ES2304529T3 - Inmunoestimulacion mediante rna modificado quimicamente. - Google Patents
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Abstract
Utilización de como mínimo un RNA de cadena simple que presenta como mínimo una modificación química, consistiendo el RNA en 8 a 200 nucleótidos y conteniendo el RNA como mínimo un análogo de nucleótidos naturales, para la producción de un agente inmunoestimulador.
Description
Inmunoestimulación mediante RNA modificado
químicamente.
La presente invención se refiere a la
utilización de como mínimo un RNA de cadena simple modificado
químicamente para la producción de un agente inmunoestimulador. La
invención también se refiere a una vacuna que contiene como mínimo
un antígeno junto con el agente inmunoestimulador. El agente
inmunoestimulador según la invención y la vacuna según la invención
se utilizan principalmente contra enfermedades infecciosas o
enfermedades
cancerosas.
cancerosas.
El RNA desempeña un papel central en la
expresión de la información genética en la célula en forma de RNAm,
RNAt y RNAr. Sin embargo, en algunas investigaciones también se ha
comprobado que el RNA participa como tal en la regulación de
algunos procesos, en particular en el organismo de mamíferos. El RNA
puede ejercer la función de sustancia mensajera de comunicación
(Benner, FEBS Lett. 1988, 232: 225-228). También se
ha descubierto un RNA que presenta una gran homología con un RNAm
normal, pero que no es traducido, sino que ejerce una función en la
regulación intracelular (Brown et al., Cell 1992, 71:
527-542). Este RNA con efecto regulador se
caracteriza por una secuencia incompleta del sitio de unión de
ribosomas (secuencia de Kozak: GCCGCCACCAUGG, en la que el
AUG constituye el codón de iniciación (véase Kozak, Gene
Expr. 1991, 1 (2): 117-125)), por la que se
diferencia del RNAm (normal). Además se ha podido demostrar que
esta clase de RNA regulador también está presente en células
activadas del sistema inmunológico, por ejemplo células CD4^{+}T
(Liu et al., Genomics 1997, 39:
171-184).
Tanto la vacunación clásica como la vacunación
genética tienen frecuentemente el problema de provocar sólo una
respuesta inmune pequeña, y en consecuencia a menudo insuficiente,
en el organismo a tratar o a vacunar. Por ello, con frecuencia a
las vacunas se les añaden sustancias llamadas adyuvantes, es decir,
sustancias que pueden aumentar una respuesta inmune contra un
antígeno y/o influir selectivamente en la misma. Algunos adyuvantes
muy conocidos en el estado actual de la técnica son, por ejemplo,
hidróxido de aluminio, el adyuvante de Freund y similares. Sin
embargo, estos adyuvantes provocan efectos secundarios no deseados,
por ejemplo irritaciones e inflamaciones muy dolorosas en el lugar
de administración. También se observan efectos secundarios tóxicos,
en particular necrosis tisulares. Por último, estos adyuvantes
conocidos sólo provocan una estimulación insuficiente de la
respuesta inmune celular, ya que únicamente activan células B.
También se sabe que el DNA bacteriano tiene un
efecto inmunoestimulador debido a la presencia de motivos CG no
metilados, por lo que este DNA-CpG ha sido propuesto
como medio inmunoestimulador por sí mismo y como adyuvante para
vacunas; véase la patente US 5,663,153. Esta propiedad
inmunoestimuladora del DNA también se puede lograr a través de
oligonucleótidos de DNA estabilizados mediante modificación con
fosforotioato (patente US 6,239,116). Finalmente, la patente US
6,406,705 da a conocer composiciones de adyuvante que contienen una
combinación sinérgica de un
oligodesoxirribonucleótido-CpG y un adyuvante que no
es ácido nucleico.
Sin embargo, la utilización de DNA como agente
inmunoestimulador o como adyuvante en vacunas es desventajosa desde
varios puntos de vista. El DNA se descompone en la corriente
sanguínea a una velocidad relativamente lenta, por lo que al
utilizar DNA inmunoestimulador se puede producir una formación de
anticuerpos anti-DNA, como ha sido confirmado en el
modelo animal con ratones (Gilkeson et al., J. Clin. Invest.
1995, 95: 1398-1402). La posible persistencia del
DNA en el organismo puede conducir a una sobreactivación del sistema
inmunológico, que, como es sabido, en los ratones resulta en una
esplenomegalia (Montheith et al., Anticancer Drug Res. 1997,
12 (5): 421-432). Además, el DNA puede interaccionar
con el genoma huésped, en particular puede provocar mutaciones por
integración en el genoma huésped. Por ejemplo, se puede producir una
inserción del DNA introducido en un genoma intacto, lo que
constituye una mutación que obstaculiza o elimina por completo la
función del gen endógeno. Estos sucesos de integración pueden
eliminar sistemas enzimáticos de vital importancia para la célula,
y además existe el peligro de que la célula así modificada se
transforme quedando en un estado degenerado si mediante la
integración del DNA extraño se modifica un gen decisivo para la
regulación del crecimiento celular. Por ello, si se utiliza DNA
como agente inmunoestimulador no se puede excluir el riesgo de
cancerización.
Riedl et al. (J. Immunol 2002,
168(10): 4951-4959) manifiestan que un RNA
unido a un dominio rico en Arg de la nucleocápsida HBcAg provoca
una respuesta inmune mediada por Th1 contra HbcAg. El dominio rico
en Arg de la nucleocápsida presenta similitud con protaminas y se
une a ácidos nucleicos de forma no específica.
El documento WO 03/028656 da a conocer una
composición utilizada como adyuvante, que consiste en un inductor
de interferón junto con una molécula inmunoestimuladora, siendo las
moléculas inmunoestimuladoras moléculas de RNA de cadena doble.
Teplova et al. (Nature Structural
Biology, vol. 6 (6) pp. 535-539, 1999) dan a conocer
una molécula de RNA modificada con 12 pares de bases en estructura
dúplex. La molécula de RNA dúplex dada a conocer en dicho documento
afecta a una sustitución de metoxi-etilo.
Por último, Minks et al. (The Journal of
Biological Chemistry, vol. 254(20) pp.
10181-10183, 1979) dan a conocer características de
un RNA de cadena doble que puede activar una respuesta a
interferón.
\newpage
Por consiguiente, la presente invención tiene
por objetivo crear un nuevo sistema para mejorar la
inmunoestimulación en general y la vacunación en particular, que
provoque una respuesta inmune especialmente eficaz en el paciente a
tratar o a vacunar y que no obstante evite las desventajas de los
inmunoestimuladores conocidos.
Este objetivo se resuelve mediante las formas de
realización de la presente invención caracterizadas en las
reivindicaciones.
En particular, de acuerdo con la invención se
utiliza como mínimo un RNA de cadena simple que presenta como
mínimo una modificación química, consistiendo el RNA en 8 a 200
nucleótidos y conteniendo el RNA como mínimo un análogo de
nucleótidos naturales, para producir un agente inmunoestimulador. En
términos generales, de acuerdo con la presente invención se da a
conocer la utilización de este RNA modificado químicamente para la
producción de un agente inmunoestimulador.
La presente invención se basa en la sorprendente
constatación de que el RNA modificado químicamente activa con
especial intensidad células del sistema inmunológico (sobre todo
células presentadoras de antígenos, en particular células
dendríticas (DC), y también las células defensoras, por ejemplo en
forma de células T), y de este modo estimula el sistema
inmunológico de un organismo. La utilización según la invención del
RNA modificado químicamente conduce en particular a un aumento de
la liberación de citoquinas, por ejemplo interleuquinas, como
IL-6, IL-12, etc.
Por ello, el agente inmunoestimulador de la
presente invención se puede utilizar por ejemplo contra infecciones
o enfermedades cancerosas, por ejemplo inyectándolo en el organismo
infectado o en el propio tumor. Como ejemplos de enfermedades
cancerosas tratables con el agente inmunoestimulador producido se
pueden mencionar: melanoma maligno, carcinoma de colon, linfomas,
sarcomas, carcinoma pulmonar de células pequeñas, blastomas, etc.
Además, el agente inmunoestimulador se utiliza ventajosamente
contra enfermedades infecciosas (por ejemplo enfermedades
infecciosas virales, como el SIDA (VIH), hepatitis A, B o C, herpes,
herpes zoster (varicelas), rubéola (virus de la rubéola), fiebre
amarilla, dengue, etc. (Flavivirus), gripe (Influenzavirus),
enfermedades infecciosas hemorrágicas (virus de Marburg o virus
Ebola), enfermedades infecciosas bacterianas, como la enfermedad de
los legionarios (Legionella), úlcera de estómago (Helicobacter),
cólera (Vibrio), infecciones por E. coli, infecciones por
estafilococos, infecciones por Salmonella o infecciones por
estreptococos (tétanos), enfermedades infecciosas protozoológicas
(malaria, enfermedad del sueño, leishmaniasis, toxoplasmosis, es
decir, infecciones por Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania,
Toxoplasma, o infecciones fúngicas provocadas por ejemplo por
Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coxidioides
immitis, Blastomyces dermatitidis o Candida albicans.
La expresión "modificación química"
significa que el RNA utilizado según la invención está modificado en
comparación con las especies de RNA naturales mediante sustitución,
adición o eliminación de uno o varios átomos o grupos de
átomos.
La modificación química está configurada de tal
modo que el RNA contiene como mínimo un análogo de nucleótidos
naturales.
En una enumeración en modo alguna definitiva,
como ejemplos de análogos de nucleótidos utilizables según la
invención se pueden mencionar fosforamidatos, fosforotioatos,
peptidonucleótidos, metil-fosfonatos,
7-deazaguanosina,
5-metil-citosina e inosina. La
preparación de estos análogos es conocida por los especialistas y se
da a conocer por ejemplo en las patentes US 4,373,071, US
4,401,796, US 4,415,732, US 4,458,066, US 4,500,707, US 4,668,777,
US 4,973,679, US 5,047,524, US 5,132,418, US 5,153,319, US 5,262,530
y 5,700,642. De forma especialmente preferente, el RNA consiste en
análogos de nucleótido, por ejemplo los análogos anteriormente
mencionados.
Otra modificación química puede consistir por
ejemplo en la adición de una, así llamada, estructura
"5'-Cap", es decir, un nucleótido guanosina
modificado, en particular m7G(5')ppp
(5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.
De acuerdo con la presente invención, el RNA
modificado químicamente consiste en moléculas de RNA relativamente
cortas formadas por 8 a aproximadamente 200 nucleótidos, de forma
especialmente preferente 15 a aproximadamente 31 nucleótidos.
De acuerdo con la invención, el RNA utilizado
como agente inmunoestimulador puede ser de cadena simple.
En ejemplos específicos de especies de RNA de
cadena simple utilizables según la invención, el RNA presenta una
de las siguientes secuencias:
5'-UCCAUGACGUUCCUGAUGCU-3',
5'-UCCAUGACGUUCCUGACGUU-3' o
5'-UCCAGGACUUCUCUCAGGUU-3'. En ese
contexto, de forma especialmente preferente las especies de RNA de
cadena simple están modificadas con fosforotioato.
En caso dado, el agente inmunoestimulador
producido puede contener el RNA de cadena simple modificado
químicamente junto con un soporte y/o vehículo farmacéuticamente
compatible.
El agente inmunoestimulador producido puede
contener uno o más adyuvantes para aumentar la inmunogenicidad. En
relación con la inmunoestimulación, de este modo preferentemente se
logra un efecto sinérgico del RNA modificado químicamente según la
invención y el adyuvante. Por "adyuvante" se ha de entender
todo compuesto que favorezca una respuesta inmune. A este respecto,
en función de los diferentes tipos de adyuvantes pueden entrar en
consideración diferentes mecanismos. Por ejemplo, una primera clase
de adyuvantes adecuados está formada por compuestos que permiten la
maduración de las DC, por ejemplo lipopolisacáridos,
TNF-\alpha o ligando CD40. En general, como
adyuvante se puede utilizar cualquier agente del tipo de una
"señal de peligro" (LPS, GP96, etc.) o citoquinas, como
GM-CFS, que influya en el sistema inmunológico y que
permita aumentar y/o influir selectivamente en una respuesta
inmune. En caso dado también se pueden utilizar
oligonucleótidos-CpG, pero se han de ponderar los
efectos secundarios que pueden aparecer en determinadas
circunstancias, tal como se ha descrito más arriba. Sin embargo,
debido a la presencia del agente inmunoestimulador producido
utilizando el RNA de cadena simple modificado químicamente como
inmunoestimulador primario, sólo es necesaria una cantidad
relativamente pequeña de DNA-CpG (en comparación
con una inmunoestimulación exclusivamente con
DNA-CpG), por lo que un efecto sinérgico del agente
inmunoestimulador producido y el DNA-CpG
generalmente conduce a una valoración positiva de esta combinación.
Algunos adyuvantes especialmente preferentes son citoquinas, como
monoquinas, linfoquinas, interleuquinas o quimioquinas, por ejemplo
IL-1, IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-8, IL-9,
IL-10, IL-12,
IFN-\alpha, IFN-\gamma,
GM-CFS, LT-\alpha o factores de
crecimiento, por ejemplo hGH; otros adyuvantes conocidos preferentes
son hidróxido de aluminio, el adyuvante de Freund y los péptidos o
polipéptidos catiónicos estabilizadores mencionados más abajo, como
protamina, y también polisacáridos catiónicos, en particular
quitosana. También se pueden utilizar de forma especialmente
adecuada lipopéptidos, como Pam3Cys, como adyuvantes en el agente
inmunoestimulador de la presente invención; véase Deres et
al., Nature 1989, 342: 561-564.
Además de su utilización directa para iniciar
una reacción inmune, por ejemplo contra un germen patógeno o contra
un tumor, el agente inmunoestimulador también se puede utilizar
ventajosamente para reforzar la respuesta inmune contra un
antígeno. Por ello, el RNA modificado químicamente se puede utilizar
para producir una vacuna en la que éste actúe como un adyuvante que
favorece la respuesta inmune específica contra el antígeno o los
antígenos correspondientes.
Por consiguiente, otro objeto de la presente
invención consiste en una vacuna que contiene el RNA de cadena
simple modificado químicamente anteriormente definido y como mínimo
un antígeno.
En la vacunación "clásica", la vacuna según
la invención o la vacuna a producir utilizando el RNA de cadena
simple modificado químicamente contiene el propio o los propios
antígenos. Por un "antígeno" se ha de entender toda estructura
que pueda provocar la formación de anticuerpos y/o la activación de
una respuesta inmune celular. Por consiguiente, de acuerdo con la
invención los conceptos "antígeno" e "inmunógeno" se
utilizan como sinónimos. Los antígenos son por ejemplo, péptidos,
polipéptidos, por tanto también proteínas, células, extractos
celulares, polisacáridos, conjugados de polisacáridos, lípidos,
glicolípidos e hidratos de carbono. Como antígenos entran en
consideración, por ejemplo, antígenos tumorales, virales,
bacterianos, fúngicos y protozoológicos. Son preferentes los
antígenos de superficie de células tumorales y los antígenos de
superficie, en particular formas segregadas, de patógenos virales,
bacterianos, fúngicos o protozoológicos. Evidentemente, el antígeno
también puede estar presente en la vacuna según la invención en
forma de un hapteno acoplado a un vehículo adecuado. Los
especialistas conocen vehículos adecuados, que incluyen por ejemplo
albúmina sérica humana (HSA), polietilén-glicoles
(PEG), y similares. El acoplamiento del hapteno al vehículo tiene
lugar de acuerdo con procedimientos conocidos en el estado actual
de la técnica, por ejemplo, en caso de un vehículo de polipéptido a
través de un enlace de amida a un radical Lys.
En la vacunación genética con ayuda de la vacuna
según la invención o la vacuna genética a producir utilizando el
RNA modificado químicamente, la estimulación de una respuesta inmune
tiene lugar mediante la introducción de la información genética
para el antígeno o los antígenos (por consiguiente, en este caso un
antígeno de péptido o de polipéptido) en forma de un ácido nucleico
codificador de este antígeno, en particular un DNA o un RNA
(preferentemente un RNAm), en el organismo o en la célula. El ácido
nucleico contenido en la vacuna se traduce en el antígeno, es
decir, se expresa el polipéptido codificado por el ácido nucleico o
un péptido antigénico, con lo que se estimula una respuesta inmune
dirigida contra este antígeno. Por ello, en la vacunación contra un
germen patógeno, es decir, un virus, una bacteria o un germen
protozoológico, preferentemente se utiliza un antígeno de
superficie de un germen de este tipo para la vacunación con ayuda de
la vacuna según la invención que contiene un ácido nucleico
codificador del antígeno de superficie. En el caso de la utilización
como vacuna genética para el tratamiento del cáncer, la respuesta
inmune se logra a través de la introducción de la información
genética para antígenos tumorales, en particular proteínas, que son
expresados exclusivamente en células de cáncer, mediante la
administración de una vacuna según la invención que contiene un
ácido nucleico codificador de dicho antígeno de cáncer. De este
modo, el antígeno o los antígenos de cáncer son expresados en el
organismo, con lo que se provoca una respuesta inmune que está
dirigida de forma eficaz contra las células cancerosas.
La vacuna según la invención entra en
consideración principalmente para el tratamiento de enfermedades
cancerosas. Preferentemente se utiliza un antígeno de superficie
específico de tumor (TSSA) o un ácido nucleico que codifica un
antígeno de este tipo. En consecuencia, la vacuna según la invención
se puede utilizar para el tratamiento de las enfermedades
cancerosas anteriormente mencionadas en relación con el agente
inmunoestimulador según la invención. Los ejemplos específicos de
antígenos tumorales utilizables según la invención en la vacuna son
entre otros: 707-AP, AFP, ART-4,
BAGE, \beta-catenina/m, Bcr-abl,
CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m,
CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M,
ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100,
HAGE, HER-2/neu,
HLA-A*0201-R170I,
HPV-E7, HSP70-2M,
HAST-2, hTERT (o hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE,
LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A,
MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3,
NA88-A, NY-ESO-1,
p190 minor bcr-abl, Pml/RAR\alpha, PRAME, PSA,
PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o
SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1,
TRP-2, TRP-2/INT2 y WT1.
La vacuna según la invención también se utiliza
contra enfermedades infecciosas, en particular las infecciones
anteriormente mencionadas en relación con el agente
inmunoestimulador según la invención. En el caso de las
enfermedades infecciosas, en la vacuna también se utilizan
preferentemente los antígenos de superficie correspondientes con el
potencial antigénico más fuerte o un ácido nucleico codificador de
éstos. En el caso de los antígenos mencionados de gérmenes
patógenos u organismos, en particular en caso de antígenos virales,
típicamente se trata de una forma segregada de un antígeno de
superficie. Además, de acuerdo con la invención preferentemente se
utilizan poliepitopos o ácidos nucleicos codificadores de éstos, en
particular RNAm, tratándose preferentemente de poliepitopos de los
antígenos anteriormente mencionados, en particular antígenos de
superficie de gérmenes patógenos u organismos o células tumorales,
preferentemente formas de proteínas segregadas.
Por otra parte, un ácido nucleico codificador de
como mínimo un antígeno, que puede estar contenido en la vacuna
según la invención, además de la sección que codifica un péptido o
polipéptido antigénico también puede contener como mínimo otra
sección funcional que codifique por ejemplo una citoquina promotora
de la respuesta inmune, en particular las citoquinas
anteriormente mencionadas en relación con el "adyuvante".
Como ya se ha mencionado, el ácido nucleico que
codifica como mínimo un antígeno puede consistir en DNA o RNA. Para
introducir la información genética para un antígeno en una célula o
un organismo, en el caso de una vacuna de DNA según la invención
generalmente se requiere un vector adecuado que contenga una sección
que codifique el antígeno correspondiente. Como ejemplos
específicos de este tipo de vectores se pueden mencionar los
vectores de las series pVITRO, pVIVO, pVAC, pBOOST, etc. (InvivoGen,
San Diego, CA USA), que se describen en la URL
http://www.invivo-gen.com.
En relación con las vacunas de DNA según la
invención se pueden mencionar diferentes procedimientos para la
introducción del DNA en células, como por ejemplo transfección de
fosfato cálcico, transfección de polipreno, fusión de protoplastos,
electroporación, microinyección y lipofección, siendo especialmente
preferente la lipofección.
Sin embargo, en caso de una vacuna de DNA es
preferible utilizar virus de DNA como vehículo de DNA. Estos virus
tienen la ventaja de que, debido a sus propiedades infecciosas,
permiten alcanzar una tasa de transfección muy alta. Los virus
utilizados se modifican genéticamente para que no se forme ninguna
partícula infecciosa funcional en la célula transfectada.
Desde el punto de vista de la seguridad es
preferible utilizar RNA como el ácido nucleico que codifica como
mínimo un antígeno en la vacuna según la invención. Principalmente,
el RNA no implica el peligro de ser integrado de forma estable en
el genoma de la célula transfectada. Además, para lograr una
transcripción eficaz no se requiere ninguna secuencia viral, como
por ejemplo promotores. Por otra parte, el RNA se descompone in
vivo con mucha más facilidad.
Probablemente a causa de la vida media
relativamente corta del RNA en la circulación sanguínea en
comparación con la del DNA, hasta ahora no se ha detectado ningún
anticuerpo anti-RNA.
Por ello, de acuerdo con la invención el ácido
nucleico que codifica como mínimo un antígeno es preferentemente un
RNAm que contiene una sección que codifica como mínimo un antígeno
de péptido o polipéptido.
Sin embargo, el RNA en solución es
considerablemente más inestable que el DNA. La inestabilidad se debe
a unas enzimas que descomponen el RNA, llamadas RNasas
(ribonucleasas). La más mínima contaminación con ribonucleasas es
suficiente para descomponer por completo el RNA en solución.
Generalmente, esta contaminación con RNasa sólo se puede eliminar
mediante tratamientos especiales, en particular con
dietilpirocarbonato (DEPC). La descomposición natural de RNAm en el
citoplasma de células presenta una regulación muy fina. A este
respecto se conocen varios mecanismos. Por ejemplo, para un RNAm
funcional la estructura terminal tiene una importancia decisiva. En
el extremo 5' se encuentra la denominada "caperuza" (un
nucleótido guanosina modificado) y en el extremo 3' una sucesión de
hasta 200 nucleótidos adenosina (la llamada cola de
poli-A). A través de estas estructuras el RNA es
reconocido como RNAm y se regula la descomposición. Además existen
otros procesos que estabilizan o desestabilizan el RNA. Muchos de
estos procesos todavía son desconocidos, pero frecuentemente parece
ser determinante una interacción entre el RNA y proteínas. Por
ejemplo, recientemente se ha descrito un
"mRNA-Surveillance-System"
(sistema de vigilancia de RNAm) (Hellerin y Parker, Ann. Rev. Genet.
1999, 33: 229 a 260), en el que mediante determinadas interacciones
de feedback-proteína en el citosol se reconoce RNAm
incompleto o antisentido y se hace accesible para la descomposición,
siendo realizada la mayor parte de estos procesos por
exonucleasas.
Por ello es preferible estabilizar frente a la
descomposición por RNasas tanto el RNA modificado químicamente
según la invención como el RNA que codifica un antígeno, en
particular RNAm, dado el caso presente en la vacuna.
La estabilización del RNA modificado
químicamente y en caso dado del RNAm que codifica como mínimo un
antígeno puede tener lugar por asociación o complejación o por
unión del RNA modificado químicamente, o del RNAm en caso dado
presente que codifica el antígeno, con un compuesto catiónico, en
particular un compuesto policatiónico, por ejemplo una proteína o
un péptido (poli)catiónico. En este contexto, en particular
la utilización de protamina como proteína policatiónica de unión de
ácido nucleico es especialmente eficaz. También se pueden utilizar
otras proteínas o péptidos catiónicos, como
poli-L-lisina o histonas. Este
procedimiento para estabilizar el RNAm modificado está descrito en
el documento EP-A-1083232, cuyo
contenido publicado a este respecto está incluido en toda su
extensión en la presente invención. Otras sustancias catiónicas
preferentes que pueden ser utilizadas para la estabilización del
RNA modificado químicamente y/o del RNAm dado el caso contenido en
la vacuna según la invención incluyen polisacáridos catiónicos, por
ejemplo quitosana. La asociación o complejación con compuestos
catiónicos también mejora la transferencia de las moléculas de RNA a
las células a tratar o al organismo a tratar.
En las secuencias de RNAm eucariotas hay
elementos de secuencia desestabilizadores (DSE) a los que se unen
proteínas señal que regulan la descomposición enzimática del RNAm
in vivo. Por consiguiente, para una estabilización adicional
del RNAm contenido en la vacuna según la invención, en particular en
el área que codifica como mínimo un antígeno, se llevan a cabo una
o más modificaciones con respecto al área correspondiente del RNAm
de tipo salvaje, de modo que ya no contenga ningún elemento de
secuencia desestabilizador. Evidentemente, de acuerdo con la
invención también es preferible eliminar los DSE del RNAm dado el
caso presentes en las áreas no traducidas (3'- y/o
5'-UTR).
Del mismo modo, en relación con el agente
inmunoestimulador según la invención también es preferible que la
secuencia del RNA modificado químicamente contenido en el mismo no
presente ninguna secuencia desestabilizadora de este tipo.
Estas DSE arriba mencionadas son por ejemplo
secuencias ricas en AU ("AURES"), que están presentes en
secciones de 3'-UTR de numerosos RNAm inestables
(Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 a
1674). Por ello, las moléculas de RNA contenidas en la vacuna según
la invención preferiblemente están modificadas con respecto al RNAm
de tipo salvaje de tal modo que no presentan ninguna secuencia
desestabilizadora de este tipo. Esto también es aplicable a los
motivos de secuencia que son reconocidos por posibles endonucleasas,
por ejemplo la secuencia GAACAAG, que está incluida en el segmento
3'UTR del gen que codifica el receptor de transferrina (Binder
et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 a 1980). Preferentemente,
estos motivos de secuencia también se eliminan en las moléculas de
RNA modificadas químicamente del agente inmunoestimulador según la
invención, o en el RNAm dado el caso presente en la vacuna según la
invención.
Las moléculas de RNAm que pueden estar
contenidas en la vacuna según la invención también presentan
preferentemente una caperuza-5'. Como ejemplos de
caperuzas se pueden mencionar de nuevo: m7G(5')ppp
(5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.
Además, el RNAm también puede presentar análogos de nucleótidos
naturales, tal como se ha explicado más arriba en relación con el
RNA modificado químicamente.
De acuerdo con otra forma de realización
preferente de la presente invención, el RNAm contiene una cola de
poli-A de como mínimo 50 nucleótidos,
preferentemente como mínimo 70 nucleótidos, preferiblemente como
mínimo 100 nucleótidos, de forma especialmente preferente como
mínimo 200 nucleótidos.
Para una traducción eficiente del RNAm que
codifica como mínimo un antígeno también se requiere una unión
eficaz de los ribosomas al sitio de unión de ribosomas (secuencia de
Kozak: GCCGCCACCAUGG, el AUG constituye el codón de iniciación). A
este respecto se ha comprobado que un contenido elevado de A/U
alrededor de dicho sitio posibilita una unión más eficiente de los
ribosomas al RNAm.
También es posible insertar en el RNAm que
codifica como mínimo un antígeno uno o más, así llamados, IRES (en
inglés "internal ribosomal entry side"). Un IRES puede actuar
como único sitio de unión de ribosomas, pero también puede servir
para la preparación de un RNAm que codifica varios péptidos o
polipéptidos que han de ser traducidos independientemente entre sí
por los ribosomas ("RNAm multicistrónico"). Las secuencias de
IRES utilizables según la invención son por ejemplo las procedentes
de picornavirus (por ejemplo FMDV), pestivirus (CFFV), poliovirus
(PV), virus de la encefalomiocarditis (ECMV), virus de la fiebre
aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la fiebre
porcina clásica (CSFV), virus del leucoma murino (MLV), virus de la
inmunodeficiencia del simio (SIV) o virus de la parálisis cricket
(CrPV).
De acuerdo con otra forma realización preferente
de la presente invención, el RNAm presenta en las áreas no
traducidas en 5' y/o 3' secuencias estabilizadoras que pueden
aumentar la vida media del RNAm en el citosol.
Las secuencias estabilizadoras pueden presentar
una homología secuencia de un 100% con respecto a las secuencias
naturales presentes en virus, bacterias y eucariotas, pero también
pueden ser de índole parcial o totalmente sintética. Como ejemplos
de secuencias estabilizadoras utilizables en la presente invención
se pueden mencionar las secuencias no traducidas (UTR) del gen de
\beta-globina, por ejemplo de Homo sapiens
o Xenopus laevis. Otro ejemplo de una secuencia
estabilizadora presenta la fórmula general
(C/U)CCAN_{x}CCC(U/A)Py_{x}UC(C/U)CC,
que está incluida en el 3'UTR del RNAm muy estable que codifica
\alpha-globina,
\alpha-(I)-colágeno,
15-lipoxigenasa o
tirosina-hidroxilasa (Holcik et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410-2414).
Evidentemente, estas secuencias estabilizadoras
se pueden utilizar de forma individual o en combinación entre sí, o
también en combinación con otras secuencias estabilizadoras
conocidas por los especialistas.
Para aumentar adicionalmente la eficacia de
traducción del RNAm dado el caso contenido en la vacuna según la
invención, el área que codifica como mínimo un antígeno (y también
cualquier otra sección codificadora incluida en caso dado) puede
presentar las modificaciones indicadas más abajo con respecto a un
RNAm de tipo salvaje correspondiente, que pueden estar presentes de
forma alternativa o en combinación.
Por una parte, el contenido de G/C del área del
RNAm modificado que codifica el péptido o polipéptido puede ser
mayor que el contenido de G/C del área codificadora del RNAm de tipo
salvaje que codifica el péptido o polipéptido, permaneciendo
inalterada la secuencia de aminoácidos codificadora con respecto al
tipo salvaje.
Esta modificación se basa en el hecho de que
para lograr una traducción eficaz de un RNAm es esencial la sucesión
de secuencia del área a traducir del RNAm. En este contexto, la
composición y la sucesión de los diferentes nucleótidos desempeñan
un papel importante. Principalmente, las secuencias con un contenido
elevado de G(guanosina)/C(citosina) son más estables
que las secuencias con un contenido elevado de
A(adenosina)/U(uracilo). Por consiguiente, de acuerdo
con la invención, los codones se varían con respecto al RNAm de tipo
salvaje de tal modo que aumente su contenido de nucleótidos G/C,
manteniendo la sucesión de aminoácidos traducida. Dado que varios
codones codifican un mismo aminoácido (degeneración del código
genético), se pueden determinar los codones favorables para la
estabilidad (utilización de codones alternativa, en inglés "codon
usage").
Dependiendo del aminoácido a codificar por el
RNAm, existen diferentes posibilidades de modificación de la
secuencia de RNAm con respecto a la secuencia de tipo salvaje. En el
caso de los aminoácidos codificados por codones que contienen
exclusivamente nucleótidos G o C, no se requiere ninguna
modificación del codón. Por ejemplo, los codones para Pro (CCC o
CCG), Arg (CGC o CGG), Ala (GCC o GCG) y Gly (GGC o GGG) no
requieren ninguna modificación, ya que no hay presente ninguna A o
U.
En los siguientes casos, los codones que
contienen nucleótidos A y/o U se cambian mediante sustitución por
otros codones que codifican los mismos aminoácidos pero que no
contienen ninguna A y/o ninguna U, por ejemplo:
- -
- los codones para Pro se pueden cambiar de CCU o CCA a CCC o CCG;
- -
- los codones para Arg se pueden cambiar de CGU o CGA o AGA o AGG a CGC o CGG;
- -
- los codones para Ala se pueden cambiar de GCU o GCA a GCC o GCG;
- -
- los codones para Gly se pueden cambiar de GGU o GGA a GGC o GGG.
\vskip1.000000\baselineskip
En otros casos no es posible eliminar
nucleótidos A o U de los codones, pero si se puede reducir el
contenido de A y U utilizando codones que contengan menos
nucleótidos A y/o U, por ejemplo:
- -
- los codones que codifican Phe se pueden cambiar de UUU a UUC;
- -
- los codones que codifican Leu se pueden cambiar de UUA, CUU o CUA a CUC o CUG;
- -
- los codones que codifican Ser se pueden cambiar de UCU o UCA o AGU a UCC, UCG o AGC;
- -
- el codón que codifica Tyr se puede cambiar de UAU a UAC;
- -
- el codón de terminación UAA se puede cambiar de UAG a UGA;
- -
- el codón que codifica Cys se puede cambiar de UGU a UGC;
- -
- el codón que codifica His se puede cambiar de CAU a CAC;
- -
- el codón que codifica Gln se puede cambiar de CAA a CAG;
- -
- los codones que codifican Ile se pueden cambiar de AUU o AUA a AUC;
- -
- los codones que codifican Thr se pueden cambiar de ACU o ACA a ACC o ACG;
- -
- el codón que codifica Asn se puede cambiar de AAU a AAC;
- -
- el codón que codifica Lys se puede cambiar de AAA a AAG;
- -
- los codones que codifican Val se pueden cambiar de GUU o GUA a GUC o GUG;
- -
- el codón que codifica Asp se puede cambiar de GAU a GAC;
- -
- el codón que codifica Glu se puede cambiar de GAA a GAG.
\vskip1.000000\baselineskip
En cambio, en el caso de los codones para Met
(AUG) y Trp (UGG) no existe ninguna posibilidad de modificación de
la secuencia.
Evidentemente, las sustituciones anteriormente
indicadas se pueden utilizar individualmente o en cualquier
combinación posible para aumentar el contenido de G/C del RNAm
modificado con respecto a la secuencia original. Por ejemplo, todos
los codones para Thr presentes en la secuencia original (de tipo
salvaje) se pueden cambiar a ACC (o ACG). Sin embargo,
preferentemente se utilizan combinaciones de las posibilidades de
sustitución anteriormente mencionadas, por ejemplo:
- -
- sustitución de todos los codones que codifican Thr en la secuencia original por ACC (o ACG) y sustitución de todos los codones que originalmente codifican Ser por UCC (o UCG o AGC);
- -
- sustitución de todos los codones que codifican Ile en la secuencia original por AUC, sustitución de todos los codones que originalmente codifican Lys por AAG y sustitución de todos los codones que originalmente codifican Tyr por UAC;
- -
- sustitución de todos los codones que codifican Val en la secuencia original por GUC (o GUG), sustitución de todos los codones que originalmente codifican Glu por GAG, sustitución de todos los codones que originalmente codifican Ala por GCC (o GCG) y sustitución de todos los codones que originalmente codifican Arg por CGC (o CGG);
- -
- sustitución de todos los codones que codifican Val en la secuencia original por GUC (o GUG), sustitución de todos los codones que originalmente codifican Glu por GAG, sustitución de todos los codones que originalmente codifican Ala por GCC (o GCG), sustitución de todos los codones que originalmente codifican Gly por GGC (o GGG) y sustitución de todos los codones que originalmente codifican Asn por ACC;
- -
- sustitución de todos los codones que codifican Val en la secuencia original por GUC (o GUG), sustitución de todos los codones que originalmente codifican Phe por UUC, sustitución de todos los codones que originalmente codifican Cys por UGC, sustitución de todos los codones que originalmente codifican Leu por CUG (o CUC), sustitución de todos los codones que originalmente codifican Gin por CAG y sustitución de todos los codones que originalmente codifican Pro por CCC (o CCG); etc.
Preferentemente, el contenido de G/C del área
que codifica el péptido o polipéptido antigénico (o de cualquier
otra sección presente en caso dado) del RNAm se incrementa como
mínimo en un 7%, preferiblemente como mínimo en un 15%, de forma
especialmente preferente como mínimo en un 20%, con respecto al
contenido de G/C del área codificada del RNAm de tipo salvaje que
codifica el péptido o polipéptido correspondiente.
En este contexto es especialmente preferente
aumentar al máximo el contenido de G/C del RNAm modificado de este
modo, principalmente en el área que codifica como mínimo un péptido
o polipéptido antigénico, en comparación con la secuencia de tipo
salvaje.
Otra modificación preferente de un RNAm dado el
caso contenido en la vacuna caracterizada en la presente invención
se basa en el conocimiento de que la eficacia de traducción también
está determinada por la diferencia en la frecuencia de la presencia
de RNAt en las células. Si una secuencia de RNA presenta un
contenido elevado de los, así llamados, codones "raros", el
RNAm correspondiente se traduce de forma claramente peor que en
caso de presencia de codones que codifican RNAt relativamente
"frecuentes".
Por consiguiente, de acuerdo con la invención,
el área que codifica el antígeno (es decir, el péptido o polipéptido
con efecto antigénico) del RNAm (que puede estar contenido en la
vacuna) se modifica con respecto al área correspondiente del RNAm
de tipo salvaje de tal modo que como mínimo un codón de la secuencia
de tipo salvaje, que codifica un RNAt relativamente raro en la
célula, se sustituye por un codón que codifica un RNAt que es
relativamente frecuente en la célula y que porta el mismo aminoácido
que el RNAt relativamente raro.
Mediante esta modificación, las secuencias de
RNA se modifican de tal modo que se introducen codones para los que
hay disponibles RNAt frecuentemente presentes.
Los especialistas saben qué RNAt son
relativamente frecuentes en la célula y cuáles son relativamente
raros; véase por ejemplo Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001,
11(6): 660-666.
De acuerdo con la invención, mediante esta
modificación, todos los codones de la secuencia de tipo salvaje que
codifican un RNAt relativamente raro en la célula pueden ser
sustituidos en cada caso por un codón que codifica un RNAt que es
relativamente frecuente en la célula y que porta el mismo aminoácido
que el RNAt relativamente raro.
De forma especialmente preferente, la proporción
de G/C secuencial aumentada en el RNAm tal como se ha descrito más
arriba, en particular aumentada al máximo, se combina con los
codones "frecuentes" sin modificar la secuencia de aminoácidos
del péptido o polipéptido antigénico (uno o más) codificado por el
área codificadora del RNAm. Esta forma de realización preferente
pone a disposición un RNAm traducido y estabilizado de forma
especialmente eficaz para la vacuna según la invención.
Preferentemente, además del RNA modificado
químicamente en el caso del agente inmunoestimulador producido y
además del agente inmunoestimulador en el caso de la vacuna según la
invención, el agente inmunoestimulador y la vacuna según la
invención contienen un soporte farmacéuticamente compatible y/o un
vehículo farmacéuticamente compatible. En "Remington's
Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980), cuyo
contenido completo forma parte de la exposición de la presente
invención, se dan a conocer métodos correspondientes para la
formulación y producción adecuada del agente inmunoestimulador y de
la vacuna según la invención. Para la administración parenteral,
como sustancias de soporte entran en consideración por ejemplo agua
estéril, soluciones de sal común estériles,
polialquilén-glicoles, naftalenos hidrogenados y
principalmente polímeros de lactida, copolímeros de
lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno
biocompatibles. Los agentes inmunoestimuladores y vacunas según la
invención pueden contener sustancias de relleno o sustancias como
lactosa, manitol, sustancias para el enlace covalente de polímeros,
como por ejemplo polietilén-glicol, en haptenos,
péptidos o polipéptidos antigénicos según la invención,
complejación con iones metálicos o inclusión de materiales en o
sobre preparaciones especiales de compuestos poliméricos, como por
ejemplo polilactato, ácido poliglicólico, hidrogel, o sobre
liposomas, microemulsión, micelas, vesículas unilaminares o
multilaminares, fragmentos de eritrocitos o esferoplastos. Las
formas de realización correspondientes del agente inmunoestimulador
y de la vacuna se eligen en función de comportamientos físicos, por
ejemplo teniendo en cuenta la solubilidad, la estabilidad, la
biodisponibilidad o la degradabilidad. La liberación controlada o
constante de los componentes de principio activo según la invención
en la vacuna o en el agente inmunoestimulador incluye formulaciones
basadas en depósitos lipófilos (por ejemplo ácidos grasos, ceras o
aceites). En el marco de la presente invención también se dan a
conocer revestimientos de sustancias inmunoestimuladoras y
sustancias de vacuna según la invención, o de composiciones que
contienen estas sustancias, a saber: revestimientos con polímeros
(por ejemplo poloxámeros o poloxaminas). Además, las sustancias o
composiciones inmunoestimuladoras o de vacuna según la invención
también pueden presentar revestimientos protectores, por ejemplo
inhibidores de proteasa o amplificadores de permeabilidad. Los
soportes preferentes son típicamente materiales de soporte acuosos,
utilizándose agua para inyección (WFI) o agua tamponada con
fosfato, citrato, HEPES o acetato, etc., y ajustándose el pH
típicamente a un valor de 5,0 a 8,0, preferentemente de 6,5 a 7,5.
Preferentemente, el soporte o el vehículo contendrán adicionalmente
componentes salinos, por ejemplo cloruro sódico, cloruro potásico u
otros componentes, que hacen que la solución por ejemplo se vuelva
isotónica. Además de los componentes anteriormente mencionados, el
soporte o el vehículo también pueden contener componentes
adicionales, como albúmina sérica humana (HSA), polisorbato 80,
azúcares o aminoácidos.
El modo de administración y la dosificación del
agente inmunoestimulador producido y de la vacuna según la
invención dependen de la enfermedad a tratar, en caso dado del
estado de avance de la misma, del antígeno (en el caso de la
vacuna) y también del peso corporal, la edad y el sexo del
paciente.
Por consiguiente, en estas formulaciones, la
concentración del RNA modificado químicamente y también del ácido
nucleico codificador dado el caso contenido en la vacuna puede
variar dentro de amplios márgenes: de 1 \mug a 100 mg/ml. El
agente inmunoestimulador producido y la vacuna según la invención se
administran al paciente preferentemente por vía parenteral, por
ejemplo intravenosa, intraarterial, subcutánea, intramuscular.
También es posible administrar el agente inmunoestimulador o la
vacuna por vía tópica u oral.
Las figuras muestran:
- La figura 1 muestra resultados de la
estimulación de la maduración de células dendríticas (DC) de ratones
mediante RNA modificado químicamente según la invención en
comparación con RNAm, RNAm asociado con protamina y DNA. Las DC de
ratón se estimularon con 10 \mug/ml de RNAm (pp65 para
RNAm-pp65, \beta-Gal para
RNAm-\beta-galactosidasa), RNAm
estabilizado mediante protamina (protamina+pp65,
protamina+\beta-Gal); DNA (CpG DNA 1668, DNA 1982
y CpG DNA 1826) y RNA modificado con fosforotioato (RNA 1668, RNA
1982 y RNA 1826), y la activación de DC se determinó a través de la
medición de la liberación de IL-12 (figura 1A) e
IL-6 (figura 1B) mediante ELISA con citoquina. Como
controles negativos en las dos series de ensayos se utilizaron
respectivamente medio sin sondas de ácido nucleico y medio con
protamina añadida. Como comparación positiva se utilizó
lipopolisacárido (LPS). Los oligodesoxirribonucleótidos (ODN) CpG
DNA 1668 y CpG DNA 1626 contienen en cada caso un motivo CpG. Se
sabe que estos ODN provocan una estimulación de DC (véase patente US
5,663,153). El ODN DNA 1982 presenta la misma secuencia que el CpG
DNA 1826, excepto que el motivo CpG ha sido eliminado mediante una
sustitución de C detrás de G. La secuencia de los
oligorribonucleótidos CpG RNA 1668, RNA 1982 y CpG RNA 1826 según la
invención estabilizados mediante fosforotioato corresponde a la de
los ODN comparativos arriba mencionados con el mismo número de
identificación. En comparación con el RNAm normal, las especies de
RNAm estabilizadas con protamina sólo muestran una activación débil
de las DC. En comparación, en los dos experimentos con los
oligorribonucleótidos modificados con fosforotioato según la
invención se provoca una liberación de interleuquina mucho más
fuerte, cuyos valores son comparables a los del control positivo
(LPS). En comparación con el mRNA asociado con protamina, en el
caso de la estimulación mediante oligorribonucleótidos modificados
con fosforotioato se produjo una liberación de
IL-12 o IL-6 más de dos veces mayor.
Además, esta liberación de interleuquina sorprendentemente grande
debido a los oligorribonucleótidos según la invención es
independiente de los motivos CpG, como muestra la comparación del
oligorribonucleótido modificado con fosforotioato según la invención
RNA 1982 con el ODN DNA 1982. El ODN DNA 1982 no provoca ninguna
liberación de interleuquina en las DC, mientras que el RNA 1982
produce una liberación de interleuquina que en el caso de la
IL-12 es comparable con el control positivo LPS y
en el caso de la IL-6 incluso lo supera.
- La figura 2 muestra los resultados de la
determinación de la expresión de un marcador de activación de
superficie (CD86) en DC que habían sido tratadas con las sondas tal
como se ha descrito más arriba en relación con la figura 1. Para
determinar la expresión del CD86, 3 días después del tratamiento de
las DC con las sondas indicadas una parte de las DC se marcó con un
anticuerpo monoclonal específico anti-CD86 y la
proporción porcentual de las células que expresaban CD86 se
determinó mediante citometría de flujo. Sólo se observó una
expresión de CD86 significativa en el caso de los OND comparativos,
que presentan un motivo CpG, y de las especies de RNA modificadas
con fosforotioato según la invención. Sin embargo, todos los valores
de los estimulantes de ácido nucleico eran claramente inferiores a
los del control positivo (LPS). Además, la determinación de CD86
confirma que, al contrario que las especies de DNA, la activación de
DC provocada mediante RNA modificado con fosforotioato según la
invención es independiente de los motivos CpG: mientras que el ODN
libre de CpG DNA 1982 no provoca ninguna expresión de CD86, en el
caso del oligorribonucleótido modificado con fosforotioato RNA 1982
se detectó una expresión de CD86 en un 5% de las DC.
- La figura 3 muestra los resultados de una
prueba de reacción alogénica utilizando DC, que se activaron in
vitro con las sondas indicadas en el eje "x" (véase también
la figura 1). Tres días después de la estimulación, las DC se
añadieron a células de bazo frescas de un animal alogénico y seis
días más tarde se utilizaron en una prueba de citotoxicidad, en la
que se midió la liberación de ^{51}Cr en células diana (P 815) en
comparación con células de control (EL 4). Las células diana o
células de control se dispusieron en placas en una cantidad
constante y después se incubaron en cada caso con tres diluciones
diferentes de las células de bazo cocultivadas con las DC (células
efectoras), de modo que se obtuvo una proporción de células
efectoras (E) con respecto a células diana (o células de control)
(T) de 41:1, 9:1 ó 2:1, respectivamente. En el eje "y" se
indica la destrucción específica en porcentaje, que se calcula de
la siguiente manera: [(radiactividad liberada medida -
radiactividad liberada espontánea)/(liberación máxima de
radiactividad - radiactividad liberada espontánea)] x 100. Con la
dilución más baja, las DC estimuladas con
RNAm-\beta-galactosidasa asociado
con protamina sólo logran provocar una destrucción de células diana
a través de las células efectoras con un 20% de especificidad. En
cambio, con la dilución más baja, las DC estimuladas mediante
oligorribonucleótido modificado con fosforotioato provocan una
destrucción de las células diana a través de las células efectoras
con una especificidad de casi un 60%, es decir, aproximadamente el
triple. Este valor es comparable con el del control positivo (LPS) y
un ODN comparativo que contiene un motivo CpG (CpG DNA 1668). En
cambio, un ODN sin motivo CpG (DNA 1982) es inactivo, lo que
confirma los resultados de los experimentos anteriores de acuerdo
con la figura 1 y la figura 2. El RNAm-pp65 (sin
protamina), el
RNAm-\beta-galactosidasa (sin
protamina) y la protamina y el medio solos no provocan ninguna
destrucción específica.
- La figura 4 muestra los resultados de la
estimulación de la maduración de células dendríticas (DC) de ratones
B6 en comparación con ratones
MyD88-Knock-Out mediante
oligorribonucleótidos modificados químicamente según la invención y
ODN comparativo. Como control negativo se utilizó la estimulación
únicamente con el medio. La estimulación se llevó a cabo tal como
se ha descrito más arriba en relación con la figura 1 y la
activación de DC se determinó a través de la medición de la
liberación de IL-12 (figura 4A) e
IL-6 (figura 4B) mediante ELISA con citoquina. En
el eje "y" de la figura 4A está representada la concentración
de IL-12 en ng/ml, mientras que en el eje "y"
de la figura 4B está representada la absorción a 405 nm (valor
máximo de absorción del reactivo de detección), que es directamente
proporcional a la concentración de interleuquina. En los ratones
MyD88 está eliminada la proteína MyD88, una proteína de la cascada
de señales de los, así llamados, "toll-like
receptors" (TLR). Por ejemplo, se sabe que el
TLR-9 interviene en la activación de DC por
DNA-CpG. Las DC de ratones de tipo salvaje B6 son
activadas por los oligorribonucleótidos modificados con
fosforotioato según la invención CpG RNA 1688 y RNA 1982, y
también, conforme a lo esperado, por el ODN comparativo CpG DNA
1668. Por otra parte, el ODN DNA 1982 (sin motivo CpG) es ineficaz.
En cambio, ninguna de las sondas puede provocar una liberación
digna de mención de IL-12 o IL-6 en
DC de ratones MyD88. Por ello, parece que la MyD88 es necesaria para
la activación de DC mediante los oligorribonucleótidos modificados
químicamente según la invención y mediante
CpG-ODN.
- La figura 5 muestra los resultados de la
estimulación de DC mediante el oligorribonucleótido modificado
químicamente según la invención RNA 1982 y dos ODN comparativos que,
antes de ser utilizados para la activación de DC, se incubaron
durante 2, 26 ó 72 horas a 37ºC con un medio que no estaba libre de
RNasa. Como comparación, en cada caso se utilizó una sonda sin
incubación previa (t=0). Las sondas identificadas con "1:1"
estaban diluidas 1:1 con tampón en comparación con las otras sondas
respectivas. La activación de DC se midió de nuevo a través de la
determinación de la liberación de IL-12 (figura 5A)
e IL-6 (figura 5B) mediante ELISA con citoquina. La
activación de DC mediante DNA-CpG es independiente
de una incubación previa con medio. Conforme a lo esperado, el ODN
comparativo sin motivo CpG no provoca ninguna liberación de
interleuquina. En el caso del oligorribonucleótido según la
invención RNA 1982 se mide una clara liberación de interleuquina sin
incubación con medio (t=0). En el ensayo de estimulación con el
oligorribonucleótido según la invención, después de 2 horas de
incubación a 37ºC con un medio no libre de RNasa ya no se observa
ninguna liberación de interleuquina digna de mención.
- La figura 6 muestra el resultado de un
experimento similar al representado en la figura 5B, pero en este
caso se registró una evolución temporal más precisa del efecto de la
descomposición de RNA en la estimulación de DC: el
oligorribonucleótido modificado químicamente según la invención RNA
1982 se utilizó de nuevo para la estimulación de DC, y la
activación de DC se determinó a través de la medición de la
liberación de IL-6. Antes de la estimulación, el
oligorribonucleótido se incubó durante 15, 30, 45 ó 60 minutos con
medio no libre de RNasa, tal como se ha descrito más arriba en
relación con la figura 5. Como comparación se utilizó de nuevo una
sonda no incubada con el medio (t=0). Como control positivo se
utilizó el ODN CpG DNA 1668 y como control negativo se utilizó el
medio solo. Sin una incubación previa con medio no libre de RNasa se
produce de nuevo una fuerte activación de DC por el RNA modificado
químicamente según la invención, como demuestra la concentración de
IL-6 de más de 5 ng/ml. Este valor baja a algo más
de 2 ng/ml en un plazo de una hora de incubación bajo condiciones
de degradación de RNA. Esto demuestra que, aunque el RNA modificado
químicamente se descompone bajo condiciones fisiológicas mucho más
rápidamente que las especies de DNA, la duración de su vida media
es claramente suficiente para que se pueda desarrollar el efecto
inmunoestimulador según la invención.
- La figura 7 muestra los resultados de la
estimulación de la proliferación de células B de ratón con
ribonucleótidos modificados con fosforotioato según la invención
(CpG RNA 1668, CpG RNA 1826 y RNA 1982) en comparación con especies
de DNA (con motivo CpG: CpG DNA 1668 y CpG DNA 1826; sin motivo CpG:
DNA 1982). Como control se utilizó medio solo sin sonda de ácido
nucleico. Los ODN con motivo CpG produjeron una proliferación muy
alta de células B con casi un 90% de células B proliferantes. El
ODN DNA 1982 (sin motivo CpG), que había resultado inactivo con
respecto a la estimulación de DC (véanse las figuras 1 a 5), también
provocó una proliferación moderada de células B (casi un 20% de
células proliferantes). En cambio, la estimulación de las células B
mediante los oligorribonucleótidos modificados químicamente según
la invención condujo a una proporción porcentual de células B
proliferantes que correspondía aproximadamente a la del control
negativo o que era incluso inferior a ésta (en todos los caso <
10% de células proliferantes).
- La figura 8 muestra los resultados de una
investigación in vivo de los efectos que tiene el RNA
modificado químicamente según la invención, en comparación con el
DNA, en el bazo de ratones. A los ratones se les inyectó por vía
subcutánea la especie de ácido nucleico correspondiente junto con
una mezcla de antígenos (péptido TPHARGL ("TPH") +
\beta-galactosidasa
("\beta-Gal"). Diez días después se extirpó
el bazo de los ratones y se pesó. En el eje "y" está
representado el peso del bazo en g. Las barras muestran en cada caso
el valor medio de dos experimentos independientes. Mientras que en
el caso de los ratones tratados con el RNA modificado químicamente
según la invención + mezcla de antígenos, el peso del bazo permanece
inalterado con aproximadamente 0,08 g en comparación con el control
(PBS), en los ratones que habían recibido una inyección de DNA +
mezcla de antígenos se observa una esplenomegalia pronunciada, que
se manifiesta en un peso medio del bazo de más de 0,1 g.
Los siguientes ejemplos explican más
detalladamente la presente invención.
Para la realización de los ejemplos se
utilizaron los siguientes materiales y métodos.
Las células dendríticas (DC) se obtuvieron
mediante lavado de la médula de la pata trasera de ratones BLAB/c,
B6 o MyD88-Knock-Out con medio,
tratamiento con solución de Gey (para la lisis de los glóbulos
rojos) y filtración a través de un tamiz celular. Después, las
células se incubaron durante 6 días en IMDM que contenía 10% suero
bovino fetal inactivado con calor (FCS; de PAN), 2 mM
L-glutamina (de Bio Whittaker), 10 mg/ml de
estreptomicina, 10 U/ml de penicilina (PEN-STREP,
de Bio Whittaker) y 51 U/ml de GM-CFS (denominado en
lo sucesivo "medio completo"), en placas de cultivo con 24
pocillos. El medio se retiró después de dos y después de cuatro días
y en cada caso se añadió un volumen equivalente de medio fresco,
que contenía la concentración de GM-CFS
anteriormente indicada.
Seis días después, las DC se trasladaron a una
placa de cultivo con 96 pocillos, introduciéndose en cada pocillo
200.000 células en 200 \mul de medio completo. Las sondas de ácido
nucleico (DNA, RNA modificado químicamente, RNAm o RNA estabilizado
con protamina) se añadieron en una concentración de 10
\mug/ml.
En cada caso, 5 \mul de las sondas de ácido
nucleico correspondiente (2 \mug/\mul DNA, RNA no modificado o
RNA modificado químicamente según la invención) se incubaron en 500
\mul de medio completo durante 2, 26 ó 72 horas, o durante 15,
30, 45 ó 60 minutos, a 37ºC. Como control se utilizó una sonda no
incubada (t=0). A continuación se estimularon DC con sondas tal
como se describe más arriba en el punto 2.
Diecisiete horas después de la adición del
estimulante correspondiente se retiraron 100 \mul del sobrenadante
y se añadieron 100 \mul de medio fresco. Las placas ELISA (Nunc
Maxisorb) se revistieron durante la noche con anticuerpos
capturadores (Pharmigen) en tampón de unión (0,02% NaN_{3}, 15 mM
Na_{2}CO_{3}, 15 mM NaHCO_{3}, pH 9,7). Los sitios de unión
no específica se saturaron con solución salina tamponada con
fosfato (PBS), que contenía un 1% de albúmina de suero bovino (BSA).
Después, en cada uno de estos pocillos así tratados se dispusieron
100 \mul del sobrenadante de cultivo celular y se incubaron
durante 4 horas a 37ºC. Se añadió anticuerpo biotinilado después de
4 pasos de lavado con PBS, que contenía un 0,05% de
Tween-20. La reacción de detección se inició
mediante adición de peroxidasa de rábano acoplada con estreptavidina
(HRP-estreptavidina) y el substrato ABTS (medición
de la absorción
a 405 nm).
a 405 nm).
Para la citometría de flujo monocromática se
incubaron 2 x 10^{5} células durante 20 minutos a 4ºC en PBS, que
contenía 10% FCS, anticuerpos anti-CD86 monoclonales
conjugados con FITC (Becton Dickinson) en la concentración
adecuada. Después de dos lavados y fijación en 1% formaldehído, las
células se analizaron con un citómetro de flujo FACScalibur (Becton
Dickinson) y el software CellQuestPro.
Unas células de bazo de ratones B6 (C57b16,
H-2º-haplotipo) se incubaron durante 5 días con las
DC de ratones BLAB/c estimuladas de acuerdo con el anterior punto 2
(H-2º-haplotipo) en una proporción de 1:3, y se
utilizaron como células efectoras.
En cada caso 5.000 células EL-4
(como control) o células P815 (como células diana) se cultivaron en
placas de 96 pocillos en IMDM con 10% FCS y se cargaron durante una
hora con ^{51}Cr. Las células marcadas con ^{51}Cr se incubaron
con las células efectoras durante 5 horas (volumen final 200
\mul). En cada caso se analizaron 3 proporciones diferentes entre
las células efectoras o células de control y las células diana
(E/T): E/T = 41, 9 ó 2. Para determinar la destrucción específica se
tomaron 50 \mul del sobrenadante y se midió la radiactividad
utilizando una placa de escintilación de fases sólidas (Luma
Plate-96, Packard) y un contador de escintilaciones
para placas de microtitulación (1450 Microbeta Plus). La proporción
porcentual de la liberación de ^{51}Cr se determinó a partir de
la cantidad del ^{51}Cr (A) liberado en el medio y se comparó con
la liberación espontánea de ^{51}Cr de células diana (B) y el
contenido total de ^{51}Cr de células diana (C), que se lisaron
con 1% Triton-X-100, resultando la
destrucción específica de la siguiente fórmula: % destrucción = [(A
- B)/(C - B)] x 100.
Las células de bazo frescas de un ratón se
lavaron dos veces con 10 ml de PBS y se recogieron en PBS en una
concentración de 1 x 10^{7} células/ml. Se añadió CSFE (marcado
con FITC) en una concentración final de 500 nM y se incubó durante
3 minutos. A continuación se lavó dos veces con medio. En cada caso
se analizó en el citómetro de flujo (FACScalibur; Becton Dickinson)
una muestra sin teñir y una muestra teñida. A 200.000
células/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fondo en
forma de U) en 200 \mul de medio se le añadió DNA CpG o RNA en
una concentración de 10 \mug/ml. El cuarto día después de la
estimulación, las células se tiñeron con V220 CyChrome y CD 69 PE
se analizaron en el FACS.
50 \mug de RNA modificado químicamente u ODN
comparativo, junto con una mezcla de antígenos (100 \mug de
péptido TPHARGL + 100 \mug de b-galactosidasa) en
200 \mul de PBS en cada caso, se inyectaron por vía subcutánea en
ratones BALB/c (para cada sonda se utilizaron dos ratones). Diez
días después se extirpó el bazo de los ratones y se pesó.
Oligodesoxirribonucleótidos (ODN):
\vskip1.000000\baselineskip
Oligorribonucleótidos (modificados con
fosforotioato):
Con el fin de determinar el poder de diferentes
especies de ácido nucleico para la estimulación de la maduración de
DC, se obtuvieron DC de ratones BALB/c y se trataron con los
oligonucleótidos indicados más arriba en el punto 6. Como sonda
adicional se utilizó en cada caso
RNAm-\beta-galactosidasa
estabilizado con protamina y RNA-pp65. La
liberación de IL-12 o IL-6 por las
DC estimuladas se determinó mediante ELISA. La estimulación de DC
mediante RNAm asociando con protamina dio como resultado una
liberación débil de interleuquina. En cambio, la liberación de
interleuquina provocada por las especies de RNA modificadas con
fosforotioato según la invención era considerablemente mayor e
incluso era comparable a la del control positivo (estimulación por
LPS) (figuras 1A y 1B). Las ODN comparativas, que contenían un
motivo CpG, mostraban la liberación esperada de interleuquina por
las DC, sin embargo, la liberación de interleuquina era claramente
inferior al valor producido por la secuencia correspondiente a la
especie de RNA según la invención (figuras 1A y 1B).
Para confirmar la inducción de la maduración de
las DC demostrada mediante el ELISA con citoquina, la expresión de
un marcador de superficie específico para DC maduras (CD86) se
determinó mediante citometría de flujo. Las especies de RNA
modificadas con fosforotioato según la invención podían provocar una
clara expresión de CD86 (figura 2), pero no el RNAm o el RNAm
asociado con protamina.
También se comprobó si las DC activadas mediante
las especies de RNA modificadas químicamente, que tienen efecto
inmunoestimulador, son capaces de provocar una respuesta inmune en
un sistema alogénico (figura 3). Para ello, las células de bazo de
ratón (B6) se activaron con las DC estimuladas y se juntaron como
células efectoras con células diana alogénicas (P815),
determinándose la destrucción de las células diana con ayuda de una
prueba de liberación de ^{51}Cr. En cada caso, tres diluciones
diferentes de células efectoras se pusieron en contacto con una
cantidad constante de células diana.
De acuerdo con ello, en comparación con el RNAm
estabilizado con protamina, el RNA modificado con fosforotioato es
mucho más capaz de provocar la maduración de DC en células activadas
que pueden iniciar una respuesta inmune por células efectoras.
Sorprendentemente se puede comprobar que las DC activadas por RNA
modificado con fosforotioato pueden provocar una respuesta inmune
igual de fuerte que la provocada por ODN que presentan motivos
CpG.
Es sabido que el TLR-9 (en
inglés: "toll-like receptor 9") interviene en
la activación de DC por CpG-DN (Kaisho et
al., Trends Immunol. 2001, 22 (2): 78-83). Por
ello se investigó si la cascada de señales de TLR también
interviene en la activación de DC provocada por el RNA modificado
químicamente, que tiene efecto inmunoestimulador. Para ello, sobre
la base de la liberación de IL-12 e
IL-6, la activación de DC de ratones de tipo salvaje
B6 se comparó con la activación de DC de ratones B6, que carecen de
la proteína MyD88. La MyD88 interviene en la cascada de señales de
TLR-9. El alto nivel de liberación de
IL-12 e IL-6 de las DC de los
ratones de tipo salvaje B6 confirmaba los resultados del ejemplo 1
(véanse las figuras 4A y B, barras negras). En cambio, la
estimulación de DC de ratones
MyD88-Knock-Out con las mismas
sondas no condujo a ninguna activación (véanse las figuras 4A y B,
barras blancas). Estos resultados demuestran que la MyD88, y en
consecuencia la cascada de señales de TLR-9, es
necesaria tanto para la activación de DC por DNA-CpG
como para la activación de DC por RNA modificado químicamente.
Con el fin de investigar si el RNA modificado
químicamente según la invención está sometido a una descomposición
continua y, en consecuencia, no existe ningún riesgo de persistencia
en el organismo, se incubaron oligorribonucleótidos según la
invención bajo condiciones de degradación de RNA (37ºC, medio no
tratado, es decir, no libre de RNasa) durante 2, 26 o 72 horas, y
después se llevó a cabo la prueba de estimulación con DC. Después de
dos horas de incubación bajo condiciones de degradación de RNA ya
no se observaba ninguna activación de las DC por el RNA modificado
químicamente según la invención, como demuestra la falta de
liberación de IL-12 (figura 5A) e
IL-6 (figura 5B). En cambio, la incubación previa de
especies de DNA-CpG no tiene ninguna influencia en
su eficacia para la activación de las DC. Esto demuestra que el RNA
modificado químicamente según la invención se descompone después de
un tiempo relativamente corto, lo que evita una persistencia en el
organismo que sí se puede producir en el caso del DNA.
Sin embargo, el RNA modificado químicamente no
se descompone tan rápidamente como para que no pueda desarrollar su
efecto inmunoestimulador. Para demostrarlo se repitió el experimento
anterior con un oligorribonucleótido modificado con fosforotioato
según la invención (RNA 1982), pero la incubación bajo condiciones
de degradación de RNA se llevó a cabo sólo durante 15, 30, 45 y 60
minutos. Como demuestra la liberación de IL-6 por
las DC que se estimularon a continuación, después de una hora de
incubación bajo condiciones de degradación de RNA también se
producía una clara activación de DC (figura 6).
La inducción de una esplenomegalia, que se ha de
atribuir esencialmente a una fuerte activación de la proliferación
de células B, constituye un obstáculo esencial para la utilización
de DNA-CpG como adyuvante inmunomodulador en
vacunas (véase más arriba Monteith et al.). Por ello,
mediante una prueba de proliferación de células B se comprobó si el
RNA modificado químicamente según la invención tenía algún efecto en
la proliferación de células B. Como era de esperar, en la prueba de
proliferación de células B se detectó una proporción alta de
células proliferantes en el caso de la estimulación con
DNA-CpG. En cambio, sorprendentemente, el RNA
modificado químicamente según la invención (independientemente de
los eventuales motivos de CpG presentes en la secuencia) era
completamente inactivo a este respecto (figura 7).
Para confirmar in vivo esta propiedad
sorprendentemente positiva del RNA modificado químicamente según la
invención se preparó una vacuna de prueba, que contenía un
oligorribonucleótico de fosforotioato según la invención (RNA 1982)
y una mezcla de antígenos formada por un péptido y
\beta-galactosidasa, y se inyectó en ratones por
vía subcutánea. Como comparación se utilizó una vacuna de prueba de
DNA correspondiente, que contenía la misma mezcla de antígenos
junto con un ODN-CpG (CpG DNA 1826). Diez días
después se extirpó el bazo de los ratones y se pesó. En comparación
con el control negativo (PBS), en los ratones tratados con la
vacuna de prueba de DNA se produjo un aumento significativo del peso
del bazo. En cambio, en los ratones tratados con la vacuna de
prueba de RNA según la invención no se detectó ninguna
esplenomegalia, ya que en este caso el peso del bazo no había
variado con respecto al control negativo (figura 8). Estos
resultados demuestran que con la utilización según la invención del
RNA modificado químicamente como agente inmunoestimulador o como
adyuvante en vacunas no se produce ningún efecto secundario
relacionado con una proliferación no deseada de células B.
En conjunto se puede constatar que el RNA
modificado químicamente provoca la maduración de DC in vitro.
Los ejemplos anteriores prueban que el RNA modificado químicamente,
en este caso en forma de oligorribonucleótidos de cadena simple
sintéticos cortos (por ejemplo 20-meros) (que están
modificados con fosforotioato), activa DC inmaduras provocando así
su maduración, tal como se demuestra mediante la determinación de la
liberación específica de citoquina (figura 1) y la expresión de
marcadores de activación de superficie (figura 2). La activación de
DC provocada por el RNA modificado químicamente es claramente más
fuerte que la provocada por una mezcla de RNAm y el compuesto
policatiónico protamina, que, como es sabido, se asocia con el RNA y
de este modo lo protege frente a nucleasas. Las DC maduradas
mediante la estimulación con RNA de cadena simple modificado
químicamente según la invención pueden iniciar una respuesta inmune
a través de células efectoras, como demuestra una prueba de
liberación de Cr^{51} en un sistema alogénico (figura 3). La
activación de DC a través del RNA modificado químicamente según la
invención tiene lugar probablemente a través de una cadena de
señales mediada por TLR (figura 4).
Como es sabido, el DNA bacteriano tiene un
efecto inmunoestimulador a causa de la presencia de motivos CG no
metilados; véase la patente US 5,663,153. Esta propiedad del DNA se
puede simular en oligonucleótidos de DNA estabilizados mediante
modificación con fosforotioato (patente US 6,239,116). También es
sabido que el RNA complejado por proteínas con carga positiva
presenta un efecto inmunoestimulador (Riedl et al., 2002,
véase más arriba). Mediante la presente invención se ha podido
demostrar que el RNA de cadena simple modificado químicamente es un
agente inmunoestimulador mucho más eficaz que otros RNA, por ejemplo
los complejados con protamina. A diferencia del DNA, con los
oligonucleótidos de RNA modificados químicamente de este tipo no se
requiere ningún motivo de CpG. Al contrario que los ribonucleótidos
20-meros, los nucleótidos de fosforotioato (no
mostrados) no tienen efecto inmunoestimulador.
Sin embargo, el RNA inmunoestimulador de cadena
simple modificado químicamente de la presente invención es superior
al DNA inmunoestimulador principalmente porque el RNA se descompone
más rápidamente y en consecuencia es eliminado del cuerpo del
paciente, con lo que se reduce o evita el riesgo de persistencia y
de la provocación de efectos secundarios graves (figuras 5 y 6).
Por ejemplo, la utilización de DNA inmunoestimulador como adyuvante
para vacunas puede provocar la formación de anticuerpos
anti-DNA, el DNA puede persistir en el organismo,
lo que puede conducir por ejemplo a una sobreactivación del sistema
inmunológico, que, como es sabido, en los ratones resulta en una
esplenomegalia (Montheith et al., 1997, véase más arriba). La
esplenomegalia provocada por adyuvantes de DNA se debe
esencialmente a una estimulación de la proliferación de células B,
que no se produce en el caso de los adyuvantes de RNA según la
invención (figuras 7 y 8). Además, el DNA puede interaccionar con
el genoma huésped, principalmente puede provocar mutaciones por
integración en el genoma huésped. Todos estos riesgos pueden ser
evitados mediante la utilización del RNA de cadena simple modificado
químicamente para la producción de agentes inmunoestimuladores o
vacunas, en particular para la vacunación o el tratamiento contra
enfermedades cancerosas o infecciosas, lográndose una
inmunoestimulación mejor o comparable.
Claims (20)
1. Utilización de como mínimo un RNA de cadena
simple que presenta como mínimo una modificación química,
consistiendo el RNA en 8 a 200 nucleótidos y conteniendo el RNA
como mínimo un análogo de nucleótidos naturales, para la producción
de un agente inmunoestimulador.
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque el RNA consiste en análogos de
nucleótido.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque el análogo se selecciona entre
fosforotioatos, fosforamidatos, peptidonucleótidos,
metil-fosfonatos, 7-deazaguanosina,
5-metil-citosina e inosina.
4. Utilización según la reivindicación 3,
caracterizada porque el análogo es un fosforotioato.
5. Utilización según una de las reivindicaciones
1 a 4, caracterizada porque el RNA consiste en 15 a 31
nucleótidos.
6. Utilización según una de las reivindicaciones
1 a 5, caracterizada porque el RNA presenta la secuencia
-
5'-UCCAUGACGUUCCUGAUGCU-3',
-
5'-UCCAGGACUUCUCUCAGGUU-3' o
-
5'-UCCAUGACGUUCCUGACGUU-3'.
7. Utilización según una de las reivindicaciones
1 a 6, caracterizada porque el RNA está asociado o complejado
con un compuesto policatiónico.
8. Utilización según una de las reivindicaciones
1 a 7, caracterizada porque el agente inmunoestimulador
contiene como mínimo otro adyuvante.
9. Utilización según la reivindicación 8,
caracterizada porque el adyuvante se selecciona entre
citoquinas, lipopéptidos y
oligonucleótidos-CpG.
10. Utilización según una de las
reivindicaciones 1 a 9, que también incluye un soporte
farmacéuticamente compatible y/o un vehículo farmacéuticamente
compatible.
11. Utilización según una de las
reivindicaciones 1 a 8 para la producción de un agente
inmunoestimulador para la prevención y/o el tratamiento de
enfermedades infecciosas o enfermedades cancerosas.
12. Vacuna que contiene como mínimo un RNA de
cadena simple que presenta como mínimo una modificación química,
consistiendo el RNA en 8 a 200 nucleótidos y conteniendo el RNA como
mínimo un análogo de nucleótidos naturales, y como mínimo un
antígeno.
13. Vacuna según la reivindicación 12,
caracterizada porque el antígeno se selecciona entre
péptidos, polipéptidos, células, extractos celulares,
polisacáridos, conjugados de polisacáridos, lípidos, glicolípidos e
hidratos de carbono.
14. Vacuna según la reivindicación 13,
caracterizada porque el antígeno de péptido o polipéptido
está presente en forma de un ácido nucleico codificador del
mismo.
15. Vacuna según la reivindicación 14,
caracterizada porque el ácido nucleico es un RNAm.
16. Vacuna según la reivindicación 14,
caracterizada porque el RNAm está estabilizado y/u optimizado
en traducción.
17. Vacuna según una de las reivindicaciones 12
a 16, caracterizada porque el antígeno se selecciona entre
antígenos tumorales y antígenos de virus, bacterias, hongos y
protozoos.
18. Vacuna según la reivindicación 17,
caracterizada porque el antígeno viral, bacteriano, fúngico o
protozoológico procede de una proteína segregada.
19. Vacuna según la reivindicación 17 ó 18,
caracterizada porque el antígeno es un poliepitopo de
antígenos tumorales y antígenos de virus, bacterias, hongos o
protozoos.
20. Utilización de una vacuna según una de las
reivindicaciones 12 a 19 para la producción de un agente para la
vacunación contra enfermedades infecciosas o enfermedades
cancerosas.
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| DE10335833A1 (de) * | 2003-08-05 | 2005-03-03 | Curevac Gmbh | Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie |
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| DE102004035227A1 (de) * | 2004-07-21 | 2006-02-16 | Curevac Gmbh | mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen |
| DE102004042546A1 (de) * | 2004-09-02 | 2006-03-09 | Curevac Gmbh | Kombinationstherapie zur Immunstimulation |
| US8003619B2 (en) | 2004-12-09 | 2011-08-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Method of stimulating an immune response and inhibiting expression of a gene using an oligonucleotide |
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| EP1764108A1 (en) * | 2005-09-14 | 2007-03-21 | Gunther Hartmann | Compositions comprising immunostimulatory RNA oligonucleotides and methods for producing said RNA oligonucleotides |
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| EP1924284A1 (en) * | 2005-09-14 | 2008-05-28 | Hartmann, Gunther | Compositions comprising immunostimulatory rna oligonucleotides and methods for producing said rna oligonucleotides |
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| DE102006007433A1 (de) * | 2006-02-17 | 2007-08-23 | Curevac Gmbh | Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure |
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| DE102007001370A1 (de) * | 2007-01-09 | 2008-07-10 | Curevac Gmbh | RNA-kodierte Antikörper |
| KR20100045508A (ko) * | 2007-08-13 | 2010-05-03 | 콜리 파마슈티칼 게엠베하 | 특이적 면역 조절 프로필을 유도하는 규정된 뉴클레오티드간 연결의 환경에서의 ｒｎａ 서열 모티프 |
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| DK2176408T5 (en) | 2008-01-31 | 2015-12-14 | Curevac Gmbh | Nucleic acids comprising FORMULA (NuGiXmGnNv) a AND DERIVATIVES AS IMMUNE STIMULATING AGENTS / ADJUVANTS. |
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| US8728465B2 (en) * | 2008-06-17 | 2014-05-20 | Cedars-Sinai Medical Center | Use of toll-like receptor ligands as adjuvants to vaccination therapy for brain tumors |
| WO2010037408A1 (en) | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Curevac Gmbh | Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof |
| US20110053829A1 (en) | 2009-09-03 | 2011-03-03 | Curevac Gmbh | Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids |
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| KR101761388B1 (ko) | 2010-07-30 | 2017-07-25 | 큐어백 아게 | 트랜스펙션 및 면역 자극을 위한 이황화-크로스링크된 양이온 성분 및 핵산의 복합체 |
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| US20160032316A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-02-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Purification and Purity Assessment of RNA Molecules Synthesized with Modified Nucleosides |
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| WO2014180490A1 (en) | 2013-05-10 | 2014-11-13 | Biontech Ag | Predicting immunogenicity of t cell epitopes |
| AU2014310935B2 (en) | 2013-08-21 | 2019-11-21 | CureVac SE | Combination vaccine |
| BR112016003361A2 (pt) | 2013-08-21 | 2017-11-21 | Curevac Ag | vacina do vírus sincicial respiratório (rsv) |
| KR102354389B1 (ko) | 2013-08-21 | 2022-01-20 | 큐어백 아게 | Rna―암호화된 단백질의 발현을 증가시키는 방법 |
| BR112016001192A2 (pt) | 2013-08-21 | 2017-08-29 | Curevac Ag | Vacina contra a raiva |
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| EP3052521A1 (en) | 2013-10-03 | 2016-08-10 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
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| EP3076994A4 (en) * | 2013-12-06 | 2017-06-07 | Modernatx, Inc. | Targeted adaptive vaccines |
| SG11201604198YA (en) | 2013-12-30 | 2016-07-28 | Curevac Ag | Methods for rna analysis |
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| CA2935878C (en) | 2014-03-12 | 2023-05-02 | Curevac Ag | Combination of vaccination and ox40 agonists |
| US10369216B2 (en) | 2014-04-01 | 2019-08-06 | Curevac Ag | Polymeric carrier cargo complex for use as an immunostimulating agent or as an adjuvant |
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| PT3313829T (pt) | 2015-06-29 | 2024-07-08 | Acuitas Therapeutics Inc | Formulações de lípidos e de nanopartículas lipídicas para a administração de ácidos nucleicos |
| US10501768B2 (en) | 2015-07-13 | 2019-12-10 | Curevac Ag | Method of producing RNA from circular DNA and corresponding template DNA |
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| EP4011451A1 (en) | 2015-10-22 | 2022-06-15 | ModernaTX, Inc. | Metapneumovirus mrna vaccines |
| AU2016341309A1 (en) | 2015-10-22 | 2018-06-07 | Modernatx, Inc. | Cancer vaccines |
| AU2016342045A1 (en) | 2015-10-22 | 2018-06-07 | Modernatx, Inc. | Human cytomegalovirus vaccine |
| WO2017070601A1 (en) | 2015-10-22 | 2017-04-27 | Modernatx, Inc. | Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (vzv) |
| WO2017070624A1 (en) | 2015-10-22 | 2017-04-27 | Modernatx, Inc. | Tropical disease vaccines |
| HRP20230209T1 (hr) | 2015-10-28 | 2023-04-14 | Acuitas Therapeutics Inc. | Novi lipidi i lipidne formulacije nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina |
| EP3373965A1 (en) | 2015-11-09 | 2018-09-19 | CureVac AG | Rotavirus vaccines |
| LT3394030T (lt) | 2015-12-22 | 2022-04-11 | Modernatx, Inc. | Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu |
| EP3701963A1 (en) | 2015-12-22 | 2020-09-02 | CureVac AG | Method for producing rna molecule compositions |
| EP3394280A1 (en) | 2015-12-23 | 2018-10-31 | CureVac AG | Method of rna in vitro transcription using a buffer containing a dicarboxylic acid or tricarboxylic acid or a salt thereof |
| US12612654B2 (en) | 2016-02-12 | 2026-04-28 | CureVac SE | Method for analyzing RNA |
| SG10201913630YA (en) | 2016-02-17 | 2020-03-30 | Curevac Ag | Zika virus vaccine |
| US11920174B2 (en) | 2016-03-03 | 2024-03-05 | CureVac SE | RNA analysis by total hydrolysis and quantification of released nucleosides |
| EP3448427A1 (en) | 2016-04-29 | 2019-03-06 | CureVac AG | Rna encoding an antibody |
| US12508308B2 (en) | 2016-05-04 | 2025-12-30 | CureVac SE | Influenza mRNA vaccines |
| EP4631970A3 (en) | 2016-05-04 | 2026-01-07 | CureVac SE | Nucleic acid molecules and uses thereof |
| WO2017191274A2 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Curevac Ag | Rna encoding a therapeutic protein |
| WO2017201342A1 (en) | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome |
| CN109475640B (zh) | 2016-06-09 | 2023-03-10 | 库瑞瓦格欧洲公司 | 核酸被运载物的混合载运体 |
| WO2017218704A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-12-21 | Modernatx, Inc. | Stabilized formulations of lipid nanoparticles |
| EP3528821A4 (en) | 2016-10-21 | 2020-07-01 | ModernaTX, Inc. | HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE |
| US11583504B2 (en) | 2016-11-08 | 2023-02-21 | Modernatx, Inc. | Stabilized formulations of lipid nanoparticles |
| EP3538550A1 (en) | 2016-11-10 | 2019-09-18 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Öffentlichen Rechts | Or10h1 modulators and uses thereof |
| WO2018096179A1 (en) | 2016-11-28 | 2018-05-31 | Curevac Ag | Method for purifying rna |
| CA3043768A1 (en) | 2016-11-29 | 2018-06-07 | PureTech Health LLC | Exosomes for delivery of therapeutic agents |
| WO2018104540A1 (en) | 2016-12-08 | 2018-06-14 | Curevac Ag | Rnas for wound healing |
| EP3551230A1 (en) | 2016-12-08 | 2019-10-16 | CureVac AG | Rna for treatment or prophylaxis of a liver disease |
| WO2018107088A2 (en) | 2016-12-08 | 2018-06-14 | Modernatx, Inc. | Respiratory virus nucleic acid vaccines |
| US11464847B2 (en) | 2016-12-23 | 2022-10-11 | Curevac Ag | Lassa virus vaccine |
| WO2018115527A2 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Curevac Ag | Mers coronavirus vaccine |
| WO2018115507A2 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Curevac Ag | Henipavirus vaccine |
| CA3049991A1 (en) | 2017-01-11 | 2018-07-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleoside-modified rna for inducing an immune response against zika virus |
| MA47515A (fr) | 2017-02-16 | 2019-12-25 | Modernatx Inc | Compositions immunogènes très puissantes |
| EA201991747A1 (ru) | 2017-02-27 | 2020-06-04 | Транслейт Био, Инк. | НОВАЯ КОДОН-ОПТИМИЗИРОВАННАЯ мРНК CFTR |
| WO2018170256A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Modernatx, Inc. | Herpes simplex virus vaccine |
| CA3055653A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticle formulation |
| WO2018170270A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Modernatx, Inc. | Varicella zoster virus (vzv) vaccine |
| EP3595713A4 (en) | 2017-03-15 | 2021-01-13 | ModernaTX, Inc. | RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS Vaccine |
| EP4186888B1 (en) | 2017-03-15 | 2025-11-26 | ModernaTX, Inc. | Compound and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents |
| EP3595676A4 (en) | 2017-03-17 | 2021-05-05 | Modernatx, Inc. | RNA VACCINES AGAINST ZOONOSES |
| SG11201906297QA (en) | 2017-03-24 | 2019-10-30 | Curevac Ag | Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof |
| WO2018191657A1 (en) | 2017-04-13 | 2018-10-18 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for delivery of active agents |
| US11596679B2 (en) | 2017-04-27 | 2023-03-07 | Vanderbilt University | Hepatitis C virus gene sequences and methods of use therefor |
| CN110799492B (zh) | 2017-04-28 | 2023-06-27 | 爱康泰生治疗公司 | 用于递送核酸的新型羰基脂质和脂质纳米颗粒制剂 |
| MX2019013752A (es) | 2017-05-16 | 2020-07-20 | Translate Bio Inc | Tratamiento de la fibrosis quística mediante el suministro de arnm que codifica cftr optimizado en codones. |
| EP3625363A1 (en) | 2017-05-17 | 2020-03-25 | CureVac Real Estate GmbH | Method for determining at least one quality parameter of an rna sample |
| WO2018224166A1 (en) | 2017-06-09 | 2018-12-13 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Methods for predicting the usefulness of disease specific amino acid modifications for immunotherapy |
| WO2018232120A1 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-20 | Modernatx, Inc. | Compounds and compositions for intracellular delivery of agents |
| SG11201911430PA (en) | 2017-07-04 | 2020-01-30 | Curevac Ag | Novel nucleic acid molecules |
| CA3073020A1 (en) | 2017-08-16 | 2019-02-21 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for use in lipid nanoparticle formulations |
| EP4501322A3 (en) | 2017-08-17 | 2025-04-16 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for use in lipid nanoparticle formulations |
| WO2019036030A1 (en) | 2017-08-17 | 2019-02-21 | Acuitas Therapeutics, Inc. | LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS |
| WO2019036028A1 (en) | 2017-08-17 | 2019-02-21 | Acuitas Therapeutics, Inc. | LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS |
| US20200362382A1 (en) | 2017-08-18 | 2020-11-19 | Modernatx, Inc. | Methods of preparing modified rna |
| US11602557B2 (en) | 2017-08-22 | 2023-03-14 | Cure Vac SE | Bunyavirales vaccine |
| EP3675817A1 (en) | 2017-08-31 | 2020-07-08 | Modernatx, Inc. | Methods of making lipid nanoparticles |
| WO2019055807A1 (en) | 2017-09-14 | 2019-03-21 | Modernatx, Inc. | RNA VACCINES AGAINST ZIKA VIRUS |
| CN111511924A (zh) | 2017-11-08 | 2020-08-07 | 库瑞瓦格股份公司 | Rna序列调整 |
| EP3723796A1 (en) | 2017-12-13 | 2020-10-21 | CureVac AG | Flavivirus vaccine |
| CN111511928A (zh) | 2017-12-21 | 2020-08-07 | 库瑞瓦格股份公司 | 偶联到单一支持物或标签的线性双链dna和用于制备所述线性双链dna的方法 |
| EP3508499A1 (en) | 2018-01-08 | 2019-07-10 | iOmx Therapeutics AG | Antibodies targeting, and other modulators of, an immunoglobulin gene associated with resistance against anti-tumour immune responses, and uses thereof |
| EP3746090A4 (en) | 2018-01-29 | 2021-11-17 | ModernaTX, Inc. | RSV RNA Vaccines |
| AU2019254591B2 (en) | 2018-04-17 | 2025-12-11 | CureVac SE | Novel RSV RNA molecules and compositions for vaccination |
| WO2020002598A1 (en) | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Curevac Ag | Bioreactor for rna in vitro transcription |
| KR102950141B1 (ko) | 2018-08-24 | 2026-04-07 | 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 | 전령 rna의 정제 방법 |
| WO2020061367A1 (en) | 2018-09-19 | 2020-03-26 | Modernatx, Inc. | Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents |
| WO2020061457A1 (en) | 2018-09-20 | 2020-03-26 | Modernatx, Inc. | Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof |
| IL281615B2 (en) | 2018-09-21 | 2026-01-01 | Acuitas Therapeutics Inc | Systems and methods for producing lipid nanoparticles and liposomes |
| CA3116576A1 (en) | 2018-10-18 | 2020-04-23 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents |
| WO2020106946A1 (en) | 2018-11-21 | 2020-05-28 | Translate Bio, Inc. | TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS BY DELIVERY OF NEBULIZED mRNA ENCODING CFTR |
| TW202039534A (zh) | 2018-12-14 | 2020-11-01 | 美商美國禮來大藥廠 | KRAS變體mRNA分子 |
| SG11202106666UA (en) | 2018-12-21 | 2021-07-29 | Curevac Ag | Methods for rna analysis |
| KR20210133218A (ko) | 2019-01-31 | 2021-11-05 | 모더나티엑스, 인크. | 볼텍스 믹서 및 연계된 방법, 시스템 및 이의 장치 |
| CN118697900A (zh) | 2019-01-31 | 2024-09-27 | 摩登纳特斯有限公司 | 制备脂质纳米颗粒的方法 |
| US11351242B1 (en) | 2019-02-12 | 2022-06-07 | Modernatx, Inc. | HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition |
| US12070495B2 (en) | 2019-03-15 | 2024-08-27 | Modernatx, Inc. | HIV RNA vaccines |
| KR20220051164A (ko) | 2019-07-05 | 2022-04-26 | 아이오엠엑스 테라퓨틱스 아게 | Igsf11 (vsig3)의 항체 결합 igc2 및 이의 용도 |
| EP4031662A1 (en) | 2019-09-20 | 2022-07-27 | Translate Bio, Inc. | Mrna encoding engineered cftr |
| EP3822288A1 (en) | 2019-11-18 | 2021-05-19 | Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts | Antibodies targeting, and other modulators of, the cd276 antigen, and uses thereof |
| CN114901360A (zh) | 2019-12-20 | 2022-08-12 | 库瑞瓦格股份公司 | 用于递送核酸的新型脂质纳米颗粒 |
| US12194089B2 (en) | 2020-02-04 | 2025-01-14 | CureVac SE | Coronavirus vaccine |
| US11241493B2 (en) | 2020-02-04 | 2022-02-08 | Curevac Ag | Coronavirus vaccine |
| AU2021232062A1 (en) * | 2020-03-06 | 2022-09-29 | Colorado State University Research Foundation | Production of vaccines comprising inactivated SARS-CoV-2 viral particles |
| WO2021204175A1 (en) | 2020-04-09 | 2021-10-14 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Lipid nanoparticle composition |
| EP4132576A1 (en) | 2020-04-09 | 2023-02-15 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Nucleic acid vaccines for coronavirus |
| IL297419B2 (en) | 2020-04-22 | 2025-02-01 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
| KR20230030588A (ko) | 2020-06-30 | 2023-03-06 | 쑤저우 아보젠 바이오사이언시스 컴퍼니 리미티드 | 지질 화합물 및 지질 나노입자 조성물 |
| EP4175668A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-05-10 | iOmx Therapeutics AG | Antibodies binding igv of igsf11 (vsig3) and uses thereof |
| ES3054438T3 (en) | 2020-07-16 | 2026-02-03 | Acuitas Therapeutics Inc | Cationic lipids for use in lipid nanoparticles |
| CN114391008B (zh) | 2020-08-20 | 2024-05-03 | 苏州艾博生物科技有限公司 | 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物 |
| US11406703B2 (en) | 2020-08-25 | 2022-08-09 | Modernatx, Inc. | Human cytomegalovirus vaccine |
| EP4203997A1 (en) | 2020-10-26 | 2023-07-05 | Pécsi Tudományegyetem | Vaccine platform |
| AU2021374803A1 (en) | 2020-11-03 | 2023-06-22 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Target-cell restricted, costimulatory, bispecific and bivalent anti-cd28 antibodies |
| WO2022106860A1 (en) | 2020-11-20 | 2022-05-27 | Pécsi Tudományegyetem | Recombinant peptides for use in therapy |
| US11918643B2 (en) | 2020-12-22 | 2024-03-05 | CureVac SE | RNA vaccine against SARS-CoV-2 variants |
| WO2022152109A2 (en) | 2021-01-14 | 2022-07-21 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions |
| WO2022152141A2 (en) | 2021-01-14 | 2022-07-21 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Polymer conjugated lipid compounds and lipid nanoparticle compositions |
| EP4301402A1 (en) | 2021-03-03 | 2024-01-10 | Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus | Bispecific antibodies enhancing cell mediated immune responses |
| KR20240013087A (ko) | 2021-05-24 | 2024-01-30 | 쑤저우 아보젠 바이오사이언시스 컴퍼니 리미티드 | 지질 화합물 및 지질 나노입자 조성물 |
| CN118317944A (zh) | 2021-09-14 | 2024-07-09 | 雷纳嘉德医疗管理公司 | 非环状脂质及其使用方法 |
| TW202328067A (zh) | 2021-09-14 | 2023-07-16 | 美商雷納嘉德醫療管理公司 | 環狀脂質及其使用方法 |
| JP2024536406A (ja) | 2021-10-08 | 2024-10-04 | スージョウ・アボジェン・バイオサイエンシズ・カンパニー・リミテッド | 脂質化合物及び脂質ナノ粒子組成物 |
| AR127312A1 (es) | 2021-10-08 | 2024-01-10 | Suzhou Abogen Biosciences Co Ltd | Compuestos lipídicos ycomposiciones de nanopartículas lipídicas |
| CN116064598B (zh) | 2021-10-08 | 2024-03-12 | 苏州艾博生物科技有限公司 | 冠状病毒的核酸疫苗 |
| US12186387B2 (en) | 2021-11-29 | 2025-01-07 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
| CA3242402A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for use in lipid nanoparticle formulations |
| EP4452928A1 (en) | 2021-12-23 | 2024-10-30 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Constrained lipids and methods of use thereof |
| JP2025502599A (ja) | 2021-12-23 | 2025-01-28 | スージョウ・アボジェン・バイオサイエンシズ・カンパニー・リミテッド | 脂質化合物及び脂質ナノ粒子組成物 |
| AU2023251104A1 (en) | 2022-04-07 | 2024-10-17 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Cyclic lipids and lipid nanoparticles (lnp) for the delivery of nucleic acids or peptides for use in vaccinating against infectious agents |
| WO2024002985A1 (en) | 2022-06-26 | 2024-01-04 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
| WO2024037578A1 (en) | 2022-08-18 | 2024-02-22 | Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. | Composition of lipid nanoparticles |
| EP4608442A1 (en) | 2022-10-28 | 2025-09-03 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Nucleic acid based vaccine |
| AU2023410277A1 (en) | 2022-12-23 | 2025-06-12 | Iomx Therapeutics Ag | Cross-specific antigen binding proteins (abp) targeting leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily b1 (lilrb1) and lilrb2, combinations and uses thereof |
| EP4491230A1 (en) | 2023-07-14 | 2025-01-15 | iOmx Therapeutics AG | Cross-specific antigen binding proteins (abp) targeting leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily b1 (lilrb1) and lilrb2, combinations and uses thereof |
| AU2024236558A1 (en) | 2023-03-15 | 2025-10-09 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Delivery of gene editing systems and methods of use thereof |
| AU2024234874A1 (en) | 2023-03-15 | 2025-10-09 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Lipid nanoparticles comprising coding rna molecules for use in gene editing and as vaccines and therapeutic agents |
| AU2024335327A1 (en) | 2023-09-01 | 2026-03-26 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Gene editing systems, compositions, and methods for treatment of vexas syndrome |
| WO2025059215A1 (en) | 2023-09-12 | 2025-03-20 | Aadigen, Llc | Methods and compositions for treating or preventing cancer |
| AU2024357861A1 (en) | 2023-10-12 | 2026-04-23 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Nickase-retron template-based precision editing system and methods of use |
| WO2025119999A1 (en) | 2023-12-04 | 2025-06-12 | Universität Duisburg-Essen | Extracellular vesicle based vaccine platform |
| WO2025128871A2 (en) | 2023-12-13 | 2025-06-19 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Lipid nanoparticles comprising coding rna molecules for use in gene editing and as vaccines and therapeutic agents |
| WO2025155753A2 (en) | 2024-01-17 | 2025-07-24 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Improved gene editing system, guides, and methods |
| WO2025174765A1 (en) | 2024-02-12 | 2025-08-21 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Lipid nanoparticles comprising coding rna molecules for use in gene editing and as vaccines and therapeutic agents |
| WO2026003224A2 (en) | 2024-06-26 | 2026-01-02 | Iomx Therapeutics Ag | Bispecific antigen binding proteins (abp) targeting immune checkpoint molecules and both leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily b1 (lilrb1) and lilrb2; combinations and uses thereof |
Family Cites Families (62)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3906092A (en) * | 1971-11-26 | 1975-09-16 | Merck & Co Inc | Stimulation of antibody response |
| US4500707A (en) | 1980-02-29 | 1985-02-19 | University Patents, Inc. | Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides |
| US5132418A (en) | 1980-02-29 | 1992-07-21 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
| US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
| US4415732A (en) | 1981-03-27 | 1983-11-15 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite compounds and processes |
| US4973679A (en) | 1981-03-27 | 1990-11-27 | University Patents, Inc. | Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates |
| US4668777A (en) | 1981-03-27 | 1987-05-26 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite nucleoside compounds |
| US4373071A (en) | 1981-04-30 | 1983-02-08 | City Of Hope Research Institute | Solid-phase synthesis of polynucleotides |
| US4401796A (en) | 1981-04-30 | 1983-08-30 | City Of Hope Research Institute | Solid-phase synthesis of polynucleotides |
| DE3314999A1 (de) * | 1983-04-26 | 1985-03-14 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verwendung des diterpen-derivates forskolin zur immunstimulation |
| US5153319A (en) | 1986-03-31 | 1992-10-06 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
| US5663163A (en) * | 1987-09-07 | 1997-09-02 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Cephem compounds and processes for preparation thereof |
| US5047524A (en) | 1988-12-21 | 1991-09-10 | Applied Biosystems, Inc. | Automated system for polynucleotide synthesis and purification |
| US5262530A (en) | 1988-12-21 | 1993-11-16 | Applied Biosystems, Inc. | Automated system for polynucleotide synthesis and purification |
| US5516652A (en) * | 1993-10-06 | 1996-05-14 | Merck Frosst Canada Inc. | DNA encoding prostaglandin receptor IP |
| CZ274596A3 (en) * | 1994-03-18 | 1997-03-12 | Lynx Therapeutics | Oligonucleotide n3 - p5 phosphoramidates and process of their synthesis and hybridization |
| WO1995026204A1 (en) * | 1994-03-25 | 1995-10-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs |
| US5874560A (en) * | 1994-04-22 | 1999-02-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods |
| EP1167379A3 (en) | 1994-07-15 | 2004-09-08 | University Of Iowa Research Foundation | Immunomodulatory oligonucleotides |
| AU754463B2 (en) | 1994-07-15 | 2002-11-14 | University Of Iowa Research Foundation, The | Immunomodulatory oligonucleotides |
| US6239116B1 (en) * | 1994-07-15 | 2001-05-29 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| US5700642A (en) | 1995-05-22 | 1997-12-23 | Sri International | Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers |
| US6689757B1 (en) * | 1996-02-12 | 2004-02-10 | M.L. Laboratories Plc | Methods for vaccination and vaccines therefor |
| US6090391A (en) * | 1996-02-23 | 2000-07-18 | Aviron | Recombinant tryptophan mutants of influenza |
| ATE292980T1 (de) * | 1996-10-11 | 2005-04-15 | Univ California | Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate |
| EP0839912A1 (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
| EP0855184A1 (en) * | 1997-01-23 | 1998-07-29 | Grayson B. Dr. Lipford | Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination |
| US6406705B1 (en) | 1997-03-10 | 2002-06-18 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant |
| EP1003850B1 (en) | 1997-06-06 | 2009-05-27 | The Regents of the University of California | Inhibitors of dna immunostimulatory sequence activity |
| US20040006034A1 (en) * | 1998-06-05 | 2004-01-08 | Eyal Raz | Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof |
| US6589940B1 (en) * | 1997-06-06 | 2003-07-08 | Dynavax Technologies Corporation | Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof |
| JP4663113B2 (ja) * | 1997-09-05 | 2011-03-30 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 抗原刺激顆粒球媒介炎症を予防または軽減するための免疫刺激オリゴヌクレオチドの使用 |
| US20030083272A1 (en) | 1997-09-19 | 2003-05-01 | Lahive & Cockfield, Llp | Sense mrna therapy |
| US6322968B1 (en) * | 1997-11-21 | 2001-11-27 | Orchid Biosciences, Inc. | De novo or “universal” sequencing array |
| US6096307A (en) * | 1997-12-11 | 2000-08-01 | A. Glenn Braswell | Compositions for immunostimulation containing Echinacea angustofolia, bromelain, and lysozyme |
| AU760549B2 (en) * | 1998-04-03 | 2003-05-15 | University Of Iowa Research Foundation, The | Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines |
| US6432925B1 (en) | 1998-04-16 | 2002-08-13 | John Wayne Cancer Institute | RNA cancer vaccine and methods for its use |
| US6514948B1 (en) * | 1999-07-02 | 2003-02-04 | The Regents Of The University Of California | Method for enhancing an immune response |
| BR0012325A (pt) | 1999-07-09 | 2002-05-21 | American Home Prod | Métodos e composições para prevenção da formação de rna anormal durante a transcrição de uma sequência de plasmìdeo |
| ES2238799T3 (es) * | 1999-09-09 | 2005-09-01 | Curevac Gmbh | Transferencia de arn-m. |
| CA2398756A1 (en) * | 2000-01-31 | 2001-08-02 | Eyal Raz | Immunomodulatory polynucleotides in treatment of an infection by an intracellular pathogen |
| ES2336887T5 (es) * | 2000-03-30 | 2019-03-06 | Whitehead Inst Biomedical Res | Mediadores de interferencia por ARN específicos de secuencias de ARN |
| WO2001093902A2 (en) * | 2000-06-07 | 2001-12-13 | Biosynexus Incorporated | Immunostimulatory rna/dna hybrid molecules |
| ATE343589T1 (de) * | 2000-06-23 | 2006-11-15 | Wyeth Corp | Modofiziertes morbillivirus v proteine |
| US6716434B1 (en) * | 2000-09-19 | 2004-04-06 | Daniel R. Ansley | Composition and method for immunostimulation in non- mammalian vertebrates |
| WO2002061113A2 (en) | 2001-02-01 | 2002-08-08 | The Johns Hopkins University | Nucleic acid derived vaccine that encodes an antigen linked to a polypeptide that promotes antigen presentation |
| DE60235297D1 (de) * | 2001-04-02 | 2010-03-25 | Univ South Florida | Auf lps-reagierendes chs1/beige-ähnliches anker-gen und therapeutische anwendungen davon |
| US7820187B2 (en) * | 2001-04-26 | 2010-10-26 | Dairy Solutions, Llc | Method and mixture for protecting animals against pests |
| ES2340499T3 (es) * | 2001-06-05 | 2010-06-04 | Curevac Gmbh | Arnm de antigeno tumoral estabilizado con un contenido de g/c aumentado. |
| US7785610B2 (en) * | 2001-06-21 | 2010-08-31 | Dynavax Technologies Corporation | Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III |
| AR045702A1 (es) * | 2001-10-03 | 2005-11-09 | Chiron Corp | Composiciones de adyuvantes. |
| DE10148886A1 (de) * | 2001-10-04 | 2003-04-30 | Avontec Gmbh | Inhibition von STAT-1 |
| US7276489B2 (en) * | 2002-10-24 | 2007-10-02 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends |
| DE10162480A1 (de) * | 2001-12-19 | 2003-08-07 | Ingmar Hoerr | Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen |
| EP3006043B1 (en) * | 2002-04-04 | 2019-05-29 | Zoetis Belgium S.A. | Immunostimulatory g,u-containing oligoribonucleotides |
| DE10229872A1 (de) | 2002-07-03 | 2004-01-29 | Curevac Gmbh | Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA |
| CA2549173A1 (en) * | 2003-12-08 | 2005-07-07 | Hybridon, Inc. | Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds |
| DE102004042546A1 (de) * | 2004-09-02 | 2006-03-09 | Curevac Gmbh | Kombinationstherapie zur Immunstimulation |
| US7470674B2 (en) * | 2005-11-07 | 2008-12-30 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides |
| WO2009127230A1 (en) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | Curevac Gmbh | MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION |
| WO2010037408A1 (en) | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Curevac Gmbh | Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof |
| DE19216461T1 (de) | 2011-10-03 | 2021-10-07 | Modernatx, Inc. | Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon |
-
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