ES2308826T3 - Inmunoglobulinas hibridas para su uso en metodos terapeuticos. - Google Patents

Abstract

Dímero de cadena pesada de inmunoglobulina, en el que una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión al ligando que es una cadena única y es un receptor que no es miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina o una proteína homóloga al mismo y no es un polipéptido de múltiples subunidades codificado por genes discontinuos, se sustituye por las regiones variables de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, las cuales mantienen por lo menos los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la región constante de la cadena pesada, para su uso en un método terapéutico de tratamiento de un paciente.

Description

Inmunoglobulinas híbridas para su uso en métodos terapéuticos.

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Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a nuevas moléculas de unión al ligando y receptores, y a composiciones y procedimientos para mejorar la vida media del plasma circulante de moléculas de unión al ligando. En particular, la presente invención también se refiere a moléculas de inmunoglobulinas híbridas.

Las inmunoglobulinas son moléculas que contienen cadenas polipeptídicas que se mantienen unidas mediante enlaces disulfuro, teniendo de forma característica dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. En cada cadena, un dominio (V) tiene una secuencia aminoacídica variable que depende de la especificidad del anticuerpo de la molécula. Y el otro dominio (C) tiene una secuencia constante común entre las moléculas de la misma clase. La secuencia de los dominios se numera a partir del extremo aminoterminal.

La superfamilia de genes de inmunoglobulinas consiste de moléculas con dominios semejantes a la inmunoglobulina. Los miembros de esta familia incluyen los antígenos de histocompatibilidad principal de clase I y clase II, las inmunoglobulinas, las cadenas \alpha, \beta, \gamma y \delta del receptor de células T, CD1, CD2, CD4, CD8, CD28, las cadenas \gamma, \delta y \varepsilon de CD3, OX-2, Thy-1, las moléculas de adhesión celular intercelular o neural (I-CAM o N-CAM), el antígeno-3 asociado a la función linfocítica (LFA-3), la proteína neurocitoplásmica (NCP-3), el receptor de poli-Ig, la glicoproteína asociada a mielina (MAG), el receptor de IgE de alta afinidad, la glicoproteína principal de mielina periférica (Po), el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, el receptor del factor-1 estimulador de colonias, el receptor Fc de macrófagos, los receptores gamma Fc y el antígeno carcinoembrionario.

Es sabido que es posible sustituir diversos dominios variables (incluyendo las regiones hipervariables) de una inmunoglobulina por otra, y de una especie por otra. Ver, por ejemplo, las patentes europeas EP 0 173494; EP 0 1 250 23; Munro, Nature, 312: (13 de diciembre de 1984); Neuberger et al., Nature, 312: (13 de diciembre de 1984); Sharon et al., Nature, 309: (24 de mayo de 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison et al., Science, 229:1202-1207 (1985); y Boulianne et al., Nature, 312:643-646 (13 de diciembre de 1984).

Morrison et al., Science, 229:1202-1207 (1985) muestran la preparación de una quimera de inmunoglobulinas que tiene una región variable de una especie fusionada con una región constante de una inmunoglobulina de otra especie. Esta referencia propone moléculas que tienen secuencias de inmunoglobulina fusionadas con secuencias que no son de inmunoglobulina (por ejemplo secuencias de enzimas de restricción), sin embargo la referencia muestra sólo dominios variables de inmunoglobulinas unidos a la secuencia que no es de inmunoglobulina. Morrisson et al., patente europea EP 0 173 494 muestran una quimera similar. Mientras que el término "receptor" es utilizado por los autores y la sección de antecedentes hace referencia a "receptores como las inmunoglobulinas, enzimas y proteínas de membrana", el término "receptores de interés" incluye los receptores de células B y células T, más particularmente, las inmunoglobulinas, como IgM, IgG, IgA, IgD y IgE, así como los diversos subtipos de los grupos individuales'' (página 3, líneas 10-13). La descripción de esta referencia es específica de las quimeras de inmunoglobulinas (ver por ejemplo la página 3, líneas 21-30).

Se ha observado también que es posible sustituir dominios de tipo variable de inmunoglobulina de dos miembros de la superfamilia CD4 de genes de inmunoglobulina y el receptor de células T para un dominio variable en una inmunoglobulina; véase, por ejemplo, Capon et al., Nature 337: 525-531, 1989, Traunecker et al., Nature 339: 68-70, 1989, Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2936-2940, 1987, y la solicitud de Patente Europea publicada EP 0325 224 A2.

Se sabe que un gran número de sustancias proteínicas funciona mediante su unión específica con moléculas diana. Estas moléculas diana son generalmente, aunque no es imprescindible, proteínas. Las sustancias que se unen a las moléculas diana o a los ligandos están referidas aquí como parejas de unión al ligando, e incluyen los receptores y proteínas transportadoras, así como hormonas, proteínas de adhesión celular, factores de adhesión específicos de tejido, moléculas de unión a lectinas, factores de crecimiento, enzimas, sustancias nutrientes y similares.

Los linfocitos son ejemplos de células que están dirigidas a tejidos específicos. Los linfocitos son mediadores de la inflamación de tejido normal así como de la lesión tisular patológica como ocurre en la artritis reumatoide y otras enfermedades autoinmunes. Los vertebrados han desarrollado un mecanismo para la distribución de linfocitos con especificidades antigénicas diversas por regiones espacialmente distintas del organismo (Butcher, E.C., Curr. Top. Micro. Immunol., 128, 85 (1986); Gallatin, W.M., et al., Cell 44, 673 (1986); Woodruff, J.J., et al., Ann. Rev. Immunol., 5, 201 (1987); Duijvestijn, A., et al., Immunol. Today, 10, 23 (1989); Yednock, T.A., et al., Adv. Immunol, (en publicación) (1989)).

Este mecanismo implica la recircularización continua de los linfocitos entre la sangre y los órganos linfoides. La migración de linfocitos entre la sangre, donde las células tienen el mayor grado de movilidad, y los órganos linfoides, donde los linfocitos hallan el antígeno secuestrado y procesado, se inicia mediante una interacción adhesiva entre receptores de la superficie de los linfocitos y los ligandos en las células endoteliales de vénulas postcapilarmente especializadas, por ejemplo, vénulas endoteliales altas (HEV) y vasos semejantes a HEV inducidos en el sinovio inflamado de forma crónica.

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Las moléculas de adhesión de linfocitos se han denominado específicamente receptores de localización, ya que permiten a estas células localizarse en o situarse en determinados órganos linfoides secundarios.

Se han identificado candidatos para el receptor de localización de linfocitos en el ratón, la rata y en el hombre (Gallatin, W. M., et al., Nature, 303, 30 (1983) Rasmussen, R.A., et al., J. Immunol., 135, 19 (1985); Chin, Y. H., et al., J. Immunol., 136, 2556 (1986); Jalkanen, S., et al., Eur. J. Immunol., 10, 1195 (1986)). La siguiente literatura describe el trabajo realizado en esta área con la utilización de un anticuerpo monoclonal, denominado Mel 14, dirigido contra una forma murina de una proteína de superficie de linfocitos (Gallatin, w. M., et al., supra; (Mountz, J.D., et al., J. Immunol., 140, 2943 (1988); (Lewinsohn, D. M., et al., J. Immunol., 138, 4313 (1987); Siegelman, M., et al., Science, 231, 823 (1986); St. John, T. et al., Science, 231, 845 (1986)).

Los experimentos de inmunoprecipitación han mostrado que este anticuerpo reconoce una proteína de superficie celular difusa de 90.000 daltons en los linfocitos (Gallatin, W.M., et al., supra) y una proteína de 100.000 daltons en neutrófilos (Lewinsohn, D.M., et al., supra).

Se describió por Siegelman et al. (Siegelman, M. et al., Science, 231, 823 (1986)) una secuencia parcial - 13 residuos - de un receptor de localización de linfocitos, la cual se identificó mediante secuenciación aminoacídica de marcaje radiactivo de una glicoproteína definida por el anticuerpo Mel 14.

Las lectinas son proteínas con un dominio de unión de carbohidratos que se han hallado en diversos animales, incluyendo los humanos así como también el percebe y el moscón gris de la carne. El concepto de lectinas con función en la adhesión celular se ejemplifica por la interacción de ciertos virus y bacterias con células huésped eucariotas (Paulson, J.C., The Receptors vol. 2, P.M. Conn, Eds. (Academic Press, NY, 1985), pág. 131; Sahron, N., FEBS Lett., 217, 145 (1897)). En las interacciones célula-célula de eucariotas, se han deducido las funciones adhesivas de las lectinas endógenas en diversos sistemas (Grable, L., et al., Cell, 17, 477 (1979); Fenderson, B., et al., J. Exp. Med., 160, 1591 (1984); Kunemund, V., J. Cell Biol., 106. 106, 213 (1988); Bischoff, R., J. Cell. Biol., 102, 2273 (1986); Crocker, P.R., et al., J. Exp. Med., 164, 1862 (1986); incluyendo la fertilización de invertebrados (Glabae, C. G., et al., J. Cell. Biol. 94, 123 (1982); DeAngelis, P., et al., J. Biol. Chem., 262, 13946 (1987)) y la de vertebrados (Bleil, J. D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 6778 (1988); Lopez, L. C., et al., J. Cell Biol., 101, 1501 (1985)). La utilización de interacciones proteína-azúcar como medio de lograr el reconocimiento celular específico es bien conocida.

La literatura sugiere que una lectina puede estar implicada en la interacción adhesiva entre linfocitos y sus ligandos (Rosen, S.D., y col, Science, 228, 1005 (1985); Rosen, S.D., et al., J. Immunol., (en publicación) (1989); Stoolman, L. M., et al., J. Cell Biol., 96, 722 (1983); Stoolman, L. M., et al., J. Cell Biol., 99, 1535 (1984); Yednock, T. A., et al., J. Cell Biol., 104, 725 (1987); Stoolman, L. M., et al., Blood, 70, 1842 (1987); una aproximación relacionada por Brandley, B.K., et al., J. Cell Biol., 105, 991 (1987); Yednock, T.A., et al., en preparación; y Yednock, T.A., et al., J. Cell Biol., 104, 725 (1987)).

Se investigaron las características de una glicoproteína de superficie que puede estar implicada en la localización de linfocitos humanos con una serie de anticuerpos mono y policlonales denominados genéricamente Hermes. Estos anticuerpos reconocen una glicoproteína de superficie de 90.000 daltons que se halló en un gran número de tipos celulares inmunes y no inmunes, los cuales mediante experimentos de preaclaramiento de anticuerpos se mostró que estaban relacionados con el antígeno de Mel 14. (Jalkanen, S., et al., Ann. Rev. Med., 38, 467-476 (1987); Jalkanen, S., et al., Blood, 66 (3), 577-582 (1985); Jalkanen, S. et al., J. Cell Biol., 105, 983-990 (1987); Jalkanen, S., et al., Eur. J. Immunol., 18, 1195-1202 (1986).

Se han hallado dominios semejantes al factor de crecimiento epitelial en una amplia gama de proteínas, incluyendo factores de crecimiento, receptores de superficie celular, productos de genes del desarrollo, proteínas de la matriz extracelular, factores de coagulación, activadores del plasminógeno y el complemento (Doolitle, R.F., et al., CSH Symp. 51, 447 (1986)).

Una glicoproteína de la superficie de células linfocitos (a la que se hace referencia en la presente invención como "LHR") se ha caracterizado por mediar en la unión de linfocitos al endotelio de tejido linfoide. Se han identificado y aislado clones de ADNc de longitud completa y ADN que codifica la LHR humana y murina (HuLHR y MLRH, respectivamente) y, además, este ADN se expresa fácilmente mediante células huésped recombinantes. La secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la LHR humana (HuLHR) se muestra en la figura 1. La secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la LHR murina (MLHR) se muestra en la figura 2. También se proporcionan LHR que tienen secuencias de aminoácidos variantes o con glicosilación que no se encuentran en ningún caso en la naturaleza, así como otros derivados de la LHR que tiene propiedades mejoradas incluyendo una mayor actividad específica y una vida media en plasma modificada, así como procedimientos aptos para la preparación de dichas variantes.

En la presente invención se muestra que la LHR es una glicoproteína que contiene los siguientes dominios de proteína: una secuencia señal, un dominio de unión de carbohidrato, un dominio de tipo del factor de crecimiento epidérmico (egf), por lo menos uno y preferiblemente dos dominios de repetición de dominio de unión a complemento, un dominio de unión transmembrana (TMD) y un dominio intracelular o citoplasmático cargado. La LHR de la presente invención contiene por lo menos uno de todos estos dominios, pero no necesariamente todos.

Una estrategia exitosa en el desarrollo de fármacos para el tratamiento de muchas anomalías en las interacciones de la pareja de unión al ligando ha sido la identificación de antagonistas que bloquean la unión o la interacción entre el ligando y la pareja de unión. Una aproximación ha sido la utilización de una pareja de unión exógena como un antagonista competitivo para la pareja de unión nativa. Sin embargo, muchas parejas de unión al ligando son proteínas de membrana celular que están ancladas en la bicapa lipídica de las células. La presencia de componentes de membrana es indeseable desde el punto de vista de fabricación y purificación. Y ya que estas moléculas se hallan normalmente presentes sólo en las superficies celulares, sería deseable producirlas en una forma que sea más estable en la circulación. Además, las parejas de unión al ligando truncadas o solubles puede que no sean óptimamente eficaces como terapéuticos ya que poseen una vida media plasmática in vivo relativamente corta, puede que no atraviesen la placenta u otras barreras biológicas, y ya que secuestran su sitio de reconocimiento del ligando sin permitir la acción de una función efectora, pueden ser inadecuadas para propósitos terapéuticos.

Según ello, es un objetivo de la presente invención el producir parejas de unión al ligando fusionadas con porciones que sirvan para prolongar la vida media plasmática in vivo de la pareja de unión al ligando, es decir dominios de inmunoglobulina, y facilitar su purificación por la proteína A. Es otro objetivo el proporcionar nuevas moléculas de inmunoglobulina híbridas que combinen características de adhesión y unión a la diana de una pareja de unión al ligando con funciones efectoras de inmunoglobulina como la unión al complemento, unión al receptor celular y similar. Otro objetivo es proporcionar moléculas con funciones nuevas tales como las descritas anteriormente para utilización terapéutica, o para utilizar como reactivos diagnósticos para el ensayo in vitro de las parejas de unión al ligando o de sus dianas. Es otro objetivo el proporcionar moléculas multifuncionales en las que diversas parejas de unión al ligando (cada una de las cuales puede ser la misma o diferente) se ensambla, por lo que las moléculas son capaces de unirse a y/o activar más de un ligando.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar heterodímeros híbridos de inmunoglobulina y la pareja de unión al ligando que se utilizan en el reconocimiento de grupos terapéuticos a tejidos y ligandos específicos.

Según la presente invención, se proporciona un dímero de cadena pesada de inmunoglobulina en el que una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión al ligando que es una única cadena y es un receptor que no es miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina o una proteína homóloga al mismo y no es un polipéptido de múltiples subunidades codificado por genes discontinuos, se sustituye por las regiones variables de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, las cuales mantienen por lo menos los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la región constante de la cadena pesada, para su uso en un método terapéutico de tratamiento de un paciente.

La LHR útil en la presente invención es LHR madura de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la presente invención en las figuras 1 y 2, y alelos naturales, derivados covalentes producidos mediante derivatización in vitro, o variantes de secuencias de aminoácidos predeterminadas o con glicosilación de las mismas.

Las nuevas composiciones que se proporcionan aquí se purifican y formulan en vehículos aceptables farmacológicamente para la administración a los pacientes que necesitan una terapia antiviral, neuromoduladora o inmunomoduladora, y para la utilización en la modulación de la adhesión celular. Esta invención es particularmente útil para el tratamiento de pacientes que tienen anomalías mediadas por receptor. Además, las composiciones que se proporcionan aquí son intermediarios útiles en la purificación de la pareja de unión al ligando a partir del cultivo de células recombinantes, en donde los anticuerpos u otras sustancias capaces de unirse al componente de proteína plasmática estable se utilizan para absorber la fusión, o son útiles en los ensayos diagnósticos para la pareja de unión al ligando en donde la proteína plasmática estable sirve como un marcador indirecto.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia aminoacídica y del ADN de la LHR humana (HuLHR).

La Figura 2 muestra la secuencia aminoacídica y del ADN de la LHR murina (MLHR).

La Figura 3 muestra una comparación entre las secuencias aminoacídicas de la HuLHR y MLHR.

Las Figuras 4A-4B muestran los resultados del aislamiento y de la secuenciación del extremo N-terminal de la MLHR. La Figura 4A muestra los resultados de la degradación de Edmann en fase gaseosa de una banda de 90.000 daltons a partir de un gel de poliacrilamida-SDS a partir de material purificado por cromatografía de afinidad con el anticuerpo monoclonal Mel 14 de un extracto obtenido con detergente de bazos murinos. Los residuos subrayados entre los aminoácidos 7 y 15 se eligieron para producir la sonda oligonucleotídica que se muestra en la Figura 4B. La Figura 4B muestra como sonda un oligonucleótido de 26-mer 32 veces redundante.

La Figura 5 muestra la expresión transitoria del clon de ADNc de MLHR. Los carriles A-F corresponden a lo siguiente: A) Lisados de células 293 transfectadas con un plásmido de expresión de MLHR e inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14. B) Sobrenadantes de las células 293 transfectadas con un plásmido de expresión de MLHR e inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14. C) Lisados de las células 293 transfectadas con un plásmido que expresa la glicoproteína de la cubierta gp120 de VIH e inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14. D) Sobrenadantes de las células 293 transfectadas con el plásmido de expresión de la cubierta de VIH inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14. E) Sobrenadantes de las células 38C13 e inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14. F) Lisados de las células 38C13 marcadas en la superficie con I^{126} e inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.

Las Figuras 6A-6C muestran las secuencias proteínicas que son heterólogas pero funcionalmente comparables con la MLHR, las líneas marcadas "MLHR" corresponden a la MLHR de la Figura 2. La Figura 6A compara los dominios de unión de carbohidrato; la Figura 6B compara los dominios del factor de crecimiento epitelial; y la Figura 6C compara los dominios del factor de unión al complemento.

La Figura 7 es un esquema de los dominios proteínicos hallados en la LHR, incluyendo la secuencia señal, el dominio de unión de carbohidratos, el dominio del factor de crecimiento epitelial (egf), dos repeticiones en el dominio de unión al complemento (flechas), el dominio de unión transmembrana (TMD) y el dominio intracelular cargado.

La Figura 8 muestra la construcción de quimeras de MLHR-IgG que contienen la lectina, lectina-egf y lectina-egf-motivos reguladores del complemento.

La Figura 9 muestra la electroforesis en gel de los productos de la expresión y purificación de las quimeras de MLHR-IgG.

La Figura 10 muestra el análisis de unión del éster de polifosfomanano (PPME) de varias quimeras de MLHR-IgG.

Descripción detallada

Las parejas de unión al ligando tal como se definen en la presente invención son proteínas conocidas por actuar en la unión específica a moléculas ligando diana y se encuentran en general en su estado nativo como polipéptidos secretados o unidos a membrana; las parejas de unión al ligando unidas a membrana incluyen habitualmente una región transmembrana hidrofóbica o fosfolípido ancla. Entre las parejas de unión al ligando se incluyen receptores y proteínas portadoras, así como hormonas, proteínas adhesivas celulares (proteínas que dirigen o inducen la adhesión de una célula a otra), moléculas de unión a lectina, factores de crecimiento, enzimas, sustancias nutrientes y similares. Los antígenos CD que no son miembros de la superfamilia de genes de inmunoglobulina o en cualquier caso excluidos tal como se ha indicado anteriormente son parejas de unión al ligando adecuadas, Knapp et al. Immunology Today 10 (8): 253-258, 1989. El receptor del factor de crecimiento plaquetario y el receptor de insulina pueden ser opcionalmente parejas de unión al ligando. Las parejas de unión al ligando incluyen no solamente la forma nativa de longitud completa, sino también truncamientos u otras variantes de secuencias de aminoácidos que mantienen la capacidad de unirse al ligando normal.

Como se utiliza aquí, el término "pareja de unión al ligando" excluye específicamente los miembros polimórficos y no polimórficos de la superfamilia de los genes de inmunoglobulina, y las proteínas que son homólogas a éstos, como los antígenos de histocompatibilidad principal de clase I y clase II, inmunoglobulinas, cadenas \alpha, \beta, \gamma y \delta del receptor de células T, CD1, CD2, CD4, CD8, CD28, las cadenas \gamma, \delta y \varepsilon de CD3, OX-2, Thy-1, las moléculas de adhesión celular intercelular o neural (I-CAM o N-CAM), el antígeno-3 asociado con la función linfocítica (LFA-3), la proteína neurocitoplasmática (NCP-3), el receptor poli-Ig, glicoproteína asociada a mielina (MAG), el receptor de alta afinidad IgE, la glicoproteína principal de mielina periférica (Po), el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, el receptor del factor-1 estimulador de colonias, el receptor Fc de macrófagos, los receptores gamma Fc y el antígeno carcinoembrionario. Homólogo a un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina, únicamente con el propósito de exclusión de esta superfamilia, quiere decir tener la secuencia de un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulinas, o tener una secuencia de ello que tenga sustancialmente la misma (o un elevado grado de) homología de secuencia aminoacídica con un miembro conocido de la superfamilia, como los ejemplos específicos proporcionados anteriormente tienen en relación con la secuencia de un dominio variable o constante de inmunoglobulina. Se ha de tener en cuenta que esto no excluye las realizaciones en las que una fusión de una pareja de unión al ligando se ensambla en un multímero con, además, un miembro o fusión de un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulinas.

También se excluyen de forma específica del término "pareja de unión al ligando" los polipéptidos de subunidades múltiples (cadenas) codificados por genes discretos (genes que no codifican un polipéptido precursor de cadena sencilla que conduce al polipéptido de subunidades múltiples), con al menos una subunidad del polipéptido insertada de forma ordinaria en la membrana de la célula, incluyendo los receptores celulares (por ejemplo, integrinas) para moléculas de la matriz extracelular, como se ejemplifica en la PCT Pub. WO90/06953 publicada el 28 de junio, 1990. Se ha de tener en cuenta que esto no excluye las realizaciones en las que una fusión de la pareja de unión al ligando se ensambla en un multímero con, además, un polipéptido de subunidades múltiples o fusión de un polipéptido de subunidades múltiples tal como se define en este párrafo.

En algunas realizaciones preferidas, la pareja de unión es una LHR. La LHR se define como un polipéptido que tiene una actividad biológica cualitativa en común con la LHR de la figura 1 o la figura 2, y que preferiblemente contiene un dominio con una homología superior a aproximadamente el 70% con el dominio de unión de carbohidrato, el dominio del factor de crecimiento epidérmico o el dominio de unión de carbohidrato de la LHR de la figura 1 o la figura 2.

La homología en relación con una LHR se define aquí como el porcentaje de residuos en la secuencia de candidatos que son idénticos con los residuos en el dominio de unión de carbohidrato, el dominio del factor de crecimiento epitelial, o los dominios de unión al complemento en la Figura 1 o Figura 2 después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de homología.

Se incluyen dentro del ámbito de la LHR, tal como se utiliza aquí este término, las LHRs que tienen secuencias aminoacídicas de la HuLHR o MLHR como se indica en la Figura 1 o 2, derivados desglicosilados o no glicosilados de la LHR, variantes de secuencia aminoacídica homóloga de la secuencia de la Figura 1 o la 2, y variantes homólogas generadas in vitro y derivadas de la LHR, que son capaces de presentar una actividad biológica común con la LHR de la Figura 1 o Figura 2.

La actividad biológica de la LHR o del fragmento de LHR se definen como 1) la reactividad cruzada con al menos un epitopo de la LHR, o 2) la posesión de al menos una función adhesiva, reguladora o efectora cualitativamente común con la LHR.

Un ejemplo de las actividades biológicas cualitativas de la LHR es su unión a ligandos en células endoteliales altamente especializadas de los tejidos linfoides. También, se requiere frecuentemente para la unión al ligando un catión divalente como el calcio.

Que reacciona de forma cruzada inmunológicamente tal como se utiliza aquí quiere decir que el polipéptido candidato es capaz de inhibir competitivamente la actividad biológica cualitativa de la LHR que tiene esta actividad con antisueros policlonales contra el análogo activo conocido. Tales antisueros se preparan de manera convencional mediante inyección en cabras o conejos, por ejemplo, de forma subcutánea con el análogo activo conocido en adyuvante completo de Freund, seguido por la inyección de refuerzo intraperitoneal o subcutánea en Freund incompleto.

Estructuralmente, como se muestra en la Figura 3, la LHR incluye varios dominios que se identifican de la manera siguiente (con + 10 residuos): una secuencia señal (residuos 20-32), que se continua por un dominio de unión de carbohidrato (identificado en la Figura 3 como un dominio de "lectina") (residuos 39-155), un dominio del factor de crecimiento epitelial (egf) (residuos 160-193), un dominio de unión al factor del complemento (residuos 197-317), un dominio de unión transmembrana (TMD) (residuos 333-355) y un dominio citoplasmático (residuos 356-372). La unión para el dominio extracelular de LHR se halla a, o en aproximadamente 30 residuos del extremo N-terminal del dominio transmembrana, y se identifica fácilmente a partir del análisis de la secuencia de LHR. Cualquiera de estos dominios se utiliza en la práctica de la presente invención.

Las Figuras 6A-6C muestran varias proteínas que tienen cierta homología con tres de estos dominios. La Figura 6A muestra los dominios de unión de carbohidrato, la Figura 6B muestra los dominios del factor de crecimiento epitelial la Figura 6C muestra cierta homología con los dominios de unión al complemento.

En la Figura 3 se muestra una comparación de las secuencias aminoacídicas de HuLHR y MLHR, y se muestra un elevado grado de homología en toda la secuencia global (83%). Los grados de homología entre los diversos dominios hallados en la HuLHR versus la MLHR son, sin embargo, variables. Por ejemplo, el grado de conservación de secuencia entre la MLHR y la HuLHR en el dominio de unión de carbohidrato y el dominio de egf es aproximadamente del 83%, mientras que el grado de conservación en la primera repetición de unión del complemento se halla en el 79% y sólo en el 63% en la segunda repetición, para una homología global del dominio de unión al complemento del 71%. Además, mientras que las dos repeticiones del dominio de unión al complemento de MLHR son idénticas, las de HuLHR presentan diferencias y difieren también con las repeticiones murinas. Es interesante destacar que el grado de conservación entre los dos receptores en la secuencia transmembrana y regiones de alrededor es virtualmente idéntico, con sólo una sustitución hidrofóbica conservativa, probablemente dentro de la región de anclaje
transmembrana.

La glicoproteína de superficie, que es reconocida por las series de anticuerpos mono y policlonales denominados Hermes como se describió anteriormente está específicamente excluida del ámbito de la presente invención.

Las inmunoglobulinas y ciertas variantes de lo mismo son conocidas y muchas se preparan en cultivos de células recombinantes. Ver por ejemplo, la patente americana U.S. 4.745.055; la patente europea EP 256. 654; Faulkner et al., Nature, 298: 286 (1982); la patente europea EP 120.694; la patente europea EP 125.023; Morrison, J. Immun., 123: 793 (1979); Kohler et al., P.N.A.S. USA 77:2197 (1980); Raso et al., Cancer Res., 41:2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol., 2:239 (1984); Morrison, Science, 229: 1202 (1985); Morrison et al., P.N.A.S. USA, 81:6851 (1984); la patente europea EP 255.694; la patente europea EP 266.663; y la patente internacional WO 88/03559. También son conocidas las cadenas de inmunoglobulinas recombinadas. Ver por ejemplo, la patente americana U.S. 4.444.878; la patente internacional WO 88/03565; y la patente europea EP 68.763 y las referencias allí citadas.

La pareja de unión al ligando se fusiona por la C-terminal al N-terminal de la región constante de cadenas pesadas de inmunoglobulina que retienen por lo menos los dominios bisagra, CH_{2} y CH_{3} de la región constante de la cadena pesada en lugar de las región o regiones variables de la misma. Preferiblemente antes de la fusión se inactivan o se eliminan las regiones transmembrana o las secuencias de reconocimiento ancla de lípido o fosfolípido de parejas de unión de ligando que comprenden dichas regiones o secuencias.

Dichas fusiones mantienen funcionalmente activos por lo menos los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones también se realizan al C-terminal de la parte Fc de un dominio constante, o inmediatamente N-terminal al CH1 de la cadena pesada. Esto se lleva a cabo habitualmente mediante la construcción de la secuencia de ADN apropiada y la expresión de ésta en un cultivo celular recombinante. Como alternativa, no obstante, los polipéptidos de esta invención pueden sintetizarse de acuerdo con los procedimientos conocidos.

El sitio preciso en el que se realiza la fusión no es crítico; se conocen bien los sitios concretos y pueden seleccionarse con el fin de optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de unión de la pareja de unión. Se determinará el sitio óptimo mediante experimentación rutinaria.

Las inmunoglobulinas híbridas se ensamblan como dímeros. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán unidades estructurales conocidas tal y como se representa en los siguientes diagramas.

En los diagramas de la presente invención, "A" significa por lo menos una parte de una pareja de unión al ligando que contiene un sitio de unión al ligando que es capaz de unir su ligando; X es un agente adicional, que es otra pareja de unión al ligando funcional (el mismo que A o diferente) y C_{H} representa los dominios constantes de cadena pesada de una inmunoglobulina.

homodímero:

1

heterodímero:

2

Se entenderá que estos diagramas son simplemente ilustrativos, y que las cadenas de los multímeros se cree que están unidas con puentes disulfuro del mismo modo que las inmunoglobulinas nativas. Según la presente invención, las inmunoglobulinas híbridas se secretan fácilmente a partir de células de mamífero transformadas con el ácido nucleico apropiado. Las formas secretadas son aquellas en las que el epítopo de pareja de unión está presente en dímeros de cadenas pesadas.

Una realización particularmente preferida es una fusión de una parte N-terminal de una LHR, que contiene el sitio de unión para el endotelio de tejido linfoide, a la parte Fc C-terminal de un anticuerpo, que contiene las funciones efectoras de la inmunoglobulina G_{1}. Existen dos realizaciones preferidas de este tipo; en una, se fusiona la región constante de la cadena pesada entera con una parte de la LHR; en la otra, se fusiona una secuencia que empieza en la región bisagra justo "upstream" con respecto al sitio de división por papaína que define la Fc de IgG químicamente (residuo 216, tomando como primer residuo de la región constante de la cadena pesada el 114 [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 4th Ed., 1987], o sitios análogos de otras inmunoglobulinas) con una parte de la LHR. Esta última realización se describe en el Ejemplo 4.

Se cree que las composiciones de la presente invención en las que una parte biológicamente activa de una pareja de unión al ligando se sustituye por las regiones variables de un dímero de cadena pesada de inmunoglobulina muestran una vida media en plasma in vivo mejor. Estas inmunoglobulinas híbridas se construyen de un modo similar a las construcciones en las que un dominio de tipo inmunoglobulina se sustituye por el dominio variable de una inmunoglobulina, ver por ejemplo Capon et al., Nature 337:525-531, 1989, Traunacker et al., Nature 339:68-70, 1989, Gascoigne et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84:2936-2940, 1987, y la solicitud de Patente Europea publicada EP 0 325 224 A2. Las inmunoglobulinas híbridas de la presente invención también se construyen de un modo similar a los anticuerpos quiméricos en los que un dominio variable de un anticuerpo de una especie se sustituye por el dominio variable de otra especie. Ver, por ejemplo, EP 0 125 023; Munro, Nature 312: (13 de diciembre de 1984); Neuberger et al., Nature 312: (13 de diciembre de 1984); Sharon et al., Nature 309: (24 de mayo de 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Morrison et al. Science 229:1202-1207 (1985); y Boulianne et al., Nature 312:643-646 (13 de diciembre de 1984). El ADN codificante de la pareja de unión se divide mediante una enzima de restricción en el extremo 3' o próximo del ADN codificante del dominio o dominios de la pareja de unión deseados y en un punto o cerca del ADN codificante del extremo N-terminal del polipéptido maduro (donde se contempla el uso de un líder diferente) o en o próximo a la región codificante del N-terminal para la pareja de unión (donde se emplea una señal nativa). A continuación, se inserta fácilmente este fragmento de ADN en el ADN codificante de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina y, si es necesario, se ajusta mediante mutagénesis supresora. Preferiblemente, ésta es una inmunoglobulina humana cuando la variante está destinada a terapia in vivo para humanos.

Generalmente, el dominio extracelular de LHR se fusiona en su C-terminal a la región constante de la inmunoglobulina. El sitio exacto en el que se realiza la fusión no es crítico; pueden seleccionarse otros sitios próximos o en la región extracelular con el objetivo de optimizar las características de secreción o de unión de la fusión LHR-Ig soluble. Se determinará el sitio óptimo mediante experimentación rutinaria. Típicamente la fusión puede reemplazar uno o ambos dominios transmembrana y citoplasmático.

Se conoce o se dispone fácilmente el ADN codificante de regiones constantes de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina a partir de bibliotecas de ADNc o se sintetiza. Ver por ejemplo, Adams et al., Biochemistry 19:2711-2719 (1980); Gough et al., Biochemistry 19:2702-2710 (1980); Dolby et al., P.N.A.S. USA, 77:6027-6031 (1980); Rice et al., P.N.A.S. USA 79:7862-7865 (1982); Falkner et al., Nature 298:286-288 (1982); y Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2:239-256 (1984).

En la presente invención se proporcionan secuencias de ADN codificantes de la LHR. En la práctica de la presente invención son adecuadas secuencias de ADN codificantes de otras parejas de unión deseadas que se conocen o están disponibles fácilmente a partir de bibliotecas de ADNc.

El ADN codificante de una fusión de la presente invención se transfecta en de una célula huésped para la expresión. La célula huésped se transforma con el ADN codificante de cada cadena que formará el multímero, seleccionando de manera óptima la célula huésped que para que sea capaz de ensamblar las cadenas de los multímeros del modo deseado.

En general, se ha descubierto que las fusiones se expresan intracelularmente y se secretan bien, pero se encuentra rutinariamente mucha variación en el grado de secreción de varias fusiones de huéspedes recombinantes.

La presente invención también contempla variantes de secuencia de aminoácidos de la LHR u otra pareja de unión. Se preparan variantes de secuencia de aminoácidos de la pareja de unión con varios objetivos en mente, incluyendo incrementar de la afinidad de la pareja por su ligando, facilitar la estabilidad, purificación y preparación de la pareja de unión, modificar su vida media en plasma, mejorar la eficacia terapéutica, y disminuir la gravedad o la aparición de efectos secundarios durante el uso terapéutico de la pareja de unión. En la discusión siguiente, se proporcionan variantes de secuencia de aminoácidos de la LHR, ejemplos de las variantes que pueden seleccionarse para otras parejas de unión de ligando.

Las variantes de secuencia de aminoácido de la pareja de unión al ligando se encuentran en una o más de las tres clases: variantes por inserción, sustitución o eliminación. Normalmente estas variantes se preparan mediante mutagénesis específica de sitio de nucleótidos en el ADN codificante de la pareja de unión del ligando, mediante la cual se obtiene el ADN codificante de la variante, y a continuación se expresa el ADN en el cultivo celular recombinante. No obstante, se preparan convenientemente fragmentos que tienen hasta aproximadamente 100-150 residuos de aminoácidos mediante síntesis in vitro. Aunque la siguiente discusión se refiere en parte a LHR, se aplica con el mismo efecto a cualquier pareja de unión al ligando en la medida en que sea aplicable a la estructura o la función de la misma.

Las variantes de la secuencia de aminoácidos de la LHR son variantes predeterminadas que no se encuentran en la naturaleza o alelos naturales. Habitualmente, las variantes de LHR muestran la misma actividad biológica cualitativa - por ejemplo, la actividad de unión a ligando- que los análogos HuLHR o MLHR naturales. No obstante, las variantes de LHR y derivados que no son capaces de unirse a sus ligandos son útiles, sin embargo, (a) como reactivo en ensayos diagnósticos para la LHR o anticuerpos de la LHR, (b) cuando se insolubiliza de acuerdo con los procedimientos conocidos, como agentes para purificar los anticuerpos anti-LHR de los antisueros o del sobrenadante de cultivo de hibridoma, y (c) como inmunógenos para aumentar los anticuerpos para la LHR o como componentes de un kit de inmunoensayo (marcados, como un reactivo competitivo para la LHR nativa o sin marcar como un patrón para el ensayo de LHR), siempre y cuando por lo menos quede un epítopo de LHR activo.

Aunque el sitio para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, con el objetivo de optimizar la realización de la mutación en un sitio determinado, se realiza una mutagénesis aleatoria o de saturación (en la que se insertan los 20 residuos posibles) en el codón diana y se criba la variante de LHR expresada para la combinación óptima de actividades deseadas. Dicho cribado está dentro de la práctica habitual en la materia.

Las inserciones de aminoácidos normalmente serán del orden de aproximadamente de 1 a 10 residuos de aminoácidos; las sustituciones se introducen normalmente por residuos individuales; y las eliminaciones variarán entre aproximadamente de 1 y 30 residuos. Las eliminaciones o las inserciones se realizan preferiblemente en pares contiguos, es decir, una eliminación de 2 residuos o una inserción de 2 residuos. A partir de la siguiente descripción será completamente obvio que las sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas se introducen o se combinan para llegar a una construcción final.

Las variantes de secuencia de aminoácidos por inserción de la LHR son aquellas en las que uno o más residuos de aminoácidos externos a LHR se introducen en un sitio predeterminado en la LHR diana y que reemplazan los residuos preexistentes.

Habitualmente, las variantes por inserción son fusiones de proteínas o polipéptidos heterólogos al extremo amino o carboxilo de la LHR. A dichas variantes se hace referencia como fusiones de la LHR y un polipéptido que contiene una secuencia que es diferente de la que normalmente se encuentra en la LHR en la posición insertada. En la presente invención se contemplan diversos grupos de fusión.

Las fusiones deseables de la pareja de unión, que también pueden ser o no inmunológicamente activas, incluyen fusiones de la secuencia de la pareja de unión madura con una secuencia señal heteróloga a la pareja de unión.

En el caso de la LHR, y cuando se desee con otras proteínas de unión seleccionadas, se emplean fusiones de secuencia señal con la finalidad de dirigir más rápidamente la secreción de la LHR. La señal heteróloga reemplaza la señal de la LHR nativa, y cuando se reconoce la fusión resultante, es decir, es procesada y dividida por la célula huésped, se secreta la LHR. Las señales se seleccionan en base a la célula huésped prevista, y puede incluir secuencias de bacterias, levadura, mamífero y virales. La señal LHR nativa o la señal de glicoproteína gD de herpes es adecuada para utilizarse en sistemas de expresión de mamíferos.

Las variantes por sustitución son aquellas en las que se ha eliminado por lo menos un residuo en la secuencia de la Fig. 1 o 2 y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Generalmente tales sustituciones se realizan de acuerdo con la siguiente Tabla 1 cuando se desea modular con precisión las características de la LHR.

TABLA 1

3

Las secuencias de aminoácidos novedosas, así como análogos isostéricos (aminoácidos u otro tipo), se incluyen dentro del ámbito de esta invención.

Se realizan cambios sustanciales en la función o la identidad inmunológica mediante la selección de sustituciones que son menos conservativas que aquellas de la Tabla 1, es decir, seleccionando residuos que se diferencian más significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan los mayores cambios en las propiedades de la LHR serán aquellas en las que (a) un residuo hidrofílico, por ejemplo serilo o treonilo, se sustituye para (o por) un residuo hidrofóbico, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o una prolina se sustituye para (o por) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo lisilo, arginilo, o histidilo, se sustituye para (o por) un residuo electronegativo, por ejemplos glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina; se sustituye para (o por) uno que no tenga una cadena lateral, por ejemplo, glicina.

Algunas eliminaciones, inserciones y sustituciones no producirán cambios radicales en las características de la molécula de LHR. No obstante, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, la eliminación, o la inserción por adelantado, por ejemplo cuando se modifica el dominio de unión de carbohidrato de la LHR o un epítopo inmune, un experto en la materia entenderá que el efecto se evaluará mediante ensayos de cribado rutinarios. Por ejemplo, una variante se produce habitualmente mediante la mutagénesis específica de sitio del ácido nucleico codificante de LHR, la expresión del ácido nucleico variante en el cultivo celular recombinante y, opcionalmente, la purificación a partir del cultivo celular, por ejemplo, mediante adsorción por inmunoafinidad en una columna anti-LHR policlonal (con el objetivo de adsorber la variante mediante por lo menos un epítopo inmune restante). A continuación, se criba la actividad del lisado celular o la variante de LHR purificada en un ensayo de cribado adecuado para la característica deseada. Por ejemplo, se mide un cambio en el carácter inmunológico de la LHR, como la afinidad para un anticuerpo determinado como el Mel-14, mediante un inmunoensayo de tipo competitivo. Cuanto más se sepa sobre las funciones in vivo de la LHR otros ensayos serán útiles en dicho cribado. Se ensayan modificaciones de propiedades proteicas tales como la estabilidad redox o térmica, la hidrofobicidad, la susceptibilidad a la degradación proteolítica, o la tendencia a agregarse con portadores o en multímeros mediante procedimientos bien conocidos por el experto.

Las variantes por sustitución de la LHR también incluyen variantes donde los dominios funcionalmente homólogos de otras proteínas se sustituyen mediante procedimientos rutinarios por uno o más de los dominios de la LHR identificados anteriormente. Cuando la variante es un fragmento de un dominio concreto de la LHR, preferiblemente, pero no necesariamente, tiene por lo menos un \sim70% de homología con el dominio de LHR correspondiente tal y como se define en la presente invención. Las Figuras 6A-6C pueden ser utilizadas por los expertos en la materia para las fuentes de dichos dominios sustituibles. Por ejemplo, la lectina de la mosca de la carne cuya secuencia se muestra en la Figura 6A puede modificarse para alcanzar un nivel de por lo menos un \sim70% de homología con el dominio de unión de carbohidrato de la LHR, y a continuación sustituirse por ese dominio. De forma similar, el Factor X de coagulación, cuya secuencia se muestra en la Figura 6B puede modificarse para alcanzar un nivel de por lo menos un \sim70% de homología con el dominio egf de la LHR, y a continuación sustituirse por ese dominio. De manera deseable, pueden realizarse sustituciones similares para la secuencia señal, el dominio de unión de complemento, el dominio transmembrana, y para el dominio citoplasmático.

Otra clase de variantes de LHR son las variantes por eliminación. Las eliminaciones se caracterizan por la eliminación de uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de la LHR. Habitualmente, se suprimen los dominios transmembrana y citoplasmáticos, o sólo los dominios citoplasmáticos de la LHR. No obstante, es adecuada la eliminación desde el C-terminal de la LHR hasta cualquier otro sitio N-terminal adecuado en la región transmembrana que conserva la actividad biológica o la reactividad cruzada inmune de la LHR. Se excluyes del ámbito de las variantes por eliminación los fragmentos de digestión proteica obtenidas hasta este momento en el transcurso de la elucidación de las secuencias de aminoácidos de la LHR, y los fragmentos de proteína que tienen menos de un \sim70% de homología de secuencia con cualquiera de los dominios de la LHR identificados anteriormente.

Las fusiones de inmunoglobulina pueden realizarse con fragmentos de la LHR, tales como el dominio de unión de complemento, el dominio de carbohidrato, y el dominio del factor de crecimiento epidérmico. La fusión de dominio de unión de complemento es útil en el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades mediadas por complemento, así como en la oligomerización de la fusión con la LHR o con otros componentes en la superficie del linfocito.

También pueden ser deseables eliminaciones de cisteína u otros residuos lábiles, por ejemplo, en el incremento de la estabilidad oxidativa de la LHR. La eliminación o las sustituciones de sitios de proteólisis potenciales, por ejemplo Arg Arg, se realiza mediante la eliminación de uno de los residuos básicos o sustituyendo uno por residuos de glutaminilo o histidilo.

En una realización, la LHR está comprendida del dominio de unión de carbohidrato en ausencia de un dominio de unión de complemento y/o el dominio egf. Esta realización puede contener o no alguna de las regiones transmembrana y citoplasmástica o ambas.

Una clase preferente de variantes por sustitución o por eliminación son aquellas que implican una región transmembrana de la LHR. Las regiones transmembrana de las subunidades de LHR son dominios altamente hidrofóbicos o lipofílicos que son del tamaño apropiado para abarcar la bicapa lipídica de la membrana celular. Se cree que sujetan la LHR en la membrana de la célula, y permiten la formación del complejo homo- o heteropolimérico con la LHR.

La inactivación del dominio transmembrana de la LHR y cualquier otra pareja de unión en la que esté una variante presente, habitualmente mediante la eliminación o la sustitución de residuos de hidroxilación del dominio transmembrana, facilitarán la recuperación y la formulación mediante la reducción de su afinidad por lípidos celulares o de membrana y el aumento de su solubilidad acuosa. Si se eliminan los dominios transmembrana y citoplasmático se evita la introducción de epítopos potencialmente inmunogénicos, ya sea mediante la exposición de otros polipéptidos intracelulares que podrían ser reconocidos como extraños por el cuerpo o mediante la inserción de polipéptidos heterólogos que son potencialmente inmunogénicos. La inactivación de la función de unión de membrana se realiza mediante la eliminación de los residuos suficientes para producir un perfil de hidropatía sustancialmente hidrofílico en este sitio o mediante la sustitución con residuos heterólogos que logran el mismo resultado.

Una ventaja principal de la LHR inactivada de membrana es que puede secretarse en el medio de cultivo de huéspedes recombinantes. Esta variante es soluble en fluidos corporales tales como la sangre y no tiene una afinidad apreciable por los lípidos de la membrana celular, de este modo simplificando considerablemente su recuperación del cultivo celular recombinante.

Como propuesta general, no todas las variantes tendrán un dominio transmembrana funcional y preferiblemente no tendrán una secuencia citoplasmática funcional.

Por ejemplo, el dominio transmembrana puede sustituirse por cualquier secuencia de aminoácidos, por ejemplo una secuencia aleatoria o predeterminada de aproximadamente 5 a 50 residuos de serina, treonina, lisina, arginina, glutamina, ácido aspártico y de tipo hidrofílico, los cuales todos juntos muestran un perfil hidropático hidrofílico. Al igual que la LHR (truncada) por eliminación, estas variantes se secretan en el medio de cultivo de huéspedes recombinantes.

En la tabla siguiente se describen ejemplos de variantes de secuencia de aminoácidos de HuLHR. El residuo que sigue al número de residuo indica los aminoácidos de sustitución o insertados.

TABLA 2

4

5

Preferiblemente, las variantes representan sustituciones conservativas. Se entenderá que algunas variantes pueden mostrar una actividad biológica reducida o ausente. Estas variantes sin embargo son útiles como patrones en inmunoensayos para la LHR, siempre y cuando mantengan por lo menos un epítopo inmune de la LHR.

Se incluyen variantes de glicosilación dentro del ámbito de la HuLHR. Éstas incluyen variantes que carecen completamente de glicosilación (no glicosilada) y variantes que tienen por lo menos un sitio glicosilado menos que la forma nativa (desglicosilada), así como variantes en las que se ha cambiado la glicosilación. Se incluyen las variantes de secuencia de aminoácidos desglicosiladas y no glicosiladas, LHR desglicosilada y no glicosilada que tiene la secuencia de aminoácidos no modificada nativa de la LHR, y otras variantes de glicosilación. Por ejemplo, se utiliza mutagénesis por sustitución o eliminación para eliminar los sitios de glicosilación unidos a N u O de la LHR, como por ejemplo, se elimina o se sustituye el residuo de asparagina por otro residuo básico tal como la lisina o la histidina. Como alternativa, se sustituyen o se eliminan los residuos flanqueantes que forman el sitio de glicosilación, aún cuando los residuos de asparagina permanecen inalterados, con el objetivo de evitar la glicosilación mediante la eliminación del sitio de reconocimiento de glicosilación.

Adicionalmente, se produce la LHR no glicosilada que tiene la secuencia de aminoácidos de la LHR nativa en un cultivo celular procariota recombinante, ya que las procariotas son incapaces de introducir la glicosilación en los polipéptidos.

Las variantes de glicosilación se producen mediante la selección de células huésped apropiadas o mediante procedimientos in vitro. La levadura, por ejemplo, introduce una glicosilación que varía significativamente de la de los sistemas mamíferos. De modo similar, se criban de forma rutinaria células de mamífero que tienen un origen de especie diferente (por ejemplo, hámster, murino, insecto, porcino, bovino u ovino) u origen tisular diferente (por ejemplo pulmón, hígado, linfoide, mesenquimal o epidérmico) que la fuente de la LHR, por la capacidad de introducir glicosilación variante tal como se caracteriza, por ejemplo, mediante niveles elevados de manosa o proporciones variantes de manosa, mucosa, ácido siálico y otros azúcares que se hallan habitualmente en glicoproteínas de mamífero. El procesamiento in vitro de la LHR se realiza habitualmente mediante hidrólisis enzimática, por ejemplo, digestión con neuraminidasa.

Se incluyen dentro del ámbito de la presente invención las modificaciones covalentes de la molécula de LHR. Dichas modificaciones se introducen haciendo reaccionar los residuos de aminoácidos diana de la proteína recuperada con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o con los residuos terminales, o aprovechando los mecanismos de modificación post-traduccional que funcionan en células huésped recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en programas dirigidos a identificar residuos importantes para la actividad biológica, para inmunoensayos de la LHR o para la preparación de anticuerpos anti-LHR para la purificación por inmunoafinidad de la LHR recombinante. Por ejemplo, la inactivación completa de la actividad biológica de la proteína después de la reacción con ninhidrina sugeriría que por lo menos un residuo arginilo o lisilo es crítico para su actividad, donde los residuos individuales que se modificaron en las condiciones seleccionadas se identifican mediante el aislamiento de un fragmento de péptido que contiene el residuo de aminoácidos modificado. Dicha modificaciones son de práctica habitual en la materia y se realizan sin una gran experimentación.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil en la preparación de agregados intermoleculares de la inmunoglobulina híbrida con polipéptidos, así como para la unión de la inmunoglobulina híbrida a una matriz o superficie soporte insoluble en agua para utilizar en el ensayo, o para la purificación por afinidad de sus ligandos. Además, un estudio de las uniones intracatenarias proporcionará información directa sobre la conformación estructural. Los agentes de unión incluyen el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo los ésteres con el ácido 4-azidosalicílico, los imidoésteres homobi-funcionales incluyendo los ésteres de disuccinimidil como el 3,3'-ditiobis (succinimidil-propionato), y las maleimidas bifuncionales como el bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivatizantes como el metil-3-[(p-azido-fenil)ditio] propiomidato rinden intermediarios fotoactivables que son capaces de formar uniones en presencia de luz. Alternativamente, matrices insolubles en agua y reactivas como los carbohidratos activados por bromuro de cianógeno y los sistemas que reaccionan en presencia de sustratos descritos en las patentes americanas U.S. 3.959.080; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635; y 4.330.440 se utilizan para la inmovilización y la unión de proteínas.

Ciertas derivatizaciones post-traduccionales son el resultado de la acción de células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos de glutaminil y asparaginil son frecuentemente desamidados post-traduccionalmente en los residuos glutamil y aspartil correspondiente. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente acídicas. Cualquier forma de estos residuos se halla dentro del ámbito de la presente invención.

Otras modificaciones post-traduccionales incluyen la hidroxilación de residuos de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de seril o treonil, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco pág. 79-86 [1983], la acetilación de la amina del extremo N-terminal, y en algunos casos, la amidación del carboxilo del extremo C-terminal.

Otros derivados comprenden los polipéptidos nuevos de la presente invención unidos covalentemente a un polímero no proteico. El polímero no proteico es generalmente un polímero sintético hidrofílico, es decir, un polímero que no se halla en la naturaleza. Sin embargo, los polímeros que existen en la naturaleza y que son producidos mediante procedimientos recombinantes o in vitro son también útiles, como lo son los polímeros aislados de la naturaleza. Se hallan dentro del ámbito de la presente invención los polímeros de polivinil hidrofílicos, por ejemplo, el polivinilalcohol y la polivinilpirrolidona. De especial utilidad son los ésteres de polialquileno como el polietilén glicol, el polipropilén glicol, los ésteres de polioxietileno o metoxi polietilén glicol; los polioxialquilenos como el polioxietilén, el polioxipropilén y copolímeros en bloque de polioxietilén y polioxipropilén (Pluronics); los polimetacrilatos; los carbamatos; polisacáridos ramificados o no que comprenden los monómeros de azúcares como la D-manosa, la D- y L-galactosa, la fucosa, la fructosa, la D-xilosa, la L-arabinosa, el ácido D-glucurónico, el ácido siálico, el ácido D-galacturónico, el ácido D-manurónico (por ejemplo, el ácido polimanurónico, o el ácido algínico), la D-glucosamina, la D-galactosamina, la D-glucosa y el ácido D-neuramínico incluyendo los homopolisacáridos y heteropolisacáridos como la lactosa, la amilopectina, el almidón, el hidroexitil almidón, la amilosa, el sulfato de dextrano, el dextrano, las dextrinas, el glucógeno, o la subunidad de polisacáridos de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo, el ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar como el polisorbitol y el polimanitol; y la heparina o el heparón.

Si el polisacárido es la glicosilación nativa o la glicosilación que se espera de la expresión recombinante, entonces el sitio de sustitución puede localizarse en un sitio distinto al sitio de N- u O-glicosilación nativa, en donde se haya introducido un sitio de N- u O-glicosilación adicional o sustitutivo en la molécula. Se pueden utilizar mezclas de tales polímeros, o el polímero puede ser homogéneo. Antes de la unión, no es necesario que el polímero sea soluble en agua, aunque es preferible, en cambio, que el conjugado final sí lo sea. Además, el polímero no debería ser altamente inmunogénico en la forma conjugada, ni debería presentar viscosidad, lo que es incompatible con la infusión o inyección intravenosa si se pretende administrar por dichas vías.

De forma preferente, el polímero sólo contiene un grupo reactivo. Esto ayuda a evitar la unión cruzada de moléculas proteicas. Sin embargo, se halla dentro del ámbito de la presente invención el optimizar las condiciones de reacción para reducir la unión cruzada, o para purificar los productos de reacción a través de filtración en gel o criba cromatográfica para recuperar los derivados esencialmente homogéneos.

El peso molecular del polímero se hallará de forma deseable en el margen de unos 100 a 500.000, y preferentemente de unos 1.000 a 20.000. El peso molecular elegido dependerá de la naturaleza del polímero y del grado de sustitución. En general, cuanto mayor es la hidrofilicidad del polímero mayor es el grado de sustitución y menor el peso molecular que se puede utilizar. Los pesos moleculares óptimos se determinarán mediante experimentación de rutina.

Generalmente, el polímero está unido covalentemente a la inmunoglobulina híbrida mediante un agente de unión multifuncional que reacciona con el polímero y con uno o más residuos aminoacídicos o de azúcares del híbrido. Sin embargo, se halla dentro del ámbito de la presente invención el unir de forma directa el polímero haciendo reaccionar un polímero derivatizado con el híbrido o viceversa.

El sitio de unión covalente en la inmunoglobulina híbrida incluye los grupos amino y épsilon amino del extremo N-terminal que se hallan en los residuos de lisina, así como otros grupos amino, imino, carboxil, sulfidril, hidroxil u otros grupos hidrofílicos. El polímero puede unirse de forma covalente directamente al híbrido sin utilizar un agente de unión multifuncional (generalmente bifuncional). La unión covalente con los grupos amino se logra mediante reacciones químicas conocidas basadas en cloruro cianúrico, diimidazol carbonil, grupos reactivos de aldehídos (PEG alcóxido más dietil acetal de bromoacetaldehído; PEG más DMSO y anhídrido acético, o PEG cloruro más fenóxido de 4-hidroxibenzaldehído, ésteres activos de succinimidil, PEG activado por ditiocarbonato, PEG activado por 2,4,5-triclofenilcloroformato o p-nitrofenilcloroformato). Los grupos carboxilo se derivatizan mediante conjugación de PEG-amina utilizando carbodiimida.

Los polímeros se conjugan con grupos de oligosacáridos mediante oxidación utilizando reactivos químicos, por ejemplo, metaperyodato, o enzimas, por ejemplo, glucosa o galactosa oxidasa, (produciendo cualquiera de ellos el derivado aldehído del carbohidrato), seguido de la reacción con hidrazida o polímeros amino-derivatizados, de la misma manera que se describe por Heitzmann et al., P.N.A.S., 71:3537-3541 (1974) o Bayer et al., Methods in Enzymology, 62:310 (1979), para el marcaje de los oligosacáridos con biotina o avidina. Además, son también adecuados otros procedimientos químicos o enzimáticos que se han utilizado anteriormente para unir oligosacáridos y polímeros. Los oligosacáridos sustituidos son particularmente ventajosos porque, en general, hay menos sitios de sustitución que en los aminoácidos para la derivatización, y por ello los productos de oligosacáridos son más homogéneos. También, se modifica opcionalmente los sustituyentes de oligosacáridos mediante digestión enzimática para eliminar los azúcares, por ejemplo, mediante digestión por neuraminidasa, antes de la derivatización del polímero.

El polímero llevará un grupo que reacciona directamente con la cadena lateral del aminoácido, o el extremo N- o C-terminal del polipéptido, o que reacciona con el agente de unión multifuncional. En general, los polímeros que llevan tales grupos reactivos son bien conocidos en la preparación de proteínas inmovilizadas. Con el fin de emplear tales reacciones químicas, se debería utilizar un polímero soluble en agua o derivatizado de la misma forma que los polímeros insolubles utilizados anteriormente para la inmovilización de proteínas. La activación por bromuro de cianógeno es un procedimiento de particular utilidad para utilizar en la unión de polisacáridos.

"Soluble en agua" en relación con el polímero inicial quiere decir que el polímero o su intermediario reactivo utilizado para la conjugación es suficientemente soluble en agua como para participar en la reacción de derivatización.

"Soluble en agua" en relación con el conjugado de polímeros quiere decir que el conjugado es soluble en fluidos fisiológicos como la sangre.

El grado de sustitución de un tal polímero variará dependiendo del número de sitios reactivos en la proteína, si se utiliza toda la proteína o un fragmento de ella, si la proteína es una fusión con una proteína heteróloga, del peso molecular, de las características hidrofílicas y otras características del polímero y de los sitios elegidos para la derivatización de la proteína en particular. En general, el conjugado contiene aproximadamente de 1 a 10 moléculas de polímero, mientras que cualquier secuencia heteróloga puede sustituirse con un número esencialmente ilimitado de moléculas de polímero siempre y cuando la actividad deseada no se vea afectada negativamente de forma significativa. El grado óptimo de unión se puede determinar fácilmente con ayuda de una matriz experimental y haciendo variar las condiciones de tiempo, temperatura y otras condiciones de la reacción para cambiar el grado de sustitución, después de lo cual se determina la capacidad de los conjugados para funcionar en la forma deseada.

El polímero, por ejemplo PEG, se une mediante muy diversos procedimientos conocidos per se para lograr la modificación covalente de proteínas con polímeros no proteicos como el PEG. Sin embargo, algunos de estos procedimientos no son adecuados para los actuales propósitos. La química del cloruro cianúrico conduce a muchas reacciones secundarias, incluyendo la unión de proteínas. Además, es muy probable que conduzca a la inactivación de proteínas que contienen grupos sulfidrilo. La química del carbonil diimidazol (Beauchamp et al., Anal. Biochem., 131:25-33 [1983]) requiere un pH elevado (>8,5), que puede inactivar proteínas. Además, ya que el intermediario de "PEG activado" puede reaccionar con agua, se necesita un gran exceso molar de "PEG activado" en relación a la proteína. La elevada concentración de PEG que se necesita para la química del carbonil diimidazol también conlleva a problemas con la purificación, por lo que tanto la cromatografía de filtración en gel como la cromatografía de interacción hidrofóbica se ven negativamente afectadas. Además, la elevada concentración de "PEG activado" puede precipitar la proteína, un problema que ya se había observado anteriormente (Davis, patente americana U.S. 4.179.337). Por otra parte, la química del aldehído (Royer, patente americana U.S. 4.002.531) es más eficiente ya que solamente requiere un exceso molar de 40 veces de PEG y de 1-2 h de incubación. Sin embargo, el dióxido de manganeso sugerido por Royer para la preparación del aldehído de PEG es problemático "debido a la tendencia pronunciada del PEG de formar complejos con agentes oxidantes con base de elementos metálicos" (Harris et al., J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed. 22:341-352 [1984]). La utilización de la oxidación de moffatt, con DMSO y anhídrido acético, solventa este problema. Además, el borohidrato de sodio sugerido por Royer debe utilizarse a un pH alto y tiene una tendencia significativa para reducir enlaces disulfuro. En cambio, es preferible el cianoborohidruro de sodio, que es efectivo a un pH neutro y tiene una leve tendencia a reducir los enlaces disulfuro.

Los conjugados de la presente invención se separan de los materiales iniciales que no han reaccionado mediante filtración en gel. De la misma manera, las especies heterólogas de los conjugados se purifican una de otra.

El polímero también puede ser insoluble en agua, como un gel hidrofílico o un artículo de determinada forma como un tubo quirúrgico en la forma de un catéter o un conducto de drenaje.

El ADN codificante de la LHR y de otras parejas de unión al ligando se sintetiza mediante procedimientos in vitro o se obtiene fácilmente a partir de bibliotecas de ADNc de linfocito. Los medios para la creación sintética del ADN codificante de la LHR, ya sea manualmente o con un aparato automático, son en general conocidos por un experto en la materia, particularmente en vista de las enseñanzas contenidas en la presenta invención. Como ejemplos del estado actual de la técnica relativa a la síntesis de polinucleótidos, debe dirigirse a Maniatis et al. Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1984), y Horvath et al. An Automated DNA Synthesizer Employing Deoxynucleoside 3'-Phosphoramidites, Methods in Enzymology 154: 313-326, 1987.

Como alternativa, para obtener el ADN codificante de la LHR a partir de fuentes diferentes de murina o humana, dado que se proporciona la secuencia de ADN completa para la realización preferida de la HuLHR (Figura 1) y de la MLHR (Figura 2), sólo se necesita realizar el cribado de hibridación con ADN marcado codificante de HuLHR o MLHR o fragmentos de los mismos (normalmente, mayores de aproximadamente 20, y habitualmente de aproximadamente 50 pb) con el objetivo de detectar clones que contienen secuencias homólogas en las bibliotecas de ADNc derivadas de los linfocitos del animal concreto, seguido del análisis de los clones mediante un análisis con enzimas de restricción y la secuenciación de ácidos nucleicos para identificar clones de longitud completa. Si los clones de longitud completa no están presentes en la biblioteca, entonces se recuperan fragmentos apropiados a partir de los diversos clones y se ligan en los sitios de restricción comunes a los fragmentos para ensamblar un clon de longitud completa. El ADN codificante de la LHR de otra especie animal se obtiene mediante el sondeo de bibliotecas de dichas especies con las secuencias humanas o murinas, o mediante la síntesis del ADN in vitro de los genes para otras parejas de unión que tienen secuencia conocida que puede obtenerse con el uso de procedimientos de hibridación rutinarios análogos.

En la presente invención se proporcionan secuencias de ácido nucleico que se hibridan bajo condiciones astringentes a un fragmento de la secuencia de ADN en la Figura 1 o la Figura 2, cuyo fragmento tiene aproximadamente 10 pb, preferiblemente 20-50 pb e incluso más de 100 pb. También se incluyen en el alcance de la presente invención secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones astringentes a un fragmento de la LHR diferente de los dominios señal, transmembrana o citoplasmáticos.

Dentro del alcance de la presente invención también se incluyen las sondas de ácido nucleico que son capaces de hibridarse bajo condiciones astringentes al ADNc de la LHR o al gen genómico para la LHR (incluyendo intrones y las regiones flanqueantes de 5' o 3' que se extienden hasta los genes adyacentes o aproximadamente 5.000 pb, lo que sea mayor).

La identificación del ADN genómico para la LHR u otra pareja de unión es una cuestión sencilla de sondeo de una biblioteca genómica concreta con el ADNc o sus fragmentos que han sido marcados con un grupo detectable, como por ejemplo radiofósforo, y la recuperación del clon o clones que contienen el gen. Si es necesario se ensambla el gen completo mediante "walking". Habitualmente, dichas sondas no codifican secuencias con menos de un 70% de homología con HuLHR o MLHR, y varían de aproximadamente 10 hasta 100 pb de longitud. Las homologías y los tamaños con respecto a otras parejas de unión pueden determinarse sin experimentación excesiva.

En general, se utilizan procariotas para clonar las secuencias de ADN en la construcción de los vectores útiles en la presente invención. Por ejemplo, la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC Nº 31446) es particularmente útil. Otras cepas microbianas que pueden utilizarse incluyen el E. coli B y el E. coli X1776 (ATCC Nº 31537). Estos ejemplos son más ilustrativos que limitantes. Como alternativa, son adecuados los procedimientos in vitro de clonación, por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa.

Los polipéptidos de la presente invención se expresan directamente en un cultivo celular recombinante como un análogo del metionilo N-terminal, o como una fusión con un polipéptido heterólogo al híbrido/parte, preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de división específico en el extremo N terminal del híbrido/parte. Por ejemplo, en la construcción de un vector de expresión secretor procariota para la LHR, se emplea la señal de LHR nativa con huéspedes que reconocen esa señal. Cuando el líder secretor es "reconocido" por el huésped, la peptidasa señal del huésped es capaz de dividir la fusión del polipéptido líder fusionado en su extremo C-terminal a la LHR madura deseada. Para huéspedes procariotas que no procesan la señal de LHR, se sustituye la señal por una señal procariota seleccionada por ejemplo del grupo de los líderes de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp o la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras la señal de LHR humana puede sustituirse por los líderes de la invertasa de levadura, el factor alfa o la fosfatasa ácida. En la expresión celular de mamíferos la secuencia nativa es satisfactoria para la LHR de mamífero, aunque son adecuadas otras señales de proteínas secretoras de mamífero, como lo son los líderes secretores virales, por ejemplo la señal de gD del herpes simplex.

Los nuevos polipéptidos se pueden expresar en cualquier célula huésped, pero preferentemente se sintetizan en huéspedes de mamífero. Sin embargo, también son útiles para la expresión las células huésped de procariotas, hongos, levaduras, insectos y similares. Ejemplos de procariotas son las cepas adecuadas para el clonaje como E. coli W3110 (F-'\lambda-'prototrófico, ATCC No. 27325), otras enterobacteriáceas como Serratia marcesans, bacilli y diversas pseudomonas. Preferentemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas.

Los huéspedes de expresión se transforman de forma típica con el ADN que codifica el híbrido que ha sido ligado en un vector de expresión. Tales vectores contienen generalmente un origen de replicación (aunque no es necesario si tiene lugar la integración cromosómica). Los vectores de expresión también incluyen secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en las células transformadas, como se discutirá más adelante. Por ejemplo, E. coli se transforma de forma típica utilizando un pBR322, un plásmido derivado de una especie E. coli (Bolivar, et al., Gene 2: 95 (1977)]. El pBR322 contiene genes para la resistencia a ampicilina y tetraciclina y por ello proporciona medios fáciles para la identificación de células transformadas, tanto para clonar o expresar. Los vectores de expresión también contendrán de forma óptima secuencias que son de utilidad para el control de la transcripción y la traducción, por ejemplo, secuencias promotoras y de Shine-Dalgarno (para procariotas) o promotores e incrementadores (para células de mamífero). Los promotores pueden ser, aunque no es obligatorio, inducibles; sorprendentemente, incluso promotores constitutivos poderosos como el promotor CMV de huéspedes de mamífero producen LHR sin causar toxicidad en la célula huésped. Aunque es concebible que los vectores de expresión no necesiten contener ningún elemento control de expresión, orígenes de replicación o genes de selección, su ausencia puede dificultar la identificación de los transformantes híbridos y el lograr un alto nivel de expresión de la inmunoglobulina híbrida.

Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen de manera ilustrativa los sistemas de promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa (Chang et al., "Nature", 275: 615 [1978]; y Goeddel et al., "Nature" 281: 544 [1979]), la fosfatasa alcalina, el sistema de promotores del triptófano (trp) (Goeddel "Nucleic Acids Res", 8: 4057 [1980] y EPO Appln. Publ. No. 36,776) y promotores híbridos tales como el promotor tac (H. de Boer et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 80: 21-25 [1983]). No obstante, son adecuados otros promotores bacterianos funcionales. Generalmente se conocen sus secuencias de nucleótidos, permitiendo de ese modo que un técnico los ligue operativamente al ADN codificante de la LHR (Siebenlist et al., "Cell" 20: 269 [1980]) utilizando enlazadores o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores que se usan en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada operativamente al ADN codificante de la LHR.

Además de las procariotas, son satisfactorios los microbios eucariotas como la levadura o los hongos filamentosos. El Saccharomyces cerevisae es el microorganismo eucariota que se usa más habitualmente, aunque están normalmente disponibles otras cepas. El plásmido YRp7 es un vector de expresión satisfactorio en levadura (Stinchcomb, et al. Nature 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7: 141 [1979]; Tschemper et al. Gene 10: 157 (1980)). Este plásmido ya contiene el gen trp1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo ATCC no. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12 [1977]). La presencia de la lesión de trp1 como una característica del genoma de la célula huésped de la levadura proporciona entonces un medio eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano.

Secuencias promotoras adecuadas para utilizar con huéspedes de levadura incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073 [1980]) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 [1968]; y Holland, Biochemistry 17:4900 [1978]), como la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada mediante las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas degradadoras asociadas con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras se describen con mayor detalle en R. Hitzeman et al., patente europea EP 73.73.557A.

Las secuencias control de la expresión son bien conocidas en eucariotas. En general, todos los genes eucariotas tienen una región rica en A-T localizada a aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Otra secuencia que se halla a unas 70 a 80 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción de muchos genes es la región CXCAAT donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas se halla una secuencia AATAAA que puede ser la señal de adición de la cola poliA en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan en los vectores de expresión de mamíferos.

Se obtienen fácilmente promotores adecuados para el control de la transcripción de vectores en células huésped de mamífero a partir de diversas fuentes, por ejemplo, los genomas de virus como el virus del polioma, SV40, adenovirus, MMV (inducible por esteroides), retrovirus (por ejemplo, el LTR o el VIH), el virus de la hepatitis B y más preferentemente el citomegalovirus, o a partir de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo el promotor de la beta actina. Los promotores tardío y temprano de SV40 se obtienen de forma conveniente de un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene de forma conveniente como un fragmento de restricción HindIII. Greenaway, P.J. et al., Gene 18:355-360 (1982).

La transcripción de un ADN que codifica para la inmunoglobulina híbrida y/o porciones del híbrido por eucariotas superiores se incrementa mediante la inserción de una secuencia intensificadora en el vector. Las secuencias intensificadoras son elementos de ADN que actúan en cis, generalmente de unas 10-300 pb, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Las secuencias intensificadoras tienen una orientación y posición relativamente independiente, se han hallado en 5' (Laimins, L. et al., PNAS 78:993 [1981] y en 3' (Lusky, M.L. et al., Mol. Cell. Biol. 3: 1108 [1983]) de la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji, J.L. et al., Cell 33:729 [1983]), así como también dentro de la propia secuencia codificante (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell. Biol. 4:1293 [1984]). Se conocen actualmente muchas secuencias intensificadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, se utilizará de forma característica una secuencia intensificadora de un virus de células eucariotas. Ejemplos incluyen la secuencia intensificadora de SV40 en el sitio tardío del origen de replicación (pb 100-270), la secuencia intensificadora del promotor temprano de citomegalovirus, la secuencia intensificadora del polioma en el sitio tardío del origen de replicación y las secuencias intensificadoras del adenovirus.

Los vectores de expresión que se utilizan en células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la finalización de la transcripción, que puedan afectar la expresión del mRNA. Estas regiones se transcriben como segmentos poliadenilados en la parte no traducida del mRNA que codifica la inmunoglobulina híbrida. Las regiones 3' no traducidas también incluyen los sitios de finalización de la transcripción.

Los vectores de expresión pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Ejemplos de marcadores seleccionables de células de mamífero son la dihidrofolato reductasa (DHFR), la timidina quinasa (TK) o la neomicina. Cuando tales marcadores seleccionables se transfieren con éxito a la célula huésped de mamífero, ésta es capaz de sobrevivir si se la coloca bajo presión selectiva. Existen dos categorías distintas ampliamente utilizadas de regímenes de selección. La primera categoría se basa en el metabolismo de las células y en la utilización de una línea celular mutante que carece de la capacidad de crecer de forma independiente de un medio suplementado. Dos ejemplos son las células CHO DHFR- y las células de ratón LTK-. Estas células carecen de la capacidad de crecer sin la adición de nutrientes como timidina o hipoxantina. Debido a que estas células carecen de ciertos genes necesarios para una vía de síntesis de ácidos nucleicos completa, no pueden sobrevivir si no se les proporciona el nucleótido carente en un medio suplementado. Una alternativa al medio suplementado es introducir un gen DHFR o TK intacto en las células carentes de los respectivos genes, alterando así sus requerimientos de crecimiento. Las células individuales que no fueron transformadas con el gen DHFR o el TK no serán entonces capaces de sobrevivir en un medio no suplementado.

La segunda categoría de regímenes selectivos es la selección dominante que hace referencia a un esquema de selección utilizado con cualquier tipo de células y no requiere la utilización de una línea celular mutante. Estos esquemas utilizan típicamente un fármaco para parar el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transformen con éxito con un gen heterólogo expresan una proteína que les confiere resistencia al fármaco y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominante utilizan los fármacos neomicina (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan et al., Science 209:1422 (1980)) o higromicina (Sudgen et al., Mol. Cell. Biol. 5:410-413 (1985)). Los tres ejemplos dados anteriormente utilizan genes bacterianos bajo control eucariótico para convertir la resistencia al fármaco G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina, respectivamente.

Células huésped eucariotas adecuadas para la expresión de la inmunoglobulina híbrida incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecer en cultivo en suspensión, Graham, F.L. et al., J. Gen. Virol., 36:59 [1977]); células de riñón de bebé hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, PNAS (USA) 77:4216, [1980]); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23:243-251); células de riñón de mono (CV1ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); y células TRI (Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 [1982]).

La construcción de vectores adecuados que contienen las secuencias codificantes y control deseadas emplea las técnicas de ligación estándares. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN se cortan, se forman extremos compatibles y se religan en la forma deseada para producir los plásmidos requeridos.

En el análisis para confirmar la presencia de secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se utilizan para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31446) y se seleccionan los transformantes con éxito mediante su resistencia a ampicilina o tetraciclina, según sea el caso. Se preparan plásmidos a partir de los transformantes, y se analizan mediante restricción y/o secuenciación por el procedimiento de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam et al., Methods in Enzymology 65:499 (1980).

Se transforman las células huésped con los vectores de expresión de la presente invención y se cultivan en medio nutritivo convencional modificado según se requiera para inducir los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH y similar, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para cualquier experto en la materia.

Las células huésped referidas en esta descripción abarcan las células en cultivo in vitro así como las células dentro del animal huésped.

La "transformación" significa la introducción de ADN en un organismo de modo que el ADN sea replicable, bien como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica. Salvo que se indique lo contrario, el procedimiento utilizado aquí para la transformación de las células huésped es el procedimiento de Graham, F. y van der Eb, A., Virology 52:456-457 (1973). Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para la introducción de ADN en las células como la inyección nuclear o la fusión de protoplastos. Si se utilizan células procariotas o células que contienen una importante pared celular, el procedimiento preferido de transfección es el tratamiento con calcio utilizando cloruro cálcico tal como se describe por Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69:2110 (1972).

La "transfección" hace referencia a la introducción de ADN en una célula huésped independientemente de que se exprese cualquiera de las secuencias codificantes que contiene dicho ADN. Numerosos procedimientos de transfección son conocidos por cualquier experto en la materia, por ejemplo, CaPO_{4} y la electroporación. La transformación de células huésped es el indicio de una transfección con éxito.

El polipéptido nuevo se recupera y se purifica de los cultivos de células recombinantes mediante procedimientos conocidos, incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. Otros procedimientos de purificación conocidos utilizan carbohidratos, factor de crecimiento epidérmico o dominios de complemento inmovilizados. Además, la HPLC de fase inversa y la cromatografía que utiliza ligandos para la inmunoglobulina híbrida son útiles para la purificación del híbrido. De manera deseable, durante la purificación pueden estar presentes concentraciones bajas (aproximadamente 1-5 mM) de ion calcio. La LHR se puede purificar preferiblemente en presencia de un inhibidor de proteasa tal como PMSF.

El híbrido LHR-inmunoglobulina se utiliza terapéuticamente para competir con la unión normal de linfocitos al tejido linfoide. El híbrido es por tanto particularmente útil para el rechazo de órganos o injertos y para el tratamiento de pacientes con inflamaciones, tales como, por ejemplo, debido a la artritis reumatoide u otras enfermedades inmunes. El híbrido LHR-inmunoglobulina también es aplicable en el control de metástasis de linfoma y en el tratamiento de enfermedades en las que existe una acumulación de linfocitos.

De este modo, la selección de parejas de unión del ligando con una afinidad específica por tejidos concretos aumenta claramente la capacidad de liberar agentes terapéuticos que son estables, tienen vidas medias relativamente largas y son capaces de adaptarse de manera precisa sin una gran experimentación.

El nuevo polipéptido se dispone en formulaciones isotónicas estériles junto con los cofactores necesarios y se administra de forma opcional mediante métodos estándares bien conocidos en la materia. La formulación es preferentemente líquida, y es generalmente una solución salina fisiológica que contiene calcio 0,5-10 mM, tampón no fosfatado a pH 6,8-7,6, o puede ser un polvo liofilizado.

Es preferible que la ruta principal para la administración terapéutica sea la liberación intravenosa, o la liberación a través de catéter u otro conducto quirúrgico. Rutas alternativas incluyen tabletas y similares, nebulizadores disponibles comercialmente para formulaciones líquidas e inhalación de receptores liofilizados o aerosolizados. Las formulaciones líquidas se pueden utilizar después de la reconstitución de formulaciones en polvo.

El nuevo polipéptido también puede administrarse mediante microesferas, liposomas u otros sistemas de liberación de micropartículas o formulaciones de liberación sostenida colocadas en ciertos tejidos, incluyendo la sangre. Ejemplos adecuados de transportadores de liberación sostenida incluyen las matrices de polímeros semipermeables en la forma de artículos con formas determinadas, por ejemplo, supositorios, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida implantables o microcapsulares incluyen los poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919, patente europea EP 58.481), copolímeros del ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (U. Sidman et al., 1985, Biopolymers 22 (11):547-556), poli(2-hidroexietil-metacrilato) o etilén vinil acetato (R. Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-227 y R. Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105). Los liposomas que contienen la inmunoglobulina híbrida se preparan mediante procedimientos bien conocidos: patente danesa DE 3.218.121A; Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692; Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034; patentes europeas EP 36676A, EP 88046A, EP 143949A, EP 142541A; solicitud de patente japonesa 83-11808; patentes americanas U.S. 4.485.045 y 4.544.545; y UP 102.342A. Generalmente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms) en donde el contenido lipídico es superior a 30 mol.% de colesterol, la proparte seleccionada se ajusta a la tasa óptima de liberación sostenida del polipéptido.

Las preparaciones polipeptídicas de liberación sostenida se implantan o inyectan en la proximidad del sitio de inflamación o terapia, por ejemplo adyacentes a las articulaciones artríticas o a los nódulos linfáticos periféricos.

Las dosis de los nuevos polipéptidos administrados dependerán de las propiedades del híbrido utilizado, por ejemplo su actividad de unión y la vida media plasmática in vivo, la concentración del híbrido en la formulación, la ruta de administración del híbrido, el sitio y la tasa de dosificación, la tolerancia clínica del paciente implicado, la condición patológica que lo afecta y similar, así como también dependerán de la competencia del clínico.

Los polipéptidos de la presente invención, pueden administrarse solos o junto con otros agentes farmacológicos utilizados para tratar las condiciones citadas anteriormente, como antibióticos, agentes antiinflamatorios y agentes antitumorales. También puede ser útil administrar el polipéptido junto con otras proteínas terapéuticas como el interferón gamma y otros inmunomoduladores.

Con el fin de facilitar la comprensión de los ejemplos siguientes se describirán algunos procedimientos y/o términos utilizados corrientemente.

Los "plásmidos" se denominan mediante una p en minúscula precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos iniciales de la presente invención están disponibles comercialmente, disponibles al público sin restricciones, o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, los plásmidos equivalentes a los descritos son conocidos en la materia y serán evidentes para cualquier experto en la materia.

En particular, es preferible que estos plásmidos tengan todas o alguna de las características siguientes: (1) contener un número mínimo de secuencias del organismo huésped; (2) ser estables en el huésped deseado; (3) ser capaces de estar presente en un número elevado de copias en el huésped deseado; (4) tener un promotor regulable; y (5) tener al menos una secuencia de ADN que codifica una característica seleccionable presente en una parte del plásmido separada del lugar donde se insertará la secuencia de ADN nueva. La alteración de plásmidos para alcanzar los criterios anteriores se realiza fácilmente por aquellos expertos en la materia a la luz de la literatura disponible y de las enseñanzas de la presente invención. Se sobreentenderá que pueden existir en la actualidad vectores de clonaje adicionales, o se descubrirán nuevos vectores que tengan las propiedades anteriormente indicadas y sean por ello adecuados para utilizar en la presente invención, por lo tanto dichos vectores se contemplan también dentro del ámbito de la presente invención.

La "digestión" de ADN hace referencia al corte catalítico del ADN con una enzima de restricción que actúa sólo en ciertas secuencias del ADN. Las diversas enzimas de restricción utilizadas aquí están disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción y otros requisitos se utilizaron como es conocido por cualquier experto en la materia. Con fines analíticos, se utiliza generalmente 1 \mug de plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en unos 20 \mul de solución tamponada. Para el propósito de aislamiento de los fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, se digiere generalmente de 5 a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un gran volumen. Las cantidades de tampón y sustrato a utilizar para cada enzima determinado se especifican por el fabricante. Los tiempos de incubación son de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones suministradas. Después de la digestión la reacción se migra directamente en una electroforesis en gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.

La separación por tamaño de los fragmentos de restricción se realiza utilizando un gel de poliacrilamida del 8 por ciento descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic. Acids Res., 8:4057 (1980).

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La "desfosforilación" hace referencia a la eliminación de los fosfatos 5' mediante el tratamiento con fosfatasa alcalina bacteriana (BAP). Este procedimiento evita que los dos extremos digeridos por restricción de un fragmento de ADN se "recircularicen" o formen un bucle cerrado que impida la inserción de otro fragmento de ADN en el sitio de restricción. Los procedimientos y reactivos para la desfosforilación son convencionales. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning pág. 113-134 (1982). Las reacciones que utilizan BAP se llevan a cabo en Tris 50 mM a 68ºC para suprimir la actividad de cualquier exonucleasa que esté presente en las preparaciones enzimáticas. Las reacciones se llevan a cabo durante 1 hora. Después de la reacción, el ADN se migra en una electroforesis en gel y se purifica del gel.

Los "oligonucleótidos" hacen referencia a un polidesoxinucleótido de cadena sencilla o a dos cadenas de polidesoxinucleótidos complementarias que pueden sintetizarse químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato 5' y por lo tanto no se ligarán con otro oligonucleótido sin la adición de un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no se ha desfosforilado.

La "ligación" hace referencia a la formación de enlaces fosfodiésteres entre fragmentos de ácido nucleico de doble cadena (Maniatis, T. et al., Id. pág. 146). Salvo que se especifique lo contrario, la ligación se realiza utilizando tampones y condiciones conocidas con 10 unidades de T4 ADN ligasa ("ligasa") por cada 0,5 \mug de cantidades equimolares aproximadamente de los fragmentos de ADN a ligar.

El "relleno" o "formación de extremos romos" hace referencia a procedimientos mediante los cuales el extremo de cadena sencilla en un extremo protuberante de un ácido nucleico digerido con una enzima de restricción se convierte en una cadena doble. Esto elimina los extremos protuberantes y forma extremos romos. Este proceso es una herramienta versátil para convertir un extremo de corte de restricción que puede ser protuberante con los extremos creados por sólo una o unas pocas enzimas de restricción en un extremo compatible con cualquier endonucleasa de restricción que produce extremos romos u otro extremo protuberante rellenado. Típicamente, la formación de extremos romos se logra mediante incubación de 2-15 \mug del ADN diana en tampón de MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 50 mM, Tris 10 mM (pH 7,5) a aproximadamente 37ºC en presencia de 8 unidades de fragmento Klenow de la ADN polimerasa I y 250 \muM de cada uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato. La incubación se finaliza generalmente al cabo de 30 min y se realiza una extracción con fenol y cloroformo y una precipitación con etanol.

Actualmente se piensa que la estructura tridimensional de las composiciones de la presente invención es importante para su funcionamiento tal como se ha descrito aquí. Por ello, todos los análogos estructurales relacionados que mimeticen la estructura activa de los formados por las composiciones reivindicadas aquí se incluyen específicamente dentro del ámbito de la presente invención.

Se entiende que la aplicación de las enseñanzas de la presente invención a un problema o situación específico se hallará dentro de las capacidades de cualquier experto en la materia a la luz de las enseñanzas aquí contenidas. Procesos representativos para el aislamiento, utilización y fabricación de moléculas de inmunoglobulina-LHR híbridas aparecen más adelante, y son ilustrativos de la invención aunque se refieren al receptor de localización de linfocitos.

Ejemplos

Todas las referencias en estos ejemplos al anticuerpo monoclonal "Mel 14" o a "Mel 14" se refiere a un anticuerpo monoclonal dirigido contra una forma presuntamente murina de una proteína de superficie de linfocito, descrita por Gallatin et al. supra Nature 303, 30 (1983). Sin embargo, el uso de Mel 14 no es necesario para realizar la presente invención debido a la disposición en la presente invención de secuencias completas para el ADN y los aminoácidos de la LHR.

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Ejemplo 1 Purificación y clonaje de MLHR Aislamiento de un clon de ADNc que codifica el MLHR

La MLHR se aisló de bazos de ratón tratados con detergente mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando el anticuerpo monoclonal Mel 14.

En una preparación típica, se trocearon 300 bazos de ratones hembras ICR (16 semanas) y luego se homogeneizaron con un molinillo de tejidos Potter-Elvehjem en 180 ml de TritonX-100 al 2% en PBS-Dulbecco que contenía PMSF 1 mM y aprotinina al 1%. La lisis se continuó durante 30 minutos en un agitador a 4ºC. El lisado se centrifugó sucesivamente a 2.000 g durante 5 minutos y a 40.000 g durante 30 minutos.

El sobrenadante se filtró a través de un filtro Nitex preaclarado mediante adsorción con suero de rata conjugado con Sepharose 4B activada con bromuro de cianógeno (10 ml de gel empaquetado). El suero de rata se diluyó a 1:10 para la conjugación, la cual se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se aplicó el flujo a una columna de 3 ml conjugada con anticuerpo MEL-14 a 0,5 mg por ml de Sepharose 4B. Todos los tampones de la columna contenían azida de sodio al 0,02%.

La columna se lavó con 25 ml de Triton X-100 al 2% en PBS seguido por 25 ml de CHAPS 10 mM en el mismo tampón. El antígeno se liberó mediante la adición de 10 ml de CHAPS 10 mM en glicina 100 mM, NaCl 200 mM, pH 3 y se neutralizó recogiéndolo en 1 ml de Tris-HCl pH 7,6. Después de lavar la columna con trietilamina 20 mM, NaCl 200 mM, pH 11 y reequilibrarse en CHAPS 10 mM en PBS, el antígeno neutralizado, se diluyó en 100 ml del tampón de la columna, se reaplicó a la columna y se repitieron las etapas de lavado y liberación.

La proteína purificada se concentró en un Centricon 30 (Amicon, Inc.) y se analizó mediante SDS-PAGE (acrilamida al 7,5%) con la utilización de tinción de plata para su visualización. Una purificación típica produjo de 30-40 \mug de antígeno por 300 ratones, basándose en la comparación con los estándares de orosomucoides.

En resultados no mostrados, un gel de poliacrilamida del material purificado mostró una banda difusa de migración a aproximadamente 90.000 daltons y una proteína de peso molecular superior a aproximadamente 180.000 daltons. El cociente del componente de 90.000 daltons con relación al de 180.000 daltons fue de 10:1 o superior en todas las amplias series de preparaciones. El material se visualizó mediante tinción de plata de un gel de poliacrilamida al 10%.

La degradación de Edman de fase gaseosa de la banda de 90.000 daltons dio como resultado la identificación de una secuencia N-terminal única (Figura 4A), incluyendo el aminoácido del extremo más N-terminal. Se identificaron 38 aminoácidos en el extremo N-terminal, con cuatro huecos (X) en las posiciones 1, 19, 33 y 34. La asparagina (N) en la posición 22 se dedujo de la ausencia de una señal aminoacídica en esta posición combinada con los residuos siguientes de tirosina (Y) y treonina (T), lo que dio como resultado una secuencia consenso de sitio de glicosilación (NXT/S).

La secuencia de 13 residuos que se muestra en la Figura 4A en el extremo N-terminal de 38 residuos de largo es la que se dedujo previamente por Siegelman et al., supra mediante secuenciación aminoacídica radioactiva, que muestra un alto nivel de homología (11 de 13 residuos) con la secuencia de la LHR determinada aquí.

No se obtuvo ninguna secuencia de ubquitina a partir de las tres migraciones de secuencia que se realizaron con dos preparaciones de MLHR por separado. Seguramente, esta modificación estaba ausente en los esplenocitos de ratón, o el extremo N-terminal de la ubiquitina se bloqueó durante la degradación de Edman en la LHR de esta fuente.

La secuencia de aminoácidos de la Figura 2 se comparó con secuencias conocidas en la base de datos de proteínas de Dayhoff, mediante la utilización del algoritmo de Lipman, D. et al., Science 227:1435-1441 (1981).

Los residuos que están subrayados en la Figura 4A entre los aminoácidos 7 y 15 se eligieron para producir la sonda oligonucleotídica que se muestra en la Figura 4B. Una sonda oligonucleotídica de 26-mer 32 veces redundante se diseñó a partir de estos residuos y se sintetizó en un sintetizador de oligonucleótidos Applied Biosystems. Todas las redundancias posibles se incluyeron en esta sonda, con la excepción de la prolina en posición 9, donde el codón CCC se eligió basándose en las reglas de utilización de codones de mamíferos.

El rastreo de una librería de ADNc de bazo murina, obtenida a partir de bazos diseccionados de ratones con esta sonda, dio como resultado el aislamiento de un sólo clon de ADNc que hibridaba. Se sembraron 600.000 calvas a 50.000 fagos por placa (12 placas) de una librería de ADNcs en lambda gt10 cebada con oligo-dT, de 10 bazos murinos obtenida a partir de mRNA aislados de esplenocitos murinos con 5 \mug/ml de Concanavalina A durante 6 horas. Las placas se hibridaron con la sonda oligonucleotídica de 26-mer 32 veces redundante que se muestra en la Figura 4B, en tampón de formamida al 20%, 5XSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardts 5X, sulfato de dextrano al 10% y 20 \mug/ml de esperma de salmón troceado y desnaturalizado a 42ºC durante toda la noche. Estos parámetros hacen referencia aquí a "condiciones de estringencia". Los filtros se lavaron en 1XSSC, SDS al 0,1% a 42ºC durante 2X 30 min y se autoradiografiaron a -70ºC durante toda la noche. Un clon positivo duplicado se rastreó de nuevo, se aisló en inserto EcoRI y se insertó en los vectores M13 o PUC 118/119 y se determinó la secuencia nucleotídica a partir de moldes de cadena sencilla utilizando cebadores específicos de la secuencia.

La Figura 2 muestra la secuencia de ADN completa del inserto EcoRI de 2,2 Kb contenido en este bacteriófago. El mayor marco de lectura abierto se inicia con un codon metionina en la posición 106-108. Se halló una homología con la caja Kozak alrededor de este codón metionina, lo que sugiere que probablemente este codon funcione iniciando la traducción proteica. Una secuencia proteica de 373 aminoácidos de aproximadamente 42.000 daltons de peso molecular está codificada en este marco de lectura abierto. La proteína traducida muestra una secuencia desde el residuo 40 al 76 que corresponde exactamente con la secuencia aminoacídica del extremo N-terminal determinada a partir de la MLHR aislada.

Este resultado sugiere que el extremo maduro N-terminal de la MLHR se inicia con el residuo de triptófano en la posición 39. Sin embargo, se cree que puede haber ocurrido algún proceso proteolítico del extremo N-terminal actual de la LHR durante el aislamiento de la proteína.

Un perfil de hidrofobicidad de la proteína puso de manifiesto un dominio hidrofóbico localizado en el extremo N-terminal que podría funcionar como una secuencia señal para la inserción en el lumen del retículo endoplasmático. La secuencia deducida para las posiciones 39 a 333 es predominantemente hidrofílica seguida por un dominio de 22 residuos hidrofóbico, que es característico de un dominio de parada de transferencia o de anclaje de membrana.

La región intracelular putativa en el extremo C-terminal de la proteína es bastante corta, sólo 17 residuos de longitud. En el sitio inmediato al C-terminal del dominio transmembrana existen diversos aminoácidos básicos, un hecho típico de uniones entre anclajes de membrana y dominios citoplasmáticos de receptores de superficie celular, Yarden et al., Nature. Un sólo residuo de serina, potencialmente un sitio para la fosforilación, está presente dentro del dominio citoplasmático putativo.

La proteína contiene diez sitios de N-glicosilación potenciales, estando todos ellos dentro del dominio extracelular que sobresale. La ausencia de asparagina en la posición 60 (residuo 22 de la proteína madura) en el análisis de secuencia peptídica confirma la glicosilación en este sitio y establece la orientación extracelular de esta región. La región codificante contiene un total de 25 residuos de cisteína, aunque 4 de estos residuos de cisteína están localizados en la secuencia líder putativa.

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Motivos proteicos dentro de la MLHR

Como se muestra en la Figura 6, la comparación de la secuencia aminoacídica de MLHR deducida con otras proteínas de la base de datos de secuencia proteica de Dayhoff mediante la utilización del programa fastp (Lipman, D., y Pearson, W., Science, 227:1435-1441, 1985) puso de manifiesto diversas homologías de secuencia interesantes.

Las proteínas con los niveles de homología de secuencia más elevados se muestran con cajas que rodean las regiones de mayor homología de secuencia. Los números en el inicio de las secuencias muestran la posición dentro de las proteínas donde estas secuencias homólogas se localizan.

La Figura 6A muestra que el motivo del extremo N-terminal de la LHR (residuos 39 a 155) tiene ciertas homologías de proteína de unión con carbohidratos, como se indica (el porcentaje de homología de estas secuencias con la MLHR se muestra entre paréntesis, y las referencias indicadas se proporcionan después de los Ejemplos): Drickamer, los residuos aminoacídicos hallados por Drickamer et al., (1); MuLHR, la secuencia de MLHR; Hu.HepLec (27,8%), lectina hepática humana (2); Barn. lec (25%), lectina de percebe (3); Ra.HepLec (23,5%), lectina hepática de rata (4); Ch.Hepl.Lec (27,5%), lectina hepática de pollo (5); Hu.IgERec (28,6%), receptor de IgE humano (6); RaHepLec2 (22,6%), lectina hepática de rata 2 (7); Ra.ASGRec (22,6%), receptor de asialoglicoproteína de rata (8); RA.IRP (25,6%), proteína de regeneración de islotes de rata (9); Ra.MBP (26,1%), proteína de unión a manosa de rata (10); RA.MBDa (26,1%), precursor de la proteína de unión a manosa de rata A (11); RA.KCBP (27%), proteína de unión de células Kuppfer de rata (12); FlyLec (23,1%), lectina del moscón gris de la carne (Sarcophaga) (13); y Rab.Surf (20,9%), tensoactivo de pulmón de conejo (14).

Como se puede ver en la Figura 6A se muestra que el motivo localizado en el extremo N-terminal de la LHR muestra un nivel elevado de homología con varias lectinas animales dependientes de calcio, es decir, lectinas de tipo C (1). Estas incluyen pero no se limitan a, diversas proteínas de unión de azúcares hepáticos del pollo, rata y humanos, lectinas de unión a manosa soluble, una lectina de células Kupffer, el receptor de asialoglicoproteína, una proteína del core de proteoglicano del cartílago, apoproteínas tensoactivas pulmonares y dos lectinas de invertebrados del moscón gris de la carne y del percebe. A pesar del adjetivo "invariante" para los aminoácidos reconocido inicialmente por Drickamer et al., supra, como una característica común de las lectinas animales de tipo C, éstas no tienen todas una secuencia completamente conservada en el dominio de unión de carbohidrato de la MLHR, aunque el grado de homología en estos residuos y en otras posiciones es evidente. Las lectinas conocidas pertenecientes a la familia de tipo C presentan un margen de especificidades de unión a azúcares, incluyendo los oligosacáridos con galactosa terminal, N-acetilglucosamina y manosa (1).

El hecho de que existan muchos residuos que son invariantes en todas estas proteínas de unión de carbohidratos, sugiere de forma importante que esta región funciona como un dominio de unión de carbohidrato en la MLHR y explica aparentemente la capacidad observada de los linfocitos para unirse al endotelio especializado del tejido linfoide, dependiendo su unión al azúcar de la presencia de calcio. En algunas realizaciones, en la práctica de la presente invención se utiliza el dominio de unión de carbohidrato de la LHR sólo, sin ninguna región flanqueante.

El próximo motivo (residuos 160-193) que se halla casi inmediatamente después del dominio de unión de carbohidrato muestra un elevado grado de homología con la familia de factores de crecimiento epitelial (egf). La Figura 6B muestra las homologías con el factor de crecimiento epitelial (egf): MLHR, secuencia de MLHR; Notch (38,5%), locus notch de Drosophila melanogaster (15); S. purp (31,7%), proteína semejante al egf de Strongylocentrotur purpuratus (16); Pro.Z (34,1%), proteína Z bovina (17); Fact. X (34,2%), factor de coagulación X (18); Fact. VII (27,3%), factor VII de coagulación (19); Fact. IX (33,3%), factor IX de coagulación (20); Lin-12 (32,1%), locus Lin-12 de Caenorhabditis elegans (21); Fact. XII (26%), factor de coagulación XII (22); y Mu.egf (30%), egf murino (23).

Como se puede ver en la Figura 6B, el mayor grado de homología en esta región de la MLHR se halló con el locus neurogénico de Drosophila, notch, aunque también existe homología significativa con otros miembros de esta gran familia. La localización variable de este dominio entre los miembros de esta familia sugiere que esta región puede estar contenida dentro de un segmento genómico que puede hallarse en proteínas diferentes para funciones distintas.

Además de los 6 residuos de cisteína, por término general todos los miembros de esta familia comparten tres residuos de glicina. La conservación de los residuos de cisteína y glicina es consistente con la posibilidad de un papel estructural para esta región en la LHR. Se cree que este dominio puede colocar el extremo N-terminal localizado en la región de unión de carbohidrato en una orientación adecuada para la interacción con el ligando. Además se cree que este dominio puede servir para reforzar la interacción entre el linfocito y el endotelio mediante la unión con un homólogo del receptor de egf sobre una superficie endotelial.

El motivo de la proteína final en la región extracelular de la MLHR está codificado por los aminoácidos 197 a 328. Esta región de la glicoproteína contiene dos repeticiones directas de una secuencia de 62 residuos que contiene un motivo aminoacídico con elevada homología con diversas proteínas de unión del factor del complemento (Figura 6C).

La Figura 6C muestra las homologías de la proteína de unión al complemento: MLHR, secuencia de MLHR; HuComH (31,9%), precursor H de la proteína del complemento humana (24); MuComH (28,9%), precursor H de la proteína del complemento murina (25); HuBeta (25,6%), glicoproteína I beta-2 humana (26); HuCR1 (29,9%), CR1 humana (27); EBV/3d (25,6%), receptor del virus de Epstein-Barr humano/Cd3 (28); HuC2 (27,1%), precursor del complemento humano (29); HuB (23,1%), factor B del complemento humano (30); MuC4b (22%), precursor de unión de C4b murino (31); HuC1s (29,2%), zimógeno C1s humano (32); HuC4b (26,1%), proteína de unión a C4b humana (33); HuDAF (27,1%), factor de deceleración humana (34); VacSecP (26,2%), péptido secretor del virus vaccinia (35).

Estas proteínas, que codifican un amplio margen de múltiplos de este dominio repetido, incluyen, entre otras, los precursores del complemento H humano y murino, la glicoproteína beta 2 humana, el receptor del virus de Epstein Barr/Cd3, la proteína de unión de C4b humana, el factor de deceleración y el polipéptido secretor del virus vaccinia.

La Figura 7C muestra las homologías entre las dos repeticiones directas halladas en la MLHR y en las halladas en las proteínas incluidas en la familia de unión al complemento. Muchos de los aminoácidos que están conservados en esta clase de proteínas de unión al complemento, incluyendo diversos residuos de cisteína conservados, también se hallan en las dos repeticiones en esta región de la MLHR.

Es interesante remarcar, que las dos repeticiones contenidas dentro de la MLHR no son sólo duplicaciones exactas una de otra a nivel aminoacídico, sino que también muestran homología exacta a nivel de secuencia nucleotídica (residuos nucleotídicos 685-865 y 866-1056). Aunque es posible que este resultado sea debido a un artefacto de clonaje, se halló una región duplicada en varios otros clones aislados separadamente de una librería de ADNc producida a partir de la línea celular que expresa la MLHR, 38C13 (disponible por la Universidad de Stanford, Palo Alto, California, U.S.A.), así como en una homóloga humana de la MLHR (que se discute más adelante). Además, varios genes, principalmente el gen Lp(a), muestran un elevado nivel de conservación de la secuencia de repetición intragénica de este dominio. Estos resultados sugieren que la MLHR, al igual que otros miembros de la familia de unión al complemento, contiene múltiples repeticiones de este dominio de unión.

En conclusión, parece ser que la región extracelular de la MLHR contiene tres motivos proteicos separados que se han unido para brindar una nueva función o funciones. En la Figura 7 se muestra un resumen de los motivos proteicos dentro de esta glicoproteína.

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Ejemplo 2 Clonaje de la HuLHR

En general, el clonaje de HuLHR se realizó como en el ejemplo descrito anteriormente. Se aisló el inserto EcoR1 de 2,2 Kb del clon de ADNc del antígeno de Mel 14 murino descrito anteriormente, se marcó mediante síntesis "random primed" con la ADN polimerasa y trifosfatos marcados con P^{32} a elevada actividad específica y se utilizó para rastrear los 600.000 clones de una librería de ADNc en lambda gt10 cebada con oligo dT y obtenida a partir del mRNA de linfocitos de sangre periférica. Los filtros se hibridaron durante toda la noche a 42ºC con formamida al 40%, 5XSSC (1XSSC es NaCl 30 mM, citrato trisódico 3 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), sulfato de dextrano al 10%, solución de 5X Denhardt y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón troceado y desnaturalizado. Los filtros se lavaron 2X40 min en 0,2XSSC, sodio dodecil sulfato al 0,1% a 55ºC. Se repicaron 12 clones (aproximadamente 1 positivo por cada placa de 50.000 fagos), y se aisló el inserto EcoR1 mayor (2,2 Kb) y se determinó la secuencia del ADN mediante secuenciación con dideoxinucleótidos en el bacteriófago m13 utilizando cebadores específicos de secuencia.

Este clon de 2,2 Kb codificaba para un marco de lectura abierto de 372 aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 42.200 daltons que se iniciaba con una metionina precedida por una homología con la caja Kozak. La proteína codificada contenía 26 residuos de cisteína y 8 sitios de N-glicosilación potenciales. Una región altamente hidrofóbica en el extremo N-terminal de la proteína (residuos 20-33) fue una secuencia señal potencial, mientras que otra región altamente hidrofóbica localizada en el extremo C-terminal de 22 aminoácidos de longitud (residuos 335-357) fue una parada de transferencia potencial o dominio de anclaje de membrana. Esta región hidrofóbica en el extremo C-terminal estaba seguida por una región cargada, presumiblemente citoplasmática.

La comparación de la secuencia nucleotídica de este clon humano con la hallada previamente para la MLHR mostró un elevado grado de homología de secuencia de ADN (83%). Los grados relativos de conservación de secuencia aminoacídica entre la MLHR y la HuLHR en cada uno de los dominios de la LHR son: 83% para el dominio de unión de carbohidrato; 82% para el dominio semejante a egf; 79% para la repetición 1 de unión del complemento; 63% para la repetición 2 de unión del complemento; 71% para el dominio de unión del complemento en general; y 96% para el dominio transmembrana.

La comparación de la secuencia Hermes publicada, Jalkanen, supra con la secuencia HuLHR de la Figura 1 muestra una falta de homología de secuencia.

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Ejemplo 3 Expresión de la MLHR

Con el fin de comprobar de forma concluyente que el clon de ADNc murino aislado aquí codificaba para la MLHR, se insertó el clon en un vector de expresión y se analizó en un ensayo de transfección celular transitoria. La expresión de la HuLHR se realizó de forma similar.

El fragmento EcoR1 que contenía el marco de lectura abierto descrito anteriormente (fragmento EcoR1 de 2,2 Kb cuya secuencia se muestra en la Figura 2) se aisló y se ligó en el vector pRK5 que contiene un promotor de citomegalovirus (Eaton, D., et al., Biochemistry 25:8343-8347, 1986; patente europea EP 307247 publicada el 15 de marzo de 1989). Se seleccionó un plásmido que contenía el ADNc insertado en la orientación correcta relativa al promotor y se transfectó en las células renales embrionales humanas 293 utilizando el método de la precipitación con CaPO_{4}.

Al cabo de dos días las células se incubaron con 500 microcuries de cisteína S^{35} y metionina S^{35}. Se prepararon los lisados y los sobrenadantes como se describió previamente (Lasky, L., et al., Cell, 50:975-985, 1987) y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo monoclonal Mel 14 (purificado mediante cromatografía de inmunoafinidad) utilizando un anticuerpo policlonal IgG anti-rata en un sándwich entre el anticuerpo monoclonal Mel 14 y la proteína A Sepharose.

Al mismo tiempo, el linfoma de células B, 38C13, una línea celular que expresa la MLHR, se marcó metabólicamente con metionina o cisteína, para el análisis de la MLHR del sobrenadante, o se marcaron las glicoproteínas de superficie celular con I^{125} y lactoperoxidasa para el análisis de la LHR asociada a células, y se analizaron mediante inmunoprecipitación con el anticuerpo Mel 14.

Los inmunoprecipitados resultantes se analizaron en geles de poliacrilamida al 7,5% y SDS y se autoradiografiaron durante toda la noche a -70ºC.

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Los resultados de estos ensayos se muestran en la Figura 5. En dicha figura, los carriles A-F corresponden a lo siguiente:

- A. Lisados de células 293 transfectadas con un plásmido de expresión de MLHR, e imunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.

- B. Sobrenadantes de células 293 transfectadas con un plásmido de expresión de MHLR, e inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.

- C. Lisados de células 293 transfectadas con un plásmido que expresa la glicoproteína de cubierta gp120 de VIH e imunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.

- D. Sobrenadantes de células 293 transfectadas con un plásmido de expresión de la cubierta de VIH e inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.

- E. Sobrenadantes de las células 38C13 inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.

- F. Lisados de las células 38C13 marcadas en la superficie con I^{125} e inmunoprecipitadas con el anticuerpo monoclonal Mel 14.

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Como se puede ver en la Figura 5, las células transfectadas con esta construcción producen dos proteínas asociadas a células que reaccionan de forma específica con el anticuerpo Mel 14. Las proteínas asociadas a células migraron a aproximadamente 70.000 daltons y 85.000 daltons, lo que sugiere que la proteína del core de 42.000 daltons se glicosila en las células transfectadas. Tras el tratamiento con sialidasa, la banda mayor sufrió un desplazamiento en su peso molecular (resultados no mostrados), lo que sugiere que es una forma relativamente madura de la glicoproteína, mientras que la banda de menor peso molecular fue resistente a la enzima, lo que indicaba que podía ser una forma precursora.

El análisis por FACS de las líneas celulares transfectadas con el anticuerpo Mel 14 mostró que una parte de la LHR expresada en dichas células se detectaba es la superficie celular (resultados no mostrados).

Se observó que la glicoproteína de mayor peso molecular producida en la línea celular transfectada era ligeramente menor que la producida por el linfoma de células B de localización en nódulo linfático periférico, 38C13 (Figura 5, carril F), un resultado que ya se había observado con otras líneas celulares transfectadas y que puede ser debido a diferencias celulares específicas en la glicosilación.

Es interesante remarcar que las células 38C13 y las células humanas transfectadas secretan en el medio una forma de MLHR de menor peso molecular (Figura 5, carriles B y E). La naturaleza de esta molécula secretada es incierta, aunque su peso molecular reducido sugiere que puede ser un producto de hidrólisis de la forma proteica de superficie celular que resulta de la proteolisis cerca del anclaje de membrana.

En conclusión, estos resultados demuestran de forma convincente que el clon de ADNc que se había aislado codifica la MLHR.

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Ejemplo 4 Construcción, purificación y análisis de quimeras truncadas de MLHR-IgG

La Figura 8 muestra la construcción de quimeras de MLHR-IgG que contienen la lectina, lectina-egf y lectina-egf-motivos reguladores del complemento. La parte superior de la figura muestra los dominios proteicos del receptor de localización de linfocitos murinos (MLHR) incluyendo la secuencia señal del extremo N-terminal (SS), la lectina, el factor de crecimiento epitelial (egf) y los dominios reguladores del complemento (CDB) así como también un dominio de anclaje transmembrana (TMD) y una secuencia corta citoplasmática. Las tres quimeras MLHR-IgG truncadas que contienen la lectina (MLHR-L+IgG), la lectina y el egf (MLHR-LE+IgG) y la lectina, egf y dos motivos reguladores del complemento (MLHR-LEC+IgG) también se muestran en la Figura 8. Todas estas proteínas truncadas están unidas a una región de cadena pesada de gamma 1 humana justo cadena arriba del dominio bisagra (H), de modo que tales quimeras contienen los dos residuos cisteína (C) de la bisagra responsables de la dimerización de la inmunoglobulina así como también de las regiones constantes CH2 y CH3. Se utilizó una caja de región constante de cadena pesada de IgG1 humana caracterizada previamente (Capone et al., supra, 1989). Los sitios de unión entre las secuencias de LHR e IgG humana se eligieron de modo que la unión de las moléculas cerca de la región bisagra diera como resultado moléculas quiméricas que se sintetizaran y dimerizaran de forma eficiente en la ausencia de producción de cadena ligera. Además, la utilización de la región constante de IgG1 humana obvia cualquier dificultad debida a la reactividad cruzada con IgGs murinas endógenas en los experimentos inmunohistoquímicos descritos más adelante.

Como se puede ver a partir de la figura 9, estas quimeras se sintetizaron y secretaron de forma eficiente en estos ensayos de transfección transitoria. La reactividad de estas quimeras con la proteína A sepharose en ausencia de anticuerpos añadidos demuestra que los dominios de la región constante se pliegan normalmente. La Figura 9 muestra que estas moléculas se dimerizan en condiciones no reductoras, lo que demuestra que la región bisagra es completamente funcional en estas quimeras. Por último, la reactividad de la proteína A también permite la purificación casi homogénea de estas quimeras en columnas de proteína A sepharose. Los resultados presentes demuestran la producción de entidades semejantes a anticuerpos, cuyo dominio "variable", se puede decir, deriva de la MLHR mientras que el dominio constante deriva de la cadena pesada de la IgG gamma 1 humana.

Construcción de quimeras

Se inició con un plásmido de expresión MLHR-PRK5 descrito anteriormente (Eaton et al., 1986; Lasky et al., Cell 50:975-985, 1987) y una copia de ADNc de una cadena pesada de IgG humana (Capon et al., Nature 337:525-531, 1989). Un fragmento HindIII de 1.100 pb que codifica las regiones CH1-CH3 de la región constante de IgG1 humana se insertó en 3' del sitio poliA del ADNc de MLHR. Este plásmido se convirtió en un molde de cadena sencilla utilizando un origen de replicación de m13 y el fago auxiliar K07, después de lo cual las regiones entre la bisagra y la lectina, egf y la segunda repetición de unión del complemento N-terminal a la región de anclaje transmembrana putativa, se eliminaron mediante formación y escisión de un bucle por mutagénesis in vitro utilizando oligonucleótidos de 48-mer (Zoller y Smith, 1982). Los mutantes resultantes se rastrearon con oligonucleótidos de 21 mer marcados con P^{32} abar-
cando las junturas de la deleción, y se secuenciaron los mutantes aislados mediante secuenciación de cadena doble.

Se analizaron los mutantes correctos para conocer su expresión mediante transfección en células 293 renales humanas mediante la utilización de los procedimientos descritos anteriormente. Se analizaron los sobrenadantes marcados con metionina y cisteína marcados con S^{35} mediante inmunoprecipitación con bolas de proteína A sepharose en ausencia de anticuerpos añadidos. Las proteínas precipitadas se analizaron en geles de poliacrilamida al 7,5% y SDS con o sin reducción por beta mercaptoetanol. Los plásmidos que dieron como resultado quimeras expresadas correctamente se introdujeron en células 293 mediante transfección en presencia de plásmidos de selección que codificaban para la resistencia a G418 así como la dihidrofolato reductasa. Los clones se seleccionaron en G418 y los plásmidos incorporados se amplificaron en presencia de metotrexato. Las líneas celulares estables que expresaban niveles elevados de cada construcción se crecieron a gran escala en frascos de cultivo T y los sobrenadantes celulares se clarificaron mediante centrifugación y filtración. Los sobrenadantes resultantes se concentraron mediante filtración en Amicon y se pasaron por columnas de proteína A sepharose, se lavaron con PBS y se eluyeron con ácido acético 0,1 M, NaCl 0,15 M (pH 3,5). El material eluido se neutralizó inmediatamente con Tris 3 M, pH 9 y se cuantificó mediante electroforesis en gel con SDS así como también en un ensayo ELISA.

Los resultados de la electroforesis en gel descritos en el párrafo anterior se muestran en la Figura 9. Las proteínas reducidas se muestran en los carriles A-F, las proteínas no reducidas en los carriles G-I y las proteínas purificadas en los carriles J-L. Los pesos moleculares de marcadores se muestran en kilodaltons. Los carriles se indentificaron de la forma siguiente: A. MLHRLEC-IgG secretada, B. MLHRLEC-IgG intracelular, C. MLHRLE-IgG secretada, D. MLHRLE-IgG intracelular, E. MLHRL-IgG secretada, F. MLHRL-IgG intracelular, G. MLHRLEC-IgG secretada, H. MLHRLE-IgG secretada, I. MLHRL-IgG secretada, J. MLHRLEC-IgG purificada, K. MLHRLE-IgG purificada y L. MLHRL-IgG purificada.

Las quimeras LHR-IgG aisladas se cuantificaron utilizando un formato ELISA que consistía de pocillos de microtitulación recubiertos con un anticuerpo monoclonal de ratón específico anti-IgG 1 humana. Se incubaron las muestras desconocidas y el estándar de inmunoadhesión CD4-IgG1 humano altamente purificado con las placas recubiertas de anticuerpo, después se lavaron las placas y el material unido se hizo reaccionar con anticuerpo de cabra anti-IgG1 humana conjugado a peroxidasa de rábano, se prosiguió por diversos lavados y adición de sustrato. Este ensayo cuantitativo permitió la cuantificación de cantidades del orden de subnanogramos de las quimeras LHR-IgG aisladas.

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Análisis de la reactividad PPME de la quimera MLHR-IgG mediante ELISA

La capacidad de diversas quimeras para reconocer el carbohidrato de pared celular de levaduras, éster de polifosfomanano o PPME se analizó mediante un formato ELISA tal como se describió anteriormente (Imae et al., 1989). Brevemente, se recubrieron pocillos de microtitulación con cantidades aproximadamente equivalentes de quimeras purificadas, durante toda la noche a 4ºC. Los sitios no específicos se bloquearon con BSA, después de lo cual los antígenos unidos se hicieron reaccionar con 5 \mug por ml de una solución de PPME. El carbohidrato unido se detectó con un anticuerpo policlonal dirigido contra éste y mediante reactivos estándares de tinción inmunohistoquímica (Vector). La inhibición con Mel 14 se realizó mediante preincubación de los pocillos que contenían MLHRLEC-IgG con el anticuerpo monoclonal antes de la adición de PPME, mientras que la dependencia de calcio de la interacción receptor de localización-carbohidrato se demostró mediante la inclusión de EGTA 10 mM durante la reacción de unión. En los ensayos para examinar la inhibición se añadieron diversos otros aditivos antes de la incubación con PPME. Al cabo de 1 h a 22ºC, las placas se lavaron e incubaron con un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra el PPME durante 1 h a 22ºC. Las placas se lavaron e incubaron con Vector-ABC-AP durante 30 min, se lavaron y revelaron. Los ensayos resultantes se cuantificaron en un lector de placas. Los carbohidratos utilizados en los ensayos inhibitorios se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO.).

Los resultados de la unión con PPME se muestran en la Figura 10. Los carriles contienen las siguientes quimeras MLHR-IgG: A. unión de PPME con quimeras MLHRL-, MLHRLE- y MLHRLEC-IgG. B. Inhibición de la unión de MLHRLEC-IgG-PPME con el anticuerpo monoclonal Mel 14 y EGTA. C. Inhibición de la unión de MLHRLEC-IgG-PPME con otros carbohidratos.

Trabajos anteriores habían demostrado que la LHR era capaz de unirse a un manano, éster de fosfomanano o PPME de pared celular de levadura (Yednock et al., J. Cell Biol., 104:725-731, 1987), y por ello esta unión inhibía la capacidad de los linfocitos de adherirse a vénulas endoteliales altas de nódulos linfáticos periféricos, de acuerdo con la suposición de que el dominio de lectina de LHR del nódulo linfático periférico puede reconocer un carbohidrato en el endotelio del nódulo linfático periférico. Además, se halló que el anticuerpo Mel 14 inhibía la unión de PPME con la superficie del linfocito (Yednock et al., supra, 1987), lo que era consistente con la noción de que este carbohidrato se unía dentro del dominio de lectina de la LHR del nódulo linfático periférico.

Se halló que la quimera que se unía al PPME era la que contenía la lectina, el egf y las estructuras de repetición de unión del complemento duplicadas. Esta unión era inhibida por el anticuerpo Mel 14, de acuerdo con los resultados que demostraban que la quimera MLHRLEC-IgG era reconocida por este anticuerpo (resultados no mostrados), y era comparable cuantitativamente con la hallada previamente utilizando la MLHR aislada a partir de células del bazo (Imai et al., enviado a publicación, 1989), lo que sugiere que dicha unión representa la misma interacción proteína-carbohidrato que se había hallado con la LHR en la superficie de linfocitos (Yednock et al., supra, 1987). Además, se halló que la unión era dependiente de calcio (Stoolman y Rosen, J.Cell. Biol. 96:722-729), lo que implicaba que el dominio de lectina dependiente de calcio o de tipo C (Drickamer, J. Biol. Chem, 263:9557-9560, 1988) era al menos responsable de esta interacción, como se había mostrado para el receptor asociado de linfocitos (figura 9b).

Trabajos anteriores habían demostrado que diversos carbohidratos además del PPME eran capaces de ser reconocidos por la MLHR derivada del bazo (Yednock et al., supra; Imai et al., supra, 1989). Estos incluyen la fucoidina, sulfato de dextrano y sulfatidas derivadas del cerebro. Se examinó la capacidad de estos carbohidratos para inhibir la interacción entre la quimera MLHRLEC-IgG y el PPME con el fin de investigar la especificidad de esta molécula versus la glicoproteína derivada del bazo descrita anteriormente (Imai y col, supra, 1989). Como se puede ver en la figura 9, la fucoidina, el sulfato de dextrano y la sulfatida son capaces de inhibir la interacción entre el PPME y la MLHRLEC-IgG, lo que implica que la especificidad del carbohidrato de esta proteína derivada recombinante mimetiza la anteriormente descrita para la proteína natural. La falta de inhibición provocada por los otros dos carbohidratos cargados, condroitín sulfato y heparina, sugiere que la inhibición es debida al reconocimiento específico del carbohidrato y no a la interferencia inespecífica debida a la naturaleza altamente cargada de los componentes.

Ensayos bloqueantes de células con quimeras MLHR-IgG

El ensayo bloqueante de células de Stampfer-Woodruff (Stampfer y Woodruff, J. Exp. Med. 144:828-833, 1976) se realizó con secciones de cortes con criostato de nódulos linfáticos periféricos de ratón, así como también con las placas de Peyer como se describió anteriormente (Geoffrey Rosen, J. Cell Biol., en publicación, 1989). Brevemente, las secciones de tejido congelado se incubaron con linfocitos mesentéricos en presencia de quimeras MLHR-IgG, MLHR derivadas de bazos aislados, o sólo con tampón. Las quimeras MLHR-IgG se incluyeron en concentraciones tan elevadas como 10 \mug por sección y se preincubaron en secciones congeladas antes de la adición de 1 x 10^{7} células por ml. Los portaobjetos se lavaron, y se cuantificó la unión de los linfocitos mediante morfometría digital como el número de linfocitos unidos a HEV en estos órganos linfoides por unidad de área.

En resultados no mostrados, se halló que la quimera MLHRLEC-IgG inhibía la unión de linfocitos con HEV del nódulo linfático periférico a un nivel de inhibición de aproximadamente el 75% mientras que, en este ensayo, la MLHR derivada del bazo bloqueaba a un nivel de aproximadamente el 50%. Esta inhibición era dependiente de calcio y era bloqueada por la inclusión del anticuerpo monoclonal Mel 14 (resultados no mostrados).

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Análisis inmunohistoquímicos de quimeras MLHR-IgG

Se utilizaron quimeras MLHR-IgG aisladas para experimentos inmunohistoquímicos utilizando procedimientos idénticos a los descritos para los anticuerpos monoclonales. Secciones de 8-10 micras de tejido se cortaron en un criostato y se fijaron con cacodilato 0,1 M, paraformaldehído al 1% durante 30 minutos a 4ºC. Las secciones se lavaron con PBS de Dulbecco y se tiñeron con cantidades variables de la quimera MLHR-IgG en suero de ratón normal al 5% a 4ºC durante 30 min. Luego, se lavaron las secciones y se incubaron en una segunda etapa con un anticuerpo específico Fc anti-humano de cabra biotinilado (Vector). La peroxidasa endógena se eliminó mediante tratamiento de las secciones con peróxido de hidrógeno-metanol después de la adición del reactivo de la segunda etapa y antes de la adición del complejo Vector ABC. Las secciones se lavaron e incubaron con el sustrato (AEC) durante 5-10 minutos. Por último, las secciones se contrastaron con tinción de hematoxilina acuosa (Biomedia) y se visualizaron con un Zeiss Axiophot.

Estos análisis inmunohistoquímicos de las tres quimeras MLHR-IgG utilizaron nódulos linfáticos periféricos como fuente de tejido. La elección del nódulo linfático periférico como fuente histológica fue dictada por la amplia bibliografía al respecto que demostraba que los linfocitos se unen a las HEV de este tejido linfoide de manera que la unión pueda ser bloqueada por Mel-14, lo que implicaba que el mayor nivel de ligando reconocido por la MLHR debería hallarse en este tejido (Gallatin et al., Nature, 304:30-34, 1983). La quimera MLHRLEC-IgG fue capaz de teñir las HEV del nódulo linfático periférico. La tinción se halló exclusivamente sobre las células del endotelio altamente tabicado, sin que se tiñeran otras regiones ad- o abluminales. Además esta tinción podía bloquearse por el anticuerpo Mel 14 y era dependiente de la presencia de calcio, lo que sugiere que la unión de MLHRLEC-IgG con las HEV del nódulo linfático periférico mimetiza la adhesión entre los linfocitos y las HEV. De acuerdo con los resultados de unión con PPME, la tinción de HEV del nódulo linfático periférico por MLHRLEC-IgG se podía inhibir por la fucoidina y el sulfato de dextrano (figura 5), mientras que el condroitín sulfato y los mananos sencillos eran incapaces de inhibir la reacción de tinción (resultados no mostrados), lo que implica de nuevo que la reacción de tinción era debida al reconocimiento de un ligando del carbohidrato expresado en las HEV del nódulo linfático periférico. Estos resultados ponen de manifiesto que este tipo de reactivo inmunohistoquímico puede utilizarse para analizar la distribución de la molécula(s) endotelial capaz de interaccionar con la LHR del nódulo linfático periférico.

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El ligando de MLHR se halla en las placas de Peyer

Se halló, en los resultados de los ensayos inmunohistoquímicos no mostrados, que la quimera MLHRLEC-IgG es, sorprendentemente, capaz de reconocer específicamente del endotelio de las placas de Peyer. La quimera parece teñir el endotelio altamente tabicado de los vasos de las placas de Peyer que contienen linfocitos. Esta tinción es inhibida por el anticuerpo Mel 14 y también es dependiente de calcio. Es interesante resaltar que la tinción de HEV de las placas de Peyer de parece algo más débil en relación con la hallada para la tinción de HEV del nódulo linfático periférico, lo que implica que en este órgano linfoide se expresa un nivel inferior de ligando(s) de MLHR. Estos resultados demuestran que, aunque otros sistemas de adhesión puedan estar implicados en este órgano (Holzman et al., Cell, 56:37-46, 1989), el ligando(s) para la LHR del nódulo linfático periférico se expresa y, por ello, está implicado en la unión de linfocitos con el endotelio de este órgano linfoide.

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Referencias de los ejemplos

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Esta lista de referencias citadas por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.

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Claims (2)

1. Dímero de cadena pesada de inmunoglobulina, en el que una secuencia de aminoácidos de una pareja de unión al ligando que es una cadena única y es un receptor que no es miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina o una proteína homóloga al mismo y no es un polipéptido de múltiples subunidades codificado por genes discontinuos, se sustituye por las regiones variables de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, las cuales mantienen por lo menos los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la región constante de la cadena pesada, para su uso en un método terapéutico de tratamiento de un paciente.

2. Dímero según la reivindicación 1, en el que dos regiones variables se sustituyen por secuencias de aminoácidos de parejas de unión al ligando diferentes.