ES2305157T3 - Liposomas. - Google Patents

Abstract

Vacuna génica que comprende liposomas que presentan un diámetro medio comprendido en el intervalo de 100 a 1.000 nm formados a partir de componentes formadores de liposomas que comprenden por lo menos un compuesto lipídico cargado catiónicamente, en una cantidad tal que los componentes formadores de liposomas presentan una carga catiónica global y en el intervalo de 10 a 25% en moles sobre la base de los moles totales de los componentes formadores de liposomas y una fosfatidiletanolamina y, atrapado en el interior del espacio intravesicular de los liposomas, un polinucleótido que codifica operativamente un polipéptido inmunogénico útil para inducir una respuesta inmune deseada en un sujeto animal o humano en la que la cantidad de polinucleótido está comprendida en el intervalo de 0,2 a 0,5 mug por mol de los componentes formadores de liposomas.

Description

Liposomas.

La presente invención se refiere a composiciones de liposomas con polinucleótidos atrapados que codifican un polipéptido deseado. El polinucleótido codifica preferentemente un polipéptido inmunogénico que es útil para inducir una respuesta inmune deseada en un individuo, por ejemplo, para la inmunización profiláctica contra microbios infecciosos o para el tratamiento inmunoterapéutico. Los liposomas incluyen preferentemente por lo menos un lípido cargado catiónicamente y se obtienen preferentemente mediante una técnica de deshidratación-rehidratación.

Es conocido introducir material genético en el organismo del hombre o de un animal con diversas finalidades. A mediados de la década de 1960 se sugirió que la técnica se podría utilizar para el tratamiento de enfermedades genéticas mediante la introducción de una secuencia génica normal en células de un individuo que transportara su parte complementaria defectuosa. Se emprendieron de forma habitual ensayos de procedimientos para el tratamiento mediante terapia génica de diversas alteraciones genéticas heredadas. Por ejemplo, se ha llevado a cabo una cantidad considerable de trabajo en el tratamiento de la fibrosis cística, introduciendo ADN que codifica el regulador CF de la conductancia transmembranosa. Ya que el producto del gen es necesario en los pulmones, se han realizado intentos para suministrar el gen intranasalmente, o a los pulmones directamente.

Más recientemente la terapia génica se ha propuesto para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, introduciendo genes que codifican el factor de necrosis tumoral (TNF) o la interleucina-2 en linfocitos o en células tumorales, se espera estimular una respuesta inmune que provoque la destrucción del tumor. Además, introduciendo genes que codifican un antígeno principal de histocompatibilidad humano del tipo A (HLA-B7) en células tumorales de pacientes que no expresen este antígeno, se espera estimular una respuesta inmune para el antígeno que dé lugar a la destrucción de las células tumorales.

Se han propuesto diversos vectores para el suministro y expresión de ácidos nucleicos en la terapia génica (Mulligan, 1993). Incluyen virus (por ejemplo, retrovirus y adenovirus), así como vectores no víricos (por ejemplo, polímeros catiónicos y vesículas). Sin embargo, existen desventajas con cada uno de estos vectores, por ejemplo, posibles efectos secundarios después de la integración de los retrovirus en el genoma celular, impidiendo de este modo la promoción de respuestas inmunes contra proteínas víricas el tratamiento a largo plazo (Kay et al, 1994), y una eficiencia de transfección escasa o transitoria mediante los vectores no víricos (Legendre y Szoka, 1995). Sin embargo, la simplicidad relativa de la incorporación del ADN en los vectores no víricos, a pesar a menudo de su tamaño y estructura, y su naturaleza no patogénica, hacen que estos vectores constituyan una alternativa atractiva. En realidad, se han desarrollado actualmente constructos (complejos de vesículas catiónicas preformadas y ADN plasmídico) que exhiben altos índices de transfección in vitro (Felgner, 1991) y una transfección entre escasa y modesta en los animales experimentales (Alton et al, 1993; Zhu et al., 1993). Por otra parte, a causa de la toxicidad potencial (Raz et al., 1994) de tales complejos y de la incapacidad para incorporar otros agentes que puedan promover la eficiencia de la transferencia del ADN, su utilidad in vivo puede no ser tan prometedora como en el caso de que los ácidos nucleicos se incorporan con liposomas convencionales. Estos, cuando se diseñan apropiadamente (en términos del tamaño de las vesículas, carga superficial y composición lipídica), se conservan estables en la circulación sanguínea (Scherphof et al, 1983; Gregoriadis, 1995) protegiendo así a su contenido de ácidos nucleicos de las nucleasas en el plasma sanguíneo, o alcanzan tasas de depuración que conducen a una utilización óptima (Gregoriadis, 1995). Sin embargo, el injerto de ligandos específicos celulares a la superficie de liposomas que circulan extensamente dirigiría preferentemente los ácidos nucleicos a las células diana (Gregoriadis, 1995). La incorporación de otros agentes a liposomas que contienen ácidos nucleicos puede también convertirlos en fusogénicos, facilitar el escape de su contenido de los endosomas al citoplasma, o promover el transporte del ADN al núcleo (Legendre y Szoka, 1995). Sin embargo, la mayoría de las técnicas (Gregoriadis, 1993) para atrapar el ADN en los liposomas son ineficaces, incompatibles con su tamaño o condiciones de utilización (por ejemplo, tratamiento con ultrasonidos, detergentes orgánicos y solventes), que pueden ser perjudiciales para la integridad del ADN.

El documento WO-A-9117424 (Vical, Inc) describe varios complejos de tipos lipídicos cargados positiva y negativamente y un compuesto activo con una mejoría en el suministro intracelular. Se sugirió que tasas de atrapamiento bajas de polinucleótidos en los liposomas catiónicos pueden superarse mediante un procedimiento en el cual un complejo tipo red cargado positivamente de liposomas preformados cargados positivamente y polinucleótidos (que están cargados negativamente) se asocia subsiguientemente con un exceso de liposomas preformados cargados negativamente que, según se afirma, revisten al complejo cargado positivamente. Sin embargo, ya que el polinucleótido no está atrapado en el interior de cualquier vesícula, se piensa que será accesible a las nucleasas en el plasma.

En el documento US-A-4.897.355, Eppstein et al (Syntex) describen liposomas formados por lípidos catiónicos para utilizarlos en el suministro intracelular de compuestos activos. Un ejemplo de compuesto activo es un polinucleótido, por ejemplo, que codifique enzimas para su utilización en condiciones de deficiencia enzimática, hormonas para utilizarlas en terapias de reemplazamiento hormonal, factores de coagulación sanguínea, neurotransmisores, compuestos antivíricos y compuestos anticáncer, o para el suministro de ARN anti-sentido para "desconectar" selectivamente la expresión de ciertas proteínas. Los compuestos activos se mezclan con liposomas preformados vacíos y el conjugado, opcionalmente, se mezcla a continuación con otros liposomas preformados.

\newpage

En Journal of Drug Targeting, 1996, (en prensa) Gregoriadis et al describieron la formación de liposomas con ADN atrapado, para su utilización en terapia génica, utilizando una técnica de deshidratación-rehidratación.

En la conferencia de 1995 "Diana de medicamentos: estrategias para el suministro de oligonucleótidos y genes en la terapia", y en las actas resultantes de dicha conferencia, eds, G.Gregoriadis y B. McCormack (publicado en 1996, Plenum Press, New York), Davis considera las respuestas inmunitarias no deseadas contra los productos de los genes introducidos en las células para procedimientos terapéuticos génicos. Sugiere cómo el estudio de la respuesta inmune inducida después de la introducción intracelular de genes es importante para optimizar los tratamientos terapéuticos génicos, así como las aplicaciones de la vacunación mediante ADN (inmunización basada en el ADN) de la transferencia génica. Describe muchas ventajas de las vacunas génicas respecto a las vacunas basadas en los antígenos y describe algunos resultados en la utilización del ADN desnudo para la inmunización basada en el ADN, respecto al antígeno superficial de la Hepatitis B (HBsAg).

En la misma conferencia, Behr describió transportadores sintéticos para secuencias polinucleótidas para utilizar en terapia génica, formados por lipopoliaminas que pretenden autoensamblarse alrededor del ADN mientras lo condensan. Se tiene la intención de que el polinucleótido alcance el núcleo celular. Este inventor considera que las partículas autoensambladas no están constituidas por una bicapa, y así, no se definirían como liposomas.

La información previa a la conferencia relativa a la segunda conferencia anual de IPC "Vacunas genéticas y estrategias inmunoterapéuticas", que tuvo lugar el 23 y 24 de octubre de 1996 en Washington DC, Estados Unidos, indicó que Felgner describiría trabajos recientes utilizando lípidos catiónicos para mejorar el suministro de genes que codifiquen antígenos. Los genes se suministran intranasalmente y en el interior del tejido pulmonar para estimular la inmunidad de la mucosa. En la misma conferencia, se afirmó que Ledley describiría sistemas de suministro génico que comprendieran lípidos catiónicos para controlar la biodisponibilidad y entrada del ADN en las células de la mucosa. La intención era lograr una respuesta inmune efectiva. El anuncio previo a la conferencia no da más información sobre cómo el suministro génico se ha llevado a cabo.

Sería deseable aumentar la tasa de encapsulación de los polinucleótidos en los sistemas de suministro liposómico. Además, sería deseable aumentar el nivel del producto génico en la circulación de los animales a los cuales se administraron los genes, especialmente para los productos terapéuticos. Es, además, deseable aumentar la tasa de suministro del gen a las células diana, donde el producto génico es un antígeno. Sería además deseable mejorar el suministro de polinucleótidos que codifican polipéptidos inmunogénicos que son útiles para inducir una respuesta inmune deseada.

En los documentos JP-A-02-135092 y EP-A-0475178, los genes son formulados con liposomas que comprenden lípido catiónico.

En el documento WO-A-95/04542, las formulaciones para la administración de los compuestos bioactivos son formadas por la combinación de liposomas catiónicos y liposomas aniónicos. El bioactivo puede ser un polinucleótido.

Vacuna génica que comprende liposomas formados a partir de componentes formadores de liposomas que comprende por lo menos un compuesto lipídico cargado catiónicamente, en una cantidad tal que los componentes formadores de liposomas presentan una carga catiónica global y en el intervalo de 10 a 25% en moles sobre la base de los moles totales de los componentes formadores de liposomas y una fosfatidiletanolamina y, atrapado en el interior del espacio intravesicular de los liposomas, un polinucleótido que codifica operativamente un polipéptido inmunogénico que es útil para inducir una respuesta inmune deseada en un sujeto humano o animal, en la que la cantidad de polinucleótido está comprendida en el intervalo de 0,2 a 0,5 \mug por mol de los componentes formadores de liposomas.

En esta memoria el término atrapado significa que el polinucleótido se encuentra en el espacio intravesicular. Así, los liposomas se han formado en presencia del polinucleótido. Esto debe compararse con los complejos de los liposomas preformados y los polinucleótidos de la técnica anterior.

El producto génico será un antígeno contra el cual se desee una respuesta inmunitaria. El péptido incluye, pues, uno o más determinantes antigénicos de microorganismos infecciosos, tales como virus, bacterias u hongos. El procedimiento es de particular utilidad en la inmunización contra bacterias, hongos y virus, especialmente el de la gripe, el HIV, el de la hepatitis B y el de la hepatitis C. El producto génico puede por tanto ser HBsAg o la proteína nuclear del virus de la hepatitis C, o un antígeno del virus de la gripe o un péptido antigénico del HIV o un fragmento suyo. La invención es también valiosa cuando el producto génico está constituido por una o varias proteínas del virus del herpes simple, un producto vírico cancerígeno, tal como SV40, o un antígeno del cáncer, antígenos de la tuberculosis e incluso antígenos de microorganismos más complejos, tales como parásitos como el de la malaria.

En la presente invención el tejido diana para la absorción de los liposomas puede consistir en las células cancerosas musculares, dérmicas, hepáticas y del bazo para ser destruidas, las células mucosas tal como las nasales o pulmonares o intestinales y especialmente, las de las nódulos linfáticos. Las células diana para las vacunas génicas sno generalmente células presentadoras de antígenos. La composición puede administrarse sistémicamente, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, o directamente al tejido diana, intranasalmente por ejemplo, intramuscular ó intradérmicamente, o incluso transdérmicamente u oralmente. La presente invención ha permitido por primera vez, la generación con éxito de una respuesta inmune en el lugar en que los liposomas se administran subcutáneamente. Constituye un aspecto preferido de la presente invención, por tanto, que la composición se administre subcutáneamente.

\global\parskip0.950000\baselineskip

En la presente memoria el término "liposoma" se refiere a vesículas rodeadas por una bicapa formada de componentes que incluyen habitualmente lípidos en combinación con componentes no lipídicos.

Puede resultar deseable proveer la superficie externa del liposoma con un fragmento diana, por ejemplo, un anticuerpo, apropiado para reconocer el tejido diana. Por ejemplo, en el lugar en que la composición se suministra a la circulación, ligandos específicos celulares unidos a la sueprficie externa de los liposomas, dirigirán los ácidos nucleicos a las células diana (Gregoriadis, 1995).

El gen estará presente en una forma tal, que el producto deseado pueda producirse en la célula diana, y así, incluye preferentemente elementos reguladores que facilitan la expresión en las células diana. El polinucleótido incluye por tanto un promotor, así como regiones que median la unión al ribosoma, y también opcionalmente otras regiones que podrían potenciar la expresión génica.

El polinucleótido puede ser ARN, pero preferiblemente es ADN. Está generalmente en forma de un plásmido, preferentemente un plásmido que sustancialmente no se replica, ya que para este aspecto de la invención, es generalmente apropiada una actividad transitoria durante un período de semanas o de unos pocos meses.

En este aspecto de la invención, los componentes que forman los liposomas utilizados para formarlos pueden incluir porciones lipídicas neutras, zwitteriónicas, aniónicas y/ó catiónicas. Estas se utilizan en cantidades relativas tales como para conferir una carga positiva global sobre el liposoma. Se encuentra que utilizando componentes lipídicos de forma que el liposoma tenga una carga positiva global, pueden mejorarse los resultados en este aspecto de la invención, dando lugar a un aumento de la respuesta inmune cuando se utilizan para suministrar un gen que codifique un antígeno. Además de los componentes que se denominan apropiadamente lípidos (incluyendo glicéridos y colesterol), los componentes formadores del liposoma pueden incluir componentes no lipídicos (es decir, que no son lípidos que se encuentran de modo natural), tales como agentes activos superficiales catiónicos o no iónicos.

El presente inventor ha establecido que en un sistema de referencia in vitro, el atrapamiento del ADN que codifica la proteína marcadora de la luciferasa, da lugar a niveles aumentados de la expresión de la luciferasa cuando se compara con otros procedimientos que utilizan liposomas no cargados o liposomas cargados aniónicamente. Aunque los niveles de expresión eran más bajos que utilizando un complejo de liposomas preformados cargados catiónicamente [la LipofectAMINA (marca comercial) disponible comercialmente], se espera que, comparándolo con el complejo, podría exhibirse in vivo una mejoría en la resistencia al ataque nucleásico mediante el atrapamiento. Además, se encuentra que los liposomas no se agregan rápidamente, aunque puede tener lugar tal agregación para los sistemas mezclados preformados liposomas-polinucleótidos, especialmente en presencia de proteínas séricas. El atrapamiento del polipéptido proporciona mayor libertad para proporcionar ligandos que hagan diana sobre la superficie liposómica o para llevar a cabo otros tratamientos superficiales sobre los liposomas con sustancias activas. Si el producto génico fuera un antígeno que indujera una respuesta inmune deseada, se espera por parte del inventor que se exhibiría el alto nivel de expresión de la proteína modelo luciferasa.

Los experimentos han mostrado que la vacunación de ratones con pRc/CMV HBS atrapado en liposomas (que codifica la región S del antígeno superficial del virus de la hepatitis B; subtipo ayw) a través de diversas vías, da lugar a respuestas inmunes humorales y mediadas celularmente que son independientes de si los ratones se han engendrado mediante endogamia (Balb/c) o por cruce de razas (T/o) y de la vía inyectable (intramuscular, im; subcutánea, sc; intravenosa, iv; e intraperitoneal, ip). Tales respuestas son en la mayoría de los casos significativamente mayores que las que se apreciaron con el ADN desnudo bajo condiciones idénticas (véase el ejemplo 5 a continuación).

Un componente catiónico incorporado al liposoma puede ser cualquiera de los compuestos lipídicos que se han utilizado en las preparaciones liposómicas para mejorar la tasa de transfección mediante la formación de complejos con los polinucleótidos. El componente puede ser sintético o natural. Los lípidos catiónicos preferidos son, el 1,2-bis(oleoiloxi)-3-trimetilamonio)propano (DOTAP), el 1,2-bis(hexadeciloxi)-3- trimetilaminopropano (BisHOP), el N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilcloruroamónico (DOTMA) y otros lípidos de estructura I definidos en el documento US-A-4.897.355, incorporada a la presente memoria como referencia o los análogos éster.

La estructura es la siguiente:

1

o un isómero óptico del mismo, en el que Y^{1} e Y^{2} son los mismos o distintos y son cada uno -O- ó O-C(O)-, en el que el carbono carbonilo se une a R^{1} de R^{2} en su caso; R^{1} y R^{2} son independientemente un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo de 6 a 24 átomos de carbono, R^{3}, R^{4} y R^{5} son independientemente hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, grupos arilo o aralquilo de 6 a 11 átomos de carbono; alternativamente, dos o tres de R^{3}, R^{4} y R^{5} se combinan con el átomo de nitrógeno cargado positivamente para formar una estructura cíclica de entre 5 y 8 átomos, donde, además del átomo de nitrógeno cargado positivamente, los átomos en la estructura son átomos de carbono y puede incluir un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre; n es entre 1 y 8; y X es un anión.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Las formas de realización preferidas son composiciones en las que R^{1} y R^{2} tienen individualmente entre 0 y 6 sitios de insaturación, y tienen la estructura

2

en la que la suma de a y c es de entre 1 a 23; y b es de 0 a 6. Más preferentemente, cada uno de R^{1} y R^{2} es oleilo. Las formas de realización particularmente preferidas son composiciones en las que los grupos alquilos de las cadenas largas son ácidos grasos, esto es, en las que Y^{1} e Y^{2} son parecidos y son -O-C(O)-.

Alternativamente, se pueden utilizar los lípidos catiónicos de la estructura general I o de la estructura general II definidos en la patente US-A-5.459.127.

Otro compuesto catiónico apropiado es el 3\beta[N-(N', N'-dimetilaminoetano)-carbamil] colesterol (DC-Chol).

Los liposomas, además de comprender los componentes catiónicos, comprenden también generalmente componentes no iónicos y/o zwitteriónicos que incluyen lípidos, que pueden ser fosfolípidos u otros lípidos que no incluyen grupos fosforilo. Preferentemente, los lípidos incluyen fosfolípidos, tales como fosfatidilcolinas naturales o sintéticas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, en cualquiera de las cuales los grupos alquilos de cadena larga (que pueden estar unidos mediante enlaces éster o éter) pueden ser saturados o no. Preferentemente, los grupos acilo de los lípidos glicéridos son insaturados. Preferentemente, los grupos acilos de los lípidos glicéridos, son insaturados. Los componentes pueden incluir componentes no lipídicos, por ejemplo surfactantes no iónicos tales como los mono ésteres de sorbitano de ácidos grasos, y/o ácidos grasos etoxilados u otros análogos, tales como las lanolinas etoxiladas.

Los mejores resultados se alcanzan cuando los liposomas incluyen lípidos fusogénicos, que son habitualmente fosfatidiletanolaminas en las que los grupos acilo están insaturados. El colesterol puede incluirse, aunque parece convertir a los liposomas en demasiado estable para la administración adecuada de polinucleótidos en las células diana.

La cantidad del componente catiónico está en el intervalo de 10 a 25% de los moles totales de los componentes formadores de liposomas.

La composición de liposomas está generalmente en forma de una suspensión acuosa, por ejemplo, un tampón fisiológico. Alternativamente, podría consistir en una composición seca para rehidratación.

Los liposomas pueden estar realizados mediante cualquiera de entre las técnicas de formación de liposomas utilizadas generalmente. Los liposomas producto pueden ser vesículas multilamelares o unilamelares y pueden ser relativamente grandes (los diámetros vesiculares del orden de 300 nm a 2000 nm con diámetros promedio, preferentemente del orden de 500-1000 nm), o pequeños (diámetros vesiculares del orden de 100 nm a 400 nm preferentemente con diámetros promedio del orden de 200 a 300 nm). Preferentemente, los liposomas tienen un diámetro medio que no excede de los 500 nm, y de modo preferente, todos poseen sustancialmente diámetros menores que 2000 nm.

Preferentemente, los liposomas se forman mediante un procedimiento en el que se forman las vesículas, se mezclan con nucleótidos para ser atrapados, y son deshidratados entonces, preferentemente mediante liofilización, rehidratándose subsecuentemente a una composición acuosa para obtener vesículas de deshidratación-rehidratación, y sometidas subsecuentemente de modo preferente a micro fluidización para reducir el tamaño promedio. El material no atrapado se separa de los liposomas preferentemente mediante centrifugación o cromatografía de cribado molecular, después de las etapas de rehidratación y/o microfluidicación.

Estos inventores han establecido que la utilización de DRV's puede proporcionar niveles aumentados de atrapamiento para los polinucleótidos para las vacunas génicas. Según el procedimiento de la presente invención, se proporciona un procedimiento para atrapar polinucleóticos en los liposomas que implica las etapas de:

a)

formación de una suspensión acuosa que comprende un polinucleótido desnudo, que codifica operativamente un polipéptido inmunogénico que es útil para la inducción de una respuesta inmune que se desea en un individuo humano o animal, y liposomas preformados, y liposomas catiónicos preformados formados a partir de componentes formadores de liposomas que comprenden por lo menos un compuesto lipídico cargado catiónicamente, en una cantidad tal que los componentes formadores de liposomas presentan una carga catiónica global y en el intervalo de 10 a 25% en moles sobre la base de los moles totales de los componentes formadores de liposomas y un fosfatidiletanolamina,

b)

deshidratar la suspensión, y

c)

rehidratar el producto de la etapa b para formar una suspensión de liposomas que presentan un diámetro medio en el intervalo de 100 a 1.000 nm.

\vskip1.000000\baselineskip

El procedimiento comprende preferentemente las etapas siguientes:

d)

someter la suspensión acuosa de las vesículas de deshidratación y rehidratación de la etapa c) a microfluidización; y

e)

separar opcionalmente el polinucleótido no atrapado de los liposomas.

\vskip1.000000\baselineskip

La deshidratación-rehidratación de ambos aspectos del procedimiento de la invención es sustancialmente tal como se describe por Kirby y Gregoriadis, 1984, cuyo contenido se incorpora a la presente memoria como referencia. Así, los liposomas de la etapa 1 son unilamelares pequeños (SUV) y los fabricados en la etapa 3 son preferentemente multilamelares (MLV), respectivamente. Los liposomas producto de la etapa 3 se denominan generalmente vesículas de deshidratación-rehidratación (DRV). La microfluidicación de las DRV es llevada a cabo sustancialmente tal como se describe en el documento WO-A-92/04009, cuya exposición se incorpora a la presente memoria como referencia y por Gregoriadis et al, 1990.

Utilizando la técnica DRV, los presentes inventores han establecido que puede alcanzarse un rendimiento global del atrapamiento del soluto superior al 10%. Los inventores han establecido que puede atraparse en los liposomas hasta un 90% o incluso más del polinucleótido que se encuentra en la suspensión acuosa sometida a la etapa de liofilización. Además de la microfluidicación, aunque da lugar a una reducción del porcentaje de polinucleótido incorporado, permite sin embargo que se alcancen tasas de atrapamiento para el polinucleótido de más del 10%, por ejemplo de hasta un 50%. El nivel de atrapamiento del polinucleótido en la composición liposómica está comprendido preferentemente en el intervalo de 0,2 a 0,5 \mug/\mu mol de lipido.

Este aspecto de la invención se utiliza preferentemente para fabricar las preparaciones liposómicas del primer aspecto de la invención.

La invención incluye también la utilización de los nuevos liposomas o de los fabricados mediante los nuevos procedimientos de la invención, para la obtención de una composición para pueda utilizarse en un procedimiento terapéutico o profiláctico. Por ejemplo, el procedimiento puede ser la inmunización (vacunación) de un individuo humano o animal para protegerlo contra una infección por microorganismos infeccciosos. Alternativamente, puede generarse una respuesta inmune mediante el producto génico el cual es útil en terapia inmune, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer.

También se proporciona en la presente invención una nueva utilización in vitro de una nueva composición según la invención o del producto del procedimiento de la invención para la transfección de células humanas o animales. Las células pueden subsiguientemente cultivarse in vitro y/o pueden implantarse subsecuentemente en el paciente a partir del cual se eliminaron. De este modo, la invención puede utilizarse en un procedimiento de trasplante ex vivo, por ejemplo del tipo descrito en el documento WO-A-93/14778.

Una composición farmacéutica que incluye una composición liposómica según la invención y un transportador farmacéuticamente aceptable. La composición puede ser apropiada para la administración inyectable, por ejemplo, intravenosa (i.v.), intramuscular, (i.m.); intraperitoneal, (i.p.), oral o subcutánea, (s.c). Alternativamente la composición es apropiada para la administración intranasal, o para el suministro directo a los pulmones, mediante inhalación, o para suministro transdérmico. Pueden usarse transportadores farmacéuticos convencionales utilizados para la administración de liposomas. Los inventores encontraron que la invención permite la inyección del cADN utilizando las técnicas im, mientras que allí donde el ADN desnudo se utilizó como una vacuna en el pasado, se encontró que tienen que seguirse protocolos inyectables especiales muy controlados para evitar cualquier daño al músculo y para realizar la inyección en exactamente la misma posición para poder proporcionar resultados comparables seguros. Por ejemplo, se ha encontrado en los procedimientos anteriores que los agentes que regeneran al músculo deben administrarse previamente para mejorar la respuesta.

La presente invención puede resultar de utilización para los procedimientos de tratamiento en los que la nueva composición farmacéutica se administra a un individuo humano o animal. El procedimiento puede de este modo ser uno que induzca una respuesta inmune para un antígeno codificado por el polinucleótido, por ejemplo, el que es un antígeno de un agente microbiano infeccioso. Alternativamente, para la utilización del aspecto del producto, el procedimiento puede ser para el reemplazamiento génico o la terapia de aumento para la terapia inmune, por ejemplo para el tratamiento del cáncer o para la administración de un polinucleótido que codifique un polipéptido farmacológicamente útil.

La presente invención se ilustra en los ejemplos siguientes. En algunos de los ejemplos, el ADN que codifica la luciferasa se utiliza como un polinucleótido modelo, siendo la luciferasa un producto génico modelo.

Los dibujos representan los resultados de algunos de los ejemplos, de la siguiente manera:

La Figura 1 consiste en una serie de gráficos con franjas que muestran los resultados mencionados en el Ejemplo 2, tabla 4.

La Figura 2 consiste en una serie de gráficos con franjas que muestran los resultados del Ejemplo 3.

La Figura 3 consiste en una serie de gráficos con franjas que muestran los resultados del Ejemplo 4.

Las Figuras 4 a 8 son series de gráficos con franjas que muestran los resultados del Ejemplo 5.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

(Referencia)

Atrapamiento y acomplejamiento del ADN que codifica la luciferasa y transfección in vitro de las células Materiales

Las fuentes y grados de la fosfatidilcolina de huevo (PC), estearilamina (SA) y 1,2-bis (hexadeciloxi)-3-trimetilaminopropano (BisHOP) se han descrito en otro lugar (Tan y Gregoriadis, 1989). N[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) fue una donación de GeneMedicine (Houston, Texas, USA). La fosfatidilserina (PS) y la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) procedían de Sigma Chemical Co. (Poole, Dorset, Reino Unido). El vector de expresión eucariótica pGL2-control (\approx3,99 X 10^{6} Daltons) que expresa el gen informador de la luciferasa a partir de un promotor SV40, se obtuvo de Promega (Southampton, Reino Unido). La LipofectAMINA, obtenida de Gibco BRL (Paisly, Reino Unido), formó un complejo con pGL2 en medio sérico reducido OptiMEM 1 que contenía GLUTAMAX 1 (Gibco BRL) en una proporción de 15:1 [peso: 6,356 kg, unidad británica de peso] antes de utilizarlo. La desoxiribonucleasa I (páncreas bovino, tipo II; actividad específica: 2500 unidades Kunitz mg^{-1} proteína) procedía de Sigma Chemical Co. La RQ1 desoxiribonucleasa (1 unidad \mul^{-1}) y el equipo del sistema de ensayo de la luciferasa se obtuvieron de Promega. El ADN plasmídico pGL2 se marcó radioactivamente con ^{35}S-dATP (37 kBq; ICN Flow, Thame, Reino Unido) mediante el procedimiento de Wheeler y Coutelle (1995). Todos los otros reactivos fueron de grado analítico.

Métodos Incorporación del ADN plasmídico en los liposomas

El procedimiento de deshidratación-rehidratación (Kirby y Gregoriadis, 1984), se utilizó para la incorporación del ADN plasmídico pGL2 en los liposomas. Brevemente, 2 ml de vesículas unilamelares pequeñas (SUV) compuestas de PC (16 \mumoles) y DOPE (proporción molar 1:1); PC (16\mumoles), DOPE y PS (proporciones molares 1:1:0,5; cargadas negativamente); PC (16\mumoles), DOPE y SA, ó BisHOP (proporciones molares 1:1:0,5; cargadas positivamente); PC (16 \mumoles), DOPE y DOTMA (proporciones molares 1:1:0,25; cargadas positivamente); y DOPE (16 \mumoles) y DOTMA (proporciones molares 1:0,25; cargadas positivamente), fueron preparadas tal como se ha descrito (Kirby y Gregoriadis, 1984), se mezclaron con 10-100 \mug (10-100 \mul) de pGL-2 al que se había añadido el ADN pGL2 plasmídico marcado con ^{35}S (6 X 10^{4}-7 X 10^{4} dpm); liofilizándose durante la noche. Después de rehidratación controlada (Kirby y Gregoriadis, 1984) y de la generación de vesículas (DRV) multilamelares de deshidratación-rehidratación (Gregoriadis et al, 1993), las vesículas se centrifugaron a 40.000 xg durante 25 minutos para eliminar el ADN no incorporado. Los sedimentos liposómicos se suspendieron en tampón de fosfato sódico 0,1 M suplementado con NaCl al 0,9%, pH 7,2 (PBS), centrifugándose otra vez. Los sedimentos lavados se volvieron a suspender en PBS y se conservaron a 4ºC hasta que se utilizaran posteriormente. En experimentos separados, las DRV que incorporan ADN como anteriormente en la mezcla con ADN libre no incorporado (es decir, antes de centrifugación, se microfluidicaron (Gregoriadis et al, 1990) en un Microfluidicador M110S (Microfluidics, Newton, MA, Estados Unidos) durante 3 ciclos o durante 1, 2, 3, 5 y 10 ciclos (sólo liposomas PC: DOPE-:DOTMA). La separación del ADN incorporado a partir del ADN libre en liposomas microfluidicados se llevó a cabo mediante centrifugación como antes (1, 2, 3, y 5 ciclos) ó mediante cromatografía de cribado (10 ciclos) utilizando (Gregoriadis et al, 1990) una columna 4B CL de Sepharose (Pharmacia). En algunos experimentos, DRV preformadas (sin ADN) se mezclaron con 10 ó 50 \mug de ADN e se incubaron a 20ºC durante 20 horas o se microfluidicaron durante 3 ciclos. En ambos casos, los liposomas se centrifugaron como antes para separar el ADN adsorbido del no adsorbido. La incorporación de ADN en los liposomas o la adsorción en su superficie se estimó basándose en la radioactividad ^{35}S que se recuperó en los sedimentos suspendidos (DRV no microfluidicadas y DRV microfluidicadas durante 1, 2, 3, ó 5 ciclos). o las fracciones eluidas después de la cromatografía (10 ciclos).

Espectroscopía de correlación fotónica

El tamaño medio del promedio z de las DRV microfluidicadas y no-microfluidicadas se determinó en un Malvern Autosizer IIc tal como se describe en otro lugar (Gregoriadis et al, 1993; Gregoriadis et al, 1990).

Incubación de los liposomas con desoxiribonucleasa

DRV no microfluidicadas o microfluidicadas (3 ciclos) que incorporaban ADN plasmídico pGL2 (0,75-22,5 \mug) y ADN plasmídico pGL2 trazador marcado con ^{35}S en 1 ml de PBS, se mezclaron con 100 unidades de desoxiribonucleasa I, incubándose a 37ºC durante 10 minutos. La reacción se detuvo con 1 \mul de 0,5 M EDTA (pH 8) y las mezclas se centrifugaron para separar el ADN liposómico digerido del no digerido. El ADN digerido se determinó basándose en la radioactividad liberada en los sobrenadantes. Trabajos preliminares habían establecido la degradación completa de 100 \mug de pGL2 bajo condiciones idénticas. En otros experimentos, muestras de liposomas similares que contenían 2 \mug de ADN se diluyeron hasta 100 \mul con un tampón que contenía 50 mM de ditiotreitol y 50 \mug/ml de albúmina sérica bovina (fracción V; Sigma Chemical Co.), mezclado con una unidad de RQ1 desoxiribonucleasa (Promega) y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La digestión finalizó añadiendo 1 \mul de 0,5 M EDTA (pH 8.0).

Electroforesis en gel de agarosa

Se incubaron como antes muestras de DRV microfluidicadas o no incorporaban ADN, con o sin RQ1 desoxiribonucleasa, extrayéndose dos veces con una mezcla de fenol-cloroformo para eliminar el material lipídico. El ADN en la capa acuosa se precipitó con etanol, se volvió a suspender en 20 \mul de tampón TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0 y 1 mM EDTA, pH 8,0) y se sometió a electroforesis en gel de agarosa para determinar la integridad del ADN.

Experimentos de transfección

Células epiteliales COS-7 renales de mono conservadas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 200 mM de FLUTAMAX I (Gibco BRL) que contenía suero fetal de ternera al 10%, se recolectaron mediante tripsinización, se sembraron en placas de 24 pocillos (Falcon) (5 x 10^{4} células por pocillo) y se incubaron durante 18 a 24 horas. Los pocillos que contenían células adherentes con una confluencia del 70-80% se lavaron con solución salina tamponada de fosfato, de Dulbecco (sin calcio o magnesio), pH 7,2 (Gibco BRL), transféctandose entonces con 1 \mug (6-18 \mul) de ADN pGL2 acomplejado con LipofectAMINA (24 \mug lípidos aproximadamente) o incorporado a los liposomas, en un volumen de 0,5 ml de medio sérico reducido de OptiMEM 1 que contenía GLUTAMAX I. Después de la incubación a 37ºC durante cuatro a seis horas, el medio de transfección se eliminó y reemplazó con 1 ml de medio completo DMEM. Las células se incubaron durante un total de 48 horas, se lisaron raspándolas en 200 \mul de tampón informador de lisis (Promega) (la lisis celular se potenció meidiante un ciclo de congelación-descongelación sobre hielo seco) y se centrifugó entonces a 12.000 xg durante 5 minutos para obtener sobrenadantes límpidos. Estos se ensayaron por triplicado en cuanto a la actividad de la luciferasa con el equipo del sistema de ensayo de la luciferasa, utilizando un luminómetro LKB 1251 con emisión total de luz, registrándose durante 60 s. La concentración proteica en cada uno de los lisados se midió mediante el procedimiento de Bradford (1976), utilizando la solución de ensayo de proteínas de Bio-rad. La actividad de la luciferasa se expresó como unidades lumínicas relativas por mg de proteína (RLU, mg).

Resultados Incorporación del ADN plasmídico en los liposomas

El ADN plasmídico se incorporó a DVR neutras (710-843 nm de diámetro); Ejemplos 1.1. (1-6) compuestos de PC y DOPE, un fosfolípido bien conocido (Legendre y Szoka, 1995) para facilitar la transfección, y en liposomas similares suplementados con anfífilos cargados negativamente (590-871 nm; Ejemplos 1.2. (1-5) ó positivamente (647-899 nm; Ejemplos 1.3. (1-6), 1.4. (1-4) y 1.5 (1-2). Se sabe que las superficies bicapa cargadas de las vesículas (Bangham et al, 1974) contribuyen a espacios acuosos más grandes entre las bicapas y, por tanto, a un atrapamiento mayor de soluto. En el caso del ADN cargado negativamente, se esperaría una mejoría ulterior de la incorporación a los liposomas cargados positivamente (DRV catiónicas) como resultado de interacciones electrostáticas. La Tabla 1 muestra que la incorporación del ADN en las DRV neutras fue considerable (44-55%), y en las DRV cargadas negativamente, todavía más, (45-63%) para cada una de las cantidades utilizadas (10-100 \mug) (Ejemplos 1.1. (1-6) y 1.2.(1-5)). Además, se consideró improbable la posibilidad de que, más que incorporarse al interior de las vesículas, la mayoría del ADN fuera adsorbido sobre la superficie liposómica: la incubación de las DRV preformadas con el ADN desnudo dió lugar sólo a una modesta recuperación de éste en una baja proporción (12-13%) en la centrifugación con las DRV (Ejemplos 1.1.7 y 1.2 (6-7)). La microfluidicación (3 ciclos) de similares DRV que incorporaban ADN en presencia de ADN no incorporado (libre) dió lugar a vesículas más pequeñas (209-329 nm de diámetro) con un contenido en ADN que se redujo considerablemente (hasta 10-20%) en el caso de las DRV neutras y en un menor grado (hasta 37-51%) para los liposomas cargados negativamente (Ejemplos 1.1. (1-6) y 1.2. (1-5). Otra vez, se recuperó muy poco ADN (6 y 10%) con los liposomas cuando las DRV preformadas se microfluidicaron en presencia del ADN libre (Ejemplos 1.1.7 y 1.2.(6-7)).

Tal como se anticipó, la incorporación de ADN en el SA catiónico, en BisHOP y DOTMA DRV fue incluso mayor (62-92%), con valores que permanecieron altos (50-83%) para las DRV microfluidicadas (269-383 nm; Ejemplos 1.3. (1-6), 1.4. (1-4) y 1.5. (1-2)). Aquí, sin embargo, después de la incubación o microfluidicación de las DRV catiónicas (SA) con el ADN desnudo, tanto como un porcentaje del 40-60% del material utilizado se recuperó con los liposomas, presumiblemente como unido a la superficie de las vesículas (Ejemplos 1.3 (7-9)).

Incubación del ADN liposómico con desoxiribonucleasa

La Tabla 1 revela que la mayoría del ADN incorporado en liposomas neutros (45-72%), cargados negativamente (58-69%) o catiónicos (68-86%), no se degradó por la DNasa. Por el contrario, la recuperación del ADN adsorbido a la superficie de los liposomas neutros o cargados negativamente después de exposición al enzima, fue baja (18%). (Ejemplos 1.1.7. y 1.2.6). Con el ADN adsorbido a la superficie de los liposomas catiónicos (SA), sin embargo, una proporción considerable (41-58%) de los últimos no estuvo disponible para la degradación por la DNasa (Ejemplos 1.3.(7-8)). Esto puede atribuirse a un estado condensado del ADN que se sabe tiene lugar con las vesículas catiónicas y que es resistente a la DNasa (Legendre y Szoka, 1995). En vista de estos hallazgos, es difícil determinar con seguridad el grado de incorporación del ADN en el interior de los liposomas catiónicos (oponiéndose al ADN que se une a su superficie) al final del procedimiento de incorporación.

Los resultados de la vulnerabilidad del ADN liposómico a la DNasa se confirmaron ampliamente en experimentos en los que muestras de ADN liposómico o desnudo se expusieron a la RQ1 desoxiribonucleasa y se sometieron subsiguientemente a electroforesis en gel de agarosa. Basándose en la intensidad de la tinción y en la apariencia de manchas, pudo apreciarse que, mientras el ADN plasmídico desnudo se había digerido completamente, el ADN atrapado en el interior de los liposomas catiónicos estaba completamente protegido. El ADN en las DRV neutras y cargadas negativamente, por otra parte, estaba menos bien protegido, tal como se comprobó mediante la aparición de bandas más ligeras en las muestras digeridas por la DNasa, cuando éstas se compararon con las que no habían sido digeridas.

Transfección con el ADN plasmídico pGL2 liposómico

En experimentos en los que células COS-7 se transfectaron con ADN plasmídico pGL2 incorporado a liposomas con DRV no microfluidicadas o que formaban complejos con LipofectAMINA, estos últimos sirviendo como control, se observaron niveles significativos de actividad luciferásica respecto al ruido de fondo (de ésta) con cada una de las formulaciones de DRV. Sin embargo, los niveles de actividad con las DRV catiónicas (DOPE:DOTMA, PC:DOPE:DOTMA y PC:DOPE:SA) fueron 10 veces más altos aproximadamente que los alcanzados con los liposomas neutros (PC:DOPE) y los cargados negativamente (PC:DOPE:PS) y también con los catiónicos PC:DOPE:BisHOP (Tabla 2). Como el tamaño de los liposomas puede estar relacionado con la eficiencia de la transfección, se llevaron también a cabo experimentos relacionados con el ADN incorporado a las DRV que estaban microfluidicadas por 1, 2, 3, 5 ó 10 ciclos para producir vesículas de un tamaño progresivamente más pequeño (de diámetros con un z-promedio respectivamente de 386, 319, 262, 235 y 123 nm; no se muestra). La Tabla 2 indica que la microfluidicación (3 ciclos) de las DRV PC:DOPE:DOTMA mejoraron 10 veces su eficiencia de transfección. Sin embargo, los experimentos de transfección con los liposomas PC:DOPE:DOTMA, DOPE:DOTMA, PC:DOPE y PE:DOPE:PS sometidos a 5 ó 10 ciclos de microfluidicación no mostraron una actividad luciferásica significativa (los resultados no se muestran), lo que puede explicarse por la tinción progresiva del ADN inducida por la microfluidicación.

Parece que de todas las preparaciones DRV ensayadas, las DRV SA y DOTMA cargadas positivamente fueron más eficientes que las restantes, exhibiendo los valores más altos de transfección la preparación microfluidicada (DOTMA). Sin embargo, incluso esta preparación fue entre 10 y 15 veces menos eficiente que la LipofectAMINA control.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

3

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Actividad de la luciferasa en células transfectadas

4

Ejemplo 2 Respuesta inmune después de transfección in vivo

Utilizando los materiales tal como se describen y a partir de las fuentes del Ejemplo 1 (y además 3\beta[N-(N'N'-dimetilaminoetano)-carbamil] colesterol, DC-CHOL, obtenido del Dr. Kirby y DOTAP -1,2-dioleoiloxi-3-trimetilamonio propano), se llevaron a cabo experimentos para determinar la respuesta inmune después de la transfección in vivo. El polinucleótido es ADN plasmídico que expresa el antígeno superficial de la hepatitis (región S, plásmido pRc/CMV-HBS del tipo ayw (Davis HL et al)). Los liposomas se formaron en cada caso utilizando completamente 16 micromoles de PC (12 mg), utilizándose los lípidos catiónicos que se especifican en las tablas, en las proporciones que en éstas se determinan. El ADN plasmídico fue atrapado en los liposomas (en una cantidad que se especifica en la tabla) utilizando los procedimientos del ejemplo 1, o se obtuvieron complejos de liposomas catiónicos preformados y ADN, mezclando aquéllos componentes conjuntamente en suspensión acuosa (empleando técnicas comparables a las anteriores llevadas a cabo por Eppstein, que se mencionó anteriormente).

Los liposomas con ADN atrapado, los complejos y el ADN desnudo se administraron entonces a los ratones para los experimentos de transfección in vivo. A grupos de tres o cuatro individuos de ratones Balb/c, se les inyectó intramuscularmente (en las patas traseras) con las preparaciones en una cantidad tal que se les administrara los \mug de ADN que se especifican en las tablas. El ADN plasmídico fue atrapado en los liposomas (en la cantidad especificada en la tabla) utilizando los procedimientos del ejemplo 1, o los complejos o los liposomas catiónicos preformados y el ADN, mezclando aquéllos componentes conjuntamente en suspensión acuosa ((empleando técnicas comparables a las anteriores llevadas a cabo por Eppstein, que se mencionó anteriormente).

Los liposomas con ADN atrapado, los complejos y el ADN desnudo, se administraron entonces a los ratones para llevar a cabo experimentos de transfección in vivo. Ratones Balb/c, en grupos de tres o cuatro, fueron inyectados intramuscularmente (patas traseras) con las preparaciones en una cantidad de forma que se administrara el nivel de ADN especificado en la tabla 4. Para cada ensayo, la cantidad de lípido en la preparación liposómica que se administró a los ratones, fue aproximadamente constante, y representa un valor del orden de 1-2 mg lípidos PC totales.

Subsiguientemente se sangraron los animales y los sueros se ensayaron mediante técnicas ELISA para determinar la respuesta inmune. En estos experimentos in vivo, el ensayo ELISA es llevado a cabo como se describe por Davis et al (1987) utilizando el antígeno superficial de la hepatitis B (región S, del tipo ayw). Los ensayos se utilizaron para determinar anti-HBS Ag (región s, tipo ayw)-IgG_{1}, IgG_{2a} y IgG_{2b}. Las respuestas inmunes obtenidas se expresaron como log_{10} (media + ó-desviación estándar) de las diluciones séricas necesarias para dar lugar a una lectura de la absorbancia (en el ensayo ELISA de la peroxidasa de rábano) de 0,200 aproximadamente.

En los experimentos, cuyos resultados se dan a conocer en la tabla 4, se inyectó a los ratones en los días 0, 10, 20, 27 y 37, y se les sangró en los días 26, 34 y 44. En los resultados que se proporcionan en la tabla 5, se inyectó a los ratones en los días 0, 7, 14, 21 y 28, y se les sangró en los días 21 y 28.

Resultados y conclusiones TABLA 3 Atrapamiento del ADN plasmídico (en los liposomas)

5

6

TABLA 5 Respuesta inmune (resultados de ELISA \pm SD) de ratones inmunizados con ADN desnudo, formando complejo y atrapado

7

En las tablas, las columnas P muestran el resultado del ensayo t de student, indicando el nivel de confianza que los resultados, tal como se especifican, son distintos unos a otros.

La tabla 3 muestra que el porcentaje de atrapamiento es muy alto para las composiciones lipídicas que contienen lípidos catiónicos. La proporción de formación de complejos del ADN plasmídico con los lípidos preformados, es también muy alta. En cada caso, el porcentaje de la proporción de atrapamiento/formación de complejos está poco afectado por la utilización de 100 \mug ó 150 \mug de ADN.

La tabla 4 y la Figura 1 muestran que la respuesta inmune después de la inmunización de los ratones con ADN atrapado que codifica el antígeno superficial de la hepatitis B, es mucho más alta que la inmunización con ADN desnudo. Aunque este efecto se muestra ya patente después de 26 días del inicio del experimento, todavía se convierte en más pronunciado cuando el experimento continúa. El efecto es particularmente pronunciado para IgG_{1}, aunque tanto los niveles de IgG_{2a} como los de IgG_{2b} se encuentran también en cantidades crecientes cuando se comparan con la transmisión del ADN desnudo, después de todos los sangrados.

Los resultados en la tabla 5 muestran que para el ADN desnudo, no se aprecia respuesta incluso al cabo de 28 días después de la primera administración del ADN.

Para el ADN atrapado en el interior de los liposomas neutros (PC, DOPE), no existe aumento en la respuesta inmune a los 21 días, aunque existe un ligero aumento en la respuesta para la cantidad más alta de ADN inyectado después de 28 días, y ésta es significativamente más alta que la respuesta obtenida después de administración del ADN desnudo.

Para el complejo de los liposomas catiónicos preformados y ADN, la respuesta inmune no parece desarrollarse después de 28 días a partir del comienzo del experimento para ambos niveles de administración del ADN, y es significativamente más alta que la respuesta obtenida después de la administración del ADN desnudo. Sin embargo, las respuestas inmunes no son tan altas como las obtenidas para el ADN atrapado en el interior de los liposomas catiónicos.

Para los liposomas catiónicos con ADN atrapado después de 21 días, la respuesta inmune ya es significativamente más alta que todas las de los otros ejemplos, cuando la cantidad del ADN inyectado es de 10 \mug; aunque no existe una diferencia significativa entre la respuesta después de administración de 1 \mug de ADN atrapado en los liposomas catiónicos y cualquiera de los otros ejemplos en los que se administró 1 \mug de ADN. Después de 28 días, con el nivel más bajo de ADN administrado (1 \mug), existe una respuesta significativamente aumentada cuando se compara con las cantidades altas o bajas del ADN desnudo. Sin embargo, no existe una diferencia significativa respecto a la respuesta que sigue a la administración de los niveles más bajos del ADN que forma complejo con los liposomas catiónicos, o que está atrapado en los liposomas neutros. Para el nivel más alto del ADN administrado (10 \mug) atrapado en los liposomas catiónicos, la respuesta inmune es, después de 28 días, significativamente más alta que la totalidad de los otros ensayos.

Ejemplo 3 Niveles de citoquinas en los bazos de ratones inmunizados con ADN plasmídico desnudo, atrapado en liposomas o acomplejado

Se inyectaron intramuscularmente ratones Balb/c em grupos de cuatro (el mismo protocolo y experimento que en el ejemplo 2) en los días 0, 7, 14, 21 y 28 con 1 (franjas en blanco) ó 10 \mug (franjas negras) de pRc/CMV HBS atrapado en liposomas cargados positivamente compuestos de PC, DOPE y DOTAP (A), liposomas no cargados compuestos de PC y DOPE (B), formando complejos con similares liposomas preformados catiónicos DOTAP (C) o en forma desnuda (D). "Control" representa los niveles de citoquinas en los ratones normales inmunizados. Tres semanas después de la inyección final, se sacrificaron los animales y sus bazos se sometieron a análisis de citoquinas. En los bazos, se determinaron los niveles endógenos de IFN-\gamma e IL-4 mediante el procedimiento de Nakane et al, previamente modificado por de Souza et al. Los bazos individuales se pesaron, se homogenizaron en medio RPMI enfriado en hielo que contenía 3-[(colamidopropil) dimetilamonio]-1-propanosulfonato al 1% (CHAPS; Sigma) en un homogenizador hístico Dounce y se preparó un 10% de homogenados (peso/vol). Los homogenados se dejaron en hielo durante 1 hora y los residuos se eliminaron entonces mediante centrifugación a 2000 Xg durante 20 minutos. Los sobrenadantes lípidos se conservaron a -70ºC.

Ensayos de las citoquinas

Se utilizaron ELISAs estándar de captura con pares de anticuerpos monoclonales y placas Maxisorp (NUNC, Reino Unido). Se utilizaron anticuerpos monoclonales primarios contra IFN-\gamma (R46A2) e IL-4 (11B11) y anticuerpos monoclonales secundarios biotinilados anti-IL-4 de ratón (BVD6-24G2) y anti- IFN-\gamma de ratón (XMG1.2) (Pharmingen, Estados Unidos) con estreptavidina peroxidasa (Dako, Dinamarca) y o-fenilendiamina (Sigma) como sustrato. Los estándares Il-4 e IFN-\gamma recombinantes eran de Pharmingen. Los resultados (media \pm SE) se expresan como ng/bazo de 4 ratones por lo menos. Los resultados se muestran en la Figura 2 en los que cada franja representa la media \pm SE de un grupo de 4 ratones (representando a-d los liposomas tal como se especificaron anteriormente).

Los datos (Fig. 2) muestran que la activación para ambos subconjuntos Th1 y Th2 fue mayor con el ADN atrapado por el liposoma cuando se comparó con el ADN desnudo o formando complejo. Este hallazgo se confirmó también en los ensayos preliminares de la proliferación de las células T contra el antígeno HBsAg in vitro. Aparece por tanto que la inmunización con el ADN plasmídico atrapado en el liposoma induce tanto inmunidad celular como humoral.

Ejemplo 4 Respuestas inmunes en ratones después de una inyección única del ADN plasmídico

La mayoría de los informes respecto a la vacunación con ADN desnudo utilizaron protocolos de inyecciones múltiples, pero una dosis única produce también una respuesta humoral al antígeno codificado (Davis et al Human Gene Therapy, 1993, y Raz et al PNAs, 1994). Por ejemplo, la respuesta IgG total para el pRc/CMV HBS desnudo (idéntica al plásmido utilizado en la presente memoria) se detectó 1-2 semanas después de la inyección, para alcanzar valores máximos a las 4-8 semanas (Davis et al, 1996).

Los ratones Balb/c en grupos de cuatro fueron inyectados una vez intramuscularmente con 2 \mug (franjas en blanco, véase la figura 3) ó 10 \mug (franjas negras) de pRc/CMV HBS atrapado en liposomas cargados positivamente compuestos de PC, DOPE y DOTAP (A), liposomas no cargados compuestos de PC y DOPE (B), formando complejo con liposomas preformados DOTAP similares (C) o en forma desnuda (D). Las repuestas anti-HBsAg IgG_{1} se analizaron (ELISA) en sueros obtenidos en distintos tiempos después de la inyección. Las respuestas inmunes aumentaron en todos los ratones inyectados con ADN liposómico, pero sólo se hicieron mensurables a los 20-27 días. Los detalles restantes fueron como en el ejemplo 2. Las diferencias en los valores log_{10} (ambas dosis; todos los intervalos de tiempo) entre los ratones inmunizados con ADN liposómico catiónico y ratones inmunizados con ADN desnudo, fueron estadísticamente significativas (P < 0,0001-0,002). En un quinto grupo de cuatro ratones inmunizados una vez como anteriormente con 10 \mug de pRc/CMV HBS atrapado en liposomas aniónicos compuestos de PC, DOPE y PS, (realizada la inmunización mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 1), las respuestas IgG_{1} (log_{10}) fueron de 2,25 \pm 0,0 y 2,73 \pm 0,0 en los días 21 y 29, respectivamente.

Bajo estas condiciones de inmunización única (Fig. 3) con dosis mucho más bajas de pRc/CMV HBS (2 y 10 \mug), la respuesta anti-HBsAg IgG_{1} para el ADN desnudo y acomplejado fue escasamente detectable, incluso a las siete semanas. Al contrario, se dió una temprana y marcada respuesta IgG_{1} para el ADN atrapado en los liposomas catiónicos y una respuesta retrasada pero significativa para el ADN atrapado en liposomas neutros o cargados negativamente (Fig. 3).

Ejemplo 5 Respuesta celular y humoral de ratones engendrados endogánicamente o mediante cruzamiento a los que se inyectó con el antígeno Hep B en liposomas catiónicos

Grupos de ratones (4-5 animales por grupo) se inyectaron (i.m, i.p., i.v. ó s.c.) dos veces (en los días 0 y 7) con 10 \mug de pRc/CMV HBS (que codifica la región S del antígeno superficial de la hepatitis B; subtipo ayw) atrapado en los liposomas de DRV catiónicas compuestas de fosfatidilcolina de huevo (PC), dioleoil fosfatidilcolina (DOPE) y de 1,2-dioleoil-3-(trimetilamonio) propano (DOTAP) (proporciones molares 1:5,5: 0,25). (producidas utilizando las técnicas generales y los materiales descritos anteriormente en el ejemplo 1), ó con 10 \mug de pRc/CMV HBS desnudo (ambos en PBS). Los animales se sangraron a distintos intervalos de tiempo e IgG_{1}, IgG_{2a} e IgG_{2b} se midieron en el plasma mediante ELISA. Al final del experimento (38 días después de la primera inyección) se sacrificaron los animales y se midieron las citoquinas IFN\gamma e IL-4 en el bazo, tal como se describe (para detalles experimentales adicionales, véase Gregoriadis et al, 1997). Las citoquinas se midieron también en el bazo de los ratones de control (intactos).

\vskip1.000000\baselineskip

Resultados

Los resultados muestran que las respuestas inmunes (media \pm desviación estándar) para ambas cepas resultaron medibles sólo después de 21 (IgG_{1}; Fig. 4) ó de 28 días (IgG_{2a} e IgG_{2b}; Figs. 5 y 6, respectivamente) después de la primera inyección. Las respuestas para el ADN liposómico (franjas negras) fueron de modo general significativamente mayores que las obtenidas para el ADN desnudo (franjas punteadas) (ambas cepas y todas las vías, especialmente im, sc e iv). Los niveles significativos (P< 0,05) aumentan del orden de + *, **, ***.

El análisis de las citoquinas IFN\gamma (respuesta Th1) (Fig. 7) e de la interleucina 4 (IL-4) (respuesta Th2) (Fig. 8) reveló niveles significativamente mayores para el ADN liposómico por las vías im y sc en ambas cepas para la (vía iv en ratones T/o). No hubo diferencia en los valores entre el ADN liposómico y el desnudo para la vía ip (ambas cepas).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Valor del atrapamiento para seis distintos ADNs plasmídicos

ADN plasmídico marcado radioactivamente con ^{35}S (10-500 \mug) se incorporó a, ó se mezcló, con vesículas neutras, aniónicas o catiónicas de deshidratación-rehidratación (DRV), utilizando la técnica descrita en el ejemplo 1. Los ADNs plasmídicos utilizados fueron los siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

pGL2 -codifica luciferasa, como para el ejemplo 1.

pRc/CMV HBS-región (S) del antígeno superficial de la hepatitis B, como en el ejemplo 2.

pRSVGH-codifica la hormona humana del crecimiento, una proteína terapéutica.

pCMV4.65-proteína de la micobacteria de la lepra, un antígeno.

pCMV4. EGFP -"proteínas verdes fluorescentes".

VR1020-proteína esquistosómica, un antígeno.

\vskip1.000000\baselineskip

Los lípidos utilizados incluyeron lípidos neutros PC y DOPE descritos anteriormente en el ejemplo 1, lípidos aniónicos, PS, fosfatidil serina, descritos en el ejemplo 1 o el fosfatidil glicerol (PG) y los compuestos catiónicos estearilamina (SA), BisHOP y DOTMA, todos descritos en el ejemplo 1, DC-Chol y DOTAP, tal como se emplearon en el ejemplo 2 y, además, 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio propano DODAP.

La tabla siguiente indica si el ADN plasmídico se incorporó (se encapsuló en (a) o se mezcló meramente (b) con la DRV). La tabla indica además los componentes lipídicos y los valores de incorporación para el ADN. Los ensayos previos habían mostrado que los valores de incorporación utilizando distintas cantidades de ADN para cada una de las formulaciones DRV no diferían significativamente. Los resultados, por tanto, se agruparon, y los valores que se muestran en la tabla, representan valores promedio de los obtenidos a partir de 3 a 5 experimentos.

TABLA 6

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

Los resultados muestran que, mediante la encapsulación del ADN, pueden alcanzarse valores mucho más altos de incorporación allí donde el lípido está cargado negativamente. Allí donde se utiliza el lípido catiónico, los valores de incorporación no parecen diferir significativamente entre la encapsulación y la mezcla física, aunque parece que la encapsulación da lugar a valores más altos allí donde el componente catiónico es un compuesto no lipídico (estearilamina).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 La composición lipídica efectiva de los liposomas catiónicos sobre la respuesta inmune al antígeno HBsAg codificado por el pRc/CMV HBS atrapado

Utilizando las técnicas generales descritas anteriormente, el ADN plasmídico fue atrapado en varios liposomas catiónicos. Los lípidos utilizados y las proporciones molares se muestran a continuación en la tabla 7. Los lípidos fueron los utilizados en los ejemplos anteriores, empleándose además PE fosfatidil etanolamina con lípido de huevos, y DSPC, di-estearoilfosfatidilcolina, un lípido saturado. Se inyectaron ratones Balb/c intramuscularmente en grupos de 5 con 10 \mug de plásmido libre o atrapado en el liposoma, en el día cero, a las dos semanas y a las cinco semanas. Se sangró a los animales a las 8, 10 y 13 semanas y se ensayaron los sueros mediante ELISA respecto a anticuerpos anti-HBsAg (región S) IgG_{1}. La técnica empleada es como la descrita generalmente en el ejemplo 5. Los resultados se muestran en la siguiente tabla 7.

TABLA 7

9

\vskip1.000000\baselineskip

El análisis estadístico de los resultados (ensayo T no apareado) reveló diferencias significativas entre (a) todas las formulaciones del ADN liposómico y el ADN libre (P< 0,0001-0,0441; todos los intervalos de tiempo), PC:DOPE:DOTAP y PC:DOTAP (P< 0,0036-0,0357, todos los intervalos de tiempo), PC:PE:DOTAP y PC:DOTAP (P< 0,0095-0,0385; 10 y 13 semanas), PC:DOPE:DOTAP y DSPC:DOPE:DOTAP (P< 0,0001-0,0138; 8 y 13 semanas) y PC:DOPE:DOTAP y PC:CHOL:DOTAP (P< 0,0158; 13 semanas).

Los resultados sugieren que en términos de eficacia liposómica para promover las respuestas inmunitarias, (a) DOPE puede reemplazarse por PE sin perder la eficacia liposómica (DOPE y PE son ambos lípidos no saturados), (b) la fosfatidiletanolamina (PE ó DOPE) hace que los liposomas sean más eficientes que los que no presentan este tipo de lípido, (c) reemplazamiento de PC con el DSPC saturado reduce la eficacia liposómica, (d) los liposomas con colesterol pero sin fosfatidiletanolamina son casi tan efectivos como los liposomas con fosfatidiletanolamina pero sólo a las 8 y 10 semanas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Atrapamiento de pRc/CMV HBS en liposomas no fosfolípidos

En este ejemplo se utilizaron varios componentes que forman liposomas distintos que los fosfolípidos para atrapar el antígeno de la hepatitis utilizado en los ejemplos anteriores. Los componentes que forman liposomas incluyeron un glicérido, MonoPal; 1-Monopalmitoil-rac-glicerol, y surfactantes aniónicos, Span 60 (- monoestearato de sorbitano) y Solulan 24, (un complejo etoxilado de 24 moles de alcoholes lanolínicos y alcoholes grasos relacionados). (Span 60 y Solulan 24 constituyen marcas comerciales). Las proporciones molares de los componentes que forman liposomas se muestran en la tabla. Los otros componentes son tal como se utilizan en los ejemplos anteriores.

Los resultados muestran que pueden alcanzarse tasas adecuadas de atrapamiento utilizando componentes formadores de liposomas que no incluyan fosfolípidos. Los surfactantes no iónicos, en combinación, opcionalmente, con otros componentes lipídicos no fosfolípidos tales como el colesterol, pueden proporcionar tasas adecuadas de atrapamiento. Se apreció que los liposomas formados en los ejemplos 8.4, 8.5, 8.6 y 8.8, precipitaron estando en posición vertical, y por tanto, no fueron optimizados en términos de composición.

Las tasas de atrapamiento se muestran en la tabla 8 siguiente.

TABLA 8

10

Referencias

Alton, E.W.F.W., Middleton, P.G., Caplen, N.J., Smith, S.N., Steel, D.M., Munkonge, F.M., Jeffery, P.K., Geddes, D.M., Hart, S.L., Williamson, R., Fasold, K.I., Miller, A.D., Dickinson, P., Stevenson, B.J., McLachlan, G., Dorin, J.R. y Porteous, D.J. (1993) Non-invasive liposome-mediated gene delivery can correct the ion transport defect in cystic fibrosis mutant mice Nat. Genet. 5, 135-142.

Bangham, A.D., Hill, M.W. y Miller, N.G.A. (1974) Preparation and use of liposomes as models of biological membranes In: Korn, E.D. (ed.), Methods in Membrane Biology (New York, Plenum) pp. 1-68.

Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.

Davis, D., Davies, A. y Gregoriadis, G. (1987) Immunology Letters, 14, 341-348.

Davis, H.L., Michel, M.L. y Whalen, R.G. (1993) "DNA-based immunisation ..."Human Molecular Genetics 2, 1847-1851.

Davis, H.L., Demeneix, B.A., Quantin, B., Coulombe, J. y Whalen, R.G., Human Gene Therapy, 4, 733-740 (1993).

Davis, H.L., in Targeting of Drugs: Stategies for oligonucleotide and Gene Delivery in Therapy, (eds Gregoriadis, G. y McCormack, B.) pp 21-29, (Plenum Press, NY, 1996).

Felgner, P.L. (1991) Gene Therapeutics, Nature 349, 351-352.

Gregoriadis, G. (1993) (ed.) Liposome Technology, 2ª edición, Vols. 1-13, CRC Press Inc., Boca Raton.

Gregoriadis, G. (1995) Engineering Liposomes: Progress and Problems. Trends in Biotechnology (1995).

Gregoriadis, G., da Silva, H. y Florence, A.T. (1990) A procedure for the efficient entrapment of drugs in dehydration-rehydration liposomes (DRV). Int. J. Pharm. 65, 235-242.

Gregoriadis, G., Garçon, N., da Silva, H. y Sternberg, B. (1993) Coupling of ligands to liposomes independently of solute entrapment: Observations on the formed vesicles. Biochim. Biophys. Acta 1147, 185-193.

Gregoriadis, G., Saffie, R., y Hart S.L. (1996) J. Drug Targetting 3, 467-475.

Gregoriadis, G., Saffie, S. y De Souza, J.B. (1997) Liposome-mediated DNA vaccination. FEBS Lett. 402, 107-110.

Kay, M.A., Landen, C.N., Rothenberg, S.R., Taylor, 4 L.A., Leland, F., Wiehle, S., Fang, B., Bellinger, D., Finegold, M., Thompson, A.R., Read, M., Brinkhous, K.M. y Woo, S.L.C. (1994) In vivo hepatic gene therapy: Complete albeit transient correction of factor IX deficiency in haemophilia B dogs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2353-2357.

Kirby, C. y Gregoriadis, G. (1984) Dehydration-rehydration vesicles (DRV): A new method for high yield drug entrapment in liposomes. Biotechnology 2, 979-984.

Legendre, Y.-Y. y Szoka Jr., F.C. (1995) Liposomes for gene therapy, In: Liposomes, New Systems and New Trends in their Applications (Puissieu, F., Couvreur, P., Delattre, J. y Devissaugnet, J.P. eds.) (Paris, Editions de Santé), pp. 669-692.

Mulligan, R.C. (1993) The basic science of gene therapy. Science 260, 926-932.

Nakane, A., Numata, A. y Minagawa, T., Infect. Immun., 60, 523-528 (1992).

Raz, E., Carson, D., Rhodes, H.G., Abal, M.A., Tsai, J.Y., Wheeler, J.C., Morrow, J., Felgner, P.L. y Baird, M.S. (1994) In: Vaccines, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

Raz, E. et al, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523 (1994).

Scherphof, G., van Leeuwen, G., Wilschut, J.C. y Damen, J. (1983) Exchange of phosphatidylcholine between small unilamellar liposomes and human plasma high-density lipo-protein involves exclusively the phospholipid in the outer monolayer of the liposomal membrane. Biochim. Biophys. Acta 732, 595-599.

de Souza, J.B., Ling, I.T., Ogun, S.A., Holder, A.A. y Playfair, J.H.L. Infect. Immun., 64, 3532-3536 (1996).

Tan, L. y Gregoriadis, G. (1989) The effect of positive surface charge of liposomes on their clearance from blood and its relation to vesicle lipid composition. Biochem. Soc. Trans. 17, 690-691.

Wheeler, V.C. y Coutelle, C. (1995) Non-degradative in vitro labelling of plasmid DNA. Anal. Biochem. 225, 374-376.

Zhu, N., Liggit, D., Liu, Y. y Debs, R. (1993) Systemic gene expression after intravenous DNA delivery into adult mice. Science, 261, 209-211.

Claims (18)

1. Vacuna génica que comprende liposomas que presentan un diámetro medio comprendido en el intervalo de 100 a 1.000 nm formados a partir de componentes formadores de liposomas que comprenden por lo menos un compuesto lipídico cargado catiónicamente, en una cantidad tal que los componentes formadores de liposomas presentan una carga catiónica global y en el intervalo de 10 a 25% en moles sobre la base de los moles totales de los componentes formadores de liposomas y una fosfatidiletanolamina y, atrapado en el interior del espacio intravesicular de los liposomas, un polinucleótido que codifica operativamente un polipéptido inmunogénico útil para inducir una respuesta inmune deseada en un sujeto animal o humano en la que la cantidad de polinucleótido está comprendida en el intervalo de 0,2 a 0,5 \mug por mol de los componentes formadores de liposomas.

2. Vacuna génica según la reivindicación 1, en la que el polinucleótido es ADN bicatenario.

3. Vacuna génica según la reivindicación 2, en la que el polinucleótido está en forma de un plásmido que incluye un promotor y, opcionalmente, secuencias de unión ribosómica.

4. Vacuna génica según la reivindicación 1, en la que el polinucleótido es ARN, preferentemente ARNm.

5. Vacuna génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido inmunogénico comprende un antígeno o fragmento de un antígeno de un microbio infeccioso.

6. Vacuna génica según la reivindicación 1, en la que el compuesto lipídico catiónico es un glicérido de fórmula general

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

o un isómero óptico del mismo, en el que Y^{1} e Y^{2} son iguales o diferentes, siendo cada uno -O-u O-C(O)-, en el que el carbono carbonilo se une a R^{1} ó R^{2} según el caso; R^{1} y R^{2} son independientemente un grupo alquilo, alquenilo, o alquinilo de 6 a 24 átomos de carbono, R^{3}, R^{4} y R^{5} son independientemente hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, ó grupos arilo o aralquilo de 6 a 11 átomos de carbono; alternativamente, dos o tres R^{3}, R^{4} y R^{5} se combinan con el átomo de nitrógeno cargado positivamente para formar una estructura cíclica con 5 a 8 átomos, en la que, además del átomo de nitrógeno cargado positivamente, los átomos en la estructura son átomos de carbono y pueden incluir un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre; n es 1 a 8; y X es un anión.

7. Vacuna génica según la reivindicación 6, en la que R^{1} y R^{2} tienen individualmente de 0 a 6 sitios de insaturación, y poseen la estructura

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

en la que la suma de a y c es de 1 a 23; y b es 0 a 6.

8. Vacuna génica según la reivindicación 1, en la que el componente catiónico es seleccionado de entre DOTAP, BisHOP, y DC-Chol.

9. Vacuna génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el diámetro medio de los liposomas está comprendido en el intervalo de 200 a 500 nm.

10. Utilización de liposomas según se definen en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la preparación de una composición de utilización en un procedimiento para tratar a un humano o animal, en la que es inducida una respuesta inmune a dicho polipéptido inmunogénico.

11. Utilización según la reivindicación 10, en la que el procedimiento es la vacunación para inmunizar contra microbios infecciosos o una célula cancerosa.

12. Utilización según la reivindicación 10 ó 11, en la que la composición se administra intramuscularmente.

13. Procedimiento de transfección de células que se eliminaron de un individuo humano o animal, en el cual las células se ponen en contacto con una composición liposómica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y las células se cultivan, por el que tienen lugar la transfección de las células y la expresión del polinucleótido y la síntesis del producto polipeptídico del polinucleótido.

14. Procedimiento para el atrapamiento del polinucleótido en los liposomas, que comprende las etapas siguientes:

a)

formar una suspensión acuosa que comprende el polinucleótido desnudo, que codifica operativamente un polipéptido inmunogénico que es útil para la inducción de una respuesta inmune deseada en un individuo humano o animal, y liposomas catiónicos preformados formados a partir de componentes formadores de liposomas que comprenden por lo menos un compuesto lipídico cargado catiónicamente, en una cantidad tal que los componentes formadores de liposomas presentan una carga catiónica global y en el intervalo de 10 a 25% en moles sobre la base de los moles totales de los componentes formadores de liposomas y una fosfatidiletanolamina,

b)

deshidratar la suspensión, y

c)

rehidratar el producto de la etapa b) para formar una suspensión de liposomas que presentan un diámetro medio comprendido en el intervalo de 100 a 1.000 nm.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, que comprende la etapa siguiente:

d)

someter la suspensión acuosa de las vesículas de deshidratación rehidratación de la etapa c) a microfluidización; y

e)

separar opcionalmente el polinucléotido no atrapado de los liposomas.

16. Procedimiento según la reivindicación 14 ó 15, en el que la tasa de atrapamiento del polinucleótido en las etapas a) - d) está comprendida en el intervalo de 10 a 90%, preferentemente en el intervalo de 20 a 85% del polinucleótido en suspensión en la etapa a).

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que, en el producto final, el nivel del polinucleótido está en el intervalo de 0,2 a 0,5 \mug por \mu moles de los componentes formadores del liposoma.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que los liposomas vacíos en la etapa a) son vesículas unilamelares pequeñas.