ES2301624T3 - Uso combinado de polipeptidos de factor vii y polipeptidos de factor viii. - Google Patents
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Abstract
Composición farmacéutica comprendiendo: (a) una preparación de factor VIIa humano o una variante de aminoácido de factor VIIa humano que tiene no más de 20 aminoácidos sustituidos, deleccionados o insertados en comparación con el factor VIIa de tipo salvaje, y (b) una preparación de factor VIII humano o una forma truncada de factor VIII humano, donde (a) y (b) son los únicos agentes hemostáticos de la composición.
Description
Uso combinado de polipéptidos de factor VII y
polipéptidos de factor VIII.
La invención se refiere a una composición
farmacéutica que comprende una preparación de un polipéptido del
factor VII o relacionado con el factor VII y una preparación de un
polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VIII. La
invención también se refiere a un kit de piezas para el tratamiento
de hemorragias que comprende una preparación de un polipéptido del
factor VI o relacionado con el factor VII y una preparación de un
polipéptido del factor VIII o relacionado con el factor VIII. La
invención también se refiere al uso de una preparación de un
polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII y una
preparación de un polipéptido del factor VIII o relacionado con el
factor VIII para la preparación de un medicamento. Además, la
invención se refiere a métodos para tratar hemorragias, reducir el
tiempo de coagulación, aumentar la hemostasis, reducir el número de
administraciones de proteína de factor de coagulación necesarias
para obtener la hemostasis, reducir la cantidad de proteína de
factor de coagulación administrada necesaria para obtener la
hemostasis, prolongar el tiempo de tisis del coágulo, aumentar la
resistencia del coágulo, y aumentar la formación del coágulo de
fibrina.
El Factor de coagulación sanguínea VII (FVII) es
un factor de coagulación del plasma. El Factor VII activado (FVIIa)
inicia el proceso hemostático normal formando un complejo con el
factor tisular (TF), expuesto como resultado del daño en la pared
del vaso, que posteriormente activa los factores IX y X (FIX y FX)
en sus formas activadas, los factores IXa y Xa (FIXa y FXa). El
Factor Xa convierte cantidades limitadas de protrombina en trombina
en la célula portadora del factor tisular. La trombina activa las
plaquetas y los factores V y VIII en los factores Va y VIIIa (FVa y
FVIIIa), ambos cofactores en el proceso posterior conduciendo a la
explosión de trombina total. Este proceso incluye la generación de
Factor Xa por el factor IXa (en complejo con el factor VIIIa) y
ocurre en la superficie de las plaquetas activadas. La trombina
finalmente convierte el fibrinógeno en fibrina dando como resultado
la formación de un coágulo de fibrina.
El Factor VII existe en el plasma principalmente
como un zimógeno monocatenario, que es dividido por FXa en su forma
bicatenaria, activada, FVIIa. El factor activado VII recombinante
(rFVIIa) ha sido desarrollado como un agente prohemostático. La
administración de rFVIIa ofrece una respuesta prohemostática rápida
y altamente eficaz en sujetos hemofílicos con hemorragias que no
pueden ser tratadas con productos del factor de coagulación debido
a la formación de anticuerpos. También los sujetos sangrantes con
deficiencia de factor VII o los sujetos que tienen un sistema de
coagulación normal pero que experimentan una hemorragia excesiva
pueden ser tratados exitosamente con FVIIa. En estos estudios, no
se han encontrado efectos secundarios desfavorables de rFVIIa (en
particular, la incidencia de tromboembolia).
El factor de coagulación sanguínea VIII es una
glicoproteína (PM 330.000) que circula en la sangre. Es segregada
por el hígado y el endotelio y segregada en el plasma donde circula
como un complejo con factor de von Willebrand. El Factor VIII
funciona como un cofactor en la coagulación sanguínea en el que
acelera la conversión de factor X a Factor Xa en presencia del
factor IXa, calcio y fosfolípido. Aunque se sintetiza como una única
cadena de polipéptidos, circula en el plasma principalmente como
una molécula bicatenaria. La activación de FVIII en un cofactor
activo requiere proteólisis adicional por la trombina o alguna otra
proteasa. Una reducción en presencia o actividad del factor VIII en
el flujo sanguíneo conduce a hemofilia A. El nivel de la reducción
en la actividad del factor VIII es directamente proporcional a la
gravedad de la enfermedad. El tratamiento actual de la hemofilia A
consiste en la sustitución de la proteína que falta por el factor
VII plasmático o recombinante (denominado tratamiento o terapia de
sustitución FVIII o de reemplazo).
Las deficiencias de factor de coagulación (p.
ej., deficiencia de FVIII) refleja diferentes tipos de defectos
genéticos. Cuando la lesión genética es severa, tal como, defección
o desvío del marco, el ARNm no es producido y resulta en una
deficiencia (severa). Las lesiones genéticas menos severas de, por
ejemplo, mutaciones puntuales que no están crucialmente localizadas
resultan en la secreción de proteína con actividad biológica
reducida. El modelo de herencia es recesivo y enlazado en X, lo que
significa que sólo los hombres que tienen un cromosoma X están
afectados. La gravedad de la falta de coagulación puede ser suave o
severa. La gravedad depende de la concentración de factor VIII que
funciona normalmente en el plasma. El objetivo de la terapia de
sustitución es aumentar el nivel de la actividad del factor de
coagulación del paciente (de ahora en adelante llamado el "nivel
de factor") a un nivel que logre la hemostasis y mantenerlo
hasta que la curación sea sustancialmente completa. Si la
iniciación del tratamiento eficaz es retrasada, la curación de una
herida puede ser perjudicada y se requerirá más tratamiento que el
usual. La cantidad de tratamiento depende de la concentración del
factor de coagulación en el plasma necesitada para la hemostasis,
la recuperación en la sangre y la vida media del material
transfundido.
El nivel de factor VIII puede también ser
reducido en mayor o menor medida en algunos sujetos (p. ej., en
mujeres que son portadoras de la enfermedad) que son heterozigotas
para el defecto genético. Estos sujetos pueden tener una tendencia
a la hemorragia aumentada comparable a la de los pacientes
medianamente afectados por la hemofilia y pueden ser tratados en
consecuencia.
Algunos pacientes que reciben la terapia de
sustitución del factor VIII (con hemofilia A) desarrollan
anticuerpos contra el factor VIII administrado. No obstante, las
personas que nacen con un nivel normal de factor VIII (que no
tienen una deficiencia de factor VIII congénita) por razones
desconocidas pueden desarrollar más tarde en la vida
auto-anticuerpos contra el factor VIII (hemofilia A
adquirida). En ambos casos los anticuerpos pueden estar presentes
en títulos bajos, medios o altos. En el caso de pacientes que tienen
un título de inhibidor bajo o medio, pueden a veces ser tratados
con factor VIII.
La hemofilia ocurre en todos los grados de
gravedad. El paciente con factor VIII no detectable o inferior al
1% es normalmente seriamente afectado y sangra en músculos y
articulaciones con el mínimo traumatismo y a veces aparentemente de
forma espontánea. Una pequeña cantidad de factor VIII proporciona
una protección considerable de modo que los pacientes con el
1-5% de factor VIII de nivel normal normalmente
sufrirán sólo una hemorragia postraumática y una hemorragia menos
severa en músculos y articulaciones, etc., y se considera
frecuentemente que se ven afectados moderadamente. Los pacientes
con más del 5% de factor VIII normalmente sangran sólo después de
un traumatismo significante o cirugía y se considera frecuentemente
que se ven ligeramente afectados. Se debe tener en cuenta que esta
clasificación no es siempre válida en casos individuales. Algunos
pacientes con niveles muy bajos de factor VIII raramente sangran
mientras que otros incluso con más del 5% de factor VIII pueden
sangrar reiteradamente en la "articulación diana" dañada
originalmente por una hemartrosis traumática y resultan ser
"severamente" afectados. Como una generalización, no obstante,
los síntomas de hemorragia son menos obvios con niveles de factor
más altos de modo que una hemorragia anormal normalmente no
ocurrirá a niveles de factor VIII sobre un 35-40%
del nivel normal. La correlación general entre los niveles de factor
y los síntomas de la hemofilia A está mostrada más
abajo.
abajo.
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\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento actual de la hemofilia A consiste
en la sustitución de la proteína que falta por factor VIII de
origen plasmático o recombinante. Los productos del Factor VIII son
usados como infusión I.V. (o inyección) para tratar hemorragias
agudas a la presentación. Los tipos de hemorragias están
catalogados como sigue:
- 1.
- Hemartrosis (hemorragia en articulaciones).
- 2.
- Hemorragias que amenazan la integridad física (hemorragias retroperitoneales, hemorragias en el CNS, hemorragias retrofaríngeas, hemorragias musculares con síndrome de compartimiento y hemorragias GI masivas).
- 3.
- Prevención de hemorragia relacionada con la cirugía (procedimientos ortopédicos electivos, cirugía de emergencia).
La experiencia ha demostrado que si los niveles
de factor VIII son mantenidos encima de un 30-40%
del nivel normal hasta que la cicatrización sea completa, entonces
la hemostasis normal se mantiene normalmente. No obstante otras
consideraciones son también importantes. El movimiento de las zonas
afectadas tales como una hemartrosis, toser o caminar después de la
cirugía abdominal puede generar la hemorragia. La fisioterapia o
manipulación puede requerir más bien niveles altos mientras que la
inmovilización de lesiones medias pueden permitir controlar la
hemorragia con niveles de factor relativamente bajos. Los niveles
diana aproximados que pueden ser deseados en varias situaciones
están mostrados abajo:
\newpage
Tratamiento de hemartrosis estándar
(categoría 1):
- El intento normal es conseguir una concentración inicial de factor VIII en el plasma de al menos un 30 - 40% del nivel normal seguido de una concentración en el plasma de al menos un 10 - 20% del nivel normal durante 2 - 3 días.
Tratamiento de hemorragias que amenazan la
integridad física (categoría 2):
- El intento normal es conseguir una concentración inicial de factor VIII en el plasma de al menos 50% seguida de una concentración en el plasma de al menos un 20% durante una semana.
Prevención de la hemorragia relacionada con
la cirugía (categoría 3):
- El intento normal es conseguir una concentración de factor VIII en el plasma de al menos 60 - 100% en el día de la cirugía seguido de una concentración en el plasma de al menos un 30 - 40% desde el día 2 a 7 y continuando con una concentración en el plasma de al menos un 10 - 20% durante una a dos semanas.
Siguiendo las pautas anteriores para el
tratamiento, se puede constatar lo siguiente a partir del número de
inyecciones de factor VIII con respecto a los tipos de
hemorragias.
Con una vida media promedio de factor VIII en el
plasma de 10-12 horas las siguientes cantidades
promedio de inyecciones de factor VIII por episodio de hemorragia
son normalmente usadas en la praxis clínica:
- Hemartrosis (hemorragia en articulaciones): tratamiento en casa, hemartrosis menor: 1-3 inyecciones; Tratamiento en hospital, hemartrosis mayor: 6 -14 inyecciones.
- Hemorragias que amenazan la integridad física: 10 - 20 inyecciones.
- Prevención de hemorragia relacionada con la cirugía: 30 - 40 inyecciones.
En el tratamiento clínico de la hemofilia, se
usa FVIIa actualmente para detener las hemorragias en pacientes con
inhibidores para FVIII o FIX (que impide la terapia de
sustitución). No obstante, los especialistas clínicos internos
normalmente no usan FVIIa como tratamiento de primera línea para
hemofílicos sin inhibidores (donde FVIII o FIX, respectivamente,
pueden ser usados) porque está previsto que la corta vida media del
factor VIIa en comparación con la del factor VIII (2,5 horas en
comparación con 10-12 horas) requeriría inyecciones
de factor VIIa más frecuentes para mantener un nivel determinado de
capacidad hemostática.
La Patente Europea No. 225.160 (Novo Nordisk) se
refiere a las composiciones de FVIIa y métodos para el tratamiento
de trastornos hemorrágicos no provocados por los defectos del
factor de coagulación o por los inhibidores del factor de
coagulación.
La Patente Europea No. 82.182 (Baxter Travenol
Lab.) se refiere a una composición de factor VIIa para el uso para
contrarrestar las deficiencias de factores de coagulación sanguínea
o los efectos de los inhibidores para los factores de coagulación
sanguínea en un sujeto.
Lusher et al., Haemophilia, 1998, 4.
págs.790-798 se refiere a la administración de
factor recombinante VIIa en el tratamiento de hemorragias en
articulaciones, músculos y mucocutáneas en personas con hemofilia A
y B, con y sin inhibidores.
Kjalke et al, Thrombosis and Haemostasis,
1999 (Suppl), 095 1 se refiere a la administración de FVIIa extra
exógeno y el efecto en la formación de trombina en la superficie de
las plaquetas activada en un sistema modelo que imita las
condiciones de la hemofilia A o B.
La patente estadounidense No. 5,891,843 (Immuno)
se refiere a una composición de FVIIa en combinación con un segundo
ingrediente que tiene actividad de FEIB, p. ej., protrombina
activada compleja o una preparación de FEIBA.
Actualmente, muchos productos del factor VIII
usados en el tratamiento de la hemofilia contienen factor VIII
producido por recombinación. No obstante, los productos pueden
también haber sido aislados del plasma humano o porcino. Estos
productos purificados frecuentemente contienen cantidades
inferiores de otros factores de coagulación u otros componentes del
plasma. Normalmente, estos componentes adicionales del plasma son
indeseados (debido al riesgo de infección vírica u otra
contaminación), y la sustitución por parte de tales productos con
una proteína recombinante (p. ej., factor VIIa) se considerará una
mejora de la composición y del tratamiento y un beneficio para el
paciente.
Actualmente, los sujetos con un nivel reducido
de factor VIII (p. ej., pacientes con hemofilia A) que experimentan
crisis de hemorragia son generalmente tratados con diferentes
inyecciones, o infusiones, de factor VIII antes de que la
hemorragia sea detenida. Además, un número considerable de
inyecciones es necesario para mantener la hemostasis hasta que la
herida que provoca la hemorragia haya cicatrizado
completamente.
Las víctimas de traumatismos, que sufren
hemorragias excesivas, son generalmente tratadas con volúmenes de
infusión grandes de fluidos, tales como fluidos para la inyección
intravenosa (i.v.), productos de infusión de coloides, albúmina,
concentrados de glóbulos rojos, etc. Las hemorragias extensas que
requieren transfusiones de sangre masivas pueden llevar al
desarrollo de fallos en los órganos múltiples incluso a una función
del pulmón y del riñón
perjudicada.
perjudicada.
Una detención más rápida de las hemorragias
sería un beneficio importante para estos sujetos. De la misma
manera lo sería una reducción en el número de inyecciones
necesarias para detener la hemorragia y mantener la hemostasis y/o
una reducción en la cantidad de uso de la proteína de coagulación
para detener la hemorragia y para mantener la hemostasis.
Hay además una necesidad en la técnica de un
tratamiento mejorado de los sujetos que experimentan hemorragias,
incluso de sujetos en quienes las hemorragias se deben a un nivel
reducido de factor VIII de la coagulación. Sigue habiendo una
necesidad en la técnica de métodos fiables y ampliamente aplicables
y mejorados de aumentar la coagulación, aumentar o asegurar la
formación de tapones hemostáticos estables, aumentar la conveniencia
de aumentar para el sujeto tratado, o realizar la hemostasis
completa o suficiente en sujetos, en particular en sujetos con una
generación de trombina perjudicada. Hay también una necesidad de
métodos donde la cantidad de FVIIa o la cantidad de FVIII
necesitada para realizar una hemostasis completa o suficiente es
reducida. Hay también una necesidad de métodos donde la cantidad
total de proteína de factor de coagulación necesitada para realizar
una hemostasis completa o suficiente es reducida y los métodos
donde el tiempo hasta la detención de la hemorragia es
reducido.
reducido.
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer aspecto la invención se refiere a
una composición farmacéutica comprendiendo (a) una preparación de
factor VIIa humano o una variante de aminoácido de factor VIIa
humano que tiene no más de 20 aminoácidos sustituidos,
deleccionados o insertados en comparación con el factor VIIa tipo
salvaje; y (b) una preparación de factor VIII humano o una forma
truncada de factor VIII humano; donde (a) y (b) son los únicos
agentes hemostáticos de la composición.
En un segundo aspecto la invención se refiere a
un kit de piezas que comprende
- a)
- una cantidad eficaz de una preparación de factor VIIa humano o una variante de aminoácido del factor VIIa humano que tiene no más de 20 aminoácidos sustituidos, deleccionados o insertados en comparación con el factor VIIa tipo salvaje; y un portador farmacéuticamente aceptable en una primera forma de dosificación unitaria;
- b)
- una cantidad eficaz de una preparación de factor VIII humano o una forma truncada de factor VIII humano, y un portador farmacéuticamente aceptable en una segunda forma de dosificación unitaria; y
- c)
- medios de contención para contener dicha primera y segunda formas de dosificación;
donde (a) y (b) son los únicos
agentes hemostáticos del
kit.
En otro aspecto la invención se refiere al uso
de una preparación de (a) factor VIIa humano o una variante de
aminoácido de factor VIIa humano que tiene no más de 20 aminoácidos
sustituidos, deleccionados o insertados en comparación con el factor
VIIa de tipo salvaje; en combinación con una preparación de (b)
factor VII humano o una forma truncada del factor VIII humano; como
los únicos agentes hemostáticos para la producción de un
medicamento para tratar hemorragias en un sujeto.
En una forma de realización la proporción entre
la actividad de la variante del factor VIIa y la actividad del
factor VIIa humano nativo (FVIIa tipo salvaje) es al menos
aproximadamente 1,25 cuando se evalúa en el "Ensayo de hidrólisis
In Vitro" como se describe en la presente descripción.
En otra forma de realización el factor VIIa
humano es el factor VIIa humano recombinante y en otra forma de
realización adicional el factor VIIa humano es el factor Vil
plasmático.
En otra forma de realización el factor VIII
humano es el factor VIII recombinante y en otra forma de
realización el polipéptido del factor VIII humano es el factor VIII
plasmático. En una serie de formas de realización de la invención
el factor VIII humano está en su forma activada. En una forma de
realización el factor VIII es un fragmento del factor VIII.
En una forma de realización el polipéptido del
factor VIIa humano y el polipéptido del factor VIII humano están
presentes en una proporción por masa de entre aproximadamente 100:1
y aproximadamente 1:100 factor VII:factor VIII.
\newpage
Las variantes del factor VIIa humano serán
variantes de secuencias que no tengan más de 20 aminoácidos
sustituidos, deleccionados o insertados en comparación con el
factor VIIa de tipo salvaje (es decir, un polipéptido que tenga la
secuencia de aminoácidos descrita en la patente estadounidense No.
4,784,950), en otra forma de realización, las variantes del factor
VIIa no tienen más de 15 aminoácidos sustituidos, deleccionados o
insertados; en otra forma de realización, las variantes del factor
VIIa no tienen más de 10 aminoácidos sustituidos, deleccionados o
insertados; en otra forma de realización, las variantes del factor
VIaI no tienen más de 8 aminoácidos sustituidos, deleccionados o
insertados; en otra forma de realización, las variantes del factor
VIIa no tienen más de 6 aminoácidos sustituidos, deleccionados o
insertados; en otra forma de realización, las variantes del factor
VIIa no tienen más de 5 aminoácidos sustituidos, deleccionados o
insertados; en otra forma de realización, las variantes del factor
VIIa no tienen más de 3 aminoácidos sustituidos, deleccionados o
insertados en comparación con el factor VIIa de tipo salvaje. En
una forma de realización, las variantes del factor VIIa son
seleccionadas de la lista de L305V-FVIIa,
L305V/
M306D/D309S-FVIIa, L3051-FVIIa, L305T-FVIIa, F374P-FVIIa, V158T/M298Q-FVIIa, V158D/E296V/M298Q-FVIIa, K337A-FVIIa, M298Q-FVIIa, V158D/M298Q-FVIIa, L305V/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, y S336G-FVII.
M306D/D309S-FVIIa, L3051-FVIIa, L305T-FVIIa, F374P-FVIIa, V158T/M298Q-FVIIa, V158D/E296V/M298Q-FVIIa, K337A-FVIIa, M298Q-FVIIa, V158D/M298Q-FVIIa, L305V/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, y S336G-FVII.
Las variantes del factor VIIa tienen actividad
independiente del factor tisular aumentada en comparación con el
factor VIIa nativo de la coagulación humana. La actividad aumentada
no está acompañada por cambios en la especificidad del sustrato. La
unión de las variantes del factor VIIa al factor tisular no debería
ser perjudicada y las variantes del factor VIIa deberían tener al
menos la actividad del factor VIIa de tipo salvaje al unirse al
factor tisular.
El tiempo de coagulación es reducido en la
sangre de mamífero. En una forma de realización, la hemostasis es
mejorada en la sangre de mamífero. En otra forma de realización, el
tiempo de tisis del coágulo es prolongado en la sangre de mamífero.
En otra forma de realización, la resistencia del coágulo es
aumentada en la sangre de mamífero. En otra forma de realización, la
formación de coágulos de fibrina es mejorada en la sangre de
mamífero. En una forma de realización, la sangre de mamífero es
sangre humana. En otra forma de realización, la sangre de mamífero
es sangre normal; en otra forma de realización, la sangre de
mamífero es sangre con un nivel normal de proteínas de factor de
coagulación; en otra forma de realización, la sangre de mamífero es
sangre con un nivel normal de factor VIII; en otra forma de
realización, la sangre es sangre humana normal; en una forma de
realización, la sangre es sangre de un sujeto con una generación de
trombina perjudicada. En una forma de realización, la sangre es
sangre de un sujeto con una deficiencia de uno o más factores de
coagulación; en otra forma de realización, la sangre es sangre de
un sujeto que tiene inhibidores contra uno o más factores de
coagulación. En una forma de realización, la sangre es de un sujeto
con una concentración reducida de fibrinógeno. En una forma de
realización, la sangre es sangre humana deficitaria de factor
VIII.
Los polipéptidos del factor VIa humano y del
factor VIII humano son los únicos agentes hemostáticos empleados.
"Únicos" agentes o factores según se utiliza en este caso se
refiere a situaciones donde el polipéptido del factor VII o
relacionado con el factor VII y el polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII, juntos, son los únicos agentes
hemostáticos, agentes hemostáticos activos, o factores de
coagulación, según sea aplicable, contenidos en la composición o
kit farmacéutico, o son los únicos agentes hemostáticos, agentes
hemostáticos activos, o factores de coagulación, según sea
aplicable, administrados al paciente en el transcurso de un
tratamiento particular, tal como, p. ej., en el transcurso de una
hemorragia particular. Se entenderá que estas situaciones
comprenden aquellas en las que otros agentes hemostáticos o
factores de coagulación, según sea aplicable, no están presentes en
cualquier cantidad o actividad suficiente para influir
significativamente en uno o más parámetros de coagulación.
En otra forma de realización, la composición
farmacéutica es formulada para la administración intravenosa. En
una forma de realización, la composición adicional contiene un
excipiente farmacéutico aceptable.
En una forma de realización de la invención, la
composición está en forma monodosis donde la forma monodosis
contiene ambos factores de coagulación. En una forma de realización
de la invención, la composición está en forma de un kit de piezas
que comprende (a) una preparación de factor VIIa humano o una
variante de aminoácido del factor VIIa humano que no tiene más de
20 aminoácidos sustituidos deleccionados o insertados en comparación
con factor VIIa de tipo salvaje; y
(b) una preparación de factor VIII humano o una
forma truncada de factor VIII humano.
En una forma de realización de la invención, el
factor VIIa humano o una variante del aminoácido del factor VIIa
humano que no tiene más de 20 aminoácidos sustituidos,
deleccionados o insertados en comparación con el factor VIIa de
tipo salvaje; y el factor VIII humano o una forma truncada del
factor VIII humano son administrados en forma de monodosis. En otra
forma de realización de la invención, el factor VIIa humano o una
variante del aminoácido del factor VIIa humano que no tiene más de
20 aminoácidos sustituidos, deleccionados o insertados en
comparación con el factor VIIa de tipo salvaje y el factor VIII
humano o una forma truncada del factor VIII humano son
administrados en forma de una primera forma de dosificación unitaria
que comprenden el factor VIIa humano o una variante del aminoácido
del factor VIIa humano que no tienen más de 20 aminoácidos
sustituidos, deleccionados o insertados en comparación con el
factor VIIa de tipo salvaje y una segunda forma de dosificación
unitaria que comprende el factor VIII humano o una forma truncada
del factor VIII humano.
En una forma de realización de la invención, el
polipéptido del factor VIIa humano y el polipéptido del factor VIII
humano son administrados simultáneamente. En otra forma de
realización, el polipéptido del factor VIIa humano y el polipéptido
del factor VIII humano son administrados consecutivamente. En una
forma de realización, el polipéptido del factor VIIa humano y el
polipéptido del factor VIII humano son administrados con un espacio
temporal de no más de 15 minutos, preferiblemente 10, más preferido
5, más preferido 2 minutos. En una forma de realización, el
polipéptido del factor VIIa humano y el polipéptido del factor VIII
humano son administrados con un espacio temporal de hasta 2 horas,
preferiblemente de 1 a 2 horas, más preferido hasta 1 hora, más
preferido de 30 minutos a 1 hora, más preferido hasta 30 minutos,
más preferido de 15 a 30 minutos.
En una forma de realización, la cantidad eficaz
del polipéptido del factor VIIa humano es una cantidad de
aproximadamente 0,05 mg/día a aproximadamente 500 mg/día (sujeto de
70 kg). En una forma de realización, la cantidad eficaz de una
preparación de un polipéptido del factor VIII humano es de
aproximadamente 0,01 mg/día a aproximadamente 500 mg/día (sujeto de
70 kg).
En una forma de realización, el polipéptido del
factor VIIa humano y el polipéptido del factor VIII humano están
presentes en una proporción por masa de entre aproximadamente 100:1
y aproximadamente 1:100 factor VII:factor VIII.
En una forma de realización de la presente
invención, la composición farmacéutica está en forma de monodosis y
consiste esencialmente en una preparación del factor VIIa humano o
una variante del aminoácido del factor VIIa humano que no tiene más
de 20 aminoácidos sustituidos, deleccionados o insertados en
comparación con el factor VIIa de tipo salvaje; y el factor VIII
humano o una forma truncada del factor VIII humano y uno o más de
los componentes seleccionados de la lista de excipientes o
portadores farmacéuticos aceptables, estabilizadores, detergentes,
sales neutras, antioxidantes, conservantes, e inhibidores de la
proteasa.
En otra forma de realización, el sujeto es un
humano; en otra forma de realización, el sujeto tiene una
generación de trombina perjudicada; en una forma de realización, el
sujeto tiene una concentración en plasma reducida de fibrinógeno
(p. ej., un sujeto multitransfundido); en una forma de realización,
el sujeto tiene una concentración en plasma reducida de factor
VIII.
En una forma de realización, la composición
farmacéutica es para el tratamiento en casa.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
de una preparación de factor VIIa humano o una variante del
aminoácido del factor VIIa humano que no tiene más de 20
aminoácidos sustituidos, deleccionados o insertados en comparación
con el factor VIIa de tipo salvaje; y el factor VIII humano o una
forma truncada del factor VIII humano para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de hemorragias en un sujeto que
padece de un síndrome del factor VIII.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
de una preparación de factor VIIa humano o una variante de
aminoácido de factor VIIa humano que no tiene no de 20 aminoácidos
sustituidos, deleccionados o insertados en comparación con el
factor VIIa de tipo salvaje; y el factor VIII humano o una forma
truncada del factor VIII humano para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de hemorragias en un sujeto que
tiene un nivel reducido de factor VIII.
En una forma de realización, el sujeto para ser
tratado tiene un nivel reducido de factor VIII. En una forma de
realización el sujeto padece un factor sensible al síndrome VIII.
En una forma de realización, el síndrome sensible del factor VIII
es la hemofilia A.
En una forma de realización, el factor VIIa es
el factor VIIa recombinante humano (rFVIIa). En otra forma de
realización, el rFVIIa es NovoSeven® (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd,
Dinamarca).
En una forma de realización, el factor VIII es
el factor VIII recombinante humano (rFVIII). En otra forma de
realización, el producto del factor VIII es ReFacto (AHP/Genetics
Institute), Alphanate (Alpha), Bioclate (Aventis),
Monoclate-P (Aventis), Helixate (Aventis),
Recombinate (Baxter), Hemofil M (Baxter), Kogenate (Bayer),
Nordiate (HemaSure), FACTEUR VIII- LFB (Laboratoire Francais du
Fractionnement et des Biotechnologies (LFB)), Hyate:C (Speywood), y
Kogenate SF (Bayer).
En una forma de realización, la composición
farmacéutica está formulada para la administración intravenosa. En
una forma de realización, la composición además comprende un
inhibidor del sistema fibrinolítico, que incluye, sin limitación,
aprotinina, ácido aminocaproico o ácido tranexámico.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: el efecto de reducción de coágulos de
rFVIIa en ausencia y presencia de FVIII en plasma deficitario en
FVIII está mostrada en la figura 1.
\newpage
Figura 2: el efecto de reducción de coágulos de
rFVIIa en ausencia y en presencia de FVIII en el plasma humano
normal está mostrado en la figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sujetos, que sangran excesivamente en
asociación con la cirugía o traumatismos mayores que por lo tanto
precisan transfusiones de sangre, desarrollan más complicaciones
que aquellos que no experimentan ninguna hemorragia. No obstante,
también las hemorragias moderadas pueden llevar a complicaciones si
requieren la administración de sangre humana o productos sanguíneos
(plaquetas, leucocitos, concentrados plasmáticos para el
tratamiento de defectos de coagulación, etc.) porque esto está
asociado con el riesgo de transmitir virus humanos (p. ej.,
hepatitis, VIH, parvovirus, u otros virus hasta ahora desconocidos)
al igual que agentes patógenos no víricos. Las hemorragias extensas
que requieren transfusiones de sangre masivas pueden llevar al
desarrollo de fallos en los órganos múltiples incluyendo un
funcionamiento del pulmón y del riñón perjudicado. Una vez que un
sujeto ha desarrollado estas complicaciones serias se inicia una
cascada de eventos que implican varias citoquinas y reacciones
inflamatorias volviendo difícil cualquier tratamiento y
desafortunadamente frecuentemente sin éxito. En consecuencia, un
objetivo más importante en cirugía al igual que en el tratamiento
del daño tisular mayor es evitar o minimizar la hemorragia. Para
evitar o minimizar tales hemorragias indeseadas es importante
asegurar la formación de tapones hemostáticos estables y sólidos
que no son fácilmente disueltos por enzimas fibrinolíticas. Además,
es importante asegurar una formación rápida y eficaz de tales
tapones o coágulos.
Los sujetos con trombocitopenia (recuento o
actividad de plaquetas reducidos) también tiene una generación de
trombina perjudicada al igual que una estabilización defectuosa de
los tapones de fibrina dando como resultado tapones hemostáticos
propensos a la disolución prematura. Además, los sujetos sometidos
a un traumatismo mayor o a un daño en los órganos y que, como
consecuencia, han obtenido transfusiones de sangre frecuentes tienen
a menudo recuentos plaquetarios reducidos al igual que niveles
reducidos de fibrinógeno, factor VIII, y otras proteínas de
coagulación. Estos sujetos experimentan una generación perjudicada
(o reducida) de trombina. Estos sujetos, en consecuencia, tienen
una hemostasis defectuosa, o menos eficaz, conduciendo a la
formación de tapones de fibrina que son fácilmente y prematuramente
disueltos por enzimas proteolíticas, tales enzimas además siendo
extensivamente liberadas en situaciones caracterizadas por un
traumatismo extensivo y daño en los órganos.
Un paciente que experimenta una pérdida de
sangre más importante se vuelve clínicamente inestable. Estos
pacientes están en riesgo de experimentar una fibrilación atrial,
que puede conducir a una parada fatal de la actividad cardíaca;
función renal perjudicada; o extravasaciones de fluido en pulmones
(denominado "pulmones húmedos" o ARDS).
Las hemorragias en tejidos pueden también llevar
a la formación de hematomas. Los tamaños de los hematomas (en
particular intracraneales y espinales) están muy correlacionados
hasta el punto de la pérdida de la función neurológica,
dificultades de rehabilitación, y/o gravedad y grado de deterioros
permanentes de la función neurológica después de la rehabilitación.
Las consecuencias más severas de los hematomas se ven cuando están
localizados en el cerebro donde pueden incluso producir la muerte
del paciente. El denominado síndrome de compartimiento es una
condición clínica provocada por una fuerte hemorragia interna en
una extremidad. En brazos y piernas, en músculos y huesos están
confinados externamente por una hoja de colágeno casi inelástica
llamada la fascia. La hemorragia en los espacios confinados por la
fascia conducirá a una presión aumentada en este compartimiento y a
una presión posterior en los nervios, vasos y tejidos musculares,
provocando por tanto una necrosis extensa del tejido si no se trata
inmediatamente. En el caso de formarse el tejido necrótico se
transformará en gran medida, durante la cicatrización, en tejido
conjuntivo, que se contrae en comparación con el tejido muscular
original. Tales contracturas vuelven propenso al sujeto para
experimentar una motilidad perjudicada de las articulaciones
afectadas conduciendo otra vez a la necesidad de cirugía
correctiva. Los hematomas severos pueden conducir además a la
formación de pseudo quistes que pueden ser comparados con los
tumores benignos en los que este tipo de quistes, como los tumores,
deterioran el músculo o los tejidos óseos afectados. Nuevamente, la
cirugía es necesaria para eliminar tales pseudo
quistes.
quistes.
La formación de hematomas además aumenta la
frecuencia de infecciones en un sujeto. Así como la infusión de
productos sanguíneos tales como, p. ej., los glóbulos rojos. Las
infusiones de glóbulos rojos llevan a un riesgo de formación de
anticuerpos en el sujeto. Una vez formados los anticuerpos para los
antígenos de grupo sanguíneo, la transfusión del sujeto es difícil,
como será aún más difícil de encontrar grupos sanguíneos
adecuados.
Por tanto, los objetivos más importantes en el
tratamiento de hemorragias son obtener hemostasis en un mínimo de
tiempo, manteniendo así la pérdida de sangre en un mínimo.
La presente invención proporciona así
composiciones, usos y métodos de tratamiento provechosos para el
tratamiento de hemorragias en sujetos en necesidad de tal
tratamiento. Las composiciones, usos y métodos pueden estar
asociados a efectos provechosos tales como la obtención de una
pérdida de sangre inferior antes de la hemostasis, menor cantidad
de sangre necesitada durante cirugía, presión sanguínea mantenida a
un nivel aceptable hasta la obtención de la hemostasis,
estabilización más rápida de la presión sanguínea, tiempo de
recuperación más corto para el paciente tratado, tiempo de
rehabilitación más corto para el paciente tratado, formación
reducida de hematomas o formación de hematomas más pequeños,
incluso de hematomas cerebrales, menor formación de pseudo quistes,
menor formación de contracturas musculares, detención más rápida de
hemorragias, reducción del número de inyecciones necesaria para
detener la hemorragia y mantener la hemostasis, reducción en la
cantidad de uso de la proteína de coagulación para detener la
hemorragia y mantener la hemostasis.
La administración de una preparación de un
polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII, p. ej.,
factor VIIa, en combinación con una preparación de un polipéptido
del factor VIII o relacionado con el factor VIII proporciona un
tiempo de coagulación reducido en comparación con el tiempo de
coagulación al administrar solamente bien el factor VIIa o bien el
factor VIII.
La administración de una preparación de un
polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII, p. ej.,
el factor VIIa, en combinación con una preparación de un
polipéptido del factor VIII o relacionado con el factor VIII
también proporciona una cantidad reducida total de uso del factor de
coagulación para detener la hemorragia y mantener la hemostasis en
un sujeto en necesidad de tal tratamiento en comparación con el uso
de proteína al administrar solamente bien el factor VIIa o bien el
factor VIII.
La administración de una preparación de un
polipéptido factor VII o relacionado con el factor VII, p. ej., el
factor VIIa, en combinación con una preparación de un polipéptido
del factor VIII o relacionado con el factor VIII también
proporciona un tiempo reducido para obtener la detención de la
hemorragia y un número reducido de inyecciones para mantener la
hemostasis en comparación con la situación al administrar solamente
bien el factor VIIa o bien el factor VIII. La administración de una
preparación de un factor VII o polipéptido relacionado con el
factor VII, p. ej., factor VIIa, en combinación con una preparación
de un factor VIII o polipéptido relacionado con el factor VIII
también proporcionará un número reducido de inyecciones para
asegurar la hemostasis completa en comparación con la situación
cuando bien el factor VIII o el factor VIIa es administrado
solo.
En pacientes que padecen hemofilia A la presente
invención proporciona un efecto provechoso de dosificación
simultánea o secuencial de una preparación de un factor VIII o de
un polipéptido relacionado con el factor VIII y una preparación de
un factor VII o polipéptido relacionado con el factor VII. La
sustitución del factor VIII de coagulación y una preparación de un
factor VII o de un polipéptido relacionado con el factor VII
inducen ambos a la detención de la hemorragia en estos grupos de
pacientes, pero tienen mecanismos diferentes bioquímicos de acción.
La dosificación simultánea aumenta el efecto hemostático.
La presente invención proporciona una
composición farmacéutica que comprende una combinación de una
preparación de un factor VII o polipéptido relacionado con el
factor VII y una preparación de un polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII. La composición puede estar en forma
de una composición individual o puede estar en forma de un kit
multicomponente (kit de piezas). La composición según la presente
invención es útil como un procoagulante terapéutico y profiláctico
en mamíferos, incluyendo los primates tales como seres humanos. La
presente invención proporciona además un método para tratar
hemorragias (incluyendo el tratamiento profiláctico o prevención)
en un sujeto, incluido un ser humano.
Siempre que, una primera o segunda o tercera,
etc., dosis unitaria es mencionada en toda esta especificación no
indica el orden preferido de administración, pero se hace
simplemente por conveniencia.
Una combinación de una preparación de un
polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII y una
preparación de un polipéptido del factor VIII o relacionado con el
factor VIII es un producto ventajoso que asegura tiempos de
coagulación cortos y formación rápida de tapones hemostáticos. Los
presentes inventores muestran que una combinación del factor VIIa y
del factor VIII pueden reducir el tiempo de coagulación en el
plasma humano normal más eficazmente que el factor VIIa o el factor
VIII solo. Por tanto, reduciendo el tiempo de coagulación se puede
obtener un tratamiento más eficaz de las hemorragias en los
sujetos. Además, los pacientes pueden ser tratados con cantidades
totales inferiores de polipéptidos del factor VII y del factor VIII
o relacionados con el factor
VIII.
VIII.
\vskip1.000000\baselineskip
En la práctica de la presente invención,
cualquier polipéptido del factor VII puede ser usado que es eficaz
para prevenir o tratar la hemorragia. Esto incluye polipéptidos del
factor VII sanguíneos o plasmáticos, o producidos por medios
recombinantes.
La presente invención incluye los polipéptidos
del factor VII, tales como, p. ej., aquellos con la secuencia de
aminoácidos descrita en la patente estadounidense No. 4,784,950
(factor VII humano de tipo salvaje). En algunas formas de
realización, el polipéptido del factor VII es el factor VIIa humano,
como se ha descrito, p. ej., en la patente estadounidense No.
4,784,950 (factor VII de tipo salvaje). En una serie de formas de
realización, los polipéptidos del factor VII incluyen polipéptidos
que presentan al menos aproximadamente el 10%, preferiblemente al
menos aproximadamente el 30%, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 50%, y más preferiblemente al menos
aproximadamente el 70%, de la actividad específica biológica del
factor VIIa humano. En una serie de formas de realización, los
polipéptidos del factor VII incluyen polipéptidos que presentan al
menos aproximadamente el 90%, preferiblemente al menos
aproximadamente el 100%, preferiblemente al menos aproximadamente
el 120%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 140%, y
más preferiblemente al menos aproximadamente el 160%, de la
actividad específica biológica del factor VIIa humano. En una serie
de formas de realización, los polipéptidos del factor VII incluyen
polipéptidos que presentan al menos aproximadamente el 70%,
preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y más
preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, de identidad con
la secuencia del factor VII de tipo salvaje, como se describe en la
patente estadounidense No.
4,784,950.
4,784,950.
Según se utiliza en este caso, "polipéptido
del factor VII" incluye, sin limitación, el factor VII, al igual
que los polipéptidos relacionados con el factor VII. El término
"factor VII" está destinado a incluir, sin limitación, los
polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos
1-406 del factor VII humano de tipo salvaje (como
se describe en la patente estadounidense No. 4,784,950), al igual
que factor VII de tipo salvaje derivado de otras especies, tales
como, p. ej., factor VII bovino, porcino, canino, murino, y de
salmón, dicho factor VII derivando de la sangre o del plasma, o
producido por medios recombinantes. Además incluye las variaciones
naturales alélicas del factor VII que pueden existir y producirse
de un individuo a otro. También, grado y ubicación de la
glicosilación u otras modificaciones post-traducción
pueden variar dependiendo de las células huéspedes elegidas y de la
naturaleza del entorno celular del huésped. El término "Factor
VII" está también destinado a incluir polipéptidos del factor
VII en su forma no dividida (zimógeno), al igual que aquellos que
han sido proteolíticamente procesados para producir sus formas
respectivas bioactivas, que pueden ser designadas como Factor VIIa.
Normalmente, el Factor VII es dividido entre los residuos 152 y 153
para producir el Factor VIIa.
"Polipéptidos relacionados con el Factor
VII" incluyen, sin limitación, polipéptidos del factor VII que
han sido modificados químicamente con respecto al factor VII humano
y/o que contienen una o más alteraciones de secuencia de
aminoácidos con respecto al factor Vil humano (es decir, variantes
del factor VII), y/o que contienen secuencias de aminoácidos
truncadas con respecto al factor VII humano (es decir, fragmentos
del factor VII). Estos polipéptidos relacionados con el factor VII
pueden presentar propiedades diferentes con respecto al factor VII
humano, incluyendo estabilidad, unión de fosfolípidos, actividad
específica alterada, y similares. El término "Polipéptidos
relacionados con el Factor VII" se destina a incluir aquellos
polipéptidos en su forma no dividida (zimógeno), al igual que
aquellos que han sido proteolíticamente procesados para producir
sus formas respectivas bioactivas, que pueden ser designadas
"polipéptidos relacionados con el factor VIIa" o
"polipéptidos relacionados con el factor VII
activado".
Según se utiliza en este caso, "Polipéptidos
relacionados con el Factor VII" incluye, sin limitación, los
polipéptidos que presentan sustancialmente la misma actividad
biológica o mejorada con respecto al factor VII humano de tipo
salvaje, al igual que los polipéptidos en los que la actividad
biológica del factor VIIa ha sido sustancialmente modificada o
reducida con respecto a la actividad del factor VIIa humano de tipo
salvaje. Estos polipéptidos incluyen, sin limitación, el factor VII
o factor VIIa que ha sido químicamente modificado y variantes del
factor VII en las que se han introducido alteraciones específicas
de la secuencia de aminoácidos que modifican o interrumpen la
bioactividad del polipéptido.
Además incluye polipéptidos con una secuencia de
aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, polipéptidos que
tienen un extremo N-terminal modificado con
defecciones o adiciones de aminoácidos N-terminales,
y/o polipéptidos que han sido químicamente modificados con respecto
al factor VIIa humano.
Los polipéptidos relacionados con el factor VII,
que incluyen variantes del factor VII, que presentan
sustancialmente la misma bioactividad o mejor que el factor VII de
tipo salvaje, o de forma alternativa, que presentan bioactividad
sustancialmente modificada o reducida con respecto al factor VII de
tipo salvaje, incluyen, sin limitación, polipéptidos con una
secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del factor VII
tipo salvaje por inserción, delección, o sustitución de uno o más
aminoácidos.
Los polipéptidos relacionados con el factor VII,
que incluyen las variantes, incluyen aquellos que presentan al
menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al
menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al
menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al
menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al
menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al
menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 100%, al
menos aproximadamente un 110%, al menos aproximadamente un 120%, o
al menos aproximadamente un 130%, de la actividad específica del
factor VIIa de tipo salvaje que ha sido producido en el mismo tipo
de célula, cuando se evalúa en un ensayo de coagulación o más,
ensayo de proteólisis, o ensayo de unión al TF según se ha
descrito
anteriormente.
anteriormente.
Los polipéptidos relacionados con el factor VII,
incluyendo las variantes, que tienen sustancialmente la misma
actividad biológica o mejorada con respecto al factor VIIa de tipo
salvaje incluyen aquellas que presentan al menos aproximadamente un
25%, preferiblemente al menos aproximadamente un 50%, más
preferiblemente al menos aproximadamente un 75%, más
preferiblemente al menos aproximadamente un 100%, más
preferiblemente al menos aproximadamente un 110%, más
preferiblemente al menos aproximadamente un 120%, y de la forma más
preferible al menos aproximadamente un 130% de la actividad
específica del factor VIIa de tipo salvaje que ha sido producida en
el mismo tipo de célula, evaluado en un ensayo de coagulación o
más, ensayo de proteólisis, o ensayo de unión al TF según se ha
descrito anteriormente.
\newpage
Los polipéptidos relacionados con el factor VII,
incluyendo las variantes, con actividad biológica sustancialmente
reducida con respecto al factor VIIa de tipo salvaje son aquellos
que presentan menos de aproximadamente el 25%, preferiblemente
menos de aproximadamente el 10%, más preferiblemente menos de
aproximadamente el 5% y de la forma más preferible menos de
aproximadamente el 1% de la actividad específica del factor VIIa de
tipo salvaje que ha sido producida en el mismo tipo de célula
cuando se evalúa en un ensayo de coagulación o más, ensayo de
proteólisis o ensayo de unión al TF, según se ha descrito
anteriormente. Las variantes del Factor VII que tienen una
actividad biológica sustancialmente modificada con respecto al
factor VII de tipo salvaje incluyen, sin limitación, variantes del
factor VII que presentan actividad proteolítica del Factor X
independiente del TF y aquellas que se enlazan al TF pero no
seccionan al Factor X.
En algunas formas de realización los
polipéptidos del factor VII son polipéptidos relacionados con el
Factor VII, en particular variantes, donde la proporción entre la
actividad de dicho polipéptido del factor VII y la actividad del
factor VIIa humano nativo (FVIIa de tipo salvaje) es al menos
aproximadamente 1,25 evaluado en el "Ensayo de hidrólisis in
vitro" (véase "Ensayos", más abajo); en otras formas de
realización, la proporción es al menos aproximadamente 2,0; en
formas de realización adicionales, la proporción es al menos
aproximadamente 4,0. En algunas formas de realización de la
invención, los polipéptidos del factor VII son polipéptidos
relacionados con el Factor VII, en particular variantes, donde la
proporción entre la actividad de dicho polipéptido del factor VII y
la actividad del factor VIIa humano nativo (FVIIa de tipo salvaje)
es al menos aproximadamente 1,25 evaluado en el "Ensayo de
Proteólisis in vitro" (véase "Ensayos", más abajo);
en otras formas de realización, la proporción es al menos
aproximadamente 2,0; en formas de realización adicionales, la
proporción es al menos aproximadamente 4,0; en formas de
realización adicionales, la proporción es al menos aproximadamente
8,0.
En algunas formas de realización, el polipéptido
del factor VII es el factor VII humano, como se describe, p. ej.,
en la patente estadounidense No. 4,784,950 (factor VII de tipo
salvaje). En algunas formas de realización, el polipéptido del
factor VII es el factor VIIa humano. En una serie de formas de
realización, los polipéptidos del factor VII son polipéptidos
relacionados con el Factor VII que presentan al menos
aproximadamente el 10%, preferiblemente al menos aproximadamente el
30%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, y de la
forma más preferible al menos aproximadamente el 70%, de la
actividad biológica específica del factor VIIa humano. En algunas
formas de realización, los polipéptidos del factor VII tienen una
secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del factor VII
de tipo salvaje por inserción, delección, o sustitución de uno o
más amino-
ácidos.
ácidos.
Ejemplos no limitativos de las variantes del
factor VII que tienen sustancialmente la misma actividad biológica
o mejorada que el factor VII de tipo salvaje incluyen
S52A-FVII, S60A-FVII (lino et
al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192,
1998); L305V-FVII,
L305V/M306D/D309S-FVII, L3051-FVII,
L305T-FVII, F374P-FVII,
V158T/M298Q-FVII,
V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII,
M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII,
L305V/K337A-FVII, V158D/
E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII,
K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, y S336G-FVII; las variantes de FVIIa que presentan estabilidad proteolítica aumentada como se describe en la patente estadounidense No. 5,580,560; factor VIIa que ha sido proteolíticamente dividido entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); y formas oxidadas del factor VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54: 1999). Ejemplos no limitativos de variantes del factor VII que tienen actividad biológica sustancialmente reducida o modificada con respecto al Factor VII de tipo salvaje incluyen R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Hoist et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), y factor VIIa carente del dominio Gla, (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993). Ejemplos no limitativos de polipéptidos del factor VII químicamente modificados y variantes de la secuencia están descritos, p. ej., en la patente estadounidense No. 5,997,864.
E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII,
K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, y S336G-FVII; las variantes de FVIIa que presentan estabilidad proteolítica aumentada como se describe en la patente estadounidense No. 5,580,560; factor VIIa que ha sido proteolíticamente dividido entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); y formas oxidadas del factor VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54: 1999). Ejemplos no limitativos de variantes del factor VII que tienen actividad biológica sustancialmente reducida o modificada con respecto al Factor VII de tipo salvaje incluyen R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Hoist et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), y factor VIIa carente del dominio Gla, (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993). Ejemplos no limitativos de polipéptidos del factor VII químicamente modificados y variantes de la secuencia están descritos, p. ej., en la patente estadounidense No. 5,997,864.
La actividad biológica del factor VIIa en la
coagulación sanguínea deriva de su capacidad para (i) enlazarse con
el factor tisular (TF) y (ii) catalizar el seccionamiento
proteolítico del factor IX o factor X para producir factor IX o X
activado (Factor IXa o Xa, respectivamente).
Para los fines de la invención, la actividad
biológica de los polipéptidos del factor VII ("actividad
biológica del factor VII") puede ser cuantificada midiendo la
capacidad de una preparación para promover la coagulación sanguínea
usando plasma deficitario de factor VII y tromboplastina, como se
describe, p. ej., en la patente estadounidense No. 5,997,864. En
este ensayo, la actividad biológica se expresa como la reducción en
el tiempo de coagulación con respecto a una muestra de control y se
convierte en "unidades de factor VII" por comparación con un
estándar de suero humano mezclado conteniendo 1 unidad/ml de
actividad del factor VII. De forma alternativa, la actividad
biológica del factor VIIa puede ser cuantificada mediante
- (i)
- medición de la capacidad del factor VIIa o un polipéptido relacionado con el factor VIIa para producir factor X activado (factor Xa) en un sistema comprendiendo TF introducido en una membrana lipídica y Factor X. (Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924: 1997);
- (ii)
- medición de la hidrólisis del Factor X en un sistema acuoso ("Ensayo de proteólisis In Vitro", véase más abajo);
\newpage
- (iii)
- medición de la unión física del factor VIIa o de un polipéptido relacionado con factor VIIa al TF usando un instrumento basado en la resonancia de plasmón de superficie (Persson, FEBS Lefts. 413:359-363, 1997); y
- (iv)
- medición de la hidrólisis de un sustrato sintético por factor VIIa y/o un polipéptido relacionado con el factor VIIa ("Ensayo de hidrólisis In Vitro", véase más abajo); y
- (v)
- medición de la generación de trombina en un sistema independiente del TF in vitro.
El término "actividad biológica del factor
VII" o "actividad del factor VII" se destina a incluir la
capacidad para generar trombina; el término también incluye la
capacidad para generar trombina en la superficie de las plaquetas
activadas en la ausencia del factor tisular.
Una preparación de factor VIIa que puede ser
usada según la invención es, sin limitación, NovoSeven® (Novo
Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención incluye polipéptidos del
Factor VIII, tales como, p. ej., aquellos que tienen la secuencia
de aminoácidos descrita en, p. ej., Toole et al.; Nature
1984; 312: 342-347 (factor VIII humano de tipo
salvaje).
En la práctica de la presente invención, se
puede usar cualquier polipéptido del factor VIII que sea eficaz
para prevenir o tratar la hemorragia. Esto incluye polipéptidos del
Factor VIII derivados de la sangre o del plasma, o producidos por
medios recombinantes.
Según se utiliza en este caso, "polipéptido
del factor VIII" incluye, sin limitación, el factor VIII, así
como los polipéptidos relacionados con el factor VIII. El término
"Factor VIII" se destina a incluir, sin limitación, los
polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos según se
describe en Toole et al.; Nature 1984 (véase arriba) (factor
VIII humano de tipo salvaje), al igual que el factor VIII de tipo
salvaje derivado de otras especies, tales como, p. ej., factor VIII
bovino, porcino, canino, murino, y de salmón. Además incluye
variaciones alélicas naturales del factor VIII que pueden existir y
que se producen de un individuo a otro. También, grado y ubicación
de glicosilación u otras modificaciones de
post-traducción pueden variar dependiendo de las
células huéspedes elegidas y de la naturaleza del entorno celular
del huésped. El término "Factor VIII" está también destinado a
incluir polipéptidos del Factor VIII en su forma no dividida
(zimógeno), al igual que aquellos que han sido procesados
proteolíticamente para producir sus formas respectivas bioactivas,
este factor pudiendo ser designado como
VIIIa.
VIIIa.
"Los polipéptidos relacionados con el Factor
VIII" incluyen, sin limitación, los polipéptidos del Factor VIII
que han sido modificados químicamente con respecto al factor VIII
humano y/o que contienen una o más alteraciones de la secuencia de
aminoácidos con respecto al factor VIII humano (es decir, variantes
del factor VIII), y/o que contienen secuencias de aminoácidos
truncadas con respecto al factor VIII humano (es decir, fragmentos
de factor VIII). Tales polipéptidos relacionados con el factor VIII
pueden presentar propiedades diferentes con respecto al factor VIII
humano, que incluyen estabilidad, unión de fosfolípidos, actividad
específica alterada, y similares. El término "polipéptidos
relacionados con el factor VIII" está destinado a incluir tales
polipéptidos en su forma no seccionada (zimógeno), al igual que
aquellos que han sido procesados proteolíticamente para producir
sus formas respectivas bioactivas, que pueden ser designadas
"polipéptidos relacionados con el factor VIIIa" o
"polipéptidos relacionados con el factor VIII activado".
Según se utiliza en este caso, "polipéptidos
relacionados con el Factor VIII" incluyen, sin limitación,
polipéptidos que presentan sustancialmente la misma actividad
biológica o mejorada con respecto al factor VIII humano de tipo
salvaje, al igual que los polipéptidos, en los que la actividad
biológica del factor VIII ha sido sustancialmente modificada o
reducida con respecto a la actividad del factor VIII humano de tipo
salvaje. Estos polipéptidos incluyen, sin limitación, el factor
VIII o el factor VIIIa que ha sido químicamente modificado y
variantes del factor VIII en el que las alteraciones específicas de
la secuencia de aminoácidos han sido introducidas que modifican o
interrumpen la bioactividad del polipéptido.
Además incluye polipéptidos con una secuencia de
aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, polipéptidos que
tienen un extremo N-terminal modificado incluyendo
defecciones o adiciones de aminoácidos N-terminales
y/o polipéptidos que han sido químicamente modificados con respecto
al factor VIII humano.
Los polipéptidos relacionados con el factor
VIII, incluidas las variantes de factor VIII, si presentan
sustancialmente la misma bioactividad o mejor que el factor VIII
tipo salvaje, o, de forma alternativa, presentan bioactividad
sustancialmente modificada o reducida con respecto al factor VIII de
tipo salvaje, incluyen, sin limitación, polipéptidos con una
secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del factor
VIII de tipo salvaje por inserción, delección, o sustitución de uno
o más aminoácidos.
\newpage
Los polipéptidos relacionados con el factor
VIII, incluidas las variantes, comprenden aquellos que presentan al
menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al
menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al
menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al
menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al
menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 100%, al
menos aproximadamente el 110%, al menos aproximadamente el 120%, y
al menos aproximadamente el 130%, de la actividad específica del
factor VIII de tipo salvaje que ha sido producida en el mismo tipo
de célula, al ser evaluados en el ensayo de actividad del factor
VIII como se describe en la presente descripción.
Los polipéptidos relacionados con el factor
VIII, incluidas las variantes, que tienen sustancialmente la misma
actividad biológica o mejorada con respecto al factor VIII de tipo
salvaje comprenden aquellos que presentan al menos aproximadamente
el 25%, preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 100%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 110%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 120%, y de la forma más
preferible al menos aproximadamente el 130% de la actividad
biológica específica del factor VIII humano de tipo salvaje que ha
sido producida en el mismo tipo de célula al ser evaluados en uno o
más ensayos de actividad del factor VIII específicos como se ha
descrito. Para los fines de la invención, la actividad biológica del
factor VIII puede ser cuantificada según se describe más adelante
en la presente descripción ("parte de ensayo").
Los polipéptidos relacionados con el factor
VIII, incluidas las variantes, que tienen actividad biológica
sustancialmente reducida con respecto al factor VIII de tipo
salvaje son aquellos que presentan menos de aproximadamente el 25%,
preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, más
preferiblemente menos de aproximadamente el 5% y de la forma más
preferible menos de aproximadamente el 1% de la actividad
específica del factor VIII de tipo salvaje que ha sido producido en
el mismo tipo de célula evaluado en uno o más ensayos de actividad
del factor VIII específicos como se ha descrito anteriormente.
Ejemplos no limitativos de polipéptidos del
Factor VIII incluyen factor VIII plasmático humano como se
describe, p. ej., en Fulcher et al.; Proc. Acad. Nat. Sci.
USA 1982. 79:1648-1652, y Rotblat et al.;
Biochemistry 1985; 24:4294-4300, y derivados del
FVIII de plasma porcino como se describe, p. ej., en Fass et
al.; Blood 1982; 59: 594-600 y Knutson et
al.; Blood 1982; 59: 615-624.
En algunas formas de realización el factor VIII
son polipéptidos relacionados con el factor VIII donde la
proporción entre la actividad de dicho polipéptido del factor VIII
y la actividad del factor VIII humano nativo (factor VIII tipo
salvaje) es al menos aproximadamente 1,25 evaluada en el "ensayo
cromogénico" (véase abajo); en otras formas de realización, la
proporción es al menos aproximadamente 2,0; en formas de
realización adicionales, la proporción es al menos aproximadamente
4,0.
Ejemplos no limitativos de variantes de la
secuencia del factor VIII están descritos, p. ej., en Lollar et
al.; Blood 2000; 95(2): 564-568
(polipéptidos de FVIII porcino/humano híbridos) y Lollar et
al.; Blood 2001;.-97(1): 169-174.
Los productos de FVIII comercialmente
disponibles (los denominados productos de sustitución) están
derivados del plasma mezclado normal o de líneas celulares
mamíferas creadas genéticamente. Los productos de sustitución son
frecuentemente clasificados según la pureza final, definidos como
actividad específica (unidades internacionales de actividad del
factor de coagulación por mg de proteína, Ul/mg). Los productos
intermedios tienen actividad específica relativamente baja (< 50
Ul/mg) porque estos también contienen proteínas de plasma extrañas,
tales como, fibrinógeno, fibronectina y otras proteínas no
coagulantes. La pureza elevada (>50 Ul/mg) y la pureza ultra
elevada (> 3000 Ul/mg) contienen proteínas de plasma pequeñas o
prácticamente de ningún otro tipo más que la albúmina añadida como
un estabilizador.
Ejemplos no limitativos de productos del factor
VIII comercialmente disponibles (concentrados y preparaciones) que
pueden ser usados según la presente invención son, por ejemplo, sin
limitación, ReFacto (rFVIII sin dominio B) de AHP/Genetics
Institute, Alphanate (FVIII) de Alpha, Bioclate (rFVIII) de
Aventis, Monoclate-P (factor VIII:C) de Aventis,
Helixate (rFVIII) de Aventis, Recombinate (rFVIII) de Baxter,
Hemofil M (FVIII) de Baxter, Kogenate (rFVIII) de Bayer, Nordiate
(FVIII) de HemaSure, FACTEUR VIII-LFB (FVIII basado
en plasma humano) de Laboratoire Francais du Fractionnement et des
Biotechnologies (LFB), Hiate:C (FVIII porcino) de Speywood, y
Kogenate SF (rFVIII formulado con sacarosa) de Bayer.
Ejemplos no limitativos de productos de
actividad elevada y ultra elevada son Alphanate (Alpha) (bajo);
ReFacto (AHP/Genetics Institute), Kogenate SF (Bayer), Kogenate
(Bayer), Helixate (Aventis), Recombinate (Baxter),
Monoclate-P (Aventis), Hemofil M (Baxter) (todos
ultra elevados).
En el presente contexto las indicaciones de tres
letras o de una sola letra de los aminoácidos han sido usadas en su
significado convencional como se indica en la tabla 1. A menos que
se indique explícitamente, los aminoácidos mencionados aquí son
L-aminoácidos. Debe entenderse, que la primera
letra en, por ejemplo, K337 representa el aminoácido naturalmente
presente en el factor VII de tipo salvaje en la posición indicada, y
que, por ejemplo, K337A-FVIIa designa la variante
de FVII donde el aminoácido representado por el código K de una
sola letra naturalmente presente en la posición indicada es
sustituido por el aminoácido representado por el código de una sola
letra A.
Los términos "factor VII", "Factor
VII" o "FVII" pueden ser usados de forma intercambiable.
Los términos "factor VIIa", "Factor VIIa" o "FVIIa"
pueden ser usados de forma intercambiable. Los términos "factor
VIII" o "Factor VIII" o "FVIII" pueden ser usados de
forma intercambiable.
En este contexto, "sujetos con generación de
trombina perjudicada" significa sujetos que no pueden generar
una explosión de trombina total en la superficie de las plaquetas
activadas e incluye sujetos que tienen una generación de trombina
inferior que la generación de trombina en sujetos que tienen un
sistema hemostático con un funcionamiento completamente normal,
incluyendo una cantidad normal y función de factores de coagulación,
plaquetas y fibrinógeno, e incluye, sin limitaciones, sujetos que
carecen de factor VIII; sujetos con un número reducido de plaquetas
o plaquetas con una función defectuosa (p. ej., trombocitopenia o
trombastenia de Glanzmann o sujetos con hemorragias excesivas);
sujetos que tienen niveles reducidos de protrombina, FX o FVII;
sujetos que tienen un nivel reducido de diferentes factores de
coagulación (p. ej., debido a una hemorragia excesiva como una
consecuencia de traumatismo o cirugía extensiva); y sujetos con
concentraciones de fibrinógeno en el plasma reducidas (p. ej.,
sujetos multitransfundidos).
El término "mejora del sistema hemostático"
significa una intensificación de la capacidad para generar
trombina. El término "hemostasis en aumento" se destina a
comprender las situaciones cuando la generación de trombina medida
para una muestra para ensayo que contiene una preparación de un
polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII y una
preparación de un polipéptido del factor VIII o relacionado con el
factor VIII es prolongado con respecto a la generación de trombina
individual de una muestra de control que contiene sólo el
polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII o el
polipéptido del factor VIII o relacionado con el factor VIII,
respectivamente, evaluado en el mismo ensayo de generación de
trombina. La generación de trombina puede ser evaluada según se
describe en el ensayo de generación de trombina de la presente
descripción (véase "parte de ensayo").
El tiempo de tisis del coágulo, resistencia del
coágulo, formación del coágulo de fibrina, y tiempo de coagulación
son parámetros clínicos usados para evaluar el estado del sistema
hemostático del paciente. Las muestras de sangre son extraídas del
paciente a intervalos adecuados y uno o más de los parámetros son
evaluados mediante, p. ej., tromboelastografía como se describe por,
p. ej., Meh et al.,Blood Coagulation & Fibrinolysis
2001;12:627-637; Vig et al., Hematology, Vol.
6 (3) pp. 205-213 (2001); Vig et al., Blood
coagulation & fibrinolysis, Vol. 12 (7) pp.
555-561 (2001) Oct; Glidden et al., Clinical
and applied thrombosis/hemostasis, Vol. 6 (4) pp.
226-233 (2000) Oct; McKenzie et al.,
Cardiology, Vol. 92 (4) pp. 240-247 (1999) Apr; o
Davis et al., Journal of the American Society of Nephrology,
Vol. 6 (4) pp. 1250-1255 (1995).
El término "prolongación del tiempo de tisis
del coágulo" se destina a comprender las situaciones cuando el
tiempo de tisis del coágulo medido para una muestra para ensayo que
contiene una preparación de un polipéptido del factor VII o
relacionado con el factor VII y una preparación de un polipéptido
del factor VIII o relacionado con el factor VIII es prolongado con
respecto al tiempo de Tisis del coágulo individual de una muestra
de control que contiene sólo el polipéptido del factor VII o
relacionado con el factor VII o el polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII, respectivamente, evaluado en el
mismo ensayo de Tisis del coágulo. El tiempo de tisis del coágulo
puede ser evaluado como se ha descrito anteriormente.
El término "aumento de la resistencia del
coágulo" se destina a comprender las situaciones cuando la
resistencia del coágulo medida, p. ej., fuerza mecánica, para una
muestra para ensayo que contiene una preparación de un polipéptido
del factor VII o relacionado con el factor VII y una preparación de
un polipéptido del factor VIII o relacionado con el factor VIII es
aumentada con respecto al tiempo de tisis del coágulo individual de
una muestra de control que contiene sólo el polipéptido del factor
VII o relacionado con el polipéptido del factor VII o del factor
VIII o relacionado con el factor VIII, respectivamente, evaluado en
el mismo ensayo de resistencia del coágulo. La resistencia del
coágulo puede ser evaluada como se describe, p. ej. en Carr et
al, 1991. (Carr ME, Zekert SL. Measurement of
platelet-mediated force development during plasma
clot formation. AM J MED SCI 1991; 302: 13-8), o
como se ha descrito anteriormente mediante tromboelastografía.
El término "aumento de la formación de coágulo
de fibrina" se destina a comprender las situaciones cuando el
nivel medido para o el grado de formación de coágulo de fibrina
para una muestra para ensayo que contiene una preparación de un
polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII y una
preparación de una preparación de un polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII es aumentado con respecto al nivel
individual para o el grado de formación de coágulo de fibrina de
una muestra de control que contiene sólo el polipéptido del factor
VII o relacionado con el polipéptido del factor VII o del factor
VIII o relacionado con el factor VIII, respectivamente, evaluado en
el mismo ensayo de coagulación. La formación del coágulo de fibrina
puede ser evaluada como se ha descrito anteriormente.
El término "reducción del tiempo de
coagulación" se destina a comprender las situaciones en las que
el tiempo medido para la formación de coágulos (tiempo de
coagulación) en una muestra de ensayo que contiene una preparación
de un polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII y
una preparación de una preparación de un polipéptido del factor
VIII o relacionado con el factor VIII es aumentado con respecto al
tiempo de coagulación individual de una muestra de control que
contiene sólo el polipéptido del factor VII o relacionado con el
factor VII o el polipéptido del factor VIII o relacionado con el
factor VIII respectivamente, evaluado en el mismo ensayo de
coagulación. El tiempo de coagulación puede ser evaluado mediante
ensayos PT o aPTT estándares, que son conocidos por el experto en
la materia en general.
Como se utiliza en este caso el término
"trastorno hemorrágico" refleja cualquier defecto, congénito,
adquirido o inducido, de origen celular o molecular que se
manifiesta en hemorragias. Ejemplos de trastornos de hemorragia
incluyen, pero no se limitan a, deficiencias del factor de
coagulación (p. ej. deficiencia de factores de coagulación VIII, IX,
XI o VII), inhibidores del factor de coagulación, función de las
plaquetas defectuosa (p. ej., trombastenia de Glanzmann y síndrome
de Bernard-Soulier), trombocitopenia, enfermedad de
von Willebrand, y coagulopatía tal como aquella provocada por una
dilución de proteínas de coagulación, fibrinólisis aumentada y
número reducido de plaquetas debido a hemorragias y/o transfusiones
(p. ej., en sujetos multitransfundidos que han sido sometidos a
cirugía o traumatismo).
La hemorragia se refiere a la extravasación de
sangre de cualquier componente del sistema circulatorio. El término
"hemorragias" se destina a incluir hemorragias indeseadas,
descontroladas y frecuentemente excesivas con respecto a la cirugía,
traumatismo, u otras formas de daños tisulares, al igual que
hemorragias indeseadas en sujetos que tienen trastornos
hemorrágicos. Las hemorragias pueden ocurrir en sujetos con un
sistema de coagulación básicamente normal pero que experimentan una
coagulopatía (temporal), así como en sujetos con una coagulación
congénita o adquirida o trastornos de hemorragia. En sujetos con
una función de las plaquetas defectuosa, las hemorragias pueden ser
comparadas con las hemorragias provocadas por la hemofilia porque
el sistema hemostático, como en la hemofilia, carecen o tienen
"compuestos" de coagulación anormal esenciales (p. ej.,
plaquetas o proteína del factor de von Willebrand). En sujetos que
experimentan daños tisulares extensivos, por ejemplo asociados con
la cirugía o con un gran traumatismo, el mecanismo hemostático
normal puede ser abrumado por la demanda de hemostasis inmediata y
éstas pueden desarrollar hemorragias a pesar de un mecanismo
hemostático básicamente normal (pretraumatismo o precirugía). Estos
sujetos, que también frecuentemente son multitransfundidos,
desarrollan una coagulopatía (temporal) como resultado de la
hemorragia y/o de las transfusiones (es decir, una dilución de
proteínas de coagulación, fibrinólisis aumentada y número reducido
de plaquetas debido a la hemorragia y/o a las transfusiones). Las
hemorragias pueden también ocurrir en órganos tales como el
cerebro, la región interna de la oreja y los ojos; éstas son áreas
con posibilidades limitadas para la hemostasis quirúrgica y por lo
tanto con problemas con la obtención de una hemostasis
satisfactoria. Problemas similares pueden surgir en el proceso de
la toma de biopsias de varios órganos (hígado, pulmón, tejido
tumoral, tracto gastrointestinal) al igual que en cirugía
laparoscópica y prostatectomía retropúbica radical. En estas
situaciones es común la dificultad de proporcionar hemostasis por
técnicas quirúrgicas, (suturas, clips, etc.) siendo también el caso
cuando la hemorragia es difusa (p. ej., gastritis hemorrágica y
hemorragia uterina profusa). Las hemorragias pueden también ocurrir
en sujetos bajo terapia anticoagulante en quienes una hemostasis
defectuosa ha sido inducida por la terapia dada; estas hemorragias
son frecuentemente agudas y profusas. La terapia anticoagulante es
frecuentemente dada para prevenir una enfermedad tromboembólica. Tal
terapia puede incluir heparina, otras formas de proteoglicanos,
Warfarina u otras formas de antagonistas de la vitamina K al igual
que la aspirina y otros inhibidores de la agregación plaquetaria,
tales como, p. ej., anticuerpos u otros inhibidores de la actividad
GP IIb/IIIa. Las hemorragias también pretenden incluir, sin
limitación, hemorragia descontrolada y excesivo con respecto a la
cirugía o traumatismo en sujetos con hemartrosis aguda (hemorragias
en articulaciones), artropatía crónica hemofílica, hematomas, (p.
ej., musculares, retroperitoneales, sublinguales y retrofaríngeos),
hemorragias en otro tejido, hematuria (hemorragia del tracto
renal), hemorragia cerebral, cirugía (p. ej., hepatectomía),
extracción dental, y hemorragias gastrointestinales (p. ej.,
hemorragias UGI). Las hemorragias pueden estar asociadas a
inhibidores contra el factor VIII; hemofilia A; hemofilia A con
inhibidores; hemofilia B; deficiencia de factor VII; deficiencia de
factor XI; trombocitopenia; deficiencia de factor de von Willebrand
(enfermedad de von Willebrand); daños tisulares severos;
traumatismos severos; cirugía; cirugía laparoscópica; gastritis
hemorrágica; toma de biopsias; terapia anticoagulante; hemorragias
gastroentestinales superiores (UGI); o transplante de células madre.
Las hemorragias pueden ser hemorragia uterina profusa; ocurriendo
en órganos con una posibilidad limitada de hemostasis mecánica;
ocurriendo en el cerebro; en la región interna de la oreja; o en
los ojos. Los términos "episodios de sangrado" y
"hemorragias", según sea apropiado, pueden ser usados de forma
intercambiable.
En este contexto, el término "tratamiento"
se entiende que incluye tanto la prevención de una hemorragia
prevista, como por ejemplo, en cirugía, y la regulación de una
hemorragia que ya esté ocurriendo, como por ejemplo, en
traumatismos, con el propósito de inhibir o minimizar la hemorragia.
La "hemorragia prevista" arriba referenciada puede ser una
hemorragia prevista para ocurrir en un tejido particular u órgano,
o puede ser una hemorragia no específica. La administración
profiláctica de una preparación de un polipéptido del factor VII o
relacionado con el factor VII y una preparación de un polipéptido
del factor VIII o relacionado con el factor VIII está por lo tanto
incluida en el término "tratamiento".
El término "sujeto" según se utiliza en
este caso se destina a significar cualquier animal, en particular
mamíferos, tales como los seres humanos, y, puede cuando sea
apropiado, ser usado de forma intercambiable con el término
"paciente".
Los polipéptidos del factor VII o relacionados
con el Factor VII y los polipéptidos del factor VIII o relacionados
con el factor VIII, según se define en la presente descripción,
pueden ser administrados simultáneamente o consecutivamente. Los
factores pueden ser suministrados en una única dosificación
unitaria donde la forma de dosificación unitaria contiene tanto
factores de coagulación, o en forma de un kit de piezas
comprendiendo una preparación de un polipéptido del factor VII o
relacionado con el factor VII como una primera forma de
dosificación unitaria y una preparación de un polipéptido del
factor VIII o relacionado con el factor VIII como una segunda forma
de dosificación unitaria. La segunda forma de dosificación unitaria
puede estar en forma de un producto de factor VIII de actividad
alta, media o baja. Los productos de actividad alta son preferidos.
Los más preferidos son los productos de actividad recombinante
elevada. Siempre que se menciona una primera o segunda o tercera,
etc., dosis unitaria en toda esta especificación no indica el orden
preferido de administración, sólo se hace por conveniencia.
Por dosificación "simultánea" de una
preparación de un polipéptido del factor VII o relacionado con el
factor VII y una preparación de un polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII se entiende la administración de las
proteínas de factor de coagulación en forma de monodosis, o la
administración de una primera proteína de factor de coagulación
seguida de la administración de una segunda proteína de factor de
coagulación con una separación temporal no superior a 15 minutos,
preferiblemente 10, más preferido 5, más preferido 2 minutos.
Cualquier factor puede ser administrado primero.
Por dosificación "secuencial" se entiende
la administración de una primera proteína de factor de coagulación
seguida de la administración de una segunda proteína de factor de
coagulación con una separación de tiempo de hasta 2 horas,
preferiblemente de 1 a 2 horas, más preferido hasta 1 hora, más
preferido de 30 minutos a 1 hora, más preferido hasta 30 minutos,
más preferido de 15 a 30 minutos.
Cualquiera de las dos formas de dosificación
unitaria, o proteínas de factor de coagulación, pueden ser
administradas primero. Preferiblemente, ambos productos son
inyectados a través del mismo acceso intravenoso.
Por "nivel de factor VIII" se entiende el
nivel de actividad del factor VIII de coagulación del paciente en
comparación con el nivel en sujetos saludables. El nivel es
designado como un porcentaje del nivel normal. Los términos pueden,
cuando sea apropiado, ser usados de forma intercambiable.
Por "nivel reducido de factor VIII" se
entiende una reducción en la presencia o en la actividad del factor
VIII en el flujo sanguíneo en comparación con el nivel medio de
factor VIII en una población de sujetos sin deficiencia de factor
VIII de coagulación ni inhibidores del factor VIII de coagulación.
En base a su purificación del plasma humano, la concentración de
factor VIII en el adulto normal es aproximadamente 100 a 200 ng/ml
de plasma (valor medio) que es equivalente a aproximadamente 0,1
\muM; esto equivale a 0,60 - 1,60 U/ml.
En individuos saludables normales, la actividad
del factor VIII y los niveles de antígenos varían entre el 60 y el
160% del plasma mezclado normal. Clínicamente, el nivel de factor
VIII circulante puede ser medido bien por un ensayo coagulante o
inmunológico. La actividad procoagulante del Factor VIII es
determinada por la capacidad del plasma del paciente para corregir
el tiempo de coagulación del plasma deficitario de factor VIII (p.
ej., un ensayo APTT, véase más abajo; véase también "parte de
ensayo" de la presente descripción).
Una unidad de factor VIII se ha definido como la
cantidad de factor VIII presente en un mililitro de plasma humano
normal (mezclado) (correspondiente a un nivel de factor VIII del
100%).
Una unidad de factor VII está definida como la
cantidad de factor VII presente en 1 ml de plasma normal,
correspondiente a aproximadamente 0,5 \mug de proteína. Después
de la activación 50 unidades corresponden a aproximadamente 1
\mug de proteína.
Por "deficiencia" se entiende una reducción
en presencia o actividad de, p. ej., factor VIII en el plasma en
comparación con aquella de individuos saludables normales. El
término, cuando sea apropiado, puede ser usado de forma
intercambiable con "nivel reducido de factor VIII".
Por "APTT" o "aPTT" se entiende el
tiempo de tromboplastina activado parcial (descrito por, p. ej.,
Proctor RR, Rapaport SI: The partial thromboplastin time with
kaolin; a simple screening test for first-stage
plasma clotting factor deficiencies. Am J Clin Pathol 36:212,
1961).
Por "síndrome responsable del factor VIII"
se entiende un síndrome cuando se administra factor VIII exógeno al
sujeto que lo necesite que puede prevenir, curar o mejorar
cualquier síntoma, condición o enfermedad, previsto o presente,
provocado por el síndrome. Están incluidos, sin limitación, los
síndromes provocados por un nivel reducido de factor VIII, p. ej.,
trastornos hemorrágicos tales como, sin limitación, hemofilia A, o
síndromes provocados por inhibidores del factor VIII.
Por "síndrome responsable del factor VII"
se entiende un síndrome donde el factor VII exógeno,
preferiblemente factor VIIa, administrado al sujeto en necesidad
del mismo puede, prevenir, curar o mejorar cualquier síntoma,
condición o enfermedad, previsto o presente, provocado por el
síndrome. Están incluidos, sin limitación, los síndromes provocados
por un nivel reducido de factores de coagulación VIII, IX, XI o
VII, inhibidores del factor de coagulación, función de las
plaquetas defectuosa (p. ej., trombastenia de Glanzmann y síndrome
de Bernard-Soulier), trombocitopenia, enfermedad de
von Willebrand y coagulopatía tal como aquella provocada por una
dilución de proteínas de coagulación, fibrinólisis aumentada y
número reducido de plaquetas debido a hemorragias y/o a
transfusiones (p. ej., en sujetos multitransfundidos que han sido
sometidos a cirugía o traumatismo).
"Vida media" se refiere al tiempo requerido
para la concentración en el plasma de un polipéptido del factor VII
o relacionado con el factor VII o un polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII para reducir desde un valor
particular hasta la mitad dicho valor.
Por "hemostasis primaria" se entiende la
generación inicial de trombina por FXa y TF:factor VIIA, la
activación posterior de las plaquetas y la formación del tapón
inicial libre de plaquetas activadas, adheridas que todavía no han
sido estabilizadas por fibrina y, finalmente, por fibrina
entrecruzada. Si no es estabilizado por la fibrina formada durante
la segunda fase del proceso hemostático (hemostasis mantenida), el
tapón es fácilmente disuelto por el sistema fibrinolítico
Por "hemostasis secundaria" o "hemostasis
mantenida" se entiende la generación secundaria, completa, y más
importante, explosión o generación de trombina que toma posición en
la superficie de las plaquetas activadas y catalizadas por el
factor VIIIa y factor VIIIa, la formación posterior de fibrina y la
estabilización del tapón de plaquetas inicial. La estabilización del
tapón por fibrina conduce a la hemostasis completa.
Por "hemostasis completa" se entiende la
formación de un coágulo o tapón de fibrina estable y sólido en el
sitio de la herida que detiene eficazmente la hemorragia y que no
es fácilmente disuelto por el sistema fibrinolítico. En este
contexto, el término hemostasis será usada para representar la
hemostasis completa como se ha descrito anteriormente.
Como se utiliza en este caso, una
"preparación" de un factor de coagulación, p. ej., factor
VIII, es aquella en la que el factor VIII es el factor
predominante. En una forma de realización, el factor de coagulación
está presente en la preparación en una cantidad superior al 20%
(p/p) de la cantidad total de proteína, más preferido el 30%, más
preferido el 40%, más preferido el 50%, más preferido el 60%, más
preferido el 70%, más preferido el 80%, más preferido el 90%, más
preferido el 95%, más preferido el 98%, más preferido el 99%.
En una forma de realización preferida, el factor
de coagulación está presente en una cantidad superior al 50% (p/p)
de la cantidad total de proteína del factor de coagulación, más
preferido el 80%, más preferido el 90%, más preferido el 95%, más
preferido el 98%, más preferido el 99%.
La cantidad total de proteína en tal preparación
puede ser medida por métodos generalmente conocidos, p. ej,
midiendo la densidad óptica. Las cantidades de proteína de
coagulación del factor VIII pueden ser medidas por métodos
generalmente conocidos tales como inmunoensayos Elisa estándares.
En términos generales, tal ensayo es conducido contactando una
solución de la preparación conteniendo la proteína de factor VIII
con un anticuerpo anti-FVIII inmovilizado sobre el
plato Elisa, posteriormente contactando el complejo de factor VIII
del anticuerpo inmovilizado con un segundo anticuerpo anti FVIII que
lleva un marcador, cuyas cantidades, en una tercera fase, son
medidas. Las cantidades de cada factor de coagulación pueden ser
medidas de una forma similar usando anticuerpos apropiados. La
cantidad total de proteína de factor de coagulación presente en una
preparación es determinada añadiendo las cantidades de las
proteínas de factor de coagulación individual. En una forma de
realización, la preparación comprende el factor de coagulación
aislado. En otra forma de realización la preparación está libre de
protrombina y factor IIa de coagulación.
Como se utiliza en este caso, el término
"aislado" se refiere a los factores de coagulación, p. ej.,
polipéptidos del factor VIII o relacionados con el factor VIII que
han sido separados de la célula donde fueron sintetizados o del
medio donde se encuentran en la naturaleza (p. ej., plasma o
sangre). La separación de polipéptidos de su célula de origen puede
ser conseguida por cualquier método conocido en la técnica,
incluyendo, sin limitación, la eliminación del medio de cultivo
celular conteniendo el producto deseado de un cultivo celular
adherente; el centrifugado o la filtración para eliminar las células
no adherentes; y similares. La separación de los polipéptidos del
medio donde se producen naturalmente puede ser conseguida por
cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin
limitación, cromatografía de afinidad, tal como, p. ej., en una
columna de anticuerpos anti-factor VII o
anti-factor VIII, respectivamente; cromatografía de
interacción hidrofóbica; cromatografía de intercambio de iones;
cromatografía de exclusión de tamaños; procedimientos
electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio (IEF)),
solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico),
o extracción y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
- TF
- factor tisular
- FVII
- factor VII en su forma monocatenaria inactivada
- FVIIa
- factor VII en su forma activada
- rFVIIa
- factor recombinante VII en su forma activada
- factor VIII
- factor VIII en su forma zimogénica inactivada
- factor VIIIa
- factor VIII en su forma activada
- rfactor VIII
- factor VIII recombinante
- rfactor VIIIa
- factor recombinante VIIIa
\vskip1.000000\baselineskip
El Factor VIIa humano purificado adecuado para
el uso en la presente invención es preferiblemente obtenido por la
tecnología de ADN recombinante, p. ej. como se describe por Hagen
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
2412-2416, 1986, o como se describe en la patente
europea No. 200.421 (ZymoGenetics, Inc.).
El Factor VII puede también ser producido por
los métodos descritos por Broze y Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4):
1242-1247, 1980 y Hedner y Kisiel, J. Clin. Invest.
71: 1836-1841, 1983. Estos métodos producen factor
VII sin cantidades detectables de otros factores de coagulación
sanguínea. Otra preparación de factor VII aún más purificada puede
ser obtenida mediante la inclusión de una filtración de gel
adicional como la fase de purificación final. El factor VII es
luego convertido en factor VIIa activado por medios conocidos, p.
ej. por diferentes proteínas del plasma, tales como factor XIIa, IX
a o Xa. De forma alternativa, como se describe por Bjoern et
al. (Research Disclosure, 269 September 1986, pp.
564-565), el factor VII puede ser activado pasándolo
a través de una columna de cromatografía de intercambio de iones,
tal como Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) o similar.
Los polipéptidos del Factor Vil relacionados
pueden ser producidos por modificación del factor VII de tipo
salvaje o por tecnología recombinante. Los polipéptidos
relacionados con el Factor VII con secuencia de aminoácidos
alterada cuando se compara con el factor VII de tipo salvaje pueden
ser producidos modificando el factor VII de tipo salvaje que
codifica la secuencia de ácidos nucleicos bien mediante la
alteración de los codones de aminoácidos o mediante la eliminación
de algunos codones de aminoácidos en el ácido nucleico que codifica
el factor VII natural por medios conocidos, p. ej. por mutagénesis
sitio específica.
\newpage
Será evidente para los expertos en la técnica
que se pueden realizar sustituciones fuera de las regiones
fundamentales para la función de la molécula del factor VIIa o del
factor VIII y además resultan en un polipéptido activo. Los
residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del
polipéptido del factor VII o relacionado con el polipéptido del
factor VII o del factor VIII o relacionado con el factor VIII, y en
consecuencia preferiblemente no sometidos a sustitución, pueden ser
identificados según procedimientos conocidos en la técnica, tales
como mutagénesis dirigida o mutagénesis de rastreo de alanina
(véase, p. ej., Cunningham y Wells 1989, ciencia 244:
1081-1085). En esta técnica, las mutaciones son
introducidas en cada residuo cargado positivamente en la molécula,
y las moléculas mutantes resultantes son evaluadas por su actividad
coagulante y de entrecruzamiento, respectivamente para identificar
los residuos de aminoácidos que son fundamentales para la actividad
de la molécula. Los sitios de interacción de
enzima-sustrato pueden también ser determinados por
análisis de la estructura tridimensional según ha sido determinado
por técnicas tales como el análisis de resonancia magnética
nuclear, cristalografia o marcado por fotoafinidad (véase, p. ej.,
de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312;
Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224:
899-904; Wiodaver et al., 1992, FEBS Letters
309: 59-64).
La introducción de una mutación en la secuencia
de ácidos nucléicos para intercambiar un nucleótido por otro
nucleótido puede ser realizada por mutagénesis dirigida usando
cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Es
particularmente útil el procedimiento que utiliza un vector de ADN
bicatenario superhelicoidal, con un inserto de interés y dos
cebadores sintéticos que contienen la mutación deseada. Los
cebadores oligonucleótidos, cada uno complementario de las cadenas
opuestas del vector, se extienden durante la variación de la
temperatura mediante Pfu ADN polimerasa. Con incorporación
de los cebadores, un plásmido mutado que contiene cortes en bisel
es generado. Después de la variación de la temperatura, el producto
es tratado con DpnI, que es específico para ADN metilado y
hemimetilado para digerir el molde de ADN parental y para
seleccionar el ADN sintetizado que contiene la mutación. Otros
procedimientos conocidos en la técnica para crear, identificar y
aislar variantes pueden también ser usados, tales como, por
ejemplo, transposición de genes o técnicas de presentación en
serie.
La separación de polipéptidos de su célula de
origen puede ser conseguida mediante cualquier método conocido en
la técnica, incluyendo, sin limitación, la eliminación del medio de
cultivo celular que contiene el producto deseado de un cultivo
celular adherente; el centrifugado o la filtración para eliminar
células no adherentes; y similares.
Opcionalmente, los polipéptidos del factor VII o
relacionados con el factor VII pueden ser purificados
adicionalmente. La purificación puede ser conseguida usando
cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin
limitación, cromatografía de afinidad, tal como, p. ej., en una
columna de anticuerpos anti-factor VII (véase, p.
ej., Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; y
Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988); cromatografía de
interacción hidrofóbica; cromatografía de intercambio de iones;
cromatografía de exclusión de tamaños; procedimientos
electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio (IEF),
solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico),
o extracción y similares. Véase, en general, Scopes, Protein
Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; y
Protein Purification, J.C. Janson y Lars Ryden, editors, VCH
Publishers, New York, 1989. Después de la purificación, la
preparación preferiblemente contiene menos de aproximadamente un
10% en peso, más preferiblemente menos de aproximadamente un 5% y
de la forma más preferible menos de aproximadamente un 1%, de
polipéptidos sin factor VII o relacionados con el Factor VII
derivados de la célula huésped.
Los polipéptidos del factor VII o relacionados
con el factor VII pueden ser activados por seccionamiento
proteolítico, usando el Factor XIIa u otras proteasas con
especificidad de tipo tripsina, tales como, p. ej., el Factor IXa,
kalikreína, Factor Xa, y trombina. Véase, p. ej., Osterud et
al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, Patente estadounidense
No. 4,456,591; y Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836
(1983). De forma alternativa, los polipéptidos del factor VII o
relacionados con el Factor VII pueden ser activados pasando a
través de una columna de cromatografía de intercambio iónico, tal
como Mono Q® (Pharmacia) o similar. El resultante polipéptido del
factor VII activado o relacionado con el factor VII puede luego ser
formulado y administrado según se describe abajo.
El Factor VIII para el uso dentro de la presente
invención puede ser aislado del plasma según métodos conocidos,
tales como aquellos descritos, p. ej., por Fulcher et al.;
Proc. Acad. Nat. Sci. USA 1982. 79:1648-1652, y
Rotblat et al.; Biochemistry 1985;
24:4294-4300. Se prefiere, no obstante, usar factor
VIII recombinante para evitar el uso de productos sanguíneos o
derivados de los tejidos que implica un riesgo de transmisión de
enfermedades.
El factor VIII humano purificado adecuado para
el uso en la presente invención es preferiblemente obtenido por la
tecnología de ADN recombinante, p. ej. como se describe por las
Patentes estadounidenses Nos. 4,757,006 y 4,965,199.
Los polipéptidos relacionados con el Factor VIII
pueden ser producidos por modificación del factor VIII de tipo
salvaje o por tecnología recombinante. Los polipéptidos
relacionados con el Factor VIII con la secuencia de aminoácidos
alterada cuando se compara con el factor VIII de tipo salvaje
pueden ser producidos modificando la secuencia de ácidos nucléicos
que codifica el factor VIII de tipo salvaje bien alterando los
codones de aminoácidos o eliminando algunos codones de aminoácidos
en el ácido nucleico que codifica el factor VIII natural por medios
conocidos, p. ej. por mutagénesis sitio específica, según está
descrito con más detalle más arriba. La separación de los
polipéptidos de su célula original puede ser conseguida por
cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin
limitación, la eliminación del medio de cultivo celular que
contiene el producto deseado de un cultivo celular adherente; el
centrifugado o la filtración para eliminar las células no
adherentes; y similares. Opcionalmente, los polipéptidos del factor
VIII o relacionados con el factor VIII pueden ser purificados
adicionalmente. La purificación puede ser conseguida usando
cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin
limitación, la cromatografía de afinidad, tal como, p. ej., en una
columna de anticuerpos anti-factor VIII; la
cromatografía de interacción hidrofóbica; la cromatografía de
intercambio de iones; la cromatografía por exclusión por tamaño;
procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque
preparatorio (IEF), la solubilidad diferencial (p. ej.,
precipitación de sulfato amónico), o extracción y similares, según
está descrito con más detalle más arriba. Después de la
purificación, la preparación preferiblemente contiene menos de
aproximadamente un 10% en peso, más preferiblemente menos de
aproximadamente un 5% y de la forma más preferible menos de
aproximadamente un 1%, de polipéptidos sin factor VII o relacionados
con el factor VIII derivados de la célula huésped. El resultante
polipéptido del factor VIII activado o relacionado con el factor
VIII puede luego ser formulado y administrado como se describe más
abajo.
Como será apreciado por los expertos en la
técnica, se prefiere usar polipéptidos del Factor VIII y
polipéptidos del factor VII singénicos con el sujeto para reducir
el riesgo de inducción de una respuesta inmunitaria. La preparación
y caracterización de factor VIII no humano ha sido descrita por, por
ejemplo, Fass et al.; Blood 1982; 59:
594-600. La presente invención también comprende el
uso de tales polipéptidos del Factor VIII y polipéptidos del factor
VII en procedimientos veterinarios.
Las preparaciones de la presente invención
pueden ser usadas para tratar cualquier síndrome sensible al factor
VIII, tal como, p. ej., trastornos, incluyendo, sin limitación,
aquellos provocados por deficiencias del factor de coagulación (p.
ej., hemofilia A), o por inhibidores (de baja o media titulación)
para el factor VIII.
Las preparaciones de la presente invención
pueden ser usadas para tratar cualquier síndrome sensible al factor
VII, tal como, p. ej., trastornos hemorrágicos, incluyendo, sin
limitación, síndromes provocados por un nivel reducido de factores
de coagulación VIII, IX, XI o VII, inhibidores del factor de
coagulación, función de las plaquetas defectuosa (p. ej.,
trombastenia de Glanzmann y síndrome de
Bernard-Soulier), trombocitopenia, enfermedad de
von Willebrand y coagulopatía tal como aquella provocada por una
dilución de proteínas de coagulación, fibrinólisis aumentada y
número reducido de plaquetas debido a hemorragias y/o transfusiones
(p. ej., en sujetos multi transfundidos que han sido sometidos a
cirugía o traumatismo).
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
una preparación de un polipéptido del factor VII o relacionado con
el factor VII y una preparación de un polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII según la presente invención están
destinados principalmente a la administración parenteral para un
tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Preferiblemente, las
composiciones farmacéuticas son administradas parenteralmente, es
decir, por vía intravenosa, subcutánea, o intramuscular; por vía
intravenosa siendo la forma más preferida. Éstas pueden también ser
administradas por infusión continua o pulsátil.
Las composiciones o formulaciones farmacéuticas
según la invención, comprenden una preparación de una preparación
de un polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII, o
una preparación de una preparación de un polipéptido del factor
VIII o relacionado con el factor VIII, o una preparación de una
preparación de un polipéptido del factor VII o relacionado con el
factor VII en combinación con una preparación de una preparación de
un polipéptido del factor VIII o relacionado con el factor VIII
combinado con, preferiblemente disuelto en, un portador
farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador o
diluyente acuoso. Una variedad de soportes acuosos puede ser usada,
tal como agua, agua tamponada, 0,4% de solución salina, 0,3% de
glicina y similares. Las preparaciones de la invención pueden
también ser formuladas usando soportes no acuosos, tales como, p.
ej., en forma de gel o como preparaciones de liposomas para la
entrega o envío a los sitios de herida. Las preparaciones de
liposomas están generalmente descritas en, p. ej., las Patentes
estadounidenses Nos. 4,837,028, 4,501,728, y 4,975,282. Las
composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de
esterilización convencionales, bien conocidas. Las soluciones
acuosas resultantes pueden ser envasadas para el uso o filtradas
bajo condiciones asépticas y liofilizadas, la preparación
liofilizada siendo combinada con una solución estéril acuosa antes
de la administración.
Las composiciones pueden contener sustancias
auxiliares o adyuvantes aceptables farmacéuticamente, incluyendo,
sin limitación, ajuste del pH y agentes amortiguadores y/o agentes
de ajuste de la tonicidad, tales como, por ejemplo, acetato sódico,
lactato sódico, cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de
calcio, etc.
Las formulaciones pueden además incluir uno o
más diluyentes emulsionantes, conservantes, tampones, excipientes,
etc. y pueden ser proporcionados en formas tales como líquidos,
polvos, emulsiones, liberación controlada, etc. Un experto en esta
técnica puede formular las composiciones de la invención de una
manera apropiada, y de acuerdo con prácticas aceptadas, tales como
aquellas descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro,
ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. Por tanto, una
composición típica farmacéutica para la infusión intravenosa podría
ser realizada para que contenga 250 ml de solución de Ringer
estéril y 10 mg de la preparación.
Las composiciones que contienen las
preparaciones de la presente invención pueden ser administradas
para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En usos
terapéuticos, las composiciones son administradas a un sujeto que
ya padece una enfermedad, como se ha descrito anteriormente, en una
cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente las
manifestaciones clínicas de la enfermedad y sus complicaciones. Una
cantidad adecuada para conseguirlo está definida como "cantidad
terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para cada
objetivo dependerán de la gravedad de la enfermedad o herida al
igual que del peso y estado general del sujeto. Se entenderá que la
determinación de una dosificación apropiada puede ser conseguida
usando una experimentación rutinaria, construyendo una matriz de
valores y evaluando los puntos diferentes en la matriz.
La entrega local de las preparaciones de la
presente invención, tal como, por ejemplo, la aplicación tópica,
puede ser realizada, p. ej., mediante pulverización, perfusión,
catéteres de balón doble, stent, incorporada en injertos vasculares
o stents, hidrogeles usados para revestir catéteres de balón, u
otros métodos bien establecidos. En cualquier caso, las
composiciones farmacéuticas deberían proporcionar una cantidad
suficiente de la preparación para tratar eficazmente la
condición.
La concentración del polipéptido del factor VII
o relacionado con el factor VII, del polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII, o del polipéptido del factor VII o
relacionado con el factor VII en combinación con el polipéptido del
factor VII o relacionado con el factor VIII en estas formulaciones
puede variar mucho, es decir, de menos de aproximadamente un 0,5% en
peso, normalmente hasta o al menos aproximadamente un 1% en peso
hasta un máximo de un 15 o 20% en peso y será seleccionada
principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc.,
dependiendo del modo particular de administración seleccionado. Se
prefiere la administración por inyección o infusión, en particular
la inyección. Por tanto, el polipéptido del factor VII o
relacionado con el factor VII y el polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII son preparados en una forma adecuada
para la administración intravenosa, tal como una preparación que es
bien un polvo liofilizado disuelto o una formulación líquida que
contiene el polipéptido del factor VII o relacionado con el factor
VII y el polipéptido del factor VIII o relacionado con el factor
VIII en una forma de dosificación unitaria, o un polvo liofilizado
disuelto o una formulación líquida conteniendo el polipéptido del
factor VII o relacionado con el factor VII en una forma de
dosificación unitaria y polvo liofilizado disuelto o una
formulación líquida conteniendo el polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII en otra forma de dosificación.
Debe entenderse que la cantidad de polipéptido
del factor VI o relacionado con el factor VII y la cantidad de
polipéptido del factor VIII o relacionado con el factor VIII juntos
comprenden una cantidad de agregado eficaz para tratar la
hemorragia.
Hay que tener en cuenta que los materiales de la
presente invención pueden generalmente ser empleados en estados de
enfermedades o heridas graves, es decir, en situaciones que
amenazan la vida o que la amenazan de forma potencial. En estos
casos, en vista de la minimización de sustancias extrañas y de
carencia general de inmunogenicidad del factor VIIa y factor VIII
en los seres humanos, es posible y puede ser considerado deseable
por el médico tratante administrar un exceso sustancial de estas
composiciones.
En aplicaciones profilácticas, las composiciones
que contienen una preparación de un polipéptido del factor VII o
relacionado con el factor VII y una preparación de un polipéptido
del factor VIII o relacionado con el factor VIII son administradas
a un sujeto susceptible de o por el contrario en riesgo de un
estado de enfermedad o herida para aumentar la capacidad coagulante
del propio sujeto. Tal cantidad está definida como una "dosis
profilácticamente eficaz". Debe ser entendido que la cantidad de
polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII y la
cantidad de polipéptido del factor VIII o relacionado con el factor
VIII juntos comprenden una cantidad de agregado eficaz para
prevenir una hemorragia.
Las administraciones individuales o múltiples de
las composiciones pueden llevarse a cabo con niveles de dosis y
modelos que son seleccionados por el médico tratante. Las
composiciones pueden ser administradas una o más veces al día o a
la semana. Una cantidad eficaz de tal composición farmacéutica es
la cantidad que proporciona un efecto clínicamente significante
contra las hemorragias. Estas cantidades dependerán, en parte, de la
condición particular para ser tratada, edad, peso, y salud general
del sujeto, y otros factores evidentes para los expertos en la
técnica.
La composición de la invención es generalmente
administrada en una dosis individual antes de la hemorragia
prevista o al principio de la hemorragia. Puede no obstante también
ser dada reiteradamente (en dosis múltiples) preferiblemente con
intervalos de
2-4-6-12 horas,
dependiendo de la dosis dada y de la condición del sujeto.
Para un tratamiento relacionado con
intervenciones deliberadas, el polipéptido del factor VII o
relacionado con el factor VII y el polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII normalmente serán administrados
dentro de aproximadamente 24 horas antes de realizar la
intervención, y durante 7 días o más después de la misma. La
administración como un coagulante puede hacerse por una variedad de
vías según se ha descrito en la presente.
La composición puede estar en forma de una única
preparación (forma monodosis) comprendiendo una preparación de una
preparación de un polipéptido del factor VII o relacionado con el
factor VII y una preparación de una preparación de un polipéptido
del factor VIII o relacionado con el factor VIII en concentraciones
adecuadas. La composición puede también estar en forma de kit de
piezas que consisten en una primera forma de dosificación unitaria
que comprende una preparación de una preparación de un polipéptido
del factor VII o relacionado con el factor VII y una segunda forma
de dosificación unitaria que comprende una preparación de una
preparación de un polipéptido del factor VIII o relacionado con el
factor VIII. En este caso, el polipéptido del factor VII o
relacionado con el factor VII y el polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII debería ser administrado uno después
del otro, preferiblemente dentro de aproximadamente 15 minutos
entre el uno y el otro, por ejemplo dentro de 10 minutos entre el
uno y el otro o, preferiblemente, dentro de 5 minutos o, más
preferido, dentro de 2 minutos entre el uno y el otro. Cualquiera
de las dos formas de dosificación unitaria puede ser administrada
primero.
El kit incluye al menos dos composiciones
farmacéuticas separadas. El kit incluye un medio contenedor para
contener las composiciones separadas tal como una botella dividida
o un paquete dividido por hojas. Normalmente el kit incluye
indicaciones para la administración de los componentes separados. La
forma del kit es particularmente ventajosa cuando los componentes
separados son preferiblemente administrados en formas de
dosificación diferentes, en intervalos de dosificación diferentes,
o cuando la titulación de los componentes individuales de la
combinación es deseada por el médico prescriptor.
La cantidad de polipéptido del factor VII o
relacionado con el factor VII y la cantidad de polipéptido del
factor VIII o relacionado con el factor VIII administrada según la
presente invención puede variar de una proporción de entre
aproximadamente 1:100 a aproximadamente 100:1 (p/p). Puede así ser
la proporción de factor VII a factor VIII, p. ej., aproximadamente
1:100, o 1:90, o 1:80, 0 1:70 0 1:60, 0 1:50, 0 1:40, 0 1:30, o
1:20, o 1:10, 0 1:5, 0 1:2, 0 1:1, o 2:1, o 5:1, o 10:1, o 20:1, o
30.1, o 40:1, o 50:1, o 60:1, o 70:1, o 80:1, o 90:1, o 100:1. o
entre aproximadamente 1:90 a aproximadamente 1:1, o entre
aproximadamente 1:80 a aproximadamente 1:2, o entre aproximadamente
1:70 a aproximadamente 1:5, o entre aproximadamente 1:60 a
aproximadamente 1:10, o entre aproximadamente 1:50 para
aproximadamente 1:25, o entre aproximadamente 1:40 a
aproximadamente 1:30, o entre aproximadamente 90:1 a
aproximadamente 1:1, o entre aproximadamente 80:1 a aproximadamente
2:1, o entre aproximadamente 70:1 a aproximadamente 5:1, o entre
aproximadamente 60:1 a aproximadamente 10:1, o entre
aproximadamente 50:1 a aproximadamente 25:1, o entre aproximadamente
40:1 a aproximadamente 30:1.
La dosis del polipéptido del factor VII o
relacionado con el factor VII varia desde aquella que corresponde a
aproximadamente 0,05 mg hasta aproximadamente 500 mg/día de factor
VII de tipo salvaje, p. ej., desde aproximadamente 1 mg hasta
aproximadamente 200 mg/día, o, p. ej., desde aproximadamente 5 mg
hasta aproximadamente 175 mg/día para un sujeto de 70 kg como dosis
de carga y de mantenimiento, dependiendo del peso del sujeto, de la
condición y de la gravedad de la enfermedad.
La dosis del polipéptido del factor VIII o
relacionado con el factor VIII varía desde aquella que corresponde
a aproximadamente 0,05 mg hasta aproximadamente 500 mg/día del
factor VIII de tipo salvaje p. ej., desde aproximadamente 1 mg
hasta aproximadamente 200 mg/día, o, p. ej., desde aproximadamente
1 mg hasta aproximadamente 175 mg/día para un sujeto de 70 kg como
dosis de carga y de mantenimiento, dependiendo del peso del sujeto,
de la condición y de la gravedad de la enfermedad.
Al tratar sujetos con un nivel reducido de
factor VIII, las dosis a continuación son preferidas:
Cuando la dosificación de un polipéptido del
factor VIII o relacionado con el factor VIII para el nivel de
actividad en el plasma hasta un 10% de actividad normal del factor
VIII:
- Niveles preferidos de polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII: 15-300 microgramo/kg de peso corporal.
- Niveles más preferidos de polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII: 30-250 microgramo/kg de peso corporal.
- Niveles los más preferidos de polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII: 60-180 microgramo/kg de peso corporal.
Cuando la dosificación de un polipéptido del
factor VIII o relacionado con el factor VIII para un nivel de
actividad en el plasma hasta un 30% de actividad normal de factor
VIII
- Niveles preferidos de polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII: 15 - 300 microgramo/kg de peso corporal.
- Niveles preferidos de polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII: 30 - 250 microgramo/kg de peso corporal.
- Niveles los más preferidos de polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII: 60 - 180 microgramo/kg de peso corporal.
Cuando la dosificación de un polipéptido del
factor VIII o relacionado con el factor VIII para un nivel de
actividad en el plasma hasta un 50% de la actividad normal del
factor VIII
- Niveles preferidos de polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII: 15 - 300 microgramo/kg de peso corporal.;
- Niveles más preferidos de polipéptido del factor VII o relacionado con el factor VII: 30 - 250 microgramo/kg de peso corporal.;
- Niveles los más preferidos de polipéptido del Factor VII o relacionado con el factor VII: 60 - 180 microgramo/kg de peso corporal.
Cuando dosificación de un polipéptido del factor
VIII o relacionado con el factor VIII para un nivel de actividad en
el plasma hasta un 80% de la actividad normal de factor VIII:
- Niveles preferidos de polipéptido del Factor VII o relacionado con el factor VII: 5 - 300 microgramo/kg de peso corporal.;
- Niveles más preferidos de polipéptido del Factor VII o relacionado con el factor VII: 10 - 180 microgramo/kg de peso corporal.;
- Niveles más preferidos de polipéptido del Factor VII o relacionado con el factor VII: 30 - 120 microgramo/kg de peso corporal.;
- Niveles los más preferidos de polipéptido del Factor VII o relacionado con el factor VII: 60 - 120 microgr/kg de peso corporal.
Cuando la dosificación de un polipéptido del
factor VIII o relacionado con el factor VIII para un nivel de
actividad en el plasma hasta un 100% de la actividad normal de
factor VIII:
- Niveles preferidos de polipéptido del Factor VII o relacionado con el factor VII: 5 - 300 microgramo/kg de peso corporal.;
- Niveles más preferidos de polipéptido del Factor VII o relacionado con el factor VII: 10 - 180 microgramo/kg de peso corporal.
- Niveles los más preferidos de polipéptido del Factor VII o relacionado con el factor VII: 60 - 120 microgramo/kg de peso corporal.
La dosificación puede ser calculada teniendo en
cuenta que 1 unidad por kg de peso corporal de sustitución de FVIII
eleva la actividad en el plasma en aprox. 0,02 U por ml (2%). El
nivel de factor VIII del paciente es vigilado extrayendo muestras
de sangre a intervalos adecuados y analizando la actividad del
factor VIII (véase la especificación más arriba).
Un ensayo adecuado para evaluar la actividad de
factor VIIa y de ese modo seleccionar las variantes de factor VIIa
adecuadas puede ser realizado como una prueba simple preliminar
in vitro:
La variante de factor VIIa nativo (tipo salvaje)
y del factor VIIa (ambas de aquí en adelante referidas como
"factor VIIa") pueden ser evaluadas por sus actividades
específicas. Éstas pueden también ser evaluadas en paralelo para
comparar directamente sus actividades específicas. El ensayo se
realiza en una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc,
Dinamarca). El sustrato cromogénico
D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilideo
(S-2288, Chromogenix, Suecia), concentración final
1 mM, se añade al factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50 mM
de HEPES, pH 7.4, que contiene 0,1 M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1
mg/ml de albúmina de suero bovino. La absorbencia a 405 nm es
medida continuamente en un lector de placas SpectraMax^{TM} 340
(Molecular Devices, EEUU). La absorbencia desarrollada durante una
incubación de 20 minutos, después de la sustracción de la
absorbencia en un ensayo en blanco que no contiene enzima, se
utiliza para calcular la proporción entre las actividades de la
variante y el factor VIIa de tipo salvaje:
Proporción =
(A_{405\ nm}\ variante\ de\ factor\ VIIa)/(_{A405\ nm}\ factor\
VIIa\ tipo\
salvaje)
En base a ello, las variantes del factor VIIa
con una actividad comparable a o superior al factor VIIa nativo
puede ser identificada, tal como, por ejemplo, las variantes en las
que la proporción entre la actividad de la variante y la actividad
del factor nativo VII (FVII de tipo salvaje) está alrededor de,
versus por encima de 1.0.
La actividad de factor VIIa o variantes de
factor VIIa pueden también ser medidas usando un sustrato
fisiológico tal como factor X, de manera adecuada a una
concentración de 100-1000 nM, donde el Factor Xa
generado es medido después de la adición de un sustrato adecuado
cromogénico (p. ej. S-2765). Además, el ensayo de
actividad puede ser realizado a temperatura fisiológica.
El factor VIIa nativo (tipo salvaje) y la
variante del factor VIIa (ambos de aquí en adelante denominados
"factor VIIa") son evaluados en paralelo para comparar
directamente sus actividades específicas. El ensayo se realiza en
una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). Factor
VIIa (10 nM) y factor X (0.8 microM) en 100 microL de HEPES 50 mM,
pH 7.4, que contiene 0,1 M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de
albúmina de suero bovino, son incubadas durante 15 min. El
seccionamiento del factor X es luego detenido por la adición de 50
microL de HEPES 50 mM, pH 7.4, que contiene 0,1 M de NaCl, 20 mM de
EDTA y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La cantidad de Factor
Xa generada es medida por adición del sustrato cromogénico
Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida
(S-2765, Chromogenix, Suecia), concentración final
0,5 mM. La absorbencia a 405 nm es medida continuamente en un
lector de placas Spectra-Max^{TM} 340 (Molecular
Devices, EEUU). La absorbencia desarrollada durante 10 minutos,
después de la sustracción de la absorbencia en un pocillo en blanco
que no contenía FVIIa, se utiliza para calcular la proporción entre
las actividades proteolíticas de la variante y el factor VIIa de
tipo salvaje:
Proporción =
(A_{405\ nm}\ variante\ de\ factor\ VIIa)/(_{A405\ nm}\ factor\
VIIa\ tipo\
salvaje)
En base a ello, las variantes de factor VIIa con
una actividad comparable a o superior al factor VIIa nativo pueden
ser identificadas, así como, por ejemplo, las variantes en las que
la proporción entre la actividad de la variante y la actividad del
factor VII nativo (FVII tipo salvaje) está alrededor de,
versus por encima de 1.0.
La capacidad de los polipéptidos del factor VII
o relacionados con el Factor VII o de los polipéptidos del factor
VIII o relacionados con el factor VIII (p. ej., variantes) para
generar trombina puede ser medida en un ensayo comprendiendo todos
los factores de coagulación y los inhibidores pertinentes a
concentraciones fisiológicas y plaquetas activadas (como se describe
en p. 543 en Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99:
542-547 estando incorporada en la presente como
referencia).
Ensayos adecuados para evaluar la actividad del
factor VIII, y de ese modo suministrar medios para seleccionar
variantes de factor VIII adecuadas para el uso en la presente
invención, pueden ser realizados como pruebas simples in
vitro como se describe, por ejemplo, en Kirkwood TBL, Rizza CR,
Snape TJ, Rhymes IL, Austen DEG. Identification of sources of
intnerlaboratory variation in factor VIII assay. B J Haematol 1981.
37. 559-68.; o Kessels et al., British
Journal of Haematology, Vol. 76 (Suppl.1) pp. 16 (1990)). La
actividad del Factor VIII puede también ser medida por un ensayo
cromogénico en dos etapas en base a la actividad amidolítica de FXa
generado (Wagenvoord et al, 1989, Haemostasis,
19(4):196-204) ("ensayo
cromogénico").
La actividad biológica del Factor VIII puede
también ser cuantificada midiendo la capacidad de una preparación
para corregir el tiempo de coagulación del plasma carente de factor
VIII, p. ej., como se describe en Nilsson et al., 1959.
(Nilsson IM, Blombaeck M, Thilen A, von Francken I., Carriers of
haemophilia A - A laboratory study, Acta Med Scan 1959; 165:357).
En este ensayo, la actividad biológica se expresa como unidades/ml
de plasma (1 unidad corresponde a la cantidad de FVIII presente en
plasma mezclado normal).
En un aspecto, la invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende un polipéptido del FVII y un
polipéptido del FVIII como únicos factores de coagulación activos.
En una forma de realización, el polipéptido del FVII es FVIIa
recombinante humano. En una forma de realización, el polipéptido
del FVIII es FVIII recombinante humano. En una forma de
realización, el polipéptido del FVII y el polipéptido del FVIII son
mezclados. En una forma de realización, el polipéptido del FVII y el
polipéptido del FVIII están en contenedores separados. En una forma
de realización, la composición es para el tratamiento en casa.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
kit para el tratamiento de la hemorragia que comprende
- a)
- una cantidad eficaz de un polipéptido del FVII y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable en una primera forma de dosificación unitaria;
- b)
- una cantidad eficaz de un polipéptido del FVIII y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable en una segunda forma de dosificación unitaria; y
- c)
- medios de contención para contener dicha primera y segunda formas de dosificación.
En una forma de realización, el polipéptido del
FVII es FVIIa recombinante humano. En una forma de realización, el
polipéptido del FVIII es FVIII recombinante humano. En una forma de
realización, el kit es para el tratamiento en casa. En otro
aspecto, la invención se refiere al uso de un polipéptido del FVII
y un polipéptido del FVIII para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de hemorragias en un sujeto que padece un
síndrome sensible al FVIII. En otro aspecto, la invención se refiere
al uso de un polipéptido del FVII y un polipéptido del FVIII para
la preparación de un medicamento para el tratamiento de hemorragias
en un sujeto con un nivel reducido de FVIII. En una forma de
realización, el medicamento es para el tratamiento de hemorragias
en pacientes de hemofilia A. En una forma de realización, el
medicamento comprende una mezcla de un polipéptido del FVII y un
polipéptido del FVIII. En una forma de realización, el medicamento
está preparado en forma de una primera forma de dosificación que
comprende un polipéptido del FVII y una segunda forma de
dosificación que comprende un polipéptido del FVIII. En una forma
de realización, el polipéptido del FVII es FVIIa recombinante
humano. En una forma de realización, el polipéptido del FVIII es
FVIII recombinante humano.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para aumentar la hemostasis en un sujeto que sufre de un
síndrome sensible al FVIII en comparación con cuando el sujeto es
tratado con FVIII como única proteína de coagulación, el método
comprendiendo la administración al sujeto en necesidad del mismo de
una cantidad eficaz de un polipéptido del FVII y una cantidad
eficaz de un polipéptido del FVIII.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para aumentar la hemostasis en un sujeto con un nivel
reducido de FVIII en comparación con cuando el sujeto es tratado
con FVIII como la única proteína de coagulación, el método
comprendiendo la administración al sujeto en necesidad del mismo de
una cantidad eficaz de un polipéptido del FVII y una cantidad eficaz
de un polipéptido del FVIII.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para aumentar la formación de trombina en un sujeto que
padece un síndrome sensible al FVIII en comparación con cuando el
sujeto es tratado con FVIII como única proteína de coagulación, el
método comprendiendo la administración al sujeto en necesidad del
mismo de una cantidad eficaz de un polipéptido del FVII y una
cantidad eficaz de un polipéptido del FVIII.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para aumentar la formación de trombina en un sujeto con un
nivel reducido de FVIII en comparación con cuando el sujeto es
tratado con FVIII como única proteína de coagulación, el método
comprendiendo la administración al sujeto en necesidad del mismo de
una cantidad eficaz de un polipéptido del FVII y una cantidad
eficaz de un polipéptido del FVIII.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para reducir el número de administraciones de proteína del
factor de coagulación necesarias para aumentar la hemostasis en un
sujeto que padece un síndrome sensible al FVIII en comparación con
el número de administraciones necesarias cuando FVIII es
administrado al sujeto como única proteína del factor de
coagulación, el método comprendiendo la administración a un sujeto
en necesidad del mismo de una cantidad eficaz de un polipéptido del
FVII y una cantidad eficaz de un polipéptido del FVIII.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para reducir el número de administraciones de proteína del
factor de coagulación necesarias para aumentar la hemostasis en un
sujeto con un nivel reducido de FVIII en comparación con el número
de administraciones necesarias cuando FVIII es administrado al
sujeto como única proteína del factor de coagulación, el método
comprendiendo la administración a un sujeto en necesidad del mismo
de una cantidad eficaz de un polipéptido del FVII y una cantidad
eficaz de un polipéptido del FVIII.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para reducir la cantidad de proteína del factor de
coagulación administrada necesaria para realizar la hemostasis en
un sujeto que padece un síndrome sensible al FVIII en comparación
con la cantidad de proteína de factor de coagulación administrada
necesaria cuando FVIII es administrado al sujeto como única
proteína del factor de coagulación, el método comprendiendo la
administración a un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad
eficaz de un polipéptido del FVII y una cantidad eficaz de un
polipéptido del FVIII.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para reducir la cantidad de proteína del factor de
coagulación administrada necesaria para aumentar la hemostasis en
un sujeto con un nivel reducido de FVIII en comparación con la
cantidad de proteína del factor de coagulación administrada
necesaria cuando FVIII es administrado al sujeto como única
proteína de factor de coagulación, el método comprendiendo la
administración a un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad
eficaz de un polipéptido del FVII y una cantidad eficaz de un
polipéptido del FVIII.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para tratar las hemorragias en un sujeto que padece un
síndrome sensible al FVIII, el método comprendiendo la
administración al sujeto en necesidad del mismo de una cantidad
eficaz de un polipéptido del FVII y un polipéptido del FVIII.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para tratar hemorragias en un sujeto con un nivel reducido
de FVIII, el método comprendiendo la administración al sujeto en
necesidad del mismo de una cantidad eficaz de un polipéptido del
FVII y un polipéptido del FVIII.
En una forma de realización de los métodos, el
polipéptido del FVII es FVIIa recombinante humano. En una forma de
realización, el polipéptido del FVIII es FVIII recombinante humano.
En una forma de realización, el sujeto padece de hemofilia A.
La presente invención está ilustrada con mayor
detalle por los ejemplos siguientes, los cuales, no obstante, no
deben ser interpretados como limitadores del objetivo de la
protección. Las características descritas en la descripción
precedente y en los ejemplos siguientes pueden, tanto por separado
como en cualquier combinación de las mismas, ser esenciales para
realizar la invención de diversas formas de la misma.
Ejemplo
1
Cuando un paciente de hemofilia A sin inhibidor
que padece hemorragias intracraneales es tratado con un producto de
FVIII comercialmente disponible generalmente necesitará entre 10 y
20 inyecciones o infusiones de FVIII para lograr la hemostasis. La
infusión de FVIII intentará conseguir una concentración inicial en
el plasma de FVIII de al menos el 80% del nivel normal seguido de
una concentración en el plasma del 50% durante una semana.
Tal paciente es tratado con una dosis de
90-180 \mug/kg en peso de NovoSeven® (Novo
Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y un producto de FVIII
administrado simultáneamente, o con una dosis de
90-180 pg/kg en peso de NovoSeven® (Novo Nordisk
A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y un producto de FVIII dentro de una
separación temporal, p. ej., de 5 minutos. Ambos productos son
inyectados a través del mismo acceso intravenoso. El paciente
experimenta un tiempo reducido para lograr detener la hemorragia y
un número reducido de inyecciones para mantener la hemostasis. Este
control conduce a una cantidad reducida total de uso de proteína
del factor de coagulación para detener la hemorragia y para la
hemostasis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El paciente es un paciente de hemofilia A sin
inhibidor que padece hemorragias causadas por el síndrome de
compartimiento en la extremidad superior derecha debido a
traumatismos externos. Cuando este paciente es tratado con un
producto de FVIII comercialmente disponible él generalmente
necesitará entre 20 y 40 inyecciones o infusiones de FVIII para
lograr la hemostasis, frecuentemente relacionada con la cirugía de
emergencia. La infusión de FVIII intentará lograr una concentración
inicial de FVIII en el plasma de al menos el 80 al 100% seguido de
una concentración en el plasma del 50% durante 1 a 2 semanas.
Tal paciente es tratado con una dosis de
90-180 \mug/kg en peso de NovoSeven® (Novo
Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y un producto de FVIII
administrado simultáneamente o con una dosis de
90-180 \mug/kg en peso de NovoSeven® (Novo
Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y un producto de FVIII dentro de
una separación temporal p. ej., de 5 minutos. Ambos productos son
inyectados a través del mismo acceso intravenoso. El paciente
experimenta un tiempo reducido para obtener la detención de la
hemorragia y un número reducido de inyecciones para mantener la
hemostasis. Este control conduce a una cantidad reducida total de
uso de proteína del factor de coagulación para detener la
hemorragia y la hemostasis.
Justo antes de la cirugía, una dosis repetida de
FVIIa en combinación con FVIII puede ser pertinente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El paciente es un paciente de hemofilia A sin
inhibidor que padece hemorragias gastrointestinales secundarias
para el uso de NSAID (fármaco antiinflamatorio no esteroideo).
Cuando tal paciente es tratado con un producto de FVIII
comercialmente disponible generalmente necesitará entre 20 y 40
inyecciones o infusiones de FVIII para lograr la hemostasis,
frecuentemente en relación con la gastroscopia de emergencia.
La infusión de FVIII intentará conseguir una
concentración inicial de FVIII en el plasma de al menos el 80 al
100% seguido de una concentración en el plasma del 50% durante 5 a
10 días.
Tal paciente es tratado con una dosis de
90-180 \mug/kg en peso de NovoSeven® (Novo
Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y un producto de FVIII
administrado simultáneamente o con una dosis de
90-180 \mug/kg en peso de NovoSeven® (Novo
Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y un producto de FVIII dentro de
una separación temporal p. ej., de 5 minutos. Ambos productos son
inyectados a través del mismo acceso intravenoso. El paciente
experimenta un tiempo reducido para obtener la detención de la
hemorragia y un número reducido de inyecciones para mantener la
hemostasis. Este control conduce a una cantidad total reducida de
uso de la proteína del factor de coagulación para detener la
hemorragia y para la hemostasis.
Justo antes de la gastroscopia, una dosis
repetida de FVIIa en combinación con FVIII puede ser
pertinente.
\newpage
Ejemplo
4
El paciente está padeciendo hemorragias difusas
debido a un traumatismo externo. Antes de esta condición de
hemorragia difusa el paciente ha sido tratado con grandes
cantidades de fluidos para la inyección i.v., productos de infusión
de coloides, albúmina y concentrados de glóbulos rojos. Este estado
multitransfundido clínico se caracteriza por cantidades de
plaquetas bajas y concentración baja de fibrinógeno y FVIII.
El tratamiento incluirá la transfusión con
plaquetas, plasma fresco congelado y productos de FVIII. La
infusión de FVIII intentará conseguir al menos un 80% del nivel
normal y será continuada hasta que el estado de hemorragia difusa
sea resuelto.
Tal paciente es tratado con una dosis de
90-180 \mug/kg en peso de NovoSeven® (Novo
Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y un producto de FVIII
administrado simultáneamente o con una dosis de
90-180 \mug/kg en peso de NovoSeven® (Novo
Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y un producto de FVIII dentro de
una separación temporal p. ej., de 5 minutos. Ambos productos son
inyectados a través del mismo acceso intravenoso. El paciente
experimenta un tiempo reducido para lograr detener la hemorragia de
los sitios de hemorragia múltiples y un número reducido de
inyecciones para mantener la hemostasis. Este control conduce a una
cantidad reducida total del uso de proteína de factor de
coagulación para detener la hemorragia y para la hemostasis y para
beneficiar la supervivencia.
Justo antes de la cirugía o de procedimientos
invasivos una dosis repetida de FVIIa en combinación con FVIII
puede ser pertinente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
El paciente es un paciente de hemofilia A sin
inhibidor que padece hemorragias, p. ej., hemorragias
intracraneales.
Cuando tal paciente es tratado con un producto
de FVIII comercialmente disponible generalmente necesitará entre 10
y 20 inyecciones o infusiones de FVIII para lograr la hemostasis.
La infusión de FVIII intentará lograr una concentración de FVIII
inicial en el plasma de al menos el 80% del nivel normal seguido de
una concentración en el plasma del 50% durante una semana. Los
ensayos in vivo.
Tal paciente es tratado con una dosis de
90-180 \mug/kg en peso de NovoSeven® (Novo
Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y un producto de FVIII
administrado simultáneamente, o con una dosis de
90-180 \mug/kg en peso de NovoSeven® (Novo
Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y un producto de FVIII dentro de
una separación temporal, p. ej., de 5 minutos. Ambos productos son
inyectados a través del mismo acceso intravenoso. Diez minutos
después de la administración de la última de las dos proteínas de
coagulación una muestra de sangre es extraída y un análisis de
coagulación sanguínea es realizado usando el método
tromboelastográfico que es un ensayo estandarizado, clínico
pertinente para el estado de coagulación (véase, por ejemplo, Meh
et al., BLOOD COAGULATION & FIBRINOLYSIS
2001;12:627-637). Usando parámetros de lectura
estándares de tal ensayo, se demostró el aumento de la formación de
coágulos de fibrina, el aumento de la resistencia del coágulo y la
prolongación del tiempo de tisis del coágulo. Tal medición en
muestras de sangre secuenciales demuestra la variación de estos
parámetros como función temporal después de la inyección de los
productos del factor VII y del factor VIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Ensayo de coagulación: la actividad de
coagulación específica del factor VIIa recombinante (rFVIIa) de la
coagulación humana, en ausencia o presencia de varias
concentraciones en el plasma de factor VIII humano purificado
(FVIII) fue medida en ensayos en una etapa tal y como se ha
descrito anteriormente (Persson et al., J Biol Chem 276:
29195-9, 2001). En resumen, partes alícuotas (55
\mul) de rFVIIa (0.2-3 \mug/ml, materia prima de
Novo Nordisk) en tubos de 50 mM, 100 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 1%
de BSA, pH 7.2, fueron mezclados con un tampón de igual volumen
conteniendo 50 mM de CaCl_{2} y vesículas de
fosfatidilcolina/fosfatidilserina (concentración de fosfolípidos
total 100 \muM; 80% de fosfatidilserina/20% de fosfatidicolina),
y la coagulación comenzó añadiendo 55 \mul de plasma humano
normal (plasma mezclado estándar de Novo Nordisk) o plasma
deficitario de FVIII (Helena Labs Helena Labs #5793) añadiendo
varias concentraciones de FVIII ((10, 50, y 80% de la concentración
en el plasma, Haematologic Technologies). La coagulación fue
continuada durante 400 segundos en un coagulómetro ACL 300 Research
(Instrumentation Laboratory, Milán, Italia) usando el programa APTT
estándar.
Ensayo de coagulación: rFVIIa y FVIII, de forma
separada y en combinación, fueron añadidos al plasma humano
deficitario de FVIII y normal y los tiempos de coagulación fueron
determinados. Antes de la adición de rFVIIa/FVIII el tiempo de
coagulación de ambos plasmas fue más largo que el tiempo de control
de 400 segundos. El efecto de reducción de coágulos de rFVIIa en
ausencia y presencia de FVIII en plasma humano deficitario de FVIII
y normal está mostrado en la figura 1 y 2, respectivamente.
Estos resultados demuestran que la combinación
de rFVIIa y FVIII es capaz de reducir el tiempo de coagulación de
ambos plasmas deficitarios de FVIII y normal por encima de lo
observado al añadir las proteínas por separado.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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Claims (21)
1. Composición farmacéutica comprendiendo:
(a) una preparación de factor VIIa humano o una
variante de aminoácido de factor VIIa humano que tiene no más de 20
aminoácidos sustituidos, deleccionados o insertados en comparación
con el factor VIIa de tipo salvaje, y
(b) una preparación de factor VIII humano o una
forma truncada de factor VIII humano, donde (a) y (b) son los
únicos agentes hemostáticos de la composición.
2. Composición según la reivindicación 1, donde
la proporción entre la actividad de la variante del factor VIIa y
la actividad del factor VIIa humano nativo (tipo salvaje FVIIa) es
al menos aproximadamente 1,25 evaluada en el "Ensayo de
hidrólisis in vitro" según está descrito en la
presente.
3. Composición según la reivindicación 1, donde
el factor VIIa humano es factor VIIa humano recombinante.
4. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde el factor VIII humano
es el factor VIII humano recombinante.
5. Composición según la reivindicación 1, donde
la forma truncada de FVIII humano es un factor VIII humano sin
dominio B.
6. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, donde el polipéptido del
factor VIIa humano y el polipéptido del factor VIII humano están
presentes en una proporción por masa de entre aproximadamente 100:1
y aproximadamente 1:100 (p/p factor VII: factor VIII).
7. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde la composición está
destinada para el tratamiento de hemorragias en un sujeto.
8. Kit de piezas para el tratamiento de
hemorragias en un sujeto, comprendiendo:
a) una cantidad eficaz de una preparación de
factor VIIa humano o una variante de aminoácido de factor VIIa
humano que tiene no más de 20 aminoácidos sustituidos,
deleccionados o insertados en comparación con el factor VIIa de
tipo salvaje, y un portador farmacéuticamente aceptable en una
primera forma de dosificación unitaria;
b) una cantidad eficaz de una preparación de
factor VIII humano o una forma truncada del factor VIII humano, y
un portador farmacéuticamente aceptable en una segunda forma de
dosificación unitaria; y
c) medios de contención para contener dicha
primera y segunda formas de dosificación,
donde (a) y (b) son los únicos
agentes hemostáticos del
kit.
9. Kit según la reivindicación 8, donde la
proporción entre la actividad de la variante del factor VIIa humano
y la actividad del factor VIIa humano nativo (FVIIa de tipo
salvaje) es al menos aproximadamente 1,25 evaluada en el "Ensayo
de hidrólisis in vitro" como se describe en la presente
descripción.
10. Kit según la reivindicación 8, donde el
factor VIIa humano es el factor VIIa humano recombinante.
11. Kit según cualquiera de las
reivindicaciones 8-10, donde el factor VIII humano
es el factor VIII humano recombinante.
12. Kit según la reivindicación 8, donde el
FVIII humano truncado es un factor VIII humano sin dominio B.
13. Kit según cualquiera de las
reivindicaciones 8-12, donde el polipéptido del
factor VIIa y el polipéptido del factor VIII humano están presentes
en una proporción por masa de entre aproximadamente 100:1 y
aproximadamente 1:100 (p/p factor VIIa:factor VIII).
14. Kit según cualquiera de las
reivindicaciones 8-14, donde la composición es para
el tratamiento de hemorragias en un sujeto con un nivel reducido de
factor VIII, preferiblemente para el tratamiento de hemorragias en
sujetos con hemofilia A.
15. Uso de una preparación de (a) factor VIIa
humano o una variante de aminoácido de factor VIIa humano que tiene
no más de 20 aminoácidos sustituidos, deleccionados o insertados en
comparación con el factor VIIa de tipo salvaje en combinación con
una preparación de (b) factor VIII humano o una forma truncada de
factor VIII humano como los únicos agentes hemostáticos para la
producción de un medicamento para tratar hemorragias en un
sujeto.
sujeto.
16. Uso según la reivindicación 15, donde la
proporción entre la actividad de la variante del factor VIIa humano
y la actividad del factor VIIa humano nativo (FVIIa tipo salvaje) es
al menos aproximadamente 1,25 evaluado en el "Ensayo de
hidrólisis in vitro" como se describe en la presente
descripción.
17. Uso según la reivindicación 15, donde el
factor VIIa humano es el factor VIIa humano recombinante.
18. Uso según la reivindicación 15, donde el
factor VIII humano es el factor VIII humano recombinante.
19. Uso según la reivindicación 16, donde el
FVIII humano truncado es un factor VIII humano con el dominio B
deleccionado.
20. Uso según cualquiera de las
reivindicaciones 15-19, donde el medicamento está
en forma de monodosis.
21. Uso según cualquiera de las
reivindicaciones 15-19, donde el medicamento está
preparado en forma de una primera forma de dosificación
comprendiendo un factor VIIa humano de preparación o una variante
de aminoácido de factor VIIa humano con no más de 20 aminoácidos
sustituidos, deleccionados o insertados en comparación con el
factor VIIa de tipo salvaje, y una segunda forma de dosificación
comprendiendo una preparación de factor VIII humano o una forma
truncada del factor VIII humano.
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