimenticias tales como hidrolizados hipoalergénicos para nutrición de lactantes, hidrolizados básicos para nutrición entérica o dietética, así como concentrados de proteínas para diversas formas de alimento sano. De esta forma, los hidrolizados de proteínas de la invención se pueden usar para producir productos alimentarios que tienen baja antigenicidad, tales como fórmulas para lactantes. Además, las preparaciones enzimáticas de acuerdo con la invención pueden ser utilizadas para reducir el amargor en alimentos saborizados mediante al menos un hidrolizado de proteínas, aún cuando el hidrolizado de proteínas esté presente en grandes cantidades. Por ejemplo, los alimentos pueden comprender entre 5% y 10% (p/v) de un hidrolizado de proteínas, y aún tener reducido su sabor amargo usando una preparación enzimática de la
invención.
La presente invención proporciona una endoproteasa específica de prolina, aislada y purificada, con un óptimo pH ácido, sola o en una composición que comprende una o más enzimas adicionales, para la preparación de un hidrolizado de proteínas para diversas aplicaciones alimentarias. Tal endoproteasa específica de prolina, aislada y purificada, tiene al menos 10 unidades de actividad de endoproteasa específica de prolina por gramo de material proteico. Estas unidades deben ser medidas usando el péptido sintético Z-Gly-Pro-pNA a 37 grados C y pH 5 en caso de que el pH óptimo de la endoproteasa específica de prolina esté por debajo de pH 6, por ejemplo en el caso de la endoproteasa específica de prolina de Aspergillus niger, o también las unidades deben ser medidas a pH=7, según lo especificado en la sección de Materiales y Métodos. Esta enzima aislada, purificada, sola o en una mezcla enzimática, supera un número de desventajas de mezclas enzimáticas conocidas previamente en la técnica. Más importantemente, la endoproteasa específica de prolina, aislada, purificada, de la invención es clave en la producción de hidrolizados que combinan un bajo potencial alergénico, un alto rendimiento y un bajo perfil amargo. Además, los hidrolizados producidos con la endoproteasa específica de prolina, aislada, purificada, o con una mezcla enzimática que comprende esta endoproteasa específica de prolina, son estables a ácidos, y contienen niveles muy bajos de aminoácidos libres, de tal manera que se generan malos sabores mínimos durante las etapas de calentamiento, tales como el secado por pulverización o la esterilización del producto. Los hidrolizados de acuerdo con la invención contendrán menos de 900 micromoles de aminoácidos libres por gramo de polvo seco, preferiblemente menos de 300 micromoles de aminoácidos libres por gramo de polvo seco, más preferiblemente menos de 150 micromoles de aminoácidos libres por gramo de polvo seco, y aún más preferiblemente menos de 50 micromoles por gramo de polvo seco.
La mezcla enzimática de acuerdo con la invención se caracteriza porque comprende otra endoproteasa tal como una serina proteasa o una metalo endoproteasa junto con una endoproteasa específica de prolina, aislada, purificada (E.C. 3.4.21.26), las cuales trabajan juntas para proporcionar un hidrolizado de proteínas primario.
Las serinas proteasas representan una bien conocida clase de endoproteasas alcalinas y algunas de sus más importantes representantes tales como la subtisilina (E.C.3.4.21.62) y la quimiotripsina (E.C.3.4.21.1) prefieren la escisión de la cadena peptídica por el lado del carboxi terminal de los aminoácidos hidrófobos tales como Tyr, Trp, Phe y Leu. La mezcla enzimática de la invención puede contener quimiotripsina y/o subtilisina. La subtilisina es producida por especies de Bacillus, tiene una especificidad por sustratos particularmente amplia, y un óptimo pH alcalino amplio. La enzima es óptimamente activa entre 50ºC y 60ºC. La enzima está disponible de forma barata como un producto comercial normal, y es útil en la producción de, por ejemplo, diversos hidrolizados de leche. La quimiotripsina se puede obtener a partir de páncreas animal, tiene una especificidad por sustratos algo más estrecha a valores de pH ligeramente más alcalinos que la subtilisina, y es óptimamente activa por debajo de 50 grados C.
La clase de metalo endoproteasas está ampliamente diseminada en bacterias, hongos y organismos superiores. Se pueden separar en metaloproteasas ácidas y neutras. De estas dos subclases, solamente las proteasas neutras exhiben la preferencia de escisión deseable, es decir, escinden la cadena peptídica en el lado carboxi terminal de restos de aminoácidos hidrófobos tales como Phe y Leu. Representantes bien conocidos de la categoría de metalo proteasas neutras son la bacilolisina (E.C.3.4.24.28) y la termolisina (E.C.3.4.24.27), y una, o ambas de éstas, pueden estar presentes en la mezcla enzimática de la invención. Ambas enzimas se obtienen a partir de especies de Bacillus, y exhiben actividad máxima en condiciones neutras o ligeramente alcalinas. Representantes menos conocidos de estas metalo proteasas neutras se han obtenido a partir de especies Aspergillus. En aquellos casos en los cuales la endoproteasa específica de prolina no es utilizada por su efecto eliminador del amargor, sino para ayudar en la hidrólisis de secuencias de proteínas ricas en prolina, pueden ser ventajosas combinaciones con la clase de metaloproteasas ácidas, como por ejemplo deuterolisina (E.C.3.4.24.39).
Una endoproteasa específica de prolina es una endoproteasa capaz de escindir péptidos o polipéptidos en el extremo carboxi terminal de restos de prolina. Tales enzimas se encuentran ampliamente en animales y plantas, pero su presencia en microorganismos parece estar limitada. Hasta la fecha, se han identificado endoproteasas específicas para prolinas en especies de Aspergillus (documento EP 0 522 428), Flavobacterium (documento EP 0 967 285) y Aeromonas (J. Biochem.113, 790-796), Xanthomonas y Bacteroides. Aunque las enzimas específicas para prolinas de la mayoría de estos organismos son activas alrededor de pH 8, la enzima de Aspergillus es óptimamente activa a alrededor de pH 5. De acuerdo con una realización preferida, se usa la endoproteasa específica de prolina que tiene un pH óptimo por debajo de 7, preferiblemente que tiene un pH óptimo de 3,5 a 6,5, debido a las ventajas técnicas y económicas de tales enzimas. La endoproteasa específica de prolina de la invención se puede aislar a partir de una de las especies microbianas antes mencionadas, particularmente a partir de una especie de Aspergillus. Preferiblemente, la endoproteasa específica de prolina se aísla a partir de un cepa de Aspergillus niger. Más preferiblemente, la endoproteasa específica de prolina se aísla a partir de un hospedante Aspergillus niger manipulado para sobreexpresar un gen que codifica una endoproteasa específica de prolina, aunque otros hospedantes, tales como E. coli, son vectores de expresión apropiados. Por ejemplo, la clonación y sobreproducción de la endoproteasa específica de prolina derivada de Flavobacterium en, entre otros, E. coli, ha hecho que ciertas endoproteasas específicas para prolinas estén disponibles en una forma pura. Un ejemplo de tal constructo sobreproductor se proporciona en World Journal of Microbiology and Biotechnology, vol 11, p. 209-212. Preferiblemente se usa un hospedante de Aspergillus niger para producir un auto-constructo no recombinante utilizando promotores de A. niger para dirigir la expresión de un gen que codifica una endoproteasa específica de prolina de A. niger.
La mayoría de las publicaciones científicas concernientes a la clonación y producción de endoproteasas específicas para prolinas se centran en el papel de esta enzima en la síntesis y regulación de proteínas biológicamente activas. Las publicaciones que implican esta enzima en la producción de hidrolizados de proteínas útiles son escasas y están involucradas con el uso de la enzima junto con una exoproteasa. Varias publicaciones japonesas se refieren a la presencia de actividad endoproteolítica específica para prolina en mezclas de enzimas brutas y complejas capaces de producir hidrolizados con bajos perfiles de amargor, pero las mezclas enzimáticas usadas siempre contiene exoproteasas. La conexión no directa entre desamargar y la actividad endoproteolítica específica para prolina en ausencia de exoproteasas, como carboxipeptidasas o aminopeptidasas, está sugerida en la técnica. Además, no se han descrito previamente datos que vinculen hidrolizados producidos usando actividad endoproteolítica específica para prolina con una respuesta inmunogénica disminuida o una solubilidad ácida mejorada.
Un polipéptido de la invención el cual tiene endoproteasa específica de prolina puede estar en forma aislada. Como se define aquí, un polipéptido aislado es un polipéptido recombinante o producido endógenamente que está esencialmente libre de otros polipéptidos de endoproteasas no específicas para prolina, y es típicamente al menos alrededor de 20% puro, preferiblemente al menos alrededor de 40% puro, más preferiblemente al menos alrededor de 60% puro, aún más preferiblemente al menos alrededor de 80%, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 90% puro, y lo más preferiblemente alrededor de 95% puro, según lo determinado por SDS-PAGE. El polipéptido se puede aislar por centrifugación y métodos cromatográficos, o cualquier otra técnica conocida en la técnica para obtener proteínas puras a partir de disoluciones brutas. Se entenderá que el polipéptido se puede mezclar con vehículos o diluyentes, los cuales no interfieren con el fin pretendido del polipéptido, y así el polipéptido en esta forma se considerará aislado. Generalmente comprenderá el polipéptido en una preparación en la cual más del 20%, por ejemplo más del 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% ó 99% en peso de las proteínas en la preparación es un polipéptido de la invención.
Preferiblemente el polipéptido de la invención es obtenible a partir de un microorganismo el cual posee un gen que codifica una enzima con actividad de endoproteasa específica de prolina. Más preferiblemente, el microorganismo es un hongo, y óptimamente es un hongo filamentoso. Organismos preferidos son así del género Aspergillus, tales como aquellos de la especie Aspergillus niger.
En una primera realización, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencias de aminoácidos con los aminoácidos 1 a 526 de SEC ID NO: 2 (es decir el polipéptido) de al menos alrededor de 40%, preferiblemente al menos alrededor de 50%, preferiblemente al menos alrededor de 60%, preferiblemente al menos alrededor de 65%, preferiblemente al menos alrededor de 70%, más preferiblemente al menos alrededor de 80%, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 90%, aún más preferiblemente al menos alrededor de 95%, y lo más preferiblemente al menos alrededor de 97%, y el cual tiene una actividad de endoproteasa específica de prolina.
Para los fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos o más secuencias de aminoácidos está determinado por el programa de búsqueda en base de datos de proteínas BLAST P (Altschul y otros, 1997, Nucleic Acids Research 25:3389-3402) con matriz Blosum 62 y un umbral esperado de 10.
Un polipéptido de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 2 o una secuencia sustancialmente homóloga, o un fragmento de alguna secuencia que tenga actividad de endoproteasa específica de prolina. En general, se prefiere la secuencia de aminoácidos que existe de manera natural mostrada en SEC ID NO: 2.
El polipéptido de la invención también puede comprender una variante que exista de manera natural o especies homólogas del polipéptido de SEC ID NO: 2.
Una variante es un polipéptido que se encuentra de manera natural en, por ejemplo, hongos, bacterias, levaduras o células de plantas, teniendo la variante actividad de endoproteasa específica de prolina y una secuencia sustancialmente similar a la de la proteína de SEC ID NO: 2. El término "variantes" se refiere a polipéptidos los cuales tienen las mismas características esenciales o funcionalidad biológica básica que la endoproteasa específica de prolina de SEC ID NO: 2, e incluye las variantes alélicas. El carácter esencial de la endoproteasa específica de prolina de SEC ID NO: 2 es que es una enzima capaz de escindir el aminoácido amino terminal de una proteína o (poli)péptido. Preferiblemente, una polipéptido variante tiene al menos el mismo nivel de actividad de endoproteasa específica de prolina que el polipéptido de SEC ID NO: 2. Las variantes incluyen algunas variantes alélicas, ya sean de la misma cepa, como el polipéptido de SEC ID NO: 2, o a partir de una cepa diferente del mismo género o especie.
De forma similar, una especie homóloga de la proteína inventiva es una proteína equivalente de secuencia similar, la cual es una endoproteasa específica de prolina y se encuentra de manera natural en otra especie de Aspergillus.
Variantes y especies homólogas se pueden aislar usando los procedimientos descritos aquí, los cuales se usaron para aislar el polipéptido de SEC ID NO: 2 y llevando a cabo tales procedimientos sobre una fuente de células apropiada, por ejemplo una célula bacteriana, de levadura, de hongo o vegetal. También es posible usar una sonda de la invención para sondar bibliotecas obtenidas a partir de células de levaduras, bacterianas, de hongos o vegetales, a fin de obtener clones que expresen variantes o especies homólogas del polipéptido de SEC ID NO: 2. Estos clones se pueden manipular por técnicas convencionales para generar un polipéptido de la invención el cual después se puede producir por técnicas sintéticas o recombinantes conocidas per se.
La secuencia del polipéptido de SEC ID NO: 2 y de las variantes y especies homólogas se pueden modificar también para proporcionar polipéptidos de la invención. Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos, por ejemplo desde 1, 2, ó 3 hasta 10, 20 ó 30 sustituciones. También se puede hacer el mismo número de eliminaciones que de inserciones. Estos cambios se pueden hacer fuera de las regiones críticas para la función del polipéptido, puesto que tal polipéptido modificado retendrá su actividad de endoproteasa específica de prolina.
Los polipéptidos de la invención incluyen fragmentos de los polipéptidos de longitud completa antes mencionados y las variantes de los mismos, incluyendo fragmentos de la secuencia expuesta en SEC ID NO: 2. Tales fragmentos retendrán típicamente actividad como una endoproteasa específica de prolina. Los fragmentos pueden tener al menos 50, 100 ó 200 aminoácidos de longitud, o puede ser este número de aminoácidos corto de la secuencia de longitud completa mostrada en SEC ID NO: 2.
Los polipéptidos de la invención se pueden producir, si es necesario, por medios sintéticos, aunque usualmente se obtendrán recombinantemente como se describe más adelante. Los polipéptidos sintéticos se pueden modificar, por ejemplo, mediante adición de restos de histidina o un marcador T7 para ayudar a su identificación o purificación, o mediante adición de una secuencia señal para promover su secreción a partir de una célula.
De esta manera, las secuencias variantes pueden comprender aquellas derivadas de cepas de Aspergillus diferentes de la cepa a partir de la cual se aisló el polipéptido de SEC ID NO: 2. Las variantes se pueden identificar a partir de otras cepas de Aspergillus mediante la búsqueda de actividad de endoproteasa específica de prolina y clonando y secuenciando como se describe aquí. Las variantes pueden incluir la supresión, modificación o adición de aminoácidos individuales o grupos de aminoácidos dentro de la secuencia proteica, en tanto que el péptido mantenga la funcionalidad biológica básica de la endoproteasa específica de prolina de SEC ID NO: 2.
Las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer, por ejemplo, desde 1, 2 o de 3 hasta 10, 20 ó 30 sustituciones. Los polipéptidos modificados generalmente retendrán la actividad como una endoprotesa específica de prolina. Se pueden hacer sustituciones conservativas; tales sustituciones son bien conocidas en la técnica. Las sustituciones preferiblemente no afectan al plegamiento o a la actividad del polipéptido.
Secuencias polipeptídicas más cortas están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, se considera que un péptido de al menos 50 aminoácidos o hasta 60, 70, 80, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud está dentro del alcance de la invención en tanto demuestre la funcionalidad biológica básica de la endoproteasa específica de prolina de SEC ID NO: 2. En particular, pero no exclusivamente, este aspecto de la invención comprende la situación en la cual la proteína es un fragmento de la secuencia de la proteína completa.
En una segunda realización, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que tiene actividad de endoproteasa específica de prolina, y está codificado por polinucleótidos que se hibridan o son capaces de hibridarse en condiciones poco restrictivas, más preferiblemente condiciones restrictivas medias, y lo más preferible condiciones muy restrictivas, con (I) la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 1 o un fragmento de ácido nucleico que comprende al menos la porción C-terminal de SEC ID NO: 1, pero que tiene menos de todas o que tiene bases que difieren de las bases de SEC ID NO: 1; o (ii) con una hebra de ácido nucleico complementaria a SEC ID NO: 1.
La expresión "capaz de hibridarse" significa que el polinucleótido diana de la invención se puede hibridar con el ácido nucleico usado como sonda (por ejemplo, la secuencia nucleotídica expuesta en SEC ID NO: 1, o un fragmento de la misma, o el complemento de SEC ID NO: 1) a un nivel significativamente por encima del de referencia. La invención también incluye los polinucleótidos que codifican la endoproteasa específica de prolina de la invención, así como las secuencias nucleotídicas que son complementarias a ellas. La secuencia nucleotídica puede ser ARN o ADN, incluyendo ADN genómico, ADN sintético o ADNc. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica es ADN y lo más preferible una secuencia de ADN genómico. Típicamente, un polinucleótido de la invención comprende una secuencia contigua de nucleótidos que es capaz de hibridarse en condiciones selectivas a la secuencia codificante o al complemento de la secuencia codificante de SEC ID NO: 1. Tales nucleótidos se pueden sintetizar de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica.
Un polinucleótido de la invención se puede hibridar con la secuencia codificante o el complemento de la secuencia codificante de la SEC ID NO: 1 a un nivel significativamente por encima del de referencia. La hibridación de referencia se puede producir, por ejemplo, debido a otros ADNc presentes en una biblioteca de ADNc. El nivel de señal generado por la interacción entre un polinucleótido de la invención y la secuencia codificante o el complemento de la secuencia codificante de SEC ID NO: 1 es típicamente al menos 10 veces, preferiblemente al menos 20 veces, más preferiblemente al menos 50 veces, e incluso más preferiblemente al menos 100 veces tan intensa como las interacciones entre otros polinucleótidos y la secuencia codificante de la SEC ID NO: 1. La intensidad de la interacción se puede medir, por ejemplo, radiomarcando la sonda, por ejemplo con ^{32}P. La hibridación selectiva se puede lograr típicamente usando condiciones de poco restrictivas (cloruro de sodio 0,3M y citrato de sodio 0,03M a alrededor de 40ºC), medio restrictivas (por ejemplo, cloruro de sodio 0,3M y citrato de sodio 0,03M a alrededor de 50ºC) o muy restrictivas (por ejemplo, cloruro de sodio 0,3M y citrato de sodio 0,03M a alrededor de 60ºC).
Modificaciones
Los polinucleótidos de la invención pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser de monocatenarios o bicatenarios. También pueden ser polinucleótidos los cuales incluyen dentro de ellos nucleótidos sintéticos o modificados que incluyen ácidos nucleicos peptídicos. Se conoce en la técnica un número de diferentes tipos de modificaciones para los polinucleótidos. Estas incluyen cadenas principales de metilfosfonato y fosforotioato, y la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines de la presente invención, se entenderá que los polinucleótidos descritos aquí pueden ser modificados por cualquier método disponible en la técnica.
Se entenderá que personas expertas podrán, usando técnicas habituales, hacer sustituciones nucleotídicas que no afecten a la secuencia de polipéptidos codificada por los polinucleótidos de la invención, para reflejar el uso de codones de cualquier organismo hospedante particular en el cual se expresarán los polipéptidos de la invención.
La secuencia codificante de SEC ID NO: 1 puede ser modificada mediante sustituciones nucleotídicas, por ejemplo de 1, 2 ó 3 hasta 10, 25, 50 ó 100 sustituciones. El polinucleótido de SEC ID NO: 1 se puede modificar alternativa o adicionalmente mediante una o más inserciones y/o supresiones y/o por una extensión en uno o ambos extremos. El polinucleótido modificado generalmente codifica un polipéptido el cual tiene una actividad de endoproteasa específica de prolina. Se puede realizar sustituciones degeneradas, y/o se pueden realizar sustituciones las cuales podrían dar como resultado una sustitución de aminoácidos conservativa cuando la secuencia modificada es traducida, por ejemplo según lo discutido con referencia a los polipéptidos posteriormente.
Homólogos
En la invención se incluye una secuencia nucleotídica la cual es capaz de hibridarse selectivamente con el complemento de la secuencia de ADN codificante de SEC ID NO: 1, y generalmente tendrá al menos 50% ó 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia codificante de SEC ID NO: 1 sobre una región de al menos 60, preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 200 nucleótidos contiguos, o lo más preferible sobre la longitud completa de SEC ID NO: 1. Igualmente, también está abarcado por la invención un nucleótido el cual codifica una endoproteasa activa específica de prolina y el cual es capaz de hibridarse selectivamente con un fragmento de un complemento de la secuencia de ADN codificante de SEC ID NO: 1. La invención engloba un fragmento C-terminal de la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 1, la cual es al menos 80% ó 90% idéntica a lo largo de 60, preferiblemente a lo largo de 100 nucleótidos, más preferiblemente al menos 90% idéntica a lo largo de 200 nucleótidos.
Para definir los polinucleótidos de la invención, se puede usar cualquier combinación de los grados de identidad y tamaños mínimos antes mencionados, siendo preferidas las combinaciones más restrictivas (es decir, mayor identidad a lo largo de mayores longitudes). Así, por ejemplo, un polinucleótido el cual es al menos 80% o 90% idéntico a lo largo de 60, preferiblemente a lo largo de 100 nucleótidos, forma un aspecto de la invención, como lo es un polinucleótido el cual es al menos idéntico 90% a lo largo de 200 nucleótidos.
El Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT el cual se puede usar para calcular la identidad (por ejemplo, usado en sus parámetros por defecto).
Los algoritmos PILEUP y BLAST N se pueden usar para calcular la identidad de secuencia o para alinear secuencias (tales como identificar secuencias equivalentes o correspondientes, por ejemplo en sus parámetros por defec-
to).
El programa para realizar el análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra identificar primero el par de secuencias de alto puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, que ya bien se corresponde o satisface alguna puntuación T umbral evaluado como positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina como el umbral de puntuación de la palabra en la vecindad. Estos aciertos de las palabras en la vecindad iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar las HSP que las contienen. Los aciertos de palabras son extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde la puntuación de alineación acumulativa se puede incrementar. Las extensiones para los aciertos de palabras en cada dirección son detenidas cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae fuera mediante la cantidad X a partir de su máximo valor logrado; la puntuación acumulativa va hacia cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos que puntúan negativo; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, las alineaciones de la matriz de puntuación BLOSUM62 (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas
cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una coincidencia entre dos secuencias nucleotídicas o de aminoácidos podría ocurrir por azar. Por ejemplo, una secuencia es considerada similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menor que alrededor de 1, preferiblemente menor que alrededor de 0,1, más preferiblemente menor que alrededor de 0,01, y lo más preferible menor que alrededor de 0,001.
Cebadores y Sondas
Los polinucleótidos de la invención incluyen y se pueden usar como cebadores, por ejemplo como cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como cebadores para reacciones de amplificación alternativas, o como sondas, por ejemplo marcadas con marcadores reveladores por medios convencionales usando marcadores radioactivos o no radioactivos, o los polinucleótidos se pueden clonar en vectores. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos tendrán al menos 15, por ejemplo al menos 20, 25, 30 ó 40 nucleótidos de longitud. Típicamente tendrán hasta 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 ó 300 nucleótidos de longitud, o incluso hasta unos pocos nucleótidos cortos (tales como 5 ó 10 nucleótidos) de la secuencia codificante de SEC ID NO: 1.
En general, los cebadores se producirán por medios sintéticos, implicando una fabricación escalonada de la secuencia de ácido nucleico deseada, un nucleótido cada vez. Las técnicas para lograr esto usando los protocolos automatizados están fácilmente disponibles en la técnica. Los polinucleótidos más largos se producirán generalmente usando medios recombinantes, por ejemplo usando técnicas de clonación por PCR. Esto implicará la fabricación de un par de cebadores (típicamente de alrededor de 15-30 nucleótidos) para amplificar la región deseada de la endoproteasa específica de prolina a ser clonada, poniendo los cebadores en contacto con el ARNm, ADNc o ADN genómico obtenido a partir de una célula de levadura, bacteriana, vegetal, procariota o fúngica, preferiblemente de una cepa de Aspergillus, realizando una reacción en cadena de la polimerasa en condiciones apropiadas para la amplificación de la región deseada, aislando el fragmento purificado (por ejemplo purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Los cebadores se pueden diseñar para que contengan sitios de reconocimiento de enzimas de restricción apropiadas, de manera que el ADN amplificado pueda ser clonado en un vector de clonación apropiado.
Tales técnicas se pueden usar para obtener todo o parte de los polinucleótidos que codifican la secuencia de endoproteasa específica de prolina descrita aquí. Los intrones, promotores y regiones trailer están dentro del alcance de la invención, y pueden también ser obtenidos de una manera análoga (por ejemplo por medios recombinantes, PCR o técnicas de clonación) partiendo del ADN genómico proveniente de una célula fúngica, de levadura, bacteriana, vegetal o procariota.
Los polinucleótidos o cebadores pueden llevar un marcador revelador. Marcadores apropiados incluyen radioisótopos tales como ^{32}P o ^{35}S, marcadores enzimáticos, u otros marcadores proteicos tales como la biotina. Tales marcadores pueden ser añadidos a los polinucleótidos o cebadores de la invención, y pueden ser detectados usando técnicas conocidas por personas expertas en la técnica.
Los polinucleótidos o cebadores (o fragmentos de los mismos) marcados o no marcados se pueden usar en ensayos basados en ácidos nucleicos para detectar o secuenciar una endoproteasa específica de prolina o una variante de la misma en una muestra fúngica. Tales ensayos de detección generalmente comprenderán poner una muestra fúngica, que se sospecha que contiene el ADN de interés, en contacto con una sonda que comprende un polinucleótido o cebador de la invención en condiciones de hibridación, y detectar cualquier dúplex formado entre la sonda y el ácido nucleico en la muestra. La detección se puede lograr usando técnicas tales como PCR o inmovilizando la sonda sobre un soporte sólido, eliminando cualquier ácido nucleico en la muestra el cual no se hidride con la sonda, y detectando luego cualquier ácido nucleico el cual se hidride con la sonda. Alternativamente, el ácido nucleico de la muestra puede ser inmovilizado en un soporte sólido, la sonda se puede hibridar, y la cantidad de sonda unida a tal soporte se puede detectar después de la eliminación de cualquier sonda no enlazada detectada.
Las sondas de la invención se pueden envasar convenientemente en forma de un kit de ensayo en un recipiente apropiado. En tales kit, la sonda puede estar enlazada a un soporte sólido, en el que el formato de ensayo para el cual el kit es diseñado requiere tal enlace. El kit también puede contener reactivos apropiados para tratar la muestra a ensayar, hibridar la sonda con el ácido nucleico en la muestra, reactivos controles, instrucciones y similares. Las sondas y los polinucleótidos de la invención también se pueden usar en microensayos.
Preferiblemente, el polinucleátido de la invención es obtenible a partir del mismo organismo que el polipéptido, tal como un hongo, en particular un hongo del género Aspergillus.
Los polinucleótidos de la invención también incluyen variantes de la secuencia de SEC ID NO: 1 que codifica un polipéptido que tiene actividad de endoproteasa específica de prolina. Las variantes pueden ser formadas por adiciones, sustituciones y/o supresiones. Tales variantes de la secuencia codificante de SEC ID NO: 1 pueden de esta forma codificar polipéptidos los cuales tienen la habilidad de digerir una cadena polipeptídica en el lado carboxi terminal de la prolina.
Producción de polinucleótidos
Los polinucleótidos los cuales no tienen 100% de identidad con SEC ID NO: 1 pero que caen dentro del alcance de la invención se pueden obtener por un número de vías. Así, variantes de la secuencia de la endoproteasa específica de prolina descrita aquí se pueden obtener, por ejemplo, sondando bibliotecas de ADN genómico obtenidas de un abanico de organismos, tal como los discutidos como fuentes de los polipéptidos de la invención. Adicionalmente, se pueden obtener otros homólogos fúngicos, vegetales o procariotas de endoproteasa específica de prolina, y tales homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridarse a SEC ID NO: 1. Tales secuencias se pueden obtener sondando bibliotecas de ADNc o bibliotecas de ADN genómico de otras especias, y sondando tales bibliotecas con sondas que contienen toda o parte de SEC ID NO: 1 en condiciones de baja, media y alta restricción (según lo descrito previamente). Las sondas de ácidos nucleicos que comprenden toda o parte de SEC ID NO: 1 se pueden usar para sondar bibliotecas de ADNc o genómicas de otras especies, tales como las descritas como fuentes para los polipéptidos de la invención.
También se pueden obtener especies homólogas usando PCR degenerada, la cual usa cebadores diseñados para seleccionar como dianas secuencias dentro de las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos conservadas. Los cebadores pueden contener una o más posiciones degeneradas, y se usarán en condiciones de restricción más bajas que los usados para clonar secuencias con cebadores de secuencias individuales contra secuencias conocidas.
Alternativamente, tales polinucleótidos se pueden obtener por mutagénesis dirigida al sitio de las secuencias de endoproteasa específica de prolina o variantes de la misma. Esto puede ser útil cuando, por ejemplo, se requieren cambios de codones silenciosos para las secuencias para optimizar preferencias de codones para una célula hospedante particular, en la cual están siendo expresadas las secuencias de polinucleótidos. Se pueden realizar otros cambios de secuencias con el objetivo de introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.
La invención incluye polinucleótidos de doble cadena que comprenden un polinucleótido de la invención y su complemento.
La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención descritos anteriormente. Puesto que tales polinucleótidos serán útiles como secuencias para la producción recombinante de polipéptidos de la invención, no es necesario que sean capaces de hibridarse a la secuencia de SEC ID NO: 1, aunque esto será generalmente deseable. De otro modo, tales polinucleótidos se pueden marcar, usar y obtener según lo descrito anteriormente, si se desea.
Polinucleótidos recombinantes
La invención también proporciona vectores que comprenden un polinucleótido de la invención, incluyendo vectores de clonación y de expresión, y en otro aspecto métodos de crecimiento, transformación o transfección de tales vector en una célula hospedante apropiada, por ejemplo en condiciones en la cuales se produce la expresión de un polipéptido de, o codificado por una secuencia de, la invención. También se proporcionan células hospedantes que comprenden un polinucleótido o vector de la invención en las que el polinucleótido es heterólogo al genoma de la célula hospedante. El término "heterólogo", usualmente con respecto a la célula hospedante, significa que el polinucleótido no está presente naturalmente en el genoma de la célula hospedante, o que el polipéptido no se produce de manera natural por esa célula. Preferiblemente, la célula hospedante es una célula de levadura, por ejemplo una célula de levadura del género Kluyveromyces o Saccharomyces o una célula fúngica filamentosa, por ejemplo del género Aspergillus.
Los polinucleótidos de la invención se pueden incorporar en un vector recombinante replicable, por ejemplo un vector de clonación o expresión. El vector se puede usar para replicar el ácido nucleico en una célula hospedante compatible. Así, en una realización adicional, la invención proporciona un método para obtener polinucleótidos de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedante compatible, y haciendo crecer la célula hospedante en condiciones las cuales provocan la replicación del vector. El vector se puede recuperar de la célula hospedante. Más abajo se describen células hospedantes apropiadas en relación con vectores de expresión.
Vectores
El vector en el cual se inserta el casete de expresión de la invención puede ser cualquier vector que pueda ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula hospedante en la cual se introduzca. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector el cual existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, tal como un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedante, se integra en el genoma de la célula hospedante y se replica junto con el cromosoma o cromosomas en el cual se ha integrado.
Preferiblemente, cuando un polinucleótido de la invención está en un vector, está operablemente unido a una secuencia reguladora la cual es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por la célula hospedante, es decir, el vector es un vector de expresión. La expresión "operablemente unido" se refiere a la yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida. Una secuencia reguladora tal como un promotor, potenciador u otra señal de regulación de la expresión "operablemente unida" a una secuencia codificante está situada de tal manera que la expresión de la secuencia codificanse se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Los vectores se pueden proporcionar, por ejemplo en el caso de vectores plasmídicos, cosmídicos, víricos o fágicos, con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente un potenciador y/o regulador del promotor. Puede estar presente una secuencia terminadora, como puede estar una secuencia de poliadenilación. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano, o un gen de resistencia a la neomicina para un vector de mamífero. Los vectores se pueden usar in vitro, por ejemplo para la producción de ARN, o se pueden usar para transfectar o transformar una célula hospedante.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido se introduce preferiblemente en un hospedante apropiado como parte de un constructo de expresión en el cual la secuencia de ADN está operablemente unida a señales de expresión las cuales son capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ADN en las células hospedantes. Para la transformación del hospedante apropiado con el constructo de expresión existen procedimientos de transformación los cuales son bien conocidos por la persona experta. El constructo de expresión se puede usar para la transformación del hospedante como parte de un vector que posee un marcador seleccionable, o el constructo de expresión es cotransformado como una molécula separada junto con el vector que posee un marcador seleccionable. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables.
Los marcadores seleccionables preferidos incluyen pero no se limitan a aquellos que complementan un defecto en la célula hospedante o confieren resistencia a un fármaco. Incluyen por ejemplo genes marcadores versátiles que se pueden usar para la transformación de la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras tales como los genes o ADNcs de acetamidasa (los genes amdS, niaD, facA o ADNc de A. nidulans, A. oryzae, o A. niger), o genes que proporcionan resistencia a antibióticos tales como resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, fleomicina o benomila (benA). Alternativamente, los marcadores de selección específicos se pueden usar como marcadores auxotróficos los cuales requieren cepas hospedantes mutantes correspondientes: por ejemplo URA3 (procedente de S. cerevisiae o genes análogos procedentes de otras levaduras), pyrG, o pyrA (procedente de A. nidulans, o A. niger), argB (procedente de A. nidulans, o A. niger) o trpC. En una realización preferida, el marcador de selección es suprimido de la célula hospedante transformada después de la introducción del constructo de expresión para obtener células hospedantes transformadas capaces de producir el polipéptido, las cuales están libres de genes marcadores de selección.
Otros marcadores incluyen la subunidad 9 de ATP sintetasa (oliC), orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa (pvrA), el gen de resistencia a G418 bacteriano (útil en levaduras, pero no en hongos filamentosos), el gen de resistencia a la ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a la neomicina (Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que codifica la glucuronidasa (GUS). Los vectores se pueden usar in Vitro, por ejemplo para la producción de ARN o para transfectar o transformar una célula hospedante.
Para la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, el constructo de expresión se integra preferiblemente en el genoma de la célula hospedante con el objetivo de obtener transformantes estables. Sin embargo, para algunas levaduras, también existen sistemas de vectores episomales apropiados en los cuales el constructo de expresión se puede incorporar para una expresión de nivel alto y estable. Ejemplos de los mismos incluyen vectores derivados de los plásmidos CEN y pKD1, 2 \mum, de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo, AMA1 de Aspergillus). Cuando los constructos de expresión se integran en los genomas de las células hospedantes, los constructos se integran en loci al azar en el genoma, o en loci diana predeterminados, usando recombinación homóloga, en cuyo caso el loci diana comprende preferiblemente un gen altamente expresado. Un gen altamente expresado es un gen cuyo ARNm puede constituir hasta al menos 0,01% (p/p) del ARNm celular total, por ejemplo bajo condiciones inducidas, o, alternativamente, un gen cuyo producto génico puede constituir al menos el 0,2% (p/p) de la proteína celular total, o, en caso de un producto génico segregado, puede ser segregado a un nivel de al menos 0,05 g/l.
Un constructo de expresión para una célula hospedante dada contendrá habitualmente los siguientes elementos unidos operablemente entre sí en un orden consecutivo desde el extremo 5' al extremo 3', con relación a la cadena codificante de la secuencia que codifica el polipéptido del primer aspecto:
(1) una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido en la célula hospedante dada, (2) preferiblemente, una región 5' no traducida (líder), (3) opcionalmente, una secuencia señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido desde la célula hospedante dada en un medio de cultivo, (4) la secuencia de ADN que codifica una forma madura y preferiblemente activa del polipéptido, y preferiblemente también (5) una región de terminación de la transcripción (terminadora) capaz de terminar la trascripción en dirección de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido.
En dirección de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido, el constructo de expresión contiene preferiblemente una región 3' no traducida que contiene uno o más sitios de terminación de la transcripción, también denominada como un terminador. El origen del terminador es menos crítico. El terminador puede ser por ejemplo nativo con respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Sin embargo, preferiblemente, se usa un terminador de levadura en células hospedantes de levadura, y se usa un terminador de hongos filamentosos en células hospedantes de hongos filamentosos. Más preferiblemente, el terminador es endógeno a la célula hospedante en la cual se expresa la secuencia de ADN que codifica el polipéptido.
La expresión potenciada del polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención también se puede lograr mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo el promotor, la secuencia señal y las regiones terminadoras, que sirven para incrementar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de proteínas de interés a partir del hospedante de expresión elegido y/o para proporcionar el control inducible de la expresión del polipéptido de la invención.
Aparte del promotor nativo al gen que codifica el polipéptido de la invención, se pueden usar otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido de la invención. El promotor se puede seleccionar por su eficiencia en dirigir la expresión del polipéptido de la invención en el hospedante de expresión deseado.
Se pueden seleccionar promotores/potenciadores y otras señales de regulación de la expresión para que sean compatibles con la célula hospedante para la cual se diseña el vector de expresión. Por ejemplo, se pueden usar promotores procariotas, en particular aquellos apropiados para uso en cepas de E. coli. Cuando la expresión de los polipéptidos de la invención se lleva a cabo en células de mamíferos, se pueden usar promotores de mamíferos. También se pueden usar promotores específicos de tejidos, por ejemplo promotores específicos para células hepatocíticas. También se pueden usar promotores virales, por ejemplo la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor de SV40, el promotor IE del citomegalovirus humano (CMV), los promotores del virus del herpes simple o los promotores de adenovirus.
Los promotores apropiados de levaduras incluyen los promotores ADH y GAL4 de S. cerevisiae, y los promotores nmt1 y adh de S. pombe. Los promotores de mamíferos incluyen el promotor de la metalotioneína que puede ser inducido en respuesta a metales pesado tales como cadmio. También se pueden usar promotores virales tales como el promotor del antígeno T grande de SV40 o los promotores de adenovirus. Todos estos promotores están fácilmente disponibles en la técnica.
Se pueden usar promotores de mamíferos, tales como los promotores de \beta-actina. Se prefieren especialmente promotores específicos de tejidos, en particular promotores específicos de células endoteliales o neuronales (por ejemplo los promotores DDAHI y DDAHII). También se pueden usar promotores virales, por ejemplo la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor de SV40, el promotor IE del citomegalovirus humano (CMV), los adenovirus, los promotores del HSV (tales como los promotores IE del HSV), o los promotores del HPV, particularmente la región reguladora en dirección 5' (URR) del HPV. Los promotores virales están fácilmente disponibles en la técnica.
Se puede usar una variedad de promotores que sea capaz de dirigir la transcripción en las células hospedantes de la invención. Preferiblemente, la secuencia promotora deriva de un gen muy expresado, según lo definido previamente. Ejemplos de genes muy expresados preferidos, a partir de los cuales derivan preferiblemente los promotores y/o que están comprendidos en los loci diana predeterminados preferidos para la integración de constructos de expresión incluyen pero no se limitan a genes que codifican enzimas glucolíticas tales como triosafosfato isomerasas (TPI), gliceraldehído fosfato deshidrogenasas (GAPDH), fosfoglicerato cinasas (PGK), piruvato cinasas (PYK), alcohol deshidrogenasas (ADH), así como genes que codifican amilasas, glucoamilasas, proteasas, xilanasas, celobiohidrolasas, \beta-galactosidasas, alcohol (metanol) oxidasas, factores de alargamiento, y proteínas ribosómicas. Ejemplos específicos de genes muy expresados apropiados incluyen por ejemplo el gen LAC4 de Kluyveromyces sp., los genes de la metanol oxidasa (AOX y MOX) de Hansenula y Pichia, respectivamente, los genes de la glucoamilasa (glaA) de A. niger y A. awamori, el gen de la TAKA amilasa de A. oryzae, el gen gpdA de A. nidulans y los genes de la celobiohidrolasa de T. reesei.
Ejemplos de promotores inducibles y/o constitutivos fuertes los cuales son preferidos para uso en los hospedantes de expresión fúngica son aquellos promotores que son obtenibles a partir de los genes fúngicos para promotores de xilanasa (xlnA), fitasa, subunidad 9 de la ATP sintetasa (oliC), triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa (AdhA), amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG del gen glaA) acetamidasa (amdS) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpd).
Ejemplos de promotores de levadura fuertes los cuales se pueden usar incluyen aquellos obtenibles a partir de los genes para alcohol deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato cinasa y triosafosfato isomerasa.
Ejemplos de promotores bacterianos fuertes los cuales se pueden usar incluyen los promotores de amilasa y SPo2, así como promotores de genes de proteasa extracelular.
Promotores apropiados para células vegetales los cuales se pueden usar incluyen los promotores de napalina sintasa (nos), octopina sintasa (ocs), manopina sintasa (mas), subunidad pequeña de ribulosa (rubisco ssu), histona, actina de arroz, faseolina, virus del mosaico de la coliflor (CMV) 35S y 19S y de circovirus.
El vector puede incluir adicionalmente secuencias que flanquean el polinucleótido que da lugar al ARN el cual comprende secuencias homólogas a las de las secuencias genómicas eucariotas, preferiblemente secuencias genómicas de mamíferos, o secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención en el genoma de células eucariotas o virales por recombinación homóloga. En particular, se puede usar un vector plasmídico que comprende el casete de expresión flanqueado por secuencias virales para preparar un vector viral apropiado para suministrar el polinucleótido de la invención a una célula de mamífero. Otros ejemplos de vectores virales apropiados incluyen vectores virales del herpes simplex y retroviruses, incluyendo lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados y los virus del HPV (tales como HPV-16 o HPV-18). Las técnicas de transferencia génica que usan estos virus son conocidas por aquellos expertos en la técnica. Se pueden usar vectores de retrovirus, por ejemplo, para integrar establemente el polinucleótido que da lugar al ARN antisentido dentro del genoma hospedante. Los vectores de adenovirus defectuosos en la replicación, por el contrario, permanecen episomales, y por lo tanto permiten la expresión transitoria.
El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección antisentido para permitir la producción de ARN antisentido. Este se puede usar para reducir, si es deseado, los niveles de expresión del polipéptido.
Células hospedantes y Expresión
En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para preparar un polipéptido de la invención, que comprende cultivar una célula hospedante transformada o transfectada con un vector de expresión como se describe anteriormente, en condiciones apropiadas para la expresión por el vector de una secuencia codificante que codifica el polipéptido, y recuperar el polipéptido expresado. Los polipéptidos de la invención se pueden incorporar en un vector recombinante replicable, tal como un vector de expresión. El vector se puede usar para replicar el ácido nucleico en una célula hospedante compatible. Así, en una realización adicional, la invención proporciona un método para obtener un polinucleótido de la invención mediante la introducción de un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedante compatible, y haciendo crecer la célula hospedante en condiciones que provoquen la replicación del vector. El vector se puede recuperar a partir de la célula hospedante. Células hospedantes apropiadas incluyen bacterias como E. coli, levaduras, líneas celulares de mamíferos, y otras líneas celulares eucariotas, por ejemplo células de insectos tales como las células de Sf9 y células fúngicas (por ejemplo, filamentosas).
Preferiblemente, el polipéptido se produce como una proteína segregada, en cuyo caso la secuencia de ADN que codifica una forma madura del polipéptido en el constructo de expresión está operablemente unida a una secuencia de ADN que codifica una secuencia señal. En el caso en el que el gen que codifica la proteína segregada tiene una secuencia señal en la cepa de tipo salvaje, preferiblemente la secuencia señal usada será nativa (homóloga) a la secuencia del ADN que codifica el polipéptido. Alternativamente, la secuencia señal es foránea (heteróloga) a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia señal es preferiblemente endógena a la célula hospedante en la cual se expresa la secuencia de ADN. Ejemplos de secuencias señales apropiadas para células hospedantes de levaduras son las secuencias señales derivadas de los genes MFalfa de levadura. Similarmente, una secuencia señal apropiada para células hospedantes de hongos filamentosos es por ejemplo una secuencia señal derivada del gen de la amiloglucosidasa (AG) de hongo filamentoso, por ejemplo el gen glaA de A. niger. Esta secuencia señal se puede usar en combinación con el propio promotor de la amiloglucosidasa (también llamada (gluco)amilasa), así como con otros promotores. Dentro del contexto de la presente invención, también se pueden usar secuencias señales
híbridas.
Las secuencias líderes de secreción heteróloga preferidas son aquellas que se originan a partir del gen de la amiloglucosidasa fúngica (AG) (glaA, ambas versiones de 18 y 24 aminoácidos, por ejemplo de Aspergillus), elgen MFalfa (de levaduras, por ejemplo Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen de la alfa-amilasa (Bacillus).
Los vectores se pueden transformar o transfectar en una célula hospedante apropiada como se describe anteriormente, para permitir la expresión de un polipéptido de la invención. Este proceso puede comprender cultivar una célula hospedante transformada con un vector de expresión como se describe anteriormente en condiciones apropiadas para expresión del polipéptido, y opcionalmente recuperar el polipéptido expresado.
Un aspecto adicional de la invención proporciona así células hospedantes trasformadas o transfectadas con o que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. Preferiblemente, el polinucleótido es portado en un vector el cual permite la replicación y expresión del polinucleótido. Las células se seleccionarán para que sean compatibles con dicho vector, y pueden ser por ejemplo procariotas (por ejemplo bacterianas), o células eucariotas fúngicas, de levaduras o vegetales.
La invención engloba procedimientos para la producción de un polipéptido de la invención por medio de la expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Para este fin, la secuencia de ADN de la invención se puede usar para la amplificación génica y/o el intercambio de señales de expresión, tales como promotores, secuencias de señales de secreción, a fin de permitir la producción económica del polipéptido en una célula hospedante apropiada homóloga o heteróloga. Una célula hospedante homóloga se define aquí como una célula hospedante la cual es de la misma especie o la cual es una variante de la misma especie como la especie a partir de la cual deriva la secuencia de ADN.
Células hospedantes apropiadas son preferiblemente microorganismos procariotas tales como las bacterias, o más preferiblemente organismos eucariotas, por ejemplo los hongos, tales como las levaduras o los hongos filamentosos o las células vegetales. En general, se prefieren las células de levaduras sobre las células de hongos filamentosos, porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son pobremente segregadas por las levaduras, o en algunos casos no son procesadas apropiadamente (por ejemplo hiperglucosilación en levaduras). En estos casos, se debería de seleccionar un organismo hospedante de hongos filamentoso.
Las bacterias del género Bacillus son muy apropiadas como hospedantes heterólogos debido a su capacidad de segregar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias apropiadas como hospedantes son aquellas de los géneros Streptomyces y Pseudomonas. Una célula hospedante preferida de levadura para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido es una del género Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, o Schizosaccharomyces. Más preferiblemente, una célula hospedante de levadura se selecciona del grupo que consiste en las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocida como Kluyveromyces marxianus var. lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, y Schizosaccharomyces pombe.
Muy preferidas para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido son, sin embargo, las células hospedantes de hongos filamentosos. Las células hospedantes de hongos filamentosos preferidas se seleccionan del grupo que consiste en el género Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, y Talaromyces. Más preferiblemente, una célula hospedante de hongos filamentosos es de las especies Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae o Aspergillus nidulans, o es de una especie del grupo de Aspergillus niger (según lo definido por Raper y Fennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, p. 293-344, 1965). Estos incluyen pero no se limitan a Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae, y Aspergillus ficuum, y también otras de las especies Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum y Thielavia terrestris.
Ejemplos de hospedantes de expresión preferidos dentro del alcance de la presente invención están los hongos tales como la especie Aspergillus (en particular los descritos en los documentos EP-A-184.438 y EP-A-284.603) y la especie Trichoderma; bacterias tales como la especie Bacillus (en particular las descritas en los documentos EP-A-134.048 y EP-A-253.455), especialmente Bacillus subtilis, Bacillus lincheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, especie de Pseudomonas; y levaduras tales como la especie Kluyveromyces (en particular aquellas descritas en el documento EP-A-096.430 tales como Kluyveromyces lactis y en el documento EP-A-301.670) y especies Saccharomyces, tales como Saccharomyces cerevisiae.
Células hospedantes de acuerdo con la invención incluyen células vegetales, y la invención se extiende por lo tanto a organismos transgénicos, tales como plantas y partes de las mismas, las cuales contienen una o más células de la invención. Las células pueden expresar heterólogamente el polipéptido de la invención, o puede contener heterólogamente uno o más polinucleótidos de la invención. La planta transgénica (o genéticamente modificada) puede tener por lo tanto insertada (típicamente de forma estable) en su genoma una secuencia que codifica el polipéptido de la invención. La transformación de células vegetales se puede realizar usando técnicas conocidas, por ejemplo usando un plásmido Ti o Ri de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido (o vector) puede contener así secuencias necesarias para infectar una planta, y se pueden emplear derivados de los plásmidos Ti y/o Ri.
La célula hospedante puede sobreexpresar el polipéptido, y las técnicas para manipular la sobreexpresión son bien conocidas y se pueden usar en la presente invención. El hospedante puede tener así dos o más copias del polinu-
cleótido.
Alternativamente, se puede efectuar la infección directa de una parte de una planta, tales como una hoja, raíz o tallo. En esta técnica, la planta a infectar puede ser herida, por ejemplo cortando la planta con una cuchilla, puncionando la planta con una aguja, o frotando la planta con un abrasivo. La herida se incula luego con Agrobacterium. La planta o parte de la planta se puede hacer crecer luego en un medio de cultivo apropiado y se deja que se desarrolle hasta una planta madura. La regeneración de células transformadas en plantas genéticamente modificadas se puede lograr usando técnicas conocidas, por ejemplo seleccionado retoños transformados usando un antibiótico y subcultivando los retoños en un medio que contiene los nutrientes apropiados, hormonas de plantas y
similares.
Cultivo de células hospedantes y producción recombinante
La invención también incluye células que se han modificado para expresar la endoproteasa específica de prolina o una variante de la misma. Tales células incluyen líneas celulares eucariotas superiores transitorias, o preferiblemente modificadas de forma establa, tales como células de mamíferos o células de insectos, células eucariotas inferiores, tales como de levaduras y células de hongos filamentosos o células procariotas tales como células
bacterianas.
Es también posible que los polipéptidos de la invención sean expresados transitoriamente en una línea celular o en una membrana, tal como por ejemplo en un sistema de expresión de baculovirus. Tales sistemas, los cuales se adaptan para expresar las proteínas de acuerdo con la invención, también están incluidos en el alcance de la presente
invención.
De acuerdo con la presente invención, la producción del polipéptido de la invención se puede efectuar cultivando hospedantes de expresión microbianos, los cuales se han transformado con uno o más polinucleótidos de la presente invención, en un medio de fermentación de nutrientes convencional.
Las células hospedantes recombinantes de acuerdo con la invención se pueden cultivar usando procedimientos conocidos en la técnica. Para cada combinación de un promotor y una célula hospedante, están disponibles condiciones de cultivo las cuales son propicias para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Después de alcanzar la densidad celular deseada o título del polipéptido, el cultivo se detiene y el polipéptido se recupera usando procedimientos conocidos.
El medio de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbono (por ejemplo glucosa, maltosa, molasas, etc.), una fuente de nitrógeno (por ejemplo sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, etc.) una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y una fuente de nutrientes inorgánicos (por ejemplo fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.). Opcionalmente, se puede incluir o añadir subsiguientemente un inductor (dependiendo del constructo de expresión usado).
La selección del medio apropiado se puede basar en la elección del hospedante de expresión y/o se puede basar en los requisitos reguladores del constructo de expresión. Los medios apropiados son bien conocidos para los expertos en la técnica. El medio puede, si se desea, contener componentes adicionales que favorezcan la expresión de los hospedantes transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.
La fermentación se puede llevar a cabo durante un período de 0,5 a 30 días. La fermentación puede ser un proceso por lotes, continuo o alimentado discontinuo, a una temperatura apropiada en el intervalo entre 0ºC y 45ºC y, por ejemplo, a un pH desde 2 hasta 10. Las condiciones de fermentación preferidas incluyen una temperatura en el intervalo entre 20ºC y 37ºC y/o un pH entre 3 y 9. Las condiciones apropiadas se seleccionan habitualmente basándose en la elección del hospedante de expresión y la proteína a expresar.
Después de la fermentación, si es necesario, las células se pueden eliminar del caldo de fermentación por medio de centrifugación o filtración. Después de que la fermentación se ha detenido o después de la eliminación de las células, el polipéptido de la invención se puede recuperar entonces y, si se desea, se puede purificar y aislar por medios convencionales. La endoproteasa específica de prolina de la invención se puede purificar a partir de micelios de hongos o del caldo de cultivo en el que la endoproteasa específica de prolina es liberada por las células fúngicas
cultivadas.
En una realización preferida, el polipéptido se obtiene de un hongo, más preferiblemente de un Aspergillus, lo más preferible de Aspergillus niger.
Modificaciones
Los polipéptidos de la invención se pueden modificar químicamente, por ejemplo, modificar post-traduccionalmente. Por ejemplo, se pueden glucosilar (una o más veces) o pueden comprender restos de aminoácidos modificados. También se pueden modificar por adición de restos de histidina para ayudar a su purificación, o por adición de una secuencia señal para promover la secreción a partir de la célula. Los polipéptidos pueden tener extensiones amino- o carboxilo terminales, tales como un resto de metionina amino terminal, un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 restos, o una pequeña extensión que facilite la purificación, tal como una cola de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.
Un polipéptido de la invención se puede marcar con un marcador revelador. El marcador revelador puede ser cualquier marcador apropiado el cual permita detectar el polipéptido. Marcadores apropiados incluyen radioisótopos, por ejemplo ^{125}I, ^{35}S, enzimas, anticuerpos, polinucleótidos y enlazadores tales como biotina.
Los polipéptidos se pueden modificar para incluir aminoácidos de origen no natural, o para incrementar la estabilidad del polipéptido. Cuando las proteínas o péptidos son producidos por medios sintéticos, tales aminoácidos se pueden introducir durante la producción. Las proteínas o péptidos también se pueden modificar siguiendo la producción sintética o recombinante.
Los polipéptidos de la invención también se pueden producir usando D-aminoácidos. En tales casos, los aminoácidos se enlazarán en secuencia inversa en la orientación C a N. Esto es convencional en la técnica para producir tales proteínas o péptidos.
Se conoce en la técnica un número de modificaciones de cadena lateral, y se pueden realizar a las cadenas laterales de las proteínas o péptidos de la presente invención. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones de aminoácidos mediante alquilación reductora por reacción con un aldehído seguido de la reducción con NaBH_{4}, amidinación con metilacetimidato o acilación con anhídrido acético.
Las secuencias proporcionadas por la presente invención también se pueden usar como materiales de partida para la construcción de enzimas de "segunda generación". Proteasas específicas de prolina de "segunda generación" son proteasas específica de prolina, alteradas por técnicas de mutagénesis (por ejemplo mutagénesis dirigida al sitio), las cuales tienen propiedades que difieren de aquella proteasa específica de prolina de tipo salvaje, o proteasas específicas de prolina recombinantes tales como las producidas por la presente invención. Por ejemplo, su temperatura o pH óptimo, actividad específica, afinidad por el sustrato, o termoestabilidad se pueden alterar de manera que sean más adecuadas para uso en un proceso particular.
Los aminoácidos esenciales para la actividad de la proteasa específica de prolina de la invención, y por lo tanto preferiblemente sometidos a sustitución, se pueden identificar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de alanina. En la última técnica, se introducen mutaciones en cada resto en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son ensayadas para determinar la actividad biológica (por ejemplo la actividad de endoproteasa específica de prolina) para identificar restos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción enzima-sustrato también se pueden determinar por análisis de la estructura cristalina según lo determinado por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, o marcaje de fotoafinidad.
Se espera que el uso de células hospedantes de levaduras y hongos filamentosos facilite tales modificaciones post-traduccionales (por ejemplo procesamiento proteolítico, miristilación, glucosilación, truncamiento, y fosforilación de serina, tirosina o treonina) según pueda ser necesario para conferir actividad biológica óptima sobre los productos de expresión recombinante de la invención.
Preparaciones
Los polipéptidos de la invención pueden estar en forma aislada. Se entenderá que el polipéptido se puede mezclar con vehículos o diluyentes los cuales no interferirán con el fin destinado del polipéptido, y aún será considerado como aislado. Un polipéptido de la invención puede ser también una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá el polipéptido en una preparación en la cual más del 70%, por ejemplo más del 80%, 90%, 95%, 98% ó 99% de las proteínas en la preparación es un polipéptido de la invención.
Los polipéptidos de la invención se pueden proporcionar en una forma de manera que están fuera de su entorno celular natural. Así, pueden estar sustancialmente aislados o purificados según lo discutido anteriormente, o en una célula en la cual no aparecen en la naturaleza, por ejemplo una célula de otras especie fúngica, animales, plantas o bacterias.
Eliminación o reducción de actividad de endoproteasa específica de prolina
La presente invención también se refiere a métodos para producir una célula mutante de una célula progenitora, la cual comprende destruir o suprimir la secuencia de ácido nucleico endógena que codifica el polipéptido o una secuencia de control de la misma, lo cual da como resultado que la célula mutante produzca menos del polipéptido que la célula progenitora.
La construcción de cepas las cuales tienen actividad de endoproteasa específica de prolina reducida se puede lograr convenientemente mediante modificación o inactivación de una secuencia de ácido nucleico necesaria para la expresión de la endoproteasa específica de prolina en la célula. La secuencia de ácido nucleico a modificar o inactivar puede ser, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifique el polipéptido o una parte del mismo esencial para exhibir actividad de endoproteasa específica de prolina, o la secuencia de ácido nucleico puede tener una función reguladora requerida para la expresión del polipéptido a partir de la secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico. Un ejemplo de tal secuencia de control o reguladora puede ser una secuencia promotora o una parte funcional de la misma, es decir, una parte la cual es suficiente para afectar la expresión del polipéptido. Otras secuencias de control para posible modificación incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propeptídica, una secuencia señal, y una secuencia de termina-
ción.
La modificación o inactivación de la secuencia de ácido nucleico se puede realizar sometiendo la célula a mutagénesis y seleccionando células en las cuales se ha reducido o eliminado la capacidad de producir endoproteasa específica de prolina. La mutagénesis, la cual puede ser específica o aleatoria, se puede realizar, por ejemplo, mediante uso de un agente mutagenizante físico o químico apropiado, mediante uso de un oligonucleótido apropiado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis por PCR. Es más, la mutagénesis se puede realizar mediante uso de cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes.
Ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico apropiado para el presente fin incluyen irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil-hidroxilamina, ácido nitroso, metanosulfonato de etilo (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos nucleotídicos.
Cuando se usa tal agente, la mutagénesis se lleva a cabo típicamente incubando la célula a mutagenizar en presencia del agente mutagenizante de elección, en condiciones apropiadas, y seleccionado células que exhiban actividad de endoproteasa específica de prolina reducida o que no tengan actividad.
La modificación o inactivación de la producción de un polipéptido de la presente invención se puede lograr por introducción, sustitución, o eliminación de uno o más nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o un elemento regulador requerido para la transcripción o traducción del mismo. Por ejemplo, los nucleótidos se pueden insertar o eliminar de manera que dé como resultado la introducción de un codón de parada, la eliminación del codón inicial, o un cambio en el marco abierto de lectura. Tal modificación o inactivación se puede lograr por mutagénesis dirigida al sitio, o mutagénesis por PCR, según métodos conocidos en la
técnica.
Aunque, en principio, la modificación se puede llevar a cabo in vivo, es decir, directamente en la célula que expresa la secuencia de ácido nucleico a modificar, es preferible que la modificación se realice in vitro según lo ejemplificado más abajo.
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Un ejemplo de una manera conveniente de inactivar o reducir la producción de endoproteasa específica de prolina por una célula hospedante de elección se basa en técnicas de sustitución génica o interrupción génica. Por ejemplo, en el método de interrupción de genes, se mutageniza in vitro una secuencia de ácido nucleico que corresponde al gen endógeno o un fragmento de gen de interés, para producir una secuencia de ácido nucleico defectuosa, la cual se transforma luego en la célula hospedante para producir un gen defectuoso. Mediante recombinación homóloga, la secuencia de ácido nucleico defectuosa sustituye el gen endógeno o el fragmento de gen. Preferiblemente, el gen defectuoso o fragmento de gen también codifica un marcador el cual se puede usar para seleccionar transformantes en los cuales se ha modificado o destruido el gen que codifica el polipéptido.
Alternativamente, la modificación o inactivación de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención se puede lograr por técnicas anti sentido establecidas, usando una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia que codifica el polipéptido. Más específicamente, la producción del polipéptido por una célula se puede reducir o eliminar introduciendo una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. El polinucleótido anti sentido luego se transcribirá típicamente en la célula y será capaz de hibridarse al ARNm que codifica la endoproteasa específica de prolina. En condiciones que permitan a la secuencia nucleotídica antisentido complementaria hibridarse al ARNm, la cantidad de endoproteasa específica de prolina producida en la célula se reducirá o eliminará.
Se prefiere que la célula a modificar de acuerdo con los métodos de la presente invención sea de origen microbiano, por ejemplo una cepa fúngica la cual es apropiada para la producción de productos proteicos deseados, ya sean homólogos o heterólogos a la célula.
La presente invención se refiere además a una célula mutante de una célula progenitora la cual comprende una interrupción o supresión de la secuencia de ácido nucleico endógena que codifica el polipéptido o una secuencia de control del mismo, lo cual da como resultado que la célula mutante produzca menos del polipéptido que la célula progenitora.
Las células mutantes deficientes en el polipéptido así creadas son particularmente útiles como células hospedantes para la expresión de polipéptidos homólogos y/o heterólogos. Por lo tanto, la presente invención se refiere además a métodos para producir un polipéptido homólogo o heterólogo, que comprende (a) cultivar la célula mutante en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. En el presente contexto, la expresión "polipéptido heterólogo" se define aquí como los polipéptidos los cuales no son nativos para la célula hospedante, una proteína nativa en la cual se han hecho modificaciones para alterar la secuencia nativa, o una proteína nativa cuya expresión se ha alterado cuantitativamente como un resultado de una manipulación de la célula hospedante por técnicas de ADN recombinante.
En aún un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para producir un producto proteico esencialmente libre de actividad de endoproteasa específica de prolina por fermentación de una célula la cual produce tanto un polipéptido de endoproteasa específica de prolina de la presente invención como el producto proteico de interés. El método comprende añadir una cantidad efectiva de un agente capaz de inhibir la actividad de endoproteasa específica de prolina al caldo de fermentación ya sea durante o después que se ha completado la fermentación, recuperando el producto de interés del caldo de fermentación, y opcionalmente sometiendo el producto recuperado a purificación posterior. Alternativamente, después del cultivo, el caldo de cultivo resultante se puede someter a tratamientos con pH o temperatura para reducir sustancialmente la actividad de endoproteasa específica de prolina, y permitir la recuperación del producto a partir del caldo de cultivo. El tratamiento combinado de pH o temperatura se puede realizar en una preparación de proteínas recuperada del caldo de cultivo.
Los métodos de la presente invención para producir un producto esencialmente libre de endoproteasa específica de prolina son de particular interés en la producción de polipéptidos eucariotas, en particular en la producción de proteínas fúngicas, tales como enzimas. Las células deficientes en endoproteasa específica de prolina también se pueden usar para expresar proteínas heterólogas de interés para la industria alimentaria, o de interés farmacéutico.
Las fuentes preferidas para la endoproteasa específica de prolina se obtienen clonando un gen microbiano que codifica una endoproteasa específica de prolina en un organismo hospedante microbiano. Las fuentes más preferidas de endoproteasa específica de prolina se obtienen clonando un gen derivado de Aspergillus que codifica una endoproteasa específica de prolina en un hospedante que pertenece al género de Aspergillus capaz de sobreexpresar el gen de endoproteasa específica de prolina.
En la categoría de productos que contienen hidrolizados de proteínas para consumidores diana con necesidades no médicas, está creciendo rápidamente el nicho mercantil de emplear hidrolizados de proteínas en productos para atletas. En esta categoría de productos, la alergenicidad del producto final no es un asunto a tener en cuenta. En lugar de esto, aspectos tales como el sabor, valor nutricional y la presencia de aminoácidos específicos que apoyan la resistencia y estimulan la recuperación fisiológica después del ejercicio son parámetros importantes para tales hidrolizados, particularmente cuando se usa en bebidas para deportistas. Por ejemplo, se ha implicado a la glutamina en la lucha contra el estrés metabólico, pero sólo puede ser suministrada en pequeños péptidos, ya que el aminoácido libre no es estable en disolución. Los hidrolizados de proteínas producidos según la invención son muy apropiados para uso en productos relacionados con atletas debido a su solubilidad muy elevada en las condiciones de pH prevalentes, por ejemplo en bebidas para deportistas. Una implicación importante de este criterio es que se pueden incluir niveles elevados de hidrolizados producidos según la invención en productos nutricionales para deportistas sin el inconveniente de la precipitación de proteínas con la esterilización y el almacenamiento prolongado. Así, la vida útil de los productos para deportistas puede ser extendida por adición de un hidrolizado de proteínas de la
invención.
La mezcla enzimática según la invención se puede usar para hidrolizar materiales proteicos de origen animal, tales como leche entera, leche desnatada, caseína, proteínas del suero o mezclas de caseína y proteína del suero. Tal mezcla de caseína y proteína del suero se puede usar, por ejemplo, en proporciones similares a las encontradas en la leche humana. Además, las proteínas animales basadas en colágeno forman un sustrato debido a la posibilidad de degradar estas proteínas en moléculas más pequeñas, desamargando de esta manera los extractos de carne animal o mejorando la incorporación de restos de prolina e hidroxiprolina, con beneficios en las articulaciones de los
atletas.
La mezcla enzimática según la invención también se puede usar para hidrolizar materiales proteicos de origen vegetal tales como, por ejemplo, gluten de trigo, cebada malteada o no malteada, u otros cereales usados para hacer cerveza, leche de soja, concentrados o aislados de la misma, concentrados de proteínas de maíz y aislados de los mismos, y proteínas del arroz.
La invención se ilustrará adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos Materiales y Métodos
La beta-caseína procedente de leche bovina (polvo esencialmente libre de sal, liofilizado) con un mínimo de 90% de beta-caseína se obtuvo de Sigma. El colágeno (tipo 1, insoluble, de tendón de Aquiles bovino) también se obtuvo de Sigma.
El caseinato de sodio (Miprodan 30®)) se obtuvo de MD Foods (Viby, Dinamarca). Concentrado de suero dulce, no pasteurizado, 10% ds, 35% de proteína, se obtuvo de Borculo Domo (Zwoile, Países Bajos).
Un hidrolizado de suero de bajo amargor Vitalarmor® 800 LB, así como proteína de suero enriquecida en beta-lactoglobulina (Protarmor® 905) se obtuvieron de Armor Proteines (Saint-Brice-en-Cogles, Francia). Otros hidrolizados comerciales se obtuvieron del productor o se compraron en farmacias.
El aislado de soja se obtuvo como Sojamin® 90 HV de Lucas Meyer, Hamburgo, Alemania.
La subtilisina de B. lincheniformis (Delvolase®, 560 000 DU por gramo) se obtuvo de DSM Food Specialities (Seclin, Francia). Sumizyme® LP 75.000 se obtuvo de Shin Nohon (Anjyo, Japón). Flavourzyme® 1000L se obtuvo de NOVO Industries, Bagsvaerd, Dinamarca. La termolisina (Thermoase; una metalo-endoproteasa termoestable de Bacillus thermoproteolyticus Rokko, con una actividad de 14000 PU/mg) fue producida según Daiwa Kasei, Osaka, Japón.
La endoproteasa específica de prolina de Flavobacterium meningosepticum y clonada en E. coli se aisló usando constructos plasmídicos conocidos y métodos de purificación de enzimas (T. Diefenthal y H. Dargatz, World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, 209-212 (1995)). La actividad enzimática se ensayó en CBZ-Gly-Pro-pNA 0,26 mM en tampón de fosfato 0,1M pH 7,0 a 25ºC. En este ensayó se usó pH 7,0 porque el pH óptimo de esta enzima está por encima de pH 6,0. El producto se monitorizó espectrofotométricamente a 410 nm.
Una unidad se definió como la cantidad de enzima que provoca la liberación de 1 \mumol de p-nitroanilida por minuto en estas condiciones.
Las endoproteasas específicas de prolina de Aspergillus se midieron según el método descrito en la patente japonesa JP5015314, con pequeñas modificaciones. De forma breve, la actividad enzimática se ensayó en CBZ-Gly-Pro-pNA a 37 grados C en un tampón de citrato/fosfato disódico pH 5. Se escoge pH 5,0 porque en este ensayo el pH óptimo de la enzima está por debajo de pH 6. El producto de reacción también se monitorizó espectrofotométricamente a 410 nm.
Electroforesis bidimensional en gel
Electroforesis bidimensional en gel y secuenciación parcial de aminoácidos de una endopeptidasa específica de prolina de Aspergillus niger.
La endoproteasa específica de prolina de A. niger G-306 se produjo y aisló según lo resumido en el Ejemplo 4. La purificación completa se llevó a cabo usando electroforesis bidimensional en gel. Para ese fin, el material activo aislado de la columna Superdex 75 se desalinizó primero por dilución (aproximadamente 20 veces) en tmapón Tris/HCl 10 mM a pH 6,8, y luego se concentró con un miniconcentrador Centricon 30 kD (Amicon).
Básicamente, la electroforesis bidimensional se llevó a cabo como se describe en "2-D electrophoresis using immobilized pH gradients; Principles and Methods; Amersham Pharmacia Biotech 80-6429-60 Rev A/10-98". La primera dimensión (IEF) se llevó a cabo en un IPGphor (Amersham-Pharmacia) usando una tira IPG de 11 cm, en un inervalo de pH 3-6 (BioRad). La muestra desalinizada, concentrada 3 veces, se diluyó en urea 8M (urea 6M y tiourea 2M). Se mezcló con 18,5 microlitros de tampón de rehidratación concentrado 10X, que contiene urea 6M, tiourea 2M, 20% de CHAPS, y 5% de tampón IPG, intervalo 3-10. El total se usó para rehidratar la tira IPG. La focalización se realizó durante 29,320 Vh usando como guía el protocolo según lo descrito en el folleto suministrado por BioRad con las tiras.
La segunda dimensión (SDS) se realizó sobre una Criterion Mini Vertical Cell (BioRad) usando un gel premoldeado de 12% (Type Prep+2 Comb) comprado a BioRad.
La tira IPG se incubó primeramente en un tampón de equilibrado de SDS que contiene DTT (1%) y una segunda vez en un tampón que contiene yodoacetamida (2,5%). Ambas incubaciones se llevaron a cabo durante 15 minutos a 20ºC. El tampón de equilibrado de SDS consistió en Tris/HCl 50 mM pH 8,8, urea 6M, glicerol al 30% (v/v) y SDS al 2% (p/v) y una traza de azul de bromofenol.
Después de la incubación, la tira IPG se recortó para fijarla al tipo de gel mencionado, y fue corrida con tampón TGS diluido 10X (BioRad). Después de la pasada, el gel se tiñó con Sypro Ruby (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos) durante 3 ó 4 horas, y se lavó con agua Milli Q durante 2 horas. La formación de imágenes se llevó a cabo en The Imager (Appligene). Las manchas más grandes se cortaron, se lavaron varias veces con bicarbonato de amonio 50 milimoles/litro, se incubaron toda la noche a 37 grados C con tripsina grado de secuenciación (nº 1047841, Boehringer Mannheim). Los péptidos se extrajeron del trozo de gel lavando varias veces con acetonitrilo/agua que contiene ácido fórmico (50/50/5, v/v/v). Las muestras se secaron usando una centrífuga de vacío (New Brunswisk Scientific, Países Bajos) y se conservaron a -20ºC, hasta el análisis.
Análisis por LC/MS
Se usó HPLC (cromatografía de líquidos de alta resolución) usando un espectrómetro de masas Qtof-2 (Micromass, Manchester, UK) para separar los péptidos formados durante la digestión con tripsina. Se atraparon 5 microlitros de la disolución peptídica en una micro-precolumna, C18, 5*0,3 mm (MCA30-05-C18, LC Packings, Amsterdam, Países Bajos) usando agua Milli Q que contiene 0,1% de ácido fórmico a un caudal de 20 microlitros/min. Los péptidos se eluyeron entonces de la precolumna, usando un gradiente rápido de 0,1% de ácido fórmico en agua Milli Q (Millipore, Bedford, MA, USA; disolución A) y 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo (disolución B). El gradiente comenzó al 100% de la disolución A, y se incrementó hasta el 60% de la disolución B en 20 minutos y se mantuvo en la última relación durante otros 5 minutos. El caudal usado durante la elución de los péptidos fue 200 nl/min. Usando el análisis mediante LC/MS/MS se pudo determinar las secuencias parciales de aminoácidos de la endopeptidasa específica de prolina de A. niger, mediante secuenciación de novo de péptidos apropiados.
Se usó la HPLC usando un espectrómetro de masas con trampa de iones (Thermoquest^{TM}, Breda, Países Bajos) acoplado a una bomba P4000 (Thermoquest^{TM}, Breda, Países Bajos) para caracterizar los hidrolizados de proteínas enzimáticas producido por la mezcla enzimática de la invención. Los péptidos formados se separaron usando una columna PEPMAP C18 300A (MIC-15-03-C18-PM, LC Packings, Amsterdam, Países Bajos) en combinación con un gradiente de 0,1% de ácido fórmico en agua Milli Q (Millipore, Bedford, MA, USA; disolución A) y 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo (disolución B) para la elución. El gradiente comenzó al 100% de la disolución A, y se incrementó hasta el 70% de la disolución B en 45 minutos, y se mantuvo en la última relación durante otros 5 minutos. El volumen de inyección usado fue de 50 microlitros, el caudal fue de 50 microlitros por minuto, y la temperatura de la columna se mantuvo a 30ºC. La concentración de proteína de la muestra inyectada fue aproximadamente 50 microgramos/mililitro.
La información detallada sobre los péptidos individuales se obtuvo usando el algoritmo MS/MS "dependiente del barrido", el cual es un algoritmo característico para un espectrómetro de masas con trampa de iones.
El análisis de barrido completo fue seguido por análisis de barrido aumentado, para la determinación del estado de la carga del ion más intenso en el intervalo de masas barrido completo. El análisis MS/MS subsiguiente del último ión dio como resultado la información de la secuencia peptídica parcial, la cual podría ser usada para búsqueda en una base de datos usando la aplicación SEQUEST de Xcalibur Bioworks (Thermoquest^{TM}, Breda, Países Bajos). Los bancos de datos usados se extrajeron de OWL.fasta databank, disponible en el NCBI (Nacional Centre for Biotechnology Informatics), que contiene las proteínas de interés para la aplicación usada. En aquellos experimentos en los cuales se midieron sustratos de proteínas bien caracterizados tales como proteínas del suero o caseínas, la precisión de la técnica de análisis se incrementó omitiendo aquellos espectros de MS/MS con un ajuste de secuencia de menos de
50%.
Sólo se consideraron adecuados para el análisis posterior mediante secuenciación por MS los péptidos con una masa que oscila desde aproximadamente 400 hasta 2000 Daltons.
Se usó angiotensina (M=1295,6) para ajustar la sensibilidad óptima en el modo de MS y para la fragmentación óptima en el modo de MS/MS, realizando la infusión constante de 60 \mug/ml, dando como resultado principalmente especies doble y triplemente cargadas en el modo de MS, y una energía de colisión óptima de alrededor 35% en el modo de MS/MS.
Análisis mediante LC/MS de fórmulas para lactantes e hidrolizados de proteínas comerciales
Previamente a LC/MS, el material graso se tuvo que eliminar de las formulaciones para lactantes. Para este fin, las muestras de nutrición completas (13,5 g de polvo en 100 ml agua Milli Q) se extrajeron 3 veces con 30 ml de hexano. Se añadieron pequeñas cantidades de NaCl para mejorar la separación de las capas de disolventes. Después, se obtuvieron 5 ml de la capa de agua y se liofilizaron. Previamente al análisis, la muestra se redisolvió en 25 ml de agua Milli Q, se centrifugó dos veces (a 13000 rpm) y se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum. A partir de muestras del hidrolizado puro, se disolvieron 400 mg en 100 ml de agua Milli Q, se centrifugaron dos veces (a 13000 rpm) y se filtraron a través de un filtro de 0,22 \mum. Para caracterizar el péptido presente en los hidrolizados comerciales de proteínas, se siguió la misma estrategia según lo descrito anteriormente para los hidrolizados enzimáticos formados por la mezcla enzimática inventiva, es decir, el hidrolizado filtrado se aplicó a la columna de HPLC y los péptidos individuales con masas moleculares entre 400 y 2000 Daltons se caracterizaron además por el análisis de MS/MS. Sin embargo, el banco de datos usado para obtener la información de la secuencia peptídica sobre los hidrolizados derivados de suero o caseína consistieron en secuencias de proteínas de leche de vaca
solamente.
Determinación de la fracción molar de péptidos (%) que poseen una prolina carboxi terminal
Para el análisis del término C de un péptido se puede usar LC/MS/MS. Con un algoritmo en el cual la masa molecular del péptido (analizada con LC/MS) y su secuencia (parcial) de aminoácidos (analizada con LC/MS/MS) están enlazadas con procedimientos de búsqueda automática dentro de bancos de datos de proteínas, se pueden analizar mezclas complejas de péptidos. Estas opciones han permitido cuantificar la incidencia de péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal. Debido al conjunto de limitaciones por la columna de separación de péptidos PEPMAP usada, sólo se analizaron los péptidos con un peso molecular entre aproximadamente 400 y 2000 Daltons usando esta técnica. Afortunadamente, en hidrolizados de proteínas la mayoría de los péptidos tiene tales pesos
moleculares.
Para determinar en un hidrolizado de proteínas la fracción molar de péptidos que posee una prolina carboxi terminal, se seleccionan picos de péptidos individuales que eluyen de la columna PEPMAP y se determinan las secuencias parciales de aminoácidos carboxi terminales usando las técnicas especificadas anteriormente. El análisis de al menos 20, preferiblemente al menos 30 y más preferiblemente entre 40 a 60, por ejemplo 50 de los péptidos más abundantes, escogidos aleatoriamente, proporciona así una idea de la frecuencia a la cual aparecen los péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal del péptido. El cociente del número de péptidos encontrados que poseen un resto de prolina carboxi terminal por 100 y el número total de péptidos analizados proporciona así la fracción molar de péptidos (%) que poseen una prolina carboxi terminal.
Determinación de la fracción molar (%) de prolina en el sustrato de proteína usado para generar el hidrolizado
El material graso como puede aparecer en los productos de fórmulas para lactantes se eliminó primeramente por extracción con hexano como se detalló en el párrafo que describe los análisis de LC/MS de fórmulas para lactantes e hidrolizados de proteínas comerciales. La hidrólisis ácida del sustrato de proteínas para convertir las proteínas presentes en aminoácidos libres, se logró obteniendo una suspensión de 100 miligramos de material proteico en 2 mililitros de HCl 6N. La hidrólisis ácida se llevó a cabo durante 22 horas a 112 grados C en una atmósfera libre de oxígeno. Después de la centrifugación, el sobrenadante se diluyó 10 veces en HCl diluido. Después de esta hidrólisis, los aminoácidos se derivatizaron y se analizaron según el método de Picotag como se especifica en el manual del operador del Amino Acid Analysis System de Waters (Milford MA, USA). El nivel de prolina presente se cuantificó usando métodos de HPLC. Para determinar la fracción molar (%) de prolina en la muestra, los micromoles de prolina presentes por 100 se dividieron entre la suma de los micromoles de todos los aminoácidos presentes en la muestra analizada. Puesto que durante la hidrólisis ácida se destruyen Trp y Cys, estos dos aminoácidos no se incluyen en esta suma de los micromoles de todos los aminoácidos.
Determinación de los niveles de aminoácidos libres en hidrolizados de proteínas o fórmulas para lactantes
Una muestra pesada exactamente de material proteico se disolvió en ácido diluido y los precipitados se eliminaron por centrifugación en una centrífuga Eppendorf. El análisis de aminoácidos se llevó a cabo en el sobrenadante transparente según el método de PicoTag como se especifica en el manual del operario del Amino Acid Analysis System de Waters (Milford MA, USA). Para este fin, se obtuvo una muestra apropiada a partir del líquido, se añadió a ácido diluido y se homogeneizó. A partir de la última disolución, se tomó una nueva muestra, se secó y se derivatizó usando isotiocianato de fenilo. Los diversos aminoácidos derivatizados presentes se cuantificaron usando métodos de HPLC y se sumaron para calcular el nivel total de aminoácidos libres en la muestra pesada.
Para relacionar este nivel total de aminoácidos libres en la muestra con el nivel total de aminoácidos que se puede liberar de esta muestra, la muestra se sometió también a hidrólisis ácida, seguido de una cuantificación de los aminoácidos libres totales presentes como se detalla anteriormente.
Leyendas de las figuras
Figura 1: Mapa plasmídico del plásmido de expresión pGBFIN11-EPO. Endo-Pro representa la endoproteasa específica de prolina.
Figura 2: Análisis por SDS-PAGE de filtrados de cultivos de la cepa hospedante (A. niger CBS513.88) y varios transformantes que sobreexpresan la endoproteasa específica de prolina, aquí indicada con la flecha.
Ejemplo 1
Hidrolizados de beta-caseína usando subtilisina en combinación con una endoproteasa específica de prolina de F. meningosepticum
La beta-caseína representa una de las fracciones de caseína principales de la leche bovina. La proteína se ha caracterizado bien en términos de su secuencia de aminoácidos, y está comercialmente disponible en una forma casi pura. Como tal, la beta-caseína ofrece un sustrato de ensayo excelente para estudiar la relación entre sitios de escisión enzimática y la longitud de diversos péptidos formados durante la hidrólisis enzimática.
Este Ejemplo demuestra que a pesar del carácter de amplio espectro de la subtilisina, la adición de una enzima muy específica como una endoproteasa específica de prolina puede tener un impacto importante en el tamaño de los fragmentos de beta-caseína formados. Por lo tanto se pueden obtener rendimientos mejorados para fracciones de caseína tras la incubación con subtilisina en combinación con una endoproteasa específica de prolina. La beta-caseína es relativamente rica en prolina, puesto que la hidrólisis ácida seguida del análisis de aminoácidos llevado a cabo según la sección de Materiales y Métodos reveló que su fracción molar de prolina es 14% (moles de prolina/moles de todos los aminoácidos como se especifica en la sección de Materiales y Métodos).
Se disolvió beta-caseína en polvo (Sigma) a una concentración de 10% (p/p) junto con Delvolase^{TM} 0,1% (p/p) en un tampón de fosfato 0,1 mol/litro pH 7,0. Después de una incubación de 24 horas a 45ºC en un baño de agua agitado, la reacción se detuvo calentando la disolución durante 15 minutos a 90ºC. A una mitad de la disolución (1 ml que contiene 100 miligramos de beta-caseína) se añadieron 100 microlitros de endoproteasa específica de prolina de F. meningosepticum (correspondientes a 4 unidades según el procedimiento descrito en World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol 11, p. 209-212), y la reacción se continuó otras 24 horas a 45ºC. Después de otro golpe de calor a 90ºC, ambas muestras del material de beta-caseína tratado con Delvolase^{TM} y Delvolase^{TM} más endoproteasa específica de prolina se analizaron mediante equipos de LC/MS como se especifica en la sección de Materiales y Métodos.
En la muestra digerida con Delvolase^{TM} solamente, el análisis de LC/MS/MS identificó 40 péptidos que cubren diversas partes de la molécula de beta-caseína. Juntos, estos péptidos dan cuenta del 79% de la secuencia de beta-caseína total. Se pudieron rastrear diferentes tiempos de retención de los péptidos en la columna C18 para longitudes de péptidos que oscilan de 2 a 23 restos de aminoácidos. La glutamina demostró ser el resto carboxi terminal que aparece más frecuentemente (10 de 40 péptidos). Ninguno de los péptidos analizados pudo mostrar que tuviera prolina como el resto carboxi terminal.
Por el contrario, la muestra digerida con Delvolase^{TM} y endoproteasa específica de prolina generó 28 péptidos identificables a partir de beta-caseína. Juntos, estos péptidos cubrieron el 63% de la secuencia total de proteínas de la beta-caseína. La distribución del tamaño de los péptidos fue extraordinariamente homogénea, ya que los péptidos oscilaron en una longitud entre 3 y 9 restos solamente. Dentro de esta población de péptidos, la glutamina fue el resto carboxi terminal en 3 péptidos solamente, y la prolina demostró ser el resto carboxi terminal más abundante (en 17 de 28 péptidos analizados). Los resultados muestran que en el hidrolizado obtenido con endoproteasa específica de prolina, esos péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal representan una fracción molar del 61% del total de los péptidos presentes en el intervalo de pesos moleculares entre 400 y 2000 Daltons. Así, la incubación de beta-caseína con endopeptidasa específica de prolina da como resultado la generación de péptidos con prolina como el resto carboxi terminal. Además, la combinación de subtilisina más una endoproteasa específica de prolina da como resultado una distribución de tamaño extraordinariamente homogénea de los diversos péptidos generados, sugiriendo altos rendimientos de producto con la ultrafiltración de tal hidrolizado.
Ejemplo 2
Hidrolizados de beta-caseína y amargor
Aunque el Ejemplo 1 ilustra el efecto de una endoproteasa específica de prolina sobre el tamaño de los péptidos y la proporción de péptidos con prolina como el resto de aminoácido carboxi terminal, el efecto de esta enzima sobre el amargor no se midió en el Ejemplo 1. Los hidrolizados de caseína son extraordinariamente amargos, y esta propiedad ha sido vinculada a su contenido relativamente alto de restos de aminoácidos hidrófobos.
Para probar el efecto de una endoproteasa específica de prolina en el sabor de beta-caseína hidrolizada por una subtilisina, se llevaron a cabo incubaciones enzimáticas usando Delvolase^{TM} y Delvolase^{TM} con endoproteasa específica de prolina, como se describe en el Ejemplo 1. Tras la inactivación por calor tanto de la subtilisina como de la endoproteasa específica de prolina, las muestras se enfriaron hasta temperatura ambiente y se añadió agua destilada para dar concentraciones finales de caseína de 4% (p/p). El sabor de las últimas disoluciones se evaluó después por un panel de experimentados catadores. Los catadores fueron unánimes en su conclusión de que el hidrolizado obtenido por la combinación de subtilisina más endoproteasa específica de prolina fue significativamente menos amargo que el hidrolizado obtenido usando subtilisina sola.
Así, el tratamiento de hidrolizados de caseína con una endoproteasa específica de prolina reduce sustancialmente la amargor del producto final.
Ejemplo 3
Aislamiento de una endoproteasa específica de prolina a partir de Aspergillus niger
Se dejó que una gran colección de mohos capaces de formar esporas negras creciera en un medio a pH 6,5 que contiene 1,0 gramo de K_{2}HPO_{4}, 0,5 gramos de KH_{2}PO_{4}, 0,5 gramos de KCl, 0,5 gramos de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 gramo de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 5 gramos de glucosa, 15 gramos de colágeno (Sigma), y se añadió agua destilada para obtener un volumen de 1 litro. El inóculo para cada experimento se preaparó por un método en el cual las esporas de los hongos que crecieron en agar inclinado (5 días) se recogieron en 5 mililitros de agua estéril. De la última suspensión, se usó 2% (v/v) para la inoculación del medio a pH 6,5. Se dejó crecer durante 100 horas a 28 grados C con agitación, después de lo cual el cultivo se filtró y las muestras del filtrado transparente se incubaron con el péptido sintético Z-Ala-Pro-pNA (Bachem; Bubendorf; Suiza) a pH 5,0, 50 grados C. Se identificaron muestras capaces de liberar pNA midiendo el incremento de la absorbancia a 410 nanómetros. Se investigaron adicionalmente cepas positivas que producen actividades relativamente altas.
La cepa G-306 excretó una endoproteasa específica de prolina, y se identificó cono Aspergillus niger Van Tieghem var. niger. Esta cepa particular se usó para aislamiento, purificación y posterior caracterización de una endoproteasa específica de prolina. Para purificar la enzima, se aplicó 1 litro del sobrenadante del cultivo a una columna de 400 mililitros de bacitracina-silocromo equilibrada con 0,05 moles/litro de acetato de sodio pH 5,0. Las proteasas unidas a la columna se eluyeron usando el tampón de acetato suplementado con 1 mol/litro de NaCl y 10% (v/v) de isopropanol (J. Appl. Biochem., 1983 p. 420-428). Las fracciones activas se recogieron y se dializaron contra agua destilada y se aplicaron en una columna de bacitracina-Sefarosa de 200 mililitros, de nuevo equilibrada con tampón de acetato. Como anteriormente, la elución se llevó a cabo usando tampón de acetato suplementado con NaCl e isopropanol. Las fracciones activasse recogieron, se dializaron frente a 5 milimoles/litro de tampón de acetato pH 5,0 y después se concentraron por medio de ultracentrifugación con una membrana Amicon PM-10. Para obtener una endoproteasa específica de prolina casi completamente pura, el líquido concentrado se cromatografió con una columna Superdex^{TM} 75 equilibrada con el tampón de acetato de sodio 0,05 moles/litro pH 5,0 y suplementado con NaCl 0,5
moles/litro.
Experimentos adicionales llevados a cabo con la enzima purificada indicaron un peso molecular de alrededor de 66,6 kDalton, un IEP a alrededor de pH 4,2, un pH óptimo a alrededor 5,0 y casi un 100% de termoestabilidad con la incubación durante 4 horas a 50 grados C.
Para obtener secuencias parciales de aminoácidos de la enzima, la preparación enzimática aislada se sometió primero a electroforesis en gel bidimencional según el procedimiento descrito en la sección de Materiales y Métodos. La mancha más grande se cortó, se incubó con tripsina y se eluyó. Los péptidos recuperados se sometieron después a análisis por LC/MS/MS como se describió en la sección de Materiales y Métodos, para determinar la secuencia parcial de aminoácidos.
Las siguientes secuencias de aminoácidos se pudieron derivar de la endoproteasa específica de prolina de A. niger:
NH2-ATTGEAYFE-COOH
NH2-ATVNSWTGGWDFTR-COOH
NH2-DGAPEGTST-COOH
NH2-EREAGAAVTP-COOH.
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Estas secuencias de aminoácidos se usaron para sintetizar las secuencias de ADN necesarias para el aislamiento del gen que codifica la endoproteasa específica de prolina de A. niger.
En experimentos posteriores (véase el Ejemplo 10), se pudo demostrar que la secuencia NH2-ATTGEAYFE-COOH representa el término amino de la endoproteasa específica de prolina madura.
\newpage
Ejemplo 4
Endoproteasa específica de prolina y sus efectos en la hidrólisis de proteína de soja
La patente japonesa JP501314 describe una preparación enzimática bruta obtenida de Aspergillus oryzae FS1-32 que muestra cantidades importantes de actividad endoproteolítica no específica y cantidades minoritarias de actividad de endoproteasa específica de prolina y de carboxipeptidasa. Se reivindica que la incubación de la proteína de haba de soja con esta preparación enzimática bruta produce un hidrolizado que es significativamente menos amargo que un hidrolizado de haba de soja que se puede obtener con otra preparación de proteasas la cual carece de una endoproteasa específica de prolina en combinación con una carboxipeptidasa. En el documento JP5015314 se sugiere que la actividad de la endoproteasa específica de prolina expone restos de prolina que son subsiguientemente eliminados por la carboxipeptidasa. Se piensa que la eliminación de estos restos de prolina hidrófobos carboxi terminales por la carboxipeptidasa es esencial para obtener hidrolizados menos amargos.
Para probar esta afirmación, se repitió uno de los Ejemplos proporcionados en JP5015314, y el hidrolizado de soja resultante se analizó usando la tecnología de LC/MS descrita anteriormente en lugar de evaluar un efecto sobre el sabor.
De acuerdo con JP5015314, sus incubaciones con Aspergillus oryzae FS 1-32 contenía por gramo de sustancia las siguientes actividades enzimáticas.
Proteasa: del orden de 650 PU; carboxipeptidasa: del orden de 0,01 unidad, y endopeptidasa específica de prolina: del orden de 0,03 mili-unidades.
Debido a que la preparación original de Aspergillus oryzae FS 1-32 no estaba disponible, en el presente Ejemplo se usaron dos preparaciones enzimáticas comerciales, también derivadas de Aspergillus oryzae. Además, se usó una endoproteasa específica de prolina, purificada cromatográficamente, aislada de Aspergillus niger (véase el Ejemplo 3) para lograr una sobredosificación de la endoproteasa específica de prolina ácida.
Las actividades enzimáticas de las diversas preparaciones se midieron de acuerdo con los procedimientos proporcionados en JP5015314, y se proporcionan a continuación:
-
Sumizyme LP 75.000, una preparación enzimática comercial de Aspergillus oryzae conocida por ser rica en actividad endoproteolítica.
Las actividades enzimáticas según se evaluaron de acuerdo con los métodos de JP5015314:
Proteasa: 226 PU/gramo de producto; carboxipeptidasa: 21 unidades/gramo de producto; prolil-endopeptidasa: 430 mili-unidades/gramo de producto.
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Flavourzyme 1000L, una preparación enzimática comercial de Aspergillus oryzae conocida por ser rica en actividad exoproteolítica.
Las actividades enzimáticas según se evaluaron de acuerdo con los métodos de JP5015314:
Proteasa: 332 PU/gramo de producto; carboxipeptidasa: 10 unidades/gramo de producto; prolil-endopeptidasa: no detectable.
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Endoproteasa específica de prolina cromatográficamente pura obtenida de Aspergillus niger y aislada como se describe en el Ejemplo 3.
Las actividades enzimáticas según se evaluaron de acuerdo con los métodos de JP5015314:
Proteasa: no detectable; carboxipeptidasa: no detectable; prolil-endopeptidasa: 45 mili-unidades/mililitro.
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A partir de estos datos es evidente que aunque Sumizyne y Flavourizyme son bien conocidas por su elevadas actividades proteolíticas, ninguna de ellas puede proporcionar la misma relación elevada de actividad de (endo)proteasa a carboxipeptidasa como se cita en el documento JP5015314. Sorprendentemente, se encontró que Sumizyme LP 75.000 contiene una actividad considerablemente más alta de endoproteasa específica de prolina que la dada a conocer en JP5015314.
Las diversas preparaciones enzimáticas se incubaron de acuerdo con el protocolo descrito en JP5015314, pero se estandarizaron de acuerdo con la actividad de carboxipeptidasa deseada (0,01 unidades por gramo de sustrato). Se usó aislado de soja (Soyamin 90 HV) como sustrato en estas reacciones. Después de la incubación durante 5 horas a pH 5 y 50 grados C, las muestras se centrifugaron y los sobrenadantes se mantuvieron congelados hasta el análisis por LC/MS.
El análisis por LC/MS se llevó a cabo como se específica en la sección de Materiales y Métodos.
En este experimento, el banco de datos de proteínas consistió en proteínas de soja solamente. Los resultados obtenidos se especifican en la Tabla 1.
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TABLA 1 Proteína de soja tratada con varias enzimas
3 
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Sumizyme LP 75.000 contiene una actividad de endoproteolítica específica de prolina la cual es alrededor de 7 veces más alta que la actividad endoproteolítica específica de prolina registrada en la cepa FS 1-32, y produce una fracción molar de aproximadamente 10% de péptidos de soja que poseen una prolina carboxi terminal. Sumizyme LP 75.000 enriquecida con la endoproteasa específica de prolina aislada de Aspergillus niger contiene una actividad endoproteolítica específica de prolina la cual es alrededor de 50 veces más alta que la actividad registrada con la cepa FS 1-32, pero también produce una fracción molar de aproximadamente 10% de péptidos de soja que poseen una prolina carboxi terminal. Estos datos se confirmaron analizando el número de restos de prolina que están presentes en los péptidos pero no en la posición carboxi terminal. Flavourzyme no contiene endoproteasa específica de prolina detectable, pero produce entre los péptidos generados y apropiados para análisis con la técnica de LC/MS una fracción molar de 6% de péptidos que poseen una prolina en el extremo carboxi terminal. Si se combina con un contenido de prolina de aproximadamente 5% de este aislado de proteína de soja, estas tres observaciones indican que la presencia y la actividad de la endoproteasa específica de prolina en combinación con la actividad de carboxipeptidasa tiene un efecto pequeño sobre la incidencia molar de los restos de prolina carboxi terminales solamente. Por lo tanto, es difícil de imaginar que el efecto de desamargar descrito en el documento JP5015314 y atribuido a una actividad de endoproteasa específica de prolina de 0,03 mili-unidades solamente se pueda vincular con la alta incidencia de péptidos que poseen prolina como el resto del aminoácido carboxi
terminal.
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Ejemplo 5
Dosis incrementadas de endoproteasa específica de prolina y sus efectos sobre la hidrólisis de proteína de soja
En este Ejemplo se demuestra que se requieren niveles elevados de una endoproteasa específica de prolina para generar hidrolizados de soja que contienen una cantidad significativa de péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal. El diseño general de estos experimentos fue idéntico a los descritos en el Ejemplo 4. De nuevo, se incubó aislado de proteína de soja con Sumizyme LP 75.000 estandarizado de acuerdo a la actividad deseada de carboxipeptidasa de 0,01 unidad por gramo de proteína de soja y en las condiciones descritas en el documento JP5015314. La incubación tuvo lugar durante 2,5 ó 5 horas a pH 5 y 50 grados C, y se detuvo manteniendo el material durante 10 minutos a 100 grados C. Subsiguientemente se obtuvo algo del material incubado durante 5 horas, y su pH se incrementó hasta 7,0. A partir de este material se obtuvieron 3 muestras a las cuales se añadieron diferentes porciones de la endoproteasa específica de prolina de F. meningosepticum producida por E. coli. A la primera muestra se añadieron 1,5 miliunidades de endoproteasa específica de prolina (de acuerdo con JP5015314, pero medida a pH 7,0 y 30 grados C para satisfacer el pH y la temperatura óptimos de la endoproteasa específica de prolina derivada de E. coli), a la segunda muestra se añadieron 150 miliunidades, y a la tercera se añadieron 15000 miliunidades, y después las muestras se incubaron nuevamente durante 2 horas a 40 grados C. Después de la incubación, las muestras se centrifugaron y los sobrenadantes se mantuvieron congelados hasta el análisis por LC/MS. El análisis por LC/MS tuvo lugar según lo especificado anteriormente. Los resultados obtenidos se especifican en la
Tabla 2.
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TABLA 2 Proteína de soja tratada con altas concentraciones de endoproteasa específica de prolina
4 
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Los resultados obtenidos ilustran claramente que un incremento significativo en la incidencia de péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal en el hidrolizado es totalmente dependiente de la adición de la endoproteasa específica de prolina. Sin embargo, solamente actividades que excedieron la actividad mencionada en el documento JP5015314 y la actividad presente en Sumizyme LP 75 000 en varios órdenes de magnitud son capaces de hacer esto. La implicación de esta observación es que una endoproteasa pura y aislada, específica de prolina, es esencial para obtener la composición peptídica deseada del hidrolizado.
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Ejemplo 6
Incidencia molar de péptidos que poseen prolina como el resto carboxi terminal en hidrolizados comerciales
Según lo descrito anteriormente, LC/MS/MS se puede usar para el análisis del término C de un péptido. Con un algoritmo en el cual la masa molecular del péptido (analizada con LC/MS) y su secuencia (parcial) de aminoácidos (analizada con LC/MS/MS) están relacionadas con procedimientos de búsqueda automática dentro de bancos de datos de proteínas, se pueden analizar mezclas complejas de péptidos.
En este Ejemplo se usaron estas posibilidades para analizar un número de productos comerciales de fórmulas para lactantes, así como hidrolizados de proteínas comerciales para determinar la incidencia molar de péptidos que poseen restos de prolina carboxi terminales que tienen un peso molecular entre 400 y 2000 Daltons.
Se analizaron los siguientes productos:
1.
Nidal® HA 1(Nestle), que contiene 11,5 g de hidrolizados de proteínas del suero por 100 g de polvo
2.
Alfare® (Nestle), que contiene 16,5 g proteínas de suero por 100 g de polvo
3.
Nutrilon® Pepti Plus (Nutricia), que contiene 13,5 g de proteínas de suero por 100 g de polvo
4.
Nutrilon® Pepti Junior (Nutricia), que contiene 16,5 g de hidrolizados de proteína de suero por 100 g de polvo
5.
Aptamil® HA (Milupa), que contiene 12,3 g de hidrolizados de proteínas de suero y caseína por 100 g de polvo
6.
Pregomin® (Milupa), que contiene 13,3 g de probablemente hidrolizados de soja y colágeno por 100 g de polvo
7.
Nutramigen® (Mead Johnson), que contiene 14,0 g de probablemente hidrolizados de caseína por 100 g de polvo
8.
Vitalarmor® 800 LB (Armor Proteines), que contiene 100% de hidrolizados de proteínas del suero
9.
WPH 916 (New Zealand Milk Products), que contiene 100% de hidrolizados de proteínas del suero
10.
WE80 BG (DMV internacional), que contiene 100% de hidrolizados de proteínas del suero.
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Como las fórmulas para lactantes contienen aproximadamente 15% de hidrolizados de proteínas más grasas (25%) e hidratos de carbono (50%), se demostró que es indispensable una extracción con hexano de estos productos para eliminar la fase grasa. Los hidrolizados puros se podrían usar como tales.
Para relacionar las secuencias parciales de proteínas obtenidas con las secuencias de proteínas conocidas, se usó solamente un banco de datos que contiene secuencias de proteínas de leche de vaca para todas las muestras, excepto para la muestra de Pregomin. La muestra de Pregomin se analizó usando un banco de datos que contiene datos de secuencias específicas de soja y colágeno. Por razones analíticas, el análisis por LC/MS se centra en péptidos con un peso molecular que oscila desde 400 hasta aproximadamente 2000 Daltons, de forma que los péptidos fuera de este intervalo no se tienen en cuenta.
En cada muestra se pudieron identificar entre 32 y 76 péptidos que contienen información de las secuencias de las proteínas hidrolizadas usadas. En la mayoría de las muestras, más del 95% de los 25 picos más intensos en el cromatograma se pudieron relacionar con la información de secuencias de las proteínas de la leche. En la muestra de Pregomin, solamente 65% de los 25 picos más intensos se pudieron relacionar con la información de secuencias de las proteínas de soja y colágeno. Posibles razones para esto son la incorporación de otras fuentes de proteínas en las bases proteicas o malos datos de MS/MS debido a picos pequeños o co-eluyentes.
Para ensayar la repetibilidad y la reproducibilidad del sistema, la muestra de Nutrilon Pepti Plus se extrajo dos veces y se analizó por triplicado (al principio de la serie, en medio y en el final). Se encontró que los datos obtenidos de los diversos análisis sobre la distribución de los restos de aminoácidos carboxi terminales eran coinci-
dentes.
La incidencia molar de péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal en los diversos productos comerciales se proporciona en la Tabla 3. La incidencia molar de tales péptidos está también relacionada con el contenido de prolina en el material bruto proteico usado para preparar el hidrolizado. Por ejemplo, la caseína y el colágeno tienen contenidos de prolina mucho más elevados que proteínas del suero o de la soja. Para tomar en cuenta este aspecto, las fracciones molares de prolina entre los aminoácidos presentes en las bases de proteínas usadas para cada producto comercial se han deducido también usando hidrólisis ácida seguida de análisis de aminoácidos usando técnicas como las descritas en la sección de Materiales y Métodos. Además, el material bruto usado puede diferir en su susceptibilidad a la escisión enzimática, por ejemplo debido a la presencia de secuencias de aminoácidos específicas que se
repiten.
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TABLA 3 Incidencia molar de péptidos que poseen prolina carboxi terminal en productos comerciales
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A partir de los datos presentados en la Tabla 3, está claro que en los hidrolizados de suero populares la incidencia molar de péptidos que poseen restos de prolina carboxi terminales es baja. Si también tomamos en cuenta el contenido de prolina del suero, se concluye que ninguno de los productos comerciales a base de suero contiene una fracción molar de péptidos que poseen restos de prolina carboxi terminales que sea más alta que la fracción molar de prolina presente en la base proteica. Típicamente, la fracción molar de péptidos que poseen un prolina carboxi terminal en estos productos comerciales a base de suero es 5% o más baja.
Mirando la incidencia molar de los restos de prolina carboxi terminales en un producto a base de caseína como Nutramigen, se observa un nivel mucho mayor que el que se puede encontrar en productos a base de suero, incluso si se tiene en cuenta el contenido relativamente elevado de prolina de la caseína. Sin embargo, comparando el producto Nutramigen por un lado con el hidrolizado de beta-caseína obtenido por incubación con subtilisina y una endoproteasa específica de prolina (véase el Ejemplo 1), se muestra la inmensa diferencia composicional que puede aparecer entre un hidrolizado de caseína existente comercial y un hidrolizado de caseína de acuerdo con la invención. Mientras que el producto comercial (es decir, Nutramigen) presenta una incidencia molar de péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal de 22%, esta cifra para el hidrolizado de caseína de acuerdo con el Ejemplo 1 es 61%.
Ejemplo 7
Incidencia molar de péptidos del suero que poseen una prolina carboxi terminal en relación con la concentración de endoproteasa específica de prolina añadida
En este Ejemplo, se incubó una proteína del suero comercial en diversas condiciones con una endoproteasa específica de prolina como la producida por E. coli. En el hidrolizado resultante, se determinó la incidencia molar de péptidos que poseen restos de prolina carboxi terminales.
Una disolución de Protamor 905 (Armor Proteins) en agua (10% p/p) se calentó lentamente desde 25ºC hasta 60ºC durante 1 hora en presencia de Devolase al 2,5% (peso enzima/peso sustrato) a pH 8,5. Después de 1 hora, la disolución se calentó rápidamente hasta 80ºC e inmediatamente se enfrió hasta 60ºC, después de lo cual se añadido una nueva dosis de Delvolase al 2,5%. Se dejó que la hidrólisis continuase otra hora; después se calentó hasta 95ºC durante 5 min y se enfrió nuevamente. Después de ajustar el pH hasta 7,4, se añadió la endoproteasa específica de prolina en concentraciones de 0, 87 y 170 unidades/gramo de sustrato (U/g en la Tabla 4; unidades de acuerdo con el procedimiento descrito en World Journal of Microbiology & Biotechnology, vol 11 p. 209-212), y se dejó que la hidrólisis transcurriese otras 3 horas a 45ºC. Al final, la disolución se mantuvo a 95ºC durante 5 minutos para inactivar la enzima y pasteurizar la disolución. El hidrolizado según fue obtenido se analizó entonces mediante LC/MS para determinar la incidencia molar de restos de prolina carboxi terminales en los péptidos formados según lo descrito previamente. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 4.
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TABLA 4 Dosis de enzima e incidencia molar de péptidos que poseen prolina carboxi terminal
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A partir de esta tabla, parece que a 45ºC la incidencia molar de péptidos que poseen prolina en su término C aumenta con la dosis de la endoproteasa específica de prolina. Usando las dosis más altas de la enzima, se pudo demostrar que hasta 50% de los péptidos obtenidos a partir de este producto de suero poseen un resto de prolina carboxi terminal. Cuando la incubación se lleva a cabo a 30ºC, la incidencia molar de péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal puede alcanzar 52% con 87 unidades/gramo de sustrato, y aumenta fuertemente con dosis superiores de la enzima. La mayor incidencia alcanzada con 87 U/g a 30ºC comparada con la de 45ºC se pudiera explicar por una baja termoestabilidad de la enzima de E. coli.
Ejemplo 8
Sabor y composición de hidrolizados de suero producidos con y sin endoproteasa específica de prolina
En este Ejemplo se usó una endoproteasa específica de prolina obtenida de E. coli en combinación con subtilisina (Delvolase) para producir un hidrolizado de suero de bajo amargor. Usando los datos generados en el Ejemplo 7, la dosis de endoproteasa específica de prolina se escogió de manera que solamente se pudiera esperar un incremento marginal de péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal. El hidrolizado formado con la endoproteasa específica de prolina se comparó con un hidrolizado similar formado sin una endoproteasa específica de prolina así como con un hidrolizado comercial de suero, de bajo de amargor. Los tres productos se caracterizaron en términos de sabor y su contenido de péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal.
Una disolución de Protarmor 905 (Armor Proteins) en agua (10% p/p) se calentó lentamente desde 25ºC hasta 60ºC durante 1 hora en presencia de Devolase al 2,5% (peso de enzima/peso de sustrato) a pH 8,5. Después de 1 hora, la disolución se calentó rápidamente hasta 80ºC e inmediatamente se enfrió hasta 60ºC, después de lo cual se añadió una nueva dosis de Delvolase al 2,5%. Se dejó que la hidrólisis continuase durante otra hora; después se calentó hasta 95ºC durante 5 min y se enfrió de nuevo. Después de ajustar el pH hasta 7,4, se añadió la endoproteasa específica de prolina en una concentración de 50 unidades/gramo de sustrato. Se dejó que continuara durante 3 horas a 45ºC. De acuerdo con los datos obtenidos en el Ejemplo 7, estas condiciones conducen a un incremento marginal en péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal solamente. Al final, la disolución se mantuvo a 95ºC durante 5 minutos para inactivar la enzima y pasteurizar la disolución. Después, la disolución se enfrió. Se aplicó el mismo tratamiento a otra muestra, pero sin añadir la endoproteasa específica de prolina.
El análisis sensorial del hidrolizado se llevó a cabo en los denominados ensayos de comparación pareada. Este tipo de ensayo se usa por la American Society of Brewers Chemists (ASBC) para comparar el amargor de dos cervezas diferentes. Si aceptamos un 5% de riesgo de error en tal ensayo de un lado, el valor umbral para tener una diferencia estadística es 17 de 24 réplicas. En cada ensayo, los hidrolizados se probaron en concentraciones de materia seca de 2,5% y se presentaron porciones de 1 ml de tal disolución en un vial desechable. A cada catador se le pidió tasar el nivel de amargor sin tragar y enjuagarse la boca después con agua. Todas las muestras se codificaron y se repartieron al azar entre los catadores.
El primer ensayo tuvo el objetivo de evaluar el beneficio de la combinación de subtilisina y la endoproteasa específica de prolina frente a la subtilisina sola. El segunda ensayo tuvo el objetivo de evaluar el amargor del hidrolizado obtenido con la combinación de subtilisina y endoproteasa específica de prolina frente a un hidrolizado comercial de bajo amargor (Vitalarmor 800LB). Para ese fin, se diluyó el Vitalarmor 800LB en el mismo tampón que el usado para el otro hidrolizado, para obtener una concentración comparable de proteínas.
De las 24 personas que participaron en el primer ensayo, 17 calificaron la muestra obtenida con la combinación de subtilisina y endoproteasa específica de prolina como menos amarga que la muestra obtenida con subtilisina sola. Este resultado es estadísticamente significativo y confirma la actividad desamargante de la endoproteasa específica de prolina, incluso si se aplica a concentraciones relativamente bajas (véase el Ejemplo 7). Merece la pena señalar que estas "bajas" concentraciones enzimáticas son varios órdenes de magnitud mayores que las dosis de enzimas aplicadas en la patente JP5015314 y por las cuales se reivindicó el efecto desamargante.
En la segunda comparación de muestras pareadas, 19 de los 24 participantes calificaron la muestra tratada con la combinación de subtilisina y endoproteasa específica de prolina como menos amarga que el producto comercial Vitalarmor 800LB. La última observación es también estadísticamente significativa e ilustra el valor económico de los hidrolizados y las mezclas de enzimas de la invención.
Los hidrolizados obtenidos con o sin la endoproteasa específica de prolina se analizaron mediante LC/MS como se describe anteriormente. En el hidrolizado obtenido con la subtilisina sola, se analizaron 41 péptidos. Resulta que ninguno de estos péptidos poseyó un resto de prolina carboxi terminal a pesar del hecho de que se demostró que 18 péptidos contienen al menos un resto de prolina.
En el hidrolizado obtenido con la combinación de subtilisina y la endoproteasa específica de prolina, se analizaron 31 péptidos y se demostró que 6 poseían un resto de prolina carboxi terminal. Esta observación, la cual está en línea con lo que sería de esperar en base a los resultados obtenidos en el Ejemplo 6, muestra que, como el resultado de la incubación con la endoproteasa específica de prolina, la incidencia molar de péptidos que poseen una prolina carboxi terminal aumentó de 0 a 19%. Como el análisis sensorial de los últimos productos ha demostrado un amargor reducido estadísticamente significativo, este experimento claramente vincula un ligero incremento en la incidencia molar de los restos de prolina carboxi terminales con un amargor reducido.
Aparte de la disminución de los niveles de amargor, también se pudo demostrar que esta incubación con un bajo nivel de endoproteasa específica de prolina disminuye la longitud de los péptidos del hidrolizado. En el hidrolizado tratado con Delvolase sola, el análisis por LC/MS reveló que los péptidos varían en longitud de 4 a 14 aminoácidos, con una longitud promedio de 7,5 aminoácidos. En el hidrolizado tratado con la combinación de Delvolase y la endoproteasa específica de prolina, la longitud de los péptidos podría mostrar variaciones de 4 a 12 aminoácidos, con una longitud promedio de 6,1 aminoácidos. Estas longitudes reducidas de los péptidos no solamente mejoran el rendimiento del proceso de producción de hidrolizados, sino que además reducen la alergenicidad total de los hidrolizados y minimizan la precipitación en condiciones ácidas.
Ejemplo 9
Clonación de una proteasa específica de prolina de Aspergillus niger
Se desarrollaron cebadores oligonucleotídicos directos e inversos usando las secuencias peptídicas que se elucidaron en el Ejemplo 3. Para reducir la degeneración de los cebadores, se introdujeron bases de inosina en varias posiciones. Esto incrementa la abundancia de los cebadores oligonucleotídicos en el conjunto de los que son capaces de cebar una reacción de PCR, pero la desventaja es que disminuye la especificidad de la reacción.
Se aisló ADN genómico de A. niger G306 (depositada como CBS109712 en la colección CBS, en 10 de septiembre de 2001) usando técnicas estándar, y se usó como molde en la reacción de PCR con los cebadores oligonucleotídicos indicados en la tabla 5.
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TABLA 5 Cebadores peptídicos y oligonucleotídicos de endo-Pro (I=inosina)
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En este experimento se usaron todas las posibles combinaciones de cebadores directos e inversos para amplificar el gen que codifica la endoproteasa específica de prolina de A. niger. Se llevaron a cano experimentos iniciales en condiciones estándar de PCR (desnaturalización a 94ºC, apareamiento a 55ºC y prolongación a 72ºC). Sorprendemente, estos experimentos no produjeron ningún producto de PCR específico. Puesto que un resultado negativo pudiera también ser debido a impurezas en el ADN molde, se llevaron a cabo reacciones de PCR de control usando cebadores de PCR para varios genes diferentes pero conocidos de A. niger. En reacciones comparables, estos últimos genes se pudieron amplificar con éxito a partir de ADN genómico de A. niger G306, demostrando que la incapacilidad para amplificar un fragmento usando los cebadores endo-Pro no fue debida a impurezas en la preparación del ADN genómico.
Subsiguientemente se decidió incrementar la restricción de la reacción de PCR, disminuyendo la temperatura de apareamiento hasta 45ºC. Consecuentemente, la especificidad de la PCR disminuyó, y se amplificaron varias bandas, aunque la mayoría de estas bandas también se detectaron en reacciones de PCR de control que carecen de uno de los cebadores. Varios de estos productos de PCR se clonaron en el vector de clonación general pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, Países Bajos), y se determinó la secuencia de ADN de estos fragmentos. Desafortunadamente, ninguno de los fragmentos clonados codificó el gen que codifica la endoproteasa específica de prolina.
Adicionalmente, se hicieron muchos otros ajustes al protocolo de PCR, tales como el uso de una polimerasa diferente, aumento de la concentración del cebador o del molde, una PCR de toque e introducción de un inicio caliente, pero ninguno de estos protocolos produjo un fragmento específico del gen que codifica la endoproteasa específica de prolina. Para minimizar los riesgos obvios de este enfoque incierto, se decidió intentar otro procedimiento de clonación menos bien conocido.
3'-RACE
Puesto que ninguno de los intentos para amplificar el gen que codifica la endoproteasa específica de prolina a partir del ADN genómico de A. niger G 306 tuvieron éxito, se decidió usar un enfoque diferente en el cual se usó ARN como el molde para la síntesis de ADNc. El enfoque de clonación de un gen desconocido usando 3'-RACE, 5'-RACE y la amplificación de todo el marco abierto de lectura se ha descrito en el documento WO9938956. La ventaja de este procedimiento, comparado con el procedimiento de PCR directo descrito anteriormente, es que se introduce un sitio adicional de cebado en el extremo 3' del ADNc, de forma que solamente se requiere un único oligonucleótido especifico del gen, más un cebador universal, para amplificar parte de la secuencia codificante, en lugar de dos cebadores degenerados. Adicionalmente, usando ADNc como molde se evitan problemas en la amplificación debido a intrones. El uso de ADNc como molde en la reacción de amplificación también incrementa la concentración del molde en comparación con la amplificación a partir de ADN genómico.
De acuerdo con este enfoque, se hizo crecer A. niger G306 en un medio que contiene colágeno como única fuente de carbono, para inducir la expresión del gen que codifica la endoproteasa específica de prolina. La composición del medio se describe en la sección de Materiales y Métodos. El micelio joven se cosechó después de 48 horas de crecimiento a 34ºC, y se usó para el aislamiento de ARN total. Para este fin, los micelios se cosecharon usando filtración a través del manto de filtración Miracloth, y se lavaron con agua estéril desmineralizada enfriada con hielo. El micelio (250 mg) se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se molió hasta un polvo blanco fino usando un mortero y un majador. El polvo blanco se transfirió a un tubo Greiner estéril de 15 ml, y se aisló ARN total con el método Trizol exactamente como se describe por el proveedor (Life Technologies, Pasley,
UK).
La preparación de ARN se usó para sintetizar ADNc a partir del cebador ancla del kit 3'-RACE (AP; Life Technologies), extendiendo ADNc desde la cola poli-A del ARNm. Después de un tratamiento con RNasa H, el ADNc se amplificó mediante PCR con el cebador de amplificación acortado universal (AUAP; Life Technologies) y los cebadores directos específicos del gen sustituido con inosina (No. 1, 3, 5 y 7) descritos anteriormente. Solamente con el cebador No. 1 más AUAP se pudo amplificar un producto de amplificación específica de \sim1,4 kb a partir del ARN de A. niger G306. Con los otros cebadores, solamente se obtuvo una amplificación no específica a baja restricción. Este fragmento de ADNc de 1,4 kb se clonó en pCR2.1, y se determinó la secuencia de
ADN.
5'-RACE
A partir de esta secuencia, se diseñaron tres cebadores específicos del gen para posteriores amplificaciones de la parte 5' del gen. Los tres cebadores, 5'-TTCAGTACTCCACCAGTACCTC-3', 5'-TGGGAAAAGGTGCCCTTCTCC-3' y 5'-GGATTATGATGGTCCAGCAGC-3', fueron complementarios e inversos a la secuencia codificante del gen que codifica endoproteasa específica de prolina.
Se usó ARN total de A. niger G306 para sintetizar el ADNc con el kit 5'-RACE (Life Technology) usando el cebador 5'-TTCAGTACTCCACCAGTACCTC-3'. Después del tratamiento con RNasa, se purificó ADNc usando el cartucho Glasmax (Life Technology). Se añadió una cola poli-dC al ADNc usando transferasa terminal (TdT; Life Technology). El ADNC se amplificó en una reacción de PCR usando el cebador ancla acortado (AAP; Life Technology) y con el primer cebador anidado 5'-TGGGAAAAGGTGCCCTTCTCC-3'. Se requirió una segunda reacción de amplificación usando el cebador AUAP (Life Technology) y un segundo cebador 5'-GGATTATGATGGTCCAGCAGC-3' para obtener un producto de amplificación específico de \sim0,25 kb. Este fragmento se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se clonó en pCR2.1, y se determinó la secuencia de ADN. Esto mostró que este fragmento contiene la parte 5' del gen que codifica la endoproteasa específica de prolina.
Caracterización del gen
La combinación de las secuencias solapantes del 3'-RACE y el 5'-RACE da como resultado la secuencia codificante completa del gen que codifica la endoproteasa específica de prolina. La SEC_ID 1 muestra toda la secuencia del marco abierto de lectura de este gen. La secuencia deducida de la proteína, de 526 aminoácidos, se describe en la SEC_ID 2. Parece que el péptido ATTGEAYFE es completamente correcto. El péptido DGAPEGTST es también correcto pero es codificado por el ADN genómico que está interrumpido por un intrón (véase SEC_ID 15 y ejemplo 11 para la clonación y secuenciación del ADN de Aspergillus niger CBS513.88). Los otros dos péptidos incorporan errores debido al enfoque de LC/MS/MS, que se ha usado para su caracterización (véase el Ejemplo 3). A pesar de estas incertidumbres, por primera vez se seleccionó con éxito y se identificó la información genética deseada que codifica la endoproteasa específica de prolina de Aspergillus niger.
La novedad de la endoproteasa específica de prolina de Aspergillus se confirmó mediante búsquedas BLAST en bases de datos bien conocidas tales como SwissProt, PIR, y trEMBL. No se pudo detectar identidad fuerte de esta proteína con cualquier otra proteína cuando se comparó con bases de datos de secuencias proteicas.
Ejemplo 10
Sobreexpresión del gen que codifica la endoproteasa específica de prolina, y aislamiento de la endoproteasa específica de prolina
Todo el marco abierto de lectura completo del gen que codifica la endoproteasa específica de prolina se amplificó por PCR a partir de ADNc de A. niger G306 usando los cebadores 5'-ATGCGTGCCTTCTCCGCTGTC-3' y el cebador AUAP (Life Technology). El fragmento obtenido por PCR se clonó en el vector de clonación pCR2.1 (Invitrogen). El plásmido resultante fue digerido con EcoRI, y el fragmento que contiene el gen endo-Pro se clonó en el sitio EcoRI del vector de expresión pGBFIN-11 (documento WO9932617). Los clones resultantes se comprobaron mediante restricción con XhoI, lo cual produce un fragmento de \sim0,65 kb cuando el fragmento se inserta en la orientación correcta. El plásmido resultante se muestra en la Figura 1 y se denominó pGBFIN11-EPO.
Se usó A. niger CBS 513.88 como hospedante para la sobreexpresión del gen que codifica la endoproteasa específica de prolina. Por consiguiente, el vector de expresión pGBFIN11-EPO fue linealizado por digestión con NotI, que elimina todas las secuencias derivadas de E. coli del vector de expresión. El ADN digerido se purificó usando extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (24:23:1) y purificación con etanol. El procedimiento de transformación de A. niger se describe ampliamente en el documento WO 98/46772. También se describe cómo seleccionar transformantes en placas de agar que contienen acetamida, y cómo seleccionar integrantes multicopias objetivos. Preferiblemente, los transformantes de A. niger que contienen múltiples copias del casete de expresión se seleccionan para la generación posterior de material de muestra.
Cultivo y aislamiento de proteasa
Una cepa de A. niger que contiene múltiples copias del casete de expresión se usó para la generación cromatográfica de material de muestra por cultivo de la cepa en cultivos en matraces de agitación. Un método útil para el cultivo de cepas de A. niger y la separación del micelio del caldo de cultivo se describe en el documento WO 98/46772. El caldo de cultivo obtenido se analizó en SDS-PAGE, lo cual se representa en la Figura 2. Subsiguientemente, el caldo de cultivo se usó para la purificación cromatográfica de la proteasa para eliminar cualquier actividad contaminante endo- y exoproteolítica. Para este fin, el caldo de fermentación se centrifugó primero para eliminar el volumen de la masa fúngica, y el sobrenadante se hizo pasar luego a través de un número de filtros con tamaños de poros decrecientes, para eliminar todos los fragmentos celulares. Finalmente, el ultrafiltrado obtenido se diluyó 10 veces en 20 milimoles/litro de acetato de sodio a pH 5,1 y se aplicó en una columna Q-Sepharose FF. Las proteínas se eluyeron en un gradiente de NaCl desde 0 hasta 0,4 moles/litro en acetato de sodio 20 milimoles/litro a pH 5,1. Las fracciones pico que presentan actividad con respecto a la escisión de Z-Gly-Pro-pNa (Bachem, Suiza) se recogieron y se reunieron, de acuerdo con el protocolo descrito en World Journal of Microbiology and Biotechnology 11, 209-212 (1995), pero en condiciones de ensayo ligeramente modificadas. Teniendo en cuenta el pH ácido óptimo de la endoproteasa específica de prolina derivada de A. niger, el ensayo enzimático se llevó a cabo a pH 5 en un tampón de citrato/fosfato a 37ºC. Reuniendo las fracciones activas, seguido de la concentración, se produjo finalmente una preparación que mostró solamente una única banda en SDS-PAGE y un pico en HP-SEC. Otros análisis por cromatografía de interacción hidrófoba confirmaron la pureza de la preparación enzimática obtenida.
Además, la endoproteasa purificada específica de prolina se usó para la determinación del término amino de la proteína madura, por degradación de Edman. El término amino de la endoproteasa madura específica de prolina comienza en la posición 42 en SEC_ID 2 e SEC_ID 17.
Ejemplo 11
Cribado de especies fúngicas distintas de A. niger en busca de la presencia del gen que codifica la endoproteasa específica de prolina
En base a la baja homología de secuencias nucleotídicas entre el gen de F. meningosepticum y de A. niger que codifica la endoproteasa específica de prolina, se puede excluir la hibridación cruzada entre estos dos genes. Para conseguir una impresión de la conservación de la secuencia nucleotídica específica de A. niger en microorganismos más relacionados, se seleccionaron las siguientes cepas para un experimento de hibridación. Las especies fúngicas de Aspergillus niger CBS 102.12, Aspergillus niger CBS513.88, Aspergillus niger G306, Aspergillus carbonarius ATCC1025, Aspergillus sojae DSM2809, Aspergillus ochraceus ATCC18500, Aspergillus acculeatis CBS101.43, Verticillium psalliotae CBS396.58, Phialophora mustea CBS142.41, Penicillium chrysogenum URCM237, Phoma exigua CBS431.74, Microsporum gallinae CBS221.55, Acremonium strictum ATCC20371, Rhizomucor miehei CBS370.65, Alternaria alternata CBS103.33, Talaromyces emersonii CBS393.64, Cladosporium chlorocephalum CBS213.73, Cladosporium tenuissinum CBS117.79, y Thrichoderma reesii ATCC26921 se cultivaron en 100 ml de PDB (Caldo de Dextrosa de Patata, Difco) a 30ºC (excepto para la cepa de Talaromyces, la cual se hizo crecer a 50ºC) y se agitaron a
220 rpm.
Cuando los cultivos estuvieron lo suficientemente crecidos, la masa micelial se recolectó por filtración a través de filtro Miracloth, se lavó con tampón KPi 10 mM (pH 7,0) y se secó entre papel de filtro. El micelio se molió en nitrógeno líquido con un mortero y un majador, hasta que se obtuvo un polvo blanco fino. Subsiguientemente, el ADN cromosómico se aisló usando el kit PureGene (Gentra System, Minneapolis USA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Se usó Saccharomyces cerevisiae ATCC20785 como control negativo en el experimento, y se cultivó en YePD a 30ºC y se agitó a 220 rpm.
Para la preparación de una transferencia Southern, el ADN cromosómico de todas las especies fue digerido con XhoI, y los fragmentos de restricción se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa sobre un gel de agarosa al 0,8% en tampón TAE. Después de la separación, los fragmentos de ADN se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (0,2 \mum, Schleicher & Schuell) mediante procedimiento convencional (Sambrook et al. (1982): Molecular cloning; a laboratory manual, ISBN 0-87969-309-6), y la transferencia fue corrido hacia atrás durante 2 horas a
80ºC.
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La sonda para hibridación se sintetizó con PCR en pGBFIN11-EPO como molde usando el cebador 5'-ATGCGTG
CCTTCTCCGCTGTC-3' y el cebador AUAP. Se marcaron alrededor de 30 nanogramos del fragmento de ADNc con ^{32}P-alfa-dATP (Amersham, Inglaterra) con el sistema de marcado de ADN RadPrime (Life Technology) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de marcar, los dNTP no incorporados se eliminaron purificando el fragmento sonda sobre una columna de SepHadex G-50 de acuerdo con el procedimiento de columna giratoria (Sambrook et al., 1982).
Antes de la adición a la mezcla de hibridación, la sonda purificada se desnaturalizó por incubación en agua hirviendo durante 5 minutos, seguido de un enfriamiento rápido en hielo, y se usó inmediatamente.
La prehibridación de las transferencias se realizó en 50 ml de 6 x SSC, SDS 0,5%, 5 x Denhardt, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque (Life Technologies) durante 1 hora a 50ºC con agitación continua. Después de añadir la sonda a la disolución de prehibridacion, se llevó a cabo la hibridación durante 16 horas a 50ºC. Las transferencias se lavaron dos veces con 200 ml de 6 x SSC, SDS 0,1% durante 30 minutos a temperatura ambiente, y una vez con 200 ml de 6 x SSC, SDS 0,1% durante 30 minutos a 50ºC, para eliminar la hibridación específica de la transferencia. Se usaron películas X-Omat AR (Kodak) para visualizar la hibridación.
Los resultados de este experimento se representan en la Tabla 6. Las cepas de A. niger y A. carbonarius dan una fuerte hibridación con la sonda. También otras cepas de Aspergillus como A. sojae, A. ochraceus, y A. acculeatis dan hibridación con la sonda. Aparentemente, el gen que codifica la endoproteasa específica de prolina está bien conservado en el género Aspergillus. Sorprendentemente, también los hongos que están más distantes de Aspergillus, como Phialophora mustea, Rhizomucor miehei, Alternaria alternata, Talaromyces emersonii y Trichodema reesii dan buena hibridación con el ADNc de la endoproteasa específica de prolina. Saccharomyces cerevisiae, que se incluyó como control negativo, así como algunas otras especies no mostraron ninguna hibridación con el ADNc de A. niger (véase la Tabla 6). Este resultado muestra que el gen que codifica la endoproteasa específica de prolina se conserva en muchas especies fúngicas, y una persona experta en el técnica podrá entender que los genes de estas especies se pueden aislar usando la hibridación heteróloga mostrada aquí como método de
detección.
Para ilustrar esto, el fragmento de ADNc de Aspergillus niger G306, usado en este ejemplo, se usó como sonda para el cribado de una biblioteca de ADN genómico a partir de Aspergillus niger CBS513.88. Una persona experta en la técnica tendrá conocimientos para generar una biblioteca de ADN genómico, y cribar tal biblioteca con una sonda de ADN marcado. Este procedimiento también se describe ampliamente en la bibliografía (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning; a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los clones positivos en el cribado se purificaron, y se secuenció el ADN. El ADN genómico del Aspergillus niger CBS513.88 que codifica la endoproteasa específica de prolina se representa en SEC_ID 15. Este ejemplo ilustra que es posible aislar el gen que codifica la endoproteasa específica de prolina de otras especies y cepas usando hibridación al ADNc de este gen de Aspergillus niger G306.
La secuencia codificante deducida y la secuencia de aminoácidos de la endoproteasa específica de prolina de CBS513.88 se representa en SEC_ID 16 y SEC_ID 17, respectivamente.
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TABLA 6 Hibridación heteróloga del gen endo-Pro de A. niger para ADN cromosómico de diversos hongos
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Ejemplo 12
Mezcla enzimática obtenida a partir de Aspergillus oryzae FS 1-32 y sus efectos en la hidrólisis de proteína de soja
La patente japonesa JP5015314 describe una preparación enzimática bruta obtenida a partir de Aspergillus oryzae FS 1-32 que contiene cantidades importantes de una actividad endoproteolítica y menores cantidades de endoprotesa específica de prolina. Esta preparación bruta contiene además una actividad significativa de carboxipeptidasa. Con la incubación de la proteína de haba de soja con esta preparación enzimática bruta, se obtiene un hidrolizado de proteínas de haba soja que se reivindica que es significativamente menos amargo que un hidrolizado que se puede obtener con otras preparaciones de proteasas. La explicación dada en JP5015314 para este efecto beneficioso desamargante es que otras preparaciones de proteasas carecen de la presencia de una endoproteasa específica de prolina en combinación con una carboxipeptidasa. El documento JP5015314 sugiere que la base para el efecto desamargante es la eliminación de los restos de prolina que están expuestos por la actividad de la endoproteasa específica de prolina y subsiguientemente eliminador por la carboxipeptidasa.
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El Ejemplo 4 de la presente solicitud describe los efectos sobre la proteína de soja de una mezcla de enzimas comerciales que se asemeja al perfil de actividad proteolítica de la cepa de A. oryzae FS 1-32. Una de las conclusiones de este trabajo experimental es que la incorporación de una actividad endoproteolítica específica de prolina en niveles como los registrados con la cepa FS 1-32 no conduce a un incremento apreciable en péptidos de soja que poseen un resto de prolina carboxi terminal. Como esta conclusión tiene importantes implicaciones con relación a los hidrolizados de proteínas no amargos descritos en la presente solicitud, se decidió repetir el experimento, pero usando la mezcla enzimática obtenida a partir de A.oryzae FS1-32, y en condiciones descritas en JP5015314.
Se colocó en placas Aspergillus oryzae FS 1-32 (según se obtiene a partir del depósito 12193 del Micr. Ind LAB en Japón) en una placa de agar con extracto de malta, se incubó durante 4 días a 35ºC y después se almacenó durante un día a 4ºC. Las esporas de estas placas se usaron para inocular el medio de inoculación que contiene 20 gramos/kg de dextrosa, 15 gramos/kg de harina de soja desgrasada, 5 gramos/kg de extracto de levadura bajo en sal, 1 gramo/kg de KH_{2}PO_{4} y 0,2 gramos/kg de antiespumante. Después de disolver en agua desmineralizada, el pH del medio se ajustó con ácido sulfúrico hasta 5,5, y luego se dividió en porciones de 20 ml en frascos de agitación de 100 ml con deflectores. Los frascos de agitación con el medio se esterilizaron durante 30 minutos a 121ºC y se inocularon y después se enfriaron. Después de dos días en una incubadora de agitación a 32ºC, se usó 1 ml para inocular otros 100 ml de medio de inoculación. Después de otro día en la incubadora de agitación a 32ºC, este cultivo se usó para inocular el medio de cultivo. Puesto que el documento JP501314 no proporciona información con respecto al procedimiento de fermentación usado, se usó el protocolo de 
\hbox{fermentación y el medio según lo proporcionado en el
documento EP 0 522 428.}
El medio de cultivo de acuerdo con EP 0 522 428 contiene los siguientes componentes: caseína ácida (Armor Proteins, Francia) 25,4 gramos/litro, harina de haba de soja tostada (Cargill, Países Bajos) 8,6 gramos/litro, salvado de trigo (Zonnatura, Países Bajos) 15,0 gramos/litro, almidón de maíz 20,0 gramos/litro, ácido tánico (Omnichem) 16,0 gramos/litro y KH_{2}PO_{4} 26,6 gramos/litro. Debido a que el ácido tánico recomendado (para estimular la formación de la endoproteasa específica de prolina) no se especificó en EP 0522428, se usaron dos tipos de ácido tánico, es decir, BREWTAN C y TANAL W2 (ambos de Omnichem (Wetteren, Bélgica)). Finalmente, el valor del pH del medio de cultivo se ajustó con ácido fosfórico (20%) hasta 4,5 y después se dividió en porciones de 100 ml en frascos de agitación de 500 ml con deflectores. Los frascos se esterilizaron durante 30 minutos a 121ºC.
Después de la inoculación con 1 mililitro del medio de inoculación que se hizo crecer previamente, los cultivos se incubaron durante 2 y 4 días a 32ºC, 250 rpm. Para eliminar la biomasa, los caldos de cultivo se filtraron en un filtro de microfibra de cristal Whatman (nº de cat. 1820090), que entonces se conservaron a -20ºC. Parte de este material congelado se liofilizó y se usó para las mediciones de actividad así como incubaciones con proteína de soja.
Las actividades de la prolil-endoproteasa, carboxipeptidasa y endoproteasa en los materiales liofilizados se midieron exactamente como se describe en JP5015314. Las muestras que habían fermentado durante 2 días mostraron niveles apreciablemente más altos de actividad enzimática que las muestras que habían fermentado durante los 4 días recomendados, por lo que se decidió usar estas muestras de dos días para la incubación final con proteína de soja. Los datos de actividad enzimática de esas muestras que muestran las actividades de prolil-endoproteasa más elevadas se muestran aquí abajo.
TABLA 7 Actividad enzimática por gramo de material liofilizado
9
Las actividades de prolil-endoproteasa y carboxipeptidasa medidas en las muestras 1, 3 y 4 son comparables con las cifras proporcionadas en el documento JP5015314. Sin embargo, las actividades de endoproteasa medidas en estas muestras resultaron ser alrededor de 200 veces más bajas que las indicadas en JP501314. En vista de las actividades endoproteolíticas reportada en diversas preparaciones enzimáticas industriales (véase el Ejemplo 4), las actividades proteolíticas extremadamente altas obtenidas con A. oryzae FS 1-32 y especificadas en JP5015314 son probablemente poco realistas.
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\global\parskip0.900000\baselineskip
En un intento por copiar el Ejemplo 2 de JP5015314 de forma tan precisa como sea posible, se llevó a cabo el siguiente experimento. Se suspendieron 10 gramos de proteína de soja Soyamin 90HV (Lucas Meyer, Hamburgo, Alemania) en 100 ml de agua desmineralizada, y el pH se ajustó con NaOH 4N hasta 8,5. Entonces se añadieron 0,5 g de Delvolase (DSM Food Specialities, Seclin, Francia) (en lugar de Protin AY de Daiwa Kasei; tanto Delvolase como Protin AY son endoproteasas alcalinas derivadas de Bacillus), y la disolución de proteínas se incubó durante 2 horas a 60ºC (en el documento JP5015314 no se especifica el tiempo de incubación ni la temperatura con Protin AY). Finalmente, la Delvolase se inactivó por calentamiento de la disolución durante 10 minutos a 92ºC.
El hidrolizado de proteínas resultante se incubó después con las muestras enzimáticas 1, 3 y 4 de acuerdo con el protocolo descrito en JP5015314, pero se estandarizó de acuerdo con la actividad de carboxipeptidasa deseada (0,01 unidades por gramo de sustrato). La implicación fue que por gramo de aislado de soja había que añadir 2,0 miligramos de muestra 1 de enzima liofilizada, 2,7 miligramos de la muestra 3 de enzima liofilizada y 1,3 miligramos de la muestra 4 de enzima liofilizada. Las actividades resultantes de endoproteasa y prolil-endoproteasa se presentan en la Tabla 8.
Después de incubar durante 5 horas a pH 5 y 50 grados C, las muestras se centrifugaron, y los sobrenadantes se mantuvieron congelados hasta el análisis por LC/MS.
El análisis por LC/MS se llevó a cabo como se especifica en la sección de Materiales y Métodos. En este experimento, el banco de datos de proteínas consistió sólo en proteínas de soja. La frecuencia de los restos de prolina carboxi terminales detectados en los péptidos obtenidos se especifican debajo.
TABLA 8 Proteína de soja tratada con varias enzimas
10 
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A partir de los datos obtenidos, es evidente que la incubación de la proteína de soja con la preparación enzimática bruta obtenida de Aspergillus oryzae FS 1-32 no da como resultado un incremento significativo de la fracción molar de péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal. Por lo tanto, el efecto desamargante descrito en el documento JP5015314 no se puede atribuir a la alta incidencia de tales péptidos en el hidrolizado final.
Ejemplo 13
Un hidrolizado de caseína no amargo obtenido combinando termolisina con una endoproteasa específica de prolina de Aspergillus
La endoproteasa específica de prolina de A. niger G306 se sobreexpresó y se purificó cromatográficamente (véase el Ejemplo 10) y se usó subsiguientemente para producir un hidrolizado de caseína no amargo. Para este fin, se añadieron a 100 ml de una disolución de caseinato de sodio (Miprodan 30) que contiene 60 gramos por litro, 100 mg de termolisina (Termoase). La incubación a pH 6,7 y 85 grados C dio como resultado una floculación y precipitación inmediatas de proteína caseinácea. La incubación durante dos horas dio como resultado finalmente una disolución clarificada que todavía contiene algo de precipitado. Después, el pH de la disolución se ajustó hasta pH 5,0, y la Termoase se inactivó calentando durante 45 minutos a 95 grados C. Después de enfriar, la disolución se saboreó y se observó si era muy amarga. En esta etapa, el DH (grado de hidrólisis; estabilizado usando el método TNBS) de la disolución de caseinato fue aproximadamente 35%. El análisis de 64 péptidos por LC/MS/MS usando un banco de datos para caseinatos bovinos indicó una incidencia molar de péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal de 14%.
Después, se añadieron 3 unidades de la endoproteasa específica de prolina de A. niger cromatográficamente purificada a 25 ml del hidrolizado. Después de la incubación durante 20 horas a 50 grados C, se llevó a cabo otro ciclo de inactivación de la enzima calentando la disolución durante 30 minutos a 90ºC. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la disolución se decantó y el sobrenadante transparente se ajustó hasta un valor de pH de 4,0; se encontró que el hidrolizado de caseinato permaneció completamente disuelto y transparente. La degustación demostró la ausencia de cualquier amargor o sabor desagradable. El DH de este hidrolizado final usando el método TNBS fue aproximadamente 50%; el análisis por LC/MS/MS de los 64 péptidos mostró que la incidencia molar de los péptidos que poseen un resto de prolina carboxi terminal aumentó hasta 45%. Este 45% es casi 4 veces más alto que la fracción molar de prolina que se encuentra en el sustrato Miprodan.
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<110> DSM NV
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> HIDROLIZADOS PROTEICOS ENRIQUECIDOS EN PÉPTIDOS QUE TIENEN UN RESTO DE PROLINA CARBOXI TERMINAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 20001WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1581
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger G306
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
11 
\hskip0,8cm
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 526
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger G306
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
13 
\hskip0,8cm
14 
\hskip0,8cm
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger G306
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /mod_base="inosina" en las posiciones 3, 6, 9, 12 y 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /mod_base="inosina" en las posiciones 9, 15, 9, 18 y 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger G306
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /mod_base="inosina" en las posiciones 6, 9 y 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /mod_base="inosina" en las posiciones 12, 15 y 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger G306
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /mod_base="inosina" en las posiciones 6, 9, 12 y 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /mod_base="inosina" en las posiciones 3, 9, 12 y 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger G306
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /mod_base="inosina" en las posiciones 6, 9, 12, 15, 18 y 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /mod_base="inosina" en las posiciones 3, 6, 9, 12, 15 y 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger CBSS13.88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
28 
\hskip0,8cm
29 
\hskip0,8cm
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1581
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger BCS513.88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
31 
\hskip0,8cm
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 526
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus niger CBS513.88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
33 
\hskip0,8cm
34 
\hskip0,8cm
35

Claims (23)

1. Un hidrolizado de proteínas que comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos (%) que poseen una prolina carboxi terminal es más de dos veces la fracción molar (%) de prolina en el sustrato proteico usado para generar el hidrolizado.
2. Un hidrolizado de proteínas según la reivindicación 1, en el que la fracción molar de péptidos (%) que poseen una prolina carboxi terminal es al menos tres veces la fracción molar (%) de prolina en la proteína.
3. Un hidrolizado de proteínas según la reivindicación 1 ó 2, en el que la longitud peptídica media es de 3 a 9 aminoácidos.
4. Un hidrolizado de proteínas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos se hidroliza el 10% del sustrato proteico, preferiblemente en el que se hidroliza de 20 a 90% del sustrato proteico.
5. Un hidrolizado de proteínas según la reivindicación 1, que es un hidrolizado de suero y que comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos que poseen una prolina carboxi terminal es al menos 8%, preferiblemente al menos 15%, más preferiblemente de 30 a 70%.
6. Un hidrolizado de proteínas según la reivindicación 1, que es un hidrolizado de caseína y que comprende péptidos en el que la fracción molar de los péptidos que poseen una prolina carboxi terminal es al menos 25%, preferiblemente de 30 a 70%.
7. Un hidrolizado de proteínas según la reivindicación 1, que es un hidrolizado de soja y que comprende péptidos en el que la fracción molar de los péptidos que poseen una prolina carboxi terminal es al menos 20%, preferiblemente de 30 a 70%.
8. Un hidrolizado de proteínas según la reivindicación 1, que es un hidrolizado de gluten y que comprende péptidos en el que la fracción molar de los péptidos que poseen una prolina carboxi terminal es al menos 20%, preferiblemente de 30 a 70%.
9. Uso de un hidrolizado de proteínas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un alimento o bebida.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el alimento o bebida comprende de 5% a 10% (p/v) del hidrolizado de proteínas.
11. Uso según la reivindicación 9 ó 10, en el que el alimento tiene un amargor reducido y/o baja antigenicidad.
12. Uso según la reivindicación 11, en el que el alimento comprende una fórmula para lactantes.
13. Un método para producir enzimáticamente un hidrolizado de proteínas a partir de un sustrato proteico, en el que el sustrato proteico se incuba con una endoproteasa específica de prolina para producir un hidrolizado de proteínas que comprende péptidos en el que la fracción molar de péptidos (%) que poseen una prolina carboxi terminal es más de dos veces la fracción molar (%) de prolina en el sustrato proteico usado para generar el hidrolizado.
14. Un método según la reivindicación 13, en el que el sustrato proteico se incuba secuencialmente o concomitántemente con la endoproteasa específica de prolina y otra endoproteasa.
15. Un método según la reivindicación 13, en el que el sustrato proteico se incuba secuencialmente o concomitántemente con la endoproteasa específica de prolina y la otra endoproteasa que es una serina o una metalo-endoproteasa o una combinación de una serina y una metalo-endoproteasa.
16 Un método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el hidrolizado de proteínas se recupera sin una etapa de ultrafiltración o de microfiltración.
17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que el sustrato proteico se incuba con una composición enzimática que comprende una endoproteasa específica de prolina, subtilisina, y carboxipeptidasa.
18. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que, en el hidrolizado de proteínas, la fracción molar de péptidos (%) que poseen una prolina carboxi terminal es más de dos veces la fracción molar (%) de prolina en el sustrato proteico.
19. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en el que al menos se usan 150 mili-unidades de endoproteasa específica de prolina por gramo de sustrato, preferiblemente al menos 1 unidad de endoproteasa específica de prolina.
\newpage
20. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en el que la endoproteasa específica de prolina tiene un pH óptimo por debajo de 7.
21. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, en el que se usa una endoproteasa específica de prolina de A. niger.
22. Una composición enzimática que comprende una endoproteasa específica de prolina, siendo capaz la composición de producir un hidrolizado de proteínas que comprende péptidos, en el que la fracción molar de péptidos (%) que poseen una prolina carboxi terminal es al menos dos veces la fracción molar (%) de prolina en la proteína o un hidrolizado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, con lo que la endoproteasa específica de prolina tiene un peso molecular de 66,6 kDalton, un IEP de pH 4,2 y pH óptimo de 5,0.
23. Una composición enzimática según la reivindicación 22, en la que la composición comprende además al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en subtilisina y carboxipeptidasa.
24. Un producto alimentario que comprende un hidrolizado de proteínas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 u obtenible mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21.
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