JPH05503009A - リガンド結合タンパク質および安定血漿タンパク質からなる融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リガンド結合タンパク質および安定血漿タンパク質からなる融合夕本発明は新規 リガンド（配位子）結合分子および受容体、並びに、リガンド結合分子の循環血 漿半減期を改善する組成物および方法に関する。具体的には、本発明はハイブリ ッド（雑種）免疫グロブリン分子、これらの免疫グロブリン類の製造法および使 用法、並びに、これらをコードする核酸に関する。

免疫グロブリンはジスルフィド結合で互いに結合し合ったポリペプチド鎖を含有 する分子であり、典型的には２つの軽鎖と２つの重鎮を有する。各鎖の１ドメイ ン（領域）（Ｖ）は、その分子の抗体特異性に依存する可変アミノ酸配列を有す る。もう１つのドメイン（Ｃ）は、同じクラスの分子に共通のかなり定常的な配 列を有する。これらのドメインはそのアミノ末端から順番に番号が付与される。

免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー（上材）は免疫グロブリン様ドメイン を伴う分子から構成されている。このファミリーの構成要素には、クラスＩおよ びクラス１１主要組轍適合性抗原、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体α、β、γお よびδ鎖、ＣＤＩ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３のγ、δおよび ε鎖、０Ｘ−２、Ｔｈｙ−ｔ、細胞間または神経細胞接着性分子（Ｉ−ＣＡＭま たはＮ−ＣＡＭ）、リンパ球機能付随抗原−３（ＬＦＡ−３）、神経細胞質タン パク質（ＮＣＰ−３）、ポリーＴｇ受容体、ミニリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ ）、高親和性ＩｇＥ受容体、抹消ミニリンの主要糖タンパク質（ＰＯ）、血小板 由来成長因子受容体、コロニー刺激因子−１受容体、マクロファージＦｃ受容体 、Ｆｃガンマ受容体およびガン胎児性抗原が含まれる。

ある免疫グロブリンの可変ドメイン（超可変領域を含む）で別の免疫グロブリン を置換できること、またある種の免疫グロブリンの可変ドメインを異なる種に置 換できることが知られている。例えばＥＰＯ１７３４９４；　ＥＰＯ１２５０２ ３；Ｍｕｎｒｏ、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：（１９８４年１２月１３日）　；　Ｎ ｅｕｂｅｒｇｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ　３１２（１９８４年１２月１３日）　；　 ５ｈａｒｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ　３０９：（１９８４年５月２４日）　；　Ｍｏ ｒｒｉｓｏｎ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　８１：６８５１−６８５５（１９８４）　：　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２２９：１２０２−１２０７（１９８５）　；　Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ等 、　Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６４３−６４６（１９８４年１２月１３日）などを 参照のこと。

Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２−１２０７（１９８５ ）は、ある種から得た免疫グロブリン定常領域に融合した別の種由来の可変領域 を有する免疫グロブリン・キメラの調製を教示している。この文献は非免疫グロ ブリン配列（例えば酵素配列）と融合した免疫グロブリン配列を有する分子を示 唆しているが、この文献は非免疫グロブリン配列に結合した免疫グロブリン可変 ドメインのみを教示している。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等のＥＰｏ　１７３　４９４は 同様のキメラを教示している。この著者等は“受容体”という用語を使用し、そ の“背景”の項で、“免疫グロブリン、酵素および膜タンパク質などの受容体” に言及しているが、彼らの述べた“興味ある受容体”には“Ｂ細胞およびＴ細胞 受容体、より具体的には免疫グロブリン（例えばＩｇＭ、ＩｇＧ、■ｇＡ、Ｉｇ ＤおよびＩｇＥ、並びに、個々の群の種々のサブタイプ）”が含まれる（３頁１ ０〜１３行）。この文献の開示は免疫グロブリンキメラに限定されている（例え ば３頁２１〜３０行を参照のこと）。

免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの２構成要素（ＣＤ４およびそのＴ細 胞受容体）由来の免疫グロブリン可変様ドメインで、ある免疫グロブリンの可変 ドメインを置換し得ることも知られている（例えばＣａｐｏｎ等、　Ｎａｔｕｒ ｅ　３３７：５２５−５３１（１９８９）　：　Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ等＋Ｎａ ｔｕｒｅ　３３９：６８−７０（１９８９）　；　Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ等、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８４　：２９３６|２９ ４０（１９８７）　；公開サレタ欧州出願Ｅ　ＰＯ０３２５２２４Ａ２などを参 照のこと）。

多数のタンパク質性物質が、標的分子に特異的に結合することによって機能する ことがわかっている。これらの標的分子は一般的にはタンパク質であるが、タン パク質であるとは限らない。標的分子またはリガンドに結合する物質を、本明細 書ではリガンド結合パートナ−（配位子結合相手）と呼び、これには受容体およ び担体タンパク質、並びに、ホルモン、細胞接着性タンパク質、組織特異的接着 因子、レクチン結合分子、成長因子、酵素、栄養物質などが含まれる。

リンパ球は特定の組織に標的を定められた細胞の例である。リンパ球は正常組織 炎症、並びに、リウマチ様関節炎および他の自己免疫疾患で起こるような病的組 織損傷のメディエータ−（媒介体）である。を推動物は、その生物の空間的に異 なる領域に対して異なった抗原特異性を有するリンパ球を分配する機構を進化さ せてきた（Ｂｕｔｃｈｅｒ、　Ｅ、　Ｃ，、Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏ 、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２８　：８５（１９８６）　；　Ｇａｌ　ｌａｔ　奄 氏A　Ｗ、　Ｍ。

等、Ｃｅ１ｌ　４４°６７３（１９８６）　；　Ｗｏｏｄｒｕｆｆ、　Ｊ、　Ｊ 、等、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍａｕｎｏｌ、　５：２０P（１ ９８７）　：　Ｄｕｉｊｖｅｓｔｉｊｎ、　Ａ、等、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏ ｄａｙ　１０：２３（１９８９）　；Ｙｅｄｎｏｃｋ、　ＴA　Ａ。

等、　Ａｄｖ、　Ｉａ＋＊ｕｎｏ１．印刷中（１９１１１９）。

この機構には、血液とリンパ様器官との間のリンパ球の連続的再循環が含まれて いる。リンパ球が最も高い移動度を持つ血液と、隔離され加工された抗原にリン パ球が出会うリンパ様器官との間のリンパ球の移動は、リンパ球表面上の受容体 と特殊化した毛細管後の細静脈（例えば高内皮細静脈（ＲＥＶ）および慢性的炎 症溝膜中に誘発されるＨＥＶ様血管）の内皮細胞上のリガンドとの接着性相互作 用によって始まる。

リンパ球接着分子は、これらの細胞を特定の２次的リンパ様器官に局在化させる 、もしくは“誘導”することができるので、特に誘導（ホーミング）受容体と呼 ばれている。

リンパ球誘導受容体の候補は、マウス、ラットおよびヒトで既に同定されている （Ｇａｌｌａｔｉｎ、　Ｌ　Ｍ、等、　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：３０（１９８３ ）　；　Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ、　Ｒ，Ａ、等、　Ｊ、　Ｉ＋＋ａ＋ｕｎｏ１．１ ３５：１９（１９８５）　；　Ｃｈｉｎ、　Ｙ、　Ｈ，等、　Ｊ、　Ｉｍａｕｎ ｏｌ、@１３６：２ ５５６（１９８６）　：　Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｓ、等、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　［ｍ ｍｕｎｏｌ、　１０：１１９５（１９８６））。次に記載する文献は、ネズミ型 とされるリンパ球表面タンパク質に対するＭｅｌ１４と呼ばれるモノクローナル 抗体を用いてこの分野で行われた研究について記述している：　Ｇａｌ　Ｉａｔ 　ｉｎ、　１１．　Ｍ、等、前掲；　Ｍｏｕｎｔｚ、　Ｊ。

Ｄｌ等、　Ｊ、　ｔｖ＋＋ｕｎｏ１．１４０：２９４３（１９８８）　；　Ｌｅ ｗｉｎｓｏｈｎ、　Ｄ、　Ｍ、等、　Ｊ、　ＩｍａｕｎｏｌA　１３ ８：４３１３（１９８７）　；　Ｓｉｅｇｅｌａ＋ａｒ１．　Ｍ、等、　５ｃｉ ｅｎｃｅ　２３１：８２３（１９８６）　；　Ｓｔ、　Ｊｏ■氏{ Ｔ８等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３１８４５（１９８Ｂ）。

免疫沈降実験によ−って、この抗体がリンパ球上の拡散した〜９０００ｏダルト ンの細胞表面タンパク質（Ｇａｌｌａｔｉｎ、　Ｗ、　）１等、前掲）および好 中球上の〜１０００００ダルトンのタンパク質（Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎ、　Ｄ、　 Ｍ。

等、前掲）を認識することが示されている。

Ｍｅｌ１４抗体によって限定される糖タンパク質の放射活性標識アミノ酸配列決 定によって同定された、リンパ球誘導受容体とされる受容体の部分的配列（１３ 残基）がＳｉｅｇｅｌｍａｎ等によって開示されている（Ｓｉｅｇｅｌａ＋ａｎ 、組等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３１：８２３（１９８６））。

レクチンは炭水化物結合ドメインを有するタンパク質であり、ヒト、フジッボお よびニクバエを含む種々の動物中に認められる。細胞接着におけるレクチン作用 の概念は、ある種のウィルスおよび細菌と真核宿主細胞との相互作用によって例 示される（Ｐａｕｌｓｏｎ、　Ｊ、　Ｃ，。

Ｔｈｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、第２巻、　Ｐ、　Ｍ、　Ｃｏｎｎ等共編（Ａｃａ ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　１９８５）、　１３１頁：　５ｈａｒｏｎ 、　Ｎ、　、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２１７：１４５（１９８７））。真核細 胞−細胞相互作用において、種々の系中の内因性レクチンに関して接着性機能が 推測されており（Ｇｒａｂｅｌ、　Ｌ、等、Ｃｅ１ｌ　１７°４７７（１９７９ ）　：　Ｆｅｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｂ、等。

Ｊ、　Ｅｘｔ）、　Ｍｅｄ、　１６０：１５９１（１９８４）　：　Ｋｕｎｅｍ ｕｎｄ、　Ｖ、　、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０６F２１３（１９ ８ｇ）　；　Ｂ１５ｃｈｏｆｆ、　Ｒ，、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０２ ：２２７３（１９８６）　：　Ｃｒｏｃｋｅｒ、　Ｐ、　ＲC等。

Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６４：１８６２（１９８６））、これには無を推 動物（Ｇｌａｂｅ、　Ｃ，Ｇ、等、Ｊ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９４：１２３（１９８２）　；　ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ 、　Ｐ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６２　：P３９４６ （１９８７））およびを推動物受精（Ｂｌｅｉｌ、　Ｊ、　Ｄ、等、　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　、　Ｕ。

Ｓ、　Ａ、　８５　：６７７８（１９８ｇ）　；　Ｌｏｐｅｚ、　Ｌ、　Ｃ，等 、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０１　：１５０１（P９８５）） が含まれる。特異的細胞認識を達成する手段としてタンパク質−糖相互作用を使 用することはよく知られているようである。

リンパ球とそのリガンドとの接着性相互作用にレクチンが関与していることを文 献は示唆している（Ｒｏｓｅｎ、　Ｓ、　Ｄ、等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：１ ００５（１９８５）　；　Ｒｏｓｅｎ、　Ｓ、　Ｄ、等、　Ｊ、　ＩＩＩ＋ｌｌ １ｕｎｏ１．印刷中（１９８９）　；　Ｓｔｏｏｌｍａｎ、　Ｌ、@Ｍ、等。

Ｊ、　Ｃａｌ　ｌ　Ｂｉｏｌ、　９６：７２２（１９８３）　；　Ｓｔｏｏｌｍ ａｎ、　Ｌ、　Ｍ、等、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、９９：１T３ ５（１９８４）　；　Ｙｅｄｎｏｃｋ、　Ｔ、　Ａ、等、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏ、　１０４ニア２５（１９８７）　；　５ｔｏｏｌＩＩ撃≠氏A　Ｌ。

Ｍｌ等、　Ｂｌｏｏｄ　７０：１８４２（１９８７）　；　Ｂｒａｎｄｌｅｙ、 　Ｂ、　Ｋ、等、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０５：X９ １（１９８７）による関連する方法；　Ｙｅｄｎｏｃｋ、　Ｔ、　Ａ、等、準備 中；　Ｙｅｄｎｏｃｋ、　Ｔ。

Ａ１等、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０４ニア２５（１９８７））。

ヒトのリンパ球誘導に関与するであろう表面糖タンパク質の特徴が、一般にヘル メス（Ｈｅｒｍｅｓ）と呼ばれる一連のモノクローナル抗体およびポリクローナ ル抗体を用いて研究された。免疫細胞型および非免疫細胞型の多数に認められ、 抗体プレクリーニング実験によって−ｅｌ１４抗原に関係すると思われる〜９０ ０００ダルトンの表面糖タンパク質を、これらの抗体が認識した（Ｊａｌｋａｎ ｅｎ、　Ｓ等、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｍｅｄ、　３８：４６７−４７６（１９８７）　；　Ｊａｌｋａｎｅｎ、　Ｓ、 等、　Ｂｌｏｏｄ、　６６（３）　：５７７−５８２（１９W５） ；　Ｊａｌｋａｎｅｎ、　Ｓ等、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０５：９８ ３−９９０（１９８７）　；　Ｊａｌｋａｎｅｎ、　Ｓ等。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　ＩＩＩＩｍｕｎｏｌ、　１８°１１９５−１２０２（１９８６ ））。

表皮成長因子様ドメインは、成長因子、細胞表面受容体、発生遺伝子産物、細胞 外マトリックス・タンパク質、血液凝固因子、プラスミノーゲン活性化因子およ び補体を含む広範囲にわたるタンパク質に認められている（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ 、　Ｒ，Ｆ、等、　ＣＳＨＳｙｍｐ、　５１：４４７（１９８６乃。

リンパ球細胞表面糖タンパク質（以下、“ＬＨＲ”と記述する）がリンパ様組織 の内皮に対するリンパ球の結合を媒介することが特徴づけられてる。ヒトおよび ネズミのＬＨＲ（それぞれＨｕＬＨＲおよびＭＬＨＲ）をコードする全長ｃＤＮ ＡクローンおよびＤＮＡは同定され、単離されており、さらにこのＤＮＡは組換 え宿主細胞によって容易に発現する。ヒトＬＨＲ（ＨｕＬＨＲ）のヌクレオチド 配列およびアミノ酸配列を図１に示す。ネズミＬＨＲ（ＭＬＨＲ）のヌクレオチ ド配列およびアミノ酸配列を図２に示す。変異アミノ酸配列もしくは天然には認 められないグリコジル化を有するＬＨＲｌ並びに、増大した特異的活性や改善さ れた血漿半減期を含む改善された特性を有するＬＨＨの他の誘導体、並びに、こ のような変異体の調製を可能にする方法をも提供する。

本明細書に、ＬＨＲが次のタンパク質ドメイン：シグナル配列、炭水化物結合ド メイン、表皮成長因子様（ｅｇｆ）ドメイン、少な（とも１つ、好ましくは２つ の補体結合ドメイン反復、貫膜結合ドメイン（ＴＭＤ）、および荷電細胞内また は細胞質ドメイン、を含有する糖タンパク質であることを示す。本発明のＬＨＲ は、これらのドメインの少な（とも１つを含有するが、すべてを含有する必要は ない。

リガンド−結合パートナ−相互作用に関する多くの先天性異常の治療用薬剤の開 発において成功した方法は、リガンドと結合パートナ−との相互作用または結合 を遮断するアンタゴニスト（拮抗薬）の同定であった。１つの方法は、外来性結 合パートナ−を天然の結合パートナ−の競争的アンタゴニストとして使用するこ とである。しかし多くのリガンド結合パートナ−は、細胞の脂質二重膜に固定さ れた細胞膜タンパク質である。膜成分の存在は典型的には製造および精製の観点 から望ましくない。さらに、これらの分子は通常は細胞表面上のみに存在するの で、循環中でより安定な形態でこれらを生産することが望ましいであろう。また 、先端の欠失したリガンド結合パートナ−や可溶性リガンド結合パートナ−でも 、生体内血漿半減期が比較的短く、胎盤または他の生物学的障壁を通過しないで あろうし、またエフェクター機能を送達せず単にそのリガンド認識部位を隔離す るだけでは治療的目的には不適切であろうから、治療薬として最適な効果を示さ ないであろう。

したがって本発明の目的は、免疫グロブリン・ドメインや血漿タンパク質など、 リガンド結合パートナ−の生体内血漿半減期を長時間持続させ、またプロティン Ａによる精製を容易にするよう機能する部分に融きしたリガンド結合パートナ− を生産することにある。

さらなる目的は、リガンド結合パートナ−の接着性および標的選択特性と、補体 結合や細胞受容体結合などの免疫グロブリン・エフェクター機能とを合わせ持つ ハイブリッド免疫グロブリン分子を提供することにある。さらに別の目的は、治 療的に使用するため、あるいはリガンド結合パートナ−またはその標的のインビ トロ（試験官内）検定のための診断用試薬として使用するために、上述のような 新規機能性を伴う分子を提供することにある。もう１つの目的は、多数のリガン ド結合パートナ−（そのそれぞれは同じであっても、異なっていてもよい）を会 合させることによって、複数のリガンドを結合および／または活性化し得るよう になる多機能性分子を提供することである。

具体的には、１つの目的は、毒素、細胞表面パートナ−１酵素、栄養物質、成長 因子、ホルモン、もしくは免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー構成要素の 定常ドメイン様部分などのエフェクター分子などのリガンド結合パートナ−を、 そのリガンド結合パートナ−のためのリガンドを保持する細胞に向かわせるため の分子、およびリガンド結合パートナ−の精製を容易にする際に使用するための 分子を製造することにある。

本発明のもう１つの目的は、治療的部分を特定の組織およびリガンドに対して誘 導する際に使用するリガンド結合パードナー−免疫グロブリン・ハイブリッド・ ヘテロ多量体、特にヘテロ多量体およびヘテロ四量体を提供することにある。例 えば、ＣＤ４−４　ｇＧをヒト免疫不全ウィルス（！（ｊＶ）などのウィルスに 感染した組織に誘導するために、ＬＨＲ−Ｉ　ｇＧ鎖１本およびＣＤ４−Ｔ　ｇ Ｇ鎖１本から構成されるハイブリッド免疫グロブリンを使用することができる。

同様に、毒素を目的の組織に送達するために、毒素−血漿タンパク質部分と組み 合わされたリガンド結合パードナー−血漿タンパク質部分を有する分子を使用す る。

もう１つの目的は、これらの分子を組換え細胞培養中で発現させる方法を提供す ることである。

発明の要約 本発明の目的は、リガンド結合パートナ−との融合物として存在するときにリガ ンド結合パートナ−の生体内血漿半減期を延ばすことができる安定な血漿タンパ ク質、特に免疫グロブリン定常ドメイン、に融合したりガント結合パートナ−か らなる新規ポリペプチドを提供することによって達成される。また、このポリペ プチドをコードするＤ　Ｎ　Ａ　、このポリペプチドを製造するための培養物お よび方法をも提供する。

安定血漿タンパク質が、同じポリペプチド鎖あるいは異なるポリペプチド鎖が通 常はジスルフィド結合および／または非共有結合で結合することによって集合し た複数鎖ポリペプチドを形成しており、通常は多量体型で存在する多くの場合（ 例えば、免疫グロブリンまたはりボタンバク質）には、リガンド結合パートナ− を含有する本発明の融合物もまた、安定血漿タンパク質前駆体と本質的に同じ構 造を有する多量体として生産され使用されるであろう。これらの多量体は、それ が含有するリガンド結合パートナ−に関して均一であり得るし、あるいは複数の リガンド結合パートナ−を含有することも冑り得る。さらにこれらの多量体は１ または複数のリガンド結合ハードナ一部分を含有し得る。

安定血漿タンパク質が免疫グロブリン鎖である好ましい態様として、リガンド結 合パートナ−を少なくとも１本の鎖中に置換し、また普通はリガンド結合パート ナ−で免疫グロブリンの可変領域またはその適切な断片を置換する。しかし、本 発明が免疫グロブリンの複数の鎖中に同じ、もしくは異なるリガンド結合パート ナ−が置換された融合物をも包含することは理解されるであろう。複数のリガン ド結合パートナ−が互いに異なる場合、集合した最終的な複数鎖ポリペプチドは 、天然の可変領域を有する多機能抗体では不可能な様式でリガンドを架橋するこ とができる。

この種類に属する特定の複数鎖融合物は、１本の免疫グロブリン鎖の可変領域が ＣＤ４などの一次受容体のリガンド結合領域によって置換されており、一方、も う１つの免疫グロブリン鎖の可変領域がＬ　ＨＨの結合機能性によって置換され ており、その両免疫グロブリン鎖が本質的に通常の様式で互いに結合し合ってい るものである。

ペプチド結合もしくは試験官内で生成する結合を通して追加の治療的部分、例え ばポリペプチド毒素、診断用標識、あるいは他の機能性など、に結合させること により、本発明の融合物をさらに修飾することができる。

本発明の融合物の製造は、その融合物をコードする核酸で宿主細胞を形質転換し 、その宿主細胞を培養し、その培養から融合物を回収することによって行う。本 発明の融合物をコードするベクターおよび核酸、並びに、それらを含有する治療 用および診断用組成物をも提供する。

本発明は、そのある側面として、ＬＨＲ自体に関する。本発明のＬＨＲは、図１ および図２に記載のアミノ酸配列を有する全長成熟ＬＨＲ１および天然に存在す る対立遺伝子、試験官内で誘導体化することによって製造した共有結合的誘導体 、あるいはそれらの予め決定されたアミノ酸配列変種もしくはグリコジル化変種 である。

本発明が提供する新規組成物は精製され、抗ウイルス療法、神経変調療法、ある いは免疫変調療法を必要とする患者に投与するための薬学的に許容される担体中 に製剤化され、細胞接着の変調に使用される。本発明は、受容体媒介性の異常を 有する患者の治療に特に有用である。さらに本発明が提供する組成物は、その安 定血漿タンパク質成分に結合し得る抗体または他の物質を使用することによって その融合物を吸収する、リガンド結合パートナ−の組換え細胞培養からの精製の 中間体としても有用であり、あるいは、安定血漿タンパク質か間接的標識として 働く、リガンド結合パートナ−の診断的検定にも有用である。

図面の簡単な説明 図冒よ、ヒｔ−ＬＨＲ（ＨｕＬＨＲンのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を表す。

図２は、ネズミＬＨＲ（ＭＬＨＲ）のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を表す。

図３は、成熟したＨｕＬＨＲとＭＬＨＲのアミノ酸配列間の比較を示す。

図４Ａ〜４Ｂは、ＭＬＨＲの単離およびＮ末端配列決定の結果を示す。図４Ａは 、ネズミ膵臓の界面活性剤抽出物からＭｅ１１４モノクローナル抗体アフィニテ ィー・クロマトグラフィーによって精製した物質の５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲルから得た９００００ダルトンのバンドの気相エドマン分解を表す。下線を付 したアミノ酸７〜１５の残基を、図４Ｂに示すオリゴヌクレオチド・プローブを 作成するために選択した。図４Ｂに３２倍に縮重した２６マー（２６量体）・ヌ クレオチド・プローブとして示す。

図５は、Ｍ　Ｌ　ＨＲＣＤ　Ｎ　Ａクローンの一時的発現を表す。レーンＡ−Ｆ を次に説明する。Ａ：Ｍｅｌ１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＭＬＨＲ 発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の溶解液。Ｂ・Ｍｅｌ１ ４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＭＬＨＲ発現プラスミドでトランスフェ クションした２９３細胞の上清。Ｃ：Ｍｅｌ１４モノクローナル抗体で免疫した 、ＨＩＶｇｐ１２０外被糖タンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクシ ョンした２９３細胞の溶解液。Ｄ：Ｍｅｌ１４モノクローナル抗体で免疫沈降し た、ＨＩＶ外被発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の上清。

Ｅ　：　Ｍｅｌ　１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、３８Ｃ１３細胞の上 清。１”　、　１１＊ｓで表面標識し、Ｍｅｌ１４モノクローナル抗体で免疫沈 降した、３８Ｃ１３細胞の溶解液。

図６Ａ〜６Ｃは、ＭＬＨＲと異種であるが、機能的には類似しているタンパク質 配列を示す。“ＭＬＨＲ”と表記した列は図２のＭＬＨＲに相当する。図６Ａは 炭水化物結合ドメインを比較し、図６Ｂは表皮成長因子ドメインを比較し、図６ Ｃは補体結合因子ドメインを比較している。

図７は、ＬＨＲ中に認められるタンパク質ドメインの模式図であり、これにはシ グナル配列、炭水化物結合ドメイン、表皮成長因子（ｅｇｆ）ドメイン、２つの 補体結合ドメイン反復（矢印）、質膜結合ドメイン（ＴＭＤ）、および荷電細胞 内ドメインが含まれる。

図８は、レクチン、レクチン−ｅｇｆおよびレクチン−ｅｇｆ−補体調節モチー フを含有するＭＬＨＲ−Ｉ　ｇＧキメラ類の構築を表す。

図９は、ＭＬＨＲ−Ｉ　ｇＧキメラ類の発現産物および精製物のゲル電気泳動を 示す。

図１Ｏは、種々のＭＬＨＲ−Ｉ　ｇＧキメラ類のポリホスホマンナンエステル（ ＰＰＭＥ）結合分析を示す。

詳細な説明 本明細書で定義されるリガンド結合パートナ−は、標的リガンド分子に特異的に 結合するよう機能することが知られているタンパク質であり、その天然状態では 一般に分泌ポリペプチドもしくは膜結合ポリペプチドとして存在する。典型的な 膜結合型リガンド結合パートナ−には疎水性質膜領域またはリン脂質アンカーが 含まれる。

リガンド結合パートナ−には、受容体、担体タンパク質、ホルモン、細胞接着性 タンパク質（ある細胞に対する他の細胞の接着を指示または誘発するタンパク質 ）、レクチン結合分子、成長因子、酵素、栄養物質などが含まれる。免疫グロブ リン遺伝子スーパーファミリーの構成要素でないか、もしくは上記の説明で除外 したＣＤ抗原類も適切なリガンド結合パートナ−である（Ｋｎａｐｐ等、　ＩＩ Ｉｌｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　１０（８）：２５３−２５８（１９８９） ）。血小板成長因子受容体およびインスリン受容体もリガンド結合パートナ−と して選択できる。リガンド結合パートナ−には全長天然型のみならず、正常なリ ガンドに結合する能力の残っている先端が欠失したアミノ酸配列変種またはその 他のアミノ酸配列変種も含まれる。

本明細書で使用する場合、用語“リガンド結合パートナ−”は免疫グロブリン遺 伝子スーパーファミリーの多形性構成要素および非多形性構成要素、並びに、そ れに相同のタンパク質（例えばクラス■およびクラスＩ＋主要組織適合性抗原、 免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体α、β、アおよびδ鎖、ＣＤＩ、ＣＤ２、ＣＤ４ 、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３のγ、δおよびε鎖、０Ｘ−２、”ｒｈｙ−ｔ、細 胞間または神経細胞接着分子（Ｉ−ＣＡＭまたはＮ−ＣＡＭ）、リンパ球機能付 随抗原−３（ＬＦＡ−３）、神経細胞質タンパク質（ＮＣＰ−３）、ポリーｒｇ 受容体、ミニリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ）、高゛親和性ＩｇＥ受容体、抹消 ミニリンの主要糖タンパク質（Ｐｏ）、血小板由来成長因子受容体、コロニー刺 激因子−１受容体、マクロファージＦｃ受容体、Ｆｃガンマ受容体、ガン胎児性 抗原など）を特に除外する。免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要 素に相同という用語は、この除外のみを目的として、免疫グロブリン遺伝子スー パーファミリーの構成要素の配列を有すること、もしくは、このスーパーファミ リーの既知の構成要素に対して、上に挙げた特定の例が免疫グロブリン可変また は定常ドメインの配列に対して有するアミノ酸配列相同性と同等（もしくはより 高度）のアミノ酸配列相同性を有する配列を、その中に含有することを意味する 。ただしこの記述は、リガンド結合パートナ−融合物がさらに免疫グロブリン遺 伝子スーパーファミリーの構成要素またはその融合物と集合して多量体を形成す る態様を排除しないことに注意すること。

また、用語“リガンド結合パートナ−”からは、分離した遺伝子（複数サブユニ ットボリペプチドを導く単一鎖前駆体ポリペプチドをフードしない遺伝子）によ ってコードされ、そのポリペプチドの少なくとも１サブユニ、トが通常は細胞膜 中に挿入されている複数サブユニット（鎖）ポリペプチド（ＰＣＴ公開Ｗ０９０ １０６９５３（１９９０年６月２８日公開）に例示されている、細胞外マトリッ クス分子のための細胞受容体（例：インテグリン）を含む）も特に除外される。

ただしこの記述は、リガンド結合パートナ−融合物がさらに本段落で定義した複 数サブユニットポリベブチドまたは複数サブユニット・ポリペプチドの融合物と 集合して多量体を形成する態様を排除しないことに注意すること。

安定血漿タンパク質は典型的には約３０〜２０００残基を有し、その天然の環境 において循環中の半減期の延長（例えば約２０時間以上）を示すタンパク質であ る。適切な安定血漿タンパク質の例は、免疫グロブリン、アルブミン、リポタン パク質、アポリポタンパク質およびトランスフェリンである。典型的には、リガ ンド結合パートナ−を、そのリガンド結合パートナ−に増大した半減期を付与し 得る血漿タンパク質またはその断片のＮ−末端で、血漿タンパク質に融合する。

リガンド結合パートナ−は一般にその天然のＣ−末端で血漿タンパク質に融合す る。しかし場合により、リガンド結合パートナ−の（質膜領域および細胞質領域 が削除された）先端欠失型を、実質的に疎水性バイトロバシー特性を示す安定タ ンパク質の一部、典型的には約２０残基以上を有する疎水領域が認められる成熟 安定タンパク質の第１部位、に融合する。このような部位はトランスフェリンに 存在し、アルブミンおよびアポリポタンパク質にも極めて普遍的であり、その同 定に困難は伴わないはずである。次に、リガンド結合パートナ−に増大した血漿 半減期を付与するのに必要な程度の安定タンパク質の残部を融合物中に組み込む 。リガンド結合パートナ−の血漿半減期の増大が約１００％以上なら満足のゆく 結果である。

いくつかの好ましい態様として、結合パートナ−をＬＨＲとする。

ＬＨＲは、図１または図２のＬＨＲと同様の定性的生物活性を有するポリペプチ ドと定義され、好ましくは図１または図２のＬＨＲの炭水化物結合ドメイン、表 皮成長因子ドメイン、もしくは炭水化物結合ドメインと約７０％以上相同なドメ インを含有する。

本明細書では、ＬＨＲに関する相同性を、配列を並べ、必要ならば最大相同性率 を達成するために間隙を導入した後に、図１または図２中の炭水化物結合ドメイ ン、表皮成長因子ドメイン、または補体結合ドメイン中の残基と同一である候補 配列中の残基の百分率と定義する。

本明細書で使用する用語としてのＬＨＨの範囲には、図」または図２に記載した ＨｕＬＨＲまたはＭＬＨＲのアミノ酸配列を有するＬＨＲ１図１または図２のＬ ＨＲと同様の生物活性を示し得る脱グリコジル化ＬＨＲ誘導体または非グリコジ ル化ＬＨＲ誘導体、図１または図２の配列の相同アミノ酸配列変種、および試験 管内で生成したＬＨＲの相同変種および誘導体が含まれる。

ＬＨＲまたはＬＨＲ断片の生物活性を、１）ＬＨＨの少なくとも１つのエピトー プと免疫学的に交差反応するか、もしくは２）Ｌ）（Ｒと質的に同等の少なくと も１つの接着性機能、調節機能またはエフェクター機能を有することと定義する 。

ＬＨＲの定性的生物活性の一例は、リンパ様組織の特殊化した高内皮細胞上のリ ガンドに対する結合である。また、リガンド結合にはしばしばカルシウムなどの 二価カチオンが必要である。

免疫学的に交差反応性という用語は、本明細書では、候補ポリペプチドが、既知 の活性類縁体に対して生じたポリクローナル抗血清とのこの活性を有するＬＨＲ の定性的生物活性を競争的に阻害し得ることを意味する。このような抗血清は、 完全フロイントアジ−パント中の既知の活性類縁体をヤギまたはウサギに例えば 皮下注射した後、追加免疫を不完全フロイントで腹腔内注射または皮下注射する ことによる常法で調製される。

構造的には、図３に示したようにＬＨＨには数個のドメインが含まれ、これらは 次のように同定される（±１０残基以内）：シグナル配列（残基２０〜３２）、 これに続く炭水化物結合ドメイン（図３では“レクチン”ドメインと同定されて いる）（残基３９〜１５５）、表皮成長因子（ｅｇｆ）ドメイン（残基１６０〜 １９３）、補体因子結合ドメイン（残基１９７〜３１７）、質膜結合ドメイン（ ＴＭＤ）（残基３３３〜３５５）および細胞質ドメイン（残基３５６〜３７２） 。ＬＨＲ細胞外ドメインの境界は一般に質膜ドメインのＮ−末端もしくはその約 ３０残基以内にあり、ＬＨＲ配列を精査することによって容易に同定できる。こ れらのドメインはいずれも、あるいはすべて本発明の実施に使用できる。

図６Ａ〜６Ｃは、これらのドメインの３つに対してい（らかの相同性を有する種 々のタンパク質を示している。図６Ａは、炭水化物結合ドメインを示し、図６Ｂ は表皮成長因子ドメインを示し、図６０はいくらか相同な補体結合ドメインを示 している。

図３に掲載したＨｕＬＨＲとＭＬＨＲのアミノ酸配列の比較は、全体の配列相同 性が高度（〜８３％）であることを示している。しかし、ＨｕＬＨＲとＭＬＨＲ に認められる種々のドメイン間の相同性の程度は様々である。例えばＭＬＨＲと ＨｕＬＨＲの間の配列保存度は、炭水化物結合ドメインおよびｅｇｆドメインの 両者では約８３％であるのに対して、第１補体結合反復中の保存度は７９％に減 少し、第２反復では６３％しかなく、補体結合ドメイン全体の相同性は約７１％ である。さらに、ＭＬＨＲの２つの補体結合ドメイン反復は同一であるのに対し 、ＨｕＬＨＲては相違が認められ、ネズミノ反復とも異なっている。興味深いこ とに、質膜配列および周辺領域おけるこれらの２つの受容体間の保存度はほぼ同 一であり、おそらく質膜アンカー領域内に保存的疎水性置換が１つあるだけであ る。

一般にヘルメスと呼ばれる一連のモノクローナルおよびポリクローナル抗体によ って認識される上述の表面糖タンパク質は、本発明の範囲から除外される。

免疫グロブリンおよびそのある種の変異体は既知であり、多くが組換え細胞培養 中で製造されている。例えば米国特許第４７４５０５５号；ＥＰ第２５６６５４ 号；　Ｆａｕｌｋｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ　２９８：２８６（１９ｇ２）；　Ｅ 　Ｐ　１２０６９４　；　Ｅ　Ｐ　１２５０２３　；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ、 　Ｉｍｍｕｎ、１２３ニア９３（１９７９）　；　Ｋｅｌｈｌｅｒ等、　Ｐ、　 Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　ＵＳＡ　７７：２１９７（１９８０）　：　Ｒａ５ｏ等、　 Ｃａｎモ■■ Ｒｅｓ、　４Ｌ：２０７３（１９８１）　；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、　Ａｎｎ、 　Ｒｅｖ、　Ｉｍｏ＋ｕｎｏ１．２：２３９（１９８４）　F　１ｌｌ ｏｒｒｉｓｏｎ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２（１９８５）　；　Ｍｏｒ ｒｉｓｏｎ等、　Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　ＵＳＡ　８１　F　８８ ５１（１９８４）；　ＥＰ２５５６９４　、ＥＰ２６６６６３　、ＷＯ３８１０ ３５５９を参照のこと。再分類された免疫グロブリン鎖も知られている。例えば 米国特許第４４４４８７８号、ＷＯ３８１０３５６５；ＥＰ６８７６３およびこ れらに引用された文献を参照のこと。

普通はリガンド結合パートナ−をＣ−末端で、免疫グロブリンの定常領域のＮ− 末端に融合して、その可変領域を置換するが、結合パートナ−のＮ−末端融合も 望ましい。質膜領域または脂質もしくはリン脂質アンカー認識配列を含有するリ ガンド結合パートナ−のこれらの領域または配列は融合に先立って不活化するか 削除することが好ましい。

典型的な場合、このような融合物は、免疫グロブリン重鎮の定常領域の少なくと も機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを残している。定常ドメ インのＦｃ部分のＣ−末端か、重鎖のＣＨＩまたは軽鎖の対応する領域のすぐＮ −末端側で融合を行うこともある。通常これは、適切なりＮＡ配列を構築し、そ れを組換え細胞培養中で発現させることにより達成される。しかし別法として、 本発明のポリペプチドを既知の方法に従って合成することもできる。

融合を行う正確な部位は重要ではない。特定の部位はよく知られており、結合パ ートナ−の生物活性、分泌または結合特性を最適化するよう選択することができ る。至適部位は定型の実験によって決定されるであろう。

いくつかの態様では、ハイブリッド免疫グロブリンが単量体、あるいはへテロ多 量体またはホモ多量体（特に二量体または四量体）として会合する。一般的にこ れらの会合した免疫グロブリンは、次の模式図で表される既知の単位構造を有す るであろう。基本４鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥがとる形態であ る。高分子量免疫グロブリン中では４鎖単位が反復される。ＩｇＭは一般に、互 いにジスルフィド結合で結合し合った基本４鎖単位の５量体として存在スる。Ｉ ｇＡグロブリン、および場合によってＩｇＧグロブリンも多量体型で血清中に存 在し得る。多量体の場合、それぞれの４鎖単位は同一であり得るし、異なること もあり得る。

本明細書の模式図において、“Ａ”は、そのリガンドに結合し得るリガンド結合 部位を含有するリガンド結合パートナ−の少なくとも一部を意味する。Ｘは追加 の薬剤を表し、これはもう１つの機能性リガンド結合パートナ−（Ａと同一また は異なる）であってもよいし、上に定義した複数サブユニット（鎖）ポリペプチ ド（例えばインテグリン）、あるいは可変領域または可変領域様ドメインなど免 疫グロブリン・スーパーファミリーの構成要素の一部（天然またはキメラ、免疫 グロブリン可変領域を含む）、あるいはシェードモナス外毒素やリシンなどの毒 素、あるいは普通は定常ドメインに結合していないポリペプチド治＃薬であって もよい。ＶＬ、ＶＦＩ、ＣＬおよびｃＫは免疫グロブリンの軽鎖または重鎮可変 または定常ドメインを表す。

これらの模式図が単に一般的な会合免疫グロブリン構造の例であって、すべての 可能性を包含するものではないことは理解されるであろう。例えば数個の興なる Ａ”または“Ｘ″がこれらの構築物いずれかに存在することが望ましいかも知れ ないことは理解されるである単量体・　＾□ｃＬ家たＩよ一 ヘテロニ量体： これらの模式図が単に例示であること、また多量体の鎖が天然の免疫グロブリン と同じ様式でジスルフィド結合していると考えられることは理解されるであろう 。本発明によれば、適切な核酸で形質転換された哺乳類細胞からハリブリッド免 疫グロブリンが容易に分泌される。この分泌型には、結合パートナ−・のエピト ープが重鎖二量体、軽鎖単量体または二量体中に存在するもの、並びに、結合パ ートナ−のエピトープが１または複数の軽鎖または重鎮に融合して存在する重鎮 および軽鎖へテロ四置体（４つまで、あるいは４つすべての可変領域類縁体が置 換されているヘテロ四量体を含む）が含まれる。軽−重鎖非結合パートナー可変 様ドメインが存在する場合、ヘテロ機能性抗体が提供される。

様々な構造の鎖また基本単位を使用することによって、本発明の単量体、ヘテロ 多量体およびホモ多量体および免疫グロブリンを組み立てることができる。これ らの基本単位の特定の例を次の模式図に表し、以下の式を省略するための等価表 示を示す。

本発明によって製造される会合した新規免疫グロブリンの種々の例を以下に模式 的に表す。上に定義した記号に加えて、ｎは整数を表し、Ｙは共有結合的架橋部 分を表す。

（ｃ）ＡＣａ　［ＡＣｇ、ＡＣＬ　ＡＣＭ、ＡＣｔ、ＶＩＩＣＭ、ＶＬＣＬ−Ａ Ｃ，、ＶＬＣＬ−Ｖ、ＣＭ、ＸＣＨ，ＸＣＬ、ＸＣＬ−ＸＣ，、ＸＣｔ、−ＶＨ Ｃ，、ＸＣ，−ＶＬＣＬ、ＸＣＬ−ＡＣＮ、また１ｔＡｃｔ、−ＸＣＨ］；（ｄ ）ＡＣＬ−ＡＣｌｌ−［ＡＣｌｌ、ＡＣＬ−ＡＣＩＩ、ＡＣＬ−Ｖ１４ＣＨ，Ｖ ＬＣＬ　ＡＣＨ，ＶＬＣＬ　ＶＨＣＩＩ、ＸＣＨ，ＸＣＬ、ＸＣＬ　ＸＣＨ，Ｘ ＣＬ−Ｖ、ＩＣ，４，ＸＣＩ（ＶＬＣＬ、ＸＣＬ　ＡＣＨ，またはＡ　ＣＬ−Ｘ 　Ｃｏ］　。

（ｅ）ＡＣｔ、−Ｖ、４ＣＨ−［ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣ）Ｉ、ＡＣＬ−ＶＭＣＩ Ｉ、Ｖｔ。

ＣＬ　ＡＣＨ，ＶＬＣＬ　ＶｓＣｖＸＣ１４，ＸＣＬ、ＸＣｔ　ＸＣｎ、ＸＣＬ −ＶＦＩＣｏ＋　ＸＣ，−ＶＬＣＬ、、ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ　ＸＣ） ｌコ；（ｆ）ＶＬＣＬ　ＡＣＦＩ　［ＡＣＮ、ＡＣＬ　ＡＣＨ，ＡＣＬ　ＶＨＣ Ｈ，ＶＬＣｔ、ＡＣＩＩ、ＶＬＣＬ−ＶＨＣｓ、ＸＣＨ，ＸＣＬ、ＸＣＬ　ＸＣ ｌ１．Ｘ、ＣＬ−ＶＩＩＣＨ，ＸＣＨＶＬＣＬ、ＸＣＬ　ＡＣＨ，またはＡｃＬ 　ＸＣＫ］；（ｇ）　［Ａ　Ｙ］−［ＶＬＣＬ　ＶｇＣ＋＜］ｔ　；（ｈ）ＸＣ ，４たはＸＣＬ−［ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣ，４，ＡＣＬ−Ｖｌ（ＣＭ＋ＶＬＣＬ 　ＡＣＨ，ＸＣｔ、ＡＣｌｌ、またはＡＣＬ−ｘＣ，Ｉコ　。

（１）ＸＣｔ、ＸＣＨ［ＡＣＨ，ＡＣＬ　ＡＣＨ，ＡＣＬ　ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ Ａ　ＣＨ，Ｘ　ＣＬ　Ａ　Ｃ，４，またはＡＣＬ　ＸＣｏ］：（ｊ）ＸＣＬ−Ｖ ＩＩＣＩ！−［ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−Ｖ１４ＣＭ、ＶＬＣＬ　ＡＣ ，４，ＸＣｔ、ＡＣｏ、またはＡＣＬ−ＸＣＨ］：（ｋ）ＸＣＨＶＬＣＬ　［Ａ ＣＨ，ＡＣＬ　ＡＣＦｌ、ＡＣＬ　ＶＦＩＣＨ，ＶＬＣＬ　ＡＣＨ，ＸＣＬ　Ａ ＣＨ，またはＡ　ＣＬＸ　Ｃｎ］　；（＋）ＸＣＬ−ＡＣＨ−［ＡＣ，Ｉ、ＡＣ Ｌ−ＡＣＲ，ＡＣＬ−Ｖ、ＣＨ，ｖｔ。

ＣＬ−ＡＣＭ、ＶＬＣＬ−ＶＨＣＩＩ、ＸＣＨ，ＸＣＬ、ＸＣｔ、−ＸＣＨ，Ｘ ＣＬＶＩＩＣＨ，ＸＣｌ４　ＶＬＣＬ、ＸＣｔ、ＡＣｕ、またはＡＣＬ　ＸＣ１ ！］；（ｍ）ＡＣＬ　ＸＣｏ　ＣＡＣＨ，ＡＣＬ　ＡＣＨ，ＡＣＬ　ＶＩＩＣＦ ｌ、ＶＬＣＬ　ＡＣ，４，ＶＬＣＬ　ＶＨＣＩＩ、ＸＣＨ，ＸＣＬ、ＸＣｔ、Ｘ ＣＨ，ＸＣＬＶＩＩＣＨ，ＸＣＨＶＬＣＬ、ＸＣＬ　ＡＣＨ，またはＡＣＬ　Ｘ ＣＨコ；Ａ、Ｘ、ＶまたはＣを共有結合的架橋部分（Ｙ）で、（Ａ　−Ｙ　）、 、（Ｘ−Ｙ）。などになるように改変してもよい。

リガンド結合パートナ−Ａは、例えば任意にＡよおよびＡ、と表される鎖を有す る複数鎖分子であってもよい。これらの鎖を一単位として、上で単一鎖“Ａ”と 記載した部位に置く。この複数鎖の１本を（残りの鎖が正常な様式で、共有結合 的または非共宵結合的に融合鎖と結合している状態で）、免疫グロブリン鎖の一 本に融合するか、あるいは、リガンド結合パートナ−が２つの鎖を含有する場合 には、１本の鎖を独立して免疫グロブリン軽鎖に融合し、もう１つの鎖を免疫グ ロブリン重鎖に融合する。

ここではリガンド結合パートナ−の１本の鎖だけを安定血漿タンパク質に融合す ることが好ましい。この場合、結合パートナ−鎖の１本と安定血漿タンパク質と の間にペプチド結合による融合を行い、リガンド結合パートナ−の他方の鎖は、 自然に結合している時の様式、例えばジスルフィド結合や疎水相互作用で、融合 鎖に結合させる。ペプチド融合のために選択するリガンド結合パートナ−鎖は、 質膜ドメインを含有する鎖であるべきであり、その融合を本質的にその質膜ドメ インのＮ−末端側から行うか、質膜および細胞質ドメインを置換するように行う であろう。複数の質膜ドメインが存在する場合には、通常、融合（または削除後 の融合）のためにその１つを選択し、他方を非融合のまま残すか、もしくは削除 する。

以下に模式化する構造を有する基本単位は、複数鎖リガンド結合パートナ−を伴 う単量体、ヘテロ多量体およびホモ多量体（特に二量体および三量体）を作成す るために使用するものの例である。

上記の単位構造に使用される２鎖すガンド結合パートナー（“Ａ１およびＡ、” ）を有する新規会合抗体の種々の例を以下に模式的に表す。

（ｎ）　Ａ、Ａ、ＣＬ−［ＡＣ，ＡＣＬ−ＡＣＮ、　ＡＣｔ、−ＶｌｌＩＣＭ＋ 　ＶＬＣＬＡＣＨ，ＶＬ（、ＬＶＦＩＣＨ，ＸＣＮ、　ＸＣＬ、　ＸＣＬ−ＸＣ Ｎ、　ＸＣＬ−ＶｗＣｎ、　ＸＣＮ−ＶＬＣＬ、　ＸＣＬ−ＡＣＮ、　ＡＣＬ　 ＸＣＮ、　Ａ、Ａ、Ｃａ。

Ａ、ＡＩＣＬ、Ａ、ＣＬ　ＡｓＣｕ、ＡＪＣＬ−Ａ、ＣＩＩ、Ａ−ＡＪＣＬ　Ｖ ＨＣＨ。

Ａ、Ａ、Ｃ，ｔ−ＶＬＣＬ、Ａ、Ａ、ＣＬ−ＸＣ，、またはＡ、Ａ、Ｃ，−ＸＣ ，］；（ｏ）Ａ、ＡＪＣＩＩ−［ＡＣＮ、ＡＣｔ、−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ ，Ｖｔ、Ｃｔ。

−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ，ＸＣＬ、ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣ，−Ｖ 、ＣＨ，ＸＣ，−ＶＬＣＬ、ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡａＡ４Ｃｏ。

Ａ、ＡＩＣＬ、Ａ、ＣＬ　ＡＪＣＨ，ＡＪＣＬ　Ａ、ＣＭ、Ａ、ＡｎＣｔ、Ｖ、 ｉＣｕ。

Ａ、ＡＪＣＩＩ　ＶＬＣＬ、Ａ、ｋａＣＬ　ＸＣＨ，またはＡ−ＡｊＣＨＸＣｃ ］；（ｐ）Ａ、、ＣＬ−ＡａｃＨ［ＡＣＨ，、ＡＣＬ　ＡＣＨ，ＡＣＬ　ＶＨＣ ｏ＋ＶＬＣＬ　ＡＣｏ、ＶＬＣＬ　ＶＩＩＣｌｌ、ＸＣＩＩ、ＸＣＬ、ＸＣＬ　 ＸＣＨ，ＸＣＬ−Ｖ、Ｃ，、ＸＣＭ−ＶＬＣＬ、ＸＣｔ、−ＡＣＬ４．　ＡＣＬ −ＸＣ，ｉ、Ａ。

ＡｌＩＣ！Ｉ、Ａ、ＡＩＣＬ、Ａ、Ｃｔ、ｋａｃＨ，ＡＩＩＣＬ　Ａ、ＣＭ、Ａ 、ＡｎＣｔＶＭＣＨ，Ａ＃ＡｎＣＭ−ＶＬＣＬ、Ａ、Ａ、ＣＬ　ＸＣｏ、またｌ ｉＡ、Ａ、ＣＭｘ　ＣＬ］　； （ｑ）ｋｓｃＬ−Ａ、ＣＭ−［ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣｔ、−ＶＨＣＨ。

ＶＬＣＬ−ＡＣ，Ｉ、ＶＬＣＬ−Ｖ、ＣＩｌ、ＸＣＩ（、ＸＣＬ、ＸＣＬ＝−Ｘ ＣＫ、ＸＣＬ−ＶＭＣ，、ＸＣ，Ｉ−ＶＬＣＬ、ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣ Ｈ，Ａ。

Ａ、Ｃ，ｌ、ＡａＡａＣ＋−Ａ、ＣＬ−ＡＪＣ，、Ａ、ＣＬ−Ａ、Ｃ，ｔ、Ａ、 Ａ、ＣＬ−ＶａＣｏ、Ａ、ＡｌＣｌ１　ＶＬＣＬ、に−ＡｓＣＬ−ＸＣｔｘ、ま たｌｔＡ、Ａ、Ｃ。

−Ｘ　Ｃｔ、］　； （ｒ）ＡａＡ４Ｃｔ、−ＶＨＣＨ−［ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣｔ、−ＶＮ ＣＨＩＶＬＣＬ−ＡＣ，、ｖＬｃ、Ｌ−ｖＨｃＩ４．ｘｃｏ、ｘＣｔ、、ＸＣＬ 　ＸＣ１４＋　ＸＣＬ　ＶＭＣＨ，ＸＣＩｔ−ＶｔＣＬ、ＸＣｔ、ＡＣＩＩ、Ａ ＣＬ　ＸＣｎ、Ａ。

ＩｃＨ，Ａ、ＡＪＣＬ、ｉｃｔ、−ＡＪＣＩＩ　Ａ、ＣＬ−Ａ、ＣＭ、Ａ、ＡＪ ＣＬＶ　Ｉ４ｃ　Ｈ，Ａ　−Ａ　ａＣｎ　Ｖ　ＬＣＬ、Ａ−ｋｓｃ　Ｌ−Ｘ　Ｃ ＝１．まｆ−ｉｔ　Ａ　−Ａ　ａ　Ｃｇ−ＸＣＬ］。

（ｓ）ｋａＡａｃｌｌ−ＶＬＣＬ−［ＡＣＭ、Ａｃｔ、−ＡＣｕ＋　ＡＣｔ、− ｖｏｃａｌＶｔ、Ｃｔ、−ＡＣｓ、ｖＬｃＬ−ｖ、ｃ、、ｘｃｎ、ＸＣＬ、ＸＣ ｔ、−ＸＣａ、ＸＣｔ、ＶＮＣＩＩ、ＸＣＨＶＬＣＬ、ＸＣＬ　ＡＣＩｌ、Ａｃ Ｌ−ＸＣａ、Ａ−ｋａＣｕ、Ａ−ＡａＣＬ、Ａ、ＣＬ　ｋｓｃｇ、ＡＪＣＬ　Ａ −ＣＢ、Ａ−ＡＪＣＬＶ＊ＣＭ、Ａ、Ａ、ＣＨＶｔ、ＣＬ、Ａ、Ａａｃｔ、ＸＣ ，！？ｌｔＡ、Ａ、Ｃｕ−ＸＣＬ］； （ｔ）Ａ、ＡＩＣＬ　ＸＣＮ　［ＡＣｓ、ＡＣＬ　ＡｃＨ，ＡＣＬ　ＶＭＣｓ。

ＶＬＣＬ　ＡＣＨ，ＶＬＣＬ　ＶＩＩｃＨｌＸＣＨ，ＸＣＬ；　ＸＣＬ　ＸＣＨ ，ＸＣｔ、−ＶｏＣＨ＋　ＸＣＨ−ＶＬＣＬ、ＸＣＬ−ＡＣ，、ＡＣＬ−ＸＣＨ ，Ａ。

Ａ、Ｃｎ、Ａ、ＡＩＣＬ、Ａ、Ｃ，−ＡｊＣ，、Ａ、ＣＬ−Ａ、Ｃ，、Ａ＃Ａａ ＣＬ。

−ＶＭＣＨ，Ａ、ＡＩＩＣＨ−ＶＬＣＬ、　ＡａＡ、Ｃｔ、ＸＣｎ、まタハＡ　 、　Ａ　ａ　Ｃｎ−Ｘ　ＣＬ］　； （ｕ）Ａ、ＡｎＣＨ−ＸＣＬ−［ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＩｌ、ＡＣｔ、−Ｖ１４ Ｃｏ＋ＶＬＣＬ−ＡＣ，、ＶＬＣＬ−Ｖ、ＣＨ，ＸＣＨ，ＸＣＬ、ＸＣＬ−ＸＣ ，、ＸＣＬ　ＶＩＩＣＨ，ＸＣＨＶＬＣＬ、ＸＣＬ　ＡＣＩＩ、ＡＣＬ　ＸＣ＋ １．Ａ。

Ａ、Ｃイ、Ａ、ＡｓＣＬ、Ａ−ＣＬ　ＡＪＣ□、Ａ　ａ　Ｃｔ、Ａ　、　ＣＭ、 Ａ　−Ａ　ａ　Ｃｂ−ＶＩ４ＣＨ，Ａ、Ａ、Ｃ＋４　ＶＬＣＬ、Ａ、ＡａＣＬ　 ＸＣ，ｌ、またはＡ、Ａ、Ｃ。

Ｘ　ＣＬコニ 上の表に示した構造は単に重要な特徴を示すだけであり、例えば上記の構造は免 疫グロブリンの結合（Ｊ）ドメインや他のドメインを示しておらず、またジスル フィド結合も示していない。これらを簡潔のために省略する。しかし、そのよう なドメインが結合活性にとって必要な場合には、その場合に応じて結合パートナ −または免疫グロブリン分子中でそれらが占める通常の位置にそのようなドメイ ンが存在すると見なされるべきである。

免疫グロブリンｖＬｖＨ抗体結合部位が上に示されている場合、あるいはＸ　Ｃ ＬまたはＸ　ＣＫが示されておりＸが免疫グロブリン可変領域を表す場合は、そ れが予め決定した抗原に結合し得ることが好ましい。適切な免疫グロブリン結合 部位および融合パートナ−はｔｇＧ−１、−２、−３、または−４サブタイプ、 ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ。

またはＩｇＭから得られるが、ＩｇＧ−１が好ましい。上記の模式的例は二価抗 体の代表例である。より複雑な構造は、他のクラス（例えばｆｇＭ）由来の免疫 グロブリン重鎮配列を使用することによって育されるであろう。

特に好ましい態様は、リンパ様組織内皮のための結合部位を含有するＬＨＲのＮ −末端部分の、免疫グロブリンＧ、のエフェクター機能を含有する抗体のＣ−末 端Ｆｃ部分への融合物である。この種類には２つの好ましい態様がある。その１ つは、全重鎮定常領域がＬＨＲの一部に融合している態様であり、もう１つはＩ ｇＧＦｃを化学的に定義するパパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域に始まる 配列（重鎮定常領域の第１残基を１１４として残基２１６　（Ｋａｂａｔ等、５ ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｓｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ ｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、第４版、１９８７）、もしくは他の免疫グロブリンの 類似の部位）がＬＨＲの一部に融合している態様である。後者の態様を実施例４ に記述する。

本発明のこれらの組成物、特にリガンド結合パートナ−の生物活性部分で免疫グ ロブリン鎖の可変領域が置換されているものは、生体内血漿半減期の改善を示す と考えられる。これらのハイブリ、ド免疫グロブリンは、免疫グロブリン様ドメ インで免疫グロブリンの可変領域が置換されている構築物と同様の方法で構築さ れる。例えばＣａｐｏｎ等、　Ｎａｔｕｒｅ　３３７：５２５−５３１（１９８ ９）　；　Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ　３３９６８−７０（１９８ ９）　：　Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　８４：２９３６−２９４０（１９８V） 、公開欧州出願Ｅ　ＰＯＯ３２５２２４Ａ２を参照のこと。本発明のハイブリ、 ド免疫グロブリンは、ある種の抗体由来の可変ドメインで別の種の可変ドメイン が置換されているキメラ抗体と同様の方法でも構築される。例えばＥ　Ｐ　０１ ２５０２３　；　Ｍｕｎｒｏ、　Ｎａｔｕｒｅ　３１２：（１９８４年１２月１ ３日）　；　ｌ１６ｕｂｅｒｇｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：（１９８４年１ ２月１３日）　；　５ｈａｒｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ　３０９：（１９８４年５月 ２４日）　；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、 　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳ` ８１：６８５Ｌ−６８５５（１９８４）　：　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２２９：１２０２−１２０７（１９８５）；　Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ等、Ｎ ａｔｕｒｅ　３１２：６４３−６４６（１９８４年１２月１３日）を参照のこと 。

結合パートナ−をコードするＤＮＡを、目的の結合パートナ−ドメインをコード するＤＮＡの３°末端かその近位、およびその成熟ポリペプチドのＮ−末端をコ ードするＤＮＡかその近傍（異なるリーダーの使用を計画する場合）、もしくは 結合パートナ−のＮ−末端コード領域かその近位（天然のシグナルを使用する場 合）で、制限酵素によって切断する。次にこのＤＮＡ断片は、免疫グロブリン軽 鎖または重鎮定常領域をコードするＤＮＡに容易に挿入でき、必要ならば欠失変 異法によって加工する。ヒトのインビボ（生体内）療法にこの変種を利用したい 場合は、これがヒト免疫グロブリンであることが好ましい。

ＬＨＲ細胞外ドメインは一般にそのＣ−末端で免疫グロブリン定常領域に融合す る。融合を行う正確な部位は重要でない。可溶性ＬＨＲ−１ｇ融合物の分泌や結 合特性を最適化するために、細胞外領域近傍または細胞外領域内の他の部位を選 択してもよい。至適部位は定型の実験によって決定されるであろう。融合は典型 的には質膜ドメインおよび細胞質ドメインの両方またはそのどちらかを置換する 。

免疫グロブリン軽鎖または重鎮定常領域をコードするＤＮＡは既知であるか、も しくはｃＤＮＡライブラリーから容易に入手可能であるか、あるいは合成できる 。例えばＡｄａｍｓ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９：２７１１−２７１９ （１９８０）　：　Ｇｏｕｇｈ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９：２７０ ２−２７１０（１９８０）　；　ＤｏｌｂＹ等、　Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　Ｕ ＳＡ、　７７：６０２７−６’０３１（１９８０）　；　Ｒｉｃｅ等、　Ｐ、　 Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　ＵrＡ　７９　ニア８ ６２−７８６５（１９ｇ２）　；　Ｆａｌｋｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ　２９８： ２８６−２８８（１９８２）　；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２：２３９−２５６（１９８４）を参照のこと。

ＬＨＲをコードするＤＮＡ配列を本明細書に記載する。既知の、あるいはｃＤＮ Ａライブラリーから容易に入手可能な他の望ましい結合パートナ−をコードする ＤＮＡ配列も本発明の実施に適している。

本発明の融合物をコードするＤＮＡを、発現用の宿主細胞に導入する。多量体を 望む場合には宿主細胞を、その多量体を構成する各鎖をコードするＤＮＡで形質 転換するが、この際、その多量体の鎖を目的の様式で組み立て得るように宿主細 胞を最適に選択する。宿主細胞がトランスフェクション前に免疫グロブリンを産 出している場合には、軽鎖または重鎮に融合した結合パートナ−でトランスフェ クションするだけでヘテロ抗体を生産することができる。結合パートナ−ドメイ ンを保持する１または複数のアームと、付随の可変領域を保持する１または複数 のアームを有する前記の免疫グロブリンは、結合パートナ−リガンドと抗原また は治療的部分について２重の特異性を賢す。多重に同時形質転換した細胞を上述 の組換え法と共に用いることによって、例えば上述のへテロ四量体免疫グロブリ ンなど、多重特異性を有するポリペプチドが生産される。

一般的に、融合物は細胞内で発現し、よく分泌されるが、種々の融合物の組換え 宿主からの分泌程度にはいつもかなりの多様性が認められることがわかった。

また、異なる特異性を有する免疫グロブリンから完全なヘテロ抗体を生産する方 法は既知である。これらの方法をインビトロ合成に採用するか、もしくは免疫グ ロブリンまたは免疫グロブリンハイブリッドを過去に使用した場合にはその結合 パードナー−免疫グロブリン鎖を単に置換することによるヘテロキメラ抗体の生 産に採用する。

ヘテロ機能性抗体生産の別法として、結合パードナー−免疫グロブリン融合物を 産出する宿主細胞（例えばトランスフエクノヨンした骨髄騰）を、ある抗原に対 して望ましい付随特異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマまたはＢ細胞と 融合する。ヘテロ二機能性抗体をこのようなハイブリドーマの培養培地から回収 することによって、従来のインビトロ再分類法（ＥＰ　６８７６３）より多少便 利にヘテロ二機能性抗体を生産することができる。

本発明はＬＨＲまたは他の結合パートナ−のアミノ酸配列変種をも包含する。結 合パートナ−のアミノ酸配列変種は種々の意図で調製され、これらの意図にはリ ガンドに対する結合パートナ−の親和性の増大、結合パートナ−の安定性、精製 および調製の助成、血漿半減期の修正、治療的効用の改善、およびその結合パー トナ−を治療的に使用する際の副作用の発生またはその重篤度の減少が含まれる 。以下の議論に、他のリガンド結合パートナ−として選択し得る変種の典型例で あるＬＨＨのアミノ酸配列変種について記述する。

リガンド結合パートナ−のアミノ酸配列変種は次の３種類のうちの１または複数 に分類できる：挿入変種、置換変種、または欠失変種。これらの変種は通常、リ ガンド結合パートナ−をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドへの部位特異的変異 導入によって変種をコードするＤＮＡを得た後、そのＤＮＡを組換え細胞培養中 で発現させることによって生産される。しかし、約１００〜１５０アミノ酸残基 までの断片ならばインビトロ合成によって便利に製造できる。以下の議論は部分 的にＬＨＲに関するものであるが、リガンド結合パートナ−の構造または機能に 適用できる範囲で、あらゆるリガンド結合パートナ−に対して適合し、等しい効 果を与える。

ＬＨＲのアミノ酸配列変種は、天然には認められないか、もしくは天然の対立遺 伝子に認められない予め決定された変種である。ＬＨＲ変種は典型的には天然に 存在するＨｕＬＨＲまたはＨＬＨＲＩｉ縁体と同じ性質の生物活性（例えばリガ ンド結合活性）を示す。しかし、そのリガンドを結合できないＬＨＲ変種および 誘導体であっても、少なくとも１つのＬＨＲエピトープが活性なまま残っている 限り、（ａ）ＬＨＲまたはＬＨＲに対する抗体の診断的検定で用いる試薬として 、（ｂ）既知の方法で不溶化した場合には、抗血清またはハイブリドーマ培養上 清から抗ＬＨＲ抗体を精製するための試薬として、および（Ｃ）Ｌ　ＨＨに対す る抗体を引き出すための免疫原として、あるいは免疫検定キットの構成要素（天 然ＬＨＲに対する競争的試薬として襟識したもの、またはＬＨＲ検定の標準とし て非標識のもの）として有用である。

アミノ酸配列変異の導入部位は予め決定するが、変異自体を予め決定する必要は ない。例えば、ある部位における変異の効果を最適化するために、ランダム（無 作為）または飽和変異法（考え得る２０残基のすべてを挿入する）を標的コドン で実施し、発現したＬＨＲ変種を、望ましい活性の最適な組み合わせについてス クリーニングする。このようなスクリーニングは当該分野では常法に属する。

アミノ酸挿入は通常約１〜１ｏアミノ酸残基程度であろう。置換は典型的にはｌ 残基に対して導入する。欠失（削除）は約１〜３ｏ残基の範囲であろう。削除ま たは挿入を隣接した対で行うこと、即ち２残基の削除または２残基の挿入が好ま しい。置換、削除、挿入およびそれらのあらゆる組み合わせを導入または組み合 わせることにより最終構築物に到達することは以下の議論からよくわかるであろ う。

ＬＨＲの挿入アミノ酸配列変種は、ＬＨＨにとって異種のアミノ酸残基の１また は複数が標的ＬＨＲ中の予め決定した部位に導入され、先に存在していた残基を 移動させたものである。

通常、挿入変種はＬＨＨのアミノまたはカルボ牛シル末端に対する異種タンパク 質またはポリペプチドの融合物である。このような変種を、ＬＨＲ中の挿入を行 った位置に通常に認められるもの以外の配列を含有するポリペプチドとＬＨＲと の融合物と言う。融合物のいくつかの群はこれに包含される。

本発明の新規ポリペプチドは、免疫アフィニティー技術（これ自体は既知である ）によるリガンド結合パートナ−の診断または精製に有用である。あるいは、結 合パートナ−の精製に際し、この新規ポリペプチドを使用することによって、不 純な混合物から融合物を吸着させた後、その融合物を溶出させ、所望により、結 合パートナ−を融合物から例えば酵素的切断によって回収する。

結合パートナ−の望ましい融合物（免疫学的に活性であっても活性でなくてもよ い）には、成熟結合パートナ−配列とその結合パートナ−にとって異種のシグナ ル配列との融合物が含まれる。

ＬＨＲの場合および他の選択された結合タンパク質に関して望ましい場合、ＬＨ Ｒの分泌をより迅速に指示するためにシグナル配列融合物を使用する。異種シグ ナルで天然のＬＨＲシグナルを置換し、得られた融合物が認識される場合、即ち 宿主細胞によるプロセ／ングを受けて切断される場合に、ＬＨＲが分泌される。

意図する宿主細胞に基づいて／グナルを選択し、これらのシグナルには細菌、酵 母、哺乳類およびウィルスの配列が含まれ得る。天然のＬＨＲシグナルまたはヘ ルペスｇＤ糖タンパク質シグナルが哺乳類発現系での使用に適している。

置換変種は、図１または図２の配列の少なくとも１残基が除去され、その位置に 異なる残基が挿入されたものである。ＬＨＲの特徴を微細に調節したい場合には 、このような置換は一般に次の表１に従って行われる。

Ａｓｎ　ｇｌｎ；ｈｉｓ Ａｓｐ　ｇｌｕ Ｃｙｓ　ｓｅｒ：ａｌａ Ｈｉｓ　ａｓｎ；ｇｌｎ ｌｌｅ　Ｉｅｕ；ｖａｔ Ｌｅｕ　ｉｌｅ；ｖａｔ Ｌｙｓ　ａｒｇ：ｇｌｎ；ｇｌｕ Ｍｅｔ　’　ｌｅｕ：１ｌｅ Ｐｈｅ　ｍｅｔ　；　Ｉｅｕ；　ｔｙｒＴｙｒ　ｔｒｐ；ｐｈｅ 新規アミノ酸配列は活性中心類縁体（アミノ酸ないし他の方法）と共に本発明の 範囲に含まれる。

機能または免疫学的同一性の本質的な変化は、表１の置換より保存性の少ない置 換を選択することによって、即ち、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造 （例えばンートまたはラセン立体配座）、（ｂ）標的部位における分子の電荷ま たは疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の嵩高さ、の維持に対する効果がより有意に異 なる残基を選択することによって起こる。一般的にＬ　ＨＲの性質に最も大きな 変化を貸すと考えられる置換は次の置換であろう：（ａ）親水性側鎖（例　セリ ンまたはスレオニン残基）で（を）疎水性残基（例・ロイシン、イソロイシン、 フェニルアラニン、バリンまたはアラニン残基）を（で）置換する。（ｂ）シス ティンまたはプロリンで（を）他の残基を（で）置換する：（Ｃ）正荷電側鎖を 有する残基（例：リジン、アルギニンまたはヒスチジン残基）で（を）負荷電残 基（例：グルタミン酸またはアスパラギン酸残基）を（で）置換する。もしくは 、（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例：フェニルアラニン）で（を）側鎖をもた ない残基（例、グリシン）を（で）置換する。

削除、挿入、および置換のいくつかは、ＬＨＲ分子の性質に極端な変化を貸さな いであろう。しかし置換、削除または挿入を行う前にその正確な効果を予測する ことが困難な場合、例えばＬＨＲ炭水化物結合ドメインまたは免疫エピトープを 改変する場合、その効果を日常的なスクリーニング法で評価することを当業者は 望むであろう。例えば典型的な場合、変種は、ＬＨＲコード核酸への部位特異的 変異導入、組換え細胞培養中でのその変種核酸の発現、および任意に、例えば（ 少なくとも１つの残存免疫エピトープによってその変種を吸着するための）ポリ クローナル抗ＬＨＲカラムでの免疫アフィニティー吸着による、その細胞培養か らの精製によって作成される。次に、その細胞溶解液または精製ＬＨＲ変種の活 性を、目的の特徴に適したスクリーニング検定法でスクリーニングする。例えば 、Ｍｅｌ−１４などのある抗体に対する親和性など、ＬＨＲの免疫学的特徴の変 化を、競争型免疫検定法で測定する。ＬＨＲの生体内での機能についてより多（ のことがわかるようになれば、他の検定法もこのようなスクリーニングに有用に なるであろう。酸化還元安定性、熱安定性、疎水性、タンパク質加水分解減成に 対する感受性、担体との会合傾向、あるいは多量体への会合傾向などのタンパク 質の性質の変化は、当業者によく知られた方法で検定する。

ＬＨＲの置換変種には、上に定義したＬＨＲドメインの１または複数が、常法に よって他のタンパク質の機能的に相同なドメインに置換されている変種も含まれ る。変種がＬＨＲの特定のドメインの断片である場合、本明細書に定義した対応 するＬＨＲドメインに対して少なくとも〜７０％相同であることが好ましい（た だし必須ではない）。このような置換可能なドメインの供給源として、当業者は 図６Ａ〜６Ｃを使用することができる。例えば、図６Ａに配列を示したニクバエ レクチンを改変してＬＨＲの炭水化物結合ドメインと少なくとも〜７０％相同な 程度にし、これでそのドメインを置換することができる。同様に、図６Ｂに配列 を示した凝固因子Ｘを改変してＬＨ’Ｒのｅｇｆ−ドメインと少なくとも〜７０ ％相同な程度にし、これでそのドメインを置換することができる。同様の置換を シグナル配列、補体結合ドメイン、質膜ドメインおよび細胞質ドメインに対して 行うことも望ましいであろう。

ＬＨＲ変種のもう１つの種類は欠失変種である。欠失（削除）はＬＨＲ配列から １または複数のアミノ酸残基を除去することを特徴とする。典型的には、ＬＨＲ の質膜および細胞質ドメイン、もしくは細胞質ドメインのみを削除する。しかし 、ＬＨＨの生物活性または免疫交差反応性が保存されるような、ＬＨＲＣ−末端 から質膜領域のＮ−末端側の他の適切な部位までの欠失が適切である。ＬＨＲの アミノ酸配列解明の過程で今までに得られているタンパク質消化断片と、上に同 定したＬＨＲドメインのいずれかに対して〜７０％より小さい相同性を有するタ ンパク質断片は欠失変種の範囲から除外される。

免疫グロブリン融合物は、補体結合ドメイン、炭水化物ドメイン、および表皮成 長因子ドメインなどのＬＨＲ断片を用いて製造できる。

補体結合ドメイン融合物は補体媒介性疾患の診断および治療、並びに、この融合 物とＬＨＲまたはリンパ球表面上の他の成分とのオリゴマー化に有用である。

システィンまたは他の不安定残基の削除も、例えばＬＨＲの酸化安定性を増大さ せる際に望ましいであろう。潜在的タンノくり加水分解部位（例：　ＡｒｇＡｒ ｇ）の削除または置換は、その塩基性残基の１つを削除するか、もしくはグルタ ミン残基またはヒスチジン残基で置換することによって達成される。

ある態様では、ＬＨＲが補体結合ドメインおよび／またはｅｇｆドメインを伴わ ない炭水化物結合ドメインで構成される。この態様は質膜および細胞質領域の一 方または両方を含有してもよいし、含有しなくてもよい。

置換または欠失変異の好ましい種類は、ＬＨＲの質膜領域が関与するものである 。ＬＨＲサブユニ・ｙ！’の質膜領域は、細胞膜の脂質二重層をまたぐのに適切 な大きさを有する高度に疎水的または親油的なドメインである。これらはＬＨＲ を細胞膜中に固定すると考えられ、ＬＨＲとのホモまたはへテロ多量体錯体形成 を可能にする。

典型的には質膜ドメイン・ヒドロキシル化残基の削除または置換によって！され るｌ、ＨＲおよび質膜ドメインが存在する他の結合パートナ−の質膜ドメインの 不活化は、その細胞または膜脂質親和性の減少および水溶性の改善によって回収 および製剤化を容易にするであろう。質膜および細胞質ドメインを削除すれば、 その身体によって外来と認識されるかも知れない本来ならば細胞内にあるポリペ プチドの露出か、もしくは潜在的に免疫原性の異種ポリペプチドの挿入による潜 在的免疫原性エピトープの導入が回避される。膜結合機能の不活化は、この部位 に本質的な親水性バイトロバシー特性を鵞すのに充分な数の残基を削除するか、 もしくはこれと同じ結果を達成する異種残基で置換することによって達成される 。

賞嘆失活ＬＨＲの基本的な利点は、それが組換え宿主の培養培地中に分泌される 得ることである。この変種は、血液などの体液に可溶であり、容易に感知できる ような対細胞膜脂質親和性を有さないので、組換え細胞培養からの回収がかなり 簡単になる。

一般的提案として、すべての変種は機能的な質膜ドメインを有さず、また、機能 的な細胞質配列を有さないことも好ましいであろう。

例えば質膜ドメインを、完全に親水性バイトロバシー特性を示すアミノ酸配列（ 例：約５〜５０のセリン、スレオニン、リジン、アルギニン、グルタミン、アス パラギン酸などの親水性残基からなる無作為または予め決定された配列）で置換 することができる。欠失（先端削除型）ＬＨＲと同様に、これらの変種は組換え 宿主の培養培地中に分泌される。

ＨｕＬＨＲアミノ酸配列変種の例を次の表に記載する。残基番号に続く残基は、 置換アミノ酸または挿入されたアミノ酸を示す。

（以下余白） 表２ Ａｒｇ５８−Ａｓｐ５９　：　Ｌｙｓ−Ｇｌｕ　Ｇ１ｙ９６−１１ｅ９７　６７ −Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−ＡｌａＡｌａ７１　：　Ｓｅｒ　Ａｓｎ１３６　８３−Ｇｌ ｙ−Ｔｈｒ−ＴｈｒＬｙｓ７８　：　Ｇｉｎ　５ｅｒ１６６　２０９−ＡｓｎＡ ｓｐＨ６：　Ｇｌｕ　５ｅｒ２２０　２９２−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−ＴｙｒＬｅｕ１ ５０　：　Ｖａｌ　Ａｓｎ２７１　２４Ｌ−ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ１８１６８ 　：　Ｇｉｎ　ｌ１ｅ２９６１１ｅ１７４　：　Ｌｅｕ Ａｓｎ１８１　：　Ｇｉｎ Ｔｈｒ２１１　：　５ｅｔ Ｐｈｅ２１４　：　Ｌｅｕ Ｓｅｔ２２６　：　Ｔｈｒ Ｐｈｅ２４４　：　Ｍｅｔ Ｔｈｒ２８２　：　５ｅｒ １１ｅ２８８　：　Ｖａｌ Ｌｙｓ２９８−Ｌｙｓ２９９　：＾ｒｇ−＾ｒｇ１１ｅ３０２　：　Ｌｅｕ これらの変種は保存的置換体であることが好ましい。いくつかの変種が生物活性 の減少または欠失を示すであろうことは理解されるであろう。これらの変種であ っても、ＬＨＲの免疫エピトープを少なくとも１つ保持している限り、ＬＨＨの 免疫検定の標準として有用である。

グリコジル化変種はＨｕＬＨＨの範囲に含まれる。これらにはグリコジル化が完 全に欠如している（非グリコジル化）変種、天然型より少な（とも１つグリコジ ル化部位が少ない（脱グリコジル化）変種およびグリコジル化が変化している変 種が含まれる。脱グリコジル化および非グリコジル化アミノ酸配列変種、天然の 非改変ＬＨＲアミノ酸配列を有する脱グリコフル化および非グリ“コシル化ＬＨ Ｒ１および他のグリコジル化変種が含まれる。例えば、置換または欠失変異法を 使用することによりＬＨＲのＮ−または〇−結合型グリコシル化部位を除去する （例えばアスパラギン残基を削除するか、もしくはリジンまたはヒスチジンなど 別の塩基性残基で置換する）。あるいは、グリコジル化認識部位を除去すること によってグリコジル化を阻害するために、アスパラギン残基には手を加えないが 、グリコジル化部位を形成する隣接残基を置換または削除する。

別法として、原核生物はポリペプチドにグリコジル化を導入できないので、天然 ＬＨＲのアミノ酸配列を有する非グリコジル化ＬＨＲを組換え原核細胞中で生産 する。

グリコジル化変種を、適切な宿主を選択することによって、もしくはインビトロ 法で製造する。例えば酵母は哺乳類系とはかなり異なるグリコジル化を導入する 。同様に、そのＬＨＲとは異なる種（例：ハムスター、ネズミ、昆虫、ブタ、ウ シまたはヒツジ）あるいは異なる組轍起源（例：胛、肝臓、リンパ様、開票、表 皮）の哺乳類細胞も、例えばマンノースレベルの増大、またはマンノース、フコ ース、シアル酸、および哺乳類糖タンパク質に典型的に認められる他の糖類の比 の変化によって特徴づけられる変種グリコジル化を導入する能力について常法で スクリーニングする。ＬＨＲのインビトロ・プロセシングは典型的には酵素的加 水分解（例・ノイラミニダーゼ消化）によって達成される。

ＬＨＲ分子の共を結合による修飾はその範囲に含まれる。このような修飾は、回 収したタンパク質の標的アミノ酸残基を、選択した側鎖または末端残基と反応し 得る有機誘導体化試薬と反応させるか、もしくは選択した組換え宿主細胞中で機 能する翻訳後修飾の機構を利用することによって導入される。得られた共冑結合 的誘導体は、生物活性、ＬＨＲの免疫検定、あるいは組換えＬＨＨの免疫アフニ ティー精製用の抗ＬＨＲ抗体の調製にとって重要な残基を同定するだめの研究に 有用である。例えば、ニンヒドリンとの反応後にそのタンパク質の生物活性が完 全に失活したら、少なくとも１つのアルギニンまたはりジン残基がその活性に必 須であることが示唆され、その後、修飾されたアミノ酸残基を含冑するペプチド 断片を単離することによって、選択した条件下で修飾された個々の残基を同定す る。このような修飾は当該技術分野では常法に属し、不都合な実験を伴わずに実 行される。

（以下余白） 二官能性試薬による誘導体化は、ハイブリッド免疫グロブリンとポリペプチドと の分子間会合体を製造するため、およびハイブリッド免疫グロブリンをそのリガ ンドの検定またはアフィニティー精製で使用するための非水溶性支持マトリック スまたは表面に架橋するために有用である。さらに、路内架橋の研究も立体配座 構造に関する直接的情報を提供するであろう。一般に使用される架橋試薬には、 １．１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類（例　４−アジドサリチル酸とのエス テル）、ジスクシンイミジルエステル類（例：３゜３°−ジチオビス（スクシン イミジル−プロピオネート））を含むホモ二官能性イミドエステル類、およびビ ス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミド類が含まれる 。メチル−３−［（ｐ−アジド−フェニル）ジチオコブロビオイミデートなどの 誘導体化試薬によって、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化が可能な中間体 を得ることができる。別法として、米国特許第３９５９０８０号、同第３９６９ ２８７号、同第３６９１０１６号、同第４１９５１２８号、同第４２４７６４２ 号、同第４２２９５３７号、同第４０５５６３５号、同第４３３０４４０号に記 述された系反応性基質および臭化シアン活性化炭水化物などの活性な非水溶性マ トリックスをタンパク質の固定化および架橋に使用する。

ある種の翻訳後誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作 用の結果である。グルタミンおよびアスパラギン残基はしばしば翻訳後に脱アミ ド化されて対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基になる。あるいは、 これらの残基を温和な酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のいずれの形 管も本発明の範囲に包含される。

他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリンまたはス レオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジ ン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ、　Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｐｒｏ ｔｅｉｎｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒ ｔｉｅｓ、　Ｗ、　ＩＩｌ、　Ｆ窒■■ ｍａｎ　＆　Ｃｏ、　、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　７９〜８６頁（１９ ８３））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および（いくつかの例では）Ｃ−末端 カルボキシルのアミド化が含まれる。

他の誘導体は、非タンパク質性重合体（ポリマー）に共有結合した本発明の新規 ポリペプチドからなる。通常、非タンパク質性重合体は親水性合成ポリマー、即 ち天然には認められないポリマーである。

しかし天然に存在し、組換え法またはインビトロ法で製造したポリマーも、天然 から単離したポリマーと同様に有用である。親水性ポリビニルポリマー（例えば ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドン）は本発明の範囲に含まれる 。特に有用なものは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポ リオキシエチレンエステル類、メトキシポリエチレングリコールなどのポリアル キレンエーテル類：ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオ キシエチレンとポリオキシプロピレンのブロック共重合体（プルロニクス（Ｐｌ ｕｒｏｎｉｃｓ））などのポリオキシアルキレン類：ポリメタクリレート類；カ ルボマー（ｃａｒｂｏａ＋ｅｒ）類：筒車量体り−マンノース、Ｄ−およびＬ− ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、 Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクトウロン酸、Ｄ−マヌロン酸（例えば ポリマヌロン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、 Ｄ−グルコースおよびノイラミン酸からなる分枝状または非分枝状多糖類（乳糖 、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デ キストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲンなどのホモ多糖類およ びヘテロ多糖類、または酸ムコ多糖類の多糖サブユニット（例：ヒアルロン酸） を含む）；ポリソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコール・ポリ マー；ヘパリンまたはヘパロンである。

多糖が天然のグリコジル化または組換え発現に付随して生じるグリコジル化であ る場合、その置換部位は、追加または置換Ｎ−または〇−−合部位がその分子中 に導入された、天然のＮ−または〇−結結合型グリコシル化部位は異なる位置で あってもよい。このようなポリマーの混合物を使用してもよく、またポリマーが 均一であってもよい。架橋前のポリマーは水溶性であることが（必要ではないカ リ好ましく、最終的複合体は水溶性でなければならない。さらに、ポリマーはそ の複合体型において高度に免疫原性であってはならず、静脈内注入または注射に よる投与を意図する場合には、そのような方法に適合しない粘度であってはなら ない。

ポリマーが反応性の基を１つだけ含有することが好ましい。このことはタンパク 質分子の架橋を避けるために役立つ。しかし、架橋を減少させるために反応条件 を最適化すること、あるいは、本質的に均一な誘導体を回収するためにゲル濾過 またはクロマトグラフィー的ふるいを通して反応生成物を精製することは本発明 の範囲に含まれる。

ポリマーの分子量は約１００〜５０００００の範囲であることが望ましく、好ま しくは約１０００〜２００００である。選択する分子量はそのポリマーの性質と 置換の程度に依存するであろう。一般に、ポリマーの親水性が大きく、置換の程 度が大きいほど、使用できる分子量は低くなる。至適分子量は日常的な実験で決 定されるであろう。

一般に、ハイブリッドの１または複数のアミノ酸もしくは糖残基およびポリマー と反応する多官能性架橋試薬を通して、ポリマーを本発明のハイブリッド免疫グ ロブリンに共有結合させる。しかし、誘導体化したポリマーをハイブリッドと反 応させることによってポリマーを直接架橋すること、またはその逆も本発明の範 囲に含まれる。

ハリブリッド免疫グロブリン上の共有結合架橋部位には、Ｎ−末端アミン基、リ ジン残基に存在するε−アミノ基、および他のアミン基、イミノ基、カルボキシ ル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基あるいは他の親水性基が含まれる。多 官能性（通常は二官能性）架橋試薬を使用せず、ポリマーを直接ハイブリッドに 共有結合させてもよい。アミ７基に対する共有結合は、シアヌル酸クロリド、カ ルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基（ＰＥＧアルコキ７キンブロモア セトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧ＋ＤＭＳ○および酢酸無水物：あ るいはＰＥＧクロリド＋４−ヒドロキシベンズアルデヒドの７エ／キシド、スク シンイミジル活性エステル類、活性化ジチオカーボネートＰＥＧ、２，４．５４ リクロロフ工二ルトリク口口ホルメートまたはｐ−二トロフェニルクロロホルメ ート活性化ＰＥＧ）に基づく既知の化学によって達成される。カルボキシル基は 、カルボジイミドを用いてＰＥＧ−アミンをカップリングさせることによって誘 導体化する。

ビオチンまたはアビジンによるオリゴ糖類の標識に関してＢａｙｅｒ等、Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６２：３１０（１９７９）またはｔｌ ｅｉｔｚｍａｎｎ等、　Ｐ、　１１．　Ａ、Ｓ、、７１：３５３７−３４１（１ ９ｇ４）に記述されている方法と同様の方法で、化学品（例゛メソ過ヨウ素酸塩 ）または酵素（例：グルコースまたはガラクトース・オキ／ダーゼ）（いずれも 各炭水化物のアルデヒド誘導体を生成させる）を用いて酸化した後、ヒドラジド またはアミノ誘導体化ポリマーと反応させることにより、ポリマーをオリゴ糖基 に結合させる。さらに、オリゴ糖類とポリマーを結合させるためにこれまでに使 用されてきた他の化学法または酵素法も適している。置換オリゴ糖類は、一般に 、アミノ酸部位より誘導体化のための置換が少なく、それゆえにオリゴ糖生成物 がより均一になるであろうから、特に有利である。任意に、オリゴ糖置換基に、 糖を除去するための酵素消化（例、ノイラミニダーゼ消化）によって、ポリマー 誘導体化の前に改変を加えてもよい。

ポリマーは、本発明のポリペプチドのアミノ酸側鎖あるいはＮ−またはＣ−末端 と直接反応する基、もしくは多官能性架橋試薬と反応する基を保持するであろう 。一般に、このような反応性基を有するポリマーは固定化タンパク質製造のため に知られている。このような化学を本発明で使用するためには、これまでにタン パク質固定化に使用されてきた不溶性ポリマーと同じ様式で誘導体化された水溶 性ポリマーを使用すべきである。臭化シアン活性化は多糖類を架橋する際に特に 有用な方法である。

出発ポリマーに関する“水溶性”という用語は、複合体のために使用するポリマ ーまたはその反応性中間体が誘導体化反応に関与し得るほど充分に水溶性である ことを意味する。

ポリマー複合体に関する”水溶性”という用語は、その複合体が血液などの生理 的液体に可溶であることを意味する。

このようなポリマーによる置換の程度は、タンパク質全体を使用するか、その断 片を使用するが、タンパク質が異種タンパク質との融合物であるか否か、タンパ ク質上の反応性部位の数、ポリマーの分子量、親水性およびその他の性質、選択 した特定のタンパク質誘導体化部位に依存して変化するであろう。異種配列はい ずれも、その望ましい活性が有意に不利な影響を受けない限り、本質的に無制限 の数のポリマー分子で置換できるが、一般に、この複合体は１〜１０ポリマー分 子を含冑する。最適な架橋度は、時間、温度およびその他の反応条件を変化させ ることによって置換度を変えた後、その複合体が目的の様式で機能する能力を決 定する一連の実験により容易に決定できる。

ＰＥＧなどのポリマーを、ＰＥＧなどの非タンパク質性ポリマーでタンパク質を 共宵結合的に修飾するための多様な（それ自体は）既知の方法で架橋する。しか しこれらの方法のいくつかは本発明の目的には好ましくない。シアヌル酸クロリ ドの化学はタンパク質架橋を含む多くの副反応を起こす。さらに、スルフヒドリ ル基をｔｉするタンパク質の失活を特に肩じゃすい。カルボニルジイミタゾール の化学（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ等、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、　１３１ ：２５−３３（１９８３））は高いｐＨ（＞８．５）を必要とし、この条件はタ ンパク質を不活化し得る。さらに、“活性化ＰＥＧ“中間体は水と反応し得るの で、タンパク質に対シテ大過剰モル量の“活性化ＰＥＧ”が必要である。カルボ ニルジイミダゾール化学に必要な高濃度のＰＥＧは、ゲル濾過クロマトグラフィ ーと疎水相互作用クロマトグラフィーの両方に悪影響を与えるので、精製にも問 題を起こす。さらに、高濃度の“活性化ＰＥＧ”はタンパク質を沈殿させる可能 性があり、この問題自体は過去に触れられている（Ｄａｖｉｓ、米国特許第４１ ７９３３７号）。一方、アルデヒド化学（Ｒｏｙｅｒ。

米国特許第４００２５３１号）は４０倍過剰モル量のＰＥＧと１〜２時間のイン キュベーションしか必要としないので、より効果的である。しかし、ＰＥＧアル デヒドの調製のためにＲｏｙｅｒが提案した二酸化マンガンは、“ＰＥＧは金属 性酸化剤と錯体を形成する傾向が極めて高いので”（Ｈａｒｒｉｓ等、　Ｊ、　 Ｐｏｌｙｍ、　Ｓｃｉ、　、　Ｐｏｌｙｍ、　Ｃｈｅｔ　Ｅｄ、　２２：３４１ −３５２（１１８４））問題が多い。ＤＭＳＯと酢酸無水物を使用するモファッ ト酸化（ｉｏｆｆａｔｔ　ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）を使用することによって、この 問題を回避できる。さらに、Ｒｏｙｅｒが提案した水素化ホウ素ナトリウムは高 ｐＨで使用しなければならず、ジスルフィド結合を還元する傾向ががなりある。

これに対し、中性ｐＨで作用し、ジスルフィド結合を還元する傾向が殆ど無い水 素化シアノポウ素ナトリウムが好ましい。

本発明の複合体を未反応の出発物質からゲル濾過によって分離する。複合体の不 埒一種を同じ方法で互いに精製する。

ポリマーは親水性ゲルとして、あるいはカテーテルまたはドレナージ導管の形態 の外科用チューブとして、非水溶性であってもよい。

ＬＨＲおよび他のリガンド結合パートナ−をコードするＤＮＡをインビトロ法で 合成するか、もしくはリンパ球ｃＤＮＡライブラリーから容易に得ることができ る。ＬＨＲをコードするＤＮＡを自動化された装置で、もしくはそのような装置 を使用せずに合成する方法は、特に本明細書の教示を考慮すれば、当業者一般に 知られている。ポリヌクレオチド合成に関する技術分野の現状の例として、Ｍａ ｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｆｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ（１９８４）およびＨｏｒｖａｔｈ等、Ａｎ　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｄ ＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　Ｅ＋＊ｐｌｏｙｉｎｇ　Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅ ｏｓｉｄｅ　３’　−Ｐｈｏｓｐｈｏｒａ＠１ｄｉｔｅｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉ ｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇｙ　１５４：３１３−３２６（１９８７）を参考にする ことができる。

別法として、好ましい態様のための全ＤＮＡ配列、即ちＨｕＬＨＲ（図１）およ びＭＬＨＲ（図２）が既知であるから、ＬＨＲをコードするＤＮＡをネズミまた はヒト以外の供給源から得るためには、ＨｕＬＨＲまたはＭＬＨＲもしくはそれ らの断片（普通、約２０ｂｐより大きく、通常は約５０ｂｐ）をコードする標識 したＤＮＡを用いて、特定の動物から得たｃＤＮＡライブラリー中の相同配列を 含有するクローンを検出するために、ハイブリッド形成スクリーニングを実施し 、次いで制限酵素分析および核酸配列決定によってそのクローンを分析すること によって全長クローンを同定するだけでよい。全長クローンがライブラリー中に 存在しない場合は、適切な断片を種々のクローンから回収し、それらの断片に共 通の制限部位で連結することにより、全長クローンを組み立てる。他の動物種の ＬＨＲをフードするＤＮＡは、その種から得たライブラリーをヒトまたはネズミ の配列でプローブすることによって、あるいはその遺伝子をインビトロで合成す ることによって得られる。配列がわかっている他の結合パートナ−のＤＮＡはこ れに類する定型のハイブリッド形成法を用いて得ることができる。

本発明は、約ｔｏｂｐより大きく、好ましくは２ｏ〜５ｏｂｐであり、ｔｏｏｂ ｐより大きいことさえある、図１または図２の断片と厳密条件下でハイブリッド 形成する核酸配列を提供する。また、厳密条件下で、シグナルまたは質膜ドメイ ンまたは細胞質ドメイン以外のＬＨＲ断片とハイブリッド形成する核酸配列も本 発明の範囲に含まれる。

さらに、ＬＨＲのｃＤＮＡか、あるいはＬＨＲのゲノム遺伝子（イントロン、並 びに、隣接する遺伝子もしくは約５０００ｂｐ（どちらがより長くても）に及ぶ ５′または３′隣接領域を含む）と、厳密条件下でハイブリ、ド形成し得る核酸 プローブも本発明の範囲に含まれる。

ＬＨＲまたは池の結合パートナ−のゲノムＤＮＡの同定は、特定のゲノムライブ ラリーを検出可能な基（例　放射性リン酸基）で標識したｃＤＮＡまたはその断 片でプローブし、その遺伝子を含むクローンを回収することに外ならない。必要 ならば、完全な遺伝子を“ウオーキング（染色体歩行）“によってつなぎ合わせ る。典型的な場合、このようなプローブはＨｕＬＨＲまたはＭＬＨＲに対して７ ０％以上相同な配列をコードし、約１０〜ｔｏｏｂｐの長さである。他の結合パ ートナ−に関する相同性と大きさは、不都合な実験を行わなくても決定できる。

本発明に有用なベクターを構築する際には、一般に原核生物をＤＮＡ配列のクロ ーニングに使用する。例えば大腸菌に１２−２９４株（ＡＴＣＣ番号３１４４６ ）は特に有用である。使用し得る他の微生物株には大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７ ７６（ＡＴＣＣ番号３１５３７）が含まれる。これらの例は単なる例示であって 、限定を意図するものではない。別法として、インビトロ・クローニング法（例 ：ポリメラーゼ連鎖反応）も適している。

本発明のポリペプチドは、Ｎ−末端メチオニル類縁体として、もしくはハイブリ ッド／部分にとって異種のポリペプチド、好ましくはそのハイブリッド／部分の Ｎ−末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドとの融 合物として、組換え細胞培養中で直接発現する。例えば、ＬＨＲの原核分泌発現 ベクターを構築する際には、天然のＬＨＲシグナルを、そのシグナルを認識する 宿主と共に使用する。分泌リーダーが宿主によって“認識される”場合、その宿 主シグナル・ペプチダーゼは、目的の成熟ＬＨＲにＣ−末端で融合しているリー ダー・ポリペプチドの融合物を切断し得る。ＬＨＲシグナルをプロセシングしな い宿主原核生物については、そのシグナルを、例えばアルカリ性ホスファターゼ 、ベニシリナーした原核シグナルで置換する。酵母分泌のためには、ヒトＬＨＲ シグナルを酵母インベルターゼ、アルファ因子または酸性ホスファターゼ・リー ダーで置換することができる。哺乳類細胞発現の場合は、ウィルス分泌リーダー （例、ヘルペス・シンプレックス・ｇＤシグナル）などの他の哺乳類分泌タンパ ク質シグナルも適当であるが、哺乳類ＬＨＨに関しては天然のシグナルで十分で ある。

本発明の新規ポリペプチドはどの宿主細胞中でも発現し得るが、哺乳類宿主中で 合成することが好ましい。しかじ原核生物、カビ、酵母、昆虫など由来の宿主細 胞も発現に使用される。代表的原核生物は、クローニングに適する株および大腸 ［ＩＷ３１１０（Ｆ−、λ−１１１ＪＫ栄１株、　Ａ　Ｔ　ＣＣ番号２７３２５ ）、セラチア・マルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ａ＋ａｒｃｅｓｃａｎｓ）な どの腸内細菌科、ノ＼チルスおよび種々のンユードモナス科である。好ましくは 、宿主細胞が分泌する原核性酵素量は最小限であるべきである。

典型的な場合、発現ベクター中に連結されている／＼イブリ、ドをコードするＤ ＮＡで発現宿主を形質転換する。このようなベクターは通常、複製部位を保持し ている（ただしこれは染色体組み込みが起こる場合には必要ない）。発現ベクタ ーは、以下に議論するように形質転換細胞中で表現型選択を提供し得る標識配列 をも含有する。

例えば大腸菌を典型的には、大腸菌種由来のプラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉ ｖａｒ等、Ｇｅｎｅ　２：９５（１９７７））を用いて形質転換する。ｐＢＲ３ ２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有しており 、それゆえに、目的がクローニングであるか発現であるかにかかわらず、形質転 換細胞を同定するための容易な手段を提供する。また発現ベクターが転写および 翻訳の制御に有用な配列（例：プロモーターおよびシャイン・ダルガルノ配列（ 原核生物の場合）またはプロモーターおよびエンハンサー（哺乳類細胞の場合） ）を含有していれば最適であろう。プロモーターは誘導性であってもよいが必ず しもその必要はない。驚くべきことに、哺乳類宿主にとってのＣＭＶプロモータ ーのように強力な構成プロモーターであっても、宿主細胞毒性を伴わずにＬＨＲ を産出することがわかった。発現ベクターが何らかの発現制御、複製配列もしく は選択遺伝子を含有する必要はないと考えられるが、これらの欠失は、ハイブリ 、ド形質転換体の同定および高レベルのノ・イブリッド免疫グロブリン発現の達 成を妨げるであろう。

原核宿主と共に使用するのに適したプロモーターには、例えばβ−ラクタマーゼ およびラクトース・プロモーター系（Ｃｈａｎｇ等、　Ｎａｔｕｒｅ。

２７５：６１５（１９７８）およびＧｏｅｄｄｅｌ等、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８ １：５４４（１９７９））、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒ ｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８：４０５７（１９８０）および欧州特 許出願番号第３６７７６号）、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッド・ プロモーター（Ｈ。

ｄｅ　Ｂｏｅｒ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 、　８０：２ｌ−２５（１９８３））が含まれる。

しかし他の機能的細菌性プロモーターも適している。これらのヌクレオチド配列 は一般に既知であるから、当業者は、必要な制限部位を供給するためにリンカ− やアダプターを使用して、ＬＨＲをコードするＤＮＡにこれらを機能的に連結す ることできる（ＳｉｅｂｅｎＬｉｓｔ等、　Ｃｅ１ｌ、　２０：２６９（１９８ ０））。細菌系で使用するプロモーターは、ＬＨＲをコードするＤＮＡに機能的 に連結されたシャイン・ダルガル／（Ｓ、Ｄ、）配列をも含有するであろう。

原核生物に加えて、酵母や糸状菌などの真核微生物も良好な結果を与える。す、 カロミセス・セレビシェは最も一般的に使用される真核微生物であるが、他の株 のいくつかも一般に利用できる。プラスミドＹＲｐ７は酵母における良好な発現 ベクターである（Ｓｔ　ｉｎｃｈｃｏｍｂ等、　Ｎａｔｕｒｅ　２８２：３９（ １９７９）　；　Ｋｉｎｇｓｍａｎ等、　Ｇｅｎｅ、　７：１４１（１９７９） 　：　ＴｓｃｈｅＢｅｒ等、Ｇｅｎｅ、　１０：１５７（１９８０））。このプ ラスミドは、トリプトファン中での生育能が欠失した酵母の変異株（例：　ＡＴ ＣＣ番号４４０７６またはＰ　Ｅ　Ｐ　４−１　（Ｊｏｎｅｓ、　Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ　８５：１２（１９７７）））のための選択櫟識を提供するｔｒｐｌ遺伝子 を既に含有している。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ欠損の存在は 、トリプトファン非存在下での生育による形質転換検出に効果的な環境を提供す る。

酵母宿主と共に使用するための適切な促進配列には、３−ホスホグリセレート・ キナーゼ（Ｒｉｔｚｅｍａｎ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５５：　 ２０７３（１９８０））または他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ等、　Ｊ、　Ａｄｖ、　 Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　７：１４９（１９６ｇ）およびＨｏ１ｌａｎｄ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｌＩｌｉｓｔｒｙ、　１７：４９００（１９７８）Ｘ例えばエノラー ゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピル ベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン 酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、 トリオセホスフエート・イソメラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グル コキナーゼなど）のためのプロモーターが含まれる。

生育条件によって転写を制御し得るという追加の利点を有する誘導プロモーター である他の酵母プロモーターは、アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトク ロムＣ５酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン 、グリセルルデヒドー３−リン酸・デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよび ガラクトース資化に寄与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現での使用 に適したベクターおよびプロモーターは、Ｒ，Ｈ５ｚｅｔａａｎ等、欧州特許出 顯第７３６５７＾にさらに記述されている。

真核生物の発現制御配列は知られている。はとんど全ての真核遺伝子が、転写が 開始する部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ含量の豊富な領域を持っ ている。多くの遺伝子の転写開始位置から７０〜８０塩基上流に認められるもう １つの配列はＣＸＣＡＡＴ領域（Ｘはいずれのヌクレオチドでもよい）である。

はとんどの真核遺伝子の３′末端はＡＡＴＡＡＡ配列であり、この配列はコード 配列の３′末端にポリＡ尾部を付加するためのシグナルであろう。

これらの配列をすべて哺乳類発現ベクター中に挿入する。

哺乳類宿主細胞においてベクターからの転写を制御するための適切ナプロモータ ーは種々の供給源、例えばウィルス（例：ポリオーマウィルス、５ｖ４０、アデ ノウィルス、ＭＭＶ（ステロイド誘導性）、レトロウィルス（例：ＨＩＶのＬＴ Ｒ）、Ｂ型肝炎ウィルス、並びに、最も好ましくはサイトメガロウィルス）のゲ ノムカラ、あるいは異種哺乳類プロモーター（例；ベータ・アクチン・プロモー ター）から容易に得られる。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは、ＳＶ４ ０ウィルス複製起点をも含有するＳＶ４０制限断片として便利に得られる（Ｆｉ ｅｒｓ等、　ｆｆａｔｕｒｅ、　２７３：１１３（１９７ｇ））。ヒト・サイト メガロウィルスの前初期プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩ　Ｅ制限断片として便利 に得られる（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ、　Ｐ、　Ｊ、等、Ｇｅｎｅ　１８：３５５− ３６０（１９８２））。

ハイブリッド免疫グロブリンおよび／またはハイブリッド部分をコードするＤＮ Ａのより高等な真核生物による転写は、ベクター中にエンハンサ−配列を挿入す ることによって増大する。エンハンサ−は、通常約１０〜３ｏｏｂｐからなる、 ＤＮＡのシス作用性要素であり、プロモーターに作用してその転写を増大させる 。エンハンサ−は比較的配向および位置非依存性であり、転写単位の５’　（Ｌ ａｉｍｉｎｓ、　Ｌ、等、　ＰＮＡＳ、　７８：９９３（１９８１））および３ 　’　（Ｌｕｓｋｙ、　Ｍ、　Ｌ、等、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｉｏ、　、　３ ：１１０８（１９８３））に発見されており、またイントロン内（Ｂａｎｅｒｊ ｉ、　Ｊ、　Ｌ、等、　Ｃｅ１ｌ、　３３ニア２９（１９８３））およびコード 配列自体の中（Ｏｓｂｏｒｎｅ、　Ｔ、　Ｆ、等、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏ、　４：１２９３（１９８４））にも発見されている。現在、哺乳類遺伝子（ グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロティン、およびインスリ ン）から多くのエンハンサー配列か知られている。しかし典型的には、真核細胞 ウィルスのエンハンサ−を利用するであろう。例としては、複製起点の後期側の ＳＶ４０エンハンサ−（１００〜２７０ｂｌ））、サイトメガロウィルス初期プ ロモーター・エンハンサ−１複製起点の後期側のポリオーマ豐エンハンサ−１お よびアデノウィルス・エンハンサ−が含まれる。

真核宿主細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由 来の有核細胞）？：′使用する発現ベクターは、転写の終止に必要であって、ｍ ＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る配列をも含有するであろう。これらの領域は、ハ イブリッド免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル 区分として転写される。この３′非翻訳領域には転写終止部位も含まれる。

発現ベクターは、選択遺伝子（これは選択可能標識とも呼ばれる）を含有するこ ともできる。哺乳類細胞に適した選択可能標識の例には、ジヒドクフォレート・ レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジン・キナーゼ（ＴＫ）、あるいはネオマイシ ンが含まれる。このような選択可能標識がうまく哺乳類宿主細胞内に導入される ならば、その形質転換哺乳類宿主細胞は選択圧下におかれた場合に生き残ること ができる。選択方式には広く用いられている２つの異なった種類がある。

第一の種類は細胞の代謝、および補足培地に依存せずに生育する能力を欠く変異 株化細胞の使用に基づいている。ＣＨＯＤＨＦＲ＝細胞およびマウスＬＴＫ−細 胞はその２例である。これらの細胞は、チミジンやヒポキサンチンなどの栄養素 を添加しない条件下で生育する能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレ オチド合成経路に必要ない（つかの遺伝子を欠いているので、補足培地中に欠失 ヌクレオチドを添加しない限り生存することができない。培地を補足するかわり に、無傷のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠（細胞中に導入 し、それによってその生育要求性を変化させることもできる。ＤＨＦＲやＴＫ遺 伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補足培地中で生存できないであろ う。

選択法の第二の種類は優性選択、即ちどの細胞型にも使用できる選択法であり、 変異株化細胞の使用を必要としない選択法である。

この方法は典型的には宿主細胞の生育を停止するための薬剤を使用する。異種遺 伝子でうまく形質転換された細胞は薬剤耐性を付与するタンパク質を発現し、そ れゆえにこの選択法に耐え得る。このような優性選択の例では、薬剤ネオマイシ ン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　Ｌ ：３２７（１９８２））、マイコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ等、５ｃｉｅ ｎｃｅ。

２０９：１４２２（１９８０））、あるいはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ等 、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　５：４１０−４１３（１９８５））を使用する。上記の３例では、 真核性の制御下にある細菌性遺伝子を使用することによって、適切な薬剤、即ち それぞれＧ４１８またはネオマイシンくジエ不ティンン）、ｘｇｐｔ（マイコフ ェノール酸）、あるいはハイグロマイシンに対する耐性を獲得する。

ハイブリッド免疫グロブリンの発現に適した真核宿主細胞には、ＳＶ４０で形質 転換されたサルの腎ＣＶＩ株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）、ヒト の胚腎株（２９３または懸濁培養中での生育のためにサブクローニングされた２ ９３細胞、Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、　Ｌ、等、　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、　３６：５９（１９７７））、幼ハムスター腎細胞（ＢＨＫ％ＡＴ ＣＣＣＣＬｌｏ）、チャイニーズハムスター卵巣−細胞−ＤＨＦＲ（ＣＨ○、ｔ ｌｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、　ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、　７７：４２１６（ １９８０））、マウスのセルドーリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ、　Ｐ、 　、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　２３　：２４３−２５１（１９８０））、 サルの腎細胞（Ｃｖｌ、ＡＴＣＣＣＣＬ　７０）　、７７’）ｈ７−　グリ−７ −モンキー腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、Ａ　Ｔ　ＣＣＣＲＬ−１５８７）、ヒトの 頚部癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ　２）、イヌの腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴ ＣＣＣＣＬ　３４）　、バッファロー・ラットの肝細胞（ＢＲＬ　３Ａ、、ＡＴ ＣＣＣＲＬ　１４４２）、ヒトの肺細胞（Ｗ　ｌ　３８、ＡＴＣＣＣＣＬ　７５ ）、ヒトの肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ　８０６５）、マウスの乳房の腫瘍細胞（ ＭＭＴ　０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ　５１）、およびＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈ ｅｒ、　Ｊ、　Ｐ等、＾ｎｎａｌｓ　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　３８ ３：４４−６８（１９８２））が含まれる。

目的のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築には、標準的 な連結技術を用いる。単離したプラスミドもしくはＤＮＡ断片を切断し、加工し 、目的の形態に再連結することによって必要なプラスミドを形成させる。

構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、その連結混合物 を用いて大腸菌に１２　２９４株（Ａ　Ｔ　ＣＣ３１４４６）を形質転換し、成 功した形質転換体を、それが適当な場合には、アンピシリンもしくはテトラサイ クリン耐性によって選択する。Ｍｅｓｓｉｎｇ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　９：３０９（１９８１）またはＭａｘａｍ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５°４９９（１９８０）の方法で、その形質 転換体からプラスミドを調製し、制限分析および／またはＤＮＡ配列決定によっ て分析する。

本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換 体の選択または目的の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改良した従 来の栄養培地中で培養する。温度やｐＨなどの培養条件を、発現用に選択した宿 主細胞について過去に使用されたものとし、これらの条件は当業者には明白であ ろう。

本明細書で使用する宿主細胞なる用語は、インビトロ培養中の細胞と共に宿主動 物内の細胞をも包含する。

“形質転換”という用語は、ＤＮＡが染色体外要素として、もしくは染色体組み 込みによって複製されるように、生物内にそのＤＮＡを導入することを意味する 。特に断らない限り、本発明で使用する宿主細胞の形質転換法は、Ｇｒａｈａｍ 、　Ｆ、およびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ａ、　、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５２ ：４５６−４５７（１９７３）の方法である。しかし、核注入あるいはプロトプ ラスト融合などによる、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も用いることが できる。原核細胞または強固な細胞壁構築物を有する細胞を使用する場合に好ま しいトランスフェクシ１ン法は、Ｃ。

ｈｅｎ、　Ｆ、　Ｎ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 （ＵＳＡ）、　６９　：２１１０（１９７２）が記述した、塩化カルシウムを用 いるカルシウム処理である。

“トランスフエフシコン”という用語は、なんらかのコード配列が実際に発現す るかどうかにかかわらず、宿主細胞へのＤＮＡの導入を意味する。数多くのトラ ンスフェクション法が当業者一般に知られている（例えば、ＣａＰＯ，および電 気穿孔法）。宿主細胞の形質転換はトランスフエフシコン成功の証拠である。

本発明の新規ポリペプチドを組換え細胞培養から既知の方法で回収し、精製する 。これらの方法には、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、アニオ ンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフ ィー、免疫アフィニティー・クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト・ク ロマトグラフィーおよびレクチン・クロマトグラフィーが含まれる。本発明の範 囲に含まれる他の既知の精製法では、固定化した炭水化物、表皮成長因子または 補体ドメインを使用する。さらに逆相ＨＰＬＣ，並びに、ハイブリッド免疫グロ ブリンのリガンドを使用するクロマトグラフィーもハイブリッドの精製にとって 有用である。精製の間、低濃度（約１〜５ＩＩＩＭ）のカルシウムイオンを存在 させることか望ましい。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤の存在下でＬＨＲを 精製することが好ましい。

ＬＨＲ−免疫グロブリン・ハイブリッドを治療的に使用すると、リンパ様組織に 対するリンパ球の正常な結合と競争する。したがってこのハイブリッドは器官ま たは移植体拒絶にとって特に有用であり、また、例えばりウマチ様関節炎あるい は他の自己免疫疾患などの炎症を伴う患者の治療に特に有用である。ＬＨＲ−免 疫グロブリン・ハイブリッドは、リンパ騰転移の制御、およびリンパ球の蓄積が 起こる症状の治療にも適用できる。

ＬＨＲ−免疫グロブリン・ハイブリッド・ヘテロ二１体およびヘテロ四量体を、 治療的部分をリンパ様組織に誘導する際に使用する。

例えば、１本のＬＨＲ−Ｉ　ｇＧ鎖と１本のＣＤ４−Ｉ　ｇＧ鎖からなるハイブ リッド免疫グロブリンを用いることにより、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）な どのウィルスに感染した組織にＣＤ４−１　ｇＧを誘導することができる。この ハイブリッドは、リンパ節内の内皮組織だけでなく、バイエル斑などの２次リン パ様器官内および脳内の内皮組織にも結合するので、ＨＩＶ関連痴呆症の治療の ために、血液脳障壁を通過してＣＤ４−１　ｇＧを送達するために使用し得る。

同様に、リシンなどの毒素を目的の組織に送達するために、本明細書に記述する ＬＨＲ−リシン−あるいはＣＤ４−リシン−免疫グロブリンを有する免疫グロブ リン・ヘテロ四量体を使用する。

この方法で、特定の組織に対して特異的な親和性を有するリガンド結合パートナ −を選択すれば、安定で比較的長い半減期を有する治療薬を送達する能力が明確 に増大し、不都合な実験を行わなくても正確な加工ができる。

本発明の新規ポリペプチドを滅菌等張製剤中に、必要な補因子と共に入れ、任意 に当該分野でよく知られた標準的手段で投与する。

この製剤は液体であることが好ましく、通常は０．５〜１０ｍＭカルシウム、非 リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，８〜７．６）を含有する生理的塩類溶液であり、ある いは凍結乾燥粉末であってもよい。

静脈内送達、またはカテーテルあるいは他の外科用チューブを通しての送達が主 要な治療的投与経路となるであろうと考えている。

別の経路には、錠剤など、液体製剤用の市販の噴霧器、および凍結乾燥またはエ アゾル化した受容体の吸入が含まれる。液体製剤は粉末製剤から再構成した後に 使用することができる。

本発明の新規ポリペプチドを微小球、リポソーム、他の微粒子送達系によって投 与してもよく、あるいは血液を含むある種の組織中に入れる徐放性製剤によって 投与してもよい。徐放性担体の好適例には、成型物（例：原剤またはマイクロカ プセル）の形態の半透性ポリマー・マトリックスが含まれる。マイクロカプセル 徐放性マトリ。

クスまたは埋め込み可能な徐放性マトリックスには、ポリラクチド（米国特許第 ３７７３９１９号、ＥＰ第５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチルーＬ −グルタメートの共重合体（Ｕ、　Ｓｊｄｍａｎ等、　Ｂｉｏｐ。

ｌｙ＠ｅｒｓ　２２（１）：５４７−５５６（１９８５））、ポリ（２−ヒドロ キシエチル−メタフレリート）またはエチレン・ビニル酢酸（Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ 等、　Ｊ、　ＢｉｏＩＩｌｅｄ、　Ｍａｔｅｒ、　Ｒｅｓ、　１５：１６７−２ ７７（１９８１）およびＲ，Ｌａｎｇｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｔｅｃｈ、　１２　 ：９ｇ−１０５（１９８２））が含まれる。ハイブリッド免疫グロブリンを含有 するリポソームは、よ（知られた方法で調製される（ＤＥ　３２１８１２１Ａ　 ；　Ｅｐｓｔｅｉｎ等＋Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ、　８２：３６８８−３６９２（１９８５）　；■ｗａ１ｇ等、　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ　P．　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７：４０３０−４０３４（１９８０）　；　 ＥＰ　５２３２２Ａ　：　ＥＰ　３６６７６Ａ　；　ＥＰ　W８０ ４６Ａ　；　ＥＰ　１４３９４９Ａ　；　Ｅ１本特許出願８３−１１８０８　、 米国特許第４４８５０４５号および同第４５４４５４５号、　ｕｐ　１０２３４ ２Ａ）。通常リポソームは小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型 であって、その脂質成分は、約３０モル％コレステロール以上であり、これはポ リペプチドの漏出速度を最適化するように調節された比率である。

徐放性ポリペプチド調製物を、炎症部位または治療部位（例：関節炎の関節また は末梢リンパ節）の近傍に埋め込むか、もしくは注射する。

医者には充分自明であるように、本発明の新規ポリペプチドの投与量は使用する ハイブリ、ドの性質（例えば結合活性および生体内血漿半減期）、製剤中のハイ ブリッド濃度、ハイブリッドの投与経路、投与部位、投与速度、関与する患者の 臨床的耐性、患者を苦しめている病的症状などに依存するであろう。

本発明のポリペプチドを、上記の症状を治療するために使用される他の医薬（例 　抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍剤）と共に投与することもできる。また、本発明 のポリペプチドを、γ−インターフェロンや他の免疫変調因子など、他の治療的 タンパク質と共に投与することも有用であろう。

以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に使用する方法および／または用 語のいくつかについて記述する。

“プラスミド”は、先行して置かれた小文字ｐ、および／またはそれに続く大文 字、および／または数字によって指定される。本発明の出発プラスミドは市販さ れており、誰にでも無制限に利用可能であり、あるいは公表された方法に従って 、利用可能なプラスミドから構築することもできる。さらに、これらに等価なプ ラスミドも本技術分野において知られており、一般の技術者には明白であろう。

具体的には、これらのプラスミドは次の特徴のいくつか、もしくはすべてを有す ることが好ましい＝（１）含有する宿主生物配列の数が最小限度であること：（ ２）目的の宿主中で安定であること：（３）目的の宿主中で高コピー数型で存在 し得ること；（４）制御可能なプロモーターを保持すること；（５）そのプラス ミドの、新規ＤＮＡ配列を挿入する部分から離れた位置にある部分に、選択可能 な特徴をコードする少なくとも１つのＤＮＡを有すること。上記の規準に合致す るようにプラスミドを改変することは、利用可能な文献および本明細書の教示を 考慮すれば、当業者には容易である。上述の性質を有し、それゆえに本発明で使 用するのに適した新たなりローニングベクターが存在し、あるいは今後発見され るであろうこと、またこれらのベクターも本発明の範囲に含まれると見なされる ことを理解すべきである。

ＤＮＡの”消化”という用語は、そのＤＮＡ中の一定のヌクレオチド配列にしか 作用しない制限酵素による、そのＤＮＡの触媒的切断を意味する。本発明で使用 する種々の制限酵素は市販されており、反応条件、補因子、および他の必要条件 は、当業者に知られているであろうものを用いた。分析が目的の場合、典型的に は１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片を、約２単位の酵素と共に、約２０μＩ の緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡ断片を単離する目的の 場合は、典型的にはより大きな体積中で、５〜５０μｇのＤＮＡを２０〜２５０ 単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適した緩衝液および基質量は、その製 造者によって指定されている。通常３７°Ｃで約１時間のインキュベージ１ンが 用いられるが、その供給者の指示に従って変更することもある。消化後、その反 応液を直接ポリアクリルアミドゲルで電気泳動することによって、目的の断片を 単離する。

切断した断片のサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

８：４０５７（１９８０）が記述した８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う 。

“脱リン酸化”は、細菌アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）を用いる処理によ る末端５゛リン酸の除去を意味する。この操作は、１つのＤＮＡ断片の２つの制 限切断末端が“環化”して、もしくは閉環を形成して、その制限部位への別のＤ ＮＡ断片の挿入を妨害することを防止する。脱リン酸化の操作法と試薬は常法で ある（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ。

等、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　１３３−１３４頁（１９８２） ）。ＢＡＰを使用する反応は、この酵素調製物中に存在するエキンヌクレアーゼ 活性を抑止するために、５０　ｄ　Ｔｒｉｓ中６８℃で実行する。反応は１時間 行う。

この反応後、ＤＮＡ断片をゲル精製する。

“オリゴヌクレオチド”は、−水路ポリゾオキシヌクレオチド、２本の相補的ポ リデオキシヌクレオチド鎖、のいずれかを意味し、これらは化学的に合成できる 。このような合成オリゴヌクレオチドは５°リン酸を有さないので、キナーゼの 存在下でＡＴＰを用いてリン酸を付加しない限り、別のヌクレオチドには連結し ない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片には連結できる 。

“ライゲーション”は、２つの二本鎖核酸断片間のホスホジエステル結合の形成 過程を意味する（Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ、　Ｔ等、同上、１４６頁）。特に述べな い限り、ライゲーションは、既知の緩衝液および条件を用い、約等モル量の連結 すべきＤＮＡ断片０５μｇあたり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（“リガーゼ” ）を使って遂行する。

“充填”または“平滑化”は、制限酵素で切断した核酸の付着末端中の一本鎖化 された末端を二本鎖に変換する操作を意味する。これによって付着末端が除去さ れ、平滑末端が生成する。この工程は、唯一の制限酵素あるいは数少ない他の制 限酵素でしか生成しない末端に付着する制限切断末端を、平滑に切断するあらゆ る制限エンドヌクレアーゼもしくは充填された池の付着末端に適合する末端に変 換するための汎用の手段である。典型的な場合、標的ＤＮＡ２〜１５μｇを１０ 　ａ＋Ｍ　ＭｇＣ１ｔ、１ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭ　ＮａＣ１，１０ ｍｋｌ　Ｔｒｉｓｌ衝液（ｐ　Ｈ７，５）巾約３７℃で、ＤＮＡポリメラーゼＩ のクレノー断片８単位および４種のデオキシヌクレオシド三すン酸各２５０μＭ と共にインキュベートすることによって、平滑化を遂行する。このインキュベー ションを一般的には３０分後に停止させ、フェノールおよびクロロホルム抽出し 、エタノール沈殿する。

本発明の組成物の３次元構造は本明細書に記述したその機能にとって重要である と現在考えている。したがって、本発明の組成物が形成する活性構造を模倣する すべての関連構造類縁体は、特に本発明の範囲に包含される。

本発明の教示を特定の問題または状況に適用することが、本明細書に記述された 教示の内容を考慮すれば当業者にとって可能な範囲になることは理解される。本 発明の産物の例、およびそれを単離し、使用し、製造するための代表的方法を以 下に記述するが、これらが本発明を限定すると見なすべきではない。

実施例 これらの実施例における“Ｍｅｌ１４″モノクローナル抗体もしくは“Ｍｅｌ１ ４”なる記載はすべて、Ｇａ１ｌａｔｉｎ等、前掲、Ｎａｔｕｒｅ　３０３：３ ０（１９８３）が記述した、ネズミ型と考えられるリンパ表面タン、＜り質に対 するモノクローナル抗体を意味する。しかし、本明細書にＬＨＲの全ＤＮＡ配列 および全アミノ酸配列か提供されているので、Ｍｅｌ１４の使用は本発明にとっ てもはや必要ではない。

実施例１　：ＭＬＨＲの精製およびクローニングＭＬＨＲをコードするｃＤＮＡ クローンの単離界面活性剤で処理したネズミ肺臓から、Ｍｅｌ１４モノクローナ ル抗体を用いる免疫アフィニティー・クロマトグラフィーによってＭＬＨＲを単 離した。

典型的調製では、ＩＣＲ雌マウマウス６週齢）から得た３００個の肺臓を細かく 切り、次いで、ＩＩＩＭＰＭｓＦおよび１％アプロチニンを含有するダルベ・ノ コＰＢＳ中の２％トリトンＸ−１００中で、ボッター・エルベジェム組織グライ ンダー（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ　ｔｉｓｓｕｅ　ｇｒｉｎｄｅｒ）を 用いて均質化（ホモジナイズ）した。溶解を浸透機上４℃で３０分間続けた。こ の溶解液を２０００ｘＧで５分間、次いで４００００ｘＧで３０分間遠心分離し た。

上清をニテノクス・スクリーン（Ｎｉｔｅｘ　５ｃｒｅｅｎ）を通して濾過した 後、臭化７アン活性化セフアロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂに結合した ラット血清（充填ゲル１０ｍ１）に吸着させることによって予備浄化した。

製造者の指示に従って複合体とカップリングするために、ラット血清を１＝１０ に希釈した。通過液を、セファロース４Ｂに対して１＋１あたり０．５ｍｇの割 合で結合したＭＥＬ−１４抗体の３ｍｌカラムにかけた。すべてのカラム緩衝液 に０．０２％濃度でアジ化ナトリウムを添加した。

このカラムをＰＢＳ中の２％トリトンＸ−１００２５ｍ１で洗浄した後、同じ緩 衝液中の１０ｄＣＨＡＰＳ　２５ｍ１で洗浄した。１００ｍＭグリ７ン、２００ ＩＩＩＭ　ＮａＣｌ５ｐＨ３中のＬＯｍＭＣＨＡＰＳｌｏｍｌを加えることによ って抗原を放出させ、これを１ｄＴＲ■≦　ＨＣＩ（ｐＨ７，６）１＋１中に集 めることによって中和した。カラムを２０ＩＩＭトリエチルアミン、２００ｄ　 ＮａＣｌ、　ｐＨ１１で洗浄し、ＰＢＳ中の１０ＬＩＭｃＨＡＰｓで前平衡化し た後、中和し、カラム緩衝液１００ａ＋１中に希釈した抗原を再添加し、洗浄お よび放出操作を繰り返した。

精製したタンパク質をセントリコン３０　（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０　；　７ ミコン・インフーポレーテノド）で濃縮し、可視化に銀染色を用いて５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥ（７，５％アクリルアミド）で分析した。典型的な精製では、オロソムコ イド襟準との比較に基づいて、マウス３００匹あたり３０〜４０μｇの抗原を得 た。

ここにはデータを示さないが、精製した物質のポリアクリルアミドゲルは約９０ ０００ダルトンに移動する拡散バンドと、１８００００ダルトン付近のより高分 子量のタンパク質を示した。１８ｏ０００ダルトン成分に対する９００００クル トン成分の比は、数多くの調製すべてにおいて１０．１か、もしくはそれ以上で あった。この物質を１０％ポリアクリルアミドゲルの銀染色によって可視化した 。

９００００ダルトンのバンドの気相エドマン分解は、Ｎ−末端アミノ酸そのもの を含む単一のＮ−末端配列（図４Ａ）の同定を冒した。

位置１．１９．３３および３４の４つの空白（Ｘ）を伴うＮ−末端の３８アミノ 酸を同定した。位置２２のアミノ酸シグナルの欠失を、Ｎ−結合型グリコシル化 部位共通配列（ＮＸＴ／Ｓ）を貸す後続のチロシン残基（Ｙ）およびスレオニン 残基（Ｔ）と組み合わせることによって、位置２２のアスパラギン（Ｎ）を推論 した。

この３８残基長のＮ−末端の上に示した図４Ａの１３配列残基は、過去にＳｉｅ ｇｅｌｍａｎ等（前掲）が放射活性樟識アミノ酸配列決定法を用いて推定したも のであり、本研究で決定したＬＨＲの配列と高度な相同性（１３残基中１１残基 ）を示している。

２つの別個のＭＬ　ＨＲ調製物を用いて行った３回の配列決定実験のいずれでも ユビキチン配列は得られなかった。おそらくこの修飾がマウスの肺細胞には欠失 しているか、もしくはユビキチンのＮ−末端がこの供給源から得たＬＨＲではエ ドマン分解に対して遮蔽されているのであろう。

図２のアミノ酸配列を、Ｌｉｐｍａｎ、　Ｄ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：１４ ３５−１４４１（１９８１）のアルゴリズムを用いて、デイホノフ（Ｄａｙｈｏ ｆｆ）タンパク質データベース中の既知配列と比較した。

図４Ａで下線を付したアミノ酸７から１５までの残基を、図４Ｂに示すオリゴヌ クレオチド・プローブを作成するために選択した。

これらの残基から３２倍に縮重しだ２６マー・オリゴヌクレオチド・プローブを 設計し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ）オリゴヌクレオチド合成機で合成した。このプローブには、哺乳類コドン使 用側に基づいてコドンＣＣＣを選択した位置９のプロリンを除いて、考え得るす べてのコドン縮重性が含まれている。

細断したマウスの肺臓から得たネズミ肺臓ｃＤＮＡライブラリーをこのプローブ を用いてスクリーニングすることによって、単一のハイブリッド形成ｃＤＮＡク ローンが単離された。操作としては、５μｇ　／　ＩｌｌコンカナバリンＡで６ 時間処理したネズミ牌細胞から単離したｍＲＮＡから作成したオリゴｄＴ−プラ イム化ｇｔ　１０ネズミ牌臓ｃＤＮＡライブラリー由来の６０００００プラーク を１ブレートあたり５００００フアージの割合で１２プレートに接種し、２０％ ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（Ｌ　５０ｍＭ　ＮａＣＩ、１５ｎ＋Ｍクエン酸三ナ トリウム）、５０ＩＩＩＭ　リン酸ナトリウム（ｐ　Ｈ７，６）、５Ｘデンハル ト溶液、１０％硫酸デキストラン、２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡ中４ ２℃で終夜、図４Ｂに示したｐ　３ｆｆｉで標識した３２倍縮重２６マー・オリ ゴヌクレオチド・プローブを用いてハイブリッド形成を行った。これらのパラメ ーターを本明細書では“厳密条件”と呼ぶ。フィルターを１ｘＳＳＣ，０，１％ ＳＤＳ中４２℃で３０分間２回洗浄し、−７０℃で終夜オートラジオグラフィー を行った。−複製陽性クローンを再スクリーニングし、ＥｃｏＲ１挿入物を単離 し、これをＭＬ３またはＰＵＣ１１８／１１９ベクター中に挿入し、配列特異的 プライマーを用いて一本鎖鋳型からそのヌクレオチド配列を決定した。

このバクテリオファージに含まれていた２、２キロ塩基のＥｃｏＲ１挿入物の全 ＤＮＡ配列を図２に示す。最長の読み取り枠は位置１０６〜１０８のメチオニン コドンで始まっている。コザック（Ｋｏｚａｋンボックス相同性がこのメチオニ ンコドンの周辺に認められ、このことはこのコドンがおそらくタンパク質の翻訳 開始に際して機能することを示唆している。分子量約４２２００ダルトンの３７ ３アミノ酸を含有するタンパク質配列がこの読み取り枠内にコードされている。

翻訳されるタンパク質には、単離したＭＬＨＲから決定したＮ−末端アミノ酸配 列と正確に対応する残基４０から７６までの配列が認められる。

この結果は、ＭＬＨＲの成熟Ｎ−末端が位置３９のトリプトファン残基から始ま ることを示唆している。しかし、ＬＨＨの実際のＮ−末端のいくつかのタンパク 加水分解プロセシングが、このタンパク質の単離中に起こったであろうと考えら れる。

このタンパク質の疎水性特性図は、Ｎ−末端に位置する、小胞体のルーメンへの 挿入のためのシグナル配列として機能し得る疎水性ドメインを明らかにしている 。位置３９〜３３３の推定配列は主として親水性であり、その後にストップ・ト ランスファーまたは膜固定ドメインに特有の２２残基疎水性ドメインが続いてい る。

このタンパク質のまさにＣ−末端にある細胞内領域と思われる領域は極めて短（ ，１７残基長しかない。質膜ドメインと予想されるドメインのすぐＣ−末端側に は数個の塩基性アミノ酸があり、これは細胞表面受容体の膜アンカーと細胞質ド メインとの結合部に典型的な性質である（Ｙａｒｄｅｎ等、　Ｎａｔｕｒｅ）。

潜在的リン酸化部位である一セリン残基が推定上の細胞質ドメイン内に存在する 。

このタンパク質は１０カ所の潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位を含有しており 、そのすべてが細胞外ドメインと考えられるドメイン内に存在する。ペプチド配 列決定分析において位置６０（成熟タンパク質の残基２２）のアスパラギンが欠 失することは、この部位でのグリコジル化を裏付けており、この領域の細胞外配 向を明らかにしている。解読領域には計２５個のシスティン残基が含まれている が、このシスティン残基のうち４個はリーダー配列と考えられる配列内に位置し ている。

ＭＬＨＲ内のタンパク質モチーフ 図６に示すように、推定ＭＬＨＲアミノ酸配列を、デイホノフ・タンパク質配列 データバンク中の他のタンパク質と、ｆａｓｔｌ）プログラム（Ｌｉｐ＋ａａｎ 、　Ｄ、およびＰｅａｒｓｏｎ、　Ｗ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７　：１４ ３５−１４４１（１９８５））を用いて比較した結果、いくつかの興味深い配列 相同性が認められた。

最も高い配列相同性値を有するタンパク質を、最大の配列相同性を示す領域を実 線で囲んで示す。配列の最初に記載した数字は、そのタンパク質内におけるこれ らの相同配列の位置を示している。

図６Ａは、ＬＨＲのＮ−末端モチーフ（残基３９〜ｌ５５）が、次に列挙するい くつかの炭水化物結合タンパク貫相同性を有することを示している（これらの配 列のＭＬＨＲに対する相同率（％）をカッコ内に示し、記載した文献は実施例の 欄の後に列挙する）　：　Ｄｒｉｋａｍｅｒ；Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ等（１）が発 見したアミノ酸残基、ＭｕＬＨＲ；ＭＬＨＲ配列、Ｈｕ、ＨｅｐＬｅｃ（２７， ８％）：ヒト肝炎レクチン（２）、Ｂａｒｎ、Ｌｅｃ（２５％）フジッボ・レク チン（３）、Ｒａ、ＨｅｐＬｅｃ（２３，５％）ニラノド肝炎レクチン（４）、 Ｃｈ、ＨｅｐＬｅｃ（２７，５％）：ニワトリ肝炎レクチン（５）、Ｈｕ、Ｉｇ ＥＲｅｃ（２８，６％）：ヒト１ｇＥ受容体（６）、ＲａＨｅｐＬｅｃ２（２２ ，６％）：ラット肝炎レクチン２（７）、Ｒａ、ＡＳＧＲｅｃ（２２，６％）＋ ５ット−７シ７゜糖タンパク質（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容 体（８）、Ｒａ、ＩＲＰ（２５゜６％）；ラット島再生タンパク質（９）、Ｒａ 、ＭＢＰ（２８，１％）：う。

トー７：／／−４結合タンパク質（ｌＯ）、Ｒａ、ＭＢＤＡ（２６，１％）；ラ ット・マンノース結合タンパク質前駆体Ａ（１１）、Ｒａ、ＫＣＢＰ（２７％） ：ラソト・クツベル細胞結合タンパク質（１２）、ＦＩｙＬｅｃ（２３，１％） ：ニクバエにクバエＲ）レクチン（１３）、およびＲａｂ、５ｕｒｆ（２０，９ ％）：ウサギ肺界面活性剤（１４）。

図６Ａかられかるように、はとんどＮ−末端に局在化しているＬＨＲのモチーフ は、カルシウム依存性動物レクチン即ちＣ−型レクチン（１）のいくつかと高度 な相同性を示す。これらには、ニワトリ、う、トおよびヒト由来の種々の肝炎糖 結合タンパク質、可溶性マンノース結合性レクチン、クツペル細胞由来のレクチ ン、アシアロ糖タンパク質受容体、軟骨プロテオグリカン核タンパク質、心肺界 面活性剤アポタンパク質およびニラバエおよびフジッボ由来の２種の無を推動物 レクチンが含まれるが、これらに限定されない。Ｄｒｉｃｋａ■ｅｒとその共同 研究者（前掲）によって初めてＣ−型動物レクチンに共通であることが認識され た“非変異”アミノ酸のすべてがＭＬＨＲの炭水化物結合ドメイン中に完全に保 存されているわけではないが、これらの残基およびその他の位置の相同性の程度 は明白である。Ｃ−型族に属する既知のレクチン類は、末端ガラクトース、Ｎ− アセチルグルコサミンおよびマンノースを伴うオリゴ糖類（１）を含む糖結合特 異性の範囲を示す。

これらの炭水化物結合タンパク質すべてに不変であることがわかった多くの残基 が存在するという事実は、この領域がＭＬＨＲにおいて炭水化物結合ドメインと して機能することを強く示唆しており、リンパ球がリンパ様組織の特殊化した内 皮に糖およびカルシウム依存的に結合し得るという観測事実を明確に説明してい る。いくつかの態様では、隣接ＬＨＲ領域を伴わないＬＨＲの炭水化物結合ドメ インを単独で用いて本発明を実施する。

炭水化物結合ドメイン完結のほとんど直後に認められる次のモチーフ（残基１６ ０〜１９３）は、表皮成長因子（ｅｇｆ）族に対して高度な相同性を示す。図６ Ｂは表皮成長因子（ｅｇｆ）相同性示している：ＭＬＨＲ；ＭＬＨＲ配列、Ｎｏ 　ｔ　ｃ　ｈ（３８，５％）：牛イロショウジョウバＸ　ｎｏｔｃｈ遺伝子座（ １５）、Ｓ、ｐｕ　ｒ　ｐ（３１，７％）；ストロンギロセントロター拳プルブ ラタス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｒ　ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）ｅｇ ｆ様タンパク質（１６）、Ｐ　ｒ　ｏ、Ｚ（３４，１％）：ウシ・プロティンＺ 　（１７）、Ｆａｃ　ｔ、Ｘ（３４，２％）：凝固因子Ｘ　（１８）、Ｆａｃｔ 。

■（２７，３％）；凝固因子■（１９）、Ｆ　ａ　ｃ　ｔ、ＩＸ（３３，３％） ；凝固因子ＩＸ（２０）、Ｌ　ｉ　ｎ−１２（３２，１％）；カエノルハドジチ スーエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）Ｌ　ｉ　ｎ −１２遺伝子座（２１）、Ｆａｃｔ、Ｘ［（２６％）：凝固因子Ｘｌ［（２２） 、およびＭｕ、ｅｇｆ（３０％）、ネズミ　ｅ　ｇ　ｆ　（２３）。

図６Ｂかられかるように、ＭＬＨＲのこの領域における相同性の最大値はショウ ジヨウバエ属の神経原性遺伝子座ｎｏｔｃｈに認められるが、この大きな族の他 の構成要素のいくつかにもかなりの相同性が認められる。この族の構成要素間で このドメインの位置が多様であることは、この領域が、異なる機能のための異な るタンパク質問で入れ換えられ得るゲノム断片内に存在し得ることを示唆してい る。

６個のシスティン残基に加えて、この族のほとんどすべての構成要素が３個のグ リシン残基を共有している。このシスティン残基とグリシン残基の保存はＬＨＲ におけるこの領域の構造上の役割の可能性と一致している。このドメインが、Ｎ −末端に位置する炭水化物結合領域をリガンド相互作用に適した配回に位置させ ると考えられる。またこのドメインは、内皮表面のｅｇｆ−受容体同族体に結合 することによるリンパ球と内皮との相互作用を強化するように働くとも考えられ る。

ＭＬＨＲの細胞外領域中の最後のタンパク質モチーフはアミノ酸１９７から３２ ８までをコードしている。この糖タンパク質のこの領域は、いくつかの補体因子 結合タンパク質と高度な相同性を有するアミノ酸モチーフ（図６Ｃ）を含有する ６２残基配列の２つの直列反復を含んでいる。

図６Ｃは補体結合タンパク質相同性を示している：ＭＬＨＲ；ＭＬＨＲ配列、Ｈ ｕＣｏｍＨ（３１，９％）、ヒト補体プロティンＨ前駆体（２４）、ＭｕＣｏｍ Ｈ（２８，９％）；ネズミ補体プロティンＨ前駆体（２５）、ＨｕＢｅ　ｔ　ａ （２５，６％）；ヒトβ−２−グリコプロティンＩ（２６）、ＨｕＣＲｌ（２９ ，９％）：ヒトＣＲｌ　（２７）、ＥＢＶ／３ｄ（２５％）６；ヒト・エプスタ イン−バー・ウィルス／Ｃ３ｄ受容体（２ｇ）、ＨｕＣ２（２７，１％）：ヒト 補体Ｃ２前駆体（２９）、ＨｕＢ（２３，１％）：ヒト補体因子Ｂ　（３０）、 ＭｕＣ４ｂ（２２％）、ネズミＣ４ｂ結合前駆体（３１）、ＨｕＣ１５（２９， ２％）；ヒトＣ１ｓチモーゲン（３２）、ＨｕＣ４ｂ（２６，１％）、ヒトＣ４ ｂ結合タンパク質（３３）、ＨｕＤＡＦ（２７，１％）：ヒト崩壊促進因子（３ ４）、ＶａｃＳｅｃＰ（２６，２％）；ワクシニア・ウィルス分泌ペプチド（３ ５）。

この反復ドメインの複数の広い範囲をコードするこれらのタンパク質には、数あ るなかでも、ヒトおよびネズミ補体Ｈ前駆体、ヒト・ベータ２糖タンパク質、エ プスタイン−バー・ウィルス／Ｃ３ｄ受容体、ヒトＣ４ｂ結合タンパク質、崩壊 促進因子およびワクシニアウィルス分泌ポリペプチドが含まれる。

図７ＣはＭＬＨＲ中の２つの直列反復と補体結合族に属するタンパク質に認めら れる直列反復との相同性を示している。補体結合タンパク質のこの群に保存され ているアミノ酸の多くが、保存されているシスティン残基の数を含めて、ＭＬＨ Ｒのこの領域中の２つの反復にも認められる。

興味深いことに、ＭＬＨＲに含まれる２つの反復は、アミノ酸レベルで厳密に互 いの複製であるばかりでなく、ヌクレオチド配列レベル（ヌクレオチド残基６８ ５〜８６５および８６６〜１０５６）でも厳密な相同性を示している。この結果 がクローニング・アーチファクト（人工産物）によるものであることも考えられ るが、Ｍ　Ｌ　ＨＲ発現細胞株３８Ｃ１３（スタッフォード大学（Ｐａｌｏ　Ａ ｌｔｏ、　Ｃａｔ　１ｆｏｒｎｉａ、　Ｕ。

Ｓ、＾、）から入手可能）から作成した別個のｃＤＮＡライブラリーから単離し た他のクローンのいくつか、およびヒトのＭＬＨＲ同族体（後述）にもこの複製 領域が認められている。さらに、いくつかの他の遺伝子（最も注目すべきはＬｐ （ａ）遺伝子である）は、さらに高度なこのドメインの遺伝予肉反復配列保存を 示す。これらの結果は、ＭＬＨＲが補体結合族の他の構成要素と同様に、この結 合ドメインの複数反復を含有することを示唆している。

結論として、ＭＬＨＲの細胞外領域は互いに結合することによって新しい１また は複数の機能を果している３つの別個のタンパク質モチーフを含有していると思 われる。この糖タンパク質に含まれるタンパク質モチーフの要約を図７に示す。

実施例２：ＨｕＬＨＲのクローニング 上記の例に記述したように一般に、上述のネズ！Ｍｅｌ１４抗原ＣＤＮＡクロー ンの２．２ｋｂＥｃｏＲ１挿入物を単離し、ｐ３を三リン酸塩を用いるランダム ・プライム化ＤＮＡポリメラーゼ合成によって高比活性に標識し、これを用いて 、−次細胞から得たヒト末梢血液リンパ球ｍＲＮＡ由来のオリゴｄＴプライム化 うムダｇｔｌｏｃＤＮＡライブラリーから６０００００クローンをスクリーニン グした。

フィルターを４０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは３０ＩＩＭＮａｃ Ｉ、３１１Ｍクエン酸三ナトリウムである）、５０ａ＋Ｍリン酸ナトリウム（ｐ 　Ｈ６，８）、１０％硫酸デキストラン、５ｘデンノ１ルト溶液および２０μｇ ／ｍｌ剪断：ｔ４サケ精子ＤＮＡ中４２℃で終夜ハイブリッド形成を行った。こ れらを０．２ｘＳＳＣ，０，１％硫酸ドデフルナトリウム中５５℃で４０分間２ 回洗浄した。１２クローン（５００００フアージのプレートあたり約１陽性）を 選択し、最大のＥｃｏＲ１挿入物（〜２２キロ塩基）を単離し、そのＤＮＡ配列 を、配列特異的プライマーを用いるバクテリオファージｍｌａ内でのジデオキシ ヌクレオチド配列決定法によって決定した。

この〜２．２ｋｂクローンは、コザソク・ボックス相同領域に続くメチオニンで 始まる約４２２００ダルトンの分子量を有する３７２アミノ酸の読み取り枠をコ ードしていた。このフード化されたタンパク質には２６個のシスティン残基と８ カ所の潜在的Ｎ−結合型グリコリル化部位が含まれていた。このタンパク質のＮ −末端の高度に疎水的な領域（残基２０〜３３）はシグナル配列と考えられ、Ｃ −末端に位置する２２アミノ酸長のもう１つの高度に疎水的な領域（残基３３５ 〜３５７）はストップ・トランスファーまたは膜固定ドメインと考えられた。こ のＣ−末端疎水領域には、荷電した、おそらく細胞質領域と考えられる領域が続 いていた。

このヒト・クローンのヌクレオチド配列を既に分かっているＭＬＨＲの配列と比 較したところ、高度な総ＤＮＡ配列相同性（〜８３％）が認められた。各ＬＨＲ ドメインにおけるＭＬＨＲとＨｕＬＨＲの相対的アミノ酸配列保存度は次の通り である：炭水化物結合ドメインー８３％Ｈｅｇｆ様ドメイン−８２％：補体結合 反復１−７９％：補体結合反復２−８３％；総補体結合ドメインー７１％；貫膜 ドメインーー９６％。

公開されたヘルメス配列（Ｊａｌｋａｎｅｎ、前掲）を、図１のＨｕＬＨＲ配列 と比較すると、配列相同性が無いことがわかる。

実施例３：ＭＬＨＲの発現 本発明において単離したネズミｃＤＮＡクローンがＭＬＨＲをコードしているこ とを決定的に立証するために、このクローンを発現ベクター中に挿入し、一時的 細胞トランスフェクション検定法で分析した。ＨｕＬＨＲの発現も同様の方法で 実行した。

上述の読み取り枠を含むＥｃｏＲ，１断片（図２に配列を示した〜２゜２キロ塩 基ＥｃｏＲ１断片）を単離し、サイトメガロウィルス・プロモーターを含有すｐ ＲＫ５ベクター（Ｅａｔｏｎ、　Ｄ、等、Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ　２５： ８３４３−８３４７（１９８６）　；欧州公開第３０７２４７号（１９８９年３ 月１５日公開））中に連結した。この挿入ｃＤＮＡをプロモーターに対して正し い配向で含有しているプラスミドを選択し、ＣａＰＯａ沈殿法を用いて２９３ヒ ト胚腎細胞に導入した。

２日後、細胞を各５００μＣｉの３　ｓｓシスティンおよびメチオニンと共にイ ンキュベートした。溶解液と上清を過去に記述されたように調製しくＬａ５ｋｙ ル等、Ｃｅ１ｌ　５０：９７５−９８５（１９８７））、Ｍｅｌ１４モノクロー ナル抗体とプロティンＡ・セファロースとの間に挟まれた抗う。

ト１ｇＧポリクローナル抗体を使用することによって、Ｍｅｌ１４モノクローナ ル抗体（免疫アフィニティー・クロマトグラフィーで精製したもの）で免疫沈降 した。

同時に、ＭＬＨＲを発現することがわかっている細胞、Ｂ−細胞リンパ腫３８Ｃ １３を、上清ＭＬＨＲを分析するためにメチオニンあるいはンステインで代謝的 に標識するか、もしくは細胞に結合したＬＨＲを分析するためにこの細胞表面糖 タンパク質をＩｌｌおよびラクトペルオキシダーゼで標識し、Ｍｅ１１４抗体免 疫沈降によって分析した。

得られた免疫沈降物を７，５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルで分析し、−７０ ℃で終夜オートラジオグラフィーにかけた。

これらの検定結果を図５に示す。この図におけるレーンＡ−Ｆの意味を次に説明 する： Ａ、　Ｍｅｌ　１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＭＬＨＲ発現プラスミ ドでトランスフエフシランした２９３細胞の溶解液；Ｂ、Ｍｅｌ１４モノクロー ナル抗体で免疫沈降した、ＭＬＨＲ発現プラスミドでトランスフェクションした ２９３細胞の上清：Ｃ，、Ｍｅｌ　１４モノクオ一ナル抗体で免疫沈降した、Ｈ ＩＶｇｐ１２０外被糖タンパク外被全タンパク質スミドでトランスフェクション した２９３細胞の溶解液。

Ｄ、Ｍｅ１１４モノクオーナル抗体で免疫沈降した、ＨＩＶ外被発現プラスミド でトランスフェクションした２９３細胞の上清；Ｅ、Ｍｅｌ１４モノクローナル 抗体で免疫沈降した３８Ｃ１３細胞上清； Ｆ、Ｉ”’で表面標識し、Ｍｅ１１４モノクローナル抗体で免疫沈降した３８Ｃ １３細胞溶解液。

図５かられかるように、この構築物でトランスフェクションした細胞は、Ｍｅｌ １４抗体と特異的に反応する２種類の細胞結合性タンパク質を生産する。これら の細胞結合性タンパク質は約〜７００００ダルトンおよび〜８５０００ダルトン に移動し、このことは〜４２２００ダルトンの核タンパク質がトランスフェクシ ョン細胞中でグリコジル化されるようになることを示唆している。シアリダーゼ 処理を行うと、より大きなバンドの分子量が変化する（データは示していない） ことは、このタンパク質が相対的に成熟型の糖タンパク質であることを示唆し、 一方、より低分子量のバンドがこの酵素に対して耐性であることは、このタン、 ｆり質が前駆体型であり得ることを示している。

一時的トランスフェクンヨン細胞株のＭｅｌ１４抗体によるＦＡＣ分析は、これ らの細胞中で発現したＬＨＲの一部が細胞表面上で検出可能であることを明らか にした（データは示していない）。

このトランスフェクション細胞株中で生産される、より高分子量の糖タンパク質 は、他のトランスフェクション細胞株で得た結果、即ち末梢リンパ節誘導性Ｂ− 細胞リンパ腫３８Ｃ１３が産出するものく図５レーンＦ）より僅かに小さいこと がわかった。これはグリコジル化の細胞特異的相違によるものであろう。

興味深いことに、３８Ｃ１３細胞とトランスフェクションしたヒト細胞はどちら も、より低分子量型のＭＬＨＲを培地中に放出するようである（図５レーンＢお よびＥ）。この放出分子の性質は明らかではないが、その分子量が小さいことは 、これが膜アンカー付近のタンパク加水分解によって生じた細胞表面型の切断産 物であることを示唆している。

結論として、これらの結果は、本発明者等が単離したｃＤＮＡクローンがＭＬＨ Ｒをコードしていることを明確に立証している。

実施例４：先端が欠失したＭＬＨＲ−Ｉ　ｇＧキメラの構築、精製お図８は、レ クチン、レクチン−ｅｇｆおよびレクチン−ｅｇｆ−補体調節モチーフを含有す るＭＬＨＲ−１３Ｇキメラ類の構築を示している。この図の最上段は、質膜アン カードメイン（ＴＭＤ）および短い細胞質配列と共にＮ−末端／グナル配列（Ｓ Ｓ）、レクチン・ドメイン、表皮成長因子（ｅｇｆ）ドメインおよび重複した補 体調節ドメイン（ＣＤＢ）を含有するネズミリンパ球誘導受容体（ＭＬＨＲ）の タンパク質ドメインを示している。レクチン（ＭＬＨＲ−Ｌ＋Ｉ　ｇＧ）、レク チンおよびｅｇ　ｆ（ＭＬＨＲ−ＬＥ＋Ｉ　ｇＧ）、およびレクチン、ｅｇｆお よび２つの補体調節モチーフ（Ｍｌ、ＨＲ−ＬＥＣ＋Ｉ　ｇＧ）を含有する３種 類の先端欠失型ＭＬＨＲ−Ｉ　ｇＧキメラ類も図８に示されている。これらの先 端欠失型タンパク質はすべて、これらのキメラがＣＨ２およびＣＨ３定常領域と 共に、免疫グロブリンニ量化に寄与するヒンジの２個のシスティン残基（Ｃ）を 含有するように、ヒンジ・ドメイン（Ｈ）の直ぐ上流のヒト重鎖ガンマ１領域に 結合している。過去に特徴づけられたヒト重鎮１ｇＧ１定常領域カセ。

ト（Ｃａｐｏｎｅｔ等、前掲（１９８９））を使用した。ＬＨＲ配列とヒトＩｇ Ｇ配列との接合部位は、ヒンジ領域近傍におけるこれらの分子の結合によって、 軽鎖が産出されない条件下でキメラ分子が効率的に合成され、三量化されるよう に選択した。さらに、ヒトＩｇＧ１定常領域を使用することにより、以下に記述 する免疫組織化学的実験において、内因性のネズミ１ｇＧ類との交差反応性に起 因する問題を避けることができる。

図９かられかるように、これらのキメラはこれらの一時的トランスフェクション 検定中で効率良く合成され、分泌された。抗体を添加しない条件下でのこれらの キメラとプロティンＡセファロースとの反応性は、これらの定常領域ドメインが 正常に畳み込まれていることを立証している。図９は、これらの分子が非還元的 条件下で三量化することを示しており、これらのキメラにおいてヒンジ領域が完 全に機能的であることを立証している。最後に、プロティンＡ反応性は、プロテ ィンＡセファロース・カラムによるこれらのキメラのほぼ均一な精製をも可能に する。この実施例の結果は、定常ドメインがヒトＩｇＧガンマ１重鎖由来であり 、一方、“可変”ドメインがＭＬＨＲ由来であると言える抗体様物質の生産を立 証している。

キメラの構築 過去に記述されたＭＬＨＲ−ＰＲＫ５発現プラスミド（Ｅａｔｏｎ等（１９８６ ）　：　Ｌａ５ｋｙ等、Ｃｅ１ｌ　５０：９７５−９８５（１９８７））および ヒト重鎖ＩｇＧのＣＤＮＡコピー（Ｃａｐｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ　３３７：５２ ５−５３１（１９８９））から出発して、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨＩ−ＣＨ ３領域をコードする１１００ｂｐのＨｉｎｄｌｌ＋断片を、ＭＬＨＲｃＤＮＡの ポリＡ部位の３゛に挿入した。ｍ１３１１［製起点およびＫＯ７ヘルパー・ファ ージを用いてこのプラスミドを一本鎖鋳型に変換した後、質膜固定領域と推定さ れる領域のＮ−末端側のレクチン、ｅｇｆおよび第２補体結合反復とヒンジとの 間の領域を、インビトロ変異法（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ（１９８２）） により、４８７−・オリゴヌクレオチドでループ・アウトした。得られた変異体 を、欠失接合部をまたぐｓａｐで標識した２１７−・オリゴヌクレオチドでスク リーニングし、単離した変異体をスーパーコイル配列決定法を用いて配列決定し た。

過去に記述された方法を用いてヒト腎２９３細胞をトランスフェクションするこ とによる発現について、正しい変異体を試験した。

ｆｆ５３メチオニンおよびシスティンで標識した上清を、抗体を添加しない条件 下でプロティンＡセファロース・ビーズによる免疫沈降によって分析した。沈降 したタンパク質を、β−メルカプトエタノールによる還元下または非還元下、７ ．５％ポリアクリルアミド−５ＤＳゲルで分析した。正しく発現したキメラを貸 すプラスミドを、Ｇ４１８に対する耐性をコードしている選択プラスミドおよび ジヒドロ葉酸レダクターゼの存在下でトランスフェクシジンすることにより、２ ９３細胞中に導入した。クローンをＧ４１８中で選択し、挿入されたプラスミド をメソトレキセートの存在下で増幅した。各構築物を高レベルで発現する永久細 胞株をＴ−フラスコ中で大量に生育させ、その細胞上清を遠心分離および濾過に よって透明化した。

得られた上清をアミコン濾過によって濃縮し、標準的プロティンＡセファロース カラムに通し、ＰＢＳで洗浄し、０，１Ｍ酢酸、０．１５Ｍ　ＮａＣＩ（ｐＨ３ ，５）で溶出させた。溶出した物質を直ちに３ＭＴ　ｒ　ｉ　５（ｐＨ９）で中 和し、ＳＤＳゲル電気泳動およびＥＬＩＳＡ検定法で定置した。

前段落に記述したゲル電気泳動の結果を図９に示す。還元されたタンパク質をレ ーンＡ−Ｆに、非還元タンパク質をレーンＧ−Ｉに、また精製したタンパク質を レーンＪ−Ｌに示す。マーカーの分子量を牛ロダルトンで示す。各レーンの同定 を次に説明する　Ａ１分泌されたＭＬＨＲＬＥＣ−１ｇＧ、Ｂ、細胞内ＭＬＨＲ ＬＥＣ−Ｉ　ｇＧ。

Ｃ分泌されたＭＬＨＲＬＥ−Ｉ　ｇＧ、Ｄ、細胞内ＭＬＨＲＬＥ−１ｇＧ、Ｅ　 分泌されたＭＬＨＲＬ−Ｉ　ｇＧ、Ｆ　細胞内ＭＬＨＲＬ−ＩｇＧ、Ｇ　分泌さ れたＭＬＨＲＬＥＣ−ｆ　ｇＧ、Ｈ，分泌サレタＭＬＨＲＬＥ−ＩｇＧ、Ｉ　分 泌されたＭＬＨＲＬ−Ｉ　ｇＧ、Ｊ　精製したＭＬＨＲＬＥＣ−１ｇＧ、に、精 製したＭＬＨＲＬＥ−１ｇＧ、Ｌ　精製したＭＬＨＲＬ−Ｉ　ｇＧ０ 抗ヒト＋ｇＧ１＝特異的マウス・モノクローナル抗体で被覆したウェルからなる 形式のＥＬ＋ＳＡを用いて、単離したＬＨＲ−＋　ｇＧキメラを定量した。未知 試料と高度に精製したヒ）ＣＤ４−１　ｇＧ１免疫アトへシン（ｉｖ＋＋ｕｎｏ ａｄｈｅｓｉｎ）標準を、抗体で被覆したプレートと共にインキュベートした後 、そのプレートを洗浄し、結合した物質を西洋ワサビ・ペルオキシダーゼと結合 したヤギ抗ヒトＩｇＧ１と反応させ、次いでさらに洗浄し、基質を添加した。こ の定量的検定法によって、サブナノグラム量の単離ＬＨＲ−Ｉ　ｇＧキメラが測 定できた。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡによるＭＬＨＲ−Ｉ　ｇＧキメラＰＰＭＥ反応性の分析種々のＩ ｇＧキメラが酵母細胞壁炭水化物、ポリホスホマンナンエステルまたはＰＰＭＥ を認識する能力を、過去に記述された形式のＥＬ　Ｉ　ＳＡで分析した（１ｍａ ｉ等（１９８９））。簡単に記述すると、約等量の精製キメラを４°Ｃで終夜微 量滴定ウェルに被覆する。非特異的部位をＢＳＡで遮断した後、結合した抗原を ５μｇ／ｍｌのＰ　ＰＭＥ溶液と反応させた。結合した炭水化物を、これに対す るポリクローナル抗体および標準的（ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ））免疫組織化学 的染色試薬を用いて検出した。Ｍｅｌ１４による阻害を、ＰＰＭＥ添加前にＭＬ ＨＲＬＥＣ−１ｇＧ含宵ウェルをこのモノクローナル抗体と共に予備インキュベ ートすることにより実行し、一方、結合反応中に１０ｍｋｌＥＧＴＡを添加する ことにより、この誘導受容体−炭水化物相互作用のカルシウム依存性を立証した 。阻害を調べる検定として、ＰＰＭＥインキュベーションの前に他の種々の添加 物を加えた。２２℃で１時間後、プレートを洗浄し、ＰＰＭＥに対するウサギ・ ポリクローナル抗体と共に２２°Ｃで１時間インキュベートした。プレートを洗 浄し、ベクターＡＢＣ−ＡＰと共に３０分間インキュベートし、洗浄し、発色さ せた。得られた検定をプレート読み取り機で測定した。阻害検定に使用した炭水 化物はシグマ・ケミカル・コーホレイテッド（Ｓｉｇ＋ｓａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、　、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，）から入手した。

ＰＰＭＥ結合分析の結果を図１０に示す。各レーンは次のＭＬＨＲ−４ｇｃキメ ラを含有する：　Ａ、ＭＬＨＲＬ−１ＭＬＨＲＬＥ−およびＭＬＨＲＬＥＣ−Ｉ ｇＧキメラに対するＰＰＭＥの結合、Ｂ。

Ｍｅｌ１４モノクローナル抗体およびＥＧＴＡによるＭＬＨＲＬＥＣ−Ｉ　ｇＧ −ＰＰＭＥ結合の阻害、Ｃ９他の炭水化物によるＭＬＨＲＬＥＣ−１ｇＧ−ＰＰ ＭＥ結合の阻害。

過去に行われた研究によって、ＬＨＲが酵母細胞壁マンナン、ホスホマンナンエ ステルまたはＰＰＭＥに結合し得ること（Ｙｅｄｎｏｃｋ等。

Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０４ニア２５−７３１（１９８７））、並びに、こ の結合がリンパ球の末梢リンパ節高内皮小嚢に対する吸着能を阻害することが立 証されており、これは末梢リンパ節ＬＨＲレクチン・ドメインが末梢リンパ節内 皮上の炭水化物を認識するであろうという仮説に合致している。さらにＭｅ１１ ４抗体がリンパ球表面に対するＰＰＭＨの結合を阻害することも発見され（Ｙｅ ｄｎｏｃｋ等、前掲（１９８７乃、これは、この炭水化物が末梢リンパ節ＬＨＲ のレクチン・ドメイン内に結合するという理解と合致している。

レクチン、ｅｇｆおよび重複した補体結合反復構造を含有するキメラがＰＰＭＥ を結合することがわかった。この結合はＭｅｌ１４抗体によって阻害可能であり 、このことは、ＭＬＨＲＬＥＣ−１ｇＧキメラがこの抗体によって認識されるこ とを立証するデータ（データ・は示していない）と合致している。またこの結合 は、肺細胞から単離されたＭＬＨＲ（１■ａｉ等、印刷中（１９８９乃を用いて 過去に認められたものと定量的に同等であり、このことは、これがリンパ球表面 上のＬＨＲで認められているタンパク質−炭水化物相互作用（Ｙｅｄｎｏｃｋ等 、前掲（１９８７））と同じであることを示唆している。さらに、この結合はカ ルシウム依存性であることもわかり（ＳｔｏｏｌｍａｎおよびＲｏｓｅｎ。

Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、９６：７２２−７２９（１９８３乃、このことは、リ ンパ球結合受容体について既に示されているように、Ｃ型またはカルシウム依存 性レクチン・ドメイン（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ ｌ、　２６３：９５５７−９５６０（１９８８））が少なくとも部分的にこの相 互作用に寄与することを暗示している（図９ｂ）。

過去に行われた研究によって、ＰＰＭＥ以外の種々の炭水化物が肺臓由来のＭＬ ＨＲによって認識され得ることが立証されている（Ｙｅｄｎｏｃｋ等、前掲（１ ９８７）　；　Ｉｍａｉ等、前掲（１９８９））。これらには、フコイジン、硫 酸デキストランおよび脳由来のスルファチド類が含まれる。

これらの炭水化物がＭＬＨＲＬＥＣ−１ｇＧキメラとＰＰＭＥとの相互作用を阻 害する能力を、この分子の特異性を過去に記述された肺臓由来の糖タンパク質（ Ｉｍａｉ等、前掲（１９８９））と比較するために試験した。図９かられかるよ うに、フコイジン、硫酸デキストランおよびスルファチドはすべてＰＰＭＥとＭ ＬＨＲＬＥＣ−Ｉ　ｇｃとの相互作用を阻害することができ、このことは、組換 え法で誘導したこのタンパク質の炭水化物特異性が、天然に存在するタンパク質 に関して過、去に記述されたものとよく似ていることを示している。他の２種類 の荷電炭水化物、硫酸フンドロイチンおよびヘパリンによって阻害されないこと は、この阻害が特異的炭水化物認識に起因するものであり、これらの化合物の高 度に荷電した性質による非特異的相互作用に起因するものではないことを示唆し ている。

ＭＬＨＲ−［ｇＧキメラによる細胞遮断検定過去に記述された（Ｇｅｏｆｆｒｅ ｙおよびＲｏｓｅｎ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　、印刷中（１９８９）） バイエル斑およびマウスの末梢リンパ節のクリオスタノト切断切片を用いて、ス タンプファー・ウノドルフ（Ｓｔａｍｐｆｅｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ）細胞遮断検 定法（ＳｔａｍｐｅｒおよびＷｏｏｄｒｕｆＴ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　 １４４：８２８−８３３（１９７６））を実行した。簡単に説明すると、ＭＬＨ Ｒ−１ｇＧキメラ、単離した肺臓由来Ｍ　Ｌ　ＨＲもしくは緩衝液単独の存在下 で、凍結組織切片を腸間膜リンパ球と共にインキュベートした。ＭＬＨＲ−１ｇ Ｇキメラを１ｏμｇ／切片程度の濃度で添加し、１　ｘ　１０’細細胞用ｌの添 加前に凍結切片上で予備インキュベートした。このスライドを洗浄し、デジタル 生物形態計測によって、リンノで球付着を、単位面積あたりのこれらのリンパ様 器官中のＨＥＶに結合したリン／−、Ｎ細胞数として測定した。

データは示さないが、ＭＬＨＲＬＥＣ−Ｉ　ｇＧキメラは末梢リンパ節ＲＥＶに 対するリンパ球の結合を約７５％阻害のレベルで阻害し、一方この検定において 、肺臓由来のＭＬＨＲは約５０％のレベルで遮断することがわかった。この阻害 はカルシウム依存性であり、ＭＥＬ１４モノクローナル抗体の添加によって遮断 された（データは示していない）。

ＭＬＨＲ−１ｇＧキメラの免疫組織化学的分析単離したＭＬＨＲ−Ｉ　ｇＧキメ ラを、モノクローナル抗体のために用いる方法と同一の方法を用いる免疫組織化 学的実験に使用した。

８〜１０ミクロンの組織切片をクリオスタフト中で切断し、０．ＩＭカコジレー ト、１％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で３０分間固定した。この切片をダ ルベツコＰＢＳ中で洗浄し、５％正常マウス血清中の種々の量のＭＬＨＲ−１ｇ Ｇキメラを用いて４°Ｃで３０分間染色した。次にこれらの切片を洗浄し、ビオ チニル化したヤギ抗ヒトＦｃ特異的抗体（ベクター）を含む第２段階と共にイン キュベートした。第２段階の試薬の添加後およびベクターＡＢＣ錯体の添加前に 切片を過酸化水素−メタノールで処理することにより、内因性のペルオキシダー ゼを除去した。切片を洗浄し、基質（ＡＥＣ）と共に５〜１０分間インキュベー トした。最後に切片を水性ヘマトキシリン（バイオメディア（Ｂｉｏｍｅｄｉａ ））で対比染色し、ツアイス・アキジオプロット（Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｐｌｏ ｔ）で検査した。

３種類のＭＬＨＲ−Ｉ　ｇＧキメラのこれらの免疫組織化学的分析では末梢リン パ節を組織源として用いた。組織学的供給源として末梢リンパ節を選択したのは 、リンパ球がこのリン、ｆ様組織のＨＥＶに対して、Ｍ（１１４によって遮断さ れ得る様式で結合することが多くの過去の文献によって立証されており、これに よりＭＬＨＲによって認識される最大レベルのリガンドがこの組織中に存在する はずであることが示唆されている（Ｇａｌｌａｔｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ　３０４ ：３Ｏ−３４（１９８３））ことに基づく。ＭＬＨＲＬＥＣ−Ｉ　ｇＧキメラは 末梢リンパ節ＨＥＶを染色することができた。この染色は専ら高望（ｈｉｇｈ　 ｗａｌｌｅｄ）内皮細胞上に認められ、内腔外または内腔近傍領域は染色されな かった。さらに、この染色はＭＥＬ１４抗体によって遮断可能であり、カル／ラ ムの存在に依存した。このことはＭＬＨＲＬＥＣ−１ｇＧの末梢リンパ節ＨＥＶ に対する結合が、リンパ球とＨＥＶとの接着に似ていることを示唆している。Ｐ ＰＭＥ結合データと合致して、ＭＬＨＲＬＥＣ−１ｇＧによる末梢リンパ節ＲＥ Ｖの染色はフコイジンおよび硫酸デキストランによって阻害可能であり（図５） 、一方、硫酸フンドロイチンおよび単純なマンナン類はこの染色反応を阻害でき なかった（データは示していない）。このこともまた、この染色反応が、この末 梢リンパ節ＨＥＶ上に発現した炭水化物リガンドの認識によるものであることを 示唆している。これらのデータは、末梢リンパ節ＬＨＲと相互作用し得る内皮分 子の組織分布を調べるために、この型の免疫組織化学的試薬を使用し得ることを 明らかにしここには示さないが、免疫組織化学的検定の結果、本発明者等は、予 想外にもＭＬＨＲＬＥＣ−Ｉ　ｇＧキメラがバイエル斑の内皮を特異的に認識し 得ることを発見した。このキメラは、リンパ細胞を含有するバイエル炎管の裏壁 内皮を染色するようである。この染色はＭＥＬ１４抗体によって阻害可能であり 、カリシラム依存性でもあった。興味深いことに、バイエル斑ＲＥＶの染色は、 末梢リンパ節ＨＥＶの染色と比較するといくらか弱いように見え、このことは、 このリンパ様器官において発現するＭＬＨＲリガンドがより低レベルであること を示唆している。これらの結果は、他の接着系もこの器官に含まれ得るが（Ｈｏ ｌｚｍａｎ等、Ｃｅ１１５６：３７−４６（１９８９））、末梢リンパ節ＬＨＲ に対するリガンドが発現し、それゆえに、このリガンドがこのリンパ様器官の内 皮に対するリンパ球の結合に関与することを立証している。

実施例６　：　ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ−ＭＬＨＲ−１ｇＧキメラの構築過去に構築さ れた２種類のＰＲＫプラスミドをＭＬＨＲ−１ｇＧおよびヒトＣＤ４−１　ｇＧ の直接発現に使用した。ＭＬＨＲプラスミドは上の実施例に記述したものである 。ＣＤ４−Ｉｇプラスミドは、Ｃ，ｉ＋ドメインおよび最初のシスティン残基ま でのヒンジ領域部分をフードする領域を削除することによって改変した、Ｃａｐ ｏｎ等の文献（前掲）に記述されているものである。これらのプラスミドを上述 の標準的リン酸カルシウム法を用い゛て、２つの遺伝子が高レベルで一時的に発 現する細胞を作成するためにＰ　Ｓ　Ｖ　Ｔ　ａｎｔ　Ｉｌｌ＠ｎと共に、もし くは２つの遺伝子が安定に発現する細胞クローンを選択するためのネオマイシン 耐性を付与するためにｐｓｖ”’と共（こ、ヒト２９３細胞中に同時トランスフ ェクションした。放射免疫沈降１こよって発現を分析した：　ＣＤ４．−Ｔ　ｇ Ｇ、ＬＨＲ−１ｇＧおよびＣＤ４−Ｉ　ｇＧ−ＬＨＲ−Ｉ　ｇＧはすべてＩｇＧ Ｆｃ部分を含有して（Ｘるので、これらはすべて標準的方法でプロティンＡによ って直接沈降させ得る。３種類の分子、Ｃ，Ｄ４−１　ｇＧホモ二重体、ＬＨＲ −Ｉ　ｇＧホモニ量体およびＣＤ４−Ｉ　ｇＧ−ＬＨＲ−１ｇＧへテロニ量体を 検出した。これらの分子は還元によってそれぞれの単量体成分に分離し、このこ とは各二量体の構成成分が、ヘテロニ量体を含めて、ジスルフィド結合によって 互いに共有結合していることを示している。

実施例の整考文献 １、　Ｄｒｉｋａｍｅｒ、　Ｋ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌｌ、　２ ６３：９５５７（１９８８）　；　Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ、　j、　、　Ｋｉｄｎ ｅ ｙ　Ｉｎｔ、３２：５１６７（１９８７）２、５ｐｉｅｓｓ、　Ｍ、等、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８２ 　：６４６５（１９８T） ３、　Ｍｕｒａｍｏｔｏ、　Ｋ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃ ｔａ　８７４：２８５（１９８６）４、　Ｌｅｕｎｇ、　Ｊ、等、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６０：１２５２３（１９８５）　：　Ｈｏ１ｌａｎｄ、 　Ｅ、等、　Ｐ窒盾メB Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８Ｌニア３３１！ （１９８４）５、　Ｄｒｉｋａｍｅｒ、　Ｋ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、 ２５６：５ｇ２７（１９８１）６、　Ｋｉｋｕｔａｎｉ、　Ｈ，等、Ｃｅ１ｌ　 ４７：６５７（１９８６）？、　ＭｃＰｈａｕｌ、　１１．等、　Ｍｏ１ｅｃ、 　Ｃｅｌ　１．　Ｂｉｏｌ、　７　：　１８４１（１９８７）８、　Ｈａｌｂｅ ｒｇ、　Ｄ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６２：９８２８（１９８７ ）９、Ｔｅｒｚａｏｎｏ、に、等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、２６３：２１１１ （１９１１１８）１Ｇ、Ｄｒｉｃｋａｓｅｒ、に、等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ 　２６２：２５８２（１９８７）１１、Ｄｒｉｋａｍｅｒ、　Ｋ、等、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓ、　２６１　：６８７８（１９８６）１２、　Ｈｏｙｌｅ 、　Ｇ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３ニア４８７（１９８ｇ） １３、　Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　Ｈ，等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ、　２ ６０　：１２２２１１ｔ（１９８５）１４、　Ｂｏｇｇａｒａａ＋、　Ｖ、等、 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ、　２６３：２９３９（１９８ｇ）１５、　Ｋ 　ｉｄｄ、　Ｓ、等、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　６：３０９４（１ ９８６）１６、　）ｌｕｒｓｈ、　Ｄ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３７：１４８７（ １９８７）１７、　Ｈｏｊｒｕｐ、　Ｐ、等、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１８４ ：３３３（１９８５）１８、　Ｆｕｎｇ、　Ｍ、等、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　１２：４４８１（１９８４）１９、　Ｔａｋｅｙａ、　Ｈ，等、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ−７６： ４９９０（１９７９）２０、　ＭｃＭｕｌｌｅｎ、　Ｂ、等、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏａ＋＋ｓｕｎ、　１１５：８（１９８３ ）２１、　Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、　１．　、　Ｃｅ１ｌ　４３：５８３（１９８ ５）２２、　Ｃｏｏｌ、　Ｄ、等、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０　：　１ ３６６６（１９８５）２３、　Ｇｒａｙ、　Ａ、等、　Ｎａｔｕｒｅ　３０３ニ ア２２（１９８３）２４、５ｃｈｌｚ、　Ｔ、等、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　１ｍ＋５ ｕｎｏ１．１６：１３５１（１９８６）２５、　Ｋｒ１ｓｔｅｎｓｅｎ、　Ｔ、 等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　 Ａ、　８３：　３９U３（１９８６） ２６、　Ｌｏｚｉｅｒ、　Ｊ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８１：３６４０（１９８４j ２７、　Ｂｅｎｔ　ｌｅｙ、　Ｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２３９　：３３ ９（１９８６）２８、　Ｍｏｏｒｅ、　Ｍ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８４　：９１９４（１９８７j ２９、　Ｂｅｎｔ　ｌｅｙ、　Ｄ、等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８１　：　１２１２i１９８４） ３０、　Ｍｏ１ｅ、　Ｊ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２５９　：３ ４０７（１９８４）３１、　ＤｉＳｃｉｐｉｏ、　Ｒ，等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　ＣｈｅＩｌ、　２６３：５４９（１９８ｇ）３２、　ＫｕｓｏＩｌｏｔｏ、■ ０等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ 、　８５ニア３０７（１９W８） ３３、　Ｌｉｎｔ　ｉｎ、　Ｓ、等、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２０４ニア７（ １９８６）３４、　Ｃａｒａｓ、　１．等、Ｎａｔｕｒｅ　３２５：５４５（１ ９８７）３５、　Ｋｏｔｗａｌ、　Ｇ、等、Ｎａｔｕｒｅ　３３５：１７６（１ ９８ｇ）（以下余白） 子は＝ツ＝シモ＝＝町モ＝＝祿モ＝ 常＝＝■＝禦諧；＝＝＝京巳臣頂諧＝＝出井：＃Ｌ！ツ＝＝憲口■忠＝＝　：ｉ Ｉｅ　：；　：Ｈ出＝禦＝化丑エロ■＝＝…諧＝＝諧櫂富±；＝囚よ＝＝櫂忠− 引モ趨Ｄり−＝＝＝ 諧に濃叱モーを升詔富＊−富＝＊ 巨ｐ＝＝櫂ニー諧轟工＝＝　＝　＝　＝　＝　＝　＝　＝　：ｍ−　・　−■ 、９ 山 １−′″；　Ｈｗ　ｉ　５　ｉ 競争到漬変（ｎに／ｓｌ） 国際調査報告 １ｍ５−＋１ａａｅｌ　Ａｅｍｌｃｍｍ　ＮａρＣＴ／ＬｊＳ　９０１０６８４ ９ｍｍｅｌｌｍｓｌＡｍｉｅｓｌｌｍｋ　ＰＣＴＡＪＳ　９０１０６８４９１− １１ｓａｍ＆６％、２．２１１１．ｌ１ａＫＴ／ＬｊＳ９０１０６８４９Ｉ、１ ．−−＾−１−１１−１１−　ＰＣＴ／υＳ　９０／Ｑ簡４９ｒａｍ　ｔＣ＋　 、ｇａ＋１＋７　＋＋１．＝、＊＋、＋、＋、−１２硝！、、ｌ　Ｆｌｌｌ＋７ ｑ　＃、＋Ｉ１１国際調査報告

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．血小板成長因子受容体またはインスリン受容体でないリガンド結合パートナ ータンパク質および安定血漿タンパク質からなるポリペプチド融合物。
2. ２．安定血漿タンパク質が免疫グロブリン鎖であり、リガンド結合パートナータ ンパク質と免疫グロブリンがＣ−またはＮ−末端アミノまたはカルボキシル基を 通して融合している請求項１のポリペプチド。
3. ３．免疫グロブリンの定常ドメインの一部がそのＮ−末端で、該リガンド結合パ ートナーのＣ−末端に結合している請求項２のポリペプチド。
4. ４．免疫グロブリンの定常ドメインのＦｃ部分がそのＮ−末端で、該リガンド結 合パートナーのＣ−末端に結合している請求項２のポリペプチド。
5. ５．免疫グロブリン配列がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、 １ｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭから得られる請求項２のポリペプチド。
6. ６．リガンド結合パートナーがＬＨＲからなる請求項２のポリペプチド。
7. ７．リガンド結合パートナーが細胞表面接着性分子からなる請求項２のポリペプ チド。
8. ８．検出可能な標識に結合した請求項２のポリペプチド。
9. ９．該免疫グロブリン配列がヒト由来である請求項２のポリペプチド。
10. １０．該リガンド結合パートナーがヒト由来である請求項２のポリペプチド。
11. １１．定常ドメインがＩｇＧ重鎖の定常ドメインである請求項２のポリペプチド 。
12. １２．リガンド結合パートナーが、リンパ様組織の高内皮細静脈に結合するＬＨ Ｒである請求項２のポリペプチド。
13. １３．グリコシル化を伴わない請求項２のポリペプチド。
14. １４．生理学的に許容される担体中の請求項２のポリペプチド。
15. １５．担体が滅菌等張溶液である請求項１４のポリペプチド。
16. １６．担体が徐放性製剤である請求項１４のポリペプチド。
17. １７．担体がリポソームである請求項１４のポリペプチド。
18. １８．融合物中の該リガンド結合パートナータンパク質が細胞膜に係留不能であ る請求項２のポリペプチド。
19. １９．該免疫グロブリンが該結合パートナーとは異なる種に由来する請求項２の ポリペプチド。
20. ２０．リガンド結合パートナーが一本鎖である請求項２のポリペプチド。
21. ２１．リガンド結合パートナーが１本より多いポリペプチド鎖を含有し、その鎖 の１本が免疫グロブリン定常領域に融合している請求項２のポリペプチド。
22. ２２．リガンド結合パートナーの融合鎖が、その貫膜および細胞質ドメインを欠 いている請求項２１のポリペプチド。
23. ２３．該リガンド結合パートナーが細胞膜タンパク質である請求項２のポリペプ チド。
24. ２４．該リガンド結合パートナーが免疫グロブリン・スーパーファミリー構成要 素の定常領域様ドメインである請求項２のポリペプチド。
25. ２５．リガンド結合パートナーが第１リガンド結合パートナーであり、該融合物 がさらに第２リガンド結合パートナーと免疫グロブリンとの追加融合物を含む請 求項２のポリペプチド融合物。
26. ２６．第２リガンド結合パートナーが第１リガンド結合パートナーとは異なる請 求項２５のポリペプチド融合物。
27. ２７．第１リガンド結合パートナーがＬＨＲであり、第２リガンド結合パートナ ーがＣＤ４である請求項２６のポリペプチド融合物。
28. ２８．第１リガンド結合パートナー融合物と第２リガンド結合パートナー融合物 がジスルフィド結合によって架橋されている請求項２５のポリペプチド融合物。
29. ２９．第１リガンド結合パートナー融合物と第２リガンド結合パートナー融合物 が非共有結合的に会合している請求項２５のポリペプチド融合物。
30. ３０．該リガンド結合パートナーがＬＨＲ炭水化物結合ドメイン、ＬＨＲ表皮成 長因子ドメインおよびしＨＲ補体結合ドメインを有するＬＨＲであって、該ＬＨ Ｒ炭水化物結合ドメインが削除されているか、もしくは異種の炭水化物結合ドメ インによって置換されている請求項２７のポリペプチド。
31. ３１．該リガンド結合パートナーがＬＨＲ炭水化物結合ドメイン、ＬＨＲ表皮成 長因子ドメインおよびＬＨＲ補体結合ドメインを有するＬＨＲであって、該ＬＨ Ｒ表皮成長因子結合ドメインが削除されているか、もしくは異種の表皮成長因子 結合ドメインによって置換されている請求項２７のポリペプチド。
32. ３２．該リガンド結合パートナーがＬＨＲ炭水化物結合ドメイン、ＬＨＲ表皮成 長因子ドメインおよびしＨＲ補体結合ドメインを有するＬＨＲであって、該ＬＨ Ｒ補体結合ドメインが削除されているか、もしくは異種の補体結合ドメインによ って置換されている請求項２７のポリペプチド。
33. ３３．該リガンド結合パートナーがＬＨＲ炭水化物結合ドメイン、ＬＨＲ表皮成 長因子ドメイン、ＬＨＲ補体結合ドメイン、ＬＨＲ細胞質ドメインおよびＬＨＲ 貫膜ドメインを有するＬＨＲであって、該ＬＨＲ細胞質および貫膜ドメインが不 活化されている請求項２７のポリペプチド。
34. ３４．安定血漿タンパク質が、血清アルブミン、トランスフェリン、リボタンパ ク質およびアポリボタンパク質からなる群から選択される請求項１のポリペプチ ド。
35. ３５．血漿タンパク質がアルブミンである請求項３４のポリペプチド。
36. ３６．リガンド結合パートナーがＣＤ抗原である請求項１のポリペプチド。
37. ３７．リガンド結合パートナーがＬＨＲである請求項１のポリペプチド。
38. ３８．第１リガンド結合パートナーおよび安定血漿タンパク質からなるポリペプ チド融合物であって、該触合物がさらに第２リガンド結合パートナーと第２安定 血漿タンパク質の追加融合物を含有し、該第１および第２リガンド結合パートナ ーが異なる、ポリペプチド融合物。
39. ３９．免疫グロブリンでない安定血漿タンパク質およびリガンド結合パートナー からなるポリペプチド融合物。
40. ４０．一本鎖融合物からなる、リガンド結合パートナーおよび安定血漿タンパク 質からなるポリペプチド融合物。
41. ４１．第１リガンド結合パートナーおよび安定血漿タンパク質からなるポリペプ チド融合物であって、該融合物がさらに第２リガンド結合パートナーと第２安定 血漿タンパク質の追加融合物を含有し、該安定血漿タンパク質のそれぞれが免疫 グロブリン定常ドメインであるポリペプチド融合物。
42. ４２．請求項１のポリペプチドをコードする核酸。
43. ４３．請求項４２の核酸を含有する複製可能な発現ベクター。
44. ４４．請求項４３の組換え発現ベクターで形質転換した細胞からなる組成物。
45. ４５．細胞が哺乳類細胞である請求項４４の組成物。
46. ４６．細胞がチャイニーズ・ハムスターの卵巣細胞株である請求項４４の組成物 。
47. ４７．形質転換細胞を培養し、その細胞培養からポリペプチドを回収することか らなる請求項４４の細胞の培養法。
48. ４８．ポリペプチドを宿主細胞から回収する請求項４７の方法。
49. ４９．ポリペプチドが培養培地中に分泌され、その培養培地から回収される請求 項４７の方法。