ES2307544T3 - Metodo de produccion de precursores de insulina y analogos de precursores de insulina. - Google Patents
Metodo de produccion de precursores de insulina y analogos de precursores de insulina. Download PDFInfo
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Abstract
Precursor de insulina o análogo de precursor de insulina que comprende la fórmula: B(1 - 27) - X2 - X3 - X1Y - A(1 - 21) X1 es una secuencia peptídica de 1-15 residuos de aminoácidos uno de los cuales es un residuo de aminoácido aromático inmediatamente N-terminal a Y, X 2 es Pro, Asp, Lys, o Ile en la posición 28 de la cadena B de insulina humana, X3 es Pro, Lys, Ala, Arg o Pro-Thr en la posición 29 de la cadena B de insulina humana, Y es Lys o Arg, A(1-21) es la cadena A de insulina natural, y B(1-27) es la cadena B de insulina natural carente de residuos aminoácidos B28, B29 y B30.
Description
Método de producción de precursores de insulina
y análogos de precursores de insulina.
Los organismos de levadura producen varias
proteínas que tienen una función fuera de la célula. Las proteínas
de este tipo son denominadas proteínas segregadas. Estas proteínas
segregadas se expresan inicialmente dentro de la célula en un
precursor o una preforma que contiene una secuencia de prepéptido
que asegura una dirección eficaz (translocación) del producto
expresado a través de la membrana del retículo endoplásmico (RE). El
prepéptido, normalmente denominado péptido señal, generalmente se
separa del producto deseado durante la translocación. Una vez
introducida en la vía secretora, la proteína es transportada al
aparato de Golgi. Del aparato de Golgi, la proteína puede seguir
vías diferentes que pueden llevar a compartimientos tales como la
vacuola celular o la membrana celular, o puede ser dirigida fuera
de la célula para ser segregada al medio externo (Pfeffer et
al. (1987) Ann. Rev. Biochem. 56:829-852).
La insulina es una hormona polipéptida segregada
por las células \beta del páncreas y consiste en dos cadenas
polipeptídicas, A y B, que son enlazadas por dos puentes disulfuro
intercadena. Además, la cadena A presenta un puente disulfuro
intracatenario.
La hormona es sintetizada como una proinsulina
(preproinsulina) precursora monocatenaria que consiste en un
prepéptido de 24 aminoácidos seguido de proinsulina que contiene 86
aminoácidos en la configuración:
prepéptido-B-Arg
Arg-C-Lys Arg-A,
donde C es un péptido de conexión de 31 aminoácidos.
Arg-Arg y Lys-Arg son sitios de
división para la división del péptido de conexión de las cadenas A
y B.
Se han utilizado tres métodos principales para
la producción de insulina humana en microorganismos. Dos implican
Escherichia coli, con la expresión de una proteína de fusión
grande en el citoplasma (Frank et al. (1981) en Peptides:
Proceedings of the 7th American Peptide Chemistry Symposium (Rich
& Gross, eds.), Pierce Chemical Co., Rockford, IL. pp
729-739), o usan un péptido señal para permitir la
secreción en el espacio periplásmico (Chan et al. (1981)
PNAS 78:5401-5404). Un tercer método utiliza
Saccharomyces cerevisiae para segregar un precursor de
insulina en el medio (Thim et al. (1986) PNAS
83:6766-6770). La técnica anterior expone un número
limitado de precursores de insulina que se expresan en E.
coli o Saccharomyces cerevisiae, véase US 5,962,267, WO
95/16708, EP 0055945, EP 0163529, EP 0347845 y EP 0741188. US
5,962,267 expone un método para preparar insulina humana expresando
un derivado de proinsulina humana con la fórmula cadena
B-Z-cadena A donde Z puede
comprender un residuo de aminoácido aromático. La proinsulina puede
ser convertida en insulina por hidrólisis enzimática.
Seung-Gu Chang et al, Biochem J. (1998) 329,
631-635 expone actividad de unión al receptor de
una de las moléculas de proinsulina descritas en US 5,962,267 con
la secuencia cadena
B-RRYPGDVKR-cadena A.
El Dicroísmo Circular (DC) se utiliza para
determinar la estabilidad proteica y estabilidades relativas de las
moléculas. El DC observado por debajo de 240 nm se debe al
cromóforo de amida peptídico y puede ser usado para estimar la
estructura secundaria de la proteína (Johnson (1988) Ann. Rev.
Biophys. Chem. 17:145-166). El espectro de la
insulina está caracterizado por mínimos en 220 y 209 nm, un cruce
negativo a positivo cerca de 203 nm, y un máximo en 195 nm. Después
de la desnaturalización, el DC negativo en la gama
240-218-nm disminuye gradualmente,
en consistencia con la pérdida de estructura secundaria ordenada
que acompaña al desplegamiento de la proteína. Consecuentemente, la
estabilidad de plegamiento de un precursor de insulina puede ser
cuantificado midiendo la pérdida de estructura secundaria como
función de desnaturalizante añadido, p. ej., hidrocloruro de
guanidinio (GuHCl) (véase p. ej., Pace (1975) CRC Crit. Rev.
Biochem. 3:1-43).
La presente invención presenta nuevos péptidos
de conexión (péptidos C) que confieren un rendimiento aumentado de
la producción y/o estabilidad aumentada en moléculas de precursores
de insulina y moléculas análogas de precursores de insulina cuando
se expresan en un microorganismo transformado, en particular la
levadura. Tales precursores de insulina o análogos de precursores
de insulina pueden después ser convertidos en insulina o un análogo
de insulina por una o más fases de conversión adecuadas bien
conocidas.
La presente invención se refiere a un precursor
de insulina o análogo de precursor de insulina que comprende la
fórmula:
B(1-27) -
X_{2} - X_{3} - X_{1} \ Y -
A(1-21)
donde
- \quad
- X_{1} es una secuencia peptídica de 1-15 residuos de aminoácidos de los cuales uno es un residuo de aminoácido aromático inmediatamente N-terminal a Y,
X_{2} es Pro, Asp, Lys, o Ile en la posición
28 de la cadena B de insulina humana,
X_{3} es Pro, Lys, Ala, Arg o
Pro-Thr en la posición 29 de la cadena B de insulina
humana,
Y es Lys o Arg,
A(1-21) es la cadena A de
insulina natural, y
B(1-27) es la cadena B de
insulina natural carente de residuos aminoácidos B28, B29 y
B30.
Los péptidos de conexión de la presente
invención contienen al menos un residuo de aminoácido aromático
Phe, Trp, o Tyr y son más cortos que el péptido C humano natural
que, incluidos los puntos de división dibásicos flanqueantes,
consiste en 35 aminoácidos. Así los nuevos péptidos de conexión en
general no contarán con más de 15 residuos de aminoácidos de
longitud y preferiblemente no más de 9 residuos de aminoácidos.
Normalmente los nuevos péptidos de conexión contarán con 7 o 5
residuos de aminoácidos como máximo y preferiblemente no más de 4
residuos de aminoácidos.
Como en la molécula de insulina humana natural,
el péptido de conexión contiene un sitio de división en sus
terminales C y N que permite la división in vitro del
péptido de conexión de las cadenas A y B. Esos sitios de división
pueden ser cualquier sitio de división conveniente conocido en la
técnica, p. ej. un Met divisible por bromuro cianógeno; un residuo
de aminoácido único básico o un par de residuos de aminoácidos
básicos (Lys o Arg) divisible por tripsina o proteasas tipo
tripsina; proteasa Acromobactor lyticus o por una proteasa
carboxipeptidasa. El sitio de división que permite la división del
péptido de conexión de la cadena A será un residuo de aminoácido
básico único Lys o Arg, preferiblemente Lys.
De forma alternativa, la división del péptido de
conexión de la cadena B puede estar habilitado por división en el
residuo de aminoácido Lys^{B29} natural en la cadena B dando
lugar a un precursor de insulina desB30 o análogo de precursor de
insulina desB30. El residuo de aminoácido B30 deseado luego puede
ser añadido por procedimientos enzimáticos in vitro
conocidos.
En una forma de realización el péptido de
conexión no contendrá dos residuos de aminoácidos básicos contiguos
(Lys,Arg). En esta forma de realización, la división de la cadena A
puede ser realizada en un único Lys o Arg localizado en el extremo
N-terminal de la cadena A y el Lys natural en la
posición B29 en la cadena B.
El péptido de conexión puede comprender más de
un residuo de aminoácido aromático pero preferiblemente no más de
5. Los residuos de aminoácidos aromáticos pueden ser iguales o
diferentes. El péptido de conexión preferiblemente no comprenderá
más de 3 residuos de aminoácidos aromáticos y más preferiblemente
sólo comprenderá un único residuo de aminoácido aromático.
En una forma de realización de la presente
invención uno de los residuos de aminoácidos aromáticos en el
péptido de conexión es inmediatamente N-terminal al
sitio de división contiguo a la cadena A. Además, uno de los
residuos de aminoácidos aromáticos preferiblemente estará situado a
menos de 5 \ring{A} de distancia de al menos uno de los residuos
en las posiciones B11, B12 o B26 en la cadena B. En una forma de
realización, el aminoácido aromático inmediatamente
N-terminal al sitio de división contiguo a la cadena
A está a menos de 5 \ring{A} de distancia de al menos uno de los
residuos en las posiciones B11, B12 o B26 en la cadena B.
Los precursores de insulina o análogos de
precursores de insulina son caracterizados por el hecho de que
tienen una alta estabilidad de plegamiento en solución. Los
precursores según la presente invención tendrán una estabilidad de
Cmid aumentada en comparación con la insulina o los análogos de
insulina, que no comprenden un residuo de aminoácido aromático en
el péptido de conexión. La estabilidad de Cmid es así superior a 5,5
M GuHCl aproximadamente, normalmente superior a 6,0 M GuHCl
aproximadamente y más normalmente superior a 6,5 M GuHCl
aproximadamente.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a precursores de insulina o análogos de precursores de
insulina que comprenden un péptido de conexión (péptido C)
divisible de las cadenas A y B y que consiste en 9 residuos de
aminoácidos como máximo de los cuales al menos uno es un residuo de
aminoácido aromático.
En otro aspecto la presente invención se refiere
a un precursor de insulina o un análogo de precursor de insulina
que comprende un péptido de conexión (péptido C) divisible de las
cadenas A y B, donde el péptido de conexión contiene un residuo de
aminoácido aromático que está a menos de 5 \ring{A} de distancia
de al menos uno de los residuos en las posiciones B11, B12 o B26 en
la cadena B.
En otro aspecto la presente invención se refiere
a precursores de insulina o análogos de precursores de insulina que
comprenden un péptido de conexión (péptido C) que comprende al
menos un residuo de aminoácido aromático y es divisible de las
cadenas A y B. Dichos precursores de insulina o análogos de
precursores de insulina con una estabilidad de Cmid aumentada
respecto del precursor de insulina o los análogos de precursores de
insulina que no comprenden un residuo de aminoácido aromático en el
péptido de conexión.
La actividad aumentada es determinada por una
variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica, y
descritos abajo. En una forma de realización, la estabilidad
aumentada es medida por determinación de DC de la concentración de
hidrocloruro de guanidina (GuHCl) necesaria para conseguir el
desplegamiento semi-máximo de una molécula
precursora de insulina (Cmid).
En una forma de realización, el número total de
residuos de aminoácidos en X_{1} será de 1-10,
1-9, 1-8, 1-7,
1-6, 1-5 o 1-4
residuos de aminoácidos de longitud. En otra forma de realización
específica X_{1} es 1-3 residuos de aminoácidos y
preferiblemente 1-2 residuos de aminoácidos. Los
residuos de aminoácidos en X_{1} pueden ser cualquier residuo de
aminoácido codificable y pueden ser iguales o diferentes con la
única condición de que uno sea un residuo de aminoácido aromático
inmediatamente N-terminal a Y.
En las fórmulas mencionadas X_{1} pueden
comprender hasta 5 residuos de aminoácidos aromáticos que pueden ser
iguales o diferentes. En una forma de realización específica,
X_{1} comprende hasta 3 residuos de aminoácidos aromáticos que
pueden ser iguales o diferentes y X_{1} preferiblemente contiene
sólo un residuo de aminoácido aromático. Los residuos de
aminoácidos aromáticos son Trp, Phe o Tyr, preferiblemente Phe o
Trp.
En una forma de realización, X_{2} es Asp y
X_{3} es Lys. Esta forma de realización abarca los análogos de
precursores de insulina que contienen un Asp en la posición B28 de
la cadena B (en adelante denominado "Asp^{B28} IP"). En otra
forma de realización X_{2} es Lys y X_{3} es Pro. En otra forma
de realización la secuencia X_{1}-Y es
seleccionada del grupo de:
(a) Met-Trp-Lys;
(b) Ala-Trp-Lys; (c)
Val-Trp-Lys; (d)
Ile-Trp-Lys; (e)
Leu-Trp-Lys; (f)
Glu-Glu-Phe-Lys (SEC
ID NO: 15); (g) Glu-Phe-Lys; (h)
Glu-Trp-Lys; (i)
Ser-Trp-Lys; (j)
Thr-Trp-Lys; (k)
Arg-Trp-Lys; (l)
Glu-Met-Trp-Lys (SEC
ID NO: 15); (g) Glu-Phe-Lys; (h)
Glu-Trp-Lys; (i)
Ser-Trp-Lys; (j)
Thr-Trp-Lys; (k)
Arg-Trp-Lys; (l)
Glu-Met-Trp-Lys (SEC
ID NO: 1); (m)
Gln-Met-Trp-Lys (SEC
ID NO: 2); y (n) Asp-Trp-Lys.
En otra forma de realización X_{2} es Pro,
X_{3} es Lys y X_{1} es 1-2 residuos de
aminoácidos de los cuales uno es Trp o Phe.
En otra forma de realización X_{2} es Lys,
X_{3} es Pro-Thr y X_{1} consiste en 15 residuos
de aminoácidos como máximo de los cuales uno es Trp, Tyr o Phe. En
esta forma de realización X_{1} contendrá un sitio de división en
el extremo del terminal C, p. ej un sitio de división monobásico o
dibásico (Lys, Arg) .
La presente invención también está relacionada
con secuencias de polinucleótidos cuyo código para los precursores
de insulina reivindicados o análogos de precursores de insulina. En
otro aspecto la presente invención se refiere a vectores que
contienen ese tipo de secuencias de polinucleótidos y la célula
huésped que contiene dichas secuencias de polinucleótidos o
vectores.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
proceso para producir los precursores de insulina o análogos de
precursores de insulina en una célula huésped, dicho método
comprende (i) el cultivo de una célula huésped que comprende una
secuencia de polinucleótidos que codifica los precursores de
insulina o análogos de precursores de insulina de la invención bajo
condiciones adecuadas para la expresión de dicho precursor o
análogo de precursor; y (ii) el aislamiento del precursor o análogo
de precursor del medio de cultivo.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
proceso para producir insulina o análogos de insulina en una célula
huésped dicho método comprendiendo (i) el cultivo de una célula
huésped que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica
un precursor de insulina o análogos de precursor de insulina de la
invención; (ii) el aislamiento del precursor o análogo del
precursor del medio de cultivo y (iii) la conversión del precursor o
análogo del precursor en insulina o un análogo de insulina por
conversión enzimática in vitro.
En una forma de realización de la presente
invención la célula huésped es una célula huésped de levadura y en
otra forma de realización la célula huésped de levadura es
seleccionada del género Saccharomyces. En otra forma de
realización la célula huésped de levadura es seleccionada de la
especie Saccharomyces cerevisiae.
La Fig. 1 representa el plásmido de expresión
depAK721 de S. cerevisiae que expresa el líder
LA19-EEAEAEAE
PK(SEC ID NO: 3)-proteína de fusión IP(AlaAlaLys).
PK(SEC ID NO: 3)-proteína de fusión IP(AlaAlaLys).
Fig. 2 es la secuencia de ADN y la secuencia
inferida de aminoácidos de la proteína de fusión codificada (líder
factor \alpha-EEAEAEAPK(SEC ID NO:
4)-Asp^{B28}IP parte de pAK1150 (SEC ID Nº: 5 y
6) usada como molde de PCR.
La Fig. 3 es la secuencia de ADN que codifica el
líder factor \alpha-proteína de fusión
Asp^{B28}IP(GluTrpLys) con un minipéptido C sintético
GluTrpLys generado por optimización aleatorizada (SEC ID NO: 7 y
8). El minipéptido C (EWK) es indicado por subrayado.
La Fig. 4 muestra la estabilidad de plegamiento
del análogo de insulina Asp^{B28} IP(MetTrpLys) respecto a
Asp^{B28} IP.
La Fig. 5 muestra las estructuras de solución de
Asp^{B28} IP(MetTrpLys) como líneas fundamentales del
conjunto de 20 estructuras convergentes.
\newpage
La Fig. 6 muestra una presentación de cinta de
Asp^{B28}IP(MetTrpLys). La figura es producida usando
MOLSCRIPT (Kraulis (1991) J. Appl. Crystallog.
24:946-950). Las anotaciones del residuo de
aminoácido son derivadas como se muestra a continuación:
B1-B29 (cadena B) están numerados
1-29, los residuos C1-C3 (péptido
de conexión) están numerados 30-32, y residuos
Al-A21 (cadena A) están numerados
33-53.
La Fig. 7 es el espectro RMN. de protón ID para
Asp^{B28} IP(MetTrpLys) registrado a 27ºC en concentración
1,0 mM en 10%/90% D_{2}O/H_{2}O con 10 mM tampón de fosfato a pH
8.0.
La Fig. 8 es la secuencia de ADN y de
aminoácidos inferida del cassette de expresión que expresa
YAP3-TA39-EEGEPK(SEC ID NO:
17)- proteína de fusión Asp^{B28} IP con un minipéptido C
sintético GluTrpLys (SEC ID NO: 9 y 10) y
La Fig. 9 es la secuencia de ADN y de
aminoácidos inferida del casette de expresión que expresa el
plásmido que expresa
YAP3-TA57-EEGEPK(SEC ID NO:
17)-proteína de fusión Asp^{B28}IP con un
minipéptido C sintético GluTrpLys (SEC ID Nº: 11 y 12).
\vskip1.000000\baselineskip
Por "péptido de conexión" o
"péptido C" se entiende la fracción de conexión
"C" de la secuencia polipeptídica
B-C-A de una molécula tipo
preproinsulina monocatenaria. Específicamente, en la cadena de
insulina natural, el péptido C conecta con la posición 30 de la
cadena B y la posición 1 de la cadena A. Un "minipéptido C" o
"péptido de conexión" tal como los descritos aquí, conecta B29
o B30 a A1, y difiere en secuencia y longitud de las del péptido C
natural.
Por "IP" se entiende un precursor de
insulina monocatenario en el cual la cadena desB30 está enlazada a
la cadena A de insulina vía un péptido de conexión. El precursor de
insulina monocatenario contendrá (tres) puentes de disulfuro
correctamente situados como en la insulina humana.
Por "desB30" o
"B(1-29)" se entiende una cadena B de
insulina natural carente del residuo de aminoácido B30,
"A(1-21)" significa la cadena A de
insulina natural, "B(1-27)" significa la
cadena B natural carente de los residuos de aminoácidos B28, B29, y
B30; "Asp^{B28} IP" significa un precursor de insulina
monocatenario con ácido aspártico en la posición 28 de la cadena B y
ningún péptido C (B29 está enlazado a A1). El minipéptido C y su
secuencia de aminoácidos están indicados en el código de aminoácido
de tres letras en paréntesis que sigue al IP; así "Asp^{B28}
IP(MetTrpLys)" significa un precursor de insulina
monocatenario con ácido aspártico en la posición 28 de la cadena B
y un minipéptido C con la secuencia
Met-Trp-Lys que conecta B29 a
A1.
Por "precursor de insulina" se
entiende un polipéptido monocatenario que por uno o más procesos
químicos y/o enzimáticos posteriores pueden ser convertidos en
insulina humana.
Por "análogo de precursor de
insulina" se entiende una molécula precursora de insulina
que tiene una o más mutaciones, sustituciones, deleciones y/o
adiciones de las cadenas de aminoácido A y/o B relativas a la
molécula de insulina humana. Los análogos de insulina son
preferiblemente aquellos en los cuales uno o más de los residuos de
aminoácidos de origen natural, preferiblemente uno, dos, o tres de
éstos, han sido sustituidos por otro residuo de aminoácido
codificable. En una forma de realización, la presente invención
comprende moléculas análogas que tienen la posición 28 de la cadena
B alterada en relación con la molécula de insulina humana natural.
En esta forma de realización, la posición 28 es modificada del
residuo Pro natural a uno de Asp, Lys, o Ile. En una forma de
realización preferida, el residuo Pro natural en la posición B28 es
modificado a un residuo Asp. En otra forma de realización Lys en la
posición B29 es modificado a Pro. También, Asn en la posición A21
puede ser modificado a Ala, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser,
Thr, Trp, Tyr o Val, en particular a Gly, Ala, Ser, o Thr y
preferiblemente a Gly. Además, Asn en la posición B3 puede ser
modificado a Lys. Otros ejemplos de análogos de precursor de
insulina son la insulina humana des(B30) , análogos de
insulina donde Phe^{B1} ha sido delecionado; análogos de insulina
donde la cadena A y/o la cadena B poseen una extensión
N-terminal y análogos de insulina donde la cadena A
y/o la cadena B poseen una extensión C-terminal.
Así uno o dos Arg pueden ser añadidos a la posición B1.
El término "inmediatamente
N-terminal a" se refiere a la situación en
la cual un residuo de aminoácido o una secuencia peptídica está
directamente enlazado en su extremo C-terminal al
extremo N-terminal de otro residuo de aminoácido o
secuencia de aminoácidos mediante un enlace peptídico.
En el contexto presente, el término
"análogo funcional de insulina" y similares, indica un
polipéptido con una acción biológica similar a la proteína de
insulina humana nativa.
Por una distancia más corta que 5
\ring{A} entre dos residuos de aminoácidos se entiende la
distancia interatómica más corta inferior a 5 \ring{A} entre
cualquier átomo en el primer aminoácido y cualquier átomo en el
segundo aminoácido. Las distancias atómicas son medidas a partir de
estructuras tridimensionales de la molécula determinadas bien por
RMN. (Wüthrich, K., 1986, NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley,
New York) o por cristalografía de rayos X (Drenth, J., 1994,
Principles of Protein X-ray crystallography,
Springer Verlag Berlin). Una distancia desde un aminoácido a otro se
mide como la distancia interatómica más corta entre cualquier átomo
en el primer aminoácido y cualquier átomo en el segundo aminoácido
si no se especifica de otro modo.
La presente invención presenta nuevos
minipéptidos C que conectan la posición 29 de la cadena B de la
insulina y la posición 1 de la cadena A de la insulina que aumentó
significativamente los rendimientos de producción en una célula
huésped de levadura. Mediante el término "producción aumentada
significativamente", "rendimiento de fermentación
aumentado", y similares, se entiende un aumento en la
cantidad segregada de la molécula precursora de insulina o molécula
análoga del precursor de insulina presente en el sobrenadante del
cultivo en comparación con el rendimiento de un precursor de
insulina o análogo de precursor de insulina sin residuo de
aminoácido aromático en el minipéptido C. Un rendimiento de
fermentación "aumentado" es un número absoluto mayor
que el control; preferiblemente, el aumento es del 50% o superior
que el nivel de control (Asp^{B28}IP); incluso más
preferiblemente, el aumento es del 100% o superior que los niveles
de control.
Mediante el término "aumento de
estabilidad" se entiende, por ejemplo, un valor aumentado de
Cmid en solución respecto al obtenido para un precursor de análogo
de insulina (p. ej., Asp^{B28}IP) sin un residuo de aminoácido
aromático en el minipéptido C. Mediante el término "Cmid" se
entiende la concentración de GuHCl necesaria para desplegar una
mitad de la población proteica en un ensayo midiendo el dicroísmo
circular UV lejano de la molécula de insulina como función de las
concentraciones en aumento de desnaturalizante.
"POT" es el gen de
triosa-fosfato isomerasa de Schizosaccharomyces
pombe, y "TPI1" es el gen de
triosa-fosfato isomerasa de S.
cerevisiae.
Por un "líder" se entiende una
secuencia de aminoácidos que consiste en un prepéptido (el péptido
señal) y un propéptido.
El término "péptido señal" se
refiere a un prepéptido que está presente como una secuencia
N-terminal en la forma precursora de una proteína.
La función del péptido señal es permitir que la proteína heteróloga
facilite la translocación en el retículo endoplásmico. El péptido
señal normalmente es dividido en el curso de este proceso. El
péptido señal puede ser heterólogo u homólogo al organismo de
levadura que produce la proteína. Varios péptidos señal que pueden
ser usados con el constructo de ADN de la invención incluido el
péptido señal de la proteasa aspártica 3 de levadura (YAP3) o
cualquier análogo funcional (Egel-Mitani et
al. (1990) YEAST 6:127-137 y US 5,726,038) y
señal de factor \alpha del gen MF\alpha1 (Thorner
(1981) en The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces
cerevisiae, Strathern et al, eds., pp
143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY y US
4,870,00.
El término "propéptido" significa
una secuencia polipeptídica cuya función es permitir que el
polipéptido expresado sea dirigido del retículo endoplásmico al
aparato de Golgi y luego a una vesícula secretora para la secreción
en el medio de cultivo (es decir, exportación del polipéptido a
través de la pared celular o al menos a través de la membrana
celular en el espacio periplásmico de la célula de levadura). El
propéptido puede ser el propéptido de factor a de levadura, véase
US 4, 546,082 y 4,870,008. De forma alternativa, el propéptido
puede ser un propéptido sintético, es decir un propéptido no
encontrado en la naturaleza. Los propéptidos sintéticos adecuados
son aquellos descritos en US 5,395,922, 5,795,746, 5,162,498 y WO
98/32867. El propéptido preferiblemente contendrá un sitio de
procesamiento de endopeptidasa en el extremo
C-terminal, tal como una secuencia
Lys-Arg o cualquier análogo funcional de la
misma.
La secuencia de polinucleótidos de la invención
puede ser preparada sintéticamente por métodos estándar
establecidos, p. ej. el método de fosfoamidita descrito por
Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters
22:1859-1869, o el método descrito por Matthes
et al. (1984) EMBO Journal 3:801-805. Según
el método de fosfoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados,
por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, purificado,
duplicado y ligado para formar el constructo de ADN sintético. Una
vía preferida habitualmente de preparación del constructo de ADN es
por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La secuencia de polinucleótido de la invención
también puede ser de origen ADNc, genómico y sintético mezclado.
Por ejemplo, una secuencia genómica o de ADNc que codifique un
péptido líder puede ser unida a una secuencia genómica o de ADNc
que codifique las cadenas A y B, después de lo cual la secuencia de
ADN puede ser modificada en un sitio insertando oligonucleótidos
sintéticos que codifiquen la secuencia de aminoácidos deseada para
la recombinación homóloga conforme a procedimientos bien conocidos
o preferiblemente generando la secuencia deseada por PCR usando
oligonucleótidos adecuados.
La invención abarca un vector que es capaz de
replicarse en el microorganismo seleccionado o en la célula huésped
y que lleva una secuencia de polinucleótidos que codifica los
precursores de insulina o análogos de precursor de insulina de la
invención. El vector recombinante puede ser un vector de
replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una
entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento
extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El
vector puede contener cualquier medio para asegurar la
autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno
que, cuando es introducido en la célula huésped, es integrado en el
genoma y replicado con el o los cromosomas en los cuales ha sido
integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido o
dos o más vectores o plásmidos que en conjunto contienen el ADN
total para ser introducidos en el genoma de la célula huésped, o un
transposón. El vector puede ser lineal o plásmidos circulares
cerrados y preferiblemente contendrá uno o más elementos que
permitan la integración estable del vector en el genoma de la
célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula
independiente del genoma.
En una forma de realización preferida, el vector
de expresión recombinante es capaz de replicarse en la levadura.
Ejemplos de secuencias que permiten que el vector se replique en
levadura son los genes de replicación REP 1-3 de 2
\muM del plásmido de levadura y el origen de la replicación.
Los vectores de la presente invención
preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables que
permiten la fácil selección de células transformadas. Un marcador
seleccionable es un gen cuyo producto sirve para biocida o
resistencia vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a
auxótrofos, y similares. Ejemplos de marcadores bacterianos
seleccionables son los genes dal de Bacillus subtilis
o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren
resistencia antibiótica tal como resistencia a la ampicilina, a la
canamicina, al cloranfenicol o a la tetraciclina. Los marcadores
seleccionables para el uso en una célula huésped fúngica
filamentosa incluyen amdS (acetamidasa), argB
(ornitina carbamil transferasa), pyrG
(orotidina-5'-fosfato
decarboxilasa) y trpC (antranilato sintasa). Los marcadores
adecuados para células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2,
LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Un marcador seleccionable preferido para
la levadura es el gen TPI de Schizosaccharomyces pompe
(Russell (1985) Gene 40:125-130).
En el vector, la secuencia polinucleótida está
operativamente conectada a una secuencia promotora adecuada. El
promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que
muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección
incluidos los promotores mutantes, truncados e híbridos, y se puede
obtener a partir de genes que codifiquen polipéptidos
extracelulares e intracelulares homólogos o heterólogos a la célula
huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción en una célula huésped bacteriana son los promotores
obtenidos del operón lac de E. coli, el gen de
agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, el gen de
levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, el gen de
alfa-amilasa (amyL) de Bacillus
licheniformis, el gen de amilasa maltogénica (amyM) de
Bacillus stearothermophilus, el gen de
alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus
amyloliquefaciens y el gen de penicilinasa (penP) de Bacillus
licheniformis. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción en una célula huésped fúngica filamentosa son
promotores obtenidos de los genes para TAKA amilasa de
Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor
miehei, alfa-amilasa neutra de Aspergillus
niger, y alfa-amilasa estable en ácido de
Aspergillus Niger. En un huésped de levadura, los promotores
útiles son los promotores Ma1, TPI, ADH o PGK de Saccharomyces
cerevisiae.
El constructo polinucleótido de la invención
también estará normalmente conectado operativamente a un terminador
adecuado. En levadura un terminador adecuado es el terminador TPI
(Alber et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet.
1:419-434).
Los procedimientos usados para enlazar la
secuencia de polinucleótidos de la invención, el promotor y el
terminador, respectivamente, y para insertarlos en vectores de
levadura adecuados que contengan la información necesaria para la
replicación en levadura, son conocidos para los expertos en la
técnica. Se entenderá que el vector puede ser construido preparando
primero un constructo de ADN que contenga la secuencia de ADN que
codifique los precursores de insulina o análogos de precursor de
insulina de la invención, y posteriormente insertando este
fragmento en un vector de expresión adecuado, o insertando
consecutivamente fragmentos de ADN que contengan información
genética para los elementos individuales (como señal, propéptido,
minipéptido C, cadenas A y B) seguido de la ligación.
La presente invención también se refiere a
células huéspedes recombinantes, que comprenden una secuencia de
polinucleótidos que codifica los precursores de insulina o los
análogos de precursor de insulina de la invención. Un vector que
comprende esa secuencia de polinucleótidos es introducido en la
célula huésped de modo que el vector se mantiene como un integrante
cromosómico o como un vector extra-cromosómico
autorreplicante como se describió anteriormente. El término
"célula huésped" comprende cualquier descendiente de una
célula madre que no es idéntico a la célula madre debido a las
mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una
célula huésped en depende gran parte del gen que codifica el
polipéptido y su fuente. La célula huésped puede ser un
microorganismo unicelular, p. ej., un procariota, o un
microorganismo no unicelular, p. ej., un eucariota. Las células
unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias
gram positivas que incluyen, pero no se limitan a, una célula de
Bacillus, célula de Streptomyces, o bacterias gram
negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. Las
células eucariotas pueden ser células de mamífero, insecto, planta,
o micóticas. En una forma de realización preferida, la célula
huésped es una célula de levadura. El organismo de levadura usado en
el proceso de la invención puede ser cualquier organismo de
levadura adecuado que, en cultivo, produzca grandes cantidades de
precursor de insulina y análogos de precursor de insulina de la
invención. Ejemplos de organismos de levadura adecuados son cepas
seleccionadas de la especie de levadura Saccharomyces
cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe,
Sacchoromyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha,
Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia
lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum
sp, y Geotrichum fermentans.
La transformación de las células de levadura
puede por ejemplo ser efectuada por la formación de protoplastos
seguida de la transformación en un modo conocido per se. El
medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio
convencional adecuado para cultivar organismos de levadura. El
precursor de insulina segregado o análogos de precursor de insulina
de la invención, una proporción significativa del cual estará
presente en el medio en forma correctamente procesada, puede ser
recuperado del medio por procedimientos convencionales incluida la
separación de las células de levadura del medio por centrifugación,
filtración o recogida del precursor de insulina o análogo de
precursor de insulina por una matriz de intercambio iónico o por
una matriz de absorción de fase inversa, precipitación de los
componentes proteicos del sobrenadante o filtrado mediante una sal,
p. ej. sulfato de amonio, seguido de purificación por una variedad
de procedimientos cromatográficos, p. ej. cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similar.
Los precursores de insulina y análogos de
precursor de insulina de la invención pueden ser expresados con una
extensión de residuo de aminoácido N-terminal, como
se describe en la patente estadounidense nº 5,395,922, y en la
patente europea nº 765,395A; ambas patentes están aquí incorporadas
específicamente por referencia. Se determina que la extensión es
unida de manera estable al precursor de insulina o análogos de
precursor de insulina de la invención durante la fermentación,
protegiendo el extremo N-terminal del precursor de
insulina o análogo de precursor de insulina contra la actividad
proteolítica de las proteasas de levadura tal como DPAP. La
presencia de una extensión N-terminal en el
precursor de insulina o análogo de precursor de insulina también
puede servir como una protección del grupo amino
N-terminal durante la elaboración química de la
proteína, es decir, puede servir como sustituto para un grupo BOC
(t-butil-oxicarbonilo) o de
protección similar. La extensión N-terminal puede
ser eliminada del precursor de insulina recuperado o análogo de
precursor de insulina mediante una enzima proteolítica que sea
específica para un aminoácido básico (p. ej., Lys) de modo que la
extensión terminal sea dividida en el residuo Lys. Ejemplos de esas
enzimas proteolíticas son la tripsina o la proteasa de
Achromobacter lyticus.
Después de la secreción al medio de cultivo y la
recuperación, el precursor de insulina o los análogos del precursor
de insulina de la invención estarán sujetos a varios procedimientos
in vitro para eliminar la posible secuencia de extensión de
N-terminal y el minipéptido C para dar insulina o el
análogo de insulina deseado. Dichos métodos incluyen la conversión
enzimática mediante tripsina o una proteasa de Achromobacter
lyticus en presencia de un éster de L-treonina
seguido de la conversión del éster de treonina de la insulina o
análogo de insulina en insulina o análogo de insulina por
hidrólisis ácida o básica como se describe en la especificación de
la patente estadounidense nº 4,343,898 o 4,916,212 o en Research
Disclosures, septiembre 1994/487 cuyas descripciones están
incorporadas aquí por referencia.
Como se describe abajo, los precursores de
insulina o análogos de precursor de insulina con péptidos C
sintéticos fueron construidos representando al menos un aminoácido
aromático (ejemplo 1). Los plásmidos de expresión de
Saccharomyces cerevisiae que contienen una secuencia de
polinucleótidos que codifica los precursores de insulina o análogos
de precursores de insulina reivindicados fueron construidos por PCR
y usados para transformar una célula huésped de S.
cerevisiae. La cantidad de producto expresado, p. ej. un análogo
de insulina fue medida como un porcentaje del nivel de control
pertinente, p. ej. cantidad de Asp^{B28} IP expresada carente de
minipéptido C (Tabla 1) y Asp^{B28} IP(AlaAlaLys) con un
minipéptido C sin un residuo de aminoácido aromático (Tabla 2). Los
nuevos péptidos C de la invención dieron rendimientos aumentados
hasta 7 niveles.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los plásmidos de expresión son del tipo
C-POT, similares a los descritos en EP 171, 142,
que son caracterizados por el hecho de que contienen el gen de
triosa fosfato isomerasa (POT) de Schizosaccharomyces pombe
para la selección y estabilización de los plásmidos en S.
cerevisiae. Los plásmidos también contienen el promotor y
terminador de triosa fosfato isomerasa de S. cerevisiae.
Estas secuencias son similares a las secuencias correspondientes en
el plásmido pKFN1003 (descrito en WO 90/100075) como lo son todas
las secuencias excepto la secuencia del fragmento
EcoRI-XbaI que codifica la proteína de fusión del
líder y el producto del precursor de insulina. Para expresar
diferentes proteínas de fusión, el fragmento
EcoRI-XbaI de pKFN1003 es simplemente sustituido por
un fragmento EcoRI-XbaI que codifica el
líder-precursor de insulina-fusión
de interés. Estos fragmentos EcoRI-XbaI pueden ser
sintetizados utilizando oligonucleótidos y PCR según técnicas
estándar.
Los transformantes de levadura fueron preparados
por transformación de la cepa huésped de S. cerevisiae, la
cepa MT663 (MATa/MAT\alpha
pep4-3/pep4-3 HIS4/his4
tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir^{+}). La cepa de levadura MT663 fue
depositada en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen en relación con la solicitud WO 92/11378 y recibió el
número de depósito DSM 6278.
MT663 fue cultivada en YPGaL (1% de extracto de
bacto-levadura, 2% de
Bacto-peptona, 2% de galactosa, 1% de lactato) para
una O.D. a 600 nm de 0,6. 100 ml de cultivo fueron cosechados por
centrifugación, lavados con 10 ml de agua, recentrifugación y
resuspendidos en 10 ml de una solución que contenía 1,2 M de
sorbitol, 25 mM de Na_{2}EDTA pH = 8.0 y 6,7 mg/ml de
ditiotreitol. La suspensión fue incubada a 30ºC durante 15 minutos,
centrifugada y las células resuspendidas en 10 ml de una solución
que contenía 1,2 M de sorbitol, 10 mM de Na_{2}EDTA, 0,1 M de
citrato sódico, pH 0 5.8, y 2 mg de Novozym®234. La suspensión fue
incubada a 30ºC durante 30 minutos, las células recogidas por
centrifugación, lavadas en 10 ml de sorbitol 1,2 M y 10 ml de CAS
(1,2 M de sorbitol, 10 mM de CaCl_{2}, 10 mM de tris HCl (tris =
Tris(hidroximetil)aminometano) pH = 7.5) y
resuspendidas en 2 ml de CAS. Para la transformación, 1 ml de
células suspendidas en CAS fueron mezcladas con aprox. 0,1 mg de
ADN plásmido y conservadas a temperatura ambiente durante 15
minutos. Se añadió 1 ml de (20% de polietilenglicol 4000, 10 mM de
CaCl_{2}, 10 mM de tris HCl, pH = 7.5) y la mezcla se conservó
durante otros 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla fue
centrifugada y el granulado resuspendido en 0,1 ml de SOS (1,2 M de
sorbitol, 33% v/v de YPD, 6,7 mM de CaCl_{2}) e incubado a 30ºC
durante 2 horas. La suspensión luego fue centrifugada y el granulado
resuspendido en 0,5 ml de 1,2 M de sorbitol. Luego, 6 ml de agar
superior (el medio SC de Sherman et al. (1982) Methods in
Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory) que contiene 1,2 M de
sorbitol más 2,5% de agar) a 52ºC fue añadido y la suspensión fue
vertida sobre placas conteniendo el mismo medio con contenido de
sorbitol solidificado con agar.
La cepa MT663 de S. cerevisiae
transformada con plásmidos de expresión fue cultivada en YPD
durante 72 h a 30ºC. Se realizó la cuantificación del rendimiento
del precursor de insulina en los sobrenadantes del cultivo por
análisis de HPLC de fase inversa con insulina humana como un
estándar externo (Snel & Damgaard (1988) Proinsulin heterogenity
in pigs. Horm. Metabol. Res. 20:476-488).
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes sintéticos que codifican las proteínas
de fusión, que consisten en Asp^{B28} IP asociado a una secuencia
líder que consiste en un prepéptido (péptido señal) y un
propéptido, fueron construidos usando PCR bajo condiciones estándar
(Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory Press) y E.H.F. polimerasa (Boehringer Mannheim
GmbH, Sandhoefer Strasse 116, Mannheim, Alemania). Los fragmentos de
ADN resultantes fueron aislados y digeridos con endonucleasas y
purificados usando el equipo Gene Clean Kit (Bio101 Inc., La Jolla,
CA, EEUU). Se utilizaron métodos estándar para la ligación del ADN
y la transformación de células de E. coli fue realizada por
el método CaCl_{2} (Sambrook et al. (1989) supra).
Los plásmidos fueron purificados de las células de E. coli
transformadas utilizando columnas QIAGEN (QIAGEN, Hilden,
Alemania). Las secuencias de nucleótidos fueron determinadas usando
el sistema de secuenciación del ADN de ALF Pharmacia Biotech con
ADN plásmido bicatenario purificado como molde. Los cebadores
oligonucleótidos para PCR fueron obtenidos a partir de la
tecnología del ADN (Arhus, Dinamarca).
La expresión secretora del Asp^{B28}IP en
S. cerevisiae fue realizada usando la cepa MT663 de S.
cerevisiae y el vector de expresión de levadura CPOT basado en
2 \mum (véase Fig. 1) como se describe en Thim, L. et al.
(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6766-6770. El
vector de expresión de levadura contiene el gen de triosa fosfato
isomerasa (POT) de Schizosaccharomyces pombe para la
selección del plásmido y la estabilización en S. cerevisiae.
Además, el promotor y terminador del gen de triosa fosfato
isomerasa (TPI1) de S. cerevisiae son usados para la
iniciación de la transcripción y la terminación del gen
recombinante que codifica el líder-proteína de
fusión Asp^{B28}IP. La secreción de Asp^{B28} IP fue facilitada
por el líder de factor \alpha, aunque se puede utilizar una
variedad de secuencias líder de levadura conocidas.
Como se muestra en la Fig. 1, el plásmido de
expresión pAK721 de S. cerevisiae que expresa el líder
LA19-EEAEAEAEPK(SEC ID NO: 3)- proteína de
fusión IP fue construido basado en el plásmido transportador
POT de S. cerevisiae-E. coli (patente
estadounidense 5,871,957). En la Fig. 1, L-IP indica
el cassette de expresión de la proteína de fusión que codifica el
líder-proteína de fusión IP;
TPI-PROMOTOR es el promotor TPI1 de S.
cerevisiae, TPI-TERMINADOR es el terminador
TPI1 de S. cerevisiae; TPI-POMBE
indica el gen POT de S. pombe usado para la selección
en S. cerevisiae; ORIGEN indica un origen de replicación de
S. cerevisiae derivado del plásmido de 2 \mum;
AMP-R indica el gen de
\beta-lactamasa que confiere resistencia a la
ampicilina, facilitando la selección en E. coli; y
ORIGEN-PBR322 indica un origen de replicación de
E. coli.
El ADN que codifica varias proteínas de fusión
de secuencias líder y Asp^{B28} IP con diferentes minipéptidos C
fue generado por PCR utilizando oligonucleótidos apropiados como
cebadores, como se describe abajo. Se utilizaron métodos estándar
para subclonar fragmentos de ADN que codifiquen el
líder-proteínas de fusión Asp^{B28} IP en el
vector de expresión CPOT en la siguiente configuración:
líder-Lys-Arg-separador-Asp^{B28}
IP, donde Lys-Arg es un sitio de procesamiento de
endoproteasa dibásica potencial y separador es una extensión
N-terminal. Para optimizar el procesamiento de la
proteína de fusión por la endoproteasa Kex2 de S.
cerevisiae, el ADN que codifica un péptido separador (extensión
N-terminal), p. ej. EEAEAEAPK (SEC ID NO: 4), fue
insertado entre el ADN que codifica el líder y Asp^{B28}IP
(Kjeldsen et al. (1996) Gene 170, 107-112).
No obstante, el presente del péptido separador no es obligatorio. La
Asp^{B28}IP madura fue segregada como un precursor de insulina
N-terminalmente extendido monocatenario con un
minipéptido C, conectando Lys^{B29} y Gly^{A1}. Después de la
purificación de Asp^{B28} IP y la eliminación proteolítica de la
extensión N-terminal y el minipéptido C, el
aminoácido Thr^{B30} puede ser añadido a Lys^{B29} por
transpeptidación mediada por enzimas, para generar insulina humana
Asp^{B28} (Markussen, et al. (1987) en "Peptides
1986" (Theodoropoulos, D., Ed.), pp. 189-194,
Walter de Gruyter & Co., Berlin.).
El desarrollo de minipéptidos C sintéticos fue
realizado por aleatorización de uno o más codones que codifican los
aminoácidos en el minipéptido C. Todos los minipéptidos C
sintéticos presentan un sitio de procesamiento enzimático (Lys) en
el extremo C que permite la eliminación enzimática del minipéptido
C sintético (patente estadounidense nº 4,916,212, incorporada
específicamente aquí por referencia). La aleatorización fue
realizada usando oligonucleótidos dopados que introdujeron
variaciones de codones a una o más posiciones de los minipéptidos C
sintéticos. Normalmente uno de los dos cebadores (oligonucleótidos)
usados para PCR fue dopado. Un ejemplo de un par de
oligonucleótidos usado para la generación de PCR de
líder-Asp^{B28}IP con minipéptidos C sintéticos
aleatorizados usado para generar minipéptidos C sintéticos con la
fórmula general: Xaa-Trp-Lys (XWK)
es tal y como se indica a continuación:
Cebador A:
- 5'-TAAATCTATAACTACAAAAAACACATA-3' (SEC ID NO:13) y
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador B:
- 3'-CCAAAGAAGATGTGACTGTTCNNMACCTTCCCATAGCAACTTGTTACAACATGAAGATAGAC AAGAAACATGGTTAACCTTTTGATGACATTGATCAGATCTTTGATTC-5' (SEC ID NO:14), donde N es A, C, G, o T y M es C o A.
Reacción en cadena de la polimerasa. PCR
fue normalmente realizada como se indica a continuación: 5 \mul
de cebador A (20 pmol), 5 \mul de cebador B (20 pmol), 10 \mul
10X tampón PCR, 8 \mul de mezcla dNTP, 0,75 \mul de enzima
E.H.F., 1 \mul de plásmido pAK1150 como molde (aproximadamente 0,2
\mug de ADN) y 70,25 \mul de agua destilada.
Normalmente se realizaron entre 10 y 15 ciclos,
un ciclo normalmente fue de 94ºC durante 45 seg.; 55ºC durante 1
min; 72ºC durante 1,5 min. La mezcla de PCR fue posteriormente
cargada en un 2% de gel de agarosa y se realizó la electroforesis
usando técnicas estándar. El fragmento de ADN resultante fue
recortado del gel de agarosa y aislado usando el equipo Gene
Clean.
La Fig. 2 muestra la secuencia de ADN pAK1150
usada como molde para PCR y aminoácidos inferidos de la proteína de
fusión codificada (factor
\alpha-líder-(EEAEAEAPK)(SEC ID NO:
4)-Asp^{B28} IP de pAK1150 (SEQ ID NO: 5 y 6). El
plásmido pAK1150 es similar al pAK721 mostrado en la Fig. 1. El
extremo C de factor \alpha-líder fue modificado
para introducir un sitio de endonucleasa de restricción de NcoI,
que cambia las secuencias de aminoácidos inferidas de SerLeuAsp a
SerMetAla. Además, el Asp^{B28}IP codificado no presenta un
minipéptido C pero Lys^{B29} está directamente conectado a
Gly^{A1}.
El fragmento de ADN PCR purificado fue disuelto
en agua y tampón de endonucleasa de restricción y digerido con
endonucleasas de restricción adecuadas (p. ej. BglII y XbaI) según
técnicas estándar. Los fragmentos de ADN BglII-XbaI
fueron sometidos a electroforesis en agarosa y purificados usando
el equipo Gene Clean.
El plásmido de expresión pAK1150 o un plásmido
similar del tipo CPOT (véase Fig. 1) fue digerido con las
endonucleasas de restricción BglII y XbaI y el fragmento del vector
de 10765 pares de bases de nucleótidos fue aislado usando el equipo
Gene Clean.
Los dos fragmentos de ADN digeridos y aislados
(el fragmento del vector y el fragmento de la PCR) fueron ligados
usando T4 ADN ligasa y condiciones estándar. La mezcla de ligación
fue posteriormente transformada en una cepa competente de E.
coli (R-, M+) seguido de la selección con resistencia a la
ampicilina. Los plásmidos de E. coli resultantes fueron
aislados usando columnas QIAGEN.
Los plásmidos fueron usados posteriormente para
la transformación de un cepa huésped de S. cerevisiae
adecuada, p. ej., MT663 (MATa/MAT\alpha
pep4-3/pep4-3 H/S4/his4
tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir^{+}). Los clones individuales de
S. cerevisiae transformados fueron cultivados en un cultivo
líquido, y la cantidad de Asp^{B28}IP segregada a los
sobrenadantes del cultivo fueron determinados por
RP-HPLC. La secuencia de ADN que codifica el
minipéptido C sintético de los plásmidos de expresión de clones de
S. cerevisiae que segregan una cantidad aumentada de
Asp^{B28}IP fue luego determinada. Posteriormente, la secuencia
de minipéptido C sintético identificada puede ser sometida a otra
ronda de optimización con aleatorización.
Un ejemplo en una secuencia de ADN que codifica
un líder-proteína de fusión Asp^{B28}
IP(GluTrpLys) que representa un minipéptido C sintético
(GluTrpLys) que resulta del proceso de optimización aleatorizada
descrito está mostrado en la Fig. 3 (SEC ID Nº: 7 y 8).
Las tablas 1 y 2 muestran los análogos de los
precursores de insulina generados por el método mencionado y el
rendimiento de producción expresado como un porcentaje de control.
La fermentación fue realizada a 30ºC durante 72 h en 5 ml de YPD.
El rendimiento del precursor de insulina fue determinado por
RP-HPLC del sobrenadante del cultivo y está
expresado con respecto al rendimiento de una cepa de control que
expresa bien un líder-proteína de fusión
Asp^{B28}IP en la cual el residuo B29 es enlazado al residuo A1
por un enlace peptídico; o líder-proteína de fusión
Asp^{B28}IP donde el residuo B29 es enlazado al residuo A1 por un
minipéptido C, respectivamente. En las tablas, "\alpha*"
indica un líder de factor a donde el término C hasta el LysArg ha
sido modificado de "SLD (SerLeuAsp)" a "SMA (SerMet Ala)"
y "ex4" es una extensión N-terminal con la
secuencia de aminoácidos EEAEAEAPK(SEC ID NO: 4). YAP3 es la
secuencia señal YAP3 TA39 es una pro-secuencia
sintética QPIDDTESNTTSVNLMADDTESR
FATNTTLAGGLDWNLISMAKR (SEC ID NO: 16). La secuencia EEGEPK(SEC ID Nº: 17) es una extensión N-terminal a la cadena B del análogo de insulina. TA57 es una pro-secuencia sintética QPIDDTESQTTSVNLMADD
TESAFATQTNSGGLDWGLISMAKR (SEC ID NO: 18).
FATNTTLAGGLDWNLISMAKR (SEC ID NO: 16). La secuencia EEGEPK(SEC ID Nº: 17) es una extensión N-terminal a la cadena B del análogo de insulina. TA57 es una pro-secuencia sintética QPIDDTESQTTSVNLMADD
TESAFATQTNSGGLDWGLISMAKR (SEC ID NO: 18).
\vskip1.000000\baselineskip
Espectroscopia de RMN. Se prepararon
muestras para RMN. disolviendo el polvo de proteína liofilizada en
10/90 D_{2}O/H_{2}O con un tampón de fosfato 10 mM y ajustando
el pH según se desee por adición de pequeños volúmenes de 1 M DCl o
NaOD. Todas las lecturas del medidor de pH son sin corrección para
los efectos del isótopo. Las muestras de Asp^{B28}
IP(MetTrpLys) para RMN fueron preparadas en concentraciones
que varían de 25 \muM a 1 mM a pH 8.0. Los espectros
^{1}H-^{1}H RMN bidimensionales de muestras de 1
mM, DQF-COSY (Piantini et al. (1982) J. Am.
Chem. Soc. 104:6800-6801, Rance et al.
(1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 117:479-485),
TOCSY (Braunschweiler et al. (1983) J. Magn. Reson.
53:521-528, Bax et al. (1985) J. Magn.
Reson. 65: 355-360) y NOESY (Jeener et al.
(1979) J. Chem. Phys. 71:4546-4553) fueron
registrados a 600 MHz en un espectómetro de RMN Varian Unity Inova
equipado con una sonda de resonancia triple
^{1}H/^{13}C/^{15}N con una bobina de gradiente de eje triple
autoprotegido que usa secuencias de pulso estándar de la biblioteca
para usuarios de Varian. La temperatura operativa se fijó en 27ºC.
Para cada fase, incrementos 512 t_{1} del espectro de RMN
bidimensional sensibles fueron adquiridos cada uno con 2048 o 4096
puntos de datos reales según el método TPPI-States
(Marion et al. (1989) J. Magn. Reson.
85:393-399). Se utilizaron las amplitudes
espectrales de 6983 Hz en ambas dimensiones, con el portador
colocado exactamente en la resonancia de agua que fue atenuada
usando saturación entre sondeos durante 1,5 segundos o excitación
selectiva por una secuencia de pulsos de excitación adaptados al
gradiente (WATERGATE, Piotto et al. (1992) J. Biomol. NMR
2:661-665). Los espectros DQFCOSY fueron registrados
usando una versión mejorada de gradiente con aplicación de
gradientes de ángulo mágico (Mattiello et al. (1996) J. Am.
Chem. Soc. 118:3253-3261). Para los espectros
TOCSY, se usaron tiempos de mezcla entre 30 y 80 ms y para NOESY se
usaron tiempos de mezcla entre 50 y 200 ms.
El procesamiento de los espectros de RMN
bidimensionales fue realizado usando el paquete de software Xwinnmr
(versión 2.5, NMR processing software from Bruker Analytische
Messtechnik GmbH, D-76275 Ettlingen, Alemania).
Cada dimensión fue procesada con apodización de campana senoide
desplazada y relleno cero realizado una vez en cada dimensión. Las
correcciones de las líneas de base fueron aplicadas en caso de
necesidad usando procedimientos estándar Xwinnmr.
La asignación espectral, integración de valor
máximo de cruce, asignación específica de secuencias, asignación
estereoespecífica, y cualquier otro registro realizado usando el
programa PRONTO (PRONTO Software Development and Distribution,
Copenhagen Denmark) (Kjær et al. (1991) NATO ASI Series
(Hoch, J. C., Redfield C., & Poulsen, F. M., Eds.), Plenum, New
York). Plenum, Nueva York). Los cambios químicos son medidos en ppm
y la resonancia de agua se fija en 4.75 ppm.
Cálculos de estructura. Las restricciones
de distancia para el cálculo de estructura posterior fueron
obtenidas a partir de los picos de cruce NOESY integrados
clasificados como débiles, medios o fuertes correspondientes a
restricciones de distancia superiores de 5,5, 3,3, y 2,7 \ring{A},
respectivamente. Para restricciones de distancia que implican
grupos metilo, 0,5 \ring{A} adicional fue añadido al límite
superior (Wagner et al. (1985) J. Mol. Biol.
196:611-639). Los cálculos de estructura fueron
realizados usando el método híbrido que combina geometría de
distancia (Crippen et al. (1988) Distance Geometry and
Molecular Conformation, Research Studies Press, Taunton, Somerset,
Engl and; Kuszewski et al. (1992) J. Biomol NMR
2:33-56) y recocimiento simulado basado en las
ideas de Nilges et al. (1988) FEBS Lett.
229:317-324 usando X-PLOR 3.0
(Brünger (1992) X-PLOR Version 3.1: A System for
X-ray Crystallography and NMR, Yale University
Press, New Haven) según los ejemplos dados por el manual
X-PLOR (dg_sub_embed.inp, dgsa.inp, refine.inp).
Los números de residuo son derivados de la numeración de residuo de
insulina estándar, los residuos en la cadena B son numerados
B1-B29, los residuos en el péptido C (por ej.
MetTrpLys) son numerados C1-C3 y los residuos en la
cadena A son numerados A1-A21.
La asignación espectral de los espectros de RMN
para la mayoría de las resonancias siguió el procedimiento de
asignación secuencial estándar descrito por Wütrich (1986 NMR of
Proteins and Nucleic Acids, Wiley, New York). El procedimiento de
asignación estándar falla cuando el protón amida de un residuo de
aminoácido particular se intercambia demasiado rápido con protones
en el agua. A pH 8.0 esto ocurre con diferentes residuos de
aminoácidos, no obstante, la comparación con asignaciones
espectrales de RMN de insulina mutante anterior y la identificación
de residuos de aminoácidos limítrofes (en espacio) a través de NOEs
permite una asignación espectral casi total. El análisis de los
espectros NOESY mostró que diferentes residuos de aminoácidos
poseían una red NOE a los residuos circundantes similar a lo que ha
sido determinado previamente para otras moléculas de insulina, es
decir, insulina humana His^{B16} mutante (Ludvigsen et al.
(1994) Biochemistry 33:7998-8006) y estas
conexiones similares se encuentran para los residuos
B1-B10, B13-B14,
B17-B24 y A4-A21. Adicionalmente las
restricciones de los ángulos diedros para los residuos indicados
arriba fueron adoptadas a partir de aquellas usadas previamente
(Ludvigsen et al. (1994) supra).
Diferentes aminoácidos en particular
B27-B29, C1-C3,
A1-A3 poseen modelos de picos de cruce que
concuerdan con cadenas de péptidos que están menos bien ordenadas
que los elementos estructurales secundarios comúnmente bien
definidos. Así, NOEs adicionales fueron convertidos en
restricciones de distancia sin más clasificación que los límites
superiores de 5,5 \ring{A} o 6,0 \ring{A} si se incluyó un
grupo metilo. Se calculó un conjunto de 20 estructuras convergidas
(Fig. 5) y los parámetros pertinentes indicados en la tabla 3 para
las estructuras convergidas. Cada NOE aquí idéntica a una
restricción de distancia es sólo contada una vez aunque puede
ocurrir varias veces en el espectro NOESY. La evaluación de la
calidad de gráfico de Ramachandran son parámetros de calidad
estándar para evaluar la calidad de geometría local. En general los
parámetros de calidad descritos son comparables a la resolución 2.5
\ring{A} de estructuras de proteína basadas en rayos X (Laskowski
et al. (1996) J. Biol-mol. NMR
8:477-486).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una estructura representativa que más se asemeja
al promedio del conjunto se muestra en la Fig. 6.
Asp^{B28}IP(MetTrpLys) es estructuralmente similar a la
estructura de insulina nativa para las regiones que comprenden los
residuos B1-Bl0, B14-B23,
A4-A21. Las diferencias son principalmente
pronunciadas para regiones en la proximidad del péptido de conexión
en las posiciones B26-B29, C1-C3,
A1-A3 y menos pronunciadas para los residuos
B11-B13. La estructura de
Asp^{B28}IP(MetTrpLys) cerca del péptido C es
sorprendentemente diferente a la estructura tipo nativa (Ludvigsen
(1994) supra). La metionina y las cadenas laterales de
triptófano en Asp^{B28}IP(MetTrpLys) abre la estructura del
núcleo de insulina tradicional apartando a un lado las cadenas
laterales de Tyr^{B26} y Phe^{B25} particulares y dejando el
parche hidrofóbico limítrofe usual comprendido por las cadenas
laterales de Leu^{B11}, Val^{B12}, Ile^{A2} y Tyr^{A19}
intactas. Esta bolsa creada moviendo Phe^{625}, Tyr^{B26} y la
cadena peptídica comprendida por los residuos B25 a B29 es
aparentemente adecuada para alojar el paquete de las cadenas
laterales Met^{C1} y Trp^{C2} del péptido C. Diferentes NOEs de
estas dos cadenas laterales para residuos estructuralmente
limítrofes verifican esta muy nueva disposición de cadenas
laterales no observadas previamente en ninguna estructura de
insulina. Met^{C1} se coloca en una bolsa compuesta por los
residuos Leu^{B15}, Phe^{B24}, Tyr^{B26}, Trp^{C1},
Ile^{A2} y Tyr^{A19} los cuales tienen todos NOEs a Met^{C1}.
Trp^{C2} tiene una red NOE incluso más amplia, pero debido al
rápido intercambio del protón amida indol sólo se pueden asignar
cuatro resonancias del sistema de anillo aromático de Trp^{C2}. A
pesar de ello, NOEs de 21 interresiduos entre Trp^{C2} y sus
vecinos fraccionados por Leu^{B11}, Val^{B12}, Leu^{B15},
Tyr^{B26}, Met^{C1} y Ile^{A2} han sido observados en el
espectro NOESY de Asp^{B28}IP (Met Trp Lys).
La presencia de una cadena lateral de triptófano
en la bolsa también tiene un amplio impacto en los cambios químicos
observados en los espectros de Asp^{B28} IP(Met Trp Lys).
Según las condiciones usadas para RMN, los espectros de Asp^{B28}
IP(Met Trp Lys) están influidos por algún grado de
autoasociación (Fig. 7) pero el intercambio entre monómero y dímero
está en el periodo de RMN sólo observado como un promedio entre los
dos estados. Entre las concentraciones de 25 \muM y 0,2 mM el
grado de autoasociación no cambia según se ve por RMN.
La tabla 4 muestra cambios químicos de
Asp^{B28} IP(MetTrpLys) a 27º Celsius obtenido a 600 MHz,
pH 8 en 10%/90% D_{2}O/H_{2}O con 10 mM tampón de fosfato. Los
cambios químicos son referenciados ajustando la señal de agua
residual a 4,75 ppm. N/A significa que no hay asignación. Las
atribuciones Asp^{B28} IP(MetTrpLys) (1-29
= B1-B29; 30-32 =
C1-C3 y 33-53 =
A1-A21) y la Tabla 5 proporciona las coordenadas
atómicas de Asp^{B28} IP(MetTrpLys) en formato PDB.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la evaluación de la estabilidad de
plegamiento para análogos del precursor de insulina, las muestras
de desnaturalización fueron preparadas combinando diferentes
proporciones de análogo del precursor de insulina y soluciones
concentradas de GuHCl con 10 mM TriS/ClO_{4}-, pH 8.0. Las
soluciones concentradas de proteína fueron normalmente 0,06 mM en 10
mM Tris/ClO_{4}-, pH 8.0. Las soluciones concentradas de GuHCl
fueron 8.25 M en 10 mM Tris/ClO_{4}-, pH 8.0. Los espectros de CD
fueron registrados con un espectropolarímetro Jasco
J-715 calibrado con ácido
(+)-10-canforsulfónico. Todos los
espectros fueron registrados a 20ºC. Las muestras de
desnaturalización fueron escaneadas de 250 a 218 nm. La longitud de
paso de célula típica y la concentración de proteína fueron 0,5 cm
y 3 \muM, respectivamente. Todos los espectros fueron alisados
antes de la sustracción de formas preliminares de solvente
apropiadas. El dicroismo circular es expresado como
\Delta\varepsilon, basado en la concentración molar del enlace
peptídico. Para los fines de presentación cada curva es normalizada
a una escala de 0-1 dividiendo el cambio observado
en cada punto por el cambio total observado en el experimento.
Análisis de datos. Las curvas de
desnaturalización por GuHCl fueron analizadas asumiendo que la
transición de plegamiento/desplegamiento es de dos estados como se
describe en Santoro & Bolen (1988) Biochemistry
27:8063-8068 y Kaarsholm et al. (1993)
Biochemistry 32:10773-10778, publicaciones
específicamente incorporadas aquí por referencia para enseñar
métodos de estabilidad de cálculo por desnaturalización por GuHCl.
Este análisis brinda varios parámetros incluida la concentración de
GuHCl en el punto medio de la curva de desnaturalización, Cmid
refleja la concentración de desnaturalizante necesaria para
desplegar una mitad de la población proteica. Un aumento en la
estabilidad de desplegamiento es entonces manifiesta por un valor
aumentado de Cmid. Las constantes de equilibrio pueden ser obtenidas
en cada concentración de desnaturalizante usando K =
(\Delta\varepsilon_{N} -
\Delta\varepsilon)/(\Delta\varepsilon -
\Delta\varepsilon_{U}), donde \Delta\varepsilon es el
valor observado del CD, y \Delta\varepsilon_{N} y
\Delta\varepsilon_{U} representan los valores de CD para
formas nativas y desplegadas, respectivamente, en la concentración
de GuHCl dada (Pace, 1975). Los valores para
\Delta\varepsilon_{N} y \Delta\varepsilon_{U} en
concentraciones de GuHCl en la región de transición son obtenidas
por líneas base de extrapolación lineal de la pre- y
post-transición en la región de transición, es decir
que \Delta\varepsilon_{N} = \Delta\varepsilon^{0}_{N}
+ m_{N}[GuHCl], y \Delta\varepsilon_{U} =
\Delta\varepsilon^{0}_{U} + m_{U} [GuHCl], donde
\Delta\varepsilon^{0}_{N} y
\Delta\varepsilon^{0}_{U} son interceptos, y m_{N}
y m_{U} son inclinaciones de las líneas de base de la pre-
y post-transición, respectivamente. La energía libre
del desplegamiento en una concentración de desnaturalizante dada en
la zona de transición es dada por \DeltaG = -RTInK. Asumiendo una
dependencia lineal de \DeltaG en la concentración de
desnaturalizante: \DeltaG = \DeltaG_{H_{2}O} -
m[GuHCl], donde \DeltaG_{H_{2}O} es el valor de \DeltaG
en la ausencia de desnaturalizante, y m es una medida de la
dependencia de \DeltaG en concentración de desnaturalizante. Por
lo tanto, los valores \DeltaG derivados de K en la zona de
transición pueden ser extrapolados a 0 M de desnaturalizante para
dar \DeltaG_{H_{2}O}. La relación entre \Delta\varepsilon y
[GuHCl] para la curva de desplegamiento completa está mostrada en la
Ec. 1 (Santoro & Bolen, 1988):
Con \Delta\varepsilon como la respuesta y
[GuHCl] como la variable independiente, ec. (1) es sometida a
análisis de mínimos cuadrados curvilíneos usando el procedimiento
NLIN de PC SAS (SAS Inc. Cary, Carolina del Norte). Seis parámetros
describen entonces la curva de desnaturalización:
\Delta\varepsilon^{0}_{N},
\Delta\varepsilon^{0}_{U}, m_{N}, m_{U},
m, y \DeltaG_{H_{2}O}. Además, la concentración de GuHCl
en el punto medio de la curva de desnaturalización, Cmid, es dada
por \DeltaG_{H_{2}O}/m.
La evaluación de la estabilidad de plegamiento
relativo de moléculas derivadas de Asp^{B28}IP con el péptido C
Met Trp Lys (Asp^{B28} IP(MetTrpLys)) fue evaluada con
respecto a Asp^{B28}IP. Los resultados muestran que la molécula
de Asp^{B28}IP(MetTrpLys) fue mucho más estable que
Asp^{B28}IP (Fig. 5), como lo demuestra el cambio en Cmid.
Mientras que Cmid para Asp^{B28}IP es aproximadamente 5,5 M de
GuHCl, el de Asp^{B28}IP(MetTrpLys) es aumentado al menos
aproximadamente a 6,5 M de GuHCl, un aumento de aproximadamente el
18%.
El precursor del análogo de insulina Asp^{B28}
IP(EWK) fue producido cultivando la cepa de levadura MT663
transformada con un plásmido de expresión que expresaba
YAP3-TA39-EEGEPK(SEC ID NO:
17)-proteína de fusión Asp^{B28}IP(EWK) o
YAP3-TA57- EEGEPK(SEC ID NO:
17)-proteína de fusión Asp^{B28}
IP(EWK).
El ADNc que codifica las secuencias líder
YAP3-TA39 y YAP3-TA57 y el ADNc que
codifica Asp^{B28}IP(EWK) y la extensión
N-terminal fueron clonados en un vector de
expresión del tipo C-POT utilizando técnicas
estándar (Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T, Molecular cloning,
Cold spring Harbour laboratory press, 1989). El ADN y las
secuencias de aminoácidos inferidos son mostrados en la Fig 8 y
9.
La tabla 6 muestra los rendimientos. La
fermentación fue conducida a 30ºC durante 72 h en 5 ml de YPD. El
rendimiento de IP fue determinado por RP-HPLC del
sobrenadante del cultivo y es expresado en relación al rendimiento
IP de una cepa de control.
En la tabla 6, "\alpha*" indica un líder
de factor a donde el término C hasta el LysArg ha sido modificado
de "SLD (SerLeuAsp)" a "SMA (SerMet Ala)" y "ex4" es
una extensión N-terminal con la secuencia de
aminoácidos EEAEAEAPK(SEQ ID NO: 4). YAP3 es el secuencia de
señal YAP3. TA39 es una pro-secuencia sintética
QPIDDTESNTTSVNL
MADDTESRFATNTTLAGGLDWNLISMAKR (SEC ID NO: 16). La secuencia EEGEPK (SEC ID Nº: 17) es una extensión N-terminal a la cadena B del análogo de insulina. TA57 es una pro-secuencia sintética QPIDDTESQTTSVNL
MADDTESAFATQTNSGGLDWGLISMAKR (SEC ID NO: 18).
MADDTESRFATNTTLAGGLDWNLISMAKR (SEC ID NO: 16). La secuencia EEGEPK (SEC ID Nº: 17) es una extensión N-terminal a la cadena B del análogo de insulina. TA57 es una pro-secuencia sintética QPIDDTESQTTSVNL
MADDTESAFATQTNSGGLDWGLISMAKR (SEC ID NO: 18).
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Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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insulina y análogos de precursores de insulina
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<160> 18
\vskip1.000000\baselineskip
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<170> PatentIn version 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> minipéptido C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> mini péptido C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211>10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> extensión
N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> extensión
N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Líder factor alfa fusionado con
Asp28IP extendido de forma N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (114)..(545)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> líder factor alfa fusionado con
Asp28IP extendido de forma N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> líder factor alfa fusionado con
Asp28IP extendido de forma N-terminal
(GluTrpLys)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (114)..(554)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> líder factor alfa fusionado con
Asp28IP extendido de forma N-terminal
(GluTrpLys)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 550
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Líder TA39 fusionado con Asp28IP
extendido de forma N-terminal(GluTrpLys)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (115)..(489)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Líder TA39 fusionado con Asp28IP
extendido de forma N-terminal (GluTrpLys)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 550
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Líder TA57 fusionado con Asp28IP
extendido de forma N-terminal (GluTrpLys)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (115).. (486)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Líder TA57 fusionado con Asp28IP
extendido de forma N-terminal (GluTrpLys)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> transcrito primario
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22) .. (24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, t, g o c y m es c o a
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> extensión
N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Líder sintético TA39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> extensión
N-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Líder sintético TA57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
Claims (12)
1. Precursor de insulina o análogo de precursor
de insulina que comprende la fórmula:
B(1-27) -
X_{2} - X_{3} - X_{1} Y -
A(1-21)
donde
X_{1} es una secuencia peptídica de
1-15 residuos de aminoácidos uno de los cuales es un
residuo de aminoácido aromático inmediatamente
N-terminal a Y,
X_{2} es Pro, Asp, Lys, o Ile en la posición
28 de la cadena B de insulina humana,
X_{3} es Pro, Lys, Ala, Arg o
Pro-Thr en la posición 29 de la cadena B de insulina
humana,
Y es Lys o Arg,
A(1-21) es la cadena A de
insulina natural, y
B(1-27) es la cadena B de
insulina natural carente de residuos aminoácidos B28, B29 y
B30.
2. Precursor de insulina o análogo de precursor
de insulina según la reivindicación 1, donde X_{1} es de
1-9, preferiblemente de 1-5 residuos
de aminoácidos.
3. Precursor de insulina o análogo de precursor
de insulina según la reivindicación 1, donde X_{1} es de
1-3 residuos de aminoácidos de los cuales uno es Trp
o Phe.
4. Precursor de insulina o análogo de precursor
de insulina según la reivindicación 1, donde
X_{1}-Y es seleccionado del grupo que consiste en;
(a) Met-Trp-Lys, (b)
Ala-Trp-Lys, (c)
Val-Trp-Lys, (d)
Ile-Trp-Lys, (e)
Leu-Trp-Lys, (f)
Glu-Glu-Phe-Lys (SEC
ID NO:15), (g) Glu-Phe-Lys, (h)
Glu-Trp-Lys, (i)
Ser-Trp-Lys, (j)
Thr-Trp-Lys, (k)
Arg-Trp-Lys, (l)
Glu-Met-Trp-Lys
(SEC ID NO: 1), (m)
Gln-Met-Trp-Lys (SEC
ID NO:2), y (n) Asp-Trp-Lys.
5. Precursor de insulina o análogo de precursor
de insulina según la reivindicación 1, donde X_{2} es Asp,
X_{3} es Lys y X_{1} es de 1-3 residuos de
aminoácidos de los cuales uno es Trp o Phe.
6. Secuencia de polinucleótidos que codifica un
precursor de insulina o análogo de precursor de insulina según la
reivindicación 1-5.
7. Vector de expresión que comprende una
secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 6.
8. Célula huésped transformada con un vector
según la reivindicación 7.
9. Proceso para hacer un precursor de insulina o
análogo de precursor de insulina según la reivindicación
1-5, dicho método comprende (i) cultivo de una
célula huésped que comprende una secuencia de polinucleótidos que
codifica un precursor de insulina o análogo de precursor de
insulina según cualquiera de las reivindicaciones
1-5 bajo condiciones de cultivo adecuadas para la
expresión de dicho análogo de precursor; y (ii) aislamiento del
análogo de precursor expresado.
10. Proceso según la reivindicación 9, donde la
célula huésped es una célula huésped de levadura.
11. Proceso para hacer un precursor de insulina
o análogo de insulina según la reivindicación 1-5,
dicho método comprende (i) cultivo de una célula huésped que
comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica el
precursor de insulina o un análogo de precursor de insulina según
cualquiera de las reivindicaciones 1-5 bajo
condiciones de cultivo adecuadas para la expresión de dicho análogo
de precursor; (ii) aislamiento del análogo de precursor del medio
de cultivo y (iii) conversión del análogo precursor en insulina o
análogo de insulina por conversión química o enzimática in
vitro.
12. Proceso según la reivindicación 11, donde la
célula huésped es una célula huésped de levadura.
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