ES2313784T3 - Vector aav5 y usos del mismo. - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína aislada de la cápside de AAV5 que tiene una homología de al menos un 80% con la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos expuestos en la SEC ID Nº 7, 8 ó 9.

Description

Vector AAV5 y usos del mismo.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención proporciona un virus adenoasociado 5 (AAV5) y vectores derivados del mismo. Así, la presente invención se refiere a vectores de AAV5 para y a procedimientos de administración de ácidos nucleicos a células de sujetos.

Estado de la técnica anterior

El virus adenoasociado (AAV) es un virus no patógeno pequeño de la familia parvoviridae (para una revisión, véase la referencia 28). El AAV se diferencia de los otros miembros de esta familia por su dependencia de un virus auxiliar para la replicación. En ausencia de un virus auxiliar, se ha demostrado que el AAV se integra, de una forma específica de locus, en el brazo q del cromosoma 19 (21). El genoma de aproximadamente 5 kb de AAV consiste en un segmento de ADN monocatenario de polaridad positiva o negativa. Físicamente, el virión de parvovirus no tiene envoltura y su cápside icosahédrica tiene un diámetro de aproximadamente 20-25 nm.

Hasta la fecha se han identificado 8 AAV serológicamente diferentes y se han aislado 6 de seres humanos o primates, y se denominan tipos 1-6 de AAV (1). El más ampliamente estudiado de estos aislados es el AAV de tipo 2 (AAV2). El genoma de AAV2 tiene 4680 nucleótidos de longitud y contiene dos marcos de lectura abierto (ORF), el ORF derecho y el ORF izquierdo. El ORF izquierdo codifica las proteínas Rep no estructurales, Rep40, Rep52, Rep68 y Rep78, que están implicadas en la regulación de la replicación y la transcripción, además de en la producción de genomas progenie monocatenarios (5-8, 11, 12, 15, 17, 19, 21-23, 25, 34, 37-40). Además, dos de las proteínas Rep se han asociado con la integración preferencial de genomas de AAV en una región del brazo q del cromosoma 19 humano. También se ha demostrado que Rep68/78 posee actividad de unión a NTP, así como actividades helicasa de ADN y ARN. Las proteínas Rep poseen una señal de localización nuclear, así como varios sitios de fosforilación potencial. La mutación de uno de estos sitios quinasa daba como resultado una pérdida de la actividad de replicación.

Los extremos del genoma son repeticiones terminales invertidas cortas que tienen el potencial de plegarse en estructuras de horquilla en forma de T que sirven como origen de replicación de ADN viral. Dentro de la región de ITR, se han descrito dos elementos que son fundamentales para la función de las ITR, un motivo de repetición GAGC y el sitio de resolución terminal (TRS). Se ha demostrado que el motivo de repetición se une a Rep cuando la ITR está en una conformación lineal o de horquilla (7, 8, 26).

Esta unión sirve para colocar Rep68/78 para la escisión en el TRS que se produce de una forma específica de sitio y de cadena. Además de su papel en la replicación, estos dos elementos parecen ser fundamentales para la integración viral. Dentro del locus de integración del cromosoma 19 está contenido un sitio de unión a Rep con un TRS adyacente. Se ha demostrado que estos elementos son funcionales y necesarios para la integración específica de locus.

El virión de AAV2 es una partícula icosahédrica sin envoltura de aproximadamente 20-25 nm de diámetro. La cápside está compuesta por tres proteínas relacionadas denominadas VP1, 2 y 3 que están codificadas por el ORF derecho. Estas proteínas se encuentran en una proporción de 1:1:10, respectivamente. Las proteínas de la cápside se diferencian entre sí por el uso de un corte y empalme ("splicing") alternativo y un codón de inicio poco común. El análisis de deleción ha demostrado que la eliminación o alteración de la VP1 de AAV2, que se traduce a partir de un mensajero cortado y empalmado de manera alternativa, da como resultado un rendimiento de partículas infecciosas reducido (15, 16, 38). Las mutaciones dentro de la región codificante de VP3 dan como resultado la falta de producción de cualquier ADN progenie monocatenario o de partículas infecciosas (15, 16, 38).

Las siguientes características de los AAV caracterizados los han convertido en vectores atractivos para transferencia génica (16). Se ha demostrado in vitro que los vectores de AAV se integran de forma estable en el genoma celular; poseen un amplio intervalo de hospedadores; transducen in vitro e in vivo tanto células en división como en no división (13, 20, 30, 32) y mantienen niveles elevados de expresión de los genes transducidos (41). Las partículas virales son termoestables, resistentes a disolventes, detergentes, cambios en el pH, temperatura y pueden concentrarse en gradientes de CsCl (1, 2). La integración de provirus de AAV no está asociada con ningún efecto negativo a largo plazo sobre el crecimiento o la diferenciación celular (3, 42). Se ha demostrado que las ITR son los únicos elementos en cis necesarios para la replicación, el empaquetamiento y la integración (35) y pueden contener algunas actividades promotoras (14).

En un principio se pensaba que el AAV2 infectaba tipos celulares de primates y no primates con tal de que estuviera presente el virus auxiliar apropiado. Sin embargo, actualmente se sabe que la incapacidad de AAV2 para infectar ciertos tipos celulares se debe al tropismo celular concreto que presentan los virus AAV2. Trabajos recientes han demostrado que algunas líneas celulares se transducen muy mal por AAV2 (30). Estudios de unión han indicado que son necesarios proteoglicanos de heparán sulfato para una transducción de eficacia elevada con AAV2. El AAV5 es un miembro único de la familia parvovirus. Los datos de hibridación de ADN presentes indican un bajo nivel de homología con las secuencias de AAV 1-4 publicadas (31). La presente invención muestra que, a diferencia de AAV2, la transducción de AAV5 no está provocada por heparina como la de AAV2 y, por lo tanto, no estará restringida a los mismos tipos celulares que AAV2.

La presente invención proporciona un vector que comprende el virus AAV5 o un vector que comprende subpartes del virus, así como partículas virales de AAV5 según se definen en las reivindicaciones. Aunque AAV5 es similar a AAV2, se ha encontrado en la presente memoria que los dos virus son físicamente y genéticamente diferentes. Estas diferencias dotan a AAV5 de algunas ventajas y propiedades únicas que lo adaptan mejor como vector para terapia génica. Por ejemplo, una de las características limitantes del uso de AAV2 como un vector para terapia génica es la producción de grandes cantidades de virus. Usando técnicas de producción convencionales, se produce AAV5 a un nivel de 10-50 veces superior en comparación con AAV2. Debido a sus proteínas rep y sitio TRS único, el AAV5 también debería tener un locus de integración diferente en comparación con AAV2.

Además, como se muestra en la presente memoria, la proteína de la cápside de AAV5, de nuevo sorprendentemente, es diferente de la proteína de la cápside de AAV2 y presenta un tropismo tisular diferente, haciendo adecuadas de este modo las partículas que contienen la cápside de AAV5 para transducir tipos celulares para los que AAV2 no está adaptado o está menos adaptado. Se ha demostrado que AAV2 y AAV5 son serológicamente diferentes y, por lo tanto, en una aplicación de terapia génica, AAV5 y vectores procedentes de AAV5 permitirían la transducción de un paciente que ya posee anticuerpos neutralizantes contra AAV2 como resultado de una defensa inmunológica natural o de una exposición previa a vectores de AAV2. Otra ventaja de AAV5 es que AAV5 no puede ser rescatado por otros serotipos. Sólo AAV5 puede rescatar el genoma de AAV5 integrado y efectuar la replicación, evitando de este modo una replicación no deseada de AAV5 causada por otros serotipos de AAV. Por lo tanto, la presente invención, proporcionando estos nuevos vectores recombinantes y partículas basadas en AAV5, proporciona una nueva y muy útil serie de vectores.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona un ácido nucleico según se define en la reivindicación 1. La presente invención proporciona un vector de ácido nucleico según se define en las reivindicaciones, que comprende un par de repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociado 5 (AAV5) y un promotor entre las repeticiones terminales invertidas.

La presente invención proporciona además una partícula de AAV5, según se define en las reivindicaciones, que contiene un vector que comprende un par de repeticiones terminales invertidas de AAV2.

Además, la presente invención proporciona una ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 (genoma de AAV5), según se define en las reivindicaciones. Además, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 (genoma de AAV5), según se define en las reivindicaciones.

La presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una proteína Rep de AAV5, por ejemplo, el ácido nucleico que se expone en la SEC ID Nº: 10. Se describe adicionalmente una proteína Rep de AAV5 de longitud completa aislada o un fragmento único de la misma. Se describe adicionalmente una proteína aislada Rep 40 de AAV5 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 12, o un fragmento único de la misma. Se describe adicionalmente una proteína aislada Rep 52 de AAV5 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 2 o un fragmento único de la misma. Se describe adicionalmente una proteína aislada Rep 68 de AAV5, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 14 o un fragmento único de la misma. Se describe adicionalmente una proteína aislada Rep 78 de AAV5 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 3, o un fragmento único de la misma. Las secuencias de estas proteínas se proporcionan a continuación en la Lista de Secuencias y en otra parte de la solicitud donde se describen las proteínas.

La presente solicitud describe además una proteína aislada de la cápside de AAV5, VP1, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 4, o un fragmento único de la misma. Se describe adicionalmente una proteína aislada de la cápside de AAV5, VP2, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 5, o un fragmento único de la misma. Se describe también una proteína aislada de la cápside de AAV5, VP3, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 6, o un fragmento único de la misma.

La presente invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de la cápside de AAV5, por ejemplo, el ácido nucleico expuesto en la SEC ID Nº: 7.

La presente invención proporciona además una partícula de AAV5 que comprende una proteína de la cápside que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 4.

Se proporciona adicionalmente por la presente invención un ácido nucleico aislado que comprende un promotor p5 de AAV5 que tiene la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEC ID Nº: 18.

La presente invención proporciona un procedimiento de cribado de una célula en base a la infectividad por AAV5, que comprende poner en contacto a la célula con AAV5 y detectar la presencia de AAV5 en las células.

La presente invención proporciona además un procedimiento de liberación de un ácido nucleico a una célula que comprende administrar a la célula una partícula de AAV5 que contiene un vector, según se define en las reivindicaciones, que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV, liberando de este modo el ácido nucleico en la célula.

La presente invención puede usarse en un procedimiento de liberación de un ácido nucleico heterólogo a un sujeto, que comprende administrar a una célula del sujeto una partícula de AAV5 que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV y devolver la célula al sujeto, liberando de este modo el ácido nucleico al sujeto.

La presente invención proporciona también un procedimiento de liberación de un ácido nucleico heterólogo a una célula ex vivo, que comprende administrar a la célula una partícula de AAV5 que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV, liberando de este modo el ácido nucleico a una célula en el sujeto.

La presente invención puede usarse además en un procedimiento de liberación de un ácido nucleico a una célula en un sujeto que tiene anticuerpos contra AAV2, que comprende administrar al sujeto una partícula de AAV5 que comprende el ácido nucleico, liberando de este modo el ácido nucleico a una célula en el sujeto.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra resultados de inhibición por heparina. Se sembraron en placas de 12 pocillos células Cos a 5 x 10^{4} células por pocillo. Se incubaron diluciones en serie de AAV2 o AAV5 producidos y purificados como se ha descrito anteriormente y suplementados con 5 x 10^{5} partículas de adenovirus de tipo salvaje (wt) durante 1 h a temperatura ambiente (RT) en presencia de heparina 20 \mug/ml (Sigma). Después de esta incubación, el virus se añadió a las células en 400 \mul de medio durante 1 h, después de la cual se retiraron los medios, las células se aclararon y se añadieron medios frescos. Después de 24 horas, las placas se tiñeron por actividad \betagal.

La Figura 2 muestra vectores de AAV2 y AAV5 y complementación con auxiliar. Se produjeron partículas de AAV recombinantes como se ha descrito anteriormente usando una diversidad de plásmidos vectores y auxiliares, como se indica en la parte inferior del gráfico. Los plásmidos vectores contenían el gen de \betagal con un promotor de RSV y flanqueado por ITR de AAV2 (2ITR) o ITR de AAV5 (5ITR). Los plásmidos auxiliares ensayados contenían genes Rep y cap de AAV2 (2repcap), genes rep y cap de AAV5 con o sin promotor de SV40 (5repcapA y 5repcapB, respectivamente), sólo el gen rep de AAV2 (2rep) en cantidades variables (1) o (0,5) o un vector vacío (pUC). Después, las partículas de AAV resultantes se titularon en células cos. Sólo se produjeron partículas de AAV cuando estaba presente el mismo serotipo de ITR y Rep.

La Figura 3 muestra el tropismo tisular de AAV2 y AAV5. La transducción de una diversidad de tipos celulares indicaba que AAV2 y AAV5 transducen células con diferentes eficacias. Se usó un número igual de partículas de AAV2 o AAV5 para transducir una diversidad de tipos celulares y se confirmó el número de células positivas para \betagal.

La Figura 4 es una comparación de secuencias del genoma de AAV2 y del genoma de AAV5.

La Figura 5 es una comparación de secuencias de la proteína de la cápside VP1 de AAV2 y de la proteína de la cápside VP1 de AAV5.

La Figura 6 es una comparación de secuencias de la proteína rep 78 de AAV2 y la proteína rep 78 de AAV5.

La Figura 7 muestra la transducción de células epiteliales de las vías respiratorias por AAV5. Se cultivaron células epiteliales de las vías respiratorias primarias y se sembraron en placas. Las células se transdujeron con un número equivalente de partículas de rAAV2 o rAAV5 que contenían un transgén de \beta-gal de localización nuclear con 50 partículas de virus/célula (MOI 50) y se continuó con el cultivo durante 10 días. Se determinó la actividad de \beta-gal y se comparó la eficacia de transducción relativa. El AAV5 transducía estas células 50 veces más eficazmente que el AAV2. Esta es la primera vez que se ha demostrado que células apicales o células expuestas al aire se infectan por un agente de terapia génica.

La Figura 8 muestra la transducción del músculo estriado por AAV5. Se cultivaron y sembraron en placas mioblastos de pollo. Se permitió que las células se fusionaran y después se transdujeran con un número similar de partículas de rAAV2 o rAAV5 que contenían un transgén de \beta-gal de localización nuclear después de 5 días en cultivo. Las células se tiñeron para actividad \beta-gal y se comparó la eficacia de transducción relativa. El AAV5 transducía estas células aproximadamente 16 veces más eficazmente que el AAV2.

La Figura 9 muestra la transducción de explantes de cerebro de rata por AAV5. Se prepararon explantes de cerebro de rata neonata primarios. Después de 7 días en cultivo, las células se transdujeron con un número similar de partículas de rAAV5 que contenían un transgén de \beta-gal de localización nuclear. Después de 5 días en cultivo, las células se tiñeron por actividad \beta-gal. Se detectó la transducción en una diversidad de tipos celulares incluyendo astrocitos, células neuronales y células gliales.

La Figura 10 muestra la transducción de células endoteliales de vena umbilical humana por AAV5. Se cultivaron y sembraron en placas células endoteliales de vena umbilical humana. Las células se transdujeron con rAAV2 o rAAV5 que contenían un transgén de \beta-gal de localización nuclear con 10 partículas de virus/célula (MOI 5) en medios mínimos y después se devolvieron a medios completos. Después de 24 horas en cultivo, las células se tiñeron por actividad \beta-gal y se comparó la eficacia de transducción relativa. Como se muestra, el AAV5 transducía estas células 5-10 veces más eficazmente que el AAV2.

Descripción detallada de la invención

Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "uno/a" puede significar uno o más dependiendo del contexto en el que se use. Los términos "que tiene" y "que comprende" se usan de forma intercambiable en la presente memoria e indican un significado indefinido.

La presente solicitud proporciona un virus adenoasociado 5 recombinante (AAV5) según se define en las reivindicaciones. Este virus tiene una o más de las características que se describen a continuación. Las composiciones de la presente invención no incluyen AAV5 de tipo salvaje. Los procedimientos de la presente invención pueden usar una liberación basada en AAV5 de tipo salvaje o en AAV5 recombinante.

La presente invención proporciona nuevas partículas de AAV5, vectores de AAV5 recombinantes, viriones de AAV5 recombinantes y nuevos ácidos nucleicos de AAV5, según se definen en las reivindicaciones. Una partícula de AAV5 es una partícula viral que comprende una proteína de la cápside de AAV5. Un vector de AAV5 recombinante es una construcción de ácido nucleico que comprende al menos un ácido nucleico único de AAV5. Un virión de AAV5 recombinante es una partícula que contiene un vector de AAV5 recombinante, en el que la partícula puede ser una partícula de AAV5 según se describe en la presente memoria o una partícula que no sea de AAV5. Como alternativa, el virión de AAV5 recombinante es una partícula de AAV5 que contiene un vector recombinante, en el que el vector puede ser un vector de AAV5 como se describe en la presente memoria o un vector que no sea de AAV5. Estos vectores, partículas, viriones, ácidos nucleicos y polipéptidos se describen a continuación.

La presente invención proporciona la secuencia de nucleótidos del genoma de AAV5 y vectores y partículas procedentes de la misma, según se definen en las reivindicaciones. En concreto, la presente invención proporciona un vector de ácido nucleico que comprende un par de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV5 y un promotor entre las repeticiones terminales invertidas, según se define en las reivindicaciones. Aunque las proteínas rep de AAV2 y AAV5 se unirán a una ITR de tipo 2 o a una ITR tipo 5, sólo se produce una replicación genómica eficaz cuando una Rep de tipo 2 replica una ITR de tipo 2 y cuando una Rep de tipo 5 replica una ITR de tipo 5. Esta especificidad es el resultado de una diferencia en la especificidad de escisión del ADN de las dos Rep la cual es necesaria para la replicación. La Rep de AAV5 escinde en CGGT-GTGA (SEC ID Nº: 21) y la Rep de AAV2 escinde en CGGT^TGAC (SEC ID Nº: 22) (Chiorini et al., 1999. J. Virol. 73 (5) 4293-7298). El mapeo del sitio de resolución terminal (TRS) de ITR de AAV5 identificó este sitio de escisión diferente, CGGT-GTGA, que está ausente en las ITR de otros serotipos de AAV. Por lo tanto, la secuencia mínima necesaria para distinguir AAV5 de AAV2 es el sitio TRS donde Rep corta para replicar el virus. Se muestran ejemplos de las ITR de tipo 5 en la SEC ID Nº: 19 y en la SEC ID Nº: 20, ITR "flip" de AAV5 y "flop" de AAV5, respectivamente. Se contemplan modificaciones minoritarias en una ITR con cualquier orientación y son las que no interferirán con la estructura de horquilla formada por las ITR de AAV5, según se describe en la presente memoria y se conoce en la técnica. Además, para considerarse dentro del término "ITR de AAV5" la secuencia de nucleótidos debe conservar una o más características descritas en la presente memoria que diferencian a las ITR de AAV5 de las ITR de otros serotipos, por ejemplo, debe conservar el sitio de unión a Rep descrito en la presente memoria.

Se ha demostrado que la región D- de la ITR de AAV5 (SEC ID Nº: 23), una región monocatenaria de la ITR hacia el interior del sitio TRS, se une a un factor que, dependiendo de su estado de fosforilación, se correlaciona con la conversión del AAV de un genoma monocatenario a una forma transcripcionalmente activa que permite la expresión del ADN viral. Esta región está conservada entre los AAV2, 3, 4 y 6 pero es divergente en AAV5. La región D+ es la complementaria inversa de la región D-.

El promotor puede ser cualquier promotor deseado, seleccionado por consideraciones conocidas, tales como el nivel de expresión de un ácido nucleico unido funcionalmente al promotor y el tipo celular en el que se va a usar el vector. Es decir, el promotor puede ser específico de tejido o célula. Los promotores pueden ser promotores procariotas, eucariotas, fúngicos, nucleares, mitocondriales, virales o vegetales. Los promotores pueden ser exógenos o endógenos al tipo celular que sea transducido por el vector. Los promotores pueden incluir, por ejemplo, promotores bacterianos, promotores fuertes conocidos tales como SV40 o el promotor inducible de la metalotioneína o un promotor de AAV, tal como un promotor p5 de AAV. Además, pueden utilizarse promotores reguladores quiméricos para una expresión génica dirigida. Ejemplos de estos sistemas reguladores, que se conocen en la técnica, incluyen el sistema regulador basado en tetraciclina, que utiliza la proteína transactivadora tet (tTA), una proteína quimérica que contiene el dominio de activación VP16 fusionado al represor tet de Escherichia coli, el sistema regulador basado en IPTG, el sistema regulador basado en CID y el sistema regulador basado en Ecdisona (44). Otros promotores incluyen promotores derivados de genes de actina, genes de inmunoglobulina, promotores de citomegalovirus (CMV), adenovirus, virus del papiloma bovino, adenovirales, tales como el promotor tardío principal de adenovirus, un promotor inducible por choque térmico, virus respiratorio sincitial, virus del sarcoma de Rous (RSV), etc., en concreto, el promotor puede ser un promotor p5 de AAV2 o un promotor p5 de AAV5. Más específicamente, el promotor p5 de AAV5 puede estar aproximadamente en la misma localización en la SEC ID Nº: 1 que el promotor p5 de AAV2, en la secuencia publicada de AAV2 correspondiente. Además, el promotor p5 puede ser potenciado por los nucleótidos 1-30 de la SEC ID Nº: 1. Además, pueden determinarse fácilmente fragmentos más pequeños del promotor p5 que conservan la actividad promotora mediante procedimientos convencionales que incluyen, por ejemplo, generar una serie de deleciones en el promotor p5, vincular la deleción a un gen indicador y determinar si se expresa el gen indicador, es decir, si se transcribe y/o traduce. El promotor puede ser el promotor de cualquiera de los serotipos de AAV y puede ser el promotor p19 (SEC ID Nº: 16) o el promotor p40 expuesto en la lista de secuencias como SEC ID Nº: 17.

Debería reconocerse que cualquier error en cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria puede corregirse, por ejemplo, mediante el uso del procedimiento de hibridación que se describe a continuación, con diversas sondas procedentes de las secuencias descritas, de tal modo que la secuencia codificante puede volver a aislarse y secuenciarse. También puede lograrse una exploración rápida de mutaciones puntuales con el uso de una reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismo en la conformación de cadena sencilla (PCR-SSCP) (43). Así, puede corregirse en consecuencia la secuencia de aminoácidos correspondiente.

El vector procedente de AAV5 de la invención puede comprender además un ácido nucleico heterólogo unido funcionalmente al promotor. Por "ácido nucleico heterólogo" se entiende que cualquier ácido nucleico heterólogo o exógeno, es decir, que no se encuentra normalmente en el AAV5 de tipo salvaje, puede insertarse en el vector para su transferencia a una célula, tejido u organismo. Por "unido funcionalmente" se entiende que el promotor puede promover la expresión del ácido nucleico heterólogo, según se conoce en la técnica, y puede incluir la orientación apropiada del promotor con respecto al ácido nucleico heterólogo. Además, el ácido nucleico heterólogo tiene preferiblemente todas las secuencias apropiadas para la expresión del ácido nucleico. El ácido nucleico puede incluir, por ejemplo, secuencias de control de la expresión, tales como un potenciador y sitios necesarios de procesamiento de la información, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción.

El ácido nucleico heterólogo puede codificar proteínas o polipéptidos beneficiosos que reemplacen proteínas ausentes o defectuosas necesarias para la célula o el sujeto en el que se transfiere el vector, o puede codificar un polipéptido citotóxico que puede dirigirse, por ejemplo, a células cancerosas u otras células cuya muerte sería beneficiosa para el sujeto. El ácido nucleico heterólogo puede codificar también ARN antisentido que puede unirse a y, por lo tanto, inactivar, ARNm generados por el sujeto que codifican proteínas perjudiciales. El ácido nucleico heterólogo puede codificar también ribozimas que pueden efectuar la inhibición específica de secuencia de la expresión génica mediante la escisión de ARNm. En una realización, pueden producirse polinucleótidos antisentido a partir de un casete de expresión heteróloga en una construcción de vector de AAV5, donde el casete de expresión contiene una secuencia que promueve la expresión específica de tipo celular (Wirak et al., EMBO 10: 259 (1991)). Para procedimientos generales relacionados con polinucleótidos antisentido, véase Antisense RNA and DNA, D. A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988).

Ejemplos de ácidos nucleicos heterólogos que pueden administrarse a una célula o sujeto como parte del presente vector de AAV5 pueden incluir, pero no se limitan a, los siguientes: ácidos nucleicos que codifican proteínas secretoras y no secretoras, ácidos nucleicos que codifican agentes terapéuticos tales como factores de necrosis tumoral (TNF), tales como TNF-\alpha; interferones, tales como interferón-\alpha, interferón-\beta e interferón-\gamma; interleuquinas, tales como IL-1, IL-1\beta e IL-2 a 14; GM-CSF; adenosina desaminasa; factores de crecimiento celular, tales como linfoquinas; CD4 soluble; Factor VIII; Factor IX; receptores de células T; receptor de LDL; ApoE; ApoC; alfa-1 antitripsina; ornitina transcarbamilasa (OTC); receptor transmembrana de la fibrosis quística (CFTR); insulina; receptores Fc para dominios de unión a antígeno de anticuerpos, tales como inmunoglobulinas; elementos tar señuelos anti-VIH; y secuencias antisentido que inhiben la replicación viral, tales como secuencias antisentido que inhiben la replicación del virus de la hepatitis B o de la hepatitis no A, no B. El ácido nucleico se selecciona considerando varios factores, incluyendo la célula que se va a transfectar. Cuando la célula diana es una célula sanguínea, por ejemplo, son ácidos nucleicos particularmente útiles para usar los que permiten que las células sanguíneas ejerzan un efecto terapéutico, tal como un gen que codifica un factor de coagulación para el uso en el tratamiento de la hemofilia. Otra célula diana es la célula de las vías respiratorias del pulmón, que pueden usarse para administrar ácidos nucleicos, tales como los que codifican el receptor transmembrana de la fibrosis quística, que proporcionaría un tratamiento terapéutico genético para la fibrosis quística. Otras células diana incluyen células musculares en las que pueden transducirse ácidos nucleicos útiles, tales como los que codifican citoquinas y factores de crecimiento, y la proteína que codifica el ácido nucleico puede expresarse y secretarse para ejercer sus efectos en otras células, tejidos y órganos, tales como el hígado. Además, el ácido nucleico puede codificar más de un producto génico, limitado solamente, si el ácido nucleico se va a empaquetar en una cápside, por el tamaño del ácido nucleico que puede empaquetarse.

Además, los ácidos nucleicos adecuados pueden incluir los que, cuando se transfieren a una célula primaria, tal como una célula sanguínea, provocan que la célula a la que se transfieren se dirija a un sitio en el cuerpo donde la presencia de la célula sería beneficiosa. Por ejemplo, pueden modificarse células sanguíneas tales como células TIL, tal como por transferencia en la célula de una porción Fab de un anticuerpo monoclonal, para reconocer un antígeno seleccionado. Otro ejemplo sería introducir un ácido nucleico que dirigiría a una célula sanguínea terapéutica hacia células tumorales. Los ácidos nucleicos útiles en el tratamiento de células cancerosas incluyen los que codifican factores quimiotáxicos que causan una respuesta inflamatoria en un sitio específico, teniendo de este modo un efecto terapéutico.

Las células, particularmente células sanguíneas, células musculares, células epiteliales de las vías respiratorias, células cerebrales y células endoteliales que tienen dichos ácidos nucleicos transferidos en su interior, pueden ser útiles en una diversidad de enfermedades, síndromes y afecciones. Por ejemplo, los ácidos nucleicos adecuados incluyen ácidos nucleicos que codifican CD4 soluble, usados en el tratamiento del SIDA y \alpha-antitripsina, usada en el tratamiento del enfisema causado por deficiencia de \alpha-antitripsina. Otras enfermedades, síndromes y afecciones en los que dichas células pueden ser útiles incluyen, por ejemplo, deficiencia de adenosina desaminasa, deficiencia de células falciformes, trastornos cerebrales tales como enfermedad de Alzheimer, talasemia, hemofilia, diabetes, fenilcetonuria, trastornos del crecimiento y enfermedades cardiacas, tales como las causadas por alteraciones en el metabolismo del colesterol y defectos del sistema inmune.

Como otro ejemplo, pueden transfectarse hepatocitos con los presentes vectores que tienen ácidos nucleicos útiles para tratar una enfermedad hepática. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica OTC puede usarse para transfectar hepatocitos (ex vivo y devolverlos al hígado o in vivo) para tratar la hiperamoniemia congénita, causada por una deficiencia hereditaria de OTC. Otro ejemplo es usar un ácido nucleico que codifica LDL para dirigirse a hepatocitos ex vivo o in vivo para tratar una deficiencia de receptor de LDL hereditaria. Dichos hepatocitos transfectados también pueden usarse para tratar enfermedades infecciosas adquiridas, tales como enfermedades que son el resultado de una infección vírica. Por ejemplo, pueden usarse precursores de hepatocitos transducidos para tratar una hepatitis vírica, tal como hepatitis B y hepatitis no A, no B, por ejemplo, por transducción del precursor de hepatocitos con un ácido nucleico que codifica un ARN antisentido que inhibe la replicación viral. Otro ejemplo incluye transferir un vector de la presente invención que tiene un ácido nucleico que codifica una proteína, tal como interferón \alpha, que puede conferir resistencia al virus de la hepatitis.

Para un procedimiento que use hepatocitos o precursores de hepatocitos transfectados, pueden cultivarse en un cultivo tisular precursores de hepatocitos que tienen un vector de la presente invención transferido, retirarse del recipiente de cultivo tisular e introducirse en el cuerpo, tal como mediante un procedimiento quirúrgico. En este ejemplo, el tejido se colocaría directamente en el hígado o en la cavidad corporal en proximidad al hígado, como en un transplante o injerto. Como alternativa, las células pueden simplemente inyectarse directamente en el hígado, en el sistema circulatorio portal o en el bazo, desde el que las células pueden transportarse al hígado a través del sistema circulatorio. Además, las células pueden unirse a un soporte, tal como perlas microtransportadoras, que después pueden introducirse, tal como mediante inyección, en la cavidad peritoneal. Una vez que las células están en el hígado, por el medio que sea, las células pueden expresar entonces el ácido nucleico y/o diferenciarse en hepatocitos maduros que pueden expresar el ácido nucleico.

El vector derivado de AAV5 puede incluir cualquier secuencia de AAV5 de origen natural, además de una ITR y un promotor. Se proporcionan a continuación ejemplos de construcciones de vectores.

El presente vector o partícula de AAV5 o virión de AAV5 recombinante puede utilizar cualquier fragmento único de estos ácidos nucleicos de AAV5 presentes, incluyendo los ácidos nucleicos de AAV5 expuestos en las SEC ID Nº: 1 y 7-11, 13, 15, 16, 17 y 18. Para ser único, el fragmento debe tener un tamaño suficiente para diferenciarse de otras secuencias conocidas, más fácilmente determinado por comparación de cualquier fragmento de ácido nucleico con las secuencias de nucleótidos de ácidos nucleicos en bases de datos informáticas, tales como GenBank. Dichas búsquedas comparativas son convencionales en la técnica. Típicamente, un fragmento único útil como cebador o sonda será de al menos aproximadamente 8 ó 10, preferiblemente de al menos 20 ó 25 nucleótidos de longitud, dependiendo del contenido de nucleótidos específico de la secuencia. Además, los fragmentos pueden ser, por ejemplo, de al menos aproximadamente 30, 40, 50, 75, 100, 200 ó 500 nucleótidos de longitud y pueden codificar polipéptidos o ser sondas. El ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario dependiendo del fin para el que se desee. Cuando se desee, el ácido nucleico puede ser ARN.

La presente solicitud describe además una proteína de la cápside de AAV5 para contener el vector. En particular, la presente solicitud no sólo describe un polipéptido que comprende las tres proteínas de cubierta de AAV5, es decir, VP1, VP2 y VP3, sino también un polipéptido que comprende cada proteína de cubierta de AAV5 individualmente, las SEC ID Nº: 4, 5 y 6, respectivamente. Por lo tanto, una partícula de AAV5 que comprende una proteína de la cápside de AAV5 comprende al menos una proteína de cubierta de AAV5 VP1, VP2 o VP3. Una partícula de AAV5 que comprende una proteína de la cápside de AAV5 puede utilizarse para administrar un vector de ácido nucleico a una célula, tejido o sujeto. Por ejemplo, los vectores de AAV5 descritos en la presente memoria pueden encapsidarse en una partícula derivada de la cápside de AAV5 y utilizarse en un procedimiento de administración de genes. Además, pueden encapsidarse otros ácidos nucleicos virales en la partícula de AAV5 y utilizarse en dichos procedimientos de administración. Por ejemplo, un vector de AAV1, 2, 3, 4 ó 6 (por ejemplo, ITR de AAV1, 2, 3, 4 ó 6 y ácido nucleico de interés) puede encapsidarse en una partícula de AAV5 y administrarse. Además, puede generarse una cápside quimérica de AAV5 que incorpore secuencias tanto de la cápside de AAV2 como de la cápside de AAV5 mediante procedimientos de clonación convencionales, seleccionando regiones de las secuencias conocidas de cada proteína según se desee. Por ejemplo, regiones particularmente antigénicas de la proteína de la cápside de AAV2 pueden reemplazarse por la región correspondiente de la proteína de la cápside de AAV5. Además de cápsides quiméricas que incorporan secuencias de la cápside de AAV2, pueden generarse cápsides quiméricas que incorporen secuencias de la cápside de AAV1, 3, 4 ó 6 y de AAV5 mediante procedimientos de clonación convencionales, seleccionando regiones de las secuencias conocidas de cada proteína según se desee.

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Las cápsides también pueden modificarse para alterar su tropismo específico mediante modificación genética de la cápside para codificar un ligando específico para un receptor de superficie celular. Como alternativa, la cápside puede modificarse químicamente mediante conjugación de un ligando a un receptor de superficie celular. Mediante la modificación genética o química de las cápsides, el tropismo puede modificarse para dirigir el AAV5 a una célula o población de células en particular. Las cápsides también pueden modificarse inmunológicamente por conjugación de la cápside a un anticuerpo que reconozca una proteína específica en la célula o población de células diana.

Las cápsides también pueden ensamblarse en partículas vacías por expresión en células de mamífero, bacterianas, fúngicas o de insectos. Por ejemplo, se sabe que las partículas de AAV2 están constituidas por las proteínas de la cápside VP3 y VP2 en baculovirus. El mismo protocolo básico puede producir una partícula de AAV5 vacía que comprenda una proteína de la cápside de AAV5.

El vector derivado de un ácido nucleico de AAV5 recombinante descrito en la presente memoria puede encapsidarse en una partícula de AAV. En particular, puede encapsidarse en una partícula de AAV1, una partícula de AAV2, una partícula de AAV3, una partícula de AAV4, una partícula de AAV5 o una partícula de AAV6, una porción de cualquiera de estas cápsides o una partícula de la cápside quimérica como se ha descrito anteriormente, mediante procedimientos convencionales usando las proteínas de la cápside apropiadas en el proceso de encapsidación, siempre que el vector de ácido nucleico se ajuste a la limitación de tamaño de la partícula utilizada. El propio proceso de encapsidación es convencional en la técnica. La maquinaria de replicación de AAV5, es decir, las proteínas iniciadoras rep y otras funciones necesarias para la replicación, pueden utilizarse para producir el genoma de AAV5, que puede empaquetarse en una cápside de AAV1, 2, 3, 4, 5 ó 6.

El virión de AAV5 recombinante que contiene un vector también puede producirse por procedimientos recombinantes utilizando múltiples plásmidos. En un ejemplo, el ácido nucleico de rep de AAV5 se clonaría en un plásmido, el ácido nucleico de ITR de AAV5 se clonaría en otro plásmido y el ácido nucleico de la cápside de AAV1, 2, 3, 4, 5 ó 6 se clonaría en otro plásmido. Después, estos plásmidos se introducirían en células. Las células que se transdujeron eficazmente por los tres plásmidos presentarían una integración específica, así como la capacidad de producir virus AAV5 recombinante. Además, podrían usarse dos plásmidos en los que el ácido nucleico de rep de AAV5 se clonaría en un plásmido y la ITR de AAV5 y la cápside de AAV5 se clonarían en otro plásmido. Después, estos plásmidos se introducirían en células. Las células que se transdujeron eficazmente por ambos plásmidos presentarían una integración específica, así como la capacidad de producir virus AAV5 recombinante.

Un polipéptido de la cápside de AAV5 que codifica el polipéptido completo VP1, VP2, y VP3 puede tener una homología del 80%, un homología del 85%, una homología del 90%, una homología del 95%, una homología del 98%, una homología del 99% o incluso una homología del 100% con la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos expuestos en las SEC ID Nº:7, 8 ó 9. El porcentaje de homología usado para identificar proteínas en la presente memoria puede basarse en una comparación nucleótido a nucleótido o, más preferiblemente, se basa en un algoritmo informatizado, como se describe en la presente memoria. Se contemplan en la presente memoria variaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de AAV5, siempre que la partícula resultante que comprende una proteína de la cápside de AAV5 continúe siendo antigénicamente o inmunológicamente diferente de la cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 o AAV6, como puede determinarse de manera rutinaria mediante procedimientos convencionales. En concreto, por ejemplo, pueden usarse ELISA y transferencias de Western para determinar si una partícula viral es antigénicamente o inmunológicamente diferente de AAV2 o de los otros serotipos. Además, preferiblemente la partícula de AAV5 conserva una distinción de tropismo tisular de AAV2, como la ejemplificada en los ejemplos en la presente memoria. Una partícula quimérica de AAV5 que comprende al menos una proteína de cubierta de AAV5 puede tener un tropismo tisular diferente del de una partícula de AAV5 que consiste sólo en proteínas de cubierta de AAV5, pero aún ser diferente del tropismo de una partícula de AAV2.

La invención proporciona además un virión de AAV5 recombinante que comprende una partícula de AAV5 que contiene, es decir, que encapsida, un vector como se define en las reivindicaciones, que comprende un par de repeticiones terminales invertidas de AAV5. El vector recombinante puede comprender además un ácido nucleico que codifique Rep de AAV5. El vector encapsidado en la partícula puede comprender además un ácido nucleico exógeno insertado entre las repeticiones terminales invertidas. El Rep de AAV5 confiere una integración dirigida y una replicación eficaz, por lo tanto, la producción de AAV5 recombinante, que comprende Rep de AAV5, produce más partículas que la producción de AAV2 recombinante. Puesto que AAV5 es más eficaz en la replicación y empaquetamiento de su genoma, el ácido nucleico exógeno insertado, o en las cápsides de AAV5 de la presente invención, entre las repeticiones terminales invertidas puede empaquetarse en las cápsides de AAV 1, 2, 3, 4 ó 6 para conseguir el tropismo tisular específico conferido por las proteínas de la cápside.

La invención contempla además ITR recombinantes quiméricas que contienen un sitio de unión a rep y un sitio TRS reconocido por esa proteína Rep. Por "proteína Rep" se entienden las cuatro proteínas Rep, Rep 40, Rep 78, Rep 52, Rep 68. Como alternativa, la "proteína Rep" puede ser una o más de las proteínas Rep descritas en la presente memoria. Un ejemplo de una ITR quimérica consistiría en una región D de AAV5 (SEC ID Nº: 23), un sitio TRS de AAV5 (SEC ID Nº: 21), una horquilla de AAV2 y un sitio de unión a AAV2. Otro ejemplo sería una región D de AAV5, un sitio TRS de AAV5, una horquilla de AAV3 y un sitio de unión a AAV3. En estas ITR quiméricas, la región D puede ser de AAV 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. La horquilla puede proceder de AAV 1, 2 3, 4, 5 ó 6. El sitio de unión puede proceder de cualquiera de AAV1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Preferiblemente, la región D y el TRS son del mismo serotipo.

Las ITR quiméricas pueden combinarse con una proteína Rep de AAV5 y cualquiera de las cápsides de serotipos de AAV para obtener un virión recombinante. Por ejemplo, puede producirse un virión recombinante mediante una región D de AAV5, un sitio TRS de AAV5, una horquilla de AAV2, un sitio de unión a AAV2, una proteína Rep de AAV5 y una cápside de AAV1. Este virión recombinante poseería el tropismo celular conferido por la proteína de la cápside de AAV1 y poseería la replicación eficaz conferida por la Rep de AAV5.

Otros ejemplos de las ITR, proteínas Rep y cápsides que producirán virus recombinantes se proporcionan en la lista a continuación:

5ITR + 5Rep + 5Cap = virus

5ITR + 5Rep + 1Cap = virus

5ITR + 5Rep + 2Cap = virus

5ITR + 5Rep + 3Cap = virus

5ITR + 5Rep + 4Cap = virus

5ITR + 5Rep + 6Cap = virus

11TR + 1Rep + 5Cap = virus

2ITR + 2Rep + 5Cap = virus

3ITR + 3Rep + 5Cap = virus

4ITR + 4Rep + 5Cap = virus

6ITR + 6Rep + 5Cap = virus

En cualquiera de las construcciones descritas en la presente memoria se prefiere la inclusión de un promotor. Como se usa en las construcciones en la presente memoria, a menos que se indique otra cosa, Cap (cápside) se refiere a cualquiera de VP1 de AAV5, VP2 de AAV5, VP3 de AAV5, combinaciones de las mismas, fragmentos funcionales de cualquiera de VP1, VP2 o VP3, o cápsides quiméricas, como se describen en la presente memoria. Las ITR de las construcciones descritas en la presente memoria pueden ser ITR recombinantes quiméricas, como se describen en otra parte en la solicitud.

Pueden usarse conjugados de viriones de AAV5 recombinantes o de tipo salvaje y ácidos nucleicos o proteínas para administrar esas moléculas a una célula. Por ejemplo, el AAV5 purificado puede usarse como un vehículo para administrar ADN unido al exterior del virus. Ejemplos de estos son conjugar el ADN al virión mediante un puente usando poli-L-lisina u otra molécula cargada. También se contemplan virosomas que contienen proteínas estructurales de AAV5 (proteínas de la cápside de AAV5), lípidos tales como DOTAP y ácidos nucleicos que están formando complejos a través de la interacción de cargas para introducir ADN en células.

También son proporcionados por esta invención conjugados que utilizan la cápside de AAV5 o una región única de la proteína de la cápside de AAV5 (por ejemplo, VP1, VP2 o VP3 o combinaciones de las mismas) para introducir ADN en células. Por ejemplo, la proteína VP3 de tipo 5 o un fragmento de la misma puede conjugarse a un ADN en un plásmido que se conjuga con un lípido. Pueden infectarse células usando la capacidad de dirección de la proteína de la cápside VP3 para conseguir el tropismo tisular deseado, específico para AAV5. También pueden utilizarse proteínas VP1 y VP2 de tipo 5 para introducir ADN u otras moléculas en células. Mediante la incorporación adicional de la proteína Rep y del TRS de AAV en el conjugado que contiene ADN, pueden transducirse células y puede conseguirse una integración dirigida. Por ejemplo, si se desea una integración dirigida específica de AAV5, puede utilizarse un conjugado compuesto por cápside VP3 de AAV5, rep de AAV5 o un fragmento de rep de AAV5, TRS de AAV5, el sitio de unión a rep, el ADN heterólogo de interés y un lípido para conseguir el tropismo específico de AAV5 y la integración dirigida específica de AAV5 en el genoma.

Se proporcionan adicionalmente por esta invención virus quiméricos en los que AAV5 puede combinarse con herpesvirus, baculovirus u otros virus para conseguir un tropismo deseado asociado con otro virus. Por ejemplo, las ITR de AAV5 podrían insertarse en el herpesvirus y podrían infectarse células. Después de la infección, podría actuarse sobre las ITR de AAV5 mediante rep de AAV5 proporcionada en el sistema o en un vehículo separado para rescatar el AAV5 del genoma. Por lo tanto, el tropismo celular del virus herpes simple puede combinarse con la integración dirigida mediada por rep de AAV5. Otros virus que podrían utilizarse para construir virus quiméricos incluyen lentivirus, retrovirus, vectores retrovirales pseudotipados y vectores adenovirales.

La presente invención proporciona además ácidos nucleicos aislados de AAV5. Por ejemplo, se proporciona un ácido nucleico aislado como se define en las reivindicaciones, que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: (genoma de AAV5). Este ácido nucleico, o porciones del mismo, puede insertarse en vectores, tales como plásmidos, cromosomas artificiales de levaduras u otros vectores virales (partícula), si se desea, mediante procedimientos de clonación convencionales. La presente invención también proporciona un ácido nucleico aislado que consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1. Los nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 pueden tener modificaciones minoritarias y todavía estar contemplados por la presente invención. Por ejemplo, pueden realizarse fácilmente modificaciones que no alteren el aminoácido codificado por cualquier codón determinado (tal como por modificación de la tercera posición, "oscilante" en un codón) y dichas modificaciones se conocen en la técnica. Además, pueden realizarse modificaciones que provoquen una sustitución aminoacídica neutra (conservada) resultante de un aminoácido similar en una región codificante del genoma. Además, se contemplan en esta invención modificaciones como las descritas en la presente memoria para los componentes de AAV5, tales como las ITR, el promotor p5 etc. Además, es probable que se toleren sin un impacto grave sobre la función del ácido nucleico como vector recombinante modificaciones en regiones de la SEC ID Nº: 1 distintas de las ITR, TRS, sitio de unión a Rep y horquilla.

Como se usa en la presente memoria, el término "aislado" se refiere a un ácido nucleico separado o significativamente libre de al menos algunos de los otros componentes del organismo de origen natural, por ejemplo, los componentes estructurales celulares o componente virales que se encuentran asociados comúnmente con los ácidos nucleicos en el entorno del virus y/o otros ácidos nucleicos. El aislamiento de los ácidos nucleicos nativos puede lograrse, por ejemplo, mediante técnicas tales como lisis celular seguida de extracción con fenol más cloroformo, seguida de precipitación con etanol de los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos de esta invención pueden aislarse a partir de células de acuerdo con cualquiera de muchos procedimientos bien conocidos en la técnica.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "ácido nucleico" se refiere a moléculas de cadena sencilla o de múltiples cadenas que pueden ser ADN o ARN o cualquier combinación de los mismos, incluyendo modificaciones en esos ácidos nucleicos. El ácido nucleico puede representar una cadena codificante o su complementaria, o cualquier combinación de las mismas. Los ácidos nucleicos pueden tener una secuencia idéntica a las secuencias que son de origen natural para cualquiera de los nuevos genes analizados en la presente memoria o pueden incluir codones alternativos que codifiquen el mismo aminoácido que los proporcionados en la presente memoria, incluyendo el que se encuentra en la secuencia de origen natural. Estos ácidos nucleicos también pueden modificarse a partir de su estructura típica. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos metilados, la sustitución de un oxígeno que no forma puente en el residuo fosfato con un azufre (dando desoxinucleótidos de fosforotioato), selenio (dando desoxinucleótidos de fosforoselenoato) o grupos metilo (dando desoxinucleótidos de metilfosfonato).

La presente invención proporciona además un ácido nucleico aislado como se define en las reivindicaciones, que hibrida selectivamente con cualquier ácido nucleico descrito en la presente memoria, incluyendo el genoma completo de AAV5 y cualquier fragmento único del mismo, incluyendo las secuencias codificantes de Rep y la cápside (por ejemplo, las SEC ID Nº: 1, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23). En concreto, el ácido nucleico puede hibridar selectivamente o específicamente con un ácido nucleico aislado que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 (genoma de AAV5). La presente invención proporciona además un ácido nucleico aislado que hibrida selectivamente o específicamente con un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 (genoma de AAV5). Por "hibrida selectivamente", como se usa en la presente memoria, se entiende un ácido nucleico que hibrida con uno de los ácidos nucleicos descritos en condiciones de rigurosidad suficiente sin una hibridación significativa con un ácido nucleico que codifica una proteína no relacionada y, particularmente, sin una hibridación detectable con ácidos nucleicos de AAV2. Por lo tanto, un ácido nucleico que hibrida selectivamente con un ácido nucleico en la presente invención no hibridará selectivamente en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que codifica una proteína diferente o la proteína correspondiente de un serotipo diferente del virus, y viceversa. Un ácido nucleico "que hibrida específicamente" es uno que hibrida en condiciones rigurosas sólo con un ácido nucleico que se encuentra en AAV5. Por lo tanto, se contemplan en la presente memoria ácidos nucleicos para usar, por ejemplo, como cebadores y sondas para detectar o amplificar los ácidos nucleicos diana. Pueden usarse fragmentos de ácidos nucleicos que hibriden selectivamente con cualquier ácido nucleico determinado, por ejemplo, como cebadores y/o sondas para una hibridación adicional o para procedimientos de amplificación (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR)). Además, por ejemplo, puede diseñarse un cebador o sonda que hibride selectivamente tanto con AAV5 como con un gen de interés transportado dentro del vector de AAV5 (es decir, un ácido nucleico quimérico).

La rigurosidad de la hibridación se controla tanto mediante la temperatura como por la concentración salina de cualquiera o de ambas etapas de hibridación y lavado. Típicamente, la rigurosidad de la hibridación para conseguir una hibridación selectiva implica la hibridación en una solución de fuerza iónica elevada (SSC 6X o SSPE 6X) a una temperatura que es de aproximadamente 12-25ºC inferior a la T_{m} (la temperatura de fusión a la que la mitad de las moléculas se disocian de sus parejas de hibridación), seguida de lavado a una combinación de temperatura y concentración salina seleccionada de tal modo que la temperatura de lavado sea de aproximadamente 5ºC a 20ºC inferior a la T_{m}. Las condiciones de temperatura y sal son determinadas fácilmente de manera empírica en experimentos preliminares en los que se hibridan muestras de ADN de referencia inmovilizado sobre filtros con un ácido nucleico de interés marcado y, después, se lavan en condiciones de rigurosidades diferentes. Las temperaturas de hibridación son típicamente superiores para hibridaciones de ADN-ARN y de ARN-ARN. Las temperaturas de lavado pueden usarse según se ha descrito anteriormente para conseguir una rigurosidad selectiva, como se conoce en la técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989; Kuucel et al. Methods Enzymol. 1987: 154: 367, 1987). Una condición de hibridación rigurosa preferible para una hibridación de ADN:ADN puede ser de aproximadamente 68ºC (en una solución acuosa) en SSC 6X o SSPE 6X, seguida de lavado a 68ºC. La rigurosidad de hibridación y lavado, si se desea, puede reducirse en consecuencia a medida que se disminuye el grado de complementariedad deseado y, además, dependiendo de la riqueza en G-C o A-T de cualquier área en la que se busque variabilidad. Asimismo, la rigurosidad de hibridación y lavado, si se desea, puede aumentarse en consecuencia a medida que se aumenta la homología deseada y, además, dependiendo de la riqueza en G-C o A-T de cualquier área en la que se desee una homología elevada, todo ello como se conoce en la técnica.

Se contempla en la presente memoria un ácido nucleico que hibrida selectivamente con cualquier porción del genoma de AAV5. Por lo tanto, un ácido nucleico que hibrida selectivamente con AAV5 puede ser de mayor longitud que el genoma de AAV5, puede ser de aproximadamente la misma longitud que el genoma de AAV5 o puede ser más corto que el genoma de AAV5. La longitud del ácido nucleico está limitada en el límite más corto del intervalo de tamaño sólo por su especificidad para la hibridación con AAV5, es decir, una vez que es demasiado corto, típicamente menor de aproximadamente 5 a 7 nucleótidos de longitud, ya no se unirá específicamente a AAV5, sino que en su lugar hibridará con numerosos ácidos nucleicos de fondo. Se contempla adicionalmente por esta invención un ácido nucleico que tiene una porción que hibrida específicamente con AAV5 y una porción que hibrida específicamente con un gen de interés insertado dentro del AAV5.

La presente solicitud describe además un ácido nucleico aislado que codifica una proteína Rep de virus adenoasociado 5. Las proteínas Rep de AAV5 están codificadas por el marco de lectura abierto (ORF) 1 del genoma de AAV5. Se muestran ejemplos de los genes de Rep de AAV5 en el ácido nucleico expuesto en la SEC ID Nº: 1 e incluyen ácidos nucleicos que consisten esencialmente en las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEC ID Nº: 10 (Rep52), 11 (Rep78), 13 (Rep40) y 15 (Rep68) y ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEC ID Nº:10, 11, 13 y 15. Sin embargo, la presente invención contempla que el ácido nucleico de Rep puede incluir cualquiera de una, dos, tres o cuatro de las cuatro proteínas Rep, en cualquier orden, en dicho ácido nucleico. Además, se contemplan modificaciones menores en el ácido nucleico, tales como mutaciones silenciosas en las secuencias codificantes, mutaciones que generan cambios neutros o conservativos en la secuencia de aminoácidos codificada y mutaciones en regiones reguladoras que no alteran la expresión del gen. Se conocen en el estado de la técnica ejemplos de otras modificaciones menores. Pueden realizarse modificaciones adicionales en el ácido nucleico, tales como para interrumpir o alterar la expresión de una o más de las proteínas Rep para, por ejemplo, determinar el efecto de dicha alteración; tal como mutar una o más de las proteínas Rep para determinar el efecto resultante, etc. Sin embargo, en general, un ácido nucleico modificado que codifica una proteína Rep tendrá una homología de al menos aproximadamente un 85%, de aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 93%, de aproximadamente el 95%, de aproximadamente el 98% o del 100% con las secuencias de ácido nucleico de Rep descritas en la presente memoria, por ejemplo, las SEC ID Nº: 10, 11, 13 y 15 y el polipéptido Rep codificado en las mismas tendrán una homología global de aproximadamente el 93%, de aproximadamente el 95%, de aproximadamente el 98%, de aproximadamente el 99% o del 100% con las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria, por ejemplo, las SEC ID Nº: 2, 3, 12 y 14. El porcentaje de homología se determina mediante las técnicas descritas en la presente memoria.

La presente solicitud también describe un ácido nucleico aislado que hibrida selectivamente o específicamente con un ácido nucleico que consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEC ID Nº: 10, 11, 13 y 15 y un ácido nucleico aislado que hibrida selectivamente con un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEC ID Nº: 10, 11, 13 y 15. Las expresiones "que hibrida selectivamente" y "rigurosidad de hibridación" se definen en otra parte en la presente memoria.

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención puede comprender el ácido nucleico que codifica una proteína Rep 40 y, en particular, un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 13, un ácido nucleico aislado que consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 13 y un ácido nucleico que codifica la proteína del virus adenoasociado 5 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 12. La presente invención también puede comprender el ácido nucleico que codifica una proteína Rep 52 y, en particular, un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 10, un ácido nucleico aislado que consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 10 y un ácido nucleico que codifica la proteína Rep del virus adenoasociado 5 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 2. La presente invención puede comprender además el ácido nucleico que codifica una proteína Rep 68 y, en particular, un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 15, un ácido nucleico aislado que consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 15 y un ácido nucleico que codifica la proteína del virus adenoasociado 5 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 14. Y, además, la presente invención puede comprender el ácido nucleico que codifica una proteína Rep 78 y, en particular, un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 11, un ácido nucleico aislado que consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 11 y un ácido nucleico que codifica la proteína Rep del virus adenoasociado 5 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 3. Como se describe en otra parte en la presente memoria, estos ácidos nucleicos pueden tener modificaciones menores, incluyendo sustituciones de nucleótidos silenciosas, mutaciones que provocan sustituciones conservativas de aminoácidos en las proteínas codificadas y mutaciones en regiones de control que no afectan o que afectan mínimamente a la secuencia de aminoácidos codificada.

La presente invención proporciona además un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la cápside de AAV5 completo, como se define en las reivindicaciones. Además, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica cada una de las tres proteínas de cubierta de AAV5, VP1, VP2 y VP3, como se define en las reivindicaciones. Por lo tanto, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica VP1 de AAV5, un ácido nucleico que codifica VP2 de AAV5 y un ácido nucleico que codifica VP3 de AAV5. Por lo tanto, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 4 (VP1); un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 5 (VP2) y un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 6 (VP3). La presiente invención también proporciona específicamente un ácido nucleico que comprende la SEC ID Nº: 7 (gen de VP I); un ácido nucleico que comprende la SEC ID Nº: 8 (gen de VP2); y un ácido nucleico que comprende la SEC ID Nº: 9 (gen de VP3). La presente invención también proporciona específicamente un ácido nucleico que consiste esencialmente en la SEC ID Nº: 7 (gen de VP 1), un ácido nucleico que consiste esencialmente en la SEC ID Nº: 8 (gen de VP2) y un ácido nucleico que consiste esencialmente en la SEC ID Nº: 9 (gen de VP3). Se contemplan modificaciones menores en las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la cápside o de cubierta, como se han descrito anteriormente, para otros ácidos nucleicos de AAV5. Sin embargo, en general, un ácido nucleico modificado que codifica una proteína de la cápside tendrá una homología de al menos aproximadamente el 85%, de aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 93%, de aproximadamente el 95%, de aproximadamente el 98% o del 100% con las secuencias de ácidos nucleicos de la cápside descritas en la presente memoria, por ejemplo, las SEC ID Nº: 7, 8 y 9, y el polipéptido de la cápside codificado en el mismo tendrá una homología global de aproximadamente el 93%, de aproximadamente el 95%, de aproximadamente el 98%, de aproximadamente el 99% o del 100% con la secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria, por ejemplo, las SEC ID Nº: 4, 5 y 6. También se proporcionan ácidos nucleicos que hibridan selectivamente con los ácidos nucleicos de las SEC ID Nº: 7, 8 y 9 en las condiciones descritas anteriormente.

La presente invención también proporciona una célula que contiene uno o más de los ácidos nucleicos que se reivindican en la presente memoria, tales como el genoma de AAV5, la ORF1 y la ORF2 de AAV5, cada gen de una proteína Rep de AAV5 o cada gen de una proteína de la cápside de AAV5. Dicha célula puede ser cualquier célula deseada y puede seleccionarse en base al uso deseado. Por ejemplo, las células pueden incluir células bacterianas, células de levadura, células de insecto, células HeLa humanas y células Cos de simios, así como otras células y líneas celulares de seres humanos y mamíferos. Pueden usarse cultivos primarios, así como cultivos y líneas celulares establecidas. Pueden liberarse ácidos nucleicos de la presente invención a células mediante cualquier medio seleccionado dependiendo, en particular, de las células diana. Se conocen bien en el estado de la técnica muchos medios de liberación. Por ejemplo, puede utilizarse electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección, liposomas catiónicos o aniónicos y liposomas en combinación con un péptido señal de localización nuclear para la administración al núcleo, como se conoce en la técnica. Además, si los ácidos nucleicos están en una partícula viral, las células pueden transducirse simplemente con el virión por medios convencionales conocidos en la técnica para transducción de AAV. Pueden generarse pequeñas cantidades del virus AAV5 recombinante para infectar células y producir más del mismo.

La solicitud describe polipéptidos de AAV5 purificados. El término "polipéptido", como se usa en la presente memoria, se refiere a un polímero de aminoácidos e incluye proteínas de longitud completa y fragmentos de las mismas. Por lo tanto, los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se usan con frecuencia de forma intercambiable en la presente memoria. Pueden seleccionarse sustituciones que sean neutras por parámetros conocidos (véase, por ejemplo, Robinson WE Jr y Mitchell WM., AIDS 4: S151-S162 (1990)). Como será entendido por los expertos en la materia, la invención también incluye los polipéptidos que tienen ligeras variaciones en las secuencias de aminoácidos u otras propiedades. Dichas variaciones pueden aparecer de forma natural como variantes alélicas (por ejemplo, debido al polimorfismo genético) o pueden producirse por intervención humana (por ejemplo, por mutagénesis de secuencias de ADN clonadas), tales como mutantes, de deleción, de inserción, de sustitución y puntuales inducidos. Generalmente se prefieren cambios menores en la secuencia de aminoácidos, tales como reemplazos de aminoácidos conservativos, pequeñas deleciones o inserciones internas y adiciones o deleciones en los extremos de las moléculas. Pueden diseñarse sustituciones en base a, por ejemplo, el modelo de Dayhoff, et al. (en Atlas of Protein Sequence and Structure 1978, Nat'l Biomed. Res. Found., Washington, D. C.). Estas modificaciones pueden dar como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, proporcionar mutaciones silenciosas, modificar un sitio de restricción o proporcionar otras mutaciones específicas. Con frecuencia, la localización de cualquier modificación en el polipéptido determinará su impacto sobre su función. Particularmente, se tolerarán alteraciones en regiones no esenciales para la función de la proteína con pocos efectos sobre la función. En otra parte en la solicitud se describen regiones de las proteínas de AAV5 para proporcionar una guía sobre dónde pueden realizarse sustituciones, adiciones o deleciones para minimizar la probabilidad de alterar la función de la variante.

Puede obtenerse fácilmente un polipéptido mediante cualquiera de varios medios. Por ejemplo, el polipéptido de interés puede sintetizarse químicamente mediante procedimientos convencionales. Además, las regiones codificantes de los genes pueden expresarse de forma recombinante y el polipéptido resultante aislarse mediante procedimientos convencionales. Además, puede generarse un anticuerpo específico para el polipéptido resultante por procedimientos convencionales (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988) y la proteína puede aislarse a partir de una célula que exprese el ácido nucleico que codifica el polipéptido mediante hibridación selectiva con el anticuerpo. Esta proteína puede purificarse hasta el grado deseado mediante procedimientos convencionales de purificación de proteínas (véase, por ejemplo,Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).

Típicamente, para que sea único, un fragmento polipeptídico tendrá al menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud; sin embargo, los fragmentos únicos pueden tener 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos de longitud. Un polipéptido único comprenderá típicamente dicho fragmento único; sin embargo, también puede determinarse un polipéptido único por su homología global. Un polipéptido único puede tener 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos de longitud. La singularidad de un fragmento polipeptídico puede determinarse fácilmente por procedimientos convencionales, tales como búsquedas en bases de datos informáticas de péptidos o secuencias de ácidos nucleicos conocidas o mediante estudios de hibridación con el ácido nucleico que codifica la proteína o con la propia proteína, como se conoce en el estado de la técnica. La singularidad de un fragmento polipeptídico también puede determinarse inmunológicamente, así como funcionalmente. La singularidad puede determinarse simplemente en una comparación aminoácido por aminoácido de los polipéptidos.

Un fragmento antigénico o inmunorreactivo es típicamente una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 5 aminoácidos consecutivos y puede proceder de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de AAV5. Un fragmento de AAV5 antigénico es cualquier fragmento único para la proteína de AAV5, como se describe en la presente memoria, contra el que puede generarse un anticuerpo específico de AAV5 mediante procedimientos convencionales. Por lo tanto, la reacción antígeno-anticuerpo resultante debería ser específica para AAV5.

La presente solicitud describe una proteína Rep de AAV5 aislada. Un polipéptido Rep de AAV5 está codificado por el ORF1 de AAV5. La presente solicitud también describe cada proteína Rep de AAV5 individual. Por lo tanto, la presente solicitud describe la Rep 40 de AAV5 (por ejemplo, la SEC ID Nº: 12) o una fragmento único de la misma. La presente solicitud describe la Rep 52 de AAV5 (por ejemplo, la SEC ID Nº: 2) o un fragmento único de la misma. La presente solicitud proporciona la Rep 68 de AAV5 (por ejemplo, la SEC ID Nº: 14) o un fragmento único de la misma. La presente solicitud proporciona un ejemplo de Rep 78 de AAV5 (por ejemplo, la SEC ID Nº: 3) o un fragmento único de la misma. Por "fragmento único de la misma" se entiende cualquier fragmento polipeptídico más pequeño codificado por un gen de rep de AAV5 que tiene una longitud suficiente para encontrarse solamente en el polipéptido Rep. Pueden realizarse sustituciones y modificaciones de la secuencia de aminoácidos como se ha descrito anteriormente y, además, pueden incluir modificaciones en el procesamiento de proteínas, tales como glicosilación, en el polipéptido.

La presente solicitud proporciona además un polipéptido de la cápside de AAV5 o un fragmento único del mismo. El polipéptido de la cápside de AAV5 está codificado por el ORF 2 de AAV5. La presente solicitud proporciona además las proteínas individuales de la cápside de AAV5, VP1, VP2 y VP3 o fragmentos únicos de las mismas. Por lo tanto, la presente solicitud proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 4 (VP 1). La presente solicitud proporciona adicionalmente un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 5 (VP2). La presente solicitud también proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 6 (VP3). Por "fragmento único del mismo" se entiende cualquier fragmento polipeptídico más pequeño codificado por cualquier gen de la cápside de AAV5 que tiene un tamaño suficiente para encontrarse solamente en la proteína de la cápside de AAV5. Pueden realizarse sustituciones y modificaciones de la secuencia de aminoácidos como se han descrito anteriormente y, además, pueden incluir modificaciones en el procesamiento de proteínas, tales como glicosilación, en el polipéptido. Sin embargo, un polipéptido de la cápside de AAV5 que incluya las tres proteínas de cubierta tendrá una homología global mayor de aproximadamente el 56% con el polipéptido codificado por los nucleótidos expuestos en las SEC ID Nº: 4, 5 ó 6. La proteína puede tener una homología de aproximadamente el 65%, de aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 75%, de aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 85%, de aproximadamente el 90%, 93%, 95%, 97% o incluso del 100% con la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos expuestos en las SEC ID Nº: 4, 5 ó 6. Un polipéptido VP1 de AAV5 puede tener una homología de al menos aproximadamente el 58%, de aproximadamente el 60%, de aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 90%, 93%, 95%, 97% o de aproximadamente el 100% con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº:4. Un polipéptido VP2 de AAV5 puede tener una homología de al menos aproximadamente el 58%, de aproximadamente el 60%, de aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 90%, 93%, 95%, 97% o de aproximadamente el 100% con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 5. Un polipéptido VP3 de AAV5 puede tener una homología de al menos aproximadamente el 60%, de aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 90%, 93%, 95%, 97% o de aproximadamente el 100% con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 6.

La presente solicitud describe además un anticuerpo aislado que se une específicamente a una proteína Rep de AAV5 o a un epítopo único de la misma. También se proporcionan anticuerpos aislados que se unen específicamente a la proteína Rep 52 de AAV5, la proteína Rep 40 de AAV5, la proteína Rep 68 de AAV5 y la proteína Rep 78 de AAV5, que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14 y SEC ID Nº: 3, respectivamente, o que se unen específicamente a un fragmento único de las mismas. Claramente, cualquier anticuerpo dado puede reconocer y unirse a uno de varios epítopos posibles presentes en el polipéptido; por lo tanto, puede ser sólo necesario que esté presente en un ensayo una porción única de un polipéptido (que tiene el epítopo) para determinar si el anticuerpo se une específicamente al polipéptido.

La presente solicitud proporciona adicionalmente un anticuerpo aislado que se une específicamente a cualquiera de las proteínas de la cápside del virus adenoasociado 5 (VP1, VP2 o VP3), un epítopo único de las mismas o el polipéptido que comprende las tres proteínas de cubierta de AAV5. También se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la proteína de la cápside de AAV5, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 4 (VP1), o que se une específicamente a un fragmento único de la misma. La presente solicitud proporciona además un anticuerpo aislado que se une específicamente a la proteína de la cápside de AAV5 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 5 (VP2), o que se une específicamente a un fragmento único de la misma. La solicitud proporciona adicionalmente un anticuerpo aislado que se une específicamente a la proteína de la cápside de AAV5 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 6 (VP3), o que se une específicamente a un fragmento único de la misma. De nuevo, cualquier anticuerpo dado puede reconocer y unirse a uno de varios epítopos posibles presentes en el polipéptido; por lo tanto, puede ser sólo necesario que esté presente en un ensayo una porción única de un polipéptido (que tiene el epítopo) para determinar si un anticuerpo se une específicamente al polipéptido.

El anticuerpo puede ser un componente de una composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente a la proteína de AAV5. La composición puede comprender además, por ejemplo, suero, medio libre de suero o un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina fisiológica, etc.

Por "un anticuerpo que se une específicamente a" un polipéptido o proteína de AAV5 se entiende un anticuerpo que se une selectivamente a un epítopo en cualquier porción del péptido de AAV5, de tal modo que el anticuerpo se une específicamente al polipéptido de AAV5 correspondiente sin una señal de fondo significativa. La unión específica por un anticuerpo significa además que el anticuerpo puede usarse para retirar selectivamente el polipéptido diana de una muestra que comprende el polipéptido y/o puede determinarse fácilmente mediante radioinmunoensayo (RIA), bioensayo o tecnología inmunoabsorbente ligada a enzimas (ELISA). Un procedimiento de ELISA eficaz para la detección de la unión antígeno-anticuerpo específica puede ser, por ejemplo, el siguiente: (1) unir el anticuerpo a un sustrato; (2) poner en contacto el anticuerpo unido con una muestra que contiene el antígeno; (3) poner en contacto lo anterior con un anticuerpo secundario unido a una porción detectable (por ejemplo, enzima peroxidasa de rábano ("horseradish") o enzima fosfatasa alcalina); (4) poner en contacto lo anterior con el sustrato para la enzima; (5) poner en contacto lo anterior con un reactivo de color; (6) observar el cambio de color.

Un anticuerpo puede incluir fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab que conservan la actividad de unión. Pueden generarse anticuerpos como se describe en, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988). Brevemente, puede inyectarse un antígeno purificado en un animal en una cantidad y en intervalos suficientes para provocar una respuesta inmune. Los anticuerpos pueden purificarse directamente o pueden obtenerse células de bazo del animal. Después, las células se fusionan con una línea celular inmortal y se criban por la secreción de anticuerpos. Después, se propagan hibridomas individuales como clones individuales que sirven como fuente para un anticuerpo monoclonal particular.

La presente solicitud proporciona adicionalmente un procedimiento de cribado de una célula por infectividad por AAV5 que comprende poner en contacto a la célula con AAV5 y detectar la presencia de AAV5 en las células. Pueden detectarse partículas de AAV5 usando cualquier procedimiento físico o bioquímico convencional. Por ejemplo, los procedimientos físicos que pueden usarse para esta detección incluyen procedimientos basados en ADN tales como 1) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para ADN o ARN viral o 2) hibridación directa con sondas marcadas y procedimientos inmunológicos tales como mediante 3) anticuerpo dirigido contra las proteínas virales estructurales o no estructurales. Los procedimientos catalíticos de detección viral incluyen, pero no se limitan a, la detección de actividad de mellado de ADN específica de sitio y cadena de proteínas Rep o de replicación de un sustrato que contiene un origen de AAV. También pueden utilizarse genes indicadores para detectar células que transduzcan AAV-5. Por ejemplo, puede insertarse \beta-gal, proteína verde fluorescente o luciferasa en un AAV-5 recombinante. Después, la célula puede ponerse en contacto con el AAV-5 recombinante in vitro o in vivo y un ensayo colorimétrico podría detectar un cambio de color en las células que indicaría la transducción de AAV-5 en la célula. Se describen procedimientos de detección adicionales en Fields, Virology, Raven Press, Nueva York, Nueva York. 1996.

Para el cribado de una célula por infectividad mediante AVV5, en la que la presencia de AAV5 en las células se determina por procedimientos de hibridación de ácido nucleico, una sonda de ácido nucleico para dicha detección puede comprender, por ejemplo, un fragmento único de cualquiera de los ácidos nucleicos de AAV5 proporcionados en la presente memoria. La singularidad de cualquier sonda de ácido nucleico puede determinarse fácilmente como se describe en la presente memoria. Además, la presencia de AAV5 en las células puede determinarse por fluorescencia, anticuerpos contra productos génicos, ensayos de formación de focos, aparición de placas, transferencias Western y ensayos cromogénicos. El ácido nucleico puede ser, por ejemplo, el ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos se expone en las SEC ID Nº: 1, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o un fragmento único de la misma.

La presente solicitud incluye un procedimiento de determinación de la idoneidad de un vector de AAV5 para la administración a un sujeto, que comprende administrar a una muestra del sujeto que contiene anticuerpos un fragmento antigénico de una proteína Rep o de la cápside de AAV5 aislada y detectar una reacción antígeno-anticuerpo neutralizante en la muestra, indicando la presencia de una reacción neutralizante que el vector de AAV5 puede ser inadecuado para el uso en el sujeto. El presente procedimiento de determinación de la idoneidad de un vector de AAV5 para la administración a un sujeto puede comprender poner en contacto una muestra del sujeto que contiene anticuerpos con un fragmento antigénico o inmunogénico único de una proteína Rep de AAV5 (por ejemplo, Rep 40, Rep 52, Rep 68, Rep 78) y detectar una reacción antígeno-anticuerpo en la muestra, indicando la presencia de una reacción que el vector de AAV5 es inadecuado para el uso en el sujeto. Se proporcionan en la presente memoria las proteínas Rep de AAV5 y sus fragmentos antigénicos se determinan de forma rutinaria. La proteína de la cápside de AAV5 puede usarse para seleccionar un fragmento antigénico o inmunogénico, por ejemplo, a partir de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 4 (VP1), la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 5 (VP2) o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 6 (VP3). Como alternativa, o adicionalmente, puede utilizarse un fragmento antigénico o inmunogénico de una proteína Rep de AAV5 aislada en este procedimiento de determinación. La proteína Rep de AAV5 de la que se selecciona un fragmento antigénico puede tener la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico expuesto en la SEC ID Nº: 1, la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 2 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 3, la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 12 o la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 14.

Pueden analizarse los fragmentos polipeptídicos de AAV5 para determinar su antigenicidad, inmunogenicidad y/o especificidad. En resumen, se preparan diversas concentraciones de un supuesto fragmento inmunogénicamente específico y se administran a un sujeto y se determina la respuesta inmunológica (por ejemplo, la producción de inmunidad mediada por anticuerpos o por células) de un animal para cada concentración. Las cantidades de antígeno administradas dependen del sujeto, por ejemplo, un ser humano, conejo o cobaya, de la afección del sujeto, del tamaño del sujeto, etc. A partir de entonces, un animal inoculado de este modo con el antígeno puede exponerse a la partícula viral de AAV5 o a la proteína de AAV5 para ensayar la inmunorreactividad o la antigenicidad del fragmento inmunogénico específico. La especificidad de un supuesto fragmento antigénico o inmunogénico puede determinarse mediante repruebas en suero, otros fluidos o linfocitos procedentes del animal inoculado para la reactividad cruzada con otros virus estrechamente relacionados, tales como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 y AAV5.

También puede usarse el ensayo de hemaglutinación para identificar y detectar rápidamente partículas virales de AAV5. La detección de actividad de hemaglutinación se correlaciona con infectividad y puede usarse para titular el virus. Este ensayo también podría usarse para identificar anticuerpos en un suero de paciente que puede que interaccione con el virus. Se ha demostrado que la hemaglutinación se correlaciona con la infectividad y, por lo tanto, la hemaglutinación puede ser un ensayo útil para identificar receptores celulares de AAV5.

Mediante la expresión "idoneidad de un vector de AAV5 para la administración a un sujeto" se entiende una determinación de si el vector de AAV5 provocará una respuesta inmune neutralizante tras la administración a un sujeto particular. Un vector que no provoca una respuesta inmune significativa es un vector potencialmente adecuado, mientras que un vector que provoca una respuesta inmune neutralizante significativa (por ejemplo, de al menos el 90%) es por lo tanto probable que sea inadecuado para el uso en ese sujeto. La significación de cualquier respuesta inmune detectable es un parámetro convencional que entienden los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede incubar el suero del sujeto con el virus, después determinar si ese virus conserva su capacidad para transducir células en cultivo. Si dicho virus no puede transducir células en cultivo, probablemente el vector ha provocado una respuesta inmune significativa.

Como alternativa, o adicionalmente, un experto en la materia podría determinar si la administración o no de AAV5 sería adecuada para un tipo celular particular de un sujeto. Por ejemplo, el experto podría cultivar células musculares in vitro y transducir las células con AAV5 en presencia o ausencia del suero del sujeto. Si existe una reducción en la eficacia de la transducción, esto podría indicar la presencia de un anticuerpo neutralizante u otros factores que puedan inhibir la transducción. Normalmente, tendría que observarse una inhibición superior al 90% para descartar el uso de AAV-5 como vector. Sin embargo, esta limitación podría superarse mediante el tratamiento del sujeto con un inmunosupresor que pudiera bloquear los factores que inhiben la transducción.

Como reconocerán los expertos en la materia, están disponibles numerosos tipos de inmunoensayos para detectar la unión entre un anticuerpo y un polipéptido de AAV5. Por ejemplo, ensayos de unión directa e indirecta, ensayos competitivos, ensayos de tipo sándwich y similares, como se describen en general en, por ejemplo, las patentes US Nº 4.642.285; 4.376.110; 4.016.043; 3.879.262; 3.852.157; 3.850.752; 3.839.153; 3.791.932; y Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, N. Y. (1988). Por ejemplo, inmunoensayos enzimáticos tales como ensayos de inmunofluorescencia (IFA), ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) e inmunotransferencias pueden adaptarse fácilmente para lograr la detección del anticuerpo. Un procedimiento de ELISA eficaz para la detección del anticuerpo unido al antígeno puede ser, por ejemplo, el siguiente: (1) unir el antígeno a un sustrato; (2) poner en contacto el antígeno unido con una muestra de fluido o tejido que contiene el anticuerpo; (3) poner en contacto lo anterior con un anticuerpo secundario específico para el antígeno y unido a una porción detectable (por ejemplo, enzima peroxidasa de rábano o enzima fosfatasa alcalina); (4) poner en contacto lo anterior con el sustrato para la enzima; (5) poner en contacto lo anterior con un reactivo de color; (6) observar el cambio de color.

La muestra que contiene anticuerpos de este procedimiento puede comprender cualquier muestra biológica que contuviera el anticuerpo o una célula que contiene el anticuerpo, tal como sangre, plasma, suero, médula ósea, saliva y orina.

La presente invención también proporciona un procedimiento de producción del virus AAV5 mediante transducción de una célula con el ácido nucleico que codifica el virus.

El presente procedimiento proporciona además un procedimiento de liberación de un ácido nucleico exógeno (heterólogo) en una célula que comprende administrar a la célula una partícula de AAV5 que contiene un vector que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV, liberando de este modo el ácido nucleico a la célula.

Las ITR de AAV en el vector para los procedimientos de liberación descritos en la presente memoria pueden ser ITR de AAV5 (SEC ID Nº: 19 y 20). Además, las ITR de AAV en el vector para los procedimientos de liberación de ácidos nucleicos descritos en la presente memoria pueden comprender también repeticiones terminales invertidas de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 o AAV6.

La presente invención también incluye un procedimiento de liberación de un ácido nucleico heterólogo a una célula ex vivo, que comprende administrar a la célula una partícula de AAV5 que contiene un vector según se define en las reivindicaciones, que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV, y la célula puede devolverse al sujeto, liberando de este modo el ácido nucleico al sujeto. Las ITR de AAV pueden ser cualquier ITR de AAV, incluyendo las ITR de AAV5 y las ITR de AAV2. Por ejemplo, en una administración ex vivo, se aíslan células de un sujeto por medios convencionales de acuerdo con el tipo celular y se colocan en un medio de cultivo apropiado, de nuevo de acuerdo con el tipo celular (véase, por ejemplo,el catálogo de la ATCC). Después, las partículas virales se ponen en contacto con las células según se ha descrito anteriormente y se permite que el virus transduzca las células. Después, las células pueden transplantarse de nuevo en el cuerpo del sujeto, de nuevo por medios convencionales para el tipo celular y el tejido (por ejemplo, en general, Patente de Estados Unidos Nº 5.399.346; para células nerviosas, Dunnett, S. B. y Björklund, A., eds., Transplantation: Neural Transplantation-A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford (1992)). Si se desea, antes del transplante, las células pueden estudiarse para determinar el grado de transducción por el virus por medios de detección conocidos, y como se describe en la presente memoria. Las células para la transducción ex vivo seguida de trasplante en un sujeto pueden seleccionarse de las enumeradas anteriormente o puede ser cualquier otra célula seleccionada. Preferiblemente, un tipo celular seleccionado se examina para determinar su capacidad para ser transfectado por AAV5. Preferiblemente, las células seleccionada será una célula fácilmente transducida con partículas de AAV5; sin embargo, dependiendo de la aplicación, pueden ser útiles incluso células con eficacias de transducción relativamente bajas, particularmente si la célula procede de un tejido u órgano en el que incluso la producción de una pequeña cantidad de la proteína o del ARN antisentido codificado por el vector será beneficiosa para el sujeto.

La presente invención puede usarse en un procedimiento de liberación de un ácido nucleico a una célula en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una partícula de AAV5 que contiene un vector que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV, liberando de este modo el ácido nucleico a una célula en el sujeto. La administración puede ser una administración directamente ex vivo a una célula extirpada de un sujeto, tal como cualquiera de las células enumeradas anteriormente, seguida de la recolocación de la célula de nuevo en el sujeto, o la administración puede ser una administración in vivo a una célula en el sujeto. Para la administración ex vivo se aíslan células de un sujeto por medios convencionales de acuerdo con el tipo celular y se colocan en un medio de cultivo apropiado, de nuevo de acuerdo con el tipo celular (véase, por ejemplo,el catálogo de la ATCC). Después, las partículas virales se ponen en contacto con las células como se ha descrito anteriormente, y se permite que el virus transfecte las células. Después, las células pueden transplantarse de nuevo en el cuerpo del sujeto, de nuevo por medios convencionales para el tipo celular y el tejido (por ejemplo, para células nerviosas, Dunnett, S. B. y Björklund, A., eds., Transplantation: Neural Transplantation-A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford (1992)). Si se desea, antes del trasplante, las células pueden estudiarse para determinar el grado de transfección por el virus, por medios de detección conocidos y como se describe en la presente memoria.

La presente invención puede usarse en un procedimiento de liberación de un ácido nucleico a una célula en un sujeto que tiene anticuerpos neutralizantes contra AAV2, que comprende administrar al sujeto una partícula de AAV5 que contiene un vector que comprende el ácido nucleico, liberando de este modo el ácido nucleico a una célula en el sujeto. Un sujeto que tiene anticuerpos neutralizantes contra AAV2 puede determinarse fácilmente mediante cualquiera de varios medios conocidos, tales como poner en contacto una proteína o proteínas de AAV2 con una muestra que contiene anticuerpos, tal como sangre, procedente de un sujeto y detectar una reacción antígeno-anticuerpo en la muestra. La liberación de la partícula de AAV5 puede ser por administración ex vivo o in vivo, como se describe en la presente memoria. Así, en un sujeto que puede que tenga una reacción inmunogénica adversa frente a un vector administrado en una partícula viral de AAV2 puede haber un ácido nucleico deseado liberado usando una partícula de AAV5. Este sistema de liberación puede ser particularmente útil para sujetos que han recibido terapia utilizando partículas de AAV2 en el pasado y que han desarrollado anticuerpos contra AAV2. Actualmente puede sustituirse un régimen de AAV5 para liberar el ácido nucleico deseado.

En cualquiera de los procedimientos de liberación de ácidos nucleicos heterólogos a una célula o sujeto descritos en la presente memoria, puede usarse el ácido nucleico conjugado con AAV5 o los ácidos nucleicos conjugados a partículas de AAV5 descritos en la presente memoria.

La administración in vivo a un sujeto humano o a un modelo animal puede ser mediante cualquiera de los muchos medios convencionales para administrar virus, dependiendo del órgano, tejido o célula diana. Pueden administrarse partículas de virus por vía oral, por vía parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa), por inyección intramuscular, por inyección directa a tejido u órgano, por inyección intraperitoneal, por vía tópica, por vía transdérmica, mediante administración por aerosol, a través de la mucosa o similares. También pueden administrase ácidos nucleicos virales (no encapsidados), por ejemplo, como un complejo con liposomas catiónicos o encapsulados en liposomas aniónicos. Las presentes composiciones pueden incluir diversas cantidades de la partícula viral o del ácido nucleico viral no encapsidado seleccionado en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable y, además, si se desea, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, vehículos, adyuvantes, diluyentes, etc. Si se usa la administración parenteral, ésta se caracteriza generalmente por inyección. Pueden prepararse inyectables en formas convencionales, como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en un líquido antes de la inyección o como emulsiones. Las dosificaciones dependerán del modo de administración, de la enfermedad o afección que se trate y de la condición del sujeto individual, pero será esa dosificación típica para y usada en la administración de otros vectores de AAV, tales como vectores de AAV2. Con frecuencia puede ser suficiente una sola dosis; sin embargo, la dosis puede repetirse si es conveniente.

Pueden usarse procedimientos de liberación para tratar trastornos cerebrales tales como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y enfermedad desmielinizante. Otras enfermedades que pueden tratarse mediante estos procedimientos incluyen trastornos metabólicos tales como enfermedades musculoesqueléticas, enfermedad cardiovascular, cáncer y trastornos autoinmunes.

La administración de este virión de AAV5 recombinante a la célula puede lograrse por cualquier medio, incluyendo contactando simplemente la partícula, opcionalmente contenida en un líquido deseado tal como un medio de cultivo de tejidos o una solución salina tamponada, con las células. Puede permitirse que el virión permanezca en contacto con las células durante cualquier extensión de tiempo deseada y, típicamente, el virión se administra y se permite que permanezca de forma indefinida. Para dichos procedimientos in vitro, el virión puede administrarse a la célula por procedimientos de transducción viral convencionales, como se conocen en el estado de la técnica y se ejemplifican en la presente memoria. Pueden variar los títulos de virus a administrar, dependiendo particularmente del tipo celular, pero serán típicamente los usados para la transducción de AAV en general, que se conocen bien en la técnica. Además, pueden utilizarse los títulos usados para transducir las células particulares en los presentes ejemplos.

Las células que pueden transducirse por el presente virión de AAV5 recombinante puede incluir cualquier célula deseada, tal como las siguientes células y células procedentes de los siguientes tejidos humanos, así como de tejidos de otros mamíferos, tales como primate, caballo, oveja, cabra, cerdo, perro, rata y ratón: adipocitos, adenocitos, corteza adrenal, amnios, aorta, ascitis, astrocitos, vejiga, hueso, médula ósea, cerebro, mama, bronquios, músculo cardiaco, ciego, cuello uterino, corion, colon, conjuntiva, tejido conectivo, córnea, dermis, duodeno, endometrio, endotelio, células endoteliales, tejido epitelial, células epiteliales, epidermis, esófago, ojo, fascias, fibroblastos, prepucio, gástrico, células gliales, glioblastos, gónadas, células hepáticas, histiocito, íleon, intestino, intestino delgado, yeyuno, queratinocitos, riñón, laringe, leucocitos, lipocito, hígado, pulmón, ganglio linfático, linfoblasto, linfocitos, macrófagos, nódulo alveolar mamario, glándula mamaria, mastocito, maxilar, melanocitos, mesénquima, monocitos, boca, mielina, mioblastos, tejido nervioso, neuroblasto, neuronas, neuroglía, osteoblastos, células osteogénicas, ovario, paladar, páncreas, papilomas, peritoneo, pituicitos, faringe, placenta, células plasmáticas, pleura, próstata, recto, glándula salival, músculo esquelético, piel, músculo liso, somáticas, bazo, escamosas, estómago, glándula submandibular, glándula submaxilar, sinoviocitos, testículo, timo, tiroides, trabéculas, traquea, cornetes, cordón umbilical, uréter y útero.

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Declaración de utilidad

La presente invención proporciona vectores recombinantes basados en AAV5. Dichos vectores pueden ser útiles para transducir células progenitoras eritroides o células que carecen de proteoglicanos de heparán sulfato, que es muy ineficaz con vectores basados en AAV2. Estos vectores también pueden ser útiles para transducir células con un ácido nucleico de interés para producir líneas células que podrían usarse para cribar agentes que interaccionen con el producto génico del ácido nucleico de interés. Además de la transducción de otros tipos celulares, la transducción de células eritroides sería útil para el tratamiento del cáncer y de enfermedades genéticas que pueden corregirse mediante trasplantes de médula ósea usando donantes que coincidan. Algunos ejemplos de este tipo de tratamiento incluyen, pero no se limitan a, la introducción de un gen terapéutico tal como genes que codifican interferones, interleuquinas, factores de necrosis tumoral, adenosina desaminasa, factores de crecimiento celular tales como linfoquinas, factores de coagulación sanguínea, tales como factor VIII y IX, proteínas de captación y transporte del metabolismo del colesterol tales como EpoE y receptor de LDL y secuencias antisentido para inhibir la replicación viral de, por ejemplo, la hepatitis o el VIH.

La presente invención proporciona un vector que comprende el virus AAV5, así como partículas virales de AAV5. Aunque AAV5 es similar a AAV2, se descubre en la presente memoria que los dos virus son físicamente y genéticamente diferentes. Estas diferencias dotan a AAV5 de algunas ventajas únicas que lo adaptan mejor como vector para terapia génica.

Además, como se muestra en la presente memoria, la proteína de la cápside de AAV5 es diferente de la proteína de la cápside de AAV2 y presenta un tropismo tisular diferente. Probablemente AAV2 y AAV5 utilizan diferentes receptores celulares. AAV2 y AAV5 son serológicamente diferentes y, por lo tanto, en una aplicación de terapia génica, AAV5 permitiría la transducción de un paciente que ya posee anticuerpos neutralizantes contra AAV2, ya sea como resultado de una defensa inmunológica natural o de una exposición anterior a vectores de AAV2.

La presente invención se describe más particularmente en los siguientes ejemplos que tienen por objeto ser sólo ilustrativos, puesto que serán evidentes numerosas modificaciones y variaciones en los mismos para los expertos en la materia.

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Ejemplos

Para entender la naturaleza del virus AAV5, y para determinar su utilidad como vector para transferencia génica, se clonó y se secuenció.

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Cultivo celular y propagación de virus

Se mantuvieron células Cos y HeLa como cultivos monocapa en medio D10 (medio de Eagle modificado por Dulbecco) que contenía suero fetal de ternero al 10%, penicilina 100 \mug/ml, estreptomicina 100 unidades/ml y Fungizona IX como recomendaba el fabricante; (GIBCO, Gaithersburg, MD, Estados Unidos). Todos los otros tipos celulares se cultivaron en condiciones convencionales que se han descrito anteriormente.

Se produjo el virus como se ha descrito anteriormente para AAV2 usando el plásmido vector con Beta-galactosidasa y un plásmido auxiliar que contenía los genes de Rep y Cap de AAV5 (9). El plásmido auxiliar se construyó de tal modo que minimizara cualquier secuencia homóloga entre los plásmidos auxiliar y vector. Esta etapa se realizó para minimizar el potencial de formación de partículas de tipo salvaje (wt) mediante recombinación homóloga.

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Clonación de ADN y secuenciación y análisis

Para clonar el genoma de AAV5, se expandió un lisado celular infeccioso en células cos adherentes y después se aislaron células HeLa en suspensión con las partículas virales resultantes mediante centrifugación en gradiente isopícnico con CsCl. Transferencias puntuales de ADN de alícuotas de las fracciones del gradiente indicaron que la mayor concentración de genomas virales estaba contenida en las fracciones con un índice de refracción de aproximadamente 1,372. Aunque la descripción inicial del virus no determinaba la densidad de las partículas, este valor es similar al de AAV2. El análisis de ADN procedente de virión hibridado obtenido de estas fracciones indicó una especie principal de 4,6 kb de longitud que, tras el análisis de restricción, daba bandas de un tamaño similar a las descritas anteriormente. Un mapeado de restricción adicional indicó un único sitio BssHII en un extremo del genoma viral. Este sitio se usó para clonar el fragmento principal del genoma viral. Se aislaron clones de solapamiento adicionales y se determinó la secuencia. Se identificaron dos marcos de lectura abiertos (ORF) diferentes. El análisis informático indicó que el ORF a la izquierda tiene una similitud de aproximadamente el 60% con el del gen de Rep de AAV2. De los otros 4 serotipos de AAV descritos, todos tienen una similitud superior al 90% en este ORF. El ORF derecho de las proteínas de la cápside viral también tiene una homología de aproximadamente el 60% con el ORF de la cápside de AAV2. Como con otros serotipos de AAV descritos, la divergencia entre AAV5 y AAV2 se agrupa en múltiples bloques. Mediante el uso de la estructura tridimensional publicada del parvovirus canino y de comparaciones de secuencias asistidas por ordenador, se ha demostrado que varias de estas regiones divergentes están en el exterior del virus y, por lo tanto, sugieren un tropismo tisular alterado.

Dentro del promotor p5, varios de los elementos transcripcionales del núcleo están conservados, tales como la caja tata y el sitio YY1 alrededor del sitio de inicio de la transcripción. Sin embargo, el sitio YY 1 en -60 y los elementos E-Box dirección cadena arriba no son detectables, sugiriendo un procedimiento alternativo de regulación o
activación.

Las repeticiones terminales invertidas (ITR) del virus se clonaron como un fragmento del extremo derecho del genoma. Se descubrió que el fragmento resultante contenía varios cambios de secuencia en comparación con AAV2. Sin embargo, se descubrió que estos cambios eran complementarios y no afectaban a la capacidad de esta región para plegarse en una estructura de horquilla. Dentro de la región principal ("stem") de la horquilla se han descubierto dos elementos de secuencia que son críticos para la función de las ITR como orígenes de la replicación viral. Un motivo repetido de GAGC/T, que sirve como sitio de reconocimiento de Rep, y una secuencia GGTTGAG dirección cadena abajo del sitio de unión a Rep, que es la posición de la reacción de escisión específica de de cadena y de sitio de Rep. Esta secuencia no está conservada entre AAV5 y los otros AAV clonados, sugiriendo que las ITR y las proteínas Rep de AAV5 no pueden complementar los otros AAV conocidos.

Para ensayar la complementariedad cruzada del genoma que contiene ITR de AAV2 y partículas recombinantes de genomas que contienen ITR de AAV5, se empaquetaron usando plásmidos de expresión de Rep y Cap de tipo 2 o Rep y Cap de tipo 5, como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 2, se produjeron partículas virales sólo cuando se usaban los plásmidos de expresión respectivos para empaquetar las ITR afines. Este resultado es diferente del de otros serotipos de AAV, que han demostrado complementariedad cruzada en el empaquetamiento.

Esta especificidad de la Rep de AAV5 por las ITR de AAV5 se confirmó usando un ensayo de resolución terminal que puede identificar el sitio dentro de una ITR cortado por la proteína Rep. La incubación de la proteína Rep de tipo 5 con una ITR de tipo 2 no produjo ningún producto de corte. Por el contrario, la adición de Rep de tipo 2 cortó el ADN en el sito esperado. No obstante, la Rep de AAV5 produjo productos de corte cuando se incubó con una ITR de tipo 5. Se trazó un mapa del sitio en una región de 21 bases del motivo de unión a Rep que es similar al TRS de AAV2. El sitio en AAV2 es CGGT TGAG (SEC ID Nº: 22) pero en la ITR de tipo 5 es CGGT GTGA (SEC ID Nº: 21). La capacidad de Rep de AAV5 para escindir en un sitio diferente pero situado de forma similar puede dar como resultado la integración de AAV5 en un locus cromosómico diferente en comparación con AAV2.

Se obtuvo virus recombinante producido usando Rep y Cap de AAV5 a un título mayor que el tipo 2. Por ejemplo, en un estudio comparativo, se aisló virus de 8 X 10^{7} células COS mediante separación en bandas con CsCI y se determinó la distribución de los genomas con Beta-galactosidasa por el gradiente mediante transferencias puntuales de ADN de alícuotas de fracciones del gradiente. Los títulos de transferencia puntual de ADN indicaron que se producían partículas de AAV5 a un nivel de 10-50 veces superior que para AAV2.

La divergencia de secuencia en el ORF de la proteína de la cápside implica que el tropismo tisular de AAV2 y AAV5 sería diferente. Para estudiar la eficacia de transducción de AAV5 y AAV2, se transdujeron una diversidad de líneas celulares con diluciones en serie del virus purificado que expresaba el gen para actividad Beta-galactosidasa de localización nuclear. Se expusieron aproximadamente 2 X 10^{4} células a virus en 1 ml de medios que contenían suero durante un periodo de 48-60 h. Después de este tiempo, las células se fijaron y se tiñeron para actividad Beta-galactosidasa con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactopiranósido (Xgal) (ICN Biochemicals). Se determinaron los títulos biológicos por recuento del número de células positivas en las diferentes diluciones usando un microscopio ocular calibrado y multiplicando después por el área del pocillo. Se determinaron los títulos mediante el número medio de células en un mínimo de 10 campos/pocillo. La transducción de células cos, HeLa y 293 e IB3 con un número similar de partículas mostró una disminución de aproximadamente 10 veces en el título con AAV5, en comparación con AAV2. Por el contrario, las células MCF7 mostraron una diferencia de 50-100 veces en la eficacia de transducción. Además, ambos vectores transducían células NIH 3T3 relativamente mal.

Una publicación reciente describía que los proteoglicanos de heparina en la superficie de las células están implicados en la transducción viral. Se ha demostrado que la adición de heparina soluble inhibe la transducción por bloqueo de la unión viral. Puesto que los datos de transducción sugerían una diferencia en el tropismo tisular para AAV5 y AAV2, se determinó la sensibilidad de la transducción de AAV5 a la heparina. A una MOI de 100, la adición de 20 \mug/ml de heparina no tenía efecto sobre la transducción de AAV5. Por el contrario, esta cantidad de heparina inhibía el 90% de la transducción de AAV2. Incluso a una MOI de 1000, no se detectó inhibición de la transducción de AAV5. Estos datos confirman las conclusiones del estudio de tropismo tisular, es decir, que AAV2 y AAV5 pueden utilizar moléculas de superficie celular diferentes y, por lo tanto, el mecanismo de captación también puede ser diferente.

El AAV5 es un virus diferente dentro de la familia de dependovirus en base al análisis de secuencia, tropismo tisular y a la sensibilidad a heparina. Mientras que se conservan elementos del promotor P5 entre AAV2-6, algunos elementos están ausentes en AAV5, sugiriendo un mecanismo alternativo de regulación. La ITR y el ORF de Rep son diferentes de las identificadas anteriormente y no complementan el empaquetamiento de genomas basados en AAV2. La ITR de AAV5 contiene un TRS diferente en comparación con otros serotipos de AAV, que es responsable de la falta de complementación de las ITR. Este TRS único también debería dar como resultado un locus de integración diferente para AAV5 en comparación con el de AAV2. Además, la producción de partículas de AAV5 recombinantes usando sistemas de empaquetamiento convencionales es aproximadamente 10-50 veces mejor que la de AAV2. La mayoría de las diferencias en las proteínas de la cápside se encuentran en regiones que se ha propuesto que están en el exterior de la superficie de los parvovirus. Estos cambios son muy probablemente responsables de la ausencia de reactividad cruzada de anticuerpos y del tropismo tisular alterado en comparación con AAV2.

A partir del ORF de Rep de AAV2 se producen 4 proteínas; el promotor p5 (SEC ID Nº: 18) produce rep 68 (una mutante de sitio de corte y empalme) y rep78 y el promotor p19 (SEC ID Nº: 16) produce rep 40 (una mutante de sitio de corte y empalme) y rep 52. Aunque estas regiones no están bien conservadas dentro del ORF de Rep de AAV5, existen algunos sitios aceptores y donadores de corte y empalme aproximadamente en la misma región que los sitios de AAV2. Estos sitios pueden identificarse usando programas de análisis informático convencionales, tales como señal en el programa PCGENE. Por lo tanto, las secuencias de las proteínas Rep pueden identificarse de forma rutinaria como en otros serotipos de AAV.

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Ensayo de Hemaglutinación

Se midió la actividad de hemaglutinación esencialmente como se ha descrito anteriormente (Chiorini et al 1997 J. Virol. Vol 71 6823-6833). En resumen, se mezclaron diluciones en serie de 2 veces de virus en solución salina tamponada con EDTA con un volumen equivalente de glóbulos rojos al 0,4% en placas de 96 pocillos de fondo en U de plástico. La reacción se completó después de una incubación de 2 h a 8ºC. La adición de AAV5 purificado a un ensayo de hemaglutinación dio como resultado actividad de hemaglutinación.

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Transducción de células epiteliales de las vías respiratorias

Se sembraron en placas y cultivaron células epiteliales de las vías respiratorias primarias como se ha descrito anteriormente (Fasbender et al. J. Clin Invest. 1998 Jul 1; 102 (1): 184-93). Las células se transdujeron con un número equivalente de partículas de rAAV2 o rAAV5 que contenían un transgén de \beta-gal de localización nuclear con 50 partículas de virus/célula (MOI 50) y se continuó con el cultivo durante 10 días. Se determinó la actividad de \beta-gal después del procedimiento de (Chiorini et al. 1995 HGT Vol: 6 1531-1541) y se comparó la eficacia de transducción relativa. Como se muestra en la Figura 7, el AAV5 transducía estas células 50 veces más eficazmente que el AAV2. Esta es la primera vez que se ha demostrado que se infectan células apicales o células expuestas al aire mediante un agente de terapia génica.

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Transducción de músculo estriado

Se sembraron en placas y se cultivaron mioblastos de pollo como se ha descrito anteriormente (Rhodes y Yamada 1995 NAR Vol 23 (12) 2305-13). Se dejó que las células se fusionaran y después se transdujeron con un número similar de partículas de rAAV2 o rAAV5 que contenían un transgén de \beta-gal de localización nuclear, como se ha descrito anteriormente, después de 5 días en cultivo. Las células se tiñeron para actividad de \beta-gal después del procedimiento de (Chiorini et al. 1995 HGT Vol: 6 1531-1541) y se comparó la eficacia de transducción relativa. Como se muestra en la Figura 8, el AAV5 transducía estas células aproximadamente 16 veces más eficazmente que el AAV2.

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Transducción de explantes de cerebro de rata

Se prepararon explantes de cerebro de rata neonata primarios como se ha descrito anteriormente (Scortegagna et al. Neurotoxicology. 1997; 18 (2): 331-9). Después de 7 días en cultivo, las células se transdujeron con un número similar de partículas de rAAV5 que contenían un transgén de \beta-gal de localización nuclear, como se ha descrito anteriormente. Después de 5 días en cultivo las células se tiñeron para actividad de \beta-gal después del procedimiento de (Chiorini et al. 1995 HGT Vol: 6 1531-1541). Como se muestra en la Figura 9, se detectó transducción en una diversidad de tipos celulares incluyendo astrocitos, células neuronales y células gliales.

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Transducción de células endoteliales de vena umbilical humana

Se sembraron en placas y se cultivaron células endoteliales de vena umbilical humana, como se ha descrito anteriormente (Gnantenko et al. J Investig Med. 1997 Feb; 45 (2): 87-98). Las células se transdujeron con rAAV2 o rAAV5 que contenía un transgén de \beta-gal de localización nuclear con 10 partículas de virus/célula (MOI 5) en medio mínimos y después se devolvieron a medios completos. Después de 24 horas en cultivo, las células se tiñeron para actividad de \beta-gal después del procedimiento de Chiorini et al. (1995 HGT Vol: 6 1531-1541) y se comparó la eficacia de transducción relativa. Como se muestra en la Figura 10, el AAV5 transducía estas células 5-10 veces más eficazmente que el AAV2.

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Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.

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<120> VECTOR DE AAV5 Y USOS DEL MISMO

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> 14014.0323/P

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<150> 60/087.029

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<151> 28-05-1998

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<160> 23

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 4652

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

1

2

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<210> 2

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 2

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3

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 3

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4

5

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 4

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6

7

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

\vskip1.000000\baselineskip

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9

10

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 6

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11

12

13

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<211> 2307

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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14

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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15

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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16

17

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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18

180

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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19

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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20

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<210> 13

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<211> 1115

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 13

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21

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<210> 14

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<211> 550

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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22

23

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<210> 15

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 15

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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25

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<210> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 17

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<210> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 18

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27

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<210> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 19

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28

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<210> 20

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<211> 168

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 20

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29

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<210> 21

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<211> 8

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 21

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cggtgtga

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8

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<210> 22

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<211> 8

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 22

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cggttgag

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8

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<210> 23

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética

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<400> 23

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caaaacctcc ttgcttgaga g

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21

Claims (46)

1. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína aislada de la cápside de AAV5 que tiene una homología de al menos un 80% con la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos expuestos en la SEC ID Nº 7, 8 ó 9.

2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, que tiene la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEC ID Nº: 7.

3. El ácido nucleico de la reivindicación 1, que tiene la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEC ID Nº: 8.

4. El ácido nucleico de la reivindicación 1, que tiene la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEC ID Nº: 9.

5. El ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende un promotor p5 de AAV5.

6. El ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de nucleótidos indicada en la
SEC ID Nº: 1.

7. El ácido nucleico de la reivindicación 6 que consiste en la secuencia de nucleótidos indicada en la
SEC ID Nº: 1.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína Rep del virus adenoasociado 5 en el que la proteína Rep del virus adenoasociado 5 tiene una homología de al menos aproximadamente un 95% con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2, 3, 12 ó 14.

9. El ácido nucleico de la reivindicación 8, en el que la proteína Rep del virus adenoasociado 5 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2.

10. El ácido nucleico de la reivindicación 8, en el que la proteína Rep del virus adenoasociado 5 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 3.

11. El ácido nucleico de la reivindicación 8, en el que la proteína Rep del virus adenoasociado 5 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 12.

12. El ácido nucleico de la reivindicación 8, en el que la proteína Rep del virus adenoasociado 5 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 14.

13. Un vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 y un par de repeticiones terminales invertidas (ITR) del virus adenoasociado 5 (AAV5) y un promotor entre las repeticiones terminales invertidas en el que las ITR tienen una secuencia que se muestra en la SEC ID Nº: 19 ó 20 o tienen una secuencia de nucleótidos que hibrida selectivamente con estas secuencias y conserva el sitio de unión a Rep.

14. El vector de la reivindicación 13, en el que el promotor es un promotor p5 de AAV.

15. El vector de la reivindicación 13, en el que el promotor p5 tiene la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEC ID Nº:18 o un fragmento de la misma, que conserva una actividad promotora, como se determina por un procedimiento convencional.

16. El vector de la reivindicación 13, que comprende además un ácido nucleico heterólogo unido funcionalmente al promotor.

17. Una partícula de AAV que comprende el vector de la reivindicación 16 encapsidado en una partícula de virus adenoasociado.

18. La partícula de la reivindicación 17, en la que la partícula es una partícula de AAV5.

19. La partícula de la reivindicación 17, en la que la partícula es una partícula de AAV1, una partícula de AAV2, una partícula de AAV3, una partícula de AAV4 o una partícula de AAV6.

20. La partícula de la reivindicación 18 que comprende una proteína de la cápside que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 6 o una proteína que tiene una homología del 80% con la misma.

21. La partícula de la reivindicación 18, en la que el ácido nucleico heterólogo se inserta entre un par de repeticiones terminales invertidas de AAV para la liberación del ácido nucleico a una célula en un sujeto.

22. La partícula de la reivindicación 18 que comprende una proteína de la cápside seleccionada del grupo que consiste en VP1, VP2 y VP3 en la que la proteína de la cápside del virus adenoasociado tiene una homología de al menos un 80% con la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos indicados en la SEC ID Nº 4, 5, 6, 7, 8 ó 9.

23. Un virión de AAV5 recombinante que contiene el vector de la reivindicación 16.

24. Un procedimiento de liberación de un ácido nucleico heterólogo a una célula ex vivo que comprende administrar a la célula la partícula de AAV5 de la reivindicación 21, liberando de este modo el ácido nucleico a la célula.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que las repeticiones terminales invertidas de AAV son repeticiones terminales invertidas de AAV5.

26. Una célula que comprende la partícula de AAV5 de la reivindicación 21 para la liberación del ácido nucleico a un sujeto.

27. Uso de la partícula de AAV5 de la reivindicación 21 para preparar una composición para la liberación de un ácido nucleico a una célula en un sujeto que tiene anticuerpos contra AAV2.

28. Un sistema vector para producir partículas víricas infecciosas que tienen una característica de AAV5 que comprende: al menos un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside de AAV5 en el que la proteína de la cápside del virus adenoasociado tiene una homología de al menos un 80% con la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos indicados en la SEC ID Nº 7, 8 ó 9.

29. El sistema vector de la reivindicación 28 para producir partículas víricas infecciosas que tienen una característica de AAV5, que comprende: al menos un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside de AAV5 en el que la proteína de la cápside del virus adenoasociado tiene una homología de al menos un 80% con la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos indicados en la SEC ID Nº 7, 8 ó 9, y un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un par de repeticiones terminales invertidas de AAV5 y un ácido nucleico que codifica una proteína rep de AAV5 en el que la proteína Rep del virus adenoasociado 5 tiene una homología de al menos aproximadamente un 95% con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº 2, 3, 12 ó 14.

30. El sistema vector de la reivindicación 28, que comprende dos vectores.

31. El sistema vector de la reivindicación 30, en el que el primer vector comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside de AAV5 y un ácido nucleico que codifica una proteína Rep de AAV5 y el segundo vector comprende un par de repeticiones terminales invertidas de AAV5.

32. El sistema vector de la reivindicación 30, en el que el primer vector comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside de AAV5 y el segundo vector comprende un par de repeticiones terminales invertidas de AAV.

33. El sistema vector de la reivindicación 32, en el que el segundo vector comprende un par de repeticiones terminales invertidas de AAV1.

34. El sistema vector de la reivindicación 32, en el que el segundo vector comprende un par de repeticiones terminales invertidas de AAV2.

35. El sistema vector de la reivindicación 32, en el que el segundo vector comprende un par de repeticiones terminales invertidas de AAV3.

36. El sistema vector de la reivindicación 32, en el que el segundo vector comprende un par de repeticiones terminales invertidas de AAV4.

37. El sistema vector de la reivindicación 32, en el que el segundo vector comprende un par de repeticiones terminales invertidas de AAV5.

38. El sistema vector de la reivindicación 32, en el que el segundo vector comprende un par de repeticiones terminales invertidas de AAV6.

39. El sistema vector de la reivindicación 32, en el que el primer vector comprende además un ácido nucleico que codifica una proteína Rep de AAV1.

40. El sistema vector de la reivindicación 32, en el que el primer vector comprende además un ácido nucleico que codifica una proteína Rep de AAV2.

41. El sistema vector de la reivindicación 32, en el que el primer vector comprende además un ácido nucleico que codifica una proteína Rep de AAV3.

42. El sistema vector de la reivindicación 32, en el que el primer vector comprende además un ácido nucleico que codifica una proteína Rep de AAV4.

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43. El sistema vector de la reivindicación 32, en el que el primer vector comprende además un ácido nucleico que codifica una proteína Rep de AAV5.

44. El sistema vector de la reivindicación 32, en el que el primer vector comprende además un ácido nucleico que codifica una proteína Rep de AAV6.

45. El sistema vector de cualquiera de las reivindicaciones 30 a 44, en el que el segundo vector comprende además un promotor entre las repeticiones terminales invertidas.

46. El sistema vector de la reivindicación 45, en el que el promotor está unido funcionalmente a un ácido nucleico exógeno.