ES2305061T3 - Uso de proteasas estables en acido en alimentos para animales. - Google Patents

Abstract

Uso de al menos una proteasa estable en ácido en alimentos para animales donde la proteasa tiene una identidad de al menos el 70% a (i) SEC ID NO: 1, y/o (ii) SEC ID NO:

Description

Uso de proteasas estables en ácido en alimentos para animales.

Campo técnico

La presente invención se refiere al uso de proteasas estables en ácido en alimentos para animales (in vivo), y al uso de proteasas de este tipo para tratar proteínas vegetales (in vitro).

Las proteínas son factores nutritivos esenciales para animales y seres humanos. Muchos animales de ganado y muchos seres humanos obtienen las proteínas necesarias de fuentes de proteínas vegetales. Las fuentes de proteínas vegetales importantes son p. ej. brotes de semillas oleaginosas, leguminosas y cereales.

Cuando se incluye p. ej. harina de soja en el alimento de animales monogástricos tales como los cerdos y las aves, una proporción significante de los sólidos de harina de soja no es digerida. P. ej., la digestibilidad ileal de proteína aparente en lechones y cerdos en crecimiento es sólo alrededor del 80%.

El estómago de los animales monogástricos y muchos peces muestran un pH fuertemente ácido. La mayor parte de la digestión de proteína, no obstante, ocurre en el intestino delgado. En consecuencia, existe una necesidad de una proteasa estable en ácido que pueda sobrevivir al paso del estómago.

Estado de la técnica

El uso de proteasas en alimentos para animales, o para tratar proteínas vegetales, es conocido a partir de los documentos siguientes:

WO95/28850 expone i.a. un aditivo alimentario para animales que comprende una fitasa y una enzima proteolítica. Varias enzimas proteolíticas son especificadas en la pág. 7.

WO96/05739 expone un aditivo alimentario enzimático que comprende xilanasa y una proteasa. Las proteasas adecuadas están catalogadas en la pág. 25.

WO95/02044 expone i.a. las proteasas derivadas de Aspergillus aculeatus, al igual que el uso en alimentos para animales de las mismas.

US 3966971 expone un proceso de obtención de proteínas a partir de una fuente proteica vegetal por tratamiento con una fitasa ácida y opcionalmente una enzima proteolítica. Las proteasas adecuadas están especificadas en la columna 2.

US 4073884, US 5047240, US 3868448, US 3823072, y US 3683069 describen preparaciones de proteasas derivadas de varias cepas de Streptomyces y su uso en alimentos para animales.

Estas proteasas, no obstante, no son estables en ácido y/o no son homólogas a las proteasas descritas en la presente.

US-A-5 312 748 describe cepas de Nocardiopsis sp. para tratar extracto de espinaca fresca en telas de algodón.

Breve descripción de la invención

Las proteasas han sido ahora identificadas las cuales resultado ser muy estables en ácido, y expectativamente de un rendimiento mejorado en alimentos para animales.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención está ilustrada con mayor detalle por referencia a los dibujos anexos, donde:

Fig. 1 muestra curvas de estabilidad del pH, es decir, la actividad proteasa residual de cinco proteasas (dos proteasas estables en ácido derivadas de Nocardiopsis, y tres proteasas de referencia (Sub.Novo, y Sub.Novo(Y217L), ambas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens, y SAVINASE^{TM}) tras la incubación durante 2 horas, a una temperatura de 37ºC, y a valores de pH en la gama de pH 2 a pH 11; la actividad es relativa a la actividad residual después de una incubación de 2 horas a pH 9.0, y 5ºC;

Fig. 2 muestra curvas de actividad de pH, es decir, la actividad proteasa entre pH 3 y pH 11, relativa a la actividad proteasa a pH óptimo, de las mismas cinco proteasas ; y

Fig. 3 muestra curvas de actividad de temperatura a pH 9.0, es decir, actividad proteasa a pH 9.0 entre 15ºC y 80ºC, relativa a la actividad proteasa a la temperatura óptima, de las mismas cinco proteasas.

Descripción detallada de la invención

El término proteasa como se utiliza en este caso es una enzima que hidroliza enlaces peptídicos (tiene actividad proteasa). Las proteasas son también llamadas p. ej. peptidasas, proteinasas, hidrolasas peptídicas, o enzimas proteolíticas.

Las proteasas preferidas para el uso según la invención son del tipo endo que actúan internamente en cadenas de polipéptidos (endopeptidasas). Las endopeptidasas muestran actividad en sustratos peptídicos N- y C-terminalmente bloqueados que son pertinentes para la especificidad de la proteasa en cuestión.

Incluida en la definición anterior de proteasa está cualquier enzima del grupo enzimático EC 3.4 (que incluye cada una de las trece sub-subclasses del mismo) de la lista EC (nomenclatura enzimática de 1992 de NC-IUBBM, 1992), como ha sido suplementado y actualizado regularmente, véase p. ej. el en internet (WWW) en http: //www.chem.qmw.-
ac.uk/iubmb/enzvme/index.html.

Las proteasas se clasifican basándose en sus mecanismos catalíticos en los agrupamientos siguientes: serina proteasas (S), cisteina proteasas (C), proteasas aspárticas (A), metaloproteasas (M), y las desconocidas, o aún sin clasificar, proteasas (U), véase Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J.Barrett, N.D.Rawlings, J.F.Woessner (eds), Academic Press (1998), en particular la parte de introducción general.

Las proteasas de Nocardiopsis descritas en la presente son serina proteasas.

En una forma de realización particular las proteasas para el uso según la invención son serina proteasas. El término serina proteasa se refiere a serina peptidasas y sus clanes tal y como se define en el manual anterior. En la versión de 1998 de este manual, las serina peptidasas y sus clanes están tratadas en los capítulos 1-175. Las serina proteasas pueden ser definidas como peptidasas donde el mecanismo catalítico depende del grupo hidróxilo de un residuo de serina que actúa como el nucleófilo que ataca el enlace peptídico. Ejemplos de serina proteasas para el uso según la invención son las proteasas del clan SA, p. ej. familia S2 (Estreptogrisina), p. ej. Sub-familia S2A (proteasa alfa-lítica), tal y como se define en el manual anterior.

La actividad proteasa puede ser medida usando cualquier ensayo, donde un sustrato es empleado, que incluye los enlaces peptídicos pertinentes para la especificidad de la proteasa en cuestión. El pH y la temperatura de ensayo deben asimismo ser adaptadas a la proteasa en cuestión. Ejemplos de valores de pH de ensayo son pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, o 11. Ejemplos de temperaturas de ensayo son 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 70ºC.

Ejemplos de sustratos de proteasa son caseína, y sustratos de pNA, tal como Suc-AAPF-pNA (disponible p. ej. de Sigma S-7388). Las mayúsculas en este sustrato de pNA se refieren al código de aminoácido de una sola letra. Otro ejemplo es Protazyme AK (caseína entrecruzada teñida con azurina preparada en comprimidos por Megazyme T-PRAK). Para los estudios de la actividad y estabilidad del pH, se prefiere el sustrato de pNA, mientras que para los estudios de actividad de temperatura, se prefiere el sustrato Protazyme AK.

Ejemplos de ensayos de proteasa están descritos en la parte experimental.

No hay limitaciones en el origen de la proteasa para el uso según la invención. Así, el término proteasa incluye no sólo las proteasas naturales o de tipo salvaje, sino que también cualquier mutante, variante, fragmento etc. de las mismas que presente actividad proteasa, al igual que las proteasas sintéticas, tales como proteasas redistribuidas, y proteasas de consenso. Tales proteasas creadas genéticamente pueden ser preparadas como es generalmente conocido en la técnica, p. ej. por mutagénesis dirigida, por PCR (usando un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada como uno de los cebadores en las reacciones de la PCR), o por mutagénesis aleatoria. La preparación de proteínas de consenso está descrita en p. ej. EP 897985.

Ejemplos de proteasas estables en ácido que incluyen también aquellas para el uso según la invención:

(i)

las proteasas derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, y de Nocardiopsis alba;

(ii)

proteasas de al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o al menos identidad de aminoácido del 95% a cualquiera de las proteasas de (i);

(iii)

proteasas de al menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o al menos una identidad del 95% a cualquiera de SEC ID NO: 1, y/o SEC ID NO: 2.

Para calcular el porcentaje de identidad, cualquier programa informático conocido puede ser usado en la técnica. Ejemplos de programas informáticos de este tipo son el algoritmo Clustal V (Higgins, D.G., and Sharp, P.M. (1989), Gene (Amsterdam), 73, 237-244; y el programa GAP proporcionado en el paquete del programa GCG versión 8 (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453.

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Cuando se usa el algoritmo Clustal V para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias proteicas, se usa una tabla de pesos residuales PAM250, con los ajustes predefinidos del programa MegAlign, v4.03, en el paquete de software Lasergene (DNASTAR Inc., 1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715, US). Los ajustes predefinidos para alineamientos múltiples son una penalización de espacio de 10 y una penalización de longitud de espacio de 10. Para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias proteicas los ajustes siguientes son usados: Ktuple de 1, penalización de espacio de 3, ventana de 5, y 5 diagonales ahorradas.

Cuando se usa GAP, los ajustes siguientes son aplicados para la comparación de secuencias polipeptídicas: penalización de creación de espacio de 5.0 y penalización de extensión de espacio de 0.3.

En una forma de realización particular, la proteasa para el uso según la invención es una proteasa microbiana, el término microbiano indicando que la proteasa es derivada de, o se origina de, un microorganismo, o es un análogo, un fragmento, una variante, un mutante, o una proteasa sintética derivada de un microorganismo. Puede ser producida o expresada en la cepa original tipo salvaje microbiana, en otra cepa microbiana, o en una planta; es decir el término cubre la expresión de, proteasas tipo salvaje de origen natural, al igual que la expresión en cualquier huésped de proteasas recombinantes, creadas genéticamente o sintéticas.

El término microorganismo como se utiliza en este caso incluye Archaea, bacterias, hongos, virus etc.

Ejemplos de microorganismos son bacterias, p. ej. bacterias del filo Actinobacteria de tipo phy.nov., p. ej. de clase I: Actinobacteria, p. ej. de la subclase V: Actinobacteridae, p. ej. Orden I: Actinomycetales, p. ej. del Suborden XII: Streptosporangineae, p. ej. de la familia II: Nocardiopsaceae, p. ej. del Género I: nocardiopsis, p. ej. Nocardiopsis sp. NRRL 18262, y de Nocardiopsis alba; o mutantes o variantes de las mismas que presentan actividad proteasa. Esta taxonomía se basa en el manual de Bergey, Systematic Bacteriology, 2ª edición, 2000, Springer (preprint: Road Map to Bergey's).

Otros ejemplos de microorganismos son hongos, tales como hongos de levadura o filamentosos.

En otra forma de realización la proteasa es una proteasa vegetal. Un ejemplo de una proteasa de origen vegetal es la proteasa del sarcocarpio de melón (Kaneda et Al, J. Biochem. 78, 1287-1296 (1975).

El término animal incluye todos los animales, incluso los seres humanos. Ejemplos de animales son no rumiantes, y rumiantes, tales como vacas, ovejas y caballos. En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen los animales monogástricos, p. ej. cerdos o puercos (incluyendo, pero sin limitarse a, lechones, cerdos en crecimiento, y cerdas); aves tales como pavos y pollos (incluyendo pero sin limitarse a pollos para asar, gallinas ponedoras); terneras jóvenes; y peces (incluyendo pero sin limitarse al salmón).

El término alimento para animales o composición alimentaria para animales significa cualquier compuesto, preparación, mezcla, o composición adecuada para, o destinada para la ingesta por un animal.

En el uso según la invención la proteasa puede ser alimentada al animal antes, después de, o simultáneamente con la dieta. Se prefiere esto último.

En el contexto presente, el término estable en ácido significa, que la actividad proteasa de la enzima proteásica pura, en una dilución correspondiente a A_{280} = 1.0, y después de la incubación durante 2 horas a 37ºC en el siguiente tampón:

100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES,

100 mM de CABS, 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM de KCl, 0,01% Triton® X-100, pH 3.5,

es al menos un 40% de la actividad de referencia, según se ha medido usando el ensayo descrito en el ejemplo 2C de la presente (sustrato: Suc-AAPF-pNA, pH 9.0, 25ºC).

En formas de realización particulares de la definición de estabilidad en ácido anterior, la actividad proteasa es al menos un 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o al menos un 97% de la actividad de referencia.

El término actividad de referencia se refiere a la actividad proteasa de la misma proteasa, después de la incubación en forma pura, en una dilución correspondiente a A_{280} = 1.0, durante 2 horas a 5ºC en el siguiente tampón: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM de KCl, 0,01% Triton® X-100, pH 9.0, donde la actividad es determinada como se ha descrito anteriormente.

En otras palabras, el método para determinar la estabilidad en ácido comprende las fases siguientes:

a) la muestra de proteasa que debe evaluarse (en forma pura, A_{280} = 1.0) es dividida en dos partes alícuotas (I y II);

b) la parte alícuota I es incubada durante 2 horas a 37ºC y pH 3.5;

c) la actividad residual de la parte alícuota I es medida (pH 9.0 y 25ºC);

d) la parte alícuota II es incubada durante 2 horas a 5ºC y pH 9.0;

e) la actividad residual de la parte alícuota II es medida (pH 9.0 y 25ºC);

f) el porcentaje de la actividad residual de la parte alícuota I relativa a la actividad residual de la parte alícuota II es calculado.

De forma alternativa, en la definición anterior de estabilidad en ácido, el valor del pH del tampón de la fase b) puede ser 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, o 3.4.

En otras formas de realización alternativas de la definición de estabilidad en ácido anterior relativa a los valores del pH del tampón de la fase alternativa b) anterior, la actividad proteasa residual en comparación con la referencia, es al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o al menos 97%.

En formas de realización alternativas, los valores de pH de 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, o 8.5 pueden ser aplicados al tampón de la fase d).

En la definición de estabilidad en ácido anterior, el término A_{280} = 1.0 significa tal concentración (dilución) de dicha proteasa pura que da lugar a una absorción de 1.0 a 280 nm en una cubeta de 1 cm de longitud de recorrido con respecto a un tampón preliminar.

Y en la definición de estabilidad en ácido anterior, el término proteasa pura se refiere a una muestra con una proporción A_{280}/A_{260} superior o igual a 1.70 (véase Ejemplo 2E), y que mediante una digitalización de un gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie es medido para tener al menos un 95% de su intensidad de digitalización en la banda correspondiente a dicha proteasa (véase Ejemplo 2A). En la alternativa, la proporción A_{280}/A_{260} es superior o igual al 1.50, 1.60, 1.65, 1.70, 1.75, 1.80, 1.85, o superior o igual al 1.90.

No obstante, para los usos según la invención, la proteasa no necesita ser esta pura; puede p. ej. incluir otras enzimas, incluso otras proteasas, en cuyo caso se podría denominar una preparación de proteasa. Sin embargo, una preparación de proteasa bien definida es ventajosa. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente al alimento para animales una proteasa que esencialmente no pueda interferir o contaminar a otras proteasas. El término dosis correctamente se refiere en particular al objetivo de obtener resultados consistentes y constantes, y a la capacidad de optimizar la dosificación en base al efecto deseado.

En una forma de realización particular, la proteasa, en la forma en la que es añadida al alimento para animales, o cuando es incluida en un aditivo alimentario, está bien definida. Bien definida significa que la preparación de proteasa es al menos un 50% pura según ha sido determinado por la cromatografía de exclusión de tamaños (véase ejemplo 8).

En otras formas de realización particulares la preparación de proteasa es al menos un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, o al menos un 95% pura según ha sido determinado por este método.

De forma alternativa, el término bien definido significa, que un fraccionamiento de la preparación de proteasa en una columna de exclusión de tamaños apropiada revela sólo un componente de proteasa más importante.

El experto sabrá seleccionar una columna de cromatografía de exclusión de tamaños apropiada. Él puede empezar fraccionando la preparación p. ej. en una columna HiLoad26/60 Superdex75pg de Amersham Pharmacia Biotech (véase ejemplo 8). Si los picos no estuvieran claramente separados, lo intentaría con columnas diferentes (p. ej. con un tamaño de partícula de columna y/o longitud de columna corregidos), y/o corregiría el volumen de la muestra. Por los métodos simples y comunes de ensayo y error, llegaría de ese modo a una columna con una resolución suficiente (separación clara de picos), basándose en que el cálculo de la pureza se realiza como se describe en el ejemplo 8.

La preparación de proteasa puede ser (a) añadida directamente al alimento (o usada directamente en el proceso de tratamiento de proteínas vegetales), o (b) ésta puede ser usada en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos o premezclas de alimentos para animales que son posteriormente añadidos al alimento para animales (o usados en un proceso de tratamiento). El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza de la preparación de la proteasa original, si se utiliza según (a) o (b) arriba.

Las preparaciones de proteasa con purezas de este orden de magnitud son en particular obtenibles usando métodos recombinantes de producción, mientras que éstas no son tan fácilmente obtenidas y también están sujetas a una variación entre lotes mucho más alta cuando la proteasa es producida por métodos de fermentación tradicionales.

Tal preparación de proteasa puede por supuesto ser mezclada con otras enzimas.

En una forma de realización particular, la proteasa para el uso según la invención, además siendo estable en ácido, también tiene una actividad de pH óptima casi neutra.

El término actividad de pH óptima casi neutra significa una o más de las siguientes conclusiones: que el pH óptimo está en el intervalo de pH 6.0-11.0, o pH 7.0-11.0, o pH 6.0-10.0, o pH 7.0-10.0, o pH 8.0-11.0, o pH 8.0-10.0 (véase ejemplo 2B y la Fig. 2 de la presente).

En otra forma de realización particular, la proteasa para el uso según la invención, que además es estable en ácido, es también termoestable.

El término termoestable significa una o más de las siguientes conclusiones: que la temperatura óptima es al menos 50ºC, 52ºC, 54ºC, 56ºC, 58ºC, 60ºC, 62ºC, 64ºC, 66ºC, 68ºC, o al menos 70ºC, haciendo referencia al Ejemplo 2D y a la Fig. 3 de la presente.

En una forma de realización adicional particular, la proteasa para el uso según la invención es capaz de solubilizar proteínas vegetales según el modelo in vitro del Ejemplo 4 de la presente.

El término proteínas vegetales como se utiliza en este caso se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de u originada de un vegetal, incluyendo las proteínas modificadas y los derivados de proteínas. En formas de realización particulares, el contenido proteico de las proteínas vegetales es al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 0 60% (pip).

Las proteínas vegetales pueden ser derivadas de fuentes de proteínas vegetales, tales como leguminosas y cereales, por ejemplo materias de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, y Poaceae, tales como harina de soja, harina de lupino y harina de semilla de colza.

En una forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Fabaceae, p. ej. la semilla de soja, el lupino, el guisante, o la judía.

En otra forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es una materia de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, p. ej. la remolacha, la remolacha azucarera, la espinaca o la quinoa.

Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son la semilla de colza, y el repollo.

La semilla de soja es una fuente de proteínas vegetales preferida.

Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son cereales tales como la cebada, el trigo, el centeno, la avena, el maíz (maíz), el arroz, y el sorgo.

El tratamiento según la invención de proteínas vegetales con al menos una proteasa estable en ácido resulta en una solubilización aumentada de proteínas vegetales.

Los siguientes son ejemplos de % de proteína solubilizada obtenible usando las proteasas de la invención: al menos en 74,0%, 74,5%, 75,0%, 75,5%, 76,0%, 76,5%, 77,0%, o al menos 77,5%, haciendo referencia al modelo in vitro del Ejemplo 4 de la presente.

El término solubilización de proteínas básicamente significa llevar proteína(s) en solución. Tal solubilización puede deberse a la liberación mediada por proteasa de la proteína de otros componentes de las composiciones normalmente complejas naturales tales como el alimento para animales. La solubilización puede ser medida como un aumento en la cantidad de proteínas solubles, por referencia a una muestra sin tratamiento de proteasa (véase el ejemplo 4 en la presente).

En una forma de realización particular de un proceso de tratamiento la(s) proteasa(s) en cuestión está afectando (o actuando, o ejerciendo su influencia solubilizante en las proteínas vegetales o fuentes proteicas. Para conseguirlo, las proteínas vegetales o fuente proteica es normalmente suspendida en un solvente, por ejemplo un solvente acuoso tal como el agua, y los valores de pH y de temperatura son ajustados debido a las características de la enzima en cuestión. Por ejemplo, el tratamiento puede ocurrir a un valor de pH en el que la actividad relativa de la proteasa real es al menos un 50, o 60, o 70, o 80 o 90%. Asimismo, por ejemplo, el tratamiento puede ocurrir a una temperatura en la que la actividad relativa de la proteasa real es al menos un 50, o 60, o 70, o 80 o 90% (estas actividades relativas estando definidas como en el ejemplo 2 de la presente). La reacción enzimática es continuada hasta la consecución del resultado deseado, tras lo cual puede o no ser detenida inactivando la enzima, p. ej. por una fase de tratamiento con calor.

En otra forma de realización particular de un proceso de la invención de tratamiento, la acción de proteasa es sostenida, lo que significa p. ej. que la proteasa se añade a las proteínas vegetales o fuentes proteicas, pero su influencia solubilizante es por así decir no activada hasta más tarde, cuando se desee, una vez que las condiciones de solubilización son establecidas, o una vez que cualquier inhibidor enzimático sea inactivado, u otros medios cualesquiera podrían aplicarse para posponer la acción de la enzima.

En una forma de realización el tratamiento es un pretratamiento de alimento para animales o proteínas vegetales para el uso en alimento para animales, es decir las proteínas son solubilizadas antes de la ingesta.

El término mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales significa mejorar la disponibilidad de las proteínas, de ese modo conduciendo a una mayor extracción de proteína, a mayores rendimientos de la proteína, y/o a una mejor utilización de proteína. El valor nutritivo del alimento es en consecuencia aumentado, y el índice de crecimiento y/o el aumento de peso y/o la conversión del alimento para animales (es decir, el peso del alimento para animales ingerido respecto al aumento de peso) del animal es/son mejorado(s).

La proteasa puede ser añadida al alimento para animales en cualquier forma, como una proteasa relativamente pura, o en un aditivo con otros componentes destinados para la adición al alimento para animales, es decir en forma de aditivos de alimento para animales, tales como las denominadas premezclas de alimento para animales.

Aditivos de alimentos para animales

Aparte de la proteasa estable en ácido, los aditivos de alimentos para animales de la invención contienen al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un oligoelemento, y/o al menos un macromineral.

Además, ingredientes opcionales de aditivo alimentario para animales son los agentes colorantes, compuestos de aroma, estabilizadores, y/o al menos otra enzima seleccionada entre fitasas EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26; xilanasas EC 3.2.1.8; galactanasas EC 3.2.1.89; y/o beta-glucanasas EC 3.2.1.4 (EC se refiere a Clases de Enzimas según la Nomeclatura Enzimática 1992 de NC-IUBBM, 1992), véase también en Internet (WWW) en http,//vvww.chem.amw.ac.uk/
iubmblenzyme/index.html.

En una forma de realización particular estas otras enzimas están bien definidas (como se define y ejemplifica arriba para las preparaciones de proteasa, i.a. por referencia al ejemplo 8).

Normalmente la grasa y las vitaminas hidrosolubles, así como los oligoelementos forman parte de una denominada premezcla destinada a la adición al alimento para animales, mientras que los macrominerales son normalmente añadidos por separado al alimento para animales. Cualquiera de estos tipos de composición, enriquecido con una proteasa estable en ácido según la invención, es un aditivo alimentario para animales de la invención.

En una forma de realización particular, el aditivo alimentario para animales de la invención está destinado a ser incluido (o prescrito como teniendo que ser incluido) en dietas de animales o alimento a niveles del 0,01-10,0%; más particularmente del 0,05-5,0%; o 0,2-1,0% (% significando g de aditivo por 100 g de alimento para animales). Esto es así en particular para premezclas.

Por consiguiente, las concentraciones de los componentes individuales del aditivo alimentario para animales, p. ej. la premezcla, puede ser encontrada multiplicando la concentración final en el alimento del mismo componente por, respectivamente, 10-10000, 20-2000, o 100-500 (refiriéndose a los tres porcentajes de intervalos de inclusión).

Las pautas para concentraciones deseadas finales, es decir concentraciones en alimento, de tal alimento para animales individual y componentes de aditivo del alimento para animales están indicados en la tabla A más abajo.

Las siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes:

Ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina D3, vitamina E, y K de vitamina, p. ej. vitamina K3.

Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, p. ej. Ca-D-pantotenato.

Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodina, selenio, y cobalto.

Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.

Los requisitos nutritivos de estos componentes - ejemplificados con aves y lechones/cerdos - están catalogados en la tabla A más abajo. Requisito nutritivo significa que estos componentes deberían ser proporcionados en la dieta en las concentraciones indicadas. Estos datos han sido recopilados de:

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NRC, Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C. 1988; y

\bullet

NRC, Nutrient requirements of poultry, ninth revised edition 1994, subcommittee on poultry nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C. 1994.

De forma alternativa, el aditivo para alimento para animales de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la tabla A. Al menos uno significa cualquiera de, uno o más de, uno, o dos, o tres, o cuatro etcétera hasta los trece, o hasta los quince componentes individuales.

Más específicamente, este al menos un componente individual está incluido en el aditivo de la invención en una cantidad tal como para proporcionar una concentración en el alimento para animales dentro de la gama indicada en la columna cuatro, o en la columna cinco, o en la columna seis de la tabla A.

Como se ha explicado arriba, concentraciones de aditivo para alimentos para animales correspondientes pueden ser encontradas multiplicando los límites de intervalo de estas gamas con 10-10000, 20-2000, o 100-500. Como un ejemplo, considerando qué contenido de premezcla de vitamina A correspondería al contenido de alimento de 10-10000 UI/kg, este ejercicio llevará a los intervalos siguientes: 100-108 UI; o 200-2x107 UI; o 1000-5x106 UI por kg de aditivo.

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TABLA A

1

2

Composiciones de alimentos para animales

Las composiciones o dietas de alimentos para animales tienen un contenido relativamente alto de proteína. Según las publicaciones del National Research Council (NCR, Consejo de Investigación Nacional) a las que se ha hecho referencia arriba, las dietas para aves y cerdos pueden estar caracterizadas como se indica en la Tabla B abajo, columnas 2-3. Las dietas para peces pueden estar caracterizadas como se indica en columna 4 de la Tabla B. Además este tipo de dietas para peces normalmente tienen un contenido bruto de grasa de 200-310 g/kg. Estas dietas para peces están ejemplificadas con dietas para Salmónidos y están diseñadas basándose en Aquaculture, principles and practices, ed. T.V.R. Pillay, Blackwell Scientific Publications Ltd. 1990; Fish nutrition, second edition, ed. John E. Halver, Academic Press Inc. 1989.

Una composición de alimentos para animales según la invención tiene un contenido bruto de proteína de 50-800 g/kg, y además comprende al menos una proteasa como se reivindica en la presente.

Además, o en la alternativa (al contenido bruto de proteína indicado arriba), la composición de alimento para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg.

En formas de realización particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína bruta, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o lisina está dentro de cualquiera de las gamas 2, 3, 4 o 5 en la Tabla B abajo (R. 2-5).

La proteína bruta es calculada como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6.25, es decir proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) X 6.25 como se declara en Animal Nutrition, 4th edition, Chapter 13 (Eds. P. McDonald, R. A. Edwards and J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and Technical, 1988, ISBN 0-582-40903-9). El contenido de nitrógeno es determinado por el método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC) .

La energía metabolizable puede ser calculada basándose en la publicación de NRC Nutrient Requirements of Swine (1988) págs. 2-6 , y The European Table of Energy Values for Poultry Feedstuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90- 71463-12-5.

El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en las dietas completas para animales se calcula basándose en las tablas de alimentos para animales tales como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

En una forma de realización particular, la composición de alimento para animales de la invención contiene al menos una proteína vegetal o fuente de proteína tal como se ha definido anteriormente.

En otras formas de realización adicionales particulares, la composición de alimento para animales de la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soja; y/o 0-10% de harina de pescado; y/o 0-20% lactosuero.

Las dietas para animales pueden p. ej. ser fabricadas como alimentos para animales triturados (no granulados) o alimentos para animales granulados. Normalmente, los alimentos para animales molidos son mezclados y cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales son agregadas según las especificaciones para las especies en cuestión. Se pueden añadir enzimas como formulaciones enzimáticas sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación enzimática sólida es normalmente añadida antes o durante la fase de mezcla; y una preparación enzimática líquida es normalmente añadida después de la fase de granulación. La enzima puede también ser incorporada en un aditivo alimentario o premezcla. La concentración enzimática final en la dieta está en la gama de 0,01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta por ejemplo en la gama de 5-30 mg de proteína enzimática por kg de dieta de animal.

Ejemplos de composiciones de alimentos para animales están mostradas en el ejemplo 7.

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TABLA B

3

En formas de realización particulares del método de la invención para tratar proteínas vegetales, otra fase de adición de fitasa está también incluida. Y en formas de realización adicionales particulares, además del tratamiento combinado con fitasa y proteasa, otras enzimas pueden también ser añadidas, donde estas enzimas son seleccionadas del grupo que comprende otras proteasas, fitasas, enzimas lipolíticas, y enzimas glucosidasas/carbohidrasas. Ejemplos de enzimas de este tipo están indicados en WO95/28850.

La proteasa debería por supuesto ser aplicada en una cantidad eficaz, es decir, en una cantidad adecuada para mejorar la solubilización y/o mejorar el valor nutritivo del alimento para animales. Está actualmente contemplado que la enzima es administrada en una o más de las siguientes cantidades (gamas de dosificación): 0,01-200, o 0,01-100, o 0,05-100, o 0,05-50, o 0,10-10 - todas estas gamas que están en mg de proteína de proteasa por kg de alimento para animales (ppm).

Para determinar mg de proteína de proteasa por kg de alimento para animales, la proteasa es purificada de la composición alimentaria para animales, y la actividad específica de la proteasa purificada es determinada usando un ensayo pertinente (véase en actividad proteasa, sustratos, y ensayos). La actividad proteasa de la composición alimentaria como tal es también determinada usando el mismo ensayo, y basándose en estas dos determinaciones, la dosificación en mg de proteína de proteasa por kg de alimento para animales es calculada.

Los mismos principios son aplicables para determinar los mg de proteína de proteasa en los aditivos para alimentos para animales.

Por supuesto, si está disponible una muestra de la proteasa usada para preparar el aditivo alimentario o el alimento, la actividad específica es determinada a partir de esta muestra (no hay necesidad de purificar la proteasa de la composición del alimento para animales o del aditivo).

Muchos vegetales contienen factores antinutritivos tales como lectinas e inhibidores de tripsina. Los factores más importantes antinutritivos de semilla de soja son la aglutinina de semilla de soja (SBA) de lectina, y el inhibidor de tripsina de semilla de soja (STI).

Las lectinas son proteínas que se enlazan con moléculas específicas conteniendo carbohidratos con especificidad considerable, y cuando son ingeridas éstas se enlazan al epitelio intestinal. Esto puede conducir a una viabilidad reducida de las células epiteliales y a una absorción reducida de nutrientes.

SBA es una lectina glicosilada tetramérica con un peso molecular de las subunidades de aproximadamente 30 kDa y una alta afinidad a la N-acetilgalactosamina.

Los inhibidores de tripsina afectan a la proteólisis intestinal reduciendo la digestibilidad de la proteína, y también aumentan la secreción de enzimas digestivas del páncreas conduciendo a una pérdida de aminoácidos en forma de enzimas digestivas. Un ejemplo de un inhibidor de tripsina es el inhibidor Bowman-Birk, que tiene un peso molecular de aproximadamente 8 kDa, contiene 7 puentes disulfuro y tiene dos bucles inhibitorios específicos para las proteasas de tipo tripsina y de tipo quimiotripsina. Otros ejemplos son los denominados inhibidores Kunitz de Factores (p. ej. inhibidor Kunitz de tripsina de la semilla de soja que contiene un sitio de unión para proteasas de tipo tripsina y tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa).

Las proteasas para el uso según la invención han demostrado que hidrolizan factores antinutritivos como lectina SBA, e inhibidores de tripsina, el inhibidor Bowman Birk y el factor Kunitz de la semilla de soja. Véase la parte experimental, Ejemplo 5.

Por tanto, la invención también se refiere al uso de proteasas estables en ácido para hidrolizar o reducir la cantidad de factores antinutritivos, p. ej. la lectina SBA y los inhibidores de tripsina, tales como el inhibidor Bowman Birk, y los Factores Kunitz, tales como el factor Kunitz de la semilla de soja.

Ejemplo 1 Selección de proteasas estables en ácido

Se analizó un gran número de proteasas por su estabilidad a pH 3, con el fin de identificar proteasas con la estabilidad necesaria para pasar por el estómago acídico de los animales monogástricos.

Las proteasas fueron purificadas por métodos convencionales cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía por exclusión de tamaño (véase p. ej. Protein Purification, Principles, High Resolution Methods, and Applications. Editors: Jan-Christer Janson, Lars Rydén, VCH Publishers, 1989).

La actividad proteasa fue determinada de la siguiente manera: la proteasa fue incubada con el 1,67% de caseína Hammarsten a 25ºC, pH 9.5 durante 30 minutos, luego ATC (ácido tricloro acético) fue añadido hasta una concentración final del 2% (p/p), la mezcla fue filtrada para eliminar el sedimento, y el producto filtrado fue analizado para estimar los grupos amino primarios libres (determinados en un ensayo colorimétrico basado en OPA (Oftaldialdehído) midiendo la absorbencia a 340 nm, usando un estándar de serina (Biochemische Taschenbuch teil II, Springer-Verlag (1964), p.93 y p.102). Una unidad de proteasa-caseína (CPU) se define como la cantidad de enzima que libera 1 mmol de grupos amino primarios solubles en TCA por minuto bajo condiciones estándares, es decir 25ºC y pH 9.5.

Las proteasas fueron diluidas hasta una actividad de 0,6 CPU/I en agua, dividida en dos partes alícuotas y cada parte alícuota fue luego diluida adicionalmente a 0,3 CPU/I con 100 mM de tampón citrato, pH 3, y 100 mM de tampón fosfato, pH 7 respectivamente. Las muestras diluidas fueron incubadas a 37ºC durante 1 hora, y 20 \mul de las muestras fueron aplicadas en los orificios en las placas de agarosa al 1% conteniendo el 1% de leche desnatada. Las placas (pH 7.0) fueron incubadas a 37ºC durante la noche y se midieron las zonas de compensación.

Varias proteasas realizadas bien en esta prueba, y en las dos siguientes han sido ahora caracterizadas: las proteasas de Nocardiopsis alba y Nocardiopsis sp. NRRL 18262 descritas en el ejemplo 2. La cepa de Nocardiopsis alba ha sido depositada conforme al Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedures (Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes) en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 BraunSchweig, Alemania, como sigue.

Fecha de depósito:

22 enero 2001

Nº DSM.:

Nocardiopsis alba DSM 14010

El depósito fue hecho por Novozymes A/S y fue más tarde transferido a Hoffmann-la Roche Ag

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Ejemplo 2 Preparación, caracterización y estudio comparativo de las proteasas de Nocardiopsis Fermentación

Nocardiopsis alba fue inoculada de placas de agar de levadura y triptona en frascos de agitación cada uno conteniendo 100 ml de medio HG-23 con la composición siguiente: harina de avena 45 g/l, extracto de levadura 2 g/l, hidrógeno fosfato de disodio 12 g/l, dihidrógeno fosfato de potasio 6 g/l, plurónico PE 6100 0,2 ml/L en agua destilada. La cepa fue fermentada durante 9 días a 37ºC.

Purificación

El caldo de cultivo fue centrifugado en 10000 x g durante 30 minutos en vasos de precipitación de 1 litro. Los sobrenadantes fueron combinados y adicionalmente clarificados por una filtración a través de una placa de filtración profunda Seitz K-250. El producto filtrado claro fue concentrado por ultrafiltración en un casete de sulfona de poliéter de con un corte de 3 kDa (Filtron). La enzima concentrada fue transferida a 50 mM de H_{3}BO_{3}, 5 mM de ácido 3,3'-dimetil glutárico, 1 mM de CaCl_{2}, pH 7 (tampón A) en una columna G25 Sephadex (Amersham pharmacia Biotech), y aplicada a una columna de agarosa de Bacitracina (Upfront Chromatography NS) equilibrada en el tampón A. Después del lavado de la columna de Bacitracina con el tampón A para eliminar la proteína no enlazada, la proteasa fue eluida de la columna usando el tampón A suplementado con 2-propanol al 25% y 1M de cloruro sódico. Las fracciones con actividad proteasa fueron agrupadas y transferidas a 20 mM de CH_{3}COOH/NaOH, 1 mM de CaCl_{2}, pH 4.5 (Tampón B) por cromatografía en una columna G25 Sephadex (Amersham Pharmacia Biotech). La agrupación de proteasa cambiada con el tampón fue aplicada a una columna SOURCE 30S (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada en el tampón B. Después del lavado de la columna SOURCE 30S con el tampón B, la proteasa fue eluida con un gradiente de NaCl en aumento lineal (0 a 0,25M) en tampón B. Las fracciones de la columna fueron evaluadas para la actividad proteasa y las fracciones que contienen proteasa fueron analizadas por SDS-PAGE. Las fracciones puras fueron agrupadas y usadas para una caracterización adicional.

La proteasa de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 fue preparada usando métodos convencionales, como se ha descrito generalmente anteriormente para la proteasa de Nocardiopsis.

Caracterización

Se encontró que la proteasa derivada de Nocardiopsis alba tenía un peso molecular de Mr = 21 kDa (SDS-PAGE), y la siguiente secuencia parcial de aminoácidos (N-terminal (MVS) fue determinada: ADIIGGLAYTMGGRCSV (SEC ID Nº: 2).

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La proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 tiene la secuencia siguiente de 188 aminoácidos:

5

El propósito de esta caracterización fue estudiar sus perfiles de estabilidad del pH, actividad del pH y actividad de temperatura, en comparación con Sub.Novo, Sub.Novo(Y217L), y SAVINASE^{TM}.

Sub.Novo es subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, y Sub.Novo (Y217L) es el mutante de la misma que está descrito en WO96/05739. Sub.Novo fue preparada y purificada de un cultivo de la cepa de tipo salvaje usando métodos convencionales, mientras que el mutante fue preparado como se describe en los ejemplos 1-2, y 15-16 de EP 130756.

SAVINASE^{TM} es una subtilisina derivada de Bacillus clausii (previamente Bacillus lentus NCIB 10309), comercialmente disponible por Novozymes NS, Krogshoejvej, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca. Su preparación está descrita en la Patente estadounidense No. 3723250.

Ejemplo 2A

Determinación de pureza de SDS-PAGE de la muestra de proteasa

La pureza de SDS-PAGE de las muestras de proteasa fue determinada por el procedimiento siguiente:

40 \mul de solución de proteasa (A_{280} concentración = 0,025) fue mezclada con 10 \mul 50%(w/v) TCA (ácido tricloroacético) en un tubo de Eppendorf en hielo. Después de media hora en hielo el tubo fue centrifugado (5 minutos, 0ºC, 14.000 x g) y el sobrenadante fue cuidadosamente eliminado. 20 \mul de tampón de muestra de SDS-PAGE (200 \mul de tampón de muestra Tris-glicina SDS (2x) (125 mM Tris/HCl, pH 6.8, 4% (p/v) SDS, 50 ppm azul de bromofenol, 20%(v/v) Glicerol, LC2676 de NOVIEX^{TM}) + 160 \mul agua dest. + 20 \mul (3-mercaptoetanol + 20 \mul de base Tris 3M no tamponada (Sigma T-1503) fueron añadidos al precipitado y el tubo fue hervido durante 3 minutos. El tubo fue centrifugado brevemente y 10 \mul de muestra fueron aplicados a un gradiente del 4-20% de gel precast de Tris-Glicina de NOVEX^{TM} (gel de gradiente de poliacrilamida basado en la química de Laemmli pero sin SDS en el gel, (Laemmli, U.K., (1970) Nature, vol. 227, págs. 680-685), EC60255). La electroforesis fue realizada con un tampón de desplazamiento de Tris-glicina (2,9 g de base Tris, 14,4 g de Glicina, 1,0 g de SDS, agua destilada hasta 1 litro) en ambas reservas de tampón a un voltaje constante de 150V hasta que el colorante marcador de azul de bromofenol alcanzara el fondo del gel. Después de la electroforesis, el gel fue enjuagado 3 veces, 5 minutos cada vez, con 100 ml de agua destilada por agitación suave. El gel fue luego suavemente agitado con reactivo de Gelcode® Blue Stain (producto coloidal Comassie G-250 de PIERCE, cat. PIERCE No. 24592) durante una hora y lavado con agitación suave durante 8 a 16 horas con agua destilada con diferentes cambios de agua destilada. Finalmente, el gel fue secado entre 2 pedazos de celofán. Los geles secos fueron escaneados con un escáner Arcu II de AGFA equipado con el software Fotolook 95 v2.08 e importado al software de evaluación de imágenes CREAM^{TM} para Windows (catálogos Nos. 990001 y 990005, Kem-ene-Tec, Dinamarca) por el comando Archivo/Adquirir con los ajustes siguientes (de Fotolook 95 v2.08): Original=Reflectivo, Modo=Color RGB, resolución de la exploración=240 ppi, resolución de salida=1201 pi, factor de escala=100%, Rango=Histograma con selección Global y Min=0 y Max=215, TonoCurva=Ninguna, Nitidez=Ninguna, Destramado=Ninguno Y Sabor=Ninguno, de ese modo produciendo un fichero de imagen *.img del gel de SDS-PAGE, que fue usado para la evaluación en CREAM^{TM}. El fichero de imagen *.img fue evaluado con el comando menú Análisis/1-D. Dos líneas de exploración fueron colocadas en el fichero de imagen *.img con la herramienta de posición en líneas: una línea de escaneado de la muestra y una línea de escaneado de fondo. La línea de escaneado de la muestra fue colocada en medio de una línea de muestra (con la proteasa en cuestión) desde justo debajo de la ranura de aplicación hasta justo encima de la posición del colorante marcador de azul de Bromofenol. La línea de escaneado de fondo fue colocada paralela a la línea de escaneado de la muestra, pero en una posición en el gel de SDS-PAGE descrito donde ninguna muestra fue aplicada, puntos iniciales y finales para la línea de escaneado de fondo fueron perpendiculares al inicio y los puntos finales de la línea de escaneado de muestra. La línea de escaneado de fondo representa el fondo real del gel. La anchura y forma de las líneas de exploración no fueron ajustadas. La intensidad a lo largo de las líneas de escaneado fueron ahora registradas con el comando del menú 1-D/Editor con sensibilidad Media. Usando el comando de menú 1-D/Editor, el escaneado de fondo fue sustraído del escaneado de la muestra. Luego el comando del menú 1-D/Resultados fue seleccionado y el % del área del valor máximo de proteasa, según fue calculado por el software CREAM^{TM}, se usó como la Pureza de SDS-PAGE de las proteasas.

Todas las muestras de proteasa tienen una pureza de SDS-PAGE superior al 95%.

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Ejemplo 2B

Ensayo de actividad del pH

Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388) fue usado para obtener perfiles de actividad del pH.

Tampón de ensayo: 100 mM de ácido succínico (Merck 1.00682), 100 mM de HEPES (Sigma H-3375), 100 mM de CHES (Sigma C-2885), 100 mM de CABS (Sigma C-5580), 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM de KCl, 0,01% de Triton® X-100 ajustado a valores de pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, o 11.0 con HCl o NaOH.

Temperatura de ensayo: 25ºC.

Una muestra de proteasa de 300 \mul (diluida en 0,01% Triton® X-100) fue mezclada con 1,5 ml del tampón de ensayo en el valor de pH respectivo, llevando el pH de la mezcla al pH del tampón de ensayo. La reacción fue comenzada añadiendo 1,5 ml de sustrato de pNA (50 mg disueltos en 1,0 ml de DMSO y adicionalmente diluido 45x con 0,01% Triton® X-100) y, después de la mezcla, el aumento en A_{405} fue vigilado por un espectrofotómetro como una medición de la actividad proteasa en el pH en cuestión. El ensayo fue repetido con el tampón de ensayo en los otros valores de pH, y las mediciones de actividad fueron fijadas como actividad relativa contra el pH. Las actividades relativas fueron normalizadas con la actividad máxima (pH óptimo), es decir ajustando la actividad al pH óptimo a 1, o al 100%. Las muestras de proteasa fueron diluidas para asegurar que todas las mediciones de actividad estaban dentro de la parte lineal de la curva de dosis-respuesta para el ensayo.

Ejemplo 2C

Ensayo de estabilidad de pH

Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388) fue usado para obtener perfiles de estabilidad de pH.

Tampón de ensayo: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM de KCl, 0.01% Triton X-100 ajustados a valores de pH 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 o 11.0 con HCl o NaOH.

Cada muestra de proteasa (en 1 mM ácido succínico, 2 mM de CaCl_{2} 100 mM de NaCl, pH 6.0 y con una absorción A_{280} > 10) fue diluida en el tampón de ensayo a cada valor de pH evaluado para A_{280} = 1.0. Las muestras de proteasa diluidas fueron incubadas durante 2 horas a 37ºC. Tras la incubación, las muestras de proteasa fueron diluidas en 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM de KCl, 0.01% Triton® X-100, pH 9.0, llevando el pH de todas las muestras a pH 9.0.

En la siguiente medición de actividad, la temperatura fue 25ºC.

300 \mul de muestra de proteasa diluida fueron mezclados con 1,5 ml del tampón de ensayo de pH 9.0 y la reacción de actividad fue comenzada añadiendo 1,5 ml de sustrato de pNA (50 mg disueltos en 1,0 ml de DMSO y adicionalmente diluidos 45x con 0,01% Triton® X-100) y, después de la mezcla, el aumento en A_{405} fue vigilado por un espectrofotómetro como una medición de la actividad proteasa (residual). La incubación a 37ºC fue realizada en los valores de pH diferentes y las mediciones de actividad fueron fijadas como actividades residuales contra el pH. Las actividades residuales fueron normalizadas con la actividad de una incubación paralela (control), donde la proteasa fue diluida a A_{280} = 1.0 en el tampón de ensayo a pH 9.0 y se incubó durante 2 horas a 5ºC antes de la medición de la actividad como las otras incubaciones. Las muestras de proteasa fueron diluidas antes de la medición de actividad para confirmar que todas las mediciones de actividad estaban dentro de la parte lineal de la curva de dosis-respuesta para el ensayo.

Ejemplo 2D

Ensayo de actividad de temperatura

Comprimidos de Protazyme AK fueron usados para obtener perfiles de temperatura. Los comprimidos de Protazyme AK son caseína reticulada teñida con azurina preparada como comprimidos por Megazyme.

Tampón de ensayo: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM de KCl, 0,01% Triton® X-100 ajustado a pH 9.0 con NaOH.

Un comprimido de Protazyme AK fue suspendido en 2,0 ml de Triton® X-100 al 0,01% por agitación suave. 500 \mul de esta suspensión y 500 \mul de tampón de ensayo fueron mezclados en un tubo de Eppendorf y colocados en hielo. 20 \mul de muestra de proteasa (diluida en 0,01% de Triton X-100) fueron añadidos. El ensayo fue iniciado transfiriendo el tubo de Eppendorf a un termomezclador Eppendorf, que fue ajustado a la temperatura de ensayo. El tubo fue incubado durante 15 minutos en el termomezclador Eppendorf a su nivel de agitación máximo. Transfiriendo el tubo de nuevo al baño de hielo, la incubación de ensayo fue detenida. El tubo fue centrifugado en un centrifugador enfriado con hielo durante unos minutos y A_{650} del sobrenadante fue leído por un espectrofotómetro. Un tampón ciego fue incluido en el ensayo (en vez de la enzima). A_{650} (proteasa) - A_{650} (ciego) fue una medición de la actividad proteasa. El ensayo fue realizado a diferentes temperaturas y las mediciones de actividad fueron fijadas como actividades relativas contra la temperatura de incubación. Las actividades relativas fueron normalizadas con la actividad máxima (temperatura óptima). Las muestras de proteasa fueron diluidas para confirmar que todas las mediciones de actividad estaban dentro de la parte lineal próxima de la curva de dosis-respuesta para el ensayo.

Una vista general de la actividad óptima (actividad de pH y temperatura) es vista en la tabla 1. Los perfiles de estabilidad de pH, actividad de pH y actividad de temperatura están vistos en las Figuras 1-3, y una comparación detallada de los datos de estabilidad del pH para las proteasas a valores de pH acídicos es vista en la tabla 2.

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TABLA 1

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TABLA 2

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Ejemplo 2E

Pureza de absorción de muestras de proteasa purificada Determinación de la proporción A_{280}/A_{260}

La proporción A_{280}/A_{260} de muestras de proteasa purificada fue determinada como sigue.

A_{260} significa la absorción de una muestra de proteasa a 260 nm en una cubeta de 1 cm de longitud de recorrido con respecto a un modelo de tampón. A_{280} significa la absorción de la misma muestra de proteasa a 280 nm en una cubeta de 1 cm de longitud de recorrido con respecto a un modelo de tampón.

Muestras de las proteasas purificadas del Ejemplo 2 fueron diluidas en el tampón hasta que la lectura de A_{280} del espectrofotómetro estaba dentro de la parte lineal de su curva de respuesta. La proporción A_{280}/A_{260} fue determinada de las lecturas: para Nocardiopsis sp. NRRL 18262 1.83, y para Nocardiopsis alba 1.75.

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Ejemplo 3 Capacidad de la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 para degradar partes insolubles de la harina de sola (SBM)

La proteasa de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 fue evaluada por su capacidad para hacer las partes insolubles/indi-
geribles de SBM accesibles para las enzimas digestivas y/o enzimas exógenas añadidas.

Su rendimiento fue comparado con dos proteasas de aspartato, la Proteasa I y la Proteasa II, preparadas como se describe en WO 95/02044. Este documento también expone su uso en alimentos para animales. La Proteasa I es una proteasa tipo aspergilopepsina II, y la Proteasa II una proteasa tipo aspergilopepsina I (ambas proteasas de aspartato, es decir proteasas distintas de la subtilisina) de Aspergillus aculeatus (haciendo referencia al manual de enzimas proteolíticas al que se ha hecho referencia arriba).

El sustrato de prueba, el denominado resto de soja, fue producido en un proceso que imita el tracto digestivo de los animales monogástricos, incluyendo un tratamiento de pepsina a pH 2, y un tratamiento de pancreatina a pH 7.

En la fase de tratamiento de pancreatina una gama de enzimas comerciales fue añadida en dosificaciones altas para degradar los componentes de SBM que son accesibles para las enzimas comerciales existentes.

Las enzimas siguientes, todas comercialmente disponibles por Novozymes NS, Dinamarca, fueron añadidas:
ALCALASE^{TM} 2,4L, NEUTRASE^{TM} 0,5L, FLAVOURZYME^{TM} 1000L, ENERGEX^{TM} L, BIOFEED^{TM} Plus L, PHYTASE NOVO^{TM} L. La SBM usada fue un estándar del 48% de proteína SBM para el alimento para animales, que fue granulado.

Después del tratamiento sólo el 5% de la proteína fue dejada en el resto de soja resultante.

Protocolo de marcado con FITC

El resto fue posteriormente marcado con FITC (Molecular Probes, F-143) a continuación: resto de soja (25 g húmedos, 5 g secos) fue suspendido en 100 ml de tampón carbonato 0,1M, pH 9 y se agitó durante 1 hora a 40ºC. La suspensión fue enfriada a la temperatura ambiente y tratada con fluoresceína 5-isotiocianato (FITC) durante la noche a oscuras. La sonda no acoplada fue eliminada por ultrafiltración (corte de 10.000 PM).

Ensayo de FITC

El resto de soja marcado con FITC fue usado para examinar la capacidad de las proteasas para degradar el resto de soja usando el ensayo siguiente: 0,4 ml de muestra de proteasa (con A_{280} = 0,1) fue mezclada con 0,4 ml de resto de soja con FITC (suspensión de 10 mg/ml en tampón de fosfato de sodio 0,2M pH 6.5) a 37ºC, y las unidades de fluorescencia relativa (RFU 485/535 nm; excitación/monitorización de longitud de onda) medida después de 0 horas, y después de 22 horas de incubación. Antes de la determinación de RFU, las muestras fueron centrifugadas durante 1 min a 20.000 x G y 250 microlitros de sobrenadante fueron transferidos a una bandeja de microtitulación negra. Las mediciones fueron realizadas usando un contador VICTOR 1420 Multilabel (In vitro, Dinamarca). RFU está generalmente descrito por Lain D. Johnson en: Introduction to Fluorescence Techniques, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Richard P. Haugland, 6ª edición, 1996 (ISBN 0-9652240-0-7).

Una muestra ciega fue preparada añadiendo 0,4 ml de tampón en vez de muestra enzimática.

8

donde ARFU = RFU (22 horas) - RFU (0 horas)

Los valores de FITC resultantes (valores de RFU_{muestra}) están mostrados en la tabla 3 abajo. Los valores de FITC están generalmente con un margen de error de +/- 20.000. A diferencia de la Proteasa I y Proteasa II, la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 degradó el resto de soja hasta una extensión significante.

TABLA 3

9

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Ejemplo 4 Prueba in vitro de la proteasa derivada de Nocardiopsis sp, NRRT. 18262

La proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 fue evaluada, junto con una proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 ("PD498", preparada como se describe en el Ejemplo 1 de WO93/24623), y junto con FLAVOURZYME^{TM}, una preparación enzimática con proteasa de Aspergillus oryzae (comercialmente disponible por Novozymes NS, Bagsvaerd, Dinamarca), por su capacidad para solubilizar proteínas SBM-maíz (Harina de soja-maíz) en un sistema de digestión in vitro (simulando la digestión en animales monogástricos). Para los tratamientos preliminares, SBM-maíz fue incubada en la ausencia de proteasas exógenas.

Perfil de modelo in vitro

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10

Sustratos

10 g de dieta de SBM-maíz con una proporción de SBM-maíz de 6:4 (p/p) fue usada. El contenido de proteína fue 43% (p/p) de SBM y 8.2% (p/p) de harina de maíz. La cantidad total de proteína en 10 g de dieta de maíz-SBM fue 2,21 g.

Enzimas digestivas

Pepsina (Sigma P-7000. 539 U/mg, sólido), pancreatina (Sigma P-7545. 8xU.S.P. (US Pharmacopeia)).

Determinaciones de proteína enzimática

La cantidad de proteína de enzima proteásica es calculada basándose en los valores A_{280} y las secuencias de aminoácidos (composiciones de aminoácidos) usando los principios perfilados en S.C.Gill & P.H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989).

Procedimiento experimental para modelo in vitro

1.

10 g de sustrato es pesado en un matraz de 100 ml.

2.

En el tiempo 0 min, 46 ml de HCl (0,1 M) conteniendo pepsina (3000 U/g de dieta) y 1 ml de proteasa (0,1 mg de proteína enzimática/g de dieta, salvo FLAVOURZYME^{TM} 3,3 mg/g de dieta) son agregados al matraz mientras se mezcla. El matraz es incubado a 40ºC.

3.

En el tiempo 20-25 min, se mide el pH.

4.

En el tiempo 45 min, se añaden 16 ml de H_{2}O.

5.

En el tiempo 60 min, se añaden 7 ml de NaOH (0,4 M).

6.

En el tiempo 80 min, se añaden 5 ml de NaHCO_{3} (1 M) conteniendo pancreatina (8,0 mg/g de dieta).

7.

En el tiempo 90 min, se mide el pH.

8.

En el tiempo 300 min, se mide el pH.

9.

En el tiempo 320 min, partes alícuotas de 30 ml son eliminadas y centrifugadas (10000 x g, 10 min, 0ºC).

10.

Se determina la proteína total soluble en los sobrenadantes.

Determinación de proteína

Los sobrenadantes son analizados por su contenido de proteína usando el método Kjeldahl (determinación de % de nitrógeno; A.O.A.C. (1984) Official Methods of Analysis 14' ed. Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

Cálculos

Para todas las muestras, se calculó la solubilidad de la proteína in vitro usando las ecuaciones abajo.

Cantidad de proteína en muestra de dieta: 22,1% de 10 g = 2,21 g

Si toda la proteína fue solubilizada en los 75 ml de líquido, la concentración de proteína en el sobrenadante sería: 2,21 g/75 ml \approx 2,95%.

Obsérvese que los sobrenadantes también incluyen las enzimas digestivas y exógenas. Para determinar la solubilidad, la aportación proteica de las enzimas digestivas y exógenas debería ser sustraída de las concentraciones de proteína en los sobrenadantes siempre que fuera posible.

% de proteína de la pancreatina (X mg/g de dieta) y pepsina (Y U/g de dieta) = ((Xmg de pancreatina/g de dieta x 10 g de dieta x 0,69 x 100%) / (1000 mg/g x 75 g)) + ((YU pepsina/g de dieta x 10 g de dieta x 0,57 x 100%) / (539 U/mg x 1000 mg/g x 75 g)),

donde 0,69 y 0,57 se refieren al contenido de proteína en las preparaciones de pancreatina y de pepsina usadas (es decir, el 69% de pancreatina, y el 57% de pepsina es proteína según ha sido determinado por el método Kjeldahl al que se ha hecho referencia más arriba).

% de proteína de enzimas exógenas (Z mg EP/g de dieta) = (Z mg EP/g de dieta x 10 g de dieta x 100%) / (1000 mg/g x 75 g)

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% de proteína corregida en sobrenadante = % proteína en sobrenadante según es analizado - (% de proteína de enzimas digestivas + % de proteína de enzimas exógenas)

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Solubilización de proteína (%) = (% de proteína corregida en sobrenadante x 100%) / 2,95%

Los resultados abajo muestran que la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 tiene un efecto significativamente mejor en solubilización de proteína comparado con el modelo, y en comparación con la proteasa de Bacillus sp. NCIMB 40484.

11

Ejemplo 5 Degradación de la lectina SRA y los inhibidores Bowman-Birk y Kunitz de la semilla de sola

La capacidad de las proteasas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 y Bacillus sp. NCIMB 40484 para hidrolizar la aglutinina de semilla de soja (SBA) y los inhibidores Bowman-Birk y Kunitz de tripsina de la semilla de soja fue evaluada.

SBA pura (Fluka 61763), inhibidor Bowman-Birk (Sigma T-9777) o inhibidor Kunitz (inhibidor de tripsina de semilla de soja, Boehringer Mannheim 109886) fue incubada con la proteasa durante 2 horas, 37ºC, a pH 6.5 (proteasa: factor antinutritivo = 1:10, basado en A_{280}). Tampón de incubación: 50 mM de ácido dimetilglutárico, 150 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, 0.01% TritOn X-100, pH 6.5.

La capacidad de las proteasas para degradar el SBA y los inhibidores de proteasa fue estimada a partir de la desaparición de la SBA nativa o bandas de inhibidor de tripsina y apariencia de productos de degradación de peso molecular bajo en geles de SDS-PAGE. Los geles fueron coloreados con azul de Coomassie e intensidad de banda determinada por escaneado.

Los resultados, como el % de factor antinutritivo degradado, están mostrados en la Tabla 4 más abajo.

Está contemplado que la capacidad para degradar los factores antinutritivos en la soja puede también ser estimada aplicando la técnica de Western con anticuerpos contra SBA, inhibidor Bowman-Birk o inhibidor Kunitz tras la incubación de harina de soja con las proteasas candidatas (véase WO98/56260).

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TABLA 4

12

Ejemplo 6 Efectos de proteasas de Nocardiopsis estables en ácido en el rendimiento en el crecimiento de pollos de engorde

La prueba se realiza conforme a las instrucciones francesas oficiales para experimentos con animales vivos. Pollos de engorde de un día ("Ross PM3"), separados por sexo, son suministrados por un criadero comercial.

Los pollos son alojados en jaulas en fila con suelo de alambre, que son mantenidas en un espacio de ambiente controlado. Alimento y agua corriente son provistos ad libitum.

En el día 8, los pollos son divididos por peso en grupos de 6 aves, que son asignados a cada tratamiento de control, recibiendo la dieta experimental sin enzimas, o al tratamiento enzimático, recibiendo la dieta experimental suplementada con 100 mg de proteína enzimática de la proteasa por kg de alimento.

Cada tratamiento es repetido con 12 grupos, 6 grupos de cada sexo. Los grupos son pesados en los días 8 y 29. El consumo de alimento del periodo intermedio es determinado y la ganancia de masa corporal y la proporción de conversión del alimento para animales son calculados.

La dieta experimental se basa en almidón de maíz y harina de soja (44% de proteína bruta) como ingredientes principales (Tabla 5). El alimento es granulado (configuración de cuño: 3 X 20 mm) a aproximadamente 70ºC. Una cantidad apropiada de la proteasa es diluida en una cantidad fija de agua y pulverizada sobre el alimento granulado. Para el tratamiento de control, las cantidades adecuadas de agua se utilizan para manejar los tratamientos de la misma manera. Para la evaluación estadística, se realiza un análisis bifactorial de varianza (factores: tratamiento y sexo), usando el procedimiento GLM del paquete SAS (SAS Institute Inc., 1985). Donde se indican tratamientos significantes (P < 0,05) mutuos, las diferencias entre medios de tratamiento son analizados con la prueba Duncan. Un aumento de peso mejorado, y/o una conversión de alimento mejorado, y/o valor nutritivo mejorado de harina de soja está previsto (teniendo en cuenta que el almidón de maíz es un ingrediente altamente digerible).

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Referencias

EEC (1986): Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur enérgetique des aliments composes destinés á la volaille. Journal Officiel des Communautés Européennes, L130, 53-54

SAS Institute Inc. (1985): SAS(r) User's Guide, Version 5 Edition. Cary NC

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TABLA 5

13

14

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Proveedor de ingredientes de alimentos para animales

Almidón de maíz: Roquettes Freres, F-62136 Lestrem, Francia

Harina de soja 44: Rekasan Gmbh, D-07338 Kaulsdorf, Alemania

Sebo: Fondoirs Gachot SA, F-67100 Estrasburgo, Francia

Aceite de soja: Ewoco Sarl, F-68970, Guemar, Francia

DL-metionina: Produit Roche SA, F-92521 Neuilly-sur-Seine, Francia

MCP: Brenntag Lorraine, F-54200 Toul, Francia

Sal: Minoterie Moderne, F-68560 Hirsingue, Francia

Aglutinante: Minoterie Moderne, F-68560 Hirsingue, Francia

Premezcla (AM vol chair NS 4231): Agrobase, F-01007 Bourg-en-Bresse, Francia

Avatec: Produit Roche SA, F-92521 Neuilly-sur-Seine, Francia

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 7 Premezcla y dietas para pavos v salmónidos suplementados con proteasas de Nocardiopsis estables en ácido

Una premezcla de la siguiente composición es preparada (contenido por kilo):

15

Para esta premezcla la proteasa de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 se añade (preparada como se describe en el ejemplo 2), en una cantidad correspondiente a 10 g de proteína/kg de enzima proteásica.

Las dietas de iniciación y de crecimiento granuladas para pavos y con una composición como se muestra en la tabla más abajo (en base a Leeson y Summers, 1997 pero recalculada sin harina de carne usando el programa de optimización AGROSOFT®) y con 100 mg de proteína de enzima proteásica por kg son preparadas de la manera siguiente:

Maíz molido, harina de soja, harina de pescado y grasa vegetal son mezclados en un mezclador de cascada. Piedra caliza, fosfato cálcico y sal son agregados, con la premezcla anterior en una cantidad de 10 g/kg de dieta, seguido de la mezcla. La resultante mezcla es granulada (preparación de vapor seguida de la fase de granulación).

16

Dos dietas para salmónidos son también preparadas, como se ha perfilado de forma general más arriba. Las composiciones reales están indicadas en la tabla más abajo (compilada por Refstie et al (1998), Aquaculture, vol. 162, p.301-302). El contenido de nutriente estimado es recalculado usando el programa de optimización de alimento Agrosoft®.

La proteasa derivada de Nocardiopsis alba, preparada como se describe en el Ejemplo 2, se añade a las dietas en una cantidad correspondiente a 100 mg de proteína de enzima proteásica por kg.

17

Ejemplo 8 Determinación de pureza de productos enzimáticos con proteasa

La pureza de productos enzimáticos conteniendo proteasa, p. ej. preparaciones de proteasa tales como productos enzimáticos multicomponente comerciales, pueden ser determinados por un método basado en el fraccionamiento del producto enzimático conteniendo proteasa en una columna de exclusión de tamaño. La cromatografía por exclusión de tamaño, también conocida como cromatografía de filtración en gel, se basa en una matriz de gel porosa (envuelta en una columna) con una distribución de tamaños de poro comparables en tamaño a las moléculas de proteína que deben ser separadas. Las moléculas de proteína relativamente pequeñas pueden propagarse en el gel de la solución circundante, mientras que moléculas más grandes evitarán propagarse por su tamaño en el gel al mismo grado. Como resultado, las moléculas de proteína son separadas según su tamaño con moléculas mayores que se eluyen de la columna antes que las más pequeñas.

Ensayo de concentración proteica

La concentración proteica en productos enzimáticos con proteasa es determinada con un kit de ensayo de proteína de BCA de PIERCE (idéntico a cat. PIERCE No.23225). La sal sódica de ácido bicinconínico (BCA) es un, compuesto estable hidrosoluble capaz de formar un complejo intenso morado con iones de cobre (Cu^{1+}) en un entorno alcalino. El reactivo de BCA forma la base del kit de ensayo de proteína de BCA capaz de controlar iones de cobre producidos en la reacción de proteína con Cu^{2+} alcalino (reacción de Biuret). El color producido de esta reacción es estable y aumenta en una forma proporcional con concentraciones de proteína en aumento (Smith, P.K., et al. (1985), Analytical Biochemistry, vol. 150, págs. 76-85). La solución de trabajo de BCA se hace mediante la mezcla de 50 partes de reactivo A con 1 parte de reactivo B (reactivo A es cat. PIERCE No. 23223, contiene BCA y tartrato en un tampón carbonato alcalino; reactivo B es cat. PIERCE No. 23224, contiene 4% CuSO_{4} *5H_{2}O). 300 \mul de muestra es mezclada con 3,0 ml de solución de trabajo de BCA. Después de 30 minutos a 37ºC, la muestra es enfriada a la temperatura ambiente y A_{490} es leída como una medida de la concentración de proteína en la muestra. Diluciones de albúmina de suero bovino (cat. PIERCE No. 23209) son incluidos en el ensayo como un estándar.

Pretratamiento de la muestra

Si el producto enzimático con proteasa es un sólido, el producto es antes disuelto/suspendido en 20 volúmenes de 100 mM de H_{3}BO_{3}, 10 mM de ácido 3,3'-dimetilglutárico, 2 mM de CaCl_{2}, pH 6 (tampón A) durante al menos 15 minutos a 5ºC, y si la enzima en esta fase es una suspensión, la suspensión es filtrada a través de un filtro de 0,45 \mu para dar una solución clara. La solución es tratada desde este punto como un producto enzimático líquido conteniendo proteasa.

Si el producto enzimático con proteasa es un líquido, el producto es antes dializado en un tubo de diálisis SpectraPor con un corte de 6-8000 Da (cat. no. 132 670 de Spectrum Medical Industries) contra 100 volúmenes de tampón A + 150 mM de NaCl (tampón B) durante al menos 5 horas a 5ºC, para eliminar los productos químicos de la formulación que podrían dar una viscosidad elevada a los productos enzimáticos conteniendo proteasa líquida, que es perjudicial para la cromatografía de exclusión de tamaño.

El producto enzimático dializado con proteasa es filtrado a través de un filtro de 0.45 \mu si se formó un precipitado durante la diálisis. La concentración de proteína en el producto enzimático dializado es determinada con el ensayo de concentración de proteína descrito anteriormente y el producto enzimático es diluido con el tampón B, para dar una muestra preparada para cromatografía de exclusión de tamaño con una concentración de proteína de 5 mg/ml. Si el producto enzimático tiene una concentración de proteína inferior a 5 mg/ml después de la diálisis, se utiliza tal como está.

Cromatografía de exclusión de tamaño

Una columna de 300 ml HiLoad26/60 Superdex75pg (Amersham Pharmacia Biotech) es equilibrada en el tampón B (flujo: 1 ml/min). 1,0 ml de la muestra enzimática conteniendo proteasa es aplicada a la columna y la columna es eluida con tampón B (flujo: 1 ml/min). Fracciones de 2,0 ml son recogidas a la salida de la columna, hasta que toda la muestra aplicada se eluyera de la columna. Las fracciones recogidas son analizadas para obtener el contenido de proteína (véase ensayo de concentración de proteína arriba) y la actividad proteasa mediante ensayos apropiados. Un ejemplo de un ensayo apropiado es el ensayo suc-AAPF-pNA (véase ejemplo 2B). Otros ensayos apropiados son p. ej. el ensayo de CPU (se ejemplo 1), y el ensayo de Protazyme AK (véase ejemplo 2D). Las condiciones, p. ej. pH, para los ensayos de actividad proteasa son ajustados para medir tantas proteasas en la muestra fraccionada como sea posible. Las condiciones de los ensayos a los que se hace referencia arriba son ejemplos de condiciones adecuadas. Otras condiciones adecuadas son mencionadas arriba en la sección sobre la medición de la actividad proteasa. Un valor máximo de proteína con actividad en uno o más de los ensayos de proteasa es definido como un valor máximo de proteasa. La pureza de un valor máximo de proteasa se calcula como la cantidad de proteína en el valor máximo dividido por la cantidad de proteína en todos los picos de proteasa identificados.

La pureza de un producto enzimático con proteasa se calcula como la cantidad de proteína en la proteasa estable de valor máximo de ácido dividido por la cantidad de proteína en todos los picos de proteasa identificados usando el procedimiento anterior.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

Patentes citadas en la descripción

\bullet WO 9528850 A [0005] [0096]

\bullet WO 9605739 A [0005] [0119]

\bullet WO 9502044 A [0005] [0140]

\bullet US 3966971 A [0005]

\bullet US 4073884 A [0005]

\bullet US 5047240 A [0005]

\bullet US 3868448 A [0005]

\bullet US 3823072 A [0005]

\bullet US 3683069 A [0005]

\bullet US 5312748 A [0007]

\bullet EP 897985 A [0019]

\bullet EP 130756 A [0119]

\bullet US 3723250 A [0120]

\bullet WO 9324623 A [0149]

\bullet WO 9856260 A [0165]

\bullet DK 200000200 [0187]

Bibliografía distinta de patentes citada en la descripción

\bullet Handbook of Proteolytic Enzymes. Academic Press, 1998. [0013]

\bulletHIGGINS, D.G.; SHARP, P.M. Gene, 1989, vol. 73, 237-244 [0021]

\bulletNEEDLEMAN, S.B.; WUNSCH, C.D. Journal of Molecular Biology, 1970, vol. 48, 443-453 [0021]

\bulletKANEDA et al. Biochem., 1975, vol. 78, 1287-1296 [0028]

\bullet NRC, Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press 1988. [0081]

\bullet NRC, Nutrient requirements of poultry, ninth revised edition 1994, subcommittee on poultry nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press 1994. [0081]

\bullet Aquaculture, principles and practices Scientific Publications Ltd. 1990. [0085]

\bullet Fish nutrition Academic Press Inc. 1989. [0085]

\bulletNRC publication Nutrient Requirements of Swine, 1988, 2-6 [0090]

\bullet Protein Purification, Principles, High Resolution Methods, and Applications VCH Publishers 1989. [0108]

\bullet Biochemische Taschenbuch teil II Springer-Verlag 1964. 93 102- [0109]

\bulletLAEMMLI, U.K. Nature, 1970, vol. 227, 680-685 [0122]

\bullet S.C. GILL; P.H. VON HIPPEL. Analytical Biochemistry, 1989, vol. 182, 319-326 [0153]

\bullet Official Methods of Analysis Association of Official Analytical Chemists 1984. [0155]

\bullet Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur énérgetique des aliments composes destinés á la volaille. Journal Officiel des Communautés Européennes, 1986, vol. L130, 53-54 [0171]

\bulletREFSTIE et al. Aquaculture, 1998, vol. 162, 301-302 [0178]

\bulletSMITH, P.K. et al. Analytical Biochemistry, 1985, vol. 150, 76-85 [0181]

<110> F. Hoffmann-La Roche Ag

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<120> Uso de proteasas estables en ácido en alimentos para animales

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<130> 10094.204-WO

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<140> DK 2000 00200

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<141> 2000-02-08

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<160> 2

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<170> Versión de patentIn 3.0

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<210> 1

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<211> 188

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<212> PRT

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<213> Nocardiopsis sp. NRRL 18262

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<400> 1

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18

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<210> 2

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Nocardiopsis alba

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<400> 2

19

Claims (12)

1. Uso de al menos una proteasa estable en ácido en alimentos para animales donde la proteasa tiene una identidad de al menos el 70% a

(i) SEC ID NO: 1, y/o

(ii) SEC ID NO: 2.

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2. Uso de al menos una proteasa estable en ácido en un aditivo alimentario para animales comprendiendo al menos una vitamina liposoluble, al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un oligoelemento, donde la proteasa tiene una identidad de al menos el 70% a

(i) SEC ID NO: 1, y/o

(ii) SEC ID NO: 2: y

donde la proteasa tiene al menos un 70% de pureza determinado por cromatografía de exclusión de tamaño como se describe en el ejemplo 8, usando el ensayo Suc-AAPF-pNA para analizar la actividad proteasa.

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3. Uso de al menos una proteasa estable en ácido en una composición de alimento para animales que tiene un contenido bruto de proteína de 50-800 g/kg, donde la proteasa tiene una identidad de al menos el 70% a

(i) SEC ID NO: 1, y/o

(ii) SEC ID NO: 2.

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4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, donde la cantidad de la proteasa es 0,01-200 mg de proteína de enzima proteásica por kg de alimento.

5. Método para mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales, donde al menos una proteasa estable en ácido es añadida al alimento, y donde la proteasa tiene una identidad de al menos el 70% a

(i) SEC ID NO: 1, y/o

(ii) SEC ID NO: 2.

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6. Aditivo alimentario para animales comprendiendo

(a) al menos una proteasa estable en ácido y

(b) al menos una vitamina liposoluble, y/o

(c) al menos una vitamina hidrosoluble, y/o

(d) al menos un oligoelemento;

donde la proteasa tiene una identidad de al menos el 70% a

(i) SEC ID NO: 1, y/o

(ii) SEC ID NO: 2, y

donde la proteasa tiene al menos un 70% de pureza determinado por cromatografía de exclusión de tamaño como se describe en el ejemplo 8, usando el ensayo Suc-AAPF-pNA para analizar la actividad proteasa.

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7. Aditivo alimentario para animales según la reivindicación 6, donde la cantidad de proteasa corresponde a una adición estimada de 0,01 200 mg de proteína de proteasa por kg de alimento para animales.

8. Aditivo alimentario para animales según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, que además comprende fitasa, xilanasa, galactanasa, y/o beta-glucanasa.

\newpage

9. Composición de alimento para animales teniendo un contenido bruto de proteína de 50-800 g/kg y comprendiendo al menos una proteasa estable en ácido donde la proteasa tiene una identidad de al menos el 70% a

(i) SEC ID NO: 1, y/o

(ii) SEC ID NO: 2.

10. Composición de alimento para animales según la reivindicación 9, donde la cantidad de la proteasa es 0,01-200 mg de proteína de proteasa por kg de alimento para animales.

11. Método para el tratamiento de proteínas vegetales para el uso en alimentos para animales, comprendiendo la fase de añadir al menos una proteasa estable en ácido a al menos una proteína vegetal o fuente proteica, donde la proteasa tiene una identidad de al menos el 70% a

(i) SEC ID NO: 1, y/o

(ii) SEC ID NO: 2.

12. Método según la reivindicación 11, donde la semilla de soja está incluida entre al menos una fuente de proteínas vegetales.