ES2310701T3 - Metodos para mejorar la conformacion de proteinas por medio de agentes reductores. - Google Patents
Metodos para mejorar la conformacion de proteinas por medio de agentes reductores. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para purificar una proteína NS3 de HCV expresada recombinantemente, que contiene cisteína, que comprende las etapas (a) y (c) y al menos una de las siguientes etapas (b), (d) o (e): (a) sulfonar un lisado de células hospedantes recombinantes, (b) tratar con un detergente bipolar, preferiblemente después de eliminar el desecho celular, (c) purificar la versión sulfonada de la proteína recombinante, o purificar la versión sulfonada de la proteína recombinante, eliminando después el detergente, (d) desulfonar la proteína recombinante sulfonada, (e) almacenar en presencia de un exceso molar de DTT, o usar inmediatamente en un ensayo.
Description
Métodos para mejorar la conformación de
proteínas por medio de agentes reductores.
La presente invención se refiere al campo del
diagnóstico y tratamiento de infección por HCV. Más particularmente,
la presente invención se refiere a NS3 helicasa de HCV, y a sus
usos. También, la presente invención se refiere a ensayos mejorados
de inmunodiagnóstico.
Los virus de la hepatitis C (HCV) constituyen un
género dentro de la familia de Flaviviridae, con una homología muy
cercana a los virus de la hepatitis G y GB, y los Pestivirus. El
genoma de ARN de hebra positiva codifica al menos 9 proteínas. El
núcleo, E1 y E2 constituyen las proteínas estructurales. NS2, NS3,
NS4A, NS4B, NS5A y NS5B son proteínas no estructurales (NS). Las
cepas clínicas de HCV presentan niveles elevados de heterogeneidad
de secuencia, permitiendo la clasificación en al menos 11 tipos y 90
subtipos (Maertens y Stuyver, 1997). A menudo, la infección por HCV
del hígado humano es clínicamente benigna, con una suave ictericia
en la fase aguda. La enfermedad incluso puede pasar desapercibida
en algunos casos de hepatitis C de resolución aguda. Sin embargo,
en la mayoría de los casos (>70%) la infección por HCV conduce a
una infección crónica persistente o activa, a menudo con
complicaciones de cirrosis hepática y trastornos autoinmunitarios.
El carcinoma hepatocelular puede aparecer después de alrededor de
20 a 35 años (Saito et al., 1990), algunas veces incluso sin
la fase intermedia de la cirrosis. Actualmente no existe ninguna
profilaxis, y el tratamiento con interferón-\alpha
(IFN-\alpha) sólo conduce a una resolución a
largo plazo en alrededor de 4 a 36% de los casos tratados,
dependiendo del genotipo del HCV (Maertens y Stuyver, 1997).
Puesto que actualmente no existen métodos de
cultivo productivos para HCV, y puesto que sólo circulan en el
paciente infectado cantidades minúsculas de antígenos de HCV, la
detección directa de las partículas de HCV no se puede realizar de
forma ordinaria, y el diagnóstico indirecto sólo es posible usando
técnicas de amplificación incómodas para la detección de ARN de
HCV. A diferencia de muchas otras infecciones víricas, las
partículas de HCV generalmente persisten en la sangre, el hígado y
en los linfocitos, a pesar de la presencia de una respuesta
inmunitaria humoral y celular a la mayoría de las proteínas de HCV.
Los anticuerpos del HCV se pueden detectar convenientemente
mediante las técnicas de ELISA, que permiten la detección
sistemática con muy buen rendimiento en bancos de sangre y en
laboratorios clínicos. Se requieren pruebas suplementarias de
anticuerpos, y actualmente es obligatorio en la mayoría de los
países. De este modo se discrimina la verdadera reactividad del HCV
de la falsa reactividad, que puede estar provocada por la unión no
específica de inmunoglobulinas del suero o del plasma o de
componentes antiidiotípicos a los reactivos de revestimiento o de
bloqueo, o a contaminantes presentes en las preparaciones de
antígenos de HCV, o incluso a partes de fusión o regiones no
específicas de los propios antígenos recombinantes (McFarlane et
al., 1990). La detección de ARN de HCV mediante técnicas de PCR
o de ADN ramificado (ADNb) se ha introducido recientemente para
monitorizar la enfermedad crónica por HCV, especialmente durante la
terapia. Sorprendentemente, la detección de ARN de HCV se emplea
algunas veces para confirmar ensayos de detección sistemática de Ab
de HCV a pesar del hecho de que sólo \sim70-94%
de las muestras de pacientes repetidamente positivos de Ab de HCV
son positivas mediante PCR interna o anidada (Marin et al.,
1994). De los donantes de sangre positivos de Ab de HCV, quienes
habitualmente presentan formas más suaves de la enfermedad y
niveles bajos de ARN de HCV, la confirmación mediante PCR interna o
anidada es habitualmente del orden de \sim40% (Waumans et
al., 1993; Stuyver et al., 1996). Por lo tanto, los
ensayos a base de bandas proporcionan la única alternativa fiable
para la confirmación de Ab de HCV. Incluso en el caso de un
resultado indeterminado en el ensayo de confirmación, es aconsejable
el seguimiento serológico del paciente en lugar de la detección de
ARN de HCV (Di Bisceglie et al., 1998). Puesto que los
antígenos nativos de HCV no están disponibles en cantidades
suficientes, tales ensayos de confirmación incorporan péptidos
sintéticos y/o fragmentos recombinantes de proteínas de HCV. Una de
las cuestiones más críticas en la confirmación de anticuerpos lo
constituye la reactividad de la proteína NS3 (Zaaijer et al.,
1994). Los anticuerpos NS3 a menudo aparecen primero en la serie de
seroconversión, y la reactividad de la proteína NS3 parece ser
diferente en los diferentes ensayos comerciales disponibles
actualmente.
La inmunogenética introdujo el concepto de
tecnología de bandas en la que habitualmente se aplica una
combinación de péptidos sintéticos y de proteínas recombinantes
como líneas discretas de una manera ordenada y fácilmente legible.
Los ensayos de Ab de VIH INNO-LIA han demostrado ser
superiores a los usados normalmente en inmunotransferencias Western
(Pollet et al., 1990). El Inmunoensayo de Línea permite el
ensayo de múltiples parámetros y, de este modo, permite la
incorporación de sistemas de corte y de otros sistemas de
valoración, permiten el control de la adición de muestras, así como
el ensayo de la reactividad falsa de proteínas que no son de HCV
usadas como un soporte o pareja de fusión requeridas para algunos
antígenos en el ensayo de Elisa. En principio, el formato de ensayo
permite combinar antígenos de diferentes agentes etiológicos o
condiciones fenotípicamente ligadas en un único ensayo.
El INNO-LIA HCV Ab III es un
Inmunoensayo de Línea de 3ª generación que incorpora antígenos de
HCV derivados de la región central, de la región hipervariable E2
(HVR), de la región de NS3 helicasa, y de las regiones NS4A, NS4B y
NS5A. En el ensayo de tercera generación, la proteína NS3 de subtipo
1b recombinante muy pura, y los péptidos E2, permitieron una
sensibilidad superior a la vez que salvaguardaban la especificidad
fiable que es característica de los ensayos a base de péptidos
(Peeters et al., 1993). Quizás una de las características
más importantes de este ensayo es su correlación sin precedentes con
la positividad de ARN de HCV (Claeys et al., 1992; De
Beenhouwer, et al., 1992).
Los antígenos se revisten como 6 líneas
discretas en una banda de nailon con un soporte posterior de
plástico. Además, en cada banda se revisten cuatro líneas de
control: antiestreptavidina, 3+ controles positivos
(anti-Ig humana), 1+ control positivo (IgG humana),
y la línea de corte (IgG humana). Se incuba una muestra de ensayo
diluida en un recipiente colector junto con la banda de LIA III. Si
están presentes en la muestra, los anticuerpos de HCV se unirán a
las líneas del antígeno de HCV en la banda. Subsiguientemente, se
añade un conjugado anti-IgG humana (H+L) de cabra
marcado con fosfatasa alcalina y purificado por afinidad, y se hace
reaccionar con los complejos de antígeno/anticuerpo de HCV, si se
han formado previamente. La incubación con el sustrato de la enzima
produce un color de tipo castaño, cuya intensidad es proporcional a
la cantidad de anticuerpo específico de HCV capturado de la muestra
en cualquier línea dada. El desarrollo del color se detiene con
ácido sulfúrico. Si no hay anticuerpos específicos de HCV, el
conjugado sólo se une a las líneas de control, 1+ y 3+. Si se omite
la adición de la muestra, sólo se teñirán las líneas de control y
1+.
La expresión proteínas eucariotas que contienen
cisteína, que puede formar enlaces de disulfuro en la proteína
activa nativa, conduce a menudo a la formación de cuerpos de
inclusión caracterizados por enlaces de disulfuro inter- e
intramoleculares no nativos. Las diferentes etapas y métodos de
aislamiento y renaturalización de enlaces de disulfuro de
polipéptidos eucariotas recombinantes expresados en Escherichia
coli como cuerpos de inclusión se han repasado en Fischer et
al. (Biotechnology and bioengineering 41:3-13,
1993). Los ejemplos específicos de tales métodos para la expresión
recombinante de proteínas de mamíferos en sistemas de expresión
bacterianos se describen en los documentos EP 0346500, EP 0361830,
US 4.616.078, WO 95/30686, DiBella et al. (Journal of
Biological Chemistry 270:163-169, 1995) y Masuda
et al. (Protein Engineering 9:101-106,
1996).
Las siguientes descripciones sirven para
ilustrar los diferentes términos y expresiones usados en la presente
invención.
La expresión "proteína NS3 de HCV" se
refiere a un polipéptido o a un análogo del mismo (por ejemplo,
mimótopos) que comprende una secuencia de aminoácidos (y/o análogos
de aminoácidos) que definen al menos un epítopo de HCV de NS3
proteasa o helicasa de HCV.
También se debe entender que las cepas clínicas
(muestras biológicas) usadas en la sección de ejemplos de la
presente invención no estaban destinadas a limitar el alcance de la
invención, y que cualquier cepa clínica de HCV que pertenezca al
tipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o cualquier otro nuevo
genotipo de HCV es una fuente adecuada de secuencia de HCV para la
práctica de la presente invención.
Los antígenos de HCV, usados en la presente
invención, pueden ser proteínas víricas de longitud completa,
versiones de longitud sustancialmente completa de las mismas, o
fragmentos funcionales de las mismas (por ejemplo, fragmentos a los
que no les falta ninguna secuencia esencial para la formación o
retención de un epítopo). Además, los antígenos de HCV de la
presente invención pueden incluir también otras secuencias que no
bloqueen o eviten la formación de cualquier epítopo conformacional
de interés. La presencia o ausencia de un epítopo conformacional se
puede determinar fácilmente mediante identificación sistemática del
antígeno de interés con un anticuerpo (anticuerpo monoclonal o
sérico policlonal), y comparando su reactividad con la de una
versión desnaturalizada del antígeno que retiene sólo epítopos
lineales (si los hay). Cuando se usan anticuerpos policlonales en
tal identificación sistemática, puede ser ventajoso adsorber el
suero policlonal primeramente con el antígeno desnaturalizado y
observar si retiene anticuerpos para el antígeno de interés.
La expresión "polipéptido de fusión" quiere
decir un polipéptido en el que el antígeno o antígenos, en
particular el antígeno o antígenos de HCV, son parte de una única
cadena continua de aminoácidos, cadena la cual no se encuentra en
la naturaleza. Los antígenos de HCV pueden estar conectados
directamente entre sí mediante enlaces peptídicos, o pueden estar
separados mediante secuencias de aminoácidos espaciadoras. Los
polipéptidos de fusión también pueden contener secuencias de
aminoácidos exógenas al HCV.
El término "purificada", como se aplica a
las proteínas de este documento, se refiere a una composición en la
que la proteína deseada comprende al menos 35% del componente
proteínico total en la composición. La proteína deseada comprende
preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos
alrededor del 50%, más preferiblemente al menos alrededor del 60%,
aún más preferiblemente al menos alrededor del 70%, incluso más
preferiblemente al menos alrededor del 80%, incluso más
preferiblemente al menos alrededor del 85%, incluso más
preferiblemente al menos alrededor del 90%, y lo más preferible al
menos alrededor del 95% del componente proteínico total. La
composición puede contener otros compuestos tales como hidratos de
carbono, sales, lípidos, disolventes, y similares, sin que afecten
a la determinación del porcentaje de pureza como se usa en este
documento. Una proteína de HCV "aislada" significa una
composición proteínica de HCV que tiene una pureza de al menos
35%.
La expresión "proteínas esencialmente
puras" se refiere a proteínas purificadas de forma que se pueden
usar para métodos de diagnóstico in vitro y como un
compuesto terapéutico. Estas proteínas están sustancialmente libres
de proteínas o ADN celular, de proteínas o ADN derivados de
vectores, o de otros componentes víricos de HCV. Habitualmente,
estas proteínas se purifican hasta homogeneidad (al menos 80% puras,
preferiblemente 85%, más preferiblemente 90%, más preferiblemente
95%, más preferiblemente 97%, más preferiblemente 98%, más
preferiblemente 99%, incluso más preferiblemente 99,5%, y lo más
preferible las proteínas contaminantes deben ser indetectables por
métodos convencionales como SDS-PAGE y tinción con
plata.
La expresión "expresada recombinantemente",
usada en el contexto de la presente invención, se refiere al hecho
de que las proteínas de la presente invención se producen mediante
métodos de expresión recombinantes, sea en procariotas o sea en
eucariotas inferiores o superiores, como se expone con detalle más
abajo.
El término "polipéptido" se refiere a un
polímero de aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica
del producto; de este modo, dentro de la definición de polipéptido
se incluyen péptidos, oligopéptidos y proteínas. Este término
tampoco se refiere o excluye modificaciones
post-expresión del polipéptido, por ejemplo,
glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Dentro
de la definición se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que
contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por
ejemplo, aminoácidos no naturales, PNA, etc.), polipéptidos con
enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la
técnica, tanto de origen natural como de origen no natural.
La expresión "polinucleótido o ácido nucleico
recombinante" está destinada a un polinucleótido o ácido nucleico
de origen genómico, de ADNc, semisintético o sintético, que, en
virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o
una parte de un polinucleótido con el que está asociado en la
naturaleza, (2) está enlazado a un polinucleótido distinto del que
está enlazado en la naturaleza, o (3) no existe en la
naturaleza.
La expresión "células hospedantes
recombinantes", "células hospedantes", "células",
"estirpes celulares", "cultivos celulares", y otros tales
términos que representan a microorganismos o estirpes celulares
eucariotas superiores, cultivados como entidades unicelulares, se
refiere a células que se pueden usar o se han usado como receptores
de un vector recombinante o de otro polinucleótido de transferencia,
e incluye a la progenie de la célula original que se ha
transfectado. Se entenderá que la progenie de una célula progenitora
individual no necesariamente tiene que ser idéntica de forma
completa en morfología o complemento de ADN total o genómico como
el progenitor original, debido a mutación natural, accidental o
deliberada.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un método para purificar proteínas NS3 de HCV
recombinantes que contienen cisteína.
Se considera que el objeto de la presente
invención se ha cumplido mediante las realizaciones expuestas a
continuación.
Como se demuestra en la sección de los Ejemplos,
se ha encontrado que la presencia de un agente reductor, tal como
DTT, aparte de un antígeno revestido a una fase sólida, hace al
antígeno acoplado al inmunoensayo en fase sólida mucho más reactivo
con anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno. También, en
disolución, el antígeno se hace más reactivo por reducción.
Un agente reductor, según la presente invención,
es cualquier agente que logra la reducción de los puentes disulfuro
S-S. La reducción de los puentes disulfuro
"S-S" es una reacción química mediante la cual
los disulfuros se reducen a tiol (-SH). Los agentes y métodos para
romper puentes de disulfuro, descritos en el documento WO 96/04385,
se incorporan aquí como referencia en la presente descripción. La
reducción de S-S' se puede obtener (1) mediante
rutas de cascadas enzimáticas, o (2) mediante compuestos reductores.
Se sabe que enzimas como tiorredoxina, glutarredoxina, están
implicadas en la reducción in vivo de disulfuros, y también
se ha demostrado que son eficaces reduciendo puentes de
"S-S" in vitro. Los enlaces de disulfuro
se rompen rápidamente mediante ruptura por tiorredoxina reducida, a
pH 7,0, con una velocidad aparente de segundo orden que es alrededor
de 10^{4} veces más grande que la constante de velocidad
correspondiente para la reacción con DTT. La cinética de la
reducción se puede aumentar dramáticamente mediante la preincubación
de la disolución proteínica con 1 mM de DTT o dihidrolipoamida
(Holmgren, 1979).
Los compuestos tiólicos capaces de reducir los
puentes de disulfuro de las proteínas son, por ejemplo, ditiotreitol
(DTT), ditioeritritol (DTE),
\beta-mercaptoetanol, tiocarbamatos,
bis(2-mercaptoetil)sulfona y
N,N'-bis-(mercaptoacetil)hidrazina, y
ditionito de sodio.
También se pueden usar, para la reducción de
NS3, agentes reductores sin grupos tiólicos, como ascorbato o
cloruro estannoso (SnCl_{2}), que han demostrado ser muy útiles en
la reducción de puentes de disulfuro en anticuerpos monoclonales
(Thakur et al., 1991). Se ha demostrado que el tratamiento
con borohidruro de sodio es eficaz para la reducción de puentes de
disulfuro en péptidos (Gailit, 1993). La
tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) es
capaz de reducir los puentes de disulfuro a pH bajo (Burns et
al., 1991). El selenol cataliza la reducción de disulfuro a
tioles, cuando se usan como agentes reductores DTT o borohidruro de
sodio. La selenocisteamina, un diselenuro comercialmente
disponible, se usó como precursor del catalizador (Singh y Kats,
1995).
La sulfonación y desulfonación es una reacción
mediante la cual se introducen o se eliminan, respectivamente los
grupos -SO_{3} de la proteína.
La sulfonación se define como un proceso en el
que los grupos tiol (SH) en las proteínas (R), y los enlaces
disulfuro, se convierten a S-sulfonatos, según las
siguientes reacciones:
(1)RSH
\rightarrow
RS-SO_{3}^{-}
(2)RS-SR +
2-SO_{3}^{-} + H_{2}O \rightarrow 2
RS-SO_{3}^{-} + 2
OH^{-}
Los productos de las reacciones son
S-sulfoproteínas que son estables habitualmente a pH
neutro. La reacción (1) se puede obtener incubando la disolución
proteínica con tetrationato a pH > 7 (Inglis y Liu, 1970). La
reacción (2) transcurre hasta su terminación, en presencia de iones
cobre (Cole, 1967). Chan (1968) ha demostrado que el tratamiento de
la proteína con sulfito sódico y con cantidades catalíticas de
cisteína en presencia de oxígeno da sulfoproteínas.
La desulfonación se puede obtener (1) mediante
un exceso de grupos -SH (tiol) competitivos, (2) mediante agentes
reductores, o (3) mediante incubación en condiciones de pH no
neutro.
RS-SO_{3}^{-}
+ R'SH \rightarrow RSH +
R'S-SO_{3}^{-}
RS-SO_{3}^{-}
+ agente reductor \rightarrow
RSH
Los grupos tioles competitivos se pueden obtener
a partir de compuestos de bajo peso molecular, o a partir de grupos
-SH proteinosos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos de compuestos que contienen mono- o
ditioles son:
- cisteína, cisteamina, glutationa reducida, N-acetilcisteína, homocisteína, \beta-mercaptoetanol, tiocarbamatos, bis(2-mercaptoetil)sulfona (BMS) y N,N'-bis(mercaptoacetil)hidrazina (BMH), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB o reactivo de Elman), ditiotreitol (DTT) y ditioeritritol (DTE).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere además a un
método para purificar una proteína NS3 de HCV expresada
recombinantemente, que contiene cisteína, que comprende las etapas
(a) y (c) y al menos una de las siguientes etapas (b), (d) o
(e):
- (a)
- sulfonar un lisado procedente de células hospedantes recombinantes o de la lisis de células hospedantes recombinantes en presencia de cloruro de guanidinio (preferiblemente Gu.HCl 6 M), y la sulfonación del lisado celular,
- (b)
- tratar con un detergente bipolar, preferiblemente después de la eliminación del desecho celular,
- (c)
- purificar la proteína recombinante sulfonada, o la purificación de la proteína recombinante sulfonada con la eliminación subsiguiente del detergente bipolar, realizándose dicha purificación mediante cromatografía, más preferiblemente una cromatografía Ni-IMAC, siendo dicha proteína recombinante una proteína recombinante marcada con His,
- (d)
- desulfonar la proteína recombinante sulfonada, preferiblemente con un exceso molar de un agente reductor tal como DTT,
- (e)
- almacenar en presencia de un exceso molar de DTT o usar inmediatamente en un ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Empigen es un ejemplo particularmente preferido
de un detergente bipolar. Se ha encontrado que la inclusión de tal
detergente bipolar y de DTT mejora el protocolo de purificación para
las proteínas NS3 helicasa de HCV.
La presente invención también se refiere a
cualquier método para producir y usar dichas poliproteínas de la
invención. En el documento WO 96/13590 se describen métodos para
producir y usar poliproteínas de HCV. Dichos usos incluyen no sólo
los usos para diagnóstico, sino también los usos terapéuticos y
profilácticos. Las proteínas NS3 de la invención también son
particularmente adecuadas para ser incorporadas en composiciones de
vacunas. Dicha composición de vacuna puede contener, además del
ingrediente activo, cualquier tipo de adyuvante conocido en la
técnica. Las proteínas de NS3 de la presente invención también se
pueden usar en cualquier aplicación en la que sea aplicable usar
una NS3 helicasa, tal como para los fines de identificación
sistemática de fármacos.
Figura 1. Secuencia de aminoácidos de clones de
NS3 de HCV aislados de sueros infectados con el subtipo 1a y 1b de
HCV.
Figura 2-1. Secuencia
codificante de ADN de la proteína de fusión del clon 19b de
mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una
secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de
mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 2-2. Secuencia de
aminoácidos de la proteína de fusión del clon 19b de mTNFH6NS3. La
secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3.
Esta secuencia contiene a la pareja de fusión de mTNF, el marcador
de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 3-1. Secuencia de
codificación de ADN de la proteína de fusión del clon B9 de
mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una
secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de
mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 3-2. Secuencia de
aminoácidos de la proteína de fusión del clon B9 de mTNFH6NS3. La
secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3.
Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de
hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 4-1. Secuencia
codificante de ADN de la proteína de fusión del clon 21 de tipo 3a
de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una
secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de
mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 4-2. Secuencia de
aminoácidos de la proteína de fusión del clon 21 de tipo 3a de
mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una
secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de
mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 5-1. Secuencia de
codificación de ADN de la proteína de fusión del clon 32 de tipo 3a
de mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una
secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de
mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 5-2. Secuencia de
aminoácidos de la proteína de fusión del clon 32 de tipo 3a de
mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una
secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de
mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 6-1. Secuencia de
codificación de ADN de la proteína de fusión de tipo 2a de
mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una
secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de
mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 6-2. Secuencia de
aminoácidos de la proteína de fusión de tipo 2a de mTNFH6NS3. La
secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3.
Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de
hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 7-1. Secuencia de
codificación de ADN de la proteína de fusión de tipo 2b de
mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una
secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de
mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 7-2. Secuencia de
aminoácidos de la proteína de fusión de tipo 2b de mTNFH6NS3. La
secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3.
Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de
hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 8-1. Secuencia de
codificación de ADN de la proteína de fusión de tipo 2c de
mTNFH6NS3. La secuencia representada en letra negrita es una
secuencia no NS3. Esta secuencia codifica la pareja de fusión de
mTNF, el marcador de hexahistidina y parte del multiligador.
Figura 8-2. Secuencia de
aminoácidos de la proteína de fusión de tipo 2c de mTNFH6NS3. La
secuencia representada en letra negrita es una secuencia no NS3.
Esta secuencia codifica la pareja de fusión de mTNF, el marcador de
hexahistidina y parte del multiligador.
Los Ejemplos 1 a 7, 9 y 10 tienen sólo fines
ilustrativos.
El dominio de NS3 helicasa (aminoácidos
1188-1465) se amplificó mediante
RT-PCR a partir de suero IG8309 del HCV de subtipo
1b (Innogenetics, Ghent, Bélgica), usando cebadores HCPr59
oligonucleotídicos sintéticos
(5'-GGGCCCCACCATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTT-3')
(SEQ ID NO 1) y HCPr60 (5'-CTATTAGCTGAAA
GTCGACTGTCTGGGTGACAGCA-3') (SEQ ID NO 2). Esto produjo un fragmento 19 de PCR, que se clonó en E. coli. El cebador HCPr59 de sentido introduce un sitio de restricción ApaI que incluye una metionina artificial. El oligonucleótido HCPr60 antisentido introduce un codón de parada después de aa 1465. El fragmento de PCR se cortó subsiguientemente con ApaI, y el fragmento de ApaI resultante de 833 pb se clonó en el vector de expresión cortado con pmTNFHRP (Innogenetics, Ghent, Bélgica). Se secuenciaron cuatro clones de hepatitis C (HCCl) HCC119a y HCC119b (véase la secuencia de aminoácidos deducida, dada en la Figura 1 y en la Figura 2-2). El clon HCC119b (pmTiNTHRPHCC119b) se retuvo para una subclonación posterior.
GTCGACTGTCTGGGTGACAGCA-3') (SEQ ID NO 2). Esto produjo un fragmento 19 de PCR, que se clonó en E. coli. El cebador HCPr59 de sentido introduce un sitio de restricción ApaI que incluye una metionina artificial. El oligonucleótido HCPr60 antisentido introduce un codón de parada después de aa 1465. El fragmento de PCR se cortó subsiguientemente con ApaI, y el fragmento de ApaI resultante de 833 pb se clonó en el vector de expresión cortado con pmTNFHRP (Innogenetics, Ghent, Bélgica). Se secuenciaron cuatro clones de hepatitis C (HCCl) HCC119a y HCC119b (véase la secuencia de aminoácidos deducida, dada en la Figura 1 y en la Figura 2-2). El clon HCC119b (pmTiNTHRPHCC119b) se retuvo para una subclonación posterior.
Partiendo del vector pmTNFHRPHCC119b, la
secuencia de codificación del clon 19b de NS3 se aisló como un
fragmento NcoI de 900 pb y se insertó en el vector de expresión
pEmTNFMPH cortado con NcoI (Innogenetics, Ghent, Bélgica), dando
como resultado el vector pEmTNFNFPHHCC119b. Este plásmido expresa el
clon 19b de NS3 de HCV como una proteína de fusión
N-terminal con los 25 aa
N-terminales de TNF murino seguido de un marcador de
purificación de hexahistidina y un sitio de ruptura con ácido
fórmico (SEQ ID NO 19 y 20; Figura 2).
Se transformaron las células de la cepa
MC1061(pAcI) de E. coli (Wertman et al., 1986)
con el plásmido
pEmTNFMPHHCC119b. Las células MC 1061 (pAcI) que albergan al pEmTNFMPHHCC119b se hicieron crecer toda la noche en caldo de Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 23ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD_{600} de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Dos a tres horas después de la inducción, las células se cosecharon. La expresión de la proteína de fusión del clon 19b de NS3 de HCV se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
pEmTNFMPHHCC119b. Las células MC 1061 (pAcI) que albergan al pEmTNFMPHHCC119b se hicieron crecer toda la noche en caldo de Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 23ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD_{600} de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Dos a tres horas después de la inducción, las células se cosecharon. La expresión de la proteína de fusión del clon 19b de NS3 de HCV se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
El dominio de NS3 helicasa (aminoácidos
1188-1465) se amplificó mediante
RT-PCR a partir de suero IG21054 de HCV de subtipo
1a (Innogenetics, Ghent, Bélgica), usando cebadores
oligonucleotídicos sintéticos HCPr59
(5'-GGGCCCCACCATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTT-3')
(SEQ ID NO 1) y HCPr60 (5'-CTATTAGCTGAAA
GTCGACTGTCTGGGTGACAGCA-3') (SEQ ID NO 2). Esto produjo un fragmento B de PCR que se clonó en E. coli. El cebador HCPr59 de sentido introduce un sitio de restricción de ApaI que incluye una metionina artificial. El oligonucleótido HCPr60 antisentido introduce un codón de parada después del aa 1465. El fragmento de PCR se clonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). Se secuenciaron cuatro clones: B7, B9, B12, y B14 (véanse las secuencias de aminoácidos deducidas, en la Figura 1 y en la Figura 3-2). El clon B9 (pGEMTNS3B9) se retuvo para una subclonación posterior.
GTCGACTGTCTGGGTGACAGCA-3') (SEQ ID NO 2). Esto produjo un fragmento B de PCR que se clonó en E. coli. El cebador HCPr59 de sentido introduce un sitio de restricción de ApaI que incluye una metionina artificial. El oligonucleótido HCPr60 antisentido introduce un codón de parada después del aa 1465. El fragmento de PCR se clonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). Se secuenciaron cuatro clones: B7, B9, B12, y B14 (véanse las secuencias de aminoácidos deducidas, en la Figura 1 y en la Figura 3-2). El clon B9 (pGEMTNS3B9) se retuvo para una subclonación posterior.
Partiendo del vector pGEMTNS3B9, la secuencia de
codificación del clon B9 se aisló como un fragmento despuntado
mediante NcoI/SpeI de 850 pb y se insertó en el vector de expresión
pIGFH111 (Innogenetics, Ghent, Bélgica), cortado mediante
NcoI/StuI, dando como resultado el vector pIGFH111NS3B9. Este
plásmido expresa el clon B9 de NS3 de HCV como una proteína de
fusión N-terminal con los 25 aa
N-terminales de TNF murino, seguido de un
mar-
cador de purificación de hexahistidina y un sitio de ruptura mediante ácido fórmico (SEQ ID Nos. 21 y 22; Figura 3).
cador de purificación de hexahistidina y un sitio de ruptura mediante ácido fórmico (SEQ ID Nos. 21 y 22; Figura 3).
Se transformaron las células de la cepa MC106
(pAcI) de E. coli (Wertman et al., 1986) con el
plásmido
pIGFH111NS3B9. Las células MC 1061 (pAcI) que albergan al pIGFH111NS3B9 se hicieron crecer toda la noche en caldo de Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD_{600} de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Dos a tres horas después de la inducción, las células se cosecharon. La expresión de la proteína de fusión del clon B9 de NS3 de HCV se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
pIGFH111NS3B9. Las células MC 1061 (pAcI) que albergan al pIGFH111NS3B9 se hicieron crecer toda la noche en caldo de Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD_{600} de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Dos a tres horas después de la inducción, las células se cosecharon. La expresión de la proteína de fusión del clon B9 de NS3 de HCV se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones A26, C16 y D18 se aislaron de sueros
IG21051, IG17790 e IG21068, respectivamente, infectados con HCV
subtipo 1a, de forma similar a como se describió para el clon B9
usando los cebadores HCPr59 y HCPr60. Inicialmente, los clones A5,
A26, C1, C3, C4, C12, C16, D17, D18 y D19 se clonaron y se
secuenciaron (véanse las secuencias de aminoácidos deducidas dadas
en la Figura 1). Los clones A26, C16 y D18 se retuvieron para una
subclonación posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
El dominio de NS3 helicasa (aminoácidos
1188-1465) se amplificó mediante
RT-PCR a partir de sueros IG21349 e IG20014 de HCV
de subtipo 3a (Innogenetics, Ghent, Bélgica), usando cebadores
oligonucleotídicos sintéticos 403
(5'-GGGCCCCACCATAGGTGTAGCAAAAGCCCTACAGTT-3')
(SEQ ID NO 33) y 404 (5'-CTATTAGCT
GAAGTCAACGTACTGTTCAACAGC-3') (SEQ ID NO 34). Esto produjo en ambos casos un fragmento de PCR de aproximadamente 850 pb que se subclonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). A partir de cada fragmento de PCR clonado se secuenciaron varios clones, pero de cada suero sólo un fragmento clonado demostró ser completamente correcto al secuenciarlo. Este fue el clon 21 (pGEM-TNS3T3a.21) para el suero IG21349, y el clon 32 (pGEM-TNS3T3a.32) para el suero IG20014 (Figuras 4 y 5).
GAAGTCAACGTACTGTTCAACAGC-3') (SEQ ID NO 34). Esto produjo en ambos casos un fragmento de PCR de aproximadamente 850 pb que se subclonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). A partir de cada fragmento de PCR clonado se secuenciaron varios clones, pero de cada suero sólo un fragmento clonado demostró ser completamente correcto al secuenciarlo. Este fue el clon 21 (pGEM-TNS3T3a.21) para el suero IG21349, y el clon 32 (pGEM-TNS3T3a.32) para el suero IG20014 (Figuras 4 y 5).
Partiendo de los vectores
pGEM-TNS3T3a.21 y pGEM-TNS3T3a.32,
se aislaron las secuencias de codificación de los clones 21 y 32
como fragmentos de NcoI/SalI de 850 pb, y se insertaron en el vector
de expresión pIGFH111 (Innogenetics, Ghent, Bélgica), cortado
mediante NcoI/SalI, dando como resultado los vectores
pIGFH111NS3T3a.21 y pIGFH111NS3T3a.32, respectivamente. Estos
plásmidos expresan los clones 21 y 32 de NS3 de HCV de tipo 3a como
proteínas de fusión N-terminales con los 25 aa
N-terminales de TNF murino seguido de un marcador de
purificación de hexahistidina y de un sitio de ruptura mediante
ácido fórmico (SEQ ID Nos 23-26; Figuras 4 y 5).
Las células de la cepa MC1061(pAcI) de
E. coli (Wertman et al., 1986) se transformaron con
los plásmidos pIGFH111NS3T3a.21 y pIGFH111NS3T3a.32,
respectivamente. Las células MC1061(pAcI) que contienen
a
pIGFH111NS3T3a.21 o pIGFH111NS3T3a.32 se hicieron crecer toda la noche en caldo Luria (LB) suplementado con 10 g/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28 C hasta una OD600 de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Las células se cosecharon 2 a 3 horas después de la inducción. La expresión de las proteínas de fusión de los clones 21 y 32 de NS3 de HCV de tipo 3a se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
pIGFH111NS3T3a.21 o pIGFH111NS3T3a.32 se hicieron crecer toda la noche en caldo Luria (LB) suplementado con 10 g/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28 C hasta una OD600 de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Las células se cosecharon 2 a 3 horas después de la inducción. La expresión de las proteínas de fusión de los clones 21 y 32 de NS3 de HCV de tipo 3a se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
\vskip1.000000\baselineskip
El dominio de NS3 helicasa (aminoácidos
1188-1465) se amplificó mediante
RT-PCR a partir de un suero IG21342 (Innogenetics,
Ghent, Bélgica) de HCV de subtipo 2a, usando cebadores
oligonucleotídicos sintéticos 412 (6'-GGGCC
CCACCATGGGCGTGGCCAAGTCCATAGACTT-3') (SEQ ID NO 35) y 413 (5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAAC
TTGAGTGACCGC-3') (SEQ ID NO 36). Esto produjo un fragmento de PCR de aproximadamente 850 pb que se subclonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). Se secuenciaron varios clones, y el clon 3 (pGEM-TNS3T2a) se retuvo para una subclonación posterior (Figura 6).
CCACCATGGGCGTGGCCAAGTCCATAGACTT-3') (SEQ ID NO 35) y 413 (5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAAC
TTGAGTGACCGC-3') (SEQ ID NO 36). Esto produjo un fragmento de PCR de aproximadamente 850 pb que se subclonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). Se secuenciaron varios clones, y el clon 3 (pGEM-TNS3T2a) se retuvo para una subclonación posterior (Figura 6).
Partiendo del vector
pGEM-TNS3T2a, la secuencia de codificación del clon
3 se aisló como un fragmento de NcoI de 850 pb y se insertó en el
vector de expresión pIGFH111 (Innogenetics, Ghent, Bélgica) cortado
con NcoI, dando como resultado un vector pIGFH111S3T2a. Este
plásmido expresa el clon 3 de NS3 de HCV de tipo 2a como una
proteína de fusión N-terminal con los 25 aa
N-terminales de TNF murino seguido de un marcador de
purificación de hexahistidina y de un sitio de ruptura con ácido
fórmico (SEQ ID Nos 27 y 28; Figura 6).
Las células de la cepa MC1061(pAcI) de
E. coli (Wertman et al., 1986) se transformaron con el
plásmido
pIGFH111NS3T2a. Las células MC1061(pAcI) que contienen a pIGFH111NS3T2a se hicieron crecer toda la noche en caldo Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD600 de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Las células se cosecharon 2 a 3 horas después de la inducción. La expresión de las proteínas de fusión del clon 3 de NS3 de HCV de tipo 2a se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
pIGFH111NS3T2a. Las células MC1061(pAcI) que contienen a pIGFH111NS3T2a se hicieron crecer toda la noche en caldo Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD600 de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Las células se cosecharon 2 a 3 horas después de la inducción. La expresión de las proteínas de fusión del clon 3 de NS3 de HCV de tipo 2a se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
\vskip1.000000\baselineskip
El dominio de NS3 helicasa (aminoácidos
1188-1465) se amplificó mediante
RT-PCR a partir de un suero IG20192 (Innogenetics,
Ghent, Bélgica) de HCV de subtipo 2b, usando cebadores
oligonucleotídicos sintéticos 401 (5'-GGGCC
CCACCATGGGCGTAGCCAAATCCATTGACTT-3') (SEQ ID NO 37) y 402 (5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAAT
TTGAGAGACCGC-3') (SEQ ID NO 38). Esto produjo un fragmento de PCR de aproximadamente 850 pb que se subclonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). Se secuenciaron varios clones, y el clon 9 se retuvo para una subclonación posterior (Figura 7).
CCACCATGGGCGTAGCCAAATCCATTGACTT-3') (SEQ ID NO 37) y 402 (5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAAT
TTGAGAGACCGC-3') (SEQ ID NO 38). Esto produjo un fragmento de PCR de aproximadamente 850 pb que se subclonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). Se secuenciaron varios clones, y el clon 9 se retuvo para una subclonación posterior (Figura 7).
Partiendo del vector
pGEM-TNS3T2b, la secuencia de codificación del clon
9 se aisló como un fragmento de NcoI de 850 pb y se insertó en el
vector de expresión pIGFH11 (Innogenetics, Ghent, Bélgica) cortado
con NcoI, dando como resultado un vector pIGFH111NS3T2b. Este
plásmido expresa el clon 9 de NS3 de HCV de tipo 2b como una
proteína de fusión N-terminal con los 25 aa
N-terminales de TNF murino seguido de un marcador de
purificación de hexahistidina y de un sitio de ruptura con ácido
fórmico (SEQ ID Nos 29 y 30; Figura 7).
Las células de la cepa MC1061(pAcI) de
E. coli (Wertman et al., 1986) se transformaron con el
plásmido
pIGFH111NS3T2b. Las células MC1061(pAcI) que contienen a pIGFH111NS3T2b se hicieron crecer toda la noche en caldo Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD600 de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Las células se cosecharon 2 a 3 horas después de la inducción. La expresión de las proteínas de fusión del clon 9 de NS3 de HCV de tipo 2b se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
pIGFH111NS3T2b. Las células MC1061(pAcI) que contienen a pIGFH111NS3T2b se hicieron crecer toda la noche en caldo Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD600 de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Las células se cosecharon 2 a 3 horas después de la inducción. La expresión de las proteínas de fusión del clon 9 de NS3 de HCV de tipo 2b se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
\vskip1.000000\baselineskip
El dominio de NS3 helicasa (aminoácidos
1188-1465) se amplificó mediante
RT-PCR a partir de un suero IG20031 (Innogenetics,
Ghent, Bélgica) de HCV de subtipo 2c, usando cebadores
oligonucleotídicos sintéticos 401 (5'-GGGCC
CCACCATGGGCGTAGCCAAATCCATTGACTT-3') (SEQ ID NO 37) y 402 (5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAAT
TTGAGAGACCGC-3') (SEQ ID NO 38). Esto produjo un fragmento de PCR de aproximadamente 850 pb que se subclonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). Se secuenciaron varios clones, y el clon 14 (pGEM-TNS3T2c) se retuvo para una subclonación posterior (Figura 8).
CCACCATGGGCGTAGCCAAATCCATTGACTT-3') (SEQ ID NO 37) y 402 (5'-CTATTAGCTGAAGTCTACAAT
TTGAGAGACCGC-3') (SEQ ID NO 38). Esto produjo un fragmento de PCR de aproximadamente 850 pb que se subclonó subsiguientemente en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, US). Se secuenciaron varios clones, y el clon 14 (pGEM-TNS3T2c) se retuvo para una subclonación posterior (Figura 8).
Partiendo del vector
pGEM-TNS3T2c, la secuencia de codificación del clon
14 se aisló como un fragmento de NcoI de 850 pb y se insertó en el
vector de expresión pIGFH111 (Innogenetics, Ghent, Bélgica) cortado
con NcoI, dando como resultado un vector pIGFH111NS3T2c. Este
plásmido expresa el clon 14 de NS3 de HCV de tipo 2c como una
proteína de fusión N-terminal con los 25 aa
N-terminales de TNF murino seguido de un marcador
de purificación de hexahistidina y de un sitio de ruptura con ácido
fórmico (SEQ ID Nos 31 y 32; Figura 8).
Las células de la cepa MC1061(pAcI) de
E. coli (Wertman et al., 1986) se transformaron con el
plásmido
pIGFH111NS3T2c. Las células MC1061(pAcI) que contienen a pIGFH111NS3T2c se hicieron crecer toda la noche en caldo Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD600 de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Las células se cosecharon 2 a 3 horas después de la inducción. La expresión de las proteínas de fusión del clon 14 de NS3 de HCV de tipo 2c se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
pIGFH111NS3T2c. Las células MC1061(pAcI) que contienen a pIGFH111NS3T2c se hicieron crecer toda la noche en caldo Luria (LB) suplementado con 10 \mug/ml de tetraciclina a 28ºC. Los cultivos se diluyeron 20 veces en LB reciente, y después se hicieron crecer a 28ºC hasta una OD600 de 0,2, después de lo cual la temperatura se elevó hasta 42ºC. Las células se cosecharon 2 a 3 horas después de la inducción. La expresión de las proteínas de fusión del clon 14 de NS3 de HCV de tipo 2c se analizó mediante transferencia Western usando anticuerpos monoclonales específicos y sueros humanos positivos para HCV.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron nueve volúmenes de hidrocloruro de
guanidinio (Gu.HCl) 8 M y 1 volumen de NaHPO_{4} 0,2 M a cada
equivalente gramo de pasta celular húmeda de E. coli, y la
disolución se homogeneizó mediante remolino continuo. Se añadieron
Na_{2}S_{4}O_{6} y Na_{2}SO_{3} sólidos a la disolución
hasta una concentración final de 65 y 360 mM, respectivamente. Se
añadió CuSO_{4} (disolución madre: 0,1 M en NH_{3} al 25%) hasta
una concentración final de 100 \muM. La disolución se agitó toda
la noche en la oscuridad a temperatura ambiente y después de la
incubación, a -70ºC, se aclaró mediante centrifugación a 4ºC (30
minutos, 20.000 rpm, rotor JA20).
Al sobrenadante se le añadieron Empigen
BB^{TM} (Albright & Wilson Ltd., Okibury, UK) e imidazol hasta
una concentración final de 1% (p/v) y 20 mM, respectivamente. El pH
se ajustó hasta 7,2 con HCl 1 N. Se cargó una muestra que
corresponde a un equivalente de cultivo celular de 3 l a 2 ml/min en
una columna Ni-IDA Sepharose FF de 25 ml (columna
XK 16/20, Pharmacia, Upsala, Suecia), que se había equilibrado con
un tampón A que contiene 20 mM de imidazol (A: 50 mM de fosfato, 6
M de Gu.HCl, 1% Empigen, pH 7,2). La columna de
Ni-IDA Sepharose se lavó consecutivamente con:
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- tampón A que contiene 20 mM de imidazol
- -
- tampón A que contiene 35 mM de imidazol
- -
- tampón A que contiene 50 mM de imidazol
- -
- tampón B que contiene 50 mM de imidazol (tampón B: 50 mM de fosfato, 6 M de Gu.HCl, pH 7,2)
- -
- tampón B que contiene 200 mM de imidazol.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada etapa de lavado se mantuvo durante la
cromatografía hasta que la absorbancia a 280 nm alcanzó el nivel de
la línea base. La columna se regeneró con 50 mM de EDTA, 500 mM de
NaCl, pH 7,0.
Las fracciones se analizaron mediante
SDS-PAGE usando condiciones no reductoras y tinción
con plata. La proteína de fusión mTNF-NS3B9 se
recuperó en la elución de imidazol 200 mM. La transferencia Western,
que usa anti-TNF humano de conejo (1 \mug de
NS3/fila) y anti-E. coli de conejo (10 \mug de NS3/fila),
mostró que la proteína NS3 tenía una pureza de alrededor de 99%
después de esta única etapa de cromatografía.
Las fracciones de la elución de imidazol de 200
mM se reunieron y se desalaron.
Se cargó una muestra de eluato de
Ni-IDA de 40 ml a 10 ml/minuto en una columna de 300
ml Sephadex G25 (XK 50, Pharmacia, Upsala, Suecia), que se había
equilibrado con 50 mM de fosfato, 6 M de urea, 1 mM de EDTA, pH
7,2. Se recogieron fracciones de 10 ml, y la concentración de
proteína se determinó mediante el método micro BCA (Pierce,
Rockford, IL, US). La concentración de proteína se ajustó hasta 500
\mug/ml, con el tampón de desalado antes de la desulfonación y
reducción. El rendimiento global fue de 50-55 mg de
proteína de fusión de NS3 purificada/l de equivalente de
cultivo.
Finalmente, se añadió DTT (disolución madre: 100
mM en agua destilada) en un exceso molar de 100 veces frente al
contenido de cisteína en el antígeno de NS3 (por ejemplo, NS3 19b
contiene 7 cisteínas). La disolución se inundó con nitrógeno y se
incubó durante 1 h a 28ºC. La muestra de NS3 se diluyó
subsiguientemente en el tampón apropiado para el revestimiento con
ELISA y con LIA.
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de ensayar la reactividad de anticuerpos
de NS3 helicasa, se aplicó sobre bandas de membrana de nailon una
línea de 50 \mug/ml de disolución de antígeno de NS3 en disolución
salina tamponada con fosfato. Las bandas se secaron durante al
menos 1 hora a una temperatura entre 18 y 24ºC, y se bloquearon
subsiguientemente con PBS/caseína en presencia (10 mM) o en
ausencia del agente reductor DTT. Las bandas se lavaron
subsiguientemente con PBS que contiene Tween 20 y nada de DTT o 10
mM de DTT, y con agua que no contiene DTT o que contiene 10 mM de
DTT y 1 mM de EDTA. Las membranas se secaron durante 30 minutos y se
cortaron en bandas para el ensayo de diferentes muestras de
pacientes.
En la Tabla 1 se dan los resultados de un
experimento en el que las bandas se incubaron con el panel PHV903
de seroconversión anti-HCV (Boston Biomedica Inc.,
Boston, US).
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de ensayar la reactividad de anticuerpos
de NS3 helicasa, se revistieron placas de ELISA con los antígenos
de NS3 purificados según el Ejemplo 4, de la siguiente manera.
Los pocillos de la placa de microtitulación se
revistieron con proteína NS3 a una concentración de 0,3 \mug/ml
de proteína NS3 en tampón de revestimiento que contiene 50 mM de
tampón de carbonato, 200 mM de DTT o nada de DTT, y 1 mM de EDTA.
Las placas de microtitulación se incubaron durante 18 horas a 20ºC,
y se bloquearon con 300 \mul de PBS/tampón de caseína por
pocillo. Las placas se incubaron durante 2 horas a 20ºC y se fijaron
subsiguientemente con 300 \mul de tampón de fijación que contiene
200 mM de DTT o nada de DTT, y 1 mM de EDTA durante 2 horas a 20ºC.
En las Tablas 2 y 3 se muestran los resultados.
La Tabla 2 da los valores de señal a ruido de
ensayos que incluyen NS3 revestida y fijada con o sin DTT, con los
paneles PHV901 a PHV912 de seroconversión de BBI. La Tabla 3 muestra
un resumen del número de días en los que los anticuerpos de HCV se
pueden detectar de forma temprana mediante el ensayo que incorpora
DTT. Claramente, se puede obtener un número total de 34 días de
detección temprana en 12 seroconversiones de HCV, al incorporar DTT
en el ensayo.
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\hskip0,9cm8
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<212> ADN
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\hskip0,9cm9
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<213> Virus de la hepatitis C
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<213> Virus de la hepatitis C
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<213> Virus de la hepatitis C
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<213> Virus de la hepatitis C
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<213> Virus de la hepatitis C
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<213> Virus de la hepatitis C
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<211> 957
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<212> ADN
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<213> Virus de la hepatitis C
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<211> 957
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<212> ADN
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<213> Virus de la hepatitis C
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<211> 318
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<212> PRT
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<213> Virus de la hepatitis C
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 981
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<212> ADN
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<213> Virus de la hepatitis C
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<400> 23
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<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 326
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Virus de la hepatitis C
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<400> 24
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 981
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<212> ADN
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<212> PRT
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<213> Virus de la hepatitis C
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<400> 26
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<210> 27
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<211> 957
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
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<400> 27
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 318
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
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<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 957
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Virus de la hepatitis C
\newpage
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<400> 30
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<212> ADN
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<213> Virus de la hepatitis C
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<400> 31
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Virus de la hepatitis C
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<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Virus de la hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Virus de la hepatitis C
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<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip0,9cm66
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\hskip0,9cm67
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<210> 37
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<212> ADN
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<213> Virus de la hepatitis C
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<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm69
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Un método para purificar una proteína NS3 de
HCV expresada recombinantemente, que contiene cisteína, que
comprende las etapas (a) y (c) y al menos una de las siguientes
etapas (b), (d) o (e):
- (a)
- sulfonar un lisado de células hospedantes recombinantes,
- (b)
- tratar con un detergente bipolar, preferiblemente después de eliminar el desecho celular,
- (c)
- purificar la versión sulfonada de la proteína recombinante, o purificar la versión sulfonada de la proteína recombinante, eliminando después el detergente,
- (d)
- desulfonar la proteína recombinante sulfonada,
- (e)
- almacenar en presencia de un exceso molar de DTT, o usar inmediatamente en un ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método según la reivindicación 1, en el
que el lisado de la etapa (a) se obtiene en presencia de cloruro de
guanidinio.
3. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que la purificación en la etapa (c) se
lleva a cabo mediante cromatografía.
4. El método según la reivindicación 3, en el
que la cromatografía es una cromatografía de
Ni-IMAC, siendo dicha proteína recombinante una
proteína recombinante marcada con His.
5. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende la etapa de desulfonar la
versión sulfonada de la proteína recombinante.
6. El método según la reivindicación 5, en el
que la desulfonación se lleva a cabo con un exceso molar de agente
reductor.
7. El método según la reivindicación 6, en el
que el agente reductor es DTT.
8. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende la etapa de almacenar en
presencia de un exceso molar de DTT, o usar inmediatamente en un
ensayo.
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