ES2310047T3 - Antagonistas del receptor del factor de crecimiento epidermico para el tratamiento de la hipersecrecion de mucosidad en los pulmones. - Google Patents

Antagonistas del receptor del factor de crecimiento epidermico para el tratamiento de la hipersecrecion de mucosidad en los pulmones. Download PDF

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Abstract

Uso de un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), donde dicho antagonista de EGF-R es un inhibidor de tirosina quinasa selectivo para EGF-R, un anticuerpo que se une específicamente a un EGF-R o una molécula antisentido específica para una secuencia que codifica EGF o un EGF-R.

Description

Antagonistas del receptor del factor de crecimiento epidérmico para el tratamiento de la hipersecreción de mucosidad en los pulmones.
Campo de la invención
Esta invención se refiere al uso de antagonistas específicos del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) en la preparación de medicamentos para el tratamiento de COPD, así como a formulaciones y envases que contienen dichos antagonistas.
Antecedentes de la invención
En las vías respiratorias de conducción del sistema respiratorio, el sistema mucociliar sirve como mecanismo de defensa principal para mover las partículas inhaladas o los agentes infecciosos hacia el exterior de las vías respiratorias en los pulmones. Además, las sustancias presentes en los fluidos de las vías respiratorias sirven para limitar la toxicidad de las partículas e inactivar a los agentes infecciosos. El mecanismo físico de la tos sirve para expulsar el moco de los conductos de las vías respiratorias (véase, por ejemplo, "Foundations of Respiratory Care," Pierson and Kacmarek, eds. (1992) Churchill Livingstone Inc. New York, New York; "Harrison's Principles of Internal Medicine", Fauci et al., eds. (1997) 14ª Edición, McGraw Hill, New York, New York).
El sistema mucociliar consiste en células epiteliales ciliadas, células epiteliales caliciformes y células serosas y mucosas localizadas en glándulas submucosas. Los cilios están rodeados por una capa acuosa (líquido periciliar) secretada en la luz del conducto de la vía respiratoria por el transporte activo de cloruro y el movimiento pasivo de agua a través del epitelio. Los cilios hacen contacto con el moco que flota en esta capa acuosa y, por medio de un movimiento de propulsión unidireccional, facilitan el movimiento del moco hacia la glotis (véase Pierson y Kacmarek, supra y Fauci, et al., supra). El moco es producido por las células epiteliales caliciformes y las células de las glándulas submucosas y se secreta en la luz de la vía respiratoria después de la desgranulación.
Aunque el moco generalmente facilita la eliminación de partículas inhaladas o agentes infecciosos, la hipersecreción de moco en las vías respiratorias puede producir una obstrucción progresiva de estas vías. En las vías respiratorias periféricas, la tos no es eficaz para eliminar las secreciones. Además, debido a sus pequeñas dimensiones, las vías respiratorias pequeñas que contienen muchas células caliciformes son especialmente vulnerables a la obstrucción por el moco. La hipersecreción de las vías respiratorias afecta a un número sustancial de individuos; puede verse en diversas enfermedades pulmonares tales como bronquitis crónica, asma aguda, fibrosis quística y bronquiectasia.
La hipersecreción de moco es el síntoma principal en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y define la afección (es decir, tos crónica y producción de esputos). Esta afección sola afecta a 14 millones de americanos y puede producir una discapacidad progresiva y muerte. Se ha estimado que el asma afecta al menos al 4% de la población de Estados Unidos y es responsable de al menos 2000 muertes al año (Pierson y Kucmarek, supra). Durante un acontecimiento asmático agudo, las paredes bronquiales se hinchan, el volumen de moco aumenta y el músculo liso bronquial se contrae, dando como resultado un estrechamiento de las vías respiratorias. Como resultado de la hipersecreción en el asma aguda, la considerable obstrucción por el moco puede ser una causa principal de morbilidad y mortalidad.
La hipersecreción también se ha implicado en la fibrosis quística, que es una de las enfermedades genéticas fatales más comunes de todo el mundo. La fibrosis quística es una enfermedad recesiva autosómica que hace que las células mucosas de las vías respiratorias no respondan a la activación de proteína quinasas dependientes de AMP cíclico de los canales de ion cloruro de la membrana (Pierson y Kacmarek, supra y Fauci, et al., supra). El posterior desequilibrio de electrólitos reduce el nivel de hidratación del moco de las vías respiratorias, lo cual hace que en los pulmones de un individuo que padece fibrosis quística haya un moco muy viscoso. La hipersecreción obstruye los conductos de aire de los individuos con fibrosis quística, comprometiendo adicionalmente la función pulmonar.
Otra enfermedad que implica hipersecreción incluye el trastorno pulmonar obstructivo crónico (COPD). El estrés oxidativo juega un papel importante en la patogénesis de la COPD. El humo de los cigarrillos, que genera radicales libres de oxígeno, está muy implicado en la patogénesis. A menudo se observan neutrófilos en el sitio de la inflamación en caso de COPD y, de manea interesante, se sabe que los neutrófilos liberan radicales libres de oxígeno durante la activación.
A menudo es necesaria una intubación mecánica para proporcionar ventilación asistida a pacientes con diversas enfermedades pulmonares. Se introduce un tubo a través de la orofaringe y se pone en la tráquea. Para prevenir la fuga de aire alrededor del tubo endotraqueal, se infla un globo alrededor del tubo en la parte inferior de la tráquea, que puede erosionar el epitelio y producir metaplasia de células caliciformes. La aparición de heridas en el epitelio conduce a procesos de reparación, que pueden ocasionar una secreción abundante de moco. Esta intubación traqueal prolongada en pacientes puede conducir a efectos perjudiciales debidos a la hipersecreción.
Como resultado de los altos niveles de moco en los pulmones de pacientes con enfermedades pulmonares hipersecretoras, se reduce el aclaramiento de la mucosa ("mucosal clearance"). Ciertos agentes patológicos tales como bacterias, por ejemplo Pseudomonas aeruginosa, a menudo establecen colonias dentro del moco, dando como resultado una infección pulmonar frecuente.
Las modalidades clásicas para tratar a los individuos que padecen una hipersecreción de las vías respiratorias incluyen terapia con antibióticos, broncodilatadores (por ejemplo metilxantinas, simpatomiméticos con fuertes propiedades estimuladoras \beta2 adrenérgicas, anticolinérgicos), el uso de corticosteroides inhalados o sistémicos, principalmente en caso de asma, licuefacción del moco por administración oral de expectorantes, por ejemplo guaifenesina, y administración de aerosoles de agentes "mucolíticos", por ejemplo, agua, solución salina hipertónica (véase Harrison, supra). Una terapia más nueva para la fibrosis quística es la administración de DNAasa para dirigir al moco o esputo rico en DNA (Shak, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. (USA) 87:9188-9192; Hubbard, R.C. et al. (1991) N. Engl. J. Med. 326: 812). Además, también puede usarse una terapia física torácica consistente en percusión, vibración y drenaje para facilitar la eliminación del moco viscoso. El trasplante de pulmón puede ser una opción final para los que padecen una lesión pulmonar grave. Por lo tanto, se necesita una terapia más eficaz o alternativa para dirigirse a las secreciones mucosas. Específicamente, existe la necesidad de una modalidad específica que reduzca la formación de secreciones de moco en las vías respiratorias.
Bibliografía Relevante
El uso de inhibidores de EGF-R para bloquear el crecimiento de células cancerosas se revisa por Levitski (1994) Eur J Biochem 226(1): 1-13; Powis(1994) Pharmac. Ther. 62:57-95 Kondapaka y Reddy (1996) Mol. Cell Endocrin. 117:53-58.
Descripción resumida de la invención
La hipersecreción de moco en las vías respiratorias es un síntoma adverso de varias enfermedades pulmonares diferentes. La secreción se produce como resultado de la desgranulación de células caliciformes, cuya proliferación se promueve por la estimulación de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R). La presente invención proporciona el uso de un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad pulmonar crónica (COPD). El antagonista de EGF-R es un inhibidor de tirosina quinasa selectivo para EGF-R, un anticuerpo que se une específicamente a un EGF-R o una molécula antisentido específica para una secuencia que codifica EGF o un EGF-R.
Una ventaja de la presente invención es que proporciona un medio para prevenir una formación excesiva de moco en las vías respiratorias pulmonares.
Una característica de la invención es que puede usarse una gama de tipos diferentes de antagonistas para bloquear los efectos de EGF y/o TGF-\alpha y su interacción con EGF-R.
Estos y otros objetos, ventajas y características de la invención serán evidentes para los expertos en la materia después de leer los detalles de los métodos de tratamiento, y los métodos de ensayo in vitro e in vivo descritos con más detalle posteriormente.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A es una transferencia de Western de EGF-R en células NCI-H292 y en células A431. Figura 1B, análisis inmunocitoquímico con anticuerpo anti-EGF-R en cultivos de células NCI-H292. Figura 1C, análisis de Northern de EGF-R en células NCI-H292.
Figura 2. Tinción con azul alcián/PAS de células NCI-H292 para la identificación de glicoproteínas de mucina.
Figura 3. Análisis de Northern de la expresión del gen MUC5 en células NCI-H292.
Figura 4A y 4B. Análisis inmunohistoquímico de EGF-R con un anticuerpo anti-EGF-R en ratas libre de patógenos. Figura 4A, ratas tratadas con TNF-\alpha. Figura 4B, ratas sensibilizadas con ovoalbúmina.
La Figura 5 es un gráfico que representa el efecto de un inhibidor de tirosina quinasa de EGF-R (BIBX1522) sobre la producción de células caliciformes (expresada como el porcentaje de área teñida de epitelio de las vías respiratorias ocupado por células teñidas de forma positiva con azul alcián/PAS).
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Se proporcionan composiciones y usos para el tratamiento de la hipersecreción de moco en las vías respiratorias mediante la administración de cantidades terapéuticas de antagonistas de EGF, preferiblemente inhibidores de quinasa. Los antagonistas pueden estar en forma de moléculas pequeñas, anticuerpos o partes de anticuerpos que se unen a EGF o a su receptor. En enfermedades hipersecretoras de las vías respiratorias, por ejemplo, bronquitis crónica, bronquiectasia, fibrosis quística, asma aguda, COPD, etc., está aumentada la síntesis de mucina en las vías respiratorias y se produce hipersecreción de moco. El moco secretado produce una obstrucción en las vías respiratorias, un efecto que produce la muerte en estas enfermedades.
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En el presente documento se ha demostrado que varias causas de lesión e inflamación de las vías respiratorias inducen la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico en células epiteliales de las vías respiratorias. Después de la inducción de EGF-R, la posterior estimulación de EGF-R mediante mecanismos dependientes de ligando e independientes de ligando ocasiona la producción de mucina tanto a nivel de expresión génica como a nivel de proteína. Se ha demostrado que ciertos inhibidores selectivos de la tirosina quinasa de EGF-R bloquean esta expresión génica y de proteína de la mucina.
Sin limitar la invención, se sugiere que una secuencia evolutiva de producción de células caliciformes puede basarse en la expresión de EGF-R. La estimulación con TNF\alpha induce una tinción intensa del EGF-R de células secretoras no granuladas; su posterior activación por ligandos de EGF-R produce una tinción progresiva de glicoconjugados mucosos en el citoplasma y las células se vuelven "precaliciformes" y después "caliciformes". Los datos sugieren que la activación de EGF-R promueve la diferenciación celular selectiva, pero no la proliferación. Las células caliciformes aparentemente proceden de células secretoras no granuladas que expresan EGF-R y son estimuladas por ligandos de EGF-R para producir mucinas.
Además de la estimulación por citoquinas, el EGF-R puede ser estimulado por otros mediadores de la señalización. Por ejemplo, una exposición prolongada al humo de los cigarrillos está asociada con cambios patológicos progresivos en las vías respiratorias periféricas, incluyendo hiperplasia de las células caliciformes. Se ha demostrado que los neutrófilos activados por citoquinas proinflamatorias y el humo de los cigarrillos ocasionan la síntesis de mucina en células del epitelio bronquial humano a través de una activación independiente de ligando de EGF-R, lo que implica a los neutrófilos reclutados y al humo de los cigarrillos como reguladores de la diferenciación de células epiteliales que tiene como resultado una inducción anómala de las células productoras de mucina en las vías respiratorias. Los neutrófilos activados por una diversidad de estímulos, incluyendo IL-8, N-formil-metionil-leucil-fenilalanina, TNF-\alpha, el humo de los cigarrillos o H_{2}O_{2}, regulan positivamente la expresión de mucina en células epiteliales, inhibiéndose su síntesis por inhibidores de EGF-R. Los neutrófilos también son capaces de producir ligandos de EGF-R, EGF y TGF\alpha. Además, las células epiteliales son fuentes de ligandos de EGF-R.
Las lesiones mecánicas en el epitelio de las vías respiratorias también pueden producir hipersecreción y ser responsables de la obstrucción mucosa. Los inhibidores de la tirosina quinasa de EGF-R sirven para prevenir la hipersecreción mucosa después de una intubación traqueal.
Las lesiones epiteliales son un hallazgo común en estudios de pacientes incluso con asma leve, y la lesión está cada vez más relacionada con el empeoramiento de los síntomas clínicos. La lesión epitelial producida por la respuesta alérgica induce la activación de EGF-R, que tiene como resultado una producción anómala de células caliciformes. El EGF-R está implicado en lesiones epiteliales, por ejemplo, la "remodelación de las vías respiratorias" que se produce en el asma, la reparación y el cierre de heridas. Las lesiones epiteliales mecánicas y las lesiones epiteliales asociadas con el asma pueden implicar una cascada de EGF-R similar, dando como resultado un crecimiento anómalo de células epiteliales secretoras.
La hipersecreción también es una manifestación importante de enfermedades inflamatorias de la nariz. Cuando las células caliciformes nasales son "desafiados" mediante la inducción de la desgranulación de células caliciformes utilizando un mecanismo dependiente de neutrófilos, la expresión de EGF-R y mucinas se regula positivamente de una manera pronunciada. Estos acontecimientos se asociaron con la regranulación de las células caliciformes. Cuando una inflamación, tal como la estimulación de la infiltración de neutrófilos, produce desgranulación de células caliciformes y secreción de mucina, la regulación positiva y la activación de EGF-R vuelve a suministrar mucinas al epitelio de las vías respiratorias.
Antes de describir los usos de la presente invención debe entenderse que esta invención no se limita a los métodos y formulaciones particulares descritas, ya que éstas, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene los fines de describir realizaciones particulares y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto habitual en la materia al que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.
Definiciones
Por "factor de crecimiento epidérmico" o "EGF" se entiende una proteína o una parte de la misma que tiene actividad biológica caracterizada por una actividad mitogénica sobre las células epiteliales (por ejemplo,Cohen (1986) Biosciences Reports 6(12): 1017; Aaronson, S.A., "Growth Factors and Cancer," Science (1991) 254: 1146-1153). Es ilustrativo el factor de crecimiento epidérmico humano, por ejemplo como se describe por Urdea et al. (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. 80: 7461-7465.
Tiene un interés particular para los fines de esta invención la actividad mitogénica del EGF sobre las células caliciformes. También pretende incluirse en esta definición proteínas o partes de las mismas que son el equivalente funcional de EGF en términos de la respuesta biológica inducida por EGF.
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Por "receptor del factor de crecimiento epidérmico" o "EGF-R" se entiende una proteína o parte de la misma capaz de unirse a la proteína EGF o a una parte de la misma. Es ilustrativo el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (véase Ullrich et al. (1984) Nature 309: 418-425; número de acceso del Genbank NM_005228). Preferiblemente, la unión del ligando de EGF activa al EGF-R (por ejemplo, dando como resultado la activación de la señalización mitogénica intracelular, la autofosforilación de EGF-R). Un experto en la materia apreciará que otros ligandos, además de EGF, pueden unirse a EGF-R y activar al EGF-R. Los ejemplos de estos ligandos incluyen, pero no se limitan a, TGF-\alpha, betacelulina, anfiregulina, EGF de unión a heparina (HB-EGF) y neuregulina (también conocida como hergulina) (Strawn y Shawver (1998) Exp.-Opin. Invest Drugs 7(4)553-573, y The Protein Kinase Facts Book: Protein Tyrosine Kinases'' (1995) Hardie, et al. (eds.), Academic Press, NY, NY).
Por "antagonista de EGF-R" se entiende cualquier agente capaz de inhibir de forma directa o indirecta el efecto de EGF-R, particularmente el efecto de EGF-R sobre la proliferación de células caliciformes o la hipersecreción de moco por las células caliciformes. El EGF-R puede activarse mediante mecanismos dependientes de ligando e independientes de ligando, dando como resultado una autofosforilación o transfosforilación, respectivamente. Los antagonistas de EGF-R de interés pueden inhibir uno o ambos mecanismos. Por ejemplo, la unión de TNF-\alpha al EGF-R produce una fosforilación dependiente de ligando, que puede bloquearse por un anticuerpo que se une a EGF-R, previniendo de esta manera la interacción de EGF con un ligando que activaría al receptor de EGF. Se describen ejemplos de estos anticuerpos en Goldstein et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318; Lorimer et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 859-864; Schmidt y Wels (1996) Br. J. Cancer 74: 853-862. Los inhibidores de tirosina quinasa de molécula pequeña también son eficaces como antagonistas de EGF-R.
Como alternativa, se demuestra que compuestos tales como los radicales libres de oxígeno estimulan una transfosforilación del EGF-R, dando como resultado una activación independiente de ligando del receptor. Otros medios para activar EGF-R por transfosforilación incluyen estrés ultravioleta y osmótico, estimulación de receptores acoplados a proteínas G por endotelina-1, ácido lisofosfatídico y trombina, receptor de acetilcolina muscarínico m1 y hormona de crecimiento humana. Los antagonistas de este mecanismo independiente de ligando incluyen antioxidantes tales como superóxido dismutasa, DMSO, DMTU, ácido ascórbico y similares.
Un antagonista de EGF-R puede ser un anticuerpo que se une a un factor que estimula la producción de EGF o la producción de EGF-R, inhibiendo de esta manera la promoción de la proliferación de células caliciformes por EGF (es decir,un inhibidor de la cascada de fosforilación que fosforila EGF-R). Por ejemplo, Arteaga et al. (1995) Cancer Res. 54: 4703-4709 describen una proteína de fusión de TGF\alpha-exotoxina-40 de Pseudomonas.
En una realización preferida, el antagonista de EGF-R es un inhibidor de la actividad tirosina quinasa de EGF-R, particularmente inhibidores de molécula pequeña que tienen acción selectiva sobre EGF-R en comparación con otras tirosina quinasas - las moléculas pequeñas preferidas bloquean al receptor de EGF natural en un mamífero, preferiblemente en un ser humano, y tienen un peso molecular menor de 1 kD.
Los inhibidores de EGF y EGF-R incluyen, pero se limitan a, inhibidores de tirosina quinasa tales como quinazolinas, tales como PD 153035, 4-(3-cloroanilino)quinazolina o CP-358.774, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706 y pirazolopirimidinas (Shawn y Shawver, supra.), 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas (Traxler et al., (1996) J. Med. Chem 39: 2285-2292), curcumina (diferuloil metano) (Laxmin arayana, et al., (1995), Carcinogen 16: 1741-1745), 4,5-bis(4-fluoroanilino)ftalimida (Buchdunger et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 813-821; Dinney et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3: 161-168); tirfostinas que contienen porciones de nitrotiofeno (Brunton et al. (1996) Anti Cancer Drug Design 11: 265-295); el inhibidor de proteína quinasa ZD-1839 (AstraZeneca); CP-358774 (Pfizer, Inc.); PD-0183805 (Warner-Lambert); o como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO99/09016 (American Cyanamid); WO98/43960 (American Cyanamid); W097/38983 (Warener Labert); WO99/06378 (Warner Lambert); WO99/06396 (Warner Lambert); WO96/30347 (Pfizer, Inc.); WO96/33978 (Zeneca); WO96/33977 (Zeneca); y WO96/33980) Zeneca; o moléculas antisentido.
Por "inhibición" se entiende la reducción, neutralización, atenuación o prevención de la proliferación de células caliciformes, desgranulación de células caliciformes o hipersecreción de moco por células caliciformes.
Los términos "tratamiento", "tratar" y similares se usan en este documento para hacer referencia en general a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una curación parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en este documento, incluye cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un ser humano e incluye:
(a) la prevención de la aparición de la enfermedad o síntoma en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero al que aún no se le ha diagnosticado;
(b) la inhibición de la enfermedad o síntoma, es decir,detención de su desarrollo; o
(c) el alivio de la enfermedad o síntoma, es decir, regresión de la enfermedad o síntoma. La invención se refiere al tratamiento de pacientes con una enfermedad pulmonar o de las vías respiratorias y se dirige particularmente al tratamiento de la hipersecreción de moco en pacientes, es decir,la prevención, inhibición o alivio de la hipersecreción de moco. En términos del tratamiento de síntomas, la invención se refiere a la reducción del moco o esputo en las vías respiratorias, la inhibición de la infección por organismos patológicos, el alivio de la tos y la prevención de hipoxia debido a una obstrucción de las vías respiratorias.
Más específicamente, se entiende que "tratamiento" significa proporcionar un efecto beneficioso y terapéuticamente detectable a un paciente que padece una enfermedad pulmonar que implica hipersecreción de moco.
Aun más específicamente, "tratamiento" hará referencia a la prevención, alivio y/o inhibición de la hipersecreción de moco con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en antagonistas de EGF y/o EGF-R tales como anticuerpos, inhibidores de proteína tirosina quinasas y moléculas antisentido y similares. Un tratamiento alternativo puede comprender la prevención de la expresión de EGF-R en las vías respiratorias, bloqueando de esta manera la ruta en una fase anterior. Por ejemplo, los reactivos que bloquean la unión de TNF\alpha a su receptor pueden prevenir la regulación positiva de EGF-R.
El tratamiento incluye la prevención o inhibición de infecciones por agentes patológicos causadas por y/o relacionadas con la hipersecreción de moco.
Por "anticuerpo" se entiende una proteína inmunoglobulina que es capaz de unirse a un antígeno. Se entiende que anticuerpo, como se usa en este documento, incluye fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, F(ab')2, Fab', Fab, capaces de unirse al antígeno o a un fragmento antigénico de interés. Preferiblemente, la unión del anticuerpo al antígeno inhibe la actividad de EGF o EGF-R.
La expresión "anticuerpo humanizado" se usa en este documento para describir moléculas de anticuerpo completas, es decir,compuestas de dos cadenas ligeras completas y dos cadenas pesadas completas, así como anticuerpos que consisten únicamente en fragmentos de anticuerpo, por ejemplo,Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, donde las CDR proceden de una fuente no humana y la parte restante de la molécula Ig o su fragmento procede de un anticuerpo humano, preferiblemente producido a partir de una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo humano.
Las expresiones "anticuerpo humano" y "anticuerpo humanizado" se usan en el presente documento para describir un anticuerpo del cual todas las partes de la molécula de anticuerpo proceden de una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo humano. Dichos anticuerpos humanos son los más deseables para uso en terapias de anticuerpo, ya que estos anticuerpos inducirían una respuesta inmunológica pequeña o nula en el paciente humano.
La expresión "anticuerpo quimérico" se usa en el presente documento para describir una molécula de anticuerpo, así como fragmentos de anticuerpo, como se ha descrito anteriormente en la definición de la expresión "anticuerpo humanizado." La expresión "anticuerpo quimérico" incluye anticuerpos humanizados. Los anticuerpos quiméricos tienen al menos una parte de una secuencia de aminoácidos de cadena pesada o ligera procedente de una primera especie de mamífero y otra parte de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada o ligera procedente de una segunda especie de mamífero diferente. Preferiblemente, la región variable procede de una especie de mamífero no humano y la región constante procede de una especie humana. Específicamente, el anticuerpo quimérico se produce preferiblemente a partir de una secuencia de nucleótidos de un mamífero no humano que codifica una región variable y una secuencia de nucleótidos de un humano que codifica una región constante de un anticuerpo.
Por "se une específicamente" se entiende una alta avidez y/o alta afinidad de unión de un anticuerpo a un polipéptido específico. La unión de un anticuerpo a su epítopo en un polipéptido específico es más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a cualquier otro epítopo, particularmente los que puedan estar presentes en moléculas en asociación con, o en la misma muestra, que el polipéptido específico de interés. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de interés pueden ser capaces de unirse a otros polipéptidos a un nivel débil, aunque detectable, por ejemplo, del 10% o menor de la unión mostrada con el polipéptido de interés. Esta unión débil, o unión de fondo, se puede distinguir fácilmente de la unión específica del anticuerpo al compuesto o polipéptido de interés, por ejemplo, por medio del uso de controles apropiados.
Por "anticuerpo marcado de manera detectable", "anti-EGF marcado de manera detectable" o "fragmento de anti-EGF marcado de manera detectable" se entiende un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo que retiene la especificidad de unión), que tiene un marcador detectable unido. El marcador detectable normalmente se une por conjugación química, pero cuando el marcador es un polipéptido, como alternativa podría unirse por técnicas de ingeniería genética. En el estado de la técnica son bien conocidos métodos para la producción de proteínas marcadas de forma detectable. Los marcadores detectables pueden seleccionarse entre una diversidad de marcadores conocidos en el estado de la técnica, pero normalmente son radioisótopos, fluoróforos, enzimas, por ejemplo peroxidasa de rábano picante u otras porciones o compuestos que emiten una señal detectable (por ejemplo, radiactividad, fluorescencia, color) o emiten una señal detectable después de la exposición del marcador a su sustrato. En el estado de la técnica se conocen bien diversos pares de marcador detectable/sustrato (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante/diaminobencidina, avidina/estreptavidina, luciferasa/luciferina), métodos para marcar anticuerpos y métodos para usar anticuerpos marcados para detectar un antígeno (por ejemplo, véase Harlow and Lane, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Métodos terapéuticos
La presente invención proporciona el uso de un antagonista de EGF-R para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de COPD. El antagonista de EGF-R es un inhibidor de tirosina quinasa selectivo para EGF-R, un anticuerpo que se une específicamente a EGF-R o una molécula antisentido específica para una secuencia que codifica EGF o un EGF-R. Los ejemplos de enfermedades pulmonares caracterizadas por hipersecreción de moco o acumulación de niveles patológicos de moco incluyen, pero no se limitan a, enfermedades pulmonares obstructivas crónicas tales como bronquitis crónica, enfermedades inflamatorias tales como asma, bronquiectasia, fibrosis pulmonar, COPD, enfermedades de hipersecreción nasal, por ejemplo, alergias nasales y otras enfermedades hipersecretoras. También pretende incluirse enfermedades genéticas tales como fibrosis quística, síndrome de Kartagener, deficiencia en alfa-1-antitripsina, engrosamiento de moco del tracto respiratorio en fibrosis quística no familiar.
Se prefieren antagonistas que se dirigen directamente a EGF o EGF-R. Sin embargo, un experto en la materia apreciará que la diana para la inhibición puede ser cualquier factor o célula implicada en la cascada biológica que tiene como resultado la promoción por EGF-R de la proliferación de células caliciformes, por ejemplo, antagonistas de TGF-\alpha. Sin limitarse por la teoría, empieza una cascada durante una respuesta inflamatoria cuando células tales como los mastocitos o los neutrófilos liberan TNF-\alpha, que después promueve la expresión de EGF-R. La estimulación de EGF-R, por ejemplo, por su ligando EGF, a su vez dispara la proliferación de células caliciformes. De esta manera, cualquier célula o factor implicado en la cascada, tal como en la ruta del TNF-\alpha, puede ser la diana para la actividad antagonista.
El antagonista de EGF-R administrado en el método terapéutico puede estar en cualquier forma. A modo de ejemplo, el antagonista de EGF-R puede estar en forma de una molécula pequeña (es decir, oligonucleótido antisentido, inhibidor de tirosina quinasa, etc.), anticuerpos o partes de anticuerpos que se unen a EGF, TGF\alpha o EGF-R.
Antagonistas de EGF-R de molécula pequeña
En el estado de la técnica se conocen inhibidores de tirosina quinasa que actúan sobre el receptor de EGF y que son selectivos para el EGF-R y pueden usarse en los presentes métodos. Anteriormente se han descrito ejemplos y éstos pueden incluir BIBX1522 (Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, Germany); CGP59326B (Novartis Corporation, Basilea, Switzerland); inhibidores de EGF-R de 4-amino-quinazolina (descritos en la patente US Nº 5.760.041); compuestos de estireno sustituidos que también pueden ser un naftaleno, un indano o una benzoxazina; incluyendo compuestos de nitrilo y molononitrilo (descritos en la patente US Nº 5.217.999); los inhibidores descritos en la patente US Nº 5.773.476; inhibidor de carboxipeptidasa de patata (PCI), un inhibidor de proteasa de 39 aminoácidos con tres enlaces disulfuro, (Blanco-Aparicio et al. (1998) J Biol Chem 273(20): 12370-12377); el antagonista de bombesina RC-3095 (Szepeshazi et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 10913-10918) etc. Otros inhibidores de tirosina quinasa incluyen quinazolinas tales como PD 153035, 4-(3-cloroanilino)quinazolina o CP-358.774, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706 y pirazolopirimidinas (Shawn y Shawver, supra.), 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d] pirimidinas (Traxler et al. (1996) J. Med. Chem 39: 2285-2292), curcumina (Korutla et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1224: 597-600); (Laxmin arayana (1995), Carcinogen 16: 1741-1745); etc.
Los inhibidores tirosina quinasa preferidos son selectivos para el receptor de EGF, es decir, el EGF-R se inhibe en una mayor medida que otros receptores de la superficie celular que tienen actividad tirosina quinasa. La selectividad es incrementada mediante los métodos de formulación y administración de fármaco, por ejemplo, cuando el inhibidor se administra preferentemente en vías respiratorias inflamadas, etc.
Las dosificaciones típicas para la administración sistémica varían de 0,1 \mug a 100 miligramos por kg de peso del sujeto por administración. Los expertos apreciarán fácilmente que los niveles de dosificación pueden variar en función del compuesto específico, la gravedad de los síntomas y la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Algunos de los compuestos específicos son más potentes que otros. Las dosificaciones preferidas para un compuesto dado pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la materia mediante una diversidad de medios. Un medio preferido es medir la potencia fisiológica de un compuesto dado, por ejemplo, con los ensayos in vitro e in vivo descritos en este documento.
Anticuerpos como antagonistas de EGF-R
Tienen un interés especial como antagonistas de EGF-R los anticuerpos (por ejemplo, Viloria, et al., American Journal of Pathology 151: 1523). Los anticuerpos contra EGF o EGF-R se producen por inmunización de un hospedador mamífero inmunocompetente xenogénico, incluyendo animales de los grupos murino, rodentia, lagomorpha, ovino, porcino, bovino, etc. con EGF o EGF-R o partes de los mismos. Preferiblemente se usan como inmunógeno EGF o EGF-R humano o partes de los mismos. La elección de un hospedador particular es principalmente de conveniencia. Las inmunizaciones se realizan de acuerdo con técnicas convencionales donde el inmunógeno puede inyectarse por vía subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravascular, etc. en el animal hospedador. Normalmente, se usará como inmunógeno de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de EGF o EGF-R por vía intraperitoneal un día sí y otro no. Las inyecciones pueden ser con o sin adyuvante, por ejemplo, adyuvante completo o incompleto de Freund, especol, alumbre, etc. Después de completar el programa de inmunización, el antisuero puede recoger-
se de acuerdo con formas convencionales para proporcionar un antisuero policlonal específico para EGF o el EGF-R.
A partir del animal inmunizado se producen anticuerpos monoclonales o policlonales, preferiblemente anticuerpos monoclonales. Los antisueros policlonales pueden recogerse a partir del suero de los animales por métodos convencionales después de completar el programa de inmunización. Para la producción de anticuerpos monoclonales, se recogen linfocitos del tejido linfoide apropiado, por ejemplo, bazo, ganglios linfáticos de drenaje, etc. y se fusionan con una molécula de fusión apropiada, normalmente una línea de mieloma, produciendo un hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal específico. La selección de clones de hibridomas para la especificidad antigénica de interés se realiza de acuerdo con métodos convencionales.
Son de un interés particular anticuerpos, preferiblemente anticuerpos monoclonales, que se unen a EGF-R o EGF para inhibir la unión de EGF a EGF-R, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de EGF-R impidiendo de esta manera la unión a EGF. Estos anticuerpos pueden obtenerse por la metodología convencional descrita anteriormente o están disponibles en el mercado. Los ejemplos de anticuerpo que funcionarían como un antagonista de EGF incluyen, pero no se limitan a, el anticuerpo monoclonal de neutralización anti-EGF-R C225 (Kawamoto et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80: 1337-1341; Petit et al. (1997) J. Path. 151: 1523-153, producido por ImClone Systems New York, NY) y el anticuerpo monoclonal anti-EGF-R EMD55900 (también denominado Mab 425), (Merck, Darmstadt, Germany).
Los presentes anticuerpos pueden producirse como una sola cadena en lugar de la estructura multimérica normal. Se describen anticuerpos monocatenarios en Jost et al. (1994) J.B.C. 269: 26267-73, y otros. Se unen secuencias de DNA que codifican la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera a un espaciador que codifica al menos aproximadamente 4 aminoácidos neutros pequeños, incluyendo glicina y/o serina. La proteína codificada por esta fusión permite el montaje de una región variable funcional que conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo original.
En el estado de la técnica se conocen métodos para humanizar anticuerpos. El anticuerpo humanizado puede ser el producto de un animal que tiene genes de la región constante de inmunoglobulina humana transgénica (véanse, por ejemplo, las Solicitudes de Patente Internacional WO 90/10077 y WO 90/04036). Como alternativa, el anticuerpo de interés puede modificarse por ingeniería genética mediante técnicas de DNA recombinante para sustituir las regiones CH1, CH2, CH3, dominios bisagra y/o los residuos flanqueantes con la correspondiente secuencia humana (véase el documento WO 92/02190).
En el estado de la técnica también se conoce el uso de CDNA de Ig para la construcción de genes de inmunoglobulina quimérica (Liu et al. (1987) P.N.A.S. 84: 3439 y (1987) J. Immunol. 139: 3521). Se aísla ARNm a partir de un hibridoma u otra célula que produzca el anticuerpo y se usa para producir CDNA. El CDNA de interés puede amplificarse por la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos (patentes US Nº 4.683.195 y 4.683.202). Como alternativa, se prepara una biblioteca y se explora para aislar la secuencia de interés. La secuencia de DNA que codifica la región variable del anticuerpo se fusiona, a continuación, con secuencias de región constante. Las secuencias de genes de regiones constantes humanas pueden encontrarse en Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Nº de Publicación N.I.H. 91-3242. Se pueden adquirir fácilmente genes de la región C humana
a partir de clones conocidos. Después se expresa el anticuerpo quimérico humanizado por métodos convencionales.
Los fragmentos de anticuerpo tales como Fv, F(ab')_{2} y Fab pueden prepararse por escisión de la proteína intacta, por ejemplo por escisión con proteasa o química. Como alternativa, se diseña un gen truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una parte del fragmento F(ab')_{2} incluiría secuencias de DNA que codifican el dominio CH1 y la región bisagra de la cadena H, seguido de un codón de terminación de la traducción para producir la molécula truncada.
A un individuo que tiene una enfermedad de hipersecreción de moco se le pueden administrar inicialmente cantidades de antagonista de EGF-R en el intervalo de aproximadamente 20 miligramos (mg) a aproximadamente 400 mg por kilogramo de peso corporal del paciente dos veces al día, por ejemplo, por inhalación.
Moléculas antisentido como antagonistas de EGF-R
En otra realización, los agentes terapéuticos de la presente invención son moléculas antisentido específicas para secuencias humanas que codifican EGF o EGF-R. El agente terapéutico administrado puede ser un oligonucleótidos antisentido, particularmente oligonucleótidos sintéticos que tienen modificaciones químicas de ácidos nucleicos nativos, o construcciones de ácido nucleico que expresan dichas moléculas antisentido como RNA. La secuencia antisentido es complementaria al ARNm de los genes de EGF o EGF-R diana e inhibe la expresión de los productos génicos diana (véase, por ejemplo, Nyce et al. (1997) Nature 385: 720). Las moléculas antisentido inhiben la expresión génica reduciendo la cantidad de ARNm disponible para la traducción, a través de la activación de RNasa H o impedimento estérico. Puede administrarse una o una combinación de moléculas antisentido, donde la combinación puede comprender múltiples secuencias diferentes de un solo gen diana, o secuencias que complementan varios genes diferentes.
Un gen diana preferido es EGF-R o EGF. Puede accederse a la secuencia del gen por medio de bases de datos publicas (factor de crecimiento epidérmico humano, número de acceso del Genbank K01166; ARNm humano para el precursor del receptor del factor de crecimiento epidérmico, número de acceso del Genbank X00588). En general, la secuencia antisentido tendrá la misma especie de origen que el hospedador animal.
Pueden producirse moléculas antisentido por expresión de todo o parte de la secuencia del gen diana en un vector apropiado, introduciéndose y expresándose el vector en las células diana. El inicio de la transcripción se orientará de tal forma que la cadena antisentido se produzca como una molécula de RNA. El RNA antisentido hibrida con el ARNm de cadena sentido endógeno, bloqueando de esta manera la expresión del gen diana. Puede emplearse la región de iniciación de la transcripción nativa, o una región de iniciación de la transcripción exógena. El promotor puede introducirse por métodos recombinantes in vitro, o como el resultado de integración homóloga de la secuencia en un cromosoma. En el estado de la técnica se conocen muchos promotores fuertes que son activos en células musculares, incluyendo el promotor de la \beta-actina, el promotor temprano y tardío de SV40, el promotor de citomegalovirus humano, LTR retrovirales, etc.
Los vectores de transcripción generalmente tienen sitios de restricción convenientes localizados cerca de la secuencia del promotor para proporcionar la inserción de secuencias de ácido nucleico. Pueden prepararse casetes de transcripción que comprenden una región de iniciación de la transcripción, el gen diana o un fragmento del mismo, y una región de terminación de la transcripción. Los casetes de transcripción pueden introducirse en una diversidad de vectores, por ejemplo, plásmidos; retrovirus, por ejemplo, lentivirus; adenovirus; y similares, donde los vectores pueden mantenerse de forma transitoria o estable en las células, normalmente durante un periodo de al menos aproximadamente un día, más habitualmente durante un periodo de al menos aproximadamente varios días.
Como alternativa, en una realización preferida, la molécula antisentido es un oligonucleótido sintético. Los oligonucleótidos antisentido generalmente tendrán de aproximadamente 7 a 500, normalmente de aproximadamente 12 a 50 nucleótidos y más habitualmente de aproximadamente 20 a 35 nucleótidos, estando determinada la longitud por la eficacia de inhibición, especificidad, incluyendo ausencia de reactividad cruzada, y similares. Se ha descubierto que los oligonucleótidos cortos, de 7 a 8 bases de longitud, pueden ser inhibidores fuertes y selectivos de la expresión génica (véase Wagner et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 840-844).
Una región o regiones específicas de la secuencia de ARNm endógena de cadena con sentido se elige para que sea complementaria a la secuencia antisentido. Se ha demostrado que la región 5' del ARNm es particularmente susceptible a la inhibición antisentido. Sin embargo, pruebas recientes indican que el análisis de la estructura secundaria del ARNm puede ser importante en la accesibilidad de sitios para la inhibición. La selección de una secuencia específica para el oligonucleótido puede usar un método empírico, donde se evalúan varias secuencias candidatas por la inhibición de la expresión del gen diana en un modelo animal o in vitro. También puede usarse una combinación de secuencias, donde varias regiones de la secuencia de ARNm se seleccionan para la complementación antisentido.
Los oligonucleótidos antisentido pueden sintetizarse químicamente por métodos conocidos en el estado de la técnica (véase, Wagner et al. (1993) supra, y Milligan et al., supra). Los oligonucleótidos preferidos se modifican químicamente a partir de la estructura fosfodiéster nativa para aumentar su estabilidad intracelular y su afinidad de unión. En la bibliografía se han descrito varias de estas modificaciones, que alteran la química del esqueleto, azúcares o bases heterocíclicas.
Los oligonucleótidos además pueden comprender una porción de dirección que aumenta la captación de la molécula por las células. La porción de dirección es una molécula de unión específica, por ejemplo un anticuerpo o un fragmento del mismo que reconoce las moléculas presentes en la superficie de células epiteliales de pulmón, particularmente células epiteliales que contienen EGF-R.
En el estado de la técnica se conocen anticuerpos biespecíficos, anticuerpos quiméricos y anticuerpos monocatenarios. Los anticuerpos no humanos preparados de forma adecuada pueden humanizarse de varias maneras. La unión entre el oligonucleótido y la porción de dirección puede usar cualquier método convencional, por ejemplo mediante enlaces disulfuro, amida o tioéter, dependiendo de la química del esqueleto del oligonucleótido. Preferiblemente, la unión se escindirá dentro de la célula para liberar el oligonucleótido.
Los oligonucleótidos pueden conjugarse con residuos hidrófobos, por ejemplo colesterol, para protegerlos de nucleasas y mejorar el transporte a través de las membranas celulares. Como alternativa, la conjugación con poli-L-lisina u otras poliaminas también puede aumentar la liberación en la célula. Otra modificación que puede realizarse es la adición de un componente intercalante, tal como acridina, capaz de intercalarse en el ARNm diana y estabilizar el híbrido resultante. Los oligonucleótidos antisentido pueden utilizarse para transfección en combinación con una o más enzimas que degradarán los complejos de ARNm antisentido en la célula, por ejemplo, la RNasa-H. De forma similar, puede ser útil cualquier proteína o enzima que degrade o forme complejos preferentemente con el dúplex de antisentido-ARNm.
Como alternativa a los inhibidores antisentido, pueden usarse compuestos de ácido nucleico catalíticos, por ejemplo ribozimas, conjugados antisentido etc. para inhibir la expresión génica. Las ribozimas pueden sintetizarse in vitro y administrarse al paciente o pueden codificarse en un vector de expresión, a partir del cual se sintetiza la ribozima en la célula diana (por ejemplo, véase la Solicitud de Patente Internacional WO 9523225, y Beigelman et al. (1995) Nucl. Acids Res 23: 4434-42). Se describen ejemplos de oligonucleótidos con actividad catalítica en el documento WO 9506764. Se describen conjugados de oligonucleótidos antisentido con un complejo metálico, por ejemplo, terpiridilCu(II), capaz de mediar la hidrólisis de ARNm, en Bashkin et al. (1995) Appl Biochem Biotechnol 54: 43-56.
Formulaciones farmacéuticas
Los antagonistas de EGF-R pueden proporcionarse en solución o en cualquier otra forma farmacológicamente adecuada para la administración, tal como un suspensión de liposomas. Los anticuerpos apropiados u otra forma de anti-EGF se formulan para administración de la manera habitual para la administración de dichos materiales. Son formulaciones típicas las proporcionadas en Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición, Mack Publishing Company, Easton, PA. La vía de administración se seleccionará basándose en el compuesto a administrar, el estado del paciente y la enfermedad que se está tratando. Cuando hay hipersecreción de moco, un compuesto puede administrarse por diferentes vías dependiendo de la gravedad de la enfermedad, por ejemplo, las situaciones de urgencia pueden requerir la administración i.v., una situación aguda, pero que no ponga en peligro la vida, puede tratarse por vía oral, mientras que el tratamiento crónico puede administrarse mediante un aerosol.
Para uso terapéutico en enfermedades nasales y de las vías respiratorias, se prefiere la administración local. La administración por inhalación o insuflación de aerosoles proporciona concentraciones de alto nivel de fármaco en comparación con la concentración absorbida sistémicamente. Como alternativa, el antagonista de EGF puede administrarse por inyección, incluyendo inyección intramuscular, intravenosa (IV), subcutánea o peritoneal, más preferiblemente inyección IV y local. Sin embargo, también pueden usarse otros modos de administración siempre que estén disponibles medios que permitan que el antagonista de EGF-R entre en la circulación sistémica, tales como formulaciones transmucosas o transdérmicas que pueden aplicarse como supositorios, parches cutáneos o por vía intranasal. Puede usarse de manera apropiada cualquier formulación adecuada que efectúe la transferencia del antagonista de EGF-R a la corriente sanguínea o localmente a los pulmones.
Para inyección, las formulaciones adecuadas generalmente comprenden soluciones o suspensiones acuosas que usan solución salina fisiológica, solución de Hank u otros tampones, incluyendo opcionalmente agentes estabilizantes u otros componentes minoritarios. También pueden usarse preparaciones liposomales y otras formas de microemulsiones. El antagonista de EGF-R también puede suministrarse en forma liofilizada y reconstituirse para la administración. Las administraciones transmucosas y transdérmicas generalmente incluyen agentes que facilitan el paso a través de la barrera mucosa o dérmica, tales como agentes de penetración, sales, ácido fusídico y sus análogos, diversos detergentes y similares. También es posible la administración oral, siempre que se formulen recubrimientos entéricos adecuados para permitir que el antagonista de EGF-R sobreviva en el tracto digestivo.
La naturaleza de la formulación dependerá en alguna medida de la naturaleza del antagonista de EGF-R elegido. Una formulación adecuada se prepara usando técnicas conocidas y principios de formulación bien conocidos para los expertos en la materia. El porcentaje de antagonistas de EGF-R contenido en una composición farmacéutica particular también dependerá de la naturaleza de la formulación; el porcentaje de un antagonista de EGF-R que es un anticuerpo variará típicamente en un amplio intervalo de aproximadamente un 1% en peso a aproximadamente un 85% en
peso.
Hay muchos métodos de administración conocidos en la técnica para mejorar la captación de ácidos nucleicos por las células. Los sistemas de administración útiles incluyen sistemas de administración de liposomas-virus Sendai (Rapaport y Shai (1994) J. Biol. Chem. 269: 15124-15131), liposomas catiónicos, geles o matrices de liberación polimérica, catéteres de globo porosos (como los descritos por Shi et al. (1994) Circulation 90: 955-951; y Shi et al. (1994) Gene Therapy 1: 408-414), vectores de expresión de retrovirus y similares.
El uso de liposomas como vehículo de administración es un método de interés para uso con antagonistas de EGF-R. Los liposomas se fusionan con las células del sitio diana y administran el contenido de la luz intracelularmente. Los liposomas se mantienen en contacto con las células durante un tiempo suficiente para la fusión, usando diversos medios para mantener el contacto, tales como aislamiento, agentes de unión y similares. Los liposomas pueden prepararse con proteínas o péptidos purificados que median la fusión de membranas, tales como el virus Sendai o el virus de la influenza, etc. Los lípidos pueden ser cualquier combinación útil de lípidos formadores de liposomas conocidos, incluyendo lípidos catiónicos tales como fosfatidilcolina. El lípido que queda normalmente será un lípido neutro, tal como colesterol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol y similares. Para preparar los liposomas, puede usarse el procedimiento descrito por Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 3361.
En una realización preferida, el antagonista de EGF-R se encapsula en liposomas "furtivos" ("stealth") estabilizados estéricamente, por ejemplo, liposomas pegilados. Cuando estos liposomas se inyectan i.v., permanecen en circulación durante largos periodos. Las uniones de huecos venulares post-capilares se abren durante la inflamación de las vías respiratorias y permiten la acumulación de fluido dejando que ciertas moléculas, por ejemplo el complemento, quininógeno, entre en los tejidos iniciando cascadas inflamatorias. Esta inflamación permite depositar los liposomas y su contenido selectivamente en el tejido inflamado (Zhang et al. (1998) Farm Res 15: 455-460).
Los antagonistas de EGF-R pueden administrarse al paciente afectado por medio de un sistema de administración farmacéutica para la vía de inhalación. Los compuestos pueden formularse en una forma adecuada para la administración por inhalación. El sistema de administración farmacéutico es uno que es adecuado para la terapia respiratoria por administración tópica de antagonistas de EGF-R a los revestimientos mucosos de los bronquios. Esta invención puede utilizar un sistema que depende de la capacidad de un gas comprimido de expulsar a los antagonistas de EGF-R desde un recipiente. Para este fin puede emplearse un aerosol o envase presurizado.
Como se usa en este documento, el término "aerosol" se usa en su sentido convencional para hacer referencia a partículas sólidas o líquidas muy finas transportadas por un gas propulsor a presión hasta un sitio de aplicación terapéutica. Cuando se emplea un aerosol farmacéutico en esta invención, el aerosol contiene el compuesto terapéuticamente activo, que puede disolverse, suspenderse o emulsionarse en una mezcla de un vehículo fluido y un propulsor. El aerosol puede estar en forma de una solución, suspensión, emulsión, polvo o preparación semisólida. Los aerosoles empleados en la presente invención están destinados para la administración como partículas sólidas finas o como nieblas líquidas a través del tracto respiratorio de un paciente. Pueden utilizarse diversos tipos de propulsores conocidos para un experto en la materia. Los ejemplos de propulsores adecuados incluyen, pero no se limitan a, hidrocarburos u otro gas adecuado. En el caso del aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida.
La presente invención también puede llevarse a cabo con un nebulizador, que es un instrumento que genera partículas líquidas muy finas de un tamaño sustancialmente uniforme en un gas. Preferiblemente, un líquido que contiene los antagonistas de EGF-R se dispersa como gotitas. Las gotitas pequeñas pueden llevarse por una corriente de aire a través de un tubo de salida del nebulizador. La niebla resultante penetra en el tracto respiratorio del paciente.
Una composición en polvo que contiene antagonistas de EGF-R o análogos de los mismos, con o sin un lubricante, vehículo o propulsor, puede administrarse a un mamífero que necesite terapia. Esta realización de la invención puede realizarse con un dispositivo convencional para administrar una composición farmacéutica en polvo por inhalación. Por ejemplo, una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón puede presentarse en formas de dosificación unitarias, por ejemplo, en cápsulas o cartuchos, por ejemplo, de gelatina o blísteres, a partir de los cuales el polvo puede administrarse con la ayuda de un inhalador.
Pueden usarse terapias de combinación para tratar enfermedades pulmonares hipersecretoras. En particular, pueden combinarse antagonistas de EGF-R con el tratamiento convencional para el alivio de la hipersecreción, tales como broncodilatadores, corticosteroides, expectorantes, agentes mucolíticos y similares para facilitar la eliminación mucociliar.
Dependiendo del estado del paciente, puede ser preferible administrar una formulación de la presente invención por inyección (por ejemplo, intravenosa) o por inhalación. Los pacientes que tienen grandes cantidades de moco en los pulmones, en general, no pueden tratarse inicialmente por inhalación. Esto se debe al hecho de que los pulmones de los pacientes están obstruidos suficientemente como para que la inhalación de la formulación aerosolizada en los pulmones no pueda ser particularmente eficaz. Sin embargo, después del tratamiento por inyección o, como alternativa, para el mantenimiento a largo plazo o en situaciones en las que los pulmones de los pacientes no están obstruidos de forma severa, se prefiere la administración por inhalación. La administración por inhalación se prefiere porque pueden administrarse dosis más pequeñas localmente a las células específicas que están más necesitadas de tratamiento. Por medio de la administración de dosis más pequeñas, se eliminan o se reducen sustancialmente los efectos secundarios adversos. Por medio de la administración directamente a las células que necesitan más el tratamiento, el efecto del tratamiento se conseguirá más rápidamente.
Hay varios tipos diferentes de metodologías de inhalación que pueden emplearse en relación con la presente invención. Los antagonistas de la presente invención pueden formularse básicamente en tres tipos diferentes de formulaciones para inhalación. En primer lugar, los antagonistas de la invención pueden formularse con propulsores de bajo punto de fusión. Estas formulaciones generalmente se administran por inhaladores dosificadores (MDI) convencionales. Sin embargo, los MDI convencionales pueden modificarse para aumentar la capacidad de obtener una dosificación repetible utilizando una tecnología que mide el volumen de inspiración y el caudal del paciente como se describe en las patentes US 5.404.871 y 5.542.410.
Como alternativa, los antagonistas de la presente invención pueden formularse en soluciones acuosas o etanólicas y administrarse por nebulizadores convencionales. Sin embargo, más preferiblemente, estas formulaciones en solución se aerosolizan usando dispositivos y sistemas tales como los descritos en las patentes US 5.497.763; 5.544.646; 5.718.222; y 5.660.166.
Por último, los compuestos antagonistas de la presente invención pueden formularse en formulaciones en polvo seco. Estas formulaciones pueden administrarse simplemente inhalando la formulación en polvo seco después de crear una niebla de aerosol del polvo. La tecnología para realizar esto se describe en la patente US 5.775.320 expedida el 7 de julio de 1998 y en la patente US 5.740.794 expedida el 21 de abril de 1998.
Con respecto a cada una de las patentes mencionadas anteriormente, los solicitantes indican que estas patentes citan otras publicaciones en la administración de fármacos por vía intrapulmonar y puede hacerse referencia a estas publicaciones en relación con la metodología específica, dispositivos y formulaciones que podrían usarse en relación con la administración de antagonistas de la presente invención.
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Ensayos de selección Fármacos Candidatos
Pueden usarse ensayos de selección para identificar agentes candidatos bioactivos que sean antagonistas de EGF. Son de un interés particular los ensayos de selección de agentes que tienen una baja toxicidad para las células humanas. Para este fin puede usarse una amplia diversidad de ensayos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína in vitro marcadas, ensayos de cambio de movilidad electroforética, inmunoensayos para la unión de proteínas y similares. La proteína EGF o EGF-R purificada también puede usarse para la determinación de la estructura cristalina tridimensional, que puede usarse para la creación de modelos de interacciones intermoleculares, función del transportador, etc.
El término "agente", como se usa en este documento, describe cualquier molécula, por ejemplo proteína o agente farmacéutico, con la capacidad de alterar o inhibir la función fisiológica de EGF o EGF-R. En general, una pluralidad de mezclas de ensayo se procesan en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como control negativo, es decir, a concentración cero o inferior al nivel de detección.
Los agentes candidatos incluyen numerosas clases químicas, aunque típicamente son moléculas orgánicas, preferiblemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular mayor de 50 y menor de aproximadamente 2.500 daltons. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente la formación de enlaces de hidrógeno, y típicamente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos a menudo comprenden estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. También se encuentran agentes candidatos entre biomoléculas que incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.
Los agentes candidatos se obtienen a partir de una amplia diversidad de fuentes que incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, se dispone de numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia diversidad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorios. Como alternativa, se dispone de bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales o se producen fácilmente. Además, las bibliotecas y compuestos producidos de forma natural o sintética son modificados fácilmente por medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y pueden usarse para producir bibliotecas combinatorias. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc., para producir análogos estructurales.
Cuando el ensayo de selección es un ensayo de unión, una o más de las moléculas pueden unirse a un marcador, pudiendo proporcionar el marcador de forma directa o indirecta una señal detectable. Diversos marcadores incluyen radioisótopos, fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimas, moléculas de unión específicas, partículas, por ejemplo partículas magnéticas y similares. Las moléculas de unión específica incluyen parejas, tales como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina, etc. Para los miembros de unión específica, el miembro complementario normalmente estaría marcado con una molécula que proporciona la detección, de acuerdo con procedimientos conocidos.
En el ensayo de selección se pueden incluir una diversidad de reactivos distintos. Estos incluyen reactivos tales como sales, proteínas neutras, por ejemplo albúmina, detergentes, etc. que se usan para facilitar la unión óptima proteína-proteína y/o reducir las interacciones no específicas o de fondo. Pueden usarse reactivos que mejoran la eficacia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes anti-microbianos, etc. La mezcla de componentes se añade en cualquier orden que proporcione la unión requerida. Las incubaciones se realizan a cualquier temperatura adecuada, típicamente entre 4 y 40ºC. Los periodos de incubación se seleccionan para una actividad óptima, pero también pueden optimizarse para facilitar una selección rápida de alto rendimiento. Típicamente, será suficiente un periodo comprendido entre 0,1 y 1 horas.
Los compuestos que tienen la actividad farmacológica deseada pueden administrarse en un vehículo fisiológicamente aceptable a un hospedador para el tratamiento de enfermedades hipersecretoras en formulaciones descritas en este documento. Dependiendo de la forma de introducción, los compuestos pueden formularse en una diversidad de formas descritas en este documento. La concentración de compuesto terapéuticamente activo en la formulación puede variar de aproximadamente 0,1-100% en peso.
Régimen de Dosificación
El nivel de dosificación apropiado también variará dependiendo de varios factores que incluyen la naturaleza del sujeto a tratar, la naturaleza particular de la afección de hipersecreción a tratar y su gravedad, la naturaleza del antagonista de EFGR usado como ingrediente activo, el modo de administración, la formulación y el criterio del médico. Por ejemplo, cuando se administran los propios anticuerpos, tales como anticuerpos anti-EGF o anti-EGF-R en una formulación inyectable, las dosificaciones estarán en el intervalo de 20 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg a una sola dosificación. Puede requerirse una administración repetida durante un periodo de días o la administración por medios intravenosos puede ser continua. Para afecciones crónicas, la administración puede continuarse durante periodos más largos cuando sea necesario.
La eficacia del régimen de dosificación se determinará evaluando la mejora de la función pulmonar en el paciente. Esta evaluación puede incluir mediciones viscoelásticas de esputos, mejoras de la función pulmonar, incluyendo mejoras en el volumen exploratorio forzado del esputo y flujo máximo a la mitad de la espiración. El régimen terapéutico mencionado anteriormente puede administrarse junto con terapias auxiliares tales como antibióticos, DNAasa I u otras terapias actuales para el tratamiento de la enfermedad pulmonar hipersecretora. Si los antibióticos se coadministran como parte de la terapia del paciente, puede incluirse una cuantificación bacteriana después de la terapia para evaluar la eficacia del tratamiento por reducción del crecimiento bacteriano, indicando una menor viscosidad del moco o esputo y un aumento de la eliminación pulmonar del moco o esputo.
Los ensayos de la función pulmonar, así como los ensayos de diagnóstico para la progresión clínica de la enfermedad hipersecretora pulmonar son conocidos por los individuos con experiencia en este campo. Los ensayos de la función pulmonar convencionales incluyen resistencia de las vías respiratorias (AR); capacidad vital forzada (FVC); volumen espiratorio forzado en 1 segundo (FEV(1)); flujo forzado en la mitad de la espiración; y caudal espiratorio máximo (PEFR). Otros ensayos de la función pulmonar incluyen análisis de los gases sanguíneos; respuestas a la medicación; pruebas de provocación y ejercicio; mediciones de la resistencia de músculo respiratorio; examen fibro-óptico de las vías respiratorias; y similares. Algunos procedimientos básicos para estudiar las propiedades del moco incluyen reología, por ejemplo, con el uso de un micro-reómetro magnético; adhesividad para caracterizar las fuerzas de atracción entre una superficie adherente y un sistema adhesivo midiendo el ángulo de contacto entre una gota de moco y una superficie. El transporte del moco por los cilios puede estudiarse usando técnicas convencionales, así como medición directa, es decir, eliminación del moco in situ. La diferencia de potencial trans-epitelial, el resultado neto de la actividad del sistema de transporte iónico del epitelio pulmonar, puede medirse usando microelectrodos apropiados. Pueden usarse métodos cuantitativos de morfología para caracterizar el estado de la superficie epitelial.
El paciente a tratar pueden ser un primate, tal como un ser humano, o cualquier otro animal que presente los síntomas descritos. Aunque el método de la invención está especialmente adaptado para el tratamiento de un paciente humano, se entenderá que la invención también es aplicable a la práctica veterinaria.
Ensayo de Selección In Vitro
Los ensayos in vitro se usan para evaluar el potencial terapéutico de agentes candidatos para inhibir la proliferación de células caliciformes, es decir, si estos agentes son activos como un antagonista de EGF. Generalmente, estos ensayos comprenderán las siguientes etapas: (i) poner en contacto un modelo in vitro de la proliferación de células caliciformes con EGF o su equivalente funcional; (ii) posteriormente poner en contacto el modelo in vitro con un agente candidato; y (iii) evaluar la proliferación de las células caliciformes, donde una inhibición de la proliferación de las células caliciformes es indicativa del potencial terapéutico del agente candidato.
El ensayo preferiblemente se realiza con dos controles donde un segundo grupo de células no está en contacto con ningún compuesto y un tercer grupo está en contacto con EGF pero no con el agente candidato. Después se realizan comparaciones para determinar el grado de efecto de EGF y el agente candidato sobre las células.
Puede usarse cualquier modelo in vitro de proliferación de células caliciformes. A modo de ejemplo, pueden aislarse células traqueales de rata y mantenerse en cultivo según se describe en Guzman et al. (1995) 217:412-419. Brevemente, las células traqueales de ratas se cultivan en placas sobre membranas semipermeables recubiertas con gel de colágeno, inicialmente se cultivan sumergidas en medio y posteriormente se mantienen con una interfaz aire/líquido. Ejemplos de células in vitro incluyen células bronquiales humanas primarias (disponibles en Clonetics, San Diego); células NCI-H292 (ATCC CRL-1848); y células A431 (ATCC CRL-1555).
El cultivo in vitro se pone en contacto con EGF y con un agente candidato. El agente candidato puede ponerse en contacto con el cultivo antes, junto con o posteriormente a la adición del EGF, dependiendo del criterio de valoración a evaluar y la naturaleza del agente candidato. Las células cultivadas se evalúan con respecto a la inhibición de la proliferación de células caliciformes en comparación con los controles.
Para evaluar la proliferación de las células caliciformes pueden usarse diversos marcadores moleculares o bioquímicos. Ejemplos de marcadores moleculares o bioquímicos que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, expresión génica o expresión de proteínas característica de las células caliciformes. Ciertos genes de mucina, por ejemplo, MUC5B (Desseyn et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:3168-3178) se expresan en la vía respiratoria y tienen un producto génico muy representado en el moco. La expresión de genes de mucina proporciona un marcador adecuado para determinar la producción de moco.
La expresión del gen de mucina puede evaluarse mediante tecnología convencional tal como análisis de transferencia de Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), examen del promotor del gen de mucina o análisis in situ. Como alternativa, las proteínas de mucina se evalúan mediante metodología convencional tal como análisis de transferencia de Western, ELISA, inmunoquímica y similares, usando anticuerpos marcados de manera detectable. También pueden usarse criterios morfológicos para determinar la presencia o ausencia de células caliciformes en el cultivo; tales como tinción para mucinas usando tinción con azul alcián/PAS (Lou et al. (1998) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:1927-1934). Los anticuerpos contra las mucinas pueden examinarse usando ensayos ELISA. Debido a la estimulación de EGF-R por un ligando, por ejemplo, EGF, TGF-\alpha, induce la fosforilación de una quinasa específica del receptor de EGF y tiene como resultado la producción de células caliciformes, y la fosforilación de EGF-R puede medirse como un reflejo de la inducción de las células caliciformes (Donato et. al. (1984) J. Biol. Chem. 264:20474-20481).
Una reducción en los marcadores moleculares o bioquímicos asociada con la proliferación de las células caliciformes indica una posibilidad terapéutica del antagonista.
Modelos In vivo
Se usan modelos animales in vivo para evaluar el potencial terapéutico de agentes candidatos para inhibir la proliferación de células caliciformes. Generalmente, el ensayo comprende las etapas de: (i) crear un modelo animal de enfermedad pulmonar hipersecretora induciendo la expresión de EGF-R; (ii) estimular el EGF-R inducido para producir células caliciformes productoras de mucina; (iii) tratar con un agente candidato; y (iv) evaluar la proliferación de las células caliciformes o la secreción de moco, donde una inhibición de la proliferación de las células caliciformes o de la secreción de moco indica el potencial terapéutico del agente candidato.
Puede usarse cualquier modelo in vivo de enfermedad pulmonar hipersecretora. A modo de ejemplo, un modelo de ratón asmático, como se describe en Temann et al. (1997) Am. J. Respir. Cell. Biol. 16:471-478, y como se muestra en los ejemplos proporcionados en este documento. Como alternativa, puede usarse un modelo de rata, como se describe por Takeyama et al. (1998) Am. J. Physiol. Ejemplos de otros modelos animales que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, cobayas (una especie que expresa las células caliciformes constitutivamente) y ratas.
El tejido pulmonar o el tejido traqueal de los modelos animales puede evaluarse por los mismos marcadores moleculares y bioquímicos descritos para el modelo in vitro. Una reducción en la proliferación de las células caliciformes indica el potencial terapéutico del antagonista de EGF-R.
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la materia una descripción completa y un análisis de cómo realizar y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden indicar que los experimentos mostrados a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deberían tener en cuenta algún error y desviación experimental. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular medio ponderado, la temperatura está en grados centígrados, y la presión es la presión atmosférica o una presión próxima a
esta.
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Parte experimental Ejemplo 1 El sistema de EGF Regula la Producción de Mucina en las Vías Respiratorias
Se produce hiperplasia de células caliciformes en diversas enfermedades hipersecretoras de las vías respiratorias, pero como se desconocen los mecanismos subyacentes, no existe una terapia eficaz. En las vías respiratorias sanas hay pocas células caliciformes, pero en las enfermedades hipersecretoras de las vías respiratorias se produce una hiperplasia de células caliciformes. Se estudió una línea celular bronquial humana (NCI-H292). Estas células expresan EGF-R constitutivamente; la expresión del gen de EGF-R se estimuló adicionalmente por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha). Los ligandos de EGF-R aumentaron la síntesis de mucinas y este efecto se aumento por co-incubación con TNF\alpha.
Las células epiteliales de las vías respiratorias de ratas libres de patógenos expresaban poca proteína EGF-R, pero la instilación intratraqueal de TNF\alpha (200 ng) indujo EGF-R en las células basales, precaliciformes y caliciformes, pero no en las células ciliadas; el TNF\alpha, EGF o TGF\alpha por sí solos no indujeron la producción de células caliciformes. Sin embargo, la instilación de TNF\alpha seguida de ligandos de EGF-R produjo un aumento del número de células caliciformes y precaliciformes y un aumento sorprendente en la tinción positiva con azul alcián/PAS (que refleja glicoconjugados mucosos) y la expresión del gen MUC5 de mucina. En ratas sensibilizadas, la ovalbúmina ocasionó la producción de células caliciformes y la expresión de EGF-R en el epitelio de las vías respiratorias. En células NCI-H292, en ratas estimuladas por TNF\alpha seguido de ligandos de EGF-R, y en el modelo de asma en ratas, el pretratamiento con el inhibidor tirosina quinasa de EGF-R (BIBX1522) impidió la producción de células caliciformes en las vías respiratorias. Estos descubrimientos demuestran un papel para los inhibidores de la cascada de EGF-R en enfermedades hipersecretoras de las vías respiratorias.
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Métodos Estudios in vitro
Cultivo Celular. Una línea celular de carcinoma mucoepidermoide pulmonar humano, células NCI-H292, se cultivó en medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) a 37ºC en un incubador humidificado con un 5% de CO_{2} con una camisa de agua. Cuando llegaron a la confluencia, las células se incubaron con EGF (EGF humano recombinante, 25 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA), TGF\alpha (TGF\alpha humano recombinante, 25 ng/ml, Genzyme), TNF\alpha (TNF\alpha humano recombinante, 20 ng/ml, Genzyme), EGF (25 ng/ml) más TNF\alpha (20 ng/ml) o TGF\alpha (25 ng/ml) más TNF\alpha (20 ng/ml) durante 12 horas, 24 horas o 48 horas. En estudios de inhibición con un inhibidor tirosina quinasa de EGF-R, BIBX1522 (10 \mug/ml, proporcionado generosamente por Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Germany), las células se pretrataron con BIBX1522 30 minutos antes de añadir factores de crecimiento. Después de la incubación, se usaron células cultivadas en un matraz T-75 para la extracción de RNA total o la extracción de proteína, y se usaron portaobjetos de 8 cámaras para la tinción con azul alcián/PAS para visualizar las mucinas.
Transferencia de Western. Se lisaron células cultivadas en matraces T-75 y se rasparon con PBS que contenía Triton X al 1%, desoxicolato sódico al 1% y PMSF (10 mg/ml). La cantidad total de proteína se estimó por el reactivo de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). Los lisados celulares se hirvieron con tampón de muestra Tricine y \betaME al 2% a 95ºC. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE en geles de acrilamida al 8%. Los geles resultantes se equilibraron en el tampón de transferencia: Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM, metanol al 20% (vol/vol), pH 8,3. Las proteínas después se transfirieron electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa. Las membranas después se incubaron durante 1 h en leche desnatada al 5% en PBS que contenía Tween 20 al 0,05%. Después, las membranas se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-EGF-R (1:100) a 4ºC durante una noche. El anticuerpo unido se visualizó de acuerdo con los protocolos convencionales para el método de complejo de avidina-biotina-fosfatasa alcalina (kit ABC, Vector Laboratories). Como control positivo para EGF-R se usaron lisados celulares de células A431 (20).
Localización inmunocitoquímica de EGF-R en células NCI-H292. Se fijaron células cultivadas en portaobjetos de 8 cámaras con paraformaldehído al 4% durante 1 hora. Para teñir el EGF-R, se usó PBS que contenía Tween 20 al 0,05%, un 2% de suero de cabra normal y levamisol 2 mM como diluyente para el anticuerpo. Las secciones se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón contra EGF-R (1:250) durante una noche a 4ºC, y después se lavaron 3 veces con PBS para retirar el exceso de anticuerpo primario. Después, las células se incubaron con inmunoglobulina de caballo anti-ratón biotinilada (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a una dilución 1:200 durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo unido se visualizó de acuerdo con protocolos convencionales para el método de complejo de avidina-biotina-fosfatasa alcalina (kit ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Sondas. La expresión de ARNm de EGF-R se determinó usando la plantilla sonda pTRI-EGF-R-humana linealizada (Ambion, Austin, TX). Esta sonda contiene un fragmento de cDNA de 360 pb del gen de EGF-R humano, que incluye los exones 12-14. La expresión de gen de MUC5 se determinó usando la sonda MUC5AC humana, que contiene un fragmento de cDNA de 298 pb del gen de MUC5AC humano (proporcionado generosamente por Dr. Carol Basbaum).
Transferencia de Northern. Se extrajo RNA total a partir de células NCI-H292 cultivadas en un matraz de cultivo de tejidos T-75 usando Tri-Reagent (Molecular Research Ctr, Cincinnati, OH) en cada condición. El RNA total (10 \mug) se sometió a electroforesis en un gel de agarosa/formaldehído al 1% y se transfirió a una membrana de nylon (Amersham, Arlington Heights, IL) por transferencia capilar. Las sondas se marcaron con ^{32}P usando el kit de marcaje de DNA cebado aleatorio (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN). Las transferencias se prehibridaron a 42ºC durante 4 horas y después se hibridaron a 42ºC durante 16 horas con una sonda de cDNA específica marcada con ^{32}P. La solución de hibridación contenía Tris-HCl 250 mM (pH 7,5), SDS al 5%, BSA al 1%, polivinil-pirrolidona al 1%, Ficoll al 1%, y pirofosfato sódico al 0,5%. Después de la hibridación, las membranas se lavaron dos veces con SSC 2x con SDS al 0,1% durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en SSC 2x con SDS al 0,1% durante 30 minutos a 50ºC y un aclarado en SSC 0,1x con SDS al 0,1%. Las membranas se expusieron a una película de rayos X.
Estudios in vivo
El protocolo animal experimental se aprobó por el Comité de Investigación Animal, Universidad de California, San Francisco. Se mantuvieron ratas Fisher F344 macho libre de patógenos específicos, que pesaban 230-250 g (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA), en una sala de temperatura controlada (21ºC) con acceso libre a pienso de laboratorio convencional y a agua.
Ratas sanas. Las ratas se anestesiaron con metohexital sódico (Brevital sódico, 50 mg/kg, i.p.; Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN) y se permitió que respiraran espontáneamente. Para determinar si el TNF\alpha regula positivamente al EGF-R en las vías respiratorias, se instiló TNF\alpha (200 ng, 100 \mul) en la tráquea y los animales se sacrificaron 24 horas después. Para examinar si el EGF o el TGF\alpha induce a las células caliciformes en el epitelio de las vías respiratorias, se instiló EGF (600 ng, 100 \mul) o TGF\alpha (TGF\alpha sintético de rata, 250 ng, 100 \mul; Sigma, St Louis, Ml) en la tráquea solo o 24 horas después de la instilación de TNF\alpha (200 ng, 100 \mul), y los animales se sacrificaron 48 horas después. En cada estudio, se instiló PBS estéril (100 \mul) en la tráquea como control. Para confirmar si tenía lugar producción de mucina por medio de la activación de EGF-R, se examinó el efecto de un inhibidor de tirosina quinasa de EGF-R, BIBX1522 (dosis estimada a partir de estudios que usan el inhibidor para prevenir el crecimiento de cánceres). Las ratas se pretrataron con BIBX1522 (3, 10 ó 30 mg/kg, i.p.), 1 hora antes y 24 horas después de la instilación de TGF\alpha. La tráquea y los pulmones se extrajeron para su examen 48 horas después de la instilación de TGF\alpha.
Ratas sensibilizadas
Sensibilización. Se sensibilizaron ratas los días 0 y 10 con inyecciones intraperitoneales de ovalbúmina (10 mg, calidad V; Sigma, St. Louis, MO), acomplejada con 100 mg de hidróxido de aluminio en 0,5 ml de solución salina estéril. Después, las ratas se dejaron en reposo durante 10 días. El día 20, se administró ovalbúmina directamente en la tráquea; los animales se expusieron a 100 \mul de ovalbúmina al 0,1% en solución salina por instilación intratraqueal tres veces (días 20, 22 y 24). Las ratas se sacrificaron sin exposición (día 20), o 48 horas después de la tercera exposición (día 26). Este procedimiento indujo metaplasia de células caliciformes. Para bloquear la hiperplasia de células caliciformes, las ratas sensibilizadas se pretrataron con un inhibidor de tirosina quinasa de EGF-R, BIBX1522. Los días de la exposición a ovalbúmina (días 20, 22 y 24), las ratas sensibilizadas se pretrataron con BIBX1522 (10 mg/kg, i.p., 1 hora antes de la exposición) y después también se instiló BIBX1522 en la tráquea junto con ovalbúmina (BIBX1522, 10^{-5} M, 100 \mul). También se inyectó BIBX1522 i.p. cada 24 horas hasta el día antes de sacrificar a las ratas. Después de sacrificar a los animales, las tráqueas se extrajeron 48 horas después de la tercera
exposición.
Preparación de tejidos. A tiempos preseleccionados durante la anestesia, se perfundió en la circulación sistémica paraformaldehído al 1% en PBS tratada con DEPC a una presión de 120 mmHg. Después se extrajo la tráquea y se puso en paraformaldehído al 4% durante 24 horas. Después de la fijación, la tráquea y los pulmones se sumergieron en JB-4 más solución de monómero A para el análisis de las células o compuesto O.C.T. (Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, CA) para la inmunohistoquímica e hibridación in situ. Los tejidos sumergidos se cortaron en secciones transversales (de 4 mm de espesor) y se pusieron en portaobjetos.
Análisis de las células. Contamos el número total de células epiteliales contando los núcleos de células epiteliales en 2 mm de la lámina basal con una lente de objetivo de inmersión de aceite (1000 aumentos). La longitud lineal de la lámina basal debajo de cada región analizada de epitelio se determinó trazando el contorno de la imagen digitalizada de la lámina basal. Después de la instilación del estímulo, se forman células caliciformes "en desarrollo". Estas células tienen gránulos positivos para la tinción con azul alcián/PAS, pero el tamaño de los gránulos es pequeño y el número de gránulos citoplásmicos es bajo. Denominamos estas células caliciformes "en desarrollo" como "células precaliciformes", una fase previa a que las células se conviertan en células caliciformes maduras. Las células caliciformes son altas, cuboidales, con forma de copa a columna baja, con abundantes gránulos teñidos con azul alcián/PAS que rellenan la mayor parte del citoplasma entre el núcleo y la superficie luminar. Las células precaliciformes se definen como células con áreas teñidas de mucosidad más pequeñas (< 1/3 de altura en el epitelio desde la membrana basal a la superficie luminal) o con gránulos pequeños ligeramente teñidos con azul alcián/PAS de forma dispersa. Las células ciliadas se reconocen por sus bordes ciliados, citoplasma ligeramente teñido y núcleos grandes y redondos. Las células secretoras no granuladas tienen forma de columna y se extienden desde la luz hasta la lámina basal. El citoplasma se tiñe de un color rosa claro y se observan unos pocos gránulos negativos para el azul alcián y positivos para PAS en el citoplasma. Las células basales son células pequeñas y aplanadas con núcleos grandes, localizadas justo por encima de la lámina basal pero que no alcanzan la luz de la vía respiratoria.
Cuantificación de la producción de células caliciformes. La producción de células caliciformes se determinó por la densidad de volumen de sustancias mucosas teñidas con azul alcián/PAS en el epitelio de la superficie mucosa usando un sistema de formación de imágenes semiautomático descrito en otras partes (Weber et al. (1984) Science 224:294-297). Se midió el área de tinción positiva con azul alcián/PAS y el área epitelial total y los datos se expresaron como porcentaje del área total teñida con azul alcián-PAS. El análisis se realizó con el programa NIH Image de dominio público (creado en el U.S. National Institute of Health y disponible en Internet por FTP anónimo en zippy.nimh.gov o en disco flexible en el National Technical Information Service, Springfield, VA, parte número PB95-500195GEI).
Localización inmunohistoquímica de EGF-R en epitelio de rata. La localización de EGF-R se examinó usando tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo contra EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA) en secciones congeladas de tráquea de rata. Después de la perfusión con paraformaldehído al 1% en PBS, los tejidos se pusieron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 1 hora y después se extrajeron en sacarosa al 30% para crioprotección durante una noche. Las tráqueas se sumergieron en compuesto O.C.T. (Sakura Finetek U.S.A. Inc., Torrance, CA) y se congelaron. Se cortaron secciones congeladas (5 \mum) y se pusieron en portaobjetos de vidrio (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). La inmunotinción se realizó de forma similar a los estudios in vitro.
Preparación de la sonda. El cDNA de MUC5 de rata fue proporcionada generosamente por el Dr. Carol Basbaum. Un fragmento de CDNA de 320 pb de MUC5 de rata se subclonó en los sitios Xba/HindIII del vector de transcripción, pBluescript-SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA). Para preparar sondas de RNA para la hibridación in situ, este plásmido recombinante que contenía el fragmento de cDNA de MUC5 de rata se linealizó y se transcribió in vitro con la polimerasa T7 o T3 para obtener una sonda antisentido o sentido, respectivamente. Las sondas para la hibridación in situ se generaron en presencia de [^{35}S]UTP. Después de la transcripción, la plantilla de cDNA se digirió con DNAasa y el RNA radiomarcado se purificó a través de una columna Sephadex G-25 Quick SpinTM (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y se precipitó en una solución de etanol/acetato amónico. Antes del uso, las sondas de RNA se lavaron con etanol al 70% y se diluyeron en DTT 10 mM.
Hibridación In Situ. Se cortaron secciones congeladas (5 \mum) y se pusieron en portaobjetos de vidrio cargados positivamente (Superfrost Plus, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA,). Se usaron secciones cortadas muy próximas para la hibridación con sondas sentido y antisentido. Se usaron secciones alternas para tinción con azul alcián/PAS. Los especimenes se volvieron a fijar en paraformaldehído al 4%, se rehidrataron en SSC 0,5x y después se acetilaron en trietanolamina con anhídrido acético. La hibridación se realizó con 2500-3000 cpm/\mul de sonda antisentido o sentido a 55ºC en formamida desionizada al 50%, NaCl 0,3 M, Tris 20 mM, EDTA 5 mM, solución de Denhardt 1x, ditiotreitol 20 mM, sulfato de dextrano al 10%, 0,5 mg/ml de tRNA de levadura y 0,5 mg/ml de DNA de esperma de salmón sonicado durante una noche. El tratamiento posterior a la hibridación consistió en lavados con SSC 2x, EDTA 1 mM y \beta-mercaptoetanol 10 mM a temperatura ambiente, incubación con solución de RNasa (20 mg/ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente y lavados adicionales en SSC 0,1x, EDTA 1 mM y \beta-mercaptoetanol 10 mM a 55ºC durante 2 horas y después en SSC 0,5x a temperatura ambiente. Las muestras se deshidrataron, se secaron al aire y se cubrieron con emulsión de rastreo nuclear NBT Kodak (Eastman Kodak, Rochester, NY) para la auto-radiografía. Después de la exposición durante 7 a 21 días a 4ºC, los portaobjetos se revelaron, se fijaron y se tiñeron con el colorante de contraste hematoxilina (21).
Estadística. Todos los datos se expresan como media \pm SEM. Se usó un análisis de varianza de una vía para determinar las diferencias estadísticamente significativas entre grupos. Se usó el test F de Scheffe para corregir las comparaciones múltiples cuando se identificaron significados estadísticos en el análisis de varianza. Se aceptó una probabilidad menor de 0,05 para la hipótesis nula que indica una diferencia estadísticamente significativa.
Resultados
El TNF\alpha Estimula la Producción de EGF-R en células NCI-H292. En primer lugar se determinó si las células NCI-H292 expresan EGF-R constitutivamente. El análisis de western de inmunotransferencias identificó la presencia de proteína EGF-R en cultivos confluentes de células NCI-H292 (Figura 1A, derecha). Las células se examinaron después de alcanzar la confluencia. Los lisados se sometieron a electroforesis en gel de acrilamida al 8% y se transfirieron con anticuerpo anti-EGF-R. A la derecha se presentan los pesos moleculares de las proteínas marcadoras. Un control positivo para EGF-R fue la proteína procedente de células A431 (Figura 1A, izquierda), que expresan EGF-R constitutivamente (Weber et. al., supra.). Estudios inmunocitoquímicos con un anticuerpo anti-EGF-R revelaron tinción positiva, más notable en las células en división (Fig. 1B, análisis inmunocitoquímico con anticuerpo anti-EGF-R en cultivos de células NCI-H292). Cuando alcanzaron la confluencia, se observó tinción positiva, más claramente en las células en división (flechas, lado derecho). En ausencia del anticuerpo primario no hubo tinción (lado izquierdo). La transferencia de Northern demostró que el TNF\alpha (20 ng/ml) regulaba positivamente la expresión del gen de EGF-R, un efecto que estaba presente a las 12 horas y aumentaba a las 24 horas (Fig. 1C, análisis de Northern de EGF-R en células NCI-H292). Se realizó un análisis sobre el RNA total extraído de cultivos confluentes incubados con TNF\alpha (20 ng/\mul) durante 12 o 24 horas. El RNA se sometió a electroforesis en gel de formaldehído-agarosa, se transfirió a una membrana de nylon y se hibridó con la sonda de cDNA- EGF-R marcada con ^{32}P. Después de la hibridación, la membrana se lavó y se autorradiografió.
Los Ligandos de EGF-R Estimulan la Expresión de Glicoconjugados Mucosos y la Expresión del Gen de MUC5 en Células NCI-H292. EGF-R se expresa constitutivamente en células NCI-H292, de forma que se evaluó la capacidad de ligandos de EGF-R (EGF, TGF\alpha) para inducir la producción de glicoconjugados mucosos (Figura 2, columna superior, tinción con azul alcián/PAS de células NCI-H292 para la identificación de glicoproteínas de mucina). Columna superior = incubación de las células sin inhibidor; columna inferior = incubación en presencia del inhibidor de tirosina quinasa de EGF-R BIBX1522 (10 \mug/ml). Cuando las células se incubaron solas (control), se observó algo de tinción positiva para PAS (flechas, columna superior); la incubación con TNF\alpha (20 ng/ml) solo no afectó a la tinción; la incubación con EGF (25 ng/ml) o con TGF\alpha (25 ng/ml) aumentaba la tinción positiva para PAS (flechas); la incubación con TNF\alpha más TGF\alpha aumentó notablemente la tinción (flecha, columna superior).
Algunas células de control mostraron tinción; la incubación con TNF\alpha (20 ng/ml) solo no afectó a la tinción; la incubación con EGF o con TGF\alpha (cada uno a 25 ng/ml) aumentó la tinción positiva para PAS (flechas); la incubación con TNF\alpha más TGF\alpha aumentó la tinción mucho más que cualquier ligando solo. De esta manera, los ligandos de EGF-R inducen glicoconjugados mucosos en células NCI-H292.
Para examinar la expresión del gen de MUC5, se realizó transferencia de Northern (Figura 3). Se extrajo RNA total (10 \mug) a partir de las células, se sometió a electroforesis en un gel de agarosa-formaldehído, se transfirió a una membrana de nylon y se hibridó con la sonda de cDNA de MUC5 marcada con ^{32}P. Después de la hibridación, la membrana se lavó y se autorradiografió. Se obtuvieron cultivos con medio solo (C), EGF o TGF\alpha (25 ng/ml), TNF\alpha (20 ng/ml), o la combinación de TNF\alpha más EGF o TGF\alpha durante 12 (columna superior) o 24 horas (columna inferior) en la expresión del gen de MUC5. También se obtuvieron cultivos con TNF\alpha más EGF- o TGFa después de la preincubación con inhibidor de tirosina quinasa de EGF-R (BIBX1522; 10 \mug/ml; columna inferior); el inhibidor impidió la expresión del gen de MUC5.
Las células NCI-H292 mostraron alguna expresión en el estado de control (Figura 3, columna izquierda inferior); cuando las células se incubaron con EGF o TGF\alpha, la expresión del gen de MUC5 apenas se reconoció a las 12 horas, pero se expresó claramente a las 24 horas. El TNF\alpha solo no afectó a la expresión del gen de MUC5, pero cuando se añadía TNF\alpha a las células incubadas con ligandos de EGF-R, la expresión del gen de MUC5 aumentaba notablemente por encima del nivel causado por el ligando de EGF-R solo (Figura 3).
El Inhibidor de Tirosina Quinasa de EGF-R (BIBX1522) Previene la Expresión de Glicoconjugados Mucosos y de MUC5 en Células NCI-H292. Para ensayar la hipótesis de que la activación de receptores EGF-R induce la expresión del gen de MUC5, se incubaron células con un inhibidor de tirosina quinasa EGF-R BIBX1522. Cuando las células NCI-H292 se pretrataron con BIBX1522 (10 \mug/ml), se inhibió la tinción positiva para PAS en el estado de control, y se inhibió notablemente el aumento de tinción que se produjo con los ligandos de EGF-R (Figura 2, columna inferior). En el análisis de Northern, la expresión del gen de MUC5 que aumentaba notablemente por la combinación de TNF\alpha más EGF o más TGF\alpha se inhibía completamente por medio de la preincubación con BIBX1522 (Figura 3, columna inferior). Estos resultados implican la activación de EGF-R en la inducción del gen de mucina y glicoproteínas mucosas en células NCI-H292.
TNF\alpha Estimula la Producción de EGF-R en Ratas. Se estudiaron ratas libres de patógenos (que tienen pocas células caliciformes en el epitelio de las vías respiratorias de forma constitutiva), empezando con el papel del TNF\alpha. En el estado de control, el epitelio traqueal contenía pocas células positivas para EGF-R (Figura 4A, izquierda). Sin embargo, la instilación intratraqueal de TNF\alpha (200 ng) indujo a la proteína EGF-R en diversos tipos celulares en el epitelio traqueal (Figura 4A, derecha). La tinción positiva para EGF-R estaba presente en células caliciformes (G), células precaliciformes (P-G), células secretoras no granuladas (S) y células basales (Ba), pero no en células ciliadas. De esta manera, el TNF\alpha induce la producción de proteína EGF-R.
Papel de Ligandos de EGF-R en la Producción de Glicoconjugados Mucosos y Expresión del Gen de MUC5 en Ratas. En el estado de control, el epitelio traqueal contenía pocas células caliciformes y precaliciformes. La instilación intratraqueal de ligandos de EGF-R, EGF (600 ng; no mostrado) o TGF\alpha (250 ng; Tabla 1) solos no tuvo ningún efecto sobre la producción epitelial de glicoconjugados mucosos. Sin embargo, cuando se administró primero TNF\alpha (200 ng), seguido en 24 horas por EGF o TGF\alpha (Tabla 1), y los animales se sacrificaron 48 horas después, la tinción con azul alcián/PAS aumentó notablemente y también aumentó notablemente el número de células caliciformes y precaliciformes, sin un cambio en el número total de células o en el número de células ciliadas (Tabla 1). La hibridación in situ para el gen de MUC5 no mostró expresión en los animales de control. Cuando se instiló por vía intratraqueal TNF\alpha, seguido de EGF o TGF\alpha, la expresión de MUC5 fue visible en el epitelio. De esta manera, la inducción de EGF-R solo o la estimulación por ligandos de EGF-R solos fue insuficiente para inducir la metaplasia de células caliciformes o la producción de glicoconjugados mucosos. Sin embargo, después de la inducción de EGF-R por TNF\alpha, la instilación de ligandos de EGF-R estimuló la metaplasia de células caliciformes notablemente.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Análisis de Células en Epitelio Traqueal
1
La sensibilización con Ovalbúmina en Ratas Induce a EGF-R y la Producción de Células Caliciformes. Como la muerte por asma aguda, según se conoce, se debe a una obstrucción de las vías respiratorias por moco, se produjo un modelo de asma en ratas libres de patógenos. Las inyecciones de ovalbúmina (10 mg, ip) los días 0 y 10 no estimulaban hiperplasia de las células caliciformes (Tabla 1). Sin embargo, cuando se continuaba por tres instilaciones intratraqueales (i.t.) de ovalbúmina (0,1% en 100 \mul) los días 20, 22, y 24, y los animales se sacrificaban el día 26, los números de células caliciformes y precaliciformes aumentaban notablemente; los números de células ciliadas y basales permanecieron sin cambios (Tabla 1, lado derecho). Los estudios inmunohistoquímicos con un anticuerpo anti-EGF-R no mostraron tinción en las tráqueas de control. Los animales sensibilizados tanto i.p. como i.t. mostraron tinción de EGF-R (Figura 4B, izquierda) selectivamente en las células que teñían positivamente con AB/PAS (Figura 4B, derecha). Después de tres instilaciones intratraqueales de ovoalbúmina (0,1%, 100 ml), se expresó fuertemente inmunorreactividad de EGF-R en células caliciformes y precaliciformes (izquierda inferior), las mismas células que se tiñeron positivamente con azul alcián/PAS (derecha inferior). De esta manera, un modelo de ovoalbúmina de asma mostró proliferación de células caliciformes en células que producían EGF-R.
El Inhibidor de Tirosina Quinasa de EGF-R (BIBX1522) Previene la Producción de Células Caliciformes Inducida por Instilación de TNF\alpha Más Ligandos de EGF-R y por Sensibilización con Ovalbúmina en Ratas. Como BIBX1522 prevenía la producción de mucina en cultivos celulares, se examinó el efecto de este inhibidor en ratas libres de patógenos. La tinción con azul alcián/PAS que aumentaba por instilación traqueal de TNF\alpha seguido del ligando de EGF-R, TGF\alpha, se inhibía de una forma dependiente de la dosis por medio del pretratamiento con BIBX1522 (3-30 mg/kg, ip; Figura 5A). La instilación traqueal de TNF\alpha (para inducir EGF-R), seguida del ligando de EGF-R TGF\alpha, produjo una notable metaplasia de células caliciformes.
En ratas sensibilizadas con ovoalbúmina, el pretratamiento con BIBX1522 (10 mg/kg, ip) inhibía la producción de células caliciformes completamente (evaluado por tinción con azul alcián/PAS; Figura. 5B). Los animales que recibieron ovalbúmina i.p. sólo mostraron una pequeña tinción positiva de AB/PAS en el epitelio bronquial. Los animales primero sensibilizados con OVA i.p., seguido de tres instilaciones intratraqueales (i.t.) de OVA, mostraron un notable aumento en la tinción positiva por AB/PAS.
Estos estudios indican que EGF-R, cuando se estimula por ligandos de EGF-R, induce la producción de células caliciformes in vitro e in vivo, efectos debidos a la activación de EGF-R y que se bloqueaban con un inhibidor de tirosina quinasa de EGF-R. En un modelo de ovalbúmina de asma, el inhibidor también era eficaz en la prevención de la producción de células caliciformes.
Además de describir un mecanismo para inducir células caliciformes, los presentes resultados sugieren una posible secuencia para la evolución de la producción de células caliciformes basada en la expresión de EGF-R: la estimulación con TNF\alpha inducía una tinción intensa de células secretoras no granuladas; su posterior activación por ligandos de EGF-R producía una tinción progresiva de los glicoconjugados mucosos en el citoplasma, y las células se convertían en "precaliciformes" y después en células "caliciformes". La instilación de TNF\alpha seguido de ligandos de EGF-R inducía la producción de células caliciformes sin alterar el número total de células epiteliales, lo que sugiere que la activación de EGF-R promovía una diferenciación celular selectiva (sin proliferación). Los descubrimientos sugieren que las células caliciformes proceden de células secretoras no granuladas que expresan EGF-R y se estimulan por ligandos de EGF-R para producir mucinas.
En pacientes que mueren por asma aguda, son hallazgos importantes la hiperplasia de células caliciformes y la obstrucción mucosa. En un modelo murino de asma, se produce sensibilización de las vías respiratorias después de una instilación repetida de ovalbúmina, que da como resultado una notable hiperplasia de las células caliciformes de las vías respiratorias. Se demuestra que EGF-R, que no se expresa en el epitelio de las vías respiratorias de control, se expresa en los animales sensibilizados. Las células que se tiñeron eran células precaliciformes y caliciformes, lo que sugiere que: el EGF-R estaba implicado en la producción de células caliciformes. El pretratamiento con un inhibidor de tirosina quinasa del receptor EGF-R (BIBX1522) prevenía la producción de células caliciformes en las vías respiratorias, confirmando el papel de la activación de EGF-R en la producción de células caliciformes en el asma experimental.
Los presentes resultados implican la ruta de EGF-R en la hiperplasia de células caliciformes. Ciertos estudios previos han demostrado que diversos estímulos tales como el ozono, dióxido de azufre, virus, lipopolisacáridos, factor de activación de plaquetas e interleucina-4 regulan positivamente la expresión y secreción de mucina. La presente invención proporciona un mecanismo para evaluar la relación de estos estímulos inflamatorios y el sistema de EGF-R.
El asma sirve como ejemplo de la estrategia terapéutica de la invención: el epitelio de las vías respiratorias humanas normales tiene una relación de 3-10 células ciliadas por cada célula caliciforme. En caso de asma, el número de células caliciformes puede ser igual o superior al de las células ciliadas; en pacientes que mueren de broncospasmo grave (status asthmaticus)hay un aumento de 30 veces en el porcentaje de área ocupado por las células caliciformes en comparación con el número de pacientes que mueren por enfermedades respiratorias no asmáticas. La inhibición de la producción de células caliciformes eliminaría esta fuente de hipersecreción. Como se desconoce el ciclo de vida de las células caliciformes, no puede predecirse con precisión el transcurso de tiempo que llevaría la resolución de la hiperplasia de células caliciformes con tratamiento. En ausencia de exposición adicional a un alérgeno, la hiperplasia de células caliciformes en ratones previamente sensibilizados se resolvió en 50 días, junto con otras manifestaciones de inflamación alérgica. La inhibición de la activación de EGF-R puede inhibir la hiperplasia de células caliciformes de una manera mucho más rápida, dependiendo de la duración de vida de las células caliciformes. Recientemente se han presentado inhibidores de tirosina quinasa muy selectivos y competitivos con respecto a ATP, evaluándose los inhibidores de tirosina quinasa de EGF-R para tratamiento de malignidades asociadas con la expresión de EGF-R.
La hipersecreción es una manifestación importante en muchas enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias. En el momento actual, no hay ninguna terapia eficaz para aliviar los síntomas y para detener la progresión de estas enfermedades. Los presentes descubrimientos proporcionan un mecanismo y una estrategia para la terapia: por medio de la inhibición de la activación de EGF-R, se previene la producción de células caliciformes. Se proponen inhibidores de la activación de EGF-R como terapia en enfermedades hipersecretoras de las vías respiratorias.
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Ejemplo 2 Papel del Estrés Oxidativo en la Producción de Células Caliciformes
En seres humanos, se ha sugerido que una exposición prolongada al humo de los cigarrillos está asociada con cambios patológicos progresivos en las vías respiratorias periféricas incluyendo hiperplasia de células caliciformes. De forma similar, se ha demostrado que modelos experimentales de humo de cigarrillos en animales producen hiperplasia de células caliciformes en las vías respiratorias. Sin embargo, no se conoce el mecanismo por medio del cual el humo de los cigarrillos puede inducir la síntesis de mucina. Los siguientes datos demuestran que los neutrófilos activados por citoquinas proinflamatorias y el humo de los cigarrillos originan la síntesis de MUC5AC de mucina en células epiteliales bronquiales humanas a través de una activación independiente de ligando de EGF-R. Estos resultados implican a los neutrófilos reclutados y al humo de los cigarrillos como reguladores de la diferenciación de células epiteliales que podrían dar como resultado una inducción anormal de células productoras de mucina en las vías respiratorias.
Métodos
Aislamiento de Neutrófilos. Se purificaron neutrófilos humanos a partir de sangre periférica obtenida de donantes humanos sanos. El aislamiento de neutrófilos se realizó por técnicas convencionales de separación en gradiente de Ficoll-Hypaque, sedimentación con dextrano y lisis hipotónica de eritrocitos. Las células rutinariamente eran viables en > 95% por exclusión de colorante azul tripán. Para prevenir la contaminación con endotoxinas, todas las soluciones se pasaron a través de un filtro de 0,1 \mum.
Cultivo de Células. Se cultivaron células NCI-H292, una línea celular de carcinoma mucoepidermoide pulmonar humano, en medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) y Hepes (25 mM) a 37ºC en un incubador humidificado, con un 5% de CO_{2}, con una camisa de agua. Para cultivar las células se usaron placas de cultivo de 6 pocillos o portaobjetos de 8 cámaras. Cuando se alcanzó la confluencia, las células se incubaron durante 1 hora con neutrófilos (10^{6} células/ml) solos, TNF\alpha solo (TNF\alpha humano recombinante, 20 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA), IL-8 (IL-8 humana recombinante, 10^{-8} M, Genzyme) sola, fMLP (10^{-8} M, Sigma, St. Louis, MO) solo, TNF\alpha más neutrófilos, IL-8 más neutrófilos, fMLP más neutrófilos, peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}, 200 \muM), solución de humo de cigarrillos o TGF\alpha (TGF\alpha humano recombinante, 0,1-25 ng/ml, Calbiochem, San Diego, CA). Las células después se lavaron y se incubaron con medio reciente solo. Los experimentos se terminaron a tiempos preseleccionados (en el caso del ARNm, 6 h y 12 h; para la proteína, 24 h). Como controles, las células se incubaron con medio solo durante los mismos periodos de tiempo. En otros estudios con neutrófilos, se eligió TNF\alpha como estímulo porque tenía el efecto más potente sobre la síntesis de MUC5AC. Se incubaron células NCI-H292 durante 1 hora con neutrófilos que se habían incubado con TNF\alpha (20 ng/ml) durante 1 hora y después se lavaron con PBS estéril para evitar la contaminación con el sobrenadante (por ejemplo, moléculas liberadas de neutrófilos), o las células NCI-H292 se incubaron con sobrenadante solo. En estudios de inhibición con inhibidores de tirosina quinasa de EGF-R, se pretrataron células NCI-H292 con BIBX1522 (10 \mug/ml, proporcionado generosamente por Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Germany) o tirfostina AG1478 (10 \muM, Calbiochem) 30 minutos antes de añadir un estímulo. También se examinaron los efectos de un inhibidor selectivo de tirosina quinasa del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (tirfostina AG1295, 100 \muM, Calbiochem), y un control negativo para tirfostinas (tirfostina A1, 100 \muM, Calbiochem). En estudios de inhibición con anticuerpos bloqueantes de ligandos de EGF-R, los sobrenadantes se pretrataron con anticuerpo anti-TGF\alpha (Calbiochem) o anticuerpo anti-EGF durante 30 minutos y después se añadieron a células NCI-H292. El papel de los radicales libres de oxígeno se examinó usando los eliminadores de radicales libres de oxígeno DMSO (1%, Sigma); 1,3-dimetil-2-tiourea (DMTU, 50 mM, Sigma) o superóxido dismutasa (SOD, 300 U/ml, Sigma).
Preparación de Solución de Humo de Cigarrillos. En el estudio se usaron cigarrillos de investigación (código 2R1, producidos por la University of Kentucky Tobacco and Health Research Foundation). La solución de humo de cigarrillos se preparó como se ha descrito previamente (Dusser et al. (1989) J. Clin. Invest 84:900-906). En resumen, se introdujo humo de cigarrillos en una jeringa de polipropileno (35 ml) a un caudal de una bocanada/minuto (10 veces) y se burbujeó lentamente en 20 ml de RPMI1640 que contenía tampón Hepes 50 mM. La solución de humo después se valoró a pH 7,4 y se usó inmediatamente después de la preparación.
Visualización de Glicoconjugados Mucosos y Proteína MUC5AC en células NCI-H292. Al final de los experimentos, las células cultivadas en portaobjetos de 8 cámaras se fijaron con paraformaldehído al 4% durante una hora y después se tiñeron con azul alcián/ácido peryódico-Schiff (PAS) para visualizar los glicoconjugados mucosos, o se usaron para inmunocitoquímica de MUC5AC. Para inmunocitoquímica de MUC5AC, como diluyente para el anticuerpo se usó PBS que contenía Tween 20 al 0,05%, suero de cabra normal al 2% y Levamisol (2 mM). Las células se incubaron con mAb de ratón contra MUC5AC (clon 45 M1, 1:200, Neo Markers, Fremont, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces con PBS para retirar el exceso de anticuerpo primario. Las células después se incubaron con IgG de caballo anti-ratón biotinilada (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) a una dilución 1:200 durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo unido se visualizó de acuerdo con un protocolo convencional para el método de complejo de avidina-biotina-fosfatasa alcalina.
Hibridación In Situ para el Gen de MUC5AC Humano. Se insertó un fragmento de cDNA de 298 pb de MUC5AC humano en el vector de clonaciónTA (Invitrogen, San Diego, CA). La preparación de sondas de RNA y la hibridación in situ se realizaron como se ha descrito anteriormente.
Inmunoensayo de Proteína MUC5AC. Se midió la proteína MUC5AC como se ha descrito anteriormente. En resumen, se prepararon lisados celulares con PBS a múltiples diluciones y se incubaron 50 \mul de cada muestra con tampón bicarbonato-carbonato (50 \mul) a 40ºC en una placa de 96 pocillos (Maxisorp Nunc, Fisher Scientific, Santa Clara, CA), hasta que se secaron. Las placas se lavaron tres veces con PBS y se bloquearon con BSA al 2% (fracción V, Sigma) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo tres veces con PBS y después se incubaron con 50 \mul de anticuerpo monoclonal de ratón contra MUC5AC (1:100) que se diluyó con PBS que contenía Tween 20 al 0,05%. Después de 1 hora, los pocillos se lavaron tres veces con PBS, y se distribuyeron 100 \mul de conjugado de IgG de cabra anti-ratón con peroxidasa de rábano picante (1:10.000, Sigma) en cada pocillo. Después de 1 hora, las placas se lavaron tres veces con PBS. Se desarrolló reacción de color con solución de TMB peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) y se detuvo con H_{2}SO_{4} 2 N. Se leyó la absorbancia a
450 nm.
Análisis Cuantitativo de Proteína TGF\alpha. La proteína TGF\alpha se midió usando un kit disponible en el mercado para ELISA (Sigma), siguiendo las instrucciones del fabricante. El sobrenadante tomado después de la incubación de neutrófilos más TNF\alpha (20 ng/ml) durante 1 hora se mezcló con el tampón de lisis PBS que contenía Triton X-100 al 1%, desoxicolato sódico al 1% y varios inhibidores de proteasa (Complete Mini, Boehringer Mannheim, Alemania), y después se usó para medir TGF\alpha.
Inmunoprecipitación para la Proteína EGF-R e Immunotransferencia para la Fosforilación de Tirosina. Las células se privaron de suero durante 24 horas y después se estimularon con TGF\alpha, H_{2}O_{2} o el sobrenadante de neutrófilos activados durante 15 minutos. Después de la estimulación, las células se lisaron y se incubaron durante 30 minutos en un agitador orbital a 4ºC. Para retirar el material insoluble, los lisados celulares se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Se inmunoprecipitaron alícuotas de sobrenadantes que contenían cantidades iguales de proteína con anticuerpo anti-receptor de EGF (policlonal, Ab4, Calbiochem) y 20 \mul de proteína A-agarosa (Santa Cruz) durante 2 horas a 4ºC. Los precipitados se lavaron 3 veces con 0,5 ml de tampón de lisis, se suspendieron en tampón de muestra de SDS y se hirvieron durante 5 minutos. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE en gel de acrilamida al 8,0%. El gel resultante se equilibró en el tampón de transferencia: Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM, metanol al 20% (vol/vol), pH 8,3. Las proteínas después se transfirieron electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa (0,22 \mum), se bloquearon con leche desnatada al 5% en PBS que contenía Tween 20 al 0,05% durante una noche y después se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (1:100, Santa Cruz) durante 1 hora. El anticuerpo unido se visualizó de acuerdo con un protocolo convencional para el método de complejo de avidina-biotina-fosfatasa alcalina (kit ABC, Vector Laboratories).
Estadística. Todos los datos se expresan como media \pm SEM. Se usó un análisis de varianza de una vía para determinar las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Se usó un ensayo F de Scheffe para realizar las correcciones para las comparaciones múltiples cuando se identificaron significados estadísticos en el análisis de varianza. Se aceptó una probabilidad menor de 0,05 para la hipótesis nula que indica una diferencia estadísticamente significativa.
Resultados
Los Neutrófilos Activados Producen la Síntesis de MUC5AC de Mucina. Cuando los neutrófilos más los estímulos que activan a los neutrófilos (IL-8, fMLP, TNF\alpha) se incubaron con células NCI-H292 durante 1 hora, la síntesis de proteína MUC5AC aumentó significativamente en 24 horas, mientras que los neutrófilos no estimulados (10^{6}/ml), la IL-8 sola o el fMLP solo no mostraron ningún efecto sobre la síntesis de MUC5AC; la incubación con TNF\alpha solo produjo un pequeño aumento insignificante en la síntesis de MUC5AC. Cuando los neutrófilos se preincubaron durante 1 hora con TNF\alpha y después se separaron los neutrófilos y su sobrenadante, la posterior incubación del sobrenadante durante 1 hora con células NCI-H292 regulaba positivamente la expresión del gen de MUC5AC en 12 horas, y estimulaba la tinción tanto con azul alcián/PAS como con un anticuerpo de la proteína MUC5AC en 24 horas; y las células NCI-H292 en reposo mostraron poca expresión del gen de MUC5AC y una pequeña tinción desigual tanto de azul alcián/PAS como de proteína MUC5AC. La síntesis de proteína MUC5AC inducida por el sobrenadante aumentaba significativamente con respecto al control; los neutrófilos separados del sobrenadante después de la incubación carecían de efecto. Se concluyó que los neutrófilos activados secretan rápidamente un producto activo que provoca la síntesis de MUC5AC.
Los Inhibidores de Tirosina Quinasa de EGF-R Previenen la Síntesis de MUC5AC Inducida por el Sobrenadante de Neutrófilos Activados. Como se sabe que los ligandos de EGF-R provocan la síntesis de MUC5AC en células NCI-H292 por medio de la activación de la tirosina quinasa de EGF-R, se examinó el papel de la activación de EGF-R en la síntesis de MUC5AC inducida por el sobrenadante de neutrófilos activados. El pretratamiento de células NCI-H292 con inhibidores selectivos de tirosina quinasa de EGF-R (BIBX1522, AG1478), previno la síntesis de proteína MUC5AC que normalmente se inducía por el sobrenadante de neutrófilos activados. Un inhibidor de quinasa selectivo del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (AG1295) y un control negativo para tirfostinas (A1) carecían de efecto. Estos resultados implican la activación de la tirosina quinasa de EGF-R en la síntesis de MUC5AC inducida por el sobrenadante de neutrófilos activados.
Papel de Ligandos de EGF-R Secretados en el Sobrenadante de Neutrófilos Activados en la Síntesis de MUC5AC. Para determinar si la activación de la tirosina quinasa de EGF-R depende de los ligandos de EGF-R (EGF y TGF\alpha), se preincubó el sobrenadante de neutrófilos activados con anticuerpos de neutralización contra ligandos de EGF-R. El pretratamiento del sobrenadante con anticuerpo anti-TGF\alpha o anticuerpo anti-EGF no inhibía la síntesis de MUC5AC inducida por el sobrenadante de neutrófilos activados. Además, TGF\alpha no se detectaba en el sobrenadante. De esta manera, la fosforilación de tirosina de EGF-R causada por el sobrenadante de los neutrófilos activados se inducía por un mecanismo independiente de los ligandos de EGF-R, EGF y TGF\alpha.
El Humo de los Cigarrillos y los Radicales Libres de Oxígeno Producen la Síntesis de MUC5AC. El humo de los cigarrillos y el radical libre de oxígeno H_{2}O_{2} regulaban positivamente la expresión del gen de MUC5AC en 12 horas, como también lo hacía TGF\alpha. De forma similar, todos los estímulos aumentaban la síntesis de proteína MUC5AC y la producción de glicoconjugado mucoso en 24 horas, efectos que se producían de una forma dependiente de la dosis. La síntesis máxima de MUC5AC en respuesta a H_{2}O_{2} fue significativamente menor que la respuesta a TGF\alpha. El pretratamiento con AG1478 impidió el aumento de síntesis de proteína MUC5AC inducida por todos los estímulos, indicando que los estímulos producen síntesis de mucina por la activación de la tirosina quinasa de EGF-R. La síntesis de MUC5AC por el sobrenadante de neutrófilos activados, el humo de cigarrillos y H_{2}O_{2} se inhibió significativamente por el pretratamiento con eliminadores de radicales libres (DMSO y DMTU) y SOD, pero la síntesis de proteína MUC5AC por TGF\alpha no se veía afectada por DMSO o SOD.
Inducción de la Fosforilación de Tirosina de EGF-R por Sobrenadante de Neutrófilos Activados y por H_{2}O_{2}. La distribución de la proteína EGF-R fue similar en el control privado de suero y en todas las condiciones estimuladas (sobrenadante de neutrófilos activados, humo de cigarrillos, H_{2}O_{2} o TGF\alpha). Se produjo una fosforilación total de la proteína de tirosina en 15 minutos después de añadir sobrenadante de neutrófilos activados, humo de cigarrillos, H_{2}O_{2} o TGF\alpha; el control privado de suero no mostró ningún efecto. La fosforilación total de la proteína de tirosina inducida por TGF\alpha era mayor que el efecto del sobrenadante de los neutrófilos activados, el humo de los cigarrillos o H_{2}O_{2}. Para determinar si el EGF-R se fosforilaba, se realizó inmunoprecipitación con anticuerpo anti-EGF-R: el sobrenadante de los neutrófilos activados, los productos solubles del humo de los cigarrillos y el H_{2}O_{2} inducían la fosforilación de tirosina especifica de EGF-R en 15 minutos, un efecto que era similar al producido por el TGF\alpha. El pretratamiento de las células NCI-H292 con AG1478 inhibía la fosforilación de tirosina de EGF-R para todos los estímulos. El DMSO inhibía la fosforilación de tirosina de EGF-R inducida por el sobrenadante, el humo de los cigarrillos y H_{2}O_{2}, pero el DMSO no tenía ningún efecto sobre la fosforilación de tirosina de EGF-R inducida por TGF\alpha.
Los resultados anteriores demuestran que los neutrófilos producen síntesis de la proteína MUC5AC de mucina en células NCI-H292 cuando se activan con IL-8, fMLP o TNF\alpha. Además, el sobrenadante que se recogió 1 hora después de la incubación de los neutrófilos con TNF\alpha produjo síntesis de MUC5AC, un efecto que se inhibió por inhibidores selectivos de tirosina quinasa de EGF-R. La inhibición de tirosina quinasa de EGF-R bloqueó completamente la síntesis de MUC5AC provocada por el sobrenadante de neutrófilos activados; un inhibidor de tirosina quinasa no asociada con EGF-R, un inhibidor selectivo de la quinasa del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (AG1295) y un control negativo para tirfostinas (A1) carecían de efecto, lo que implica a la fosforilación de tirosina de EGF-R como la ruta de señalización de la síntesis de MUC5AC inducida por el sobrenadante de neutrófilos
activados.
Para analizar adicionalmente el mecanismo por medio del cual los sobrenadantes de neutrófilos activados inducen la fosforilación de tirosina de EGF-R, se examinaron rutas de EGF-R tanto dependientes de ligando como independientes de ligando. En primer lugar, se midió TGF\alpha en el sobrenadante de neutrófilos activados y se descubrió que el sobrenadante no contenía cantidades medibles de TGF\alpha. Los informes previos demostraron que los neutrófilos sólo contenían bajas concentraciones (2,5 pg/10^{6} células) de TGF\alpha. El efecto del sobrenadante de los neutrófilos activados sobre la síntesis de MUC5AC era tan potente como el efecto de 1 ng de TGF\alpha, que era 400 veces mayor que la cantidad de TGF\alpha encontrada en los neutrófilos. En segundo lugar, se realizaron estudios de bloqueo con anticuerpos de neutralización de ligandos de EGF-R: el pretratamiento con anticuerpos de neutralización contra EGF y TGF\alpha no pudo inhibir la síntesis de MUC5AC producida por el sobrenadante de neutrófilos activados. Estos resultados sugieren que la síntesis de MUC5AC inducida por sobrenadante de neutrófilos no se debía a la secreción de ligandos de EGF-R (TGF\alpha y EGF) por los neutrófilos. A continuación se examinó la ruta independiente de ligando: como se sabe que los neutrófilos liberan radicales libres de oxígeno durante la activación y sabe que producen la transactivación de tirosina quinasa de EGF-R en diversas células, se propuso la hipótesis de que la liberación de radicales libres de oxígeno por los neutrófilos activados causaba la fosforilación de tirosina de EGF-R y daba como resultado la síntesis de MUC5AC en células NCI-H292. Los eliminadores de radicales libres (DMSO y DMTU) y SOD inhibían la síntesis de MUC5AC por el sobrenadante de neutrófilos activados. Se ha notificado que TNF\alpha provoca un estallido oxidativo en neutrófilos en suspensión, con una respuesta máxima en 1 hora; los presentes resultados muestran un transcurso de tiempo
similar.
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En el presente estudio, el H_{2}O_{2} exógeno, un producto principal liberado a partir de los neutrófilos durante el estallido oxidativo, provocó la síntesis de MUC5AC en células NCI-H292. Sin embargo, la respuesta máxima a H_{2}O_{2} en la síntesis de MUC5AC sólo era la mitad de la respuesta a TGF\alpha. Un hallazgo significativo en el presente estudio es el hecho de que el humo de los cigarrillos solo produjo la síntesis de MUC5AC. Esto sugiere que el humo de los cigarrillos podría provocar la síntesis de MUC5AC in vivo tanto a través de la estimulación directa como a través de la estimulación indirecta producida por el reclutamiento de neutrófilos. Las moléculas exactas en el humo de cigarrillos causantes de la síntesis de MUC5AC aún no están claras. Se ha demostrado que el humo de los cigarrillos contiene múltiples productos (por ejemplo, nicotina, alquitrán, acroleína y oxidantes). En nuestros experimentos, el DMSO y SOD inhibieron parcialmente la síntesis de MUC5AC inducida por el humo de los cigarrillos. De esta manera, el estrés oxidativo podría ser un mecanismo productor de esta respuesta. El hecho de que la síntesis de MUC5AC inducida por el humo de los cigarrillos se bloqueara completamente por inhibidores de tirosina quinasa de EGF-R indica que la activación de EGF-R juega un papel importante en la síntesis de MUC5AC inducida por el humo de los
cigarrillos.
En enfermedades de las vías respiratorias, es una característica común la inflamación neutrofílica de la vías respiratorias y los neutrófilos se reclutan y activan por citoquinas y por el humo de los cigarrillos. Los presentes estudios demuestran que los neutrófilos reclutados y el humo de los cigarrillos también actúan como reguladores de la diferenciación de células epiteliales que tienen como resultado la inducción de células productoras de mucina en las vías respiratorias. Lo que es más importante, la inhibición de la activación de EGF-R será útil como terapia en enfermedades hipersecretoras de las vías respiratorias.
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Ejemplo 3 Las Heridas del Epitelio de las Vías Respiratorias Producen Metaplasia de Células Caliciformes
Se propuso la hipótesis de que bloques de agarosa introducidos en las vías respiratorias por instilación se alojarían de forma crónica en los bronquios sin obstruirlos, y que los bloques residentes producirían inflamación, dando como resultado una metaplasia de células caliciformes. Se demuestra que los bloques de agarosa inducen una producción local marcada de células caliciformes, como se demuestra por la tinción positiva con azul alcián/PAS y la expresión del gen de MUC5AC de mucina, asociadas con el reclutamiento local de células inflamatorias. Los resultados implican la activación de EGF-R en la metaplasia de células caliciformes inducida por bloques.
Métodos
Animales. El protocolo animal experimental se aprobó por el Comité sobre Investigación Animal de la Universidad de California, San Francisco. Se usaron ratas F344 macho, libres de patógenos específicos (de 230 a 250 g de peso corporal; Simonsen Lab., Gilroy, CA). Las ratas se encerraron en jaulas BioClean libres de patógenos con campanas de flujo laminar de ambiente controlado; los animales tuvieron acceso libre a un pienso estéril y a agua.
Fármacos. Se usaron fármacos de las siguientes fuentes: ciclofosfamida (Sigma, St. Louis, MO), metohexital sódico (Brevital, Jones Medical Industries, Inc., St. Louis, MO), pentobarbital sódico (Nembutal, Abbott Lab., North Chicago, IL); BIBX1522, un inhibidor selectivo de la tirosina quinasa de EGF-R (proporcionado generosamente por Boehringer Ingelheim, Inc., Ingelheim, Germany), disueltos en la siguiente solución: 2 ml de polietilenglicol 400 (Sigma, St. Louis, MO), 1 ml de HCl 0,1 N y 3 ml de solución de manitol al 2% en agua (pH 7,0). NPC 15669 (un inhibidor de la motilidad de los leucocitos) se proporcionó amablemente por Scios Nova, Inc., Mountain
View, CA.
Bloques de agarosa. Los bloques de agarosa (con un diámetro de 0,7-0,8 mm) se prepararon con medio de agarosa al 4% de tipo II EEO (Sigma, St. Louis, MO) en tampón salino fosfato (PBS) estéril. Para visualizar los bloques de agarosa en tejido, se añadió una suspensión al 3% de azul Monastral B (Sigma, St. Louis, MO) después de fundir la agarosa a 50ºC.
Protocolo de los experimentos. Se estudiaron ratas libres de patógenos porque normalmente tienen pocas células caliciformes en las vías respiratorias. Los animales se anestesiaron con metohexital sódico (Brevital, 25 mg/kg, i.p.). Las tráqueas se expusieron asépticamente con una incisión cervical en la línea media y se introdujeron bloques de agarosa por instilación en un bronquio a través de un Angiocath de calibre 20 (Becton Dikinson, Sandy, UT) conectado a un tubo de polietileno (PE 90, diámetro interno 0,86 mm y diámetro externo 1,27 mm, Clay Adams, Parsippany, NY) ensartado en la tráquea en la que se hizo la incisión. El tubo de polietileno se dobló formando un ángulo de 30º para permitir la instilación selectiva en el bronquio derecho. Después de la instilación, la incisión se cerró con una
sutura.
Para evaluar el papel de EGF-R sobre la metaplasia de células caliciformes inducida por bloques de agarosa, los animales se trataron con BIBX1522 (80 mg/kg, i.p.) 1 hora antes de la instilación de los bloques de agarosa y este tratamiento se repitió diariamente (40 mg/kg, i.p., bid). Los animales se sacrificaron 24, 48 ó 72 horas después de la instilación de los bloques de agarosa.
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Para evaluar el papel de TNF\alpha en la metaplasia de células caliciformes inducida por bloques de agarosa, los animales se trataron con un anticuerpo de neutralización de TNF\alpha (Genzyme, Boston, MA). El primer tratamiento (100 \mul en 0,2 ml de solución salina i.p.) se administró 1 hora antes de la instilación de bloques de agarosa, y se repitieron las inyecciones i.p. diariamente. Además, el anticuerpo de neutralización de TNF\alpha se infundió (10 \mul/h) a través de un minibomba osmótica (Alzet 2ML1, Alza Corp., Palo Alto, CA) implantada por vía subcutánea.
Para estudiar el efecto de los neutrófilos sobre la metaplasia de células caliciformes inducida por bloques de agarosa, las ratas se pretrataron con ciclofosfamida (un inhibidor de leucocitos de médula ósea) o con una combinación de ciclofosfamida más NPC 15669. La ciclofosfamida (100 mg/kg, i.p.) se administró 5 días antes de la instilación de los bloques de agarosa y se administró una segunda inyección de ciclofosfamida (50 mg/kg, i.p.) 1 día antes de la instilación de los bloques. En estudios con NPC 15669, el fármaco (10 mg/kg, i.p.) se inyectó 1 hora antes de la instilación de bloques de agarosa y después diariamente durante 3 días.
Todos los fármacos (BIBX1522, anticuerpo neutralizador de TNF\alpha, ciclofosfamida y NPC 15669) se administraron i.p. 1 hora antes de la instilación de bloques de agarosa y las dosis se repitieron diariamente durante 3 días.
Preparación de tejidos. A diversos tiempos después de la instilación de bloques de agarosa, las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico (65 mg/kg, i.p.) y la circulación sistémica se perfundió con paraformaldehído al 1% en PBS tratado con pirocarbonato de dietilo a una presión de 120 mmHg. Se extrajo el pulmón derecho y el lóbulo caudal derecho se usó para la histología. Para las secciones congeladas, se retiraron los tejidos y se pusieron en paraformaldehído al 4% durante 1 hora y después se reemplazaron en sacarosa al 30% para la crioprotección durante una noche. Los tejidos incluyeron en compuesto O.C.T. (Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance, CA). Para las secciones de metacrilato, los tejidos se pusieron en paraformaldehído al 4% durante 24 horas y después se deshidrataron con concentraciones graduadas de etanol y se incluyeron en metacrilato JB-4 (Polysciences, Inc., Warrington, PA). Las secciones de tejido (4 \mum de espesor) se tiñeron con azul alcián/PAS y se usó el colorante de contraste hematoxilina.
Análisis morfométrico del epitelio bronquial. El porcentaje de área teñida con azul alcián/PAS de glicoconjugados mucosos en el epitelio se determinó usando un sistema de análisis de imágenes semiautomático de acuerdo con los métodos publicados previamente. El área de epitelio y los conjugados mucosos teñidos con azul alcián/PAS dentro del epitelio se limitó manualmente y se analizó usando el programa NIH Image (desarrollado en U.S. National Institutes of health y disponible en Internet por FTP anónimo o en un disco flexible en el National Technical Information Service, Springfield, VA, parte número PB95-500195GEI). Los datos se expresan como porcentaje de área total de epitelio ocupada por tinción con azul alcián/PAS. Para evaluar la secreción de moco de una forma semicuantitativa, se determinó el porcentaje de la longitud de superficie epitelial ocupada por tinción positiva con azul alcián/PAS calculando la longitud que se teñía positivamente como una relación con respecto a la longitud total. El porcentaje de epitelio denudado se determinó calculando la relación de la longitud de epitelio denudado con respecto a la longitud de epitelio total.
Identificación de tipos celulares en secciones de metacrilato y análisis de células. El número total de células epiteliales se determinó contando los núcleos de células epiteliales sobre 2 mm de la lámina basal con una lente de objetivo de inmersión con aceite (1000 aumentos). La longitud lineal de la lámina basal debajo de cada región analizada de epitelio se determinó trazando el contorno de la imagen digitalizada de la lámina basal. Las células epiteliales se identificaron como se ha descrito previamente. En resumen, las células basales se identificaron como células aplanadas pequeñas con núcleos grandes, localizadas justo por encima de la lámina basal pero que no alcanzaban la luz de las vías respiratorias. El citoplasma se teñía de forma oscura, y no estaban presentes gránulos positivos para azul alcián o PAS. Las células ciliadas se reconocieron por sus bordes ciliados, citoplasma ligeramente teñido y núcleos grandes y redondos. Las células secretoras no granuladas tenían forma de columna y se extendían desde la luz bronquial a la lámina basal. Después de la instilación intrabronquial de bloques de agarosa, se formaron células caliciformes "en desarrollo" (células precaliciformes). Estas células mostraron tinción positiva para azul alcián/PAS, los gránulos eran pequeños y las células no se empaquetaban con los gránulos; contenían pequeñas áreas teñidas mucosas (<1/3 altura en el epitelio desde la membrana basal hasta la superficie en contacto con la luz del conducto) o gránulos pequeños teñidos con azul alcián/PAS de forma ligera y dispersa. Las células de tipo indeterminado se definen como perfiles de células que carecen de suficientes características citoplásmicas como para realizar una categorización apropiada.
Localización inmunohistoquímica de EGF-R. La presencia de EGF-R se determinó por localización inmunohistoquímica, usando un anticuerpo monoclonal de ratón contra el EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA). Secciones congeladas de 4 \mum preparadas previamente se fijaron posteriormente con paraformaldehído al 4% y se trataron con H_{2}O_{2}/metanol al 3%. Los tejidos se incubaron con anticuerpo contra EGF-R (dilución 1:250). Se usó IgG de caballo anti-ratón biotinilada (1:200; Vector Lab., Burlingame, CA), seguido del complejo de estreptavidina-peroxidasa (kit ABC, Vector Lab., Burlingame, CA) para visualizar los complejos de antígeno-anticuerpo teñidos con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (Sigma, St Louis, MO). Los portaobjetos de controles negativos se incubaron omitiendo el anticuerpo primario o secundario y reemplazándolo con PBS.
Hibridación in situ. Se generaron ribosondas marcadas con [^{35}S] a partir de un plásmido que contenía un fragmento de CDNA de 320 pb de MUC5AC proporcionada amablemente por el Dr. Carol Basbaum. Las secciones se hibridaron con sondas de RNA marcadas con [^{35}S] (2.500-3.000 cpm/\mul de tampón de hibridación) y se lavaron en condiciones rigurosas, incluyendo el tratamiento con RNasa A. Después de la autorradiografía durante 7-21 días, se reveló la emulsión fotográfica y los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina.
Recuento de neutrófilos en el epitelio de las vías respiratorias. La evaluación de la entrada de neutrófilos en los bronquios se realizó tiñendo los neutrófilos con tetraclorhidrato de 3-3'-diaminobencidina y el número de neutrófilos se contó en la luz de las vías respiratorias y en el epitelio; los resultados se expresaron como el número de células teñidas por mililitro de longitud de lámina basal.
Lavado broncoalveolar (BAL). Para evaluar los recuentos de células diferenciales en cada grupo de animales, los pulmones se lavaron cinco veces con alícuotas de 3 ml de PBS estéril, los lavados se reunieron y se midió el volumen. Se recogieron las células en BAL por centrifugación del fluido de lavado a 1.000 rpm durante 10 minutos. Después se contaron 10 \mul de una suspensión celular con un hematocitómetro para determinar el número de células en el fluido BAL. Se realizaron recuentos de células diferenciales en preparaciones citocentrifugadas (cytospun) teñidas con Diff-Quik (American Scientific Products, McGaw Park, IL). Se obtuvieron recuentos de células diferenciales por muestreo de al menos 200 células en cada portaobjetos citocentrifugado.
Análisis estadístico. Los datos se expresan como medias \pm SE. Para el análisis estadístico, cuando fue apropiado se usó el análisis de varianza de una vía o dos vías (ANOVA) seguido del test t de Student. Una probabilidad menor de 0,05 se consideró una diferencia estadísticamente significativa.
Resultados
Efecto sobre la estructura epitelial de las vías respiratorias: Metaplasia de células caliciformes. Para determinar si los bloques de agarosa afectan a la estructura del epitelio de las vías respiratorias, se instilaron bloques de agarosa en el bronquio derecho en 5 ratas libres de patógenos. En los animales control, el epitelio bronquial contenía pocas células caliciformes. Sin embargo, después de la instilación local de bloques de agarosa, la tinción con azul alcián/PAS mostró un aumento dependiente del tiempo en el área de las células caliciformes, que ya era detectable a las 24 horas y era máximo 72 horas después de la instilación. A las 24 horas, los bloques de agarosa produjeron un aumento significativo en el número de células precaliciformes y caliciformes, y a las 48 horas se encontraron más células caliciformes maduras (Tabla 1). A las 72 horas, los bloques de agarosa aumentaron el número de células caliciformes (P < 0,01); los números de células basales y ciliadas no cambiaron (P > 0,05). El número total de células epiteliales por milímetro de lámina basal 72 horas después de la instilación aumentó ligeramente pero no significativamente (P > 0,05, Tabla 1); la altura del epitelio (medida desde la membrana basal a la superficie del epitelio en contacto con la luz del conducto) aumentó desde 16,0 \pm 1,2 \mum en las vías respiratorias de control a 38,1 \pm 9,1 \mum a las 72 horas después de la instilación de los bloques (n = 5, P < 0,01).
En la luz de las vías respiratorias de los animales control, no hubo tinción con azul alcián/PAS. Sin embargo, en la zona adyacente a los bloques de agarosa, se observó tinción positiva en la luz, indicando que se había producido secreción de glicoconjugados mucosos. En las vías respiratorias con bloques de agarosa, la tinción aumentó de una forma dependiente del tiempo. El porcentaje de longitud total de epitelio ocupado por tinción positiva con azul alcián/PAS en las vías respiratorias adyacentes a los bloques aumentó de 0,1 \pm 0,1% en los animales de control a 4,7 \pm 1,4%, 13,3 \pm 0,7%, y a 19,1 \pm 0,7% las 24 horas, 48 horas y 72 horas (n = 5). Además, los bloques de agarosa denudaron el epitelio del bronquio con bloques en 13,5 \pm 2,3%, 6,9 \pm 2,4% y 5,1 \pm 1,5% del área total a las 24, 48, y 72 h, respectivamente (n = 5).
Efecto de bloques de agarosa sobre la expresión del gen de mucina. En las ratas control no hubo ninguna señal detectable con una sonda antisentido de MUC5AC en bronquios (n = 4 por grupo). En los bronquios en los que se instilaron bloques de agarosa, hubo una señal para MUC5AC que aumentaba de una forma dependiente del tiempo de 24 a 72 horas (n = 4). Se encontró expresión del gen de MUC5AC preferentemente en células que se tiñeron positivamente con azul alcián/PAS. No se detectaron señales en otros tipos celulares (por ejemplo, músculo liso o tejido conectivo). Las secciones examinadas con la sonda sentido de MUC5AC no mostraron expresión.
Efecto de bloques de agarosa sobre la expresión de EGF-R en el epitelio de las vías respiratorias. En los animales control, la inmunotinción con un anticuerpo contra EGF-R mostró una tinción dispersa en el epitelio. Sin embargo, después de la instilación de bloques de agarosa, el epitelio adyacente a los bloques de agarosa mostró una tinción positiva para EGF-R en células que se tiñeron positivamente con azul alcián/PAS. El patrón de tinción para EGF-R es comparable a la tinción para MUC5AC y AB/PAS. Las células precaliciformes, caliciformes y secretoras no granuladas eran inmunopositivas para EGF-R. Las células ciliadas no mostraron inmunorreactividad. En las vías respiratorias no obstruidas por bloques de agarosa, el epitelio mostró poca tinción para EGF-R y parecía similar a la tinción en los animales de control.
Efecto de inhibidor de tirosina quinasa de EGF-R sobre metaplasia de células caliciformes y sobre la expresión del gen de mucina. En los presentes estudios, la instilación de bloques de agarosa produjo la expresión de EGF-R en las células que producen mucinas. EGF-R es un miembro de la clase de receptores de tirosina quinasa. De esta manera, cuando los ligandos de EGF-R (EGF o TGF\alpha) se unen a EGF-R, se activa una tirosina quinasa de EGF-R específica. Por lo tanto, para evaluar la hipótesis de que la activación de EGF-R induce la expresión del gen de MUC5AC y de glicoconjugados mucosos después de la instilación de bloques de agarosa, se inyectó un inhibidor de tirosina quinasa de EGF-R (BIBX1522) por vía intraperitoneal en ratas. BIBX1522 inhibía notablemente el área teñida con azul alcián/PAS inducida con bloques de agarosa del epitelio a las 24, 48 y 72 horas. También inhibía completamente la expresión del gen de MUC5AC a las 72 horas después de la instilación del bloque.
Efecto de anticuerpo neutralizador de TNF\alpha sobre la metaplasia de células caliciformes y sobre la expresión de proteína EGF-R. Se propuso la hipótesis de que el TNF\alpha se libera durante la inflamación causada por bloques de agarosa. Por lo tanto, se examinó el efecto del pretratamiento de ratas con un anticuerpo neutralizador de TNF\alpha sobre la metaplasia de células caliciformes inducida por bloques de agarosa: en animales pretratados con el anticuerpo neutralizador de TNF\alpha (n = 5), los bloques de agarosa ya no estimulaban la expresión de proteína EGF-R o la producción de células teñidas positivamente con azul alcián/PAS (caliciformes).
Reclutamiento de células inflamatorias por bloques de agarosa. Se detectó que los bloques de agarosa producen lesiones epiteliales e infiltración de células inflamatorias. Diversas células inflamatorias pueden producir tanto TNF\alpha como ligandos de EGF-R. Tanto EGF-R como sus ligandos están implicados en la cascada de EGF-R que conduce a la metaplasia de células caliciformes. Se evaluaron los papeles de los leucocitos y macrófagos en los efectos inducidos por bloques de agarosa de dos formas. En primer lugar, se examinaron las células en el lavado broncoalveolar: en las ratas de control, los macrófagos fueron las células predominantes recuperadas (n = 5; Fig. 4, Control). Después de la instilación de bloques de agarosa, el número de macrófagos aumentó (P < 0,05), y aparecieron cantidades significativas de neutrófilos (P < 0,01) en el fluido de lavado. El número de linfocitos permaneció sin cambios.
También se evaluaron células de infiltración en secciones de tejido: las vías respiratorias sin bloques de agarosa contenían pocos neutrófilos, pero las vías respiratorias que contenían bloques mostraban la presencia de neutrófilos, tanto en el epitelio como en la luz. El número de neutrófilos en la luz de las vías respiratorias fue de 0,2 \pm 0,2, 42,4 \pm 7,1, 40,7 \pm 7,7y 20,1 \pm 7,2/mm de lámina basal en las vías respiratorias de control y a las 24, 48 y 72 horas después de la instilación de los bloques, respectivamente (P < 0,05, n = 5). Además, el número de neutrófilos en el epitelio de las vías respiratorias fue de 1,3 \pm 0,4, 15,6 \pm 2,6, 14,9 \pm 1,4 y 14,8 \pm 2,6/mm de lámina basal en el control y a las 24, 48 y 72 horas después de la instilación de bloques, respectivamente (P < 0,01, n = 5).
Efecto de ciclofosfamida sobre el reclutamiento de neutrófilos, metaplasia de células caliciformes y expresión de proteína EGF-R. En ratas tratadas con ciclofosfamida, se redujeron los neutrófilos sanguíneos (recuento de neutrófilos en sangre venosa después de ciclofosfamida, 1,8 \pm 0,5%, n = 5), y se inhibió el reclutamiento de neutrófilos inducido por bloques en BAL. El número de neutrófilos en la luz de las vías respiratorias (2,6 \pm 0,3/mm de lámina basal) y en el epitelio (0,8 \pm 0,2/mm) también se redujo significativamente a las 24 horas. La ciclofosfamida también inhibió la metaplasia de células caliciformes inducida por bloques de agarosa y la expresión de la proteína EGF-R. Cuando se añadió leumedin, NPC 15669 a ciclofosfamida, la inhibición de la metaplasia de células caliciformes inducida por bloques de agarosa fue similar al efecto de la ciclofosfamida sola. Estos resultados implican a los neutrófilos en la metaplasia de las células caliciformes inducida por bloques.
Discusión
En el presente estudio, se examinó el efecto de la instilación de bloques de agarosa sobre la metaplasia de células caliciformes en las vías respiratorias de ratas libres de patógenos, que tienen muy pocas células caliciformes en el estado de control. Las células epiteliales en los bronquios de los animales de control y en los bronquios sin bloques de agarosa (pulmones control) se tiñeron uniformemente de forma negativa con azul alcián/PAS. La instilación de bloques de agarosa produjo un profundo aumento dependiente del tiempo en el área de las células caliciformes del epitelio bronquial adyacente a los bloques instilados, que fue detectable en 24 horas y fue el máximo aproximadamente 72 horas después de la instilación. Las vías respiratorias adyacentes a las vías respiratorias con bloques también se tiñeron positivamente con azul alcián/PAS. El número total de células y el número de células basales y ciliadas no cambió, pero aumentó el número de células caliciformes y el número de células secretoras no granuladas se redujo de una forma dependiente del tiempo después de la instilación de bloques de agarosa (Tabla 2). Estos resultados sugieren que la metaplasia de células caliciformes fue el resultado de la conversión de células secretoras no granuladas en células caliciformes
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2
2
Se ha indicado que las células caliciformes de las vías respiratorias de rata expresan el gen de MUC5AC. En los presentes estudios, los bronquios control no expresaban el gen de MUC5AC, pero las vías respiratorias obstruidas por bloques o adyacentes a los bloques, que se teñían positivamente con azul alcián/PAS, expresaban el gen de MUC5AC, lo que sugiere que el gen de MUC5AC está implicado en la producción de moco inducida por bloques de agarosa. Estos resultados indican que los bloques de agarosa inducen la expresión de genes de mucina y la producción de glicoconjugados mucosos en células seleccionadas en las vías respiratorias en ratas.
Se examinó el mecanismo de metaplasia de células caliciformes inducida por bloques de agarosa. EGF-R no se expresa normalmente en el epitelio de las vías respiratorias de ratas libres de patógenos, pero se induce por TNF\alpha. En presencia de EGF-R en el epitelio, la instilación de ligandos de EGF-R (EGF o TGF\alpha) produce un aumento en el gen y en la expresión de la proteína de mucina. Un inhibidor selectivo de la tirosina quinasa de EGF-R (BIBX1522) inhibe completamente estas respuestas, lo cual implica a la señalización de EGF-R en la metaplasia de células caliciformes. Se determinó el efecto de BIBX1522 sobre la metaplasia de células caliciformes inducida por bloques de agarosa: BIBX1522 inhibía la producción inducida por bloques de agarosa de glicoconjugados mucosos y la expresión del gen de MUC5AC. Estos resultados implican una cascada de EGF-R en la metaplasia de células caliciformes inducida por bloques de agarosa.
Se estudiaron los mecanismos mediante los cuales la cascada de EGF-R causa metaplasia de células caliciformes con bloques de agarosa. En primer lugar, se estudió la expresión de la proteína EGF-R en el epitelio bronquial. Las vías respiratorias de control se tiñeron uniformemente de forma negativa para EGF-R, pero las vías respiratorias que contenían bloques de agarosa mostraron una tinción positiva, selectiva y dependiente del tiempo para EGF-R. Las células teñidas positivamente incluían células secretoras no granuladas, precaliciformes y caliciformes. De esta manera, los bloques de agarosa inducían la expresión de proteína EGF-R. Las ratas que se pretrataron con un anticuerpo de neutralización contra TNF\alpha no desarrollaron metaplasia de células caliciformes inducida por bloques de agarosa, lo cual implica al TNF\alpha en la expresión de EGF-R inducida por bloques de agarosa.
La ciclofosfamida, un fármaco que reduce de forma selectiva la producción de leucocitos, previno el reclutamiento de neutrófilos en el fluido de lavado de las vías respiratorias y en el epitelio de las vías respiratorias después de la instilación de bloques de agarosa y también previno la metaplasia de células caliciformes inducida por bloques de agarosa. Los macrófagos también aumentaron después de la introducción de bloques de agarosa, pero la ciclofosfamida no inhibía el reclutamiento de macrófagos. Estos resultados implican a los neutrófilos en la metaplasia de células caliciformes inducida por bloques de agarosa. El hecho de que la ciclofosfamida también redujera la expresión de la proteína EGF-R después de los bloques de agarosa sugiere que los neutrófilos contribuyen, al menos en parte, a la expresión de EGF-R en este estado inflamatorio.
Los neutrófilos también son capaces de producir los ligandos de EGF-R, EGF y TGF\alpha. Además, las células epiteliales son fuentes de ligandos de EGF-R, y hubo una notable denudación de epitelio adyacente a los bloques de agarosa. De esta manera, el epitelio podría ser una fuente potencial importante de ligandos de TNF\alpha y EGF-R.
Razonablemente, se supone que el estímulo eficaz del bloque de agarosa está relacionado con el movimiento de los bloques durante la respiración, con la consiguiente abrasión del epitelio. Se ha notificado que las lesiones mecánicas en el epitelio de las vías respiratorias producen hipersecreción. Estos estudios previos dan crédito a la hipótesis de que el traumatismo mecánico en el epitelio de las vías respiratorias conduce a una hipersecreción. Se ha notificado que la intubación orotraqueal produce una abundante secreción de moco en los caballos. La intubación crónica en pacientes produciría hipersecreción mucosa y podría ser responsable del taponamiento mucoso. Los inhibidores de tirosina quinasa de EGF-R podrían servir para prevenir la hipersecreción mucosa después de una intubación traqueal.
Las lesiones epiteliales son un descubrimiento común en estudios de pacientes incluso con asma leve, y las lesiones están cada vez más relacionadas con el empeoramiento de los síntomas clínicos. Las lesiones epiteliales producidas por la respuesta alérgica pueden inducir activación de EGF-R, que ocasiona una producción anómala de células caliciformes. Los datos presentados anteriormente implican la activación de EGF-R en una respuesta diferente, que implica específicamente metaplasia de células caliciformes. Las lesiones epiteliales mecánicas y las lesiones epiteliales producidas por el asma pueden implicar una cascada similar (EGF-R), dando como resultado un desarrollo anómalo de células secretoras epiteliales. Esto proporciona un mecanismo para la hipersecreción que se produce en casos fatales de asma aguda.
Ejemplo 4 Regranulación de células caliciformes por receptores de EGF
Se indujo desgranulación de células caliciformes en epitelio respiratorio nasal de rata por inhalación intranasal de fMLP. Se indujo una desgranulación significativa en el epitelio del tabique nasal 4 horas después de la inhalación intranasal de fMLP (10^{-7} M). Tuvo lugar una regranulación de células caliciformes 48 horas después de la inhalación. En el estado de control, se expresó proteína MUC5AC en las células caliciformes, pero no se expresó proteína EGF-R. En el epitelio de control estaban ausentes tanto EGF-R como el gen y la proteína MUC5AC de la mucina, pero se expresaron significativamente 48 horas después de la inhalación. El pretratamiento con un inhibidor de tirosina quinasa de EGF-R, BIBX1522, inhibía la expresión del gen y de la proteína MUC5AC de mucina después de la desgranulación de células caliciformes inducida por fMLP. Estos resultados indican que la expresión y activación de EGF-R están implicadas en la regranulación de las células caliciformes en el epitelio nasal de rata.
Métodos
Animales. El protocolo animal experimental se aprobó por el Comité sobre Investigación Animal de la Universidad de California, San Francisco. Se usaron ratas F344 macho, libres de patógenos específicos (de 200 a 230 g de peso corporal; Simonsen Lab., Gilroy, CA). Los animales se encerraron en jaulas BioClean libres de patógenos con campanas de flujo laminar de ambiente controlado; los animales tuvieron acceso libre a un pienso estéril y a agua.
Preparación de tejido nasal. A diversos tiempos después de la inhalación, las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico (65 mg/kg, i.p.). Se expuso el corazón del animal, se insertó una aguja de extremos romo desde el ápice del ventrículo izquierdo hasta el interior de la aorta ascendente y se perfundió la circulación sistémica con paraformaldehído al 1%. Una incisión en la aurícula derecha proporcionó una salida para el agente de fijación. Se extrajeron los ojos, las mandíbulas inferiores, la piel y la musculatura y la cabeza se sumergió en un gran volumen del mismo agente de fijación durante 24 h. Después de la fijación, la cabeza se descalcificó con Surgipath (Decalcifierll, Surgical Medical Industries, Inc., Richmond, IL) durante 4-5 días y se aclaró en tampón salino fosfato. La cavidad nasal se seccionó transversalmente a nivel de la papila incisiva del paladar nasal. El bloque de tejido frontal se incluyó en metacrilato de glicol (JB4 Plus, Polysciences, Inc., Warrington, PA), o en compuesto OCT (Sakura Finetek, U.S.A., Inc., Torrance, CA) en el caso de las secciones congeladas. Se cortaron secciones de 5 \mum de espesor de la superficie anterior de los bloques incluidos en metacrilato de glicol y se tiñeron con azul alcián (pH 2,5)/ácido peryódico-Schiff (AB/PAS) para demostrar la presencia de glicoconjugados ácidos y neutros, o 3,3'-diaminobencidina (Sigma Chemical, St. Louis, MO) para visualizar leucocitos que habían migrado al interior del epitelio. Se cortaron secciones de 5 \mum de espesor de las superficies anteriores de bloques incluidos congelados y se tiñeron con AB/PAS o se usaron para inmunotinción de EGF-R y MUC5AC.
Recuento de Neutrófilos en el Epitelio Nasal. Se contaron neutrófilos en campos de alta potencia de la capa epitelial teñida con 3,3'-diaminobencidina a 400 aumentos. El número de neutrófilos dentro del epitelio del tabique nasal (desde la membrana basal a los ápices celulares) se determinó contando el número de perfiles nucleares por unidad de longitud de lámina basal.
Cuantificación de Desgranulación y Regranulación de Células Caliciformes. Para evaluar la desgranulación y regranulación de células caliciformes, se midió la densidad de volumen de mucosustancias teñidas con azul alcián/PAS sobre el epitelio de la superficie mucosa usando un sistema de imágenes semiautomático de acuerdo con un método publicado previamente. Se examinaron los cortes teñidos con un microscopio Axioplan (Zeiss, Inc.), que se conectó a una unidad de control de videocámara (DXC7550MD; Sony Corp. of America, Park Ridge, NJ). Las imágenes del epitelio nasal se registraron en campos de alta potencia con una lente de contraste de fase a 400 aumentos, usando un IMAXX Video System (PDI, Redmond, WA). La mucina intracelular en las células secretoras epiteliales superficiales aparece en forma de gránulos de color morado con forma ovalada de tamaños variables. Se midió el área teñida positivamente con azul alcián/PAS y el área epitelial total, y se expresaron los datos como el porcentaje de área con azul alcián/PAS con respecto al área total. El análisis se realizó en un ordenador Macintosh 9500/120 (Apple Computer, Inc., Cupertino, CA), usando el programa NIH Image del dominio público.
Inmunolocalización de EGF-R y proteína MUC5AC. Se trataron secciones congeladas de tejidos nasales fijados con paraformaldehído con H_{2}O_{2}/metanol al 3% para bloquear el peróxido endógeno y se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón contra EGF-R (Calbiochem, San Diego, CA) o MUC5AC (NeoMarkers Inc., Fremont, CA) durante 1 hora a una dilución de 1:100. El EGF-R o la proteína MUC5AC con inmunorreactividad se visualizaron con el kit Vectastain Elite ABC (Vector Lab., Inc., Burlingame, CA) usando tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina como cromógeno. Los controles incluían la sustitución de anticuerpo primario o secundario con PBS.
Métodos. Se estudiaron ratas libres de patógenos, que normalmente tienen muchas células caliciformes en el epitelio del tabique nasal. Para determinar el efecto del fMLP aerosolizado sobre la desgranulación de las células caliciformes y sobre la migración de neutrófilos al interior del epitelio de la mucosa nasal, los animales se anestesiaron con pentobarbital sódico (65 mg/kg, i.p.), y recibieron N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP; 10^{-5} M, Sigma, St. Louis, MO) en solución salina libre de pirógenos mediante vía intranasal por medio de un aerosol durante 5 minutos. La exposición al aerosol se realizó ventilando a los animales con un nebulizador ultrasónico (PulmoSonic, DeVilbiss Co., Somerset, PA) que generaba una niebla de aerosol a una velocidad de 0,3 ml/min. De forma similar, los animales de control recibieron aerosol de solución salina sola por vía intranasal.
Para estudiar la regranulación de las células caliciformes nasales después de la inhalación de aerosol de fMLP, las ratas se sacrificaron 48 horas después de la administración intranasal de fMLP.
Para evaluar el efecto de la activación de la tirosina quinasa de EGF-R sobre la regranulación de células caliciformes, los animales se pretrataron por vía intraperitoneal con un inhibidor de tirosina quinasa de EGF-R (BIBX1522, 15 mg/kg, proporcionado generosamente por Boehringer Ingelheim Inc., Ingelheim, Germany) 30 minutos antes de la inhalación de fMLP y el tratamiento se repitió dos veces al día.
Estadística. Todos los datos se expresan como media \pm SEM. Para cada grupo experimental se usó el ANOVA de una vía o el test t de Student. Una probabilidad menor de 0,05 se consideró una diferencia estadísticamente significativa.
Resultados
Efecto de la desgranulación de células caliciformes por fMLP sobre la estructura del epitelio nasal. En el estado de control, el epitelio del tabique nasal contenía un área significativa de células caliciformes teñidas con AB/PAS, pero la superficie en contacto con la luz estaba sin teñir. La inmunotinción para la proteína MUC5AC de mucina correspondía al área de tinción AB/PAS, pero la hibridación in situ mostró una expresión génica de MUC5AC pequeña o nula. La tinción inmunohistoquímica para la proteína EGF-R fue negativa. Estos resultados indican que el epitelio nasal de rata de control contiene células caliciformes intactas que contienen proteína MUC5AC en ausencia de expresión del gen de la mucina. La ausencia de tinción en la luz sugiere que no estaba presente la desgranulación (secreción) de mucinas.
Se propuso la hipótesis de que el epitelio nasal de rata no estimulado contiene células caliciformes "estables" sin desgranulación que contienen proteínas de mucina. Se ha demostrado que los quimioatrayentes de neutrófilos (por ejemplo, fMLP) reclutan neutrófilos en el epitelio de las vías respiratorias, donde producen desgranulación de GC a través de un proceso dependiente de elastasa. Para examinar el efecto de la desgranulación de GC, se administró por vía intranasal un aerosol del quimioatrayente de neutrófilos fMLP (10^{-7} M) durante 5 minutos. En ratas sacrificadas 4 horas después de fMLP, se redujeron notablemente el área teñida con AB/PAS y el área de inmunotinción positiva con MUC5AC y se produjo reclutamiento de neutrófilos en el epitelio nasal. La tinción de AB/PAS fue prominente en la superficie en contacto con la luz de las vías respiratorias nasales, confirmando que había tenido lugar la desgranulación de GC. A las 4 horas después de fMLP, sin embargo, la expresión del gen de MUC5AC no había cambiado.
En ratas sacrificadas 48 horas después de fMLP, la tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo de EGF-R fue positiva para EGF-R en células precaliciformes y caliciformes y el área de tinción inmunopositiva para AB/PAS y MUC5AC volvió al nivel presente en el estado control, indicando que se había producido regranulación de GC nasal. En este momento, ya no estaba presente el reclutamiento de neutrófilos; la expresión del gen MUC5AC era visible en el área ocupada por GC, indicando que la regranulación de GC estaba asociada con un aumento de la expresión del gen de mucina.
Papel de la fosforilación de tirosina quinasa de EGF-R en la regranulación de células caliciformes. Ciertos estudios previos realizados en ratas indicaron que la activación de receptores de EGF (EGF-R) conduce a la expresión del gen y la proteína de mucina. Para evaluar la hipótesis de que la activación de EGF-R juega un papel en la regranulación de GC nasal de rata después de fMLP, se pretrataron ratas (n = 5) con el inhibidor de tirosina quinasa de EGF-R selectivo BIBX1522; la aerosolización de fMLP produjo un reclutamiento de neutrófilos en el epitelio nasal y desgranulación de GC, pero 48 horas después las áreas de tinción de AB/PAS y tinción inmunopositiva para MUC5AC permanecieron reducidas. Estos resultados implican la activación de EGF-R en la síntesis de mucina de GC nasal después de la desgranulación por fMLP.
En el presente estudio se examinó la regulación de la producción de mucina en el epitelio nasal de rata. El epitelio de control contenía un número significativo de células caliciformes y la proteína MUC5AC estaba presente en estas células. Sin embargo, estaba ausente la expresión del gen MUC5AC. Se ha notificado que la expresión de mucina de MUC5AC se produce en otras células epiteliales de las vías respiratorias a través de la expresión de EGF-R y su activación. En células epiteliales nasales de rata de control, se descubrió que no había expresión de proteína ni del gen de EGF-R. No hubo tinción en la luz para AB/PAS o proteína MUC5AC, sugiriendo que no estaba teniendo lugar una desgranulación (secreción) significativa de las células caliciformes. EGF-R podría estar regulada negativamente en las células caliciformes "estables", previniéndose la síntesis adicional de mucina. Por lo tanto, se "expusieron" las células caliciformes nasales por inducción de la desgranulación de células caliciformes y se examinaron los cambios posteriores en la estructura epitelial de las vías respiratorias.
Los quimioatrayentes de neutrófilos producen desgranulación de células caliciformes dependiente de neutrófilos en las vías respiratorias de cobayas y de seres humanos mediada por elastasa de neutrófilos, lo cual implica un contacto estrecho entre los neutrófilos y las células caliciformes. Para inducir la desgranulación de células caliciformes presentes normalmente en el tabique nasal, el quimioatrayente fMLP se inhaló por vía intranasal reclutando neutrófilos en el epitelio nasal seguido de desgranulación de las células caliciformes; el área teñida con azul alcián/PAS se redujo notablemente.
A continuación se examinaron los acontecimientos posteriores en el epitelio nasal después de la desgranulación de GC inducida por fMLP. A las 4 horas después administrar fMLP, cuando se había producido la desgranulación máxima de las GC nasales, estaba ausente la expresión de EGF-R y MUC5AC. Sin embargo, 48 horas después de fMLP, EGF-R se expresaba fuertemente en las células precaliciformes y caliciformes. La expresión del gen de MUC5AC ahora se expresaba fuertemente en el epitelio y estos acontecimientos estaban asociados con la regranulación de las células caliciformes (aumento de la tinción de AB/PAS y MUC5AC). De hecho, 48 horas después de fMLP, se había producido regranulación hasta el punto de que el área de las células caliciformes era similar al estado de control. Estos descubrimientos sugieren que la desgranulación de GC conduce a la expresión y activación de EGF-R, induciendo de esta manera la expresión de MUC5AC de mucina.
Para examinar el papel de la activación de la tirosina quinasa de EGF-R en la regranulación de GC, se pretrataron animales con un inhibidor selectivo de tirosina quinasa de EGF-R, BIBX1522. En los animales pretratados con BIBX1522, fMLP producía desgranulación de GC. Sin embargo, el pretratamiento con BIBX1522 previno la regranulación de las GC y su expresión de la proteína MUC5AC. Estos resultados implican la activación de EGF-R en el desarrollo de mucinas después de la desgranulación de GC. En ratas libres de patógenos las células caliciformes son "inactivas" (es decir, sin desgranulación) y el EGF-R está regulado negativamente. Cuando una inflamación (por ejemplo, estimulación de la infiltración de neutrófilos) produce desgranulación de GC y secreción de mucina, la regulación positiva y activación de EGF-R reaprovisiona al epitelio de las vías respiratorias con mucinas. Los presentes descubrimientos sugieren que los inhibidores selectivos de tirosina quinasa de EGF-R pueden ser útiles para prevenir la hipersecreción en enfermedades nasales.
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1. Uso de un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), donde dicho antagonista de EGF-R es un inhibidor de tirosina quinasa selectivo para EGF-R, un anticuerpo que se une específicamente a un EGF-R o una molécula antisentido específica para una secuencia que codifica EGF o un EGF-R.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el antagonista inhibe la transfosforilación de EGF-R.
4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el antagonista se administra por inyección.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, donde el antagonista se administra por vía intravenosa con un vehículo en forma de una solución salina normal.
6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el antagonista se administra por inhalación.
7. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el antagonista se administra mediante el suministro de liposomas.
8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde dicho liposoma se estabiliza estéricamente y se administra por vía intravenosa.
9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-8, donde dicho antagonista de EGF-R se selecciona de PD 153035, CP-358.774, CGP 59326, CGP 60261, CGP 62706, ZD-1839, PD-0183805 y PD-153035.
10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde dicho antagonista de EGF-R es ZD-1839.
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