ES2314334T3 - Asialoglicoproteinas del virus de la hepatitis c. - Google Patents

Abstract

Una asialoglicoproteína del virus de la hepatitis C (VHC) seleccionada de una glicoproteína truncada expresada a partir de la región E1 del VHC que comprende una deleción en una porción de la secuencia encontrada en una región que abarca los aminoácidos 330-380 de la región E1, numerados desde el principio de las poliproteínas del VHC, y una glicoproteína expresada a partir de la región E2 del VHC que comprende una deleción en una porción de la secuencia encontrada en una región que abarca los aminoácidos 660-830 de la región E2, numerados desde el principio de la poliproteína del VHC.

Description

Asialoglicoproteínas del virus de la hepatitis C.

Campo técnico

Esta invención se refiere a los campos generales de la expresión de proteínas recombinantes y la virología. Más particularmente, la invención se refiere a glicoproteínas útiles para el diagnóstico, el tratamiento y la profilaxis de infección por el virus de la hepatitis C (VHC) y a procedimientos para producir tales glicoproteínas.

Antecedentes de la invención

La hepatitis no A no B (HNANB) es una enfermedad transmisible (o familia de enfermedades) que se cree que se induce viralmente y puede distinguirse de otras formas de enfermedad hepática asociada a virus tales como aquellas producidas por el virus de la hepatitis A (VHA), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis delta (VHD), citomegalovirus (CMV) o virus de Epstein-Barr (VEB). Las pruebas epidemiológicas sugieren que puede haber tres tipos de HNANB: el tipo epidémico transmitido por el agua; el tipo asociado a sangre o agujas; y el tipo extrahospitalario que se produce esporádicamente. Se desconoce el número de agentes causales. Sin embargo, recientemente se ha identificado una nueva especie viral, el virus de la hepatitis C (VHC), como la causa principal (si no la única) de la HNANB transmitida por la sangre (HNANB-TS). Véase, por ejemplo, el documento PCT WO89/046699. La hepatitis C parece ser la forma principal de hepatitis asociada a transfusión en varios países o regiones que incluyen los Estados Unidos, Europa y Japón. También hay pruebas que implican al VHC en la inducción de carcinoma hepatocelular. Por tanto, existe la necesidad de un procedimiento eficaz para prevenir y tratar la infección por VHC.

Es significativa la demanda de procedimientos específicos sensibles para seleccionar e identificar portadores del VHC y sangre o hemoderivados contaminados con el VHC. La hepatitis postransfusional (HPT) se produce en aproximadamente el 10% de los pacientes transfundidos y el VHC representa hasta el 90% de estos casos. El problema principal en esta enfermedad es la frecuente progresión a lesión hepática crónica (25-55%).

La atención al paciente, además de la prevención de la transmisión del VHC por sangre y hemoderivados o por contacto personal íntimo requiere herramientas diagnósticas y pronósticas fidedignas para detectar ácidos nucleicos, antígenos y anticuerpos relacionados con el VHC. Además, también existe la necesidad de vacunas y agentes terapéuticos inmunoterapéuticos eficaces para la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad.

El VHC aparece en la sangre de individuos infectados a tasas muy bajas con respecto a otros virus infecciosos que hace que el virus sea muy difícil de detectar. La baja carga viral es probablemente la razón principal de que el agente causal de la hepatitis NANB permaneciera tanto tiempo sin detectar. Aún cuando ahora se ha clonado, el VHC todavía resulta difícil de cultivar y propagar. Por consiguiente, existe una fuerte necesidad de medios recombinantes para producir proteínas del VHC diagnósticas/terapéuticas/profilácticas.

Adicionalmente, existe una gran necesidad de una vacuna contra el VHC. Sin embargo, es extremadamente difícil cultivar el VHC en líneas celulares. Por tanto, no ha sido posible producir cepas virales atenuadas mediante pase seriado en cultivo de tejido/celular.

Descripción de la invención

Se ha encontrado que dos proteínas del VHC, E1 y E2, parecen ser asialoglicoproteínas asociadas a membrana cuando se expresan en sistemas recombinantes. Esto es sorprendente porque las glicoproteínas normalmente no se quedan en forma terminada en manosa en mamíferos, sino que se modifican adicionalmente con otros carbohidratos: la forma terminada en manosa es normalmente sólo transitoria. En el caso de E1 y E2 (como se expresan en nuestros sistemas), la asialoglicoproteína parece ser la forma final. La E1 (proteína de la envuelta 1) es una glicoproteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 35 kD que se traduce de la región E1 predicha del genoma del VHC. La E2 (proteína de la envuelta 2) es una glicoproteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 72 kD que se traduce de la región NS1 predicha (proteína no estructural 1) del genoma del VHC, basado en el modelo flaviviral del VHC. Como las glicoproteínas virales son frecuentemente sumamente inmunogénicas, E1 y E2 son excelentes candidatas para uso en inmunoensayos y vacunas terapéuticas/profilácticas.

El descubrimiento de que E1 y E2 no están sialiladas es significativo. La forma particular de una proteína dicta frecuentemente qué células pueden servir de huéspedes adecuados para la expresión recombinante. Los procariotas tales como E. coli no glicosilan proteínas, y generalmente no son adecuados para la producción de glicoproteínas para uso como antígenos porque la glicosilación es frecuentemente importante para la completa antigenicidad, solubilidad y estabilidad de la proteína. Los eucariotas inferiores tales como levadura y hongos glicosilan proteínas, pero generalmente no pueden añadir residuos de ácido siálico terminal a los complejos de carbohidrato. Por tanto, las proteínas procedentes de levadura pueden ser antigénicamente distintas de sus homólogos naturales (no recombinantes). Se prefiere la expresión en células de mamífero para aplicaciones en las que es importante la antigenicidad del producto ya que la glicosilación de la proteína recombinante debe parecerse fielmente a la de las proteínas virales
salvajes.

Nuevas pruebas indican que el virus VHC puede conseguir entrar en células huésped durante la infección por o el receptor de asialoglicoproteína encontrado en hepatocitos o por el receptor de manosa encontrado en células endoteliales hepáticas y macrófagos (particularmente células de Kupffer). Sorprendentemente se ha encontrado que la mayoría de E1 y E2 naturales no contienen residuos de ácido siálico terminal, sino que sólo están glicosilados en el núcleo. Una pequeña fracción contiene adicionalmente N-acetilglucosamina terminal. Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar glicoproteínas de la envuelta del VHC que carecen de todos o sustancialmente todos los residuos de ácido siálico terminal.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para producir asialo-E1 o E2 en condiciones que inhiban la adición de ácido siálico terminal, por ejemplo, mediante expresión en levadura o mediante expresión en células de mamífero usando antibióticos para facilitar la secreción o liberación.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para purificar E1 o E2 mediante afinidad por lectinas que se unen a residuos de manosa terminal o residuos de N-acetilglucosamina terminal.

Otro aspecto de la invención es una composición inmunogénica que comprende una asialoglicoproteína recombinante seleccionada del grupo que está constituido por E1 y E2 del VHC en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente puede incluirse un adyuvante inmunológico, si se desea.

Otro aspecto de la invención es un reactivo de inmunoensayo que comprende una asialoglicoproteína recombinante seleccionada del grupo que está constituido por E1 y E2 del VHC en combinación con un soporte adecuado. Otro reactivo de inmunoensayo de la invención comprende una asialoglicoproteína recombinante seleccionada del grupo que está constituido por E1 y E2 del VHC en combinación con un marcador detectable adecuado.

Otro aspecto de la invención se refiere a dímeros y conjuntos de orden superior de E1 y/o E2. Una especie de la invención es un complejo de E2. Otra especie de la invención es un heterodímero E1:E2.

Otro aspecto de la invención es una composición de vacuna contra el VHC que comprende conjuntos E1:E2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para purificar complejos E1:E2.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para propagar el VHC en cultivo celular que comprende (a) proporcionar una célula que expresa un receptor seleccionado del grupo que está constituido por el receptor de manosa y el receptor de asialoglicoproteína, (b) infectar la célula con el VHC; y (c) cultivar la célula infectada. Preferentemente, la célula expresa un receptor recombinante.

Modos de llevar a cabo la invención A. Definiciones

El término "asialoglicoproteína" se refiere a una proteína glicosilada que está sustancialmente libre de restos de ácido siálico. Las asialoglicoproteínas pueden prepararse recombinantemente o mediante purificación de cultivo celular o fuentes naturales. Las asialoglicoproteínas actualmente preferidas proceden del VHC, preferentemente las glicoproteínas E1 y E2, lo más preferentemente E1 y E2 recombinantes (E1r y E2r). Una proteína está "sustancialmente libre" de ácido siálico dentro del alcance de esta definición si la cantidad de residuos de ácido siálico no interfiere sustancialmente con la unión de la glicoproteína a proteínas de unión a la manosa tales como GNA. Este grado de sialilación se obtendrá generalmente cuando menos de aproximadamente el 40% del carbohidrato ligado a N total sea ácido siálico, más preferentemente menos de aproximadamente el 30%, más preferentemente menos de aproximadamente el 20%, más preferentemente menos de aproximadamente el 10%, más preferentemente menos de aproximadamente el 5%, y lo más preferentemente menos de aproximadamente el 2%.

El término "E1" como se usa en este documento se refiere a una proteína o polipéptido expresado dentro de los primeros 400 aminoácidos de una poliproteína del VHC, algunas veces se denomina en lo sucesivo la proteína E o S. En su forma natural es una glicoproteína de 35 kD que se encuentra fuertemente asociada a la membrana. En la mayoría de las cepas naturales del VHC, la proteína E1 se codifica en la poliproteína viral que sigue a la proteína C (núcleo). La proteína E1 se extiende desde aproximadamente el aminoácido 192 hasta aproximadamente el aa 383 de la poliproteína de longitud completa. El término "E1" como se usa en este documento también incluye análogos y mutantes truncados que son inmunológicamnte reactivos de forma cruzada con E1 natural.

El término "E2" como se usa en este documento se refiere a una proteína o polipéptido expresado dentro de los primeros 900 aminoácidos de una poliproteína del VHC, algunas veces se denomina en lo sucesivo la proteína NS1. En su forma natural es una glicoproteína de 72 kD que se encuentra fuertemente asociada a la membrana. En la mayoría de las cepas naturales del VHC, la proteína E1 sigue a la proteína E1. La proteína E2 se extiende desde aproximadamente el aa 384 hasta aproximadamente el aa 820. El término "E2" como se usa en este documento también incluye análogos y mutantes truncados que son inmunológicamente reactivos de forma cruzada con E2 natural.

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El término "conjunto" como se usa en este documento se refiere a un complejo de E1 y/o E2 que contiene más de un monómero de E1 o E2. Los dímeros E1:E1, dímeros E2:E2 y heterodímeros E1:E2 son todos "conjuntos" dentro del alcance de esta definición. Las composiciones de la invención también pueden incluir conjuntos más grandes y pueden tener pesos moleculares superiores a 800 kD.

El término "partícula" como se usa en este documento se refiere a un conjunto de E1, E2 o E1/E2 visible por microscopía electrónica y que tiene una dimensión de al menos 20 nm. Partículas preferidas son aquellas que tienen un aspecto aproximadamente esférico y un diámetro de aproximadamente 40 nm por microscopía electrónica.

El término "purificada" como se aplica a proteínas en este documento se refiere a una composición en la que la proteína deseada comprende al menos el 35% del componente de proteína total en la composición. La proteína deseada comprende preferentemente al menos el 40%, más preferentemente al menos aproximadamente el 50%, más preferentemente al menos aproximadamente el 60%, todavía más preferentemente al menos aproximadamente el 70%, incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 80%, incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 90% y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 95% del componente de proteína total. La composición puede contener otros compuestos tales como carbohidratos, sales, lípidos, disolventes y similares sin afectar la determinación de la pureza en porcentaje como se usa en este documento. Una asialoglicoproteína del VHC "aislada" quiere decir una composición de asialoglicoproteína del VHC que tiene al menos el 35% de pureza.

"Proteína de unión a la manosa" como se usa en este documento quiere decir una lectina u otra proteína que se une específicamente a proteínas que tienen glicosilación terminada en manosa (por ejemplo, asialoglicoproteínas), por ejemplo, lectinas de unión a la manosa, anticuerpos específicos para glicosilación terminada en manosa, proteína del receptor de manosa (R.A.B. Ezekowitz y col., J Exp Med (1990) 176:1785-94), proteínas del receptor de asialoglicoproteína (H. Kurata y col., J Biol Chem (1990) 265:11295-98), proteína del suero de unión a la manosa (I. Schuffenecker y col., Cytogenet Cell Genet (1991) 56:99-102; K. Sastry y col., J Immunol (1991) 147:692-97), proteína del suero de unión a asialoglicoproteína y similares. Las lectinas de unión a la manosa incluyen, por ejemplo, GNA, concanavalina A (ConA) y otras lectinas con propiedades de unión similares.

El término "lectina GNA" se refiere a aglutinina de Galanthus nivalis, una lectina comercialmente disponible que se une a glicoproteínas terminadas en manosa.

Una glicoproteína "recombinante" como se usa en este documento es una glicoproteína expresada a partir de un polinucleótido recombinante en la que el gen estructural que codifica la glicoproteína se expresa bajo el control de secuencias reguladoras no naturalmente adyacentes al gen estructural o en la que el gen estructural está modificado. Por ejemplo, puede formarse un vector en que el gen estructural de E1 se pone bajo el control de un fragmento funcional del promotor gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de la levadura. Un promotor actualmente preferido para uso en levadura es el promotor híbrido ADH2/GAP descrito en la patente de EE.UU. nº 4.880.734 que emplea un fragmento del promotor GAPDH en combinación con la secuencia de activación aguas arriba procedente del alcohol deshidrogenasa 2. Modificaciones del gen estructural pueden incluir la sustitución de diferentes codones con codones degenerados (por ejemplo, para utilizar codones preferidos para huéspedes, eliminar o generar sitios de escisión de enzimas de restricción, para controlar la formación de horquillas, etc.) y la sustitución, inserción o deleción de un número limitado de codones que codifican diferentes aminoácidos (debe alterarse preferentemente no más de aproximadamente el 10%, más preferentemente menos de aproximadamente el 5% en número de la secuencia de aminoácidos naturales) y similares. Similarmente, un receptor "recombinante" se refiere a una proteína del receptor expresada a partir de un polinucleótido recombinante en la que el gen estructural que codifica el receptor se expresa bajo el control de las secuencias reguladoras no naturalmente adyacentes al gen estructural, o en las que el gen estructural está modificado.

El término "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido que está sustancialmente libre de otros componentes virales del VHC, particularmente polinucleótidos. Una composición de polipéptidos está "sustancialmente libre" de otro componente si el peso del polipéptido en la composición es al menos el 70% del peso del polipéptido y otro componente combinado, más preferentemente al menos aproximadamente el 80%, todavía más preferentemente aproximadamente el 90%, y lo más preferentemente el 95% o superior. Por ejemplo, una composición que contiene 100 \mug/ml de E1 y sólo 3 \mug/ml de otros componentes del VHC (por ejemplo, ADN, lípidos, etc.) está sustancialmente libre de "otros componentes virales del VHC", y por tanto, es una composición de un polipéptido aislado dentro del alcance de esta definición.

El término "líder de la secreción" se refiere a un polipéptido que, cuando se codifica en el extremo N de una proteína, hace que la proteína se secrete dentro del medio de cultivo de la célula huésped tras la traducción. El líder de la secreción procederá generalmente de la célula huésped empleada. Por ejemplo, líderes de la secreción adecuados para uso en levadura incluyen el líder del factor \alpha de Saccharomyces cerevisiae (véase la patente de EE.UU. nº 4.870.008).

El término "eucariota inferior" se refiere a células huésped tales como levadura, hongos y similares. Los eucariotas inferiores son generalmente (pero no necesariamente) unicelulares. Eucariotas inferiores preferidos son levaduras, particularmente especies dentro de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hansenula y similares. Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis y K. lactis son los huéspedes de levadura más comúnmente usados y son huéspedes fúngicos convenientes.

El término "eucariota superior" se refiere a células huésped procedentes de animales superiores tales como mamíferos, reptiles, insectos y similares. Las células huésped de eucariotas superiores actualmente preferidas proceden de hámster chino (por ejemplo, CHO), mono (por ejemplo, células COS), ser humano e insecto (por ejemplo, Spodoptera frugiperda). Las células huésped pueden proporcionarse en cultivos en suspensión o en matraz, cultivos de tejido, cultivos de órganos y similares.

El término "modulador del calcio" se refiere a un compuesto que puede secuestrar o unirse a iones calcio dentro del retículo endoplásmico o afecta la concentración de iones calcio dentro del RE mediante su efecto en las proteínas reguladoras del calcio (por ejemplo, proteínas de los canales de calcio, bombas de calcio, etc.). Moduladores del calcio adecuados incluyen, por ejemplo, tapsigargina, EGTA (ácido etilenglicol-bis[\beta-aminoetiléter]-N,N,N',N'-tetraacético). El modulador actualmente preferido es tapsigargina (véase, por ejemplo, O. Thastrup y col., Proc Nat Acad Sci USA (1990) 87:2466-70).

El término "inmunogénico" se refiere a la capacidad de una sustancia para producir una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, tanto si está sola como cuando se liga a un vehículo, en presencia o ausencia de un adyuvante. "Neutralización" se refiere a una respuesta inmunitaria que bloquea la infectividad, bien parcialmente o completamente, de un agente infeccioso. Una "vacuna" es una composición inmunogénica que puede provocar protección contra el VHC, tanto si es parcial como completa, útil para el tratamiento de un individuo.

El término "líquido biológico" se refiere a un fluido obtenido de un organismo tal como suero, plasma, saliva, secreciones gástricas, mucosidad y similares. En general se detectará un líquido biológico para la presencia de partículas del VHC. Algunos fluidos biológicos se usan como fuente de otros productos tales como factores de coagulación (por ejemplo, factor VIII:C), albúmina de suero, hormona de crecimiento y similares. En tales casos es importante que el fluido biológico fuente esté libre de contaminación por virus tales como el VHC.

B. Procedimiento general

La región E1 del genoma del VHC se describe en el documento EP 388.232 como la región "E", mientras que la E2 se describe como "NS1". La región E1 comprende aproximadamente los aminoácidos 192-383 en la poliproteína viral de longitud completa. La región E2 comprende aproximadamente los aminoácidos 384-820. Las secuencias completas de prototipos de estas proteínas (cepa VHC-1) están disponibles en la técnica (véase el documento EP 388.232) ya que son procedimientos generales para clonar y expresar las proteínas. Tanto E1 como E2 pueden expresarse a partir de un polinucleótido que codifica los primeros 850-900 aminoácidos de la poliproteína del VHC: el procesamiento posterior a la traducción en la mayoría de las células huésped eucariotas escinde la poliproteína inicial en C, E1 y E2. Puede truncarse el extremo 5' de la región codificante para reducir la cantidad de proteína C producida.

La expresión de asialoglicoproteínas puede lograrse por varios procedimientos. Por ejemplo, puede obtenerse la expresión en eucariotas inferiores (tales como levadura) que normalmente no añaden residuos de ácido siálico a proteínas glicosiladas. En sistemas de expresión en levaduras actualmente se prefiere emplear un líder de la secreción tal como el líder del factor \alpha de S. cerevisiae de manera que la proteína se expresa en el medio de cultivo tras la traducción. Actualmente también se prefiere emplear mutantes deficientes en glicosilación tales como pmr1 ya que estos mutantes sólo proporcionan la glicosilación del núcleo y frecuentemente secretan proteínas heterólogas con mayor eficiencia (H.K. Rudolph y col., Cell (1989) 58:133-45). Alternativamente, pueden emplearse otras especies de levadura, tales como Pichia pastoris, que expresan glicoproteínas que contienen 8-9 residuos de manosa en un patrón que se cree que se asemeja al patrón de glicosilación del núcleo observado en mamíferos y S. cerevisiae.

Alternativamente, la expresión puede disponerse en células de mamífero y bloquear la glicosilación terminal (adición de ácido siálico). Los constructos recombinantes incluirán preferentemente una señal de secreción para asegurar que la proteína se dirige hacia el retículo endoplásmico. El transporte al golgi parece estar bloqueado por las propias E1 y E2: parece que la expresión de alto nivel de E1 o E2 en células de mamífero detiene la secreción de todas las proteínas celulares en el retículo endoplásmico o cis golgi. Adicionalmente puede emplearse un mutante defectuoso para la glicosilación. Véase, por ejemplo, P. Stanley, Ann Rev Genet (1984) 18:525-52. En el caso de que un mutante de glicosilación o de transporte exprese E1 o E2 con sialilación, los residuos de ácido siálico terminal pueden eliminarse mediante tratamiento con neuraminidasa.

El rendimiento debe aumentarse adicionalmente mediante el uso de un modulador del calcio para obtener la liberación de proteína de dentro del retículo endoplásmico. Moduladores adecuados incluyen tapsigargina, EGTA y A23817 (véase, por ejemplo, O. Thastrup y col., Proc Nat Acad Sci USA (1990) 87:2466-70). Por ejemplo, puede expresarse una gran cantidad de E1 o E2 intracelularmente en células de mamífero (por ejemplo, células CHO, COS, HeLa y similares) mediante transfección con un vector de virus de la variolovacuna recombinante. Después de dejar un tiempo para la expresión y acumulación de proteínas en el retículo endoplásmico, las células se exponen a un modulador del calcio en concentración suficientemente grande para producir la liberación del contenido del RE. La proteína se recupera luego del medio de cultivo, que se sustituye para el siguiente ciclo.

Adicionalmente puede ser ventajoso expresar una forma truncada de la proteína de la envuelta. Parece que tanto E1 como E2 tienen un dominio sumamente hidrófobo que aparentemente ancla la proteína dentro del retículo endoplásmico y evita la liberación eficaz. Por tanto, puede desearse eliminar porciones de la secuencia encontrada en una o más de las regiones de aa 170-190, aa 260-290 o aa 330-380 de E1 (numerando desde el principio de la poliproteína) y aa 660-830 de E2 (véase, por ejemplo, la figura 20-1 del documento EP 388.232). Es probable que al menos uno de estos dominios hidrófobos forme una región transmembrana que no es esencial para la antigenicidad de la proteína y que, por tanto, puede eliminarse sin efecto perjudicial. La mejor región para eliminar puede determinarse realizando un pequeño número de experimentos de deleción dentro de la destreza del médico general. La deleción del extremo 3' hidrófobo de E2 da como resultado la secreción de una porción de la E2 expresada, con sialilación de la proteína secretada.

Puede usarse cualquiera de una variedad de vectores para obtener la expresión. Los eucariotas inferiores tales como la levadura se transforman normalmente con plásmidos usando el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio, o se transfectan con un virus recombinante. Los vectores pueden replicarse independientemente dentro de la célula huésped o pueden integrarse dentro del genoma de la célula huésped. Los eucariotas superiores pueden transformarse con plásmidos, pero normalmente se infectan con un virus recombinante, por ejemplo un virus de la variolovacuna recombinante. Se prefiere particularmente variolovacuna ya que la infección con variolovacuna detiene la expresión de proteínas de células huésped. Células huésped actualmente preferidas incluyen líneas celulares HeLa y de plasmacitoma. En el presente sistema, esto significa que E1 y E2 se acumulan como las principales especies glicosiladas en el RE huésped. Como las E1r y E2r serán las glicoproteínas predominantes que terminan en manosa, pueden purificarse fácilmente a partir de las células usando lectinas tales como aglutinina de Galanthus nivalis (GNA) que se unen a residuos de manosa terminal.

Las proteínas que se expresan naturalmente como glicoproteínas terminadas en manosa son relativamente raras en la fisiología de los mamíferos. En la mayoría de los casos, una glicoproteína de mamífero termina en manosa sólo como producto intermedio transitorio en la ruta de glicosilación. El hecho de que las proteínas de la envuelta del VHC, expresadas recombinantemente, contengan glicosilación terminada en manosa o (en menor grado) N-acetilglucosamina significa que las proteínas del VHC y los viriones completos pueden separarse y purificarse parcialmente a partir de proteínas endógenas usando lectinas específicas para manosa o N-acetilglucosamina terminal. Las proteínas recombinantes parecen auténticas y se cree que son esencialmente idénticas a las proteínas de la envuelta encontradas en el virión libre maduro o a una forma de proteína de la envuelta asociada a células. Por tanto, pueden emplearse lectinas tales como GNA para proteínas terminadas en manosa y WGA (aglutinina del germen de trigo) y sus equivalentes para proteínas terminadas en N-acetilglucosamina. Pueden emplearse lectinas unidas a una fase sólida (por ejemplo, una columna de lectina-Sepharose®) para separar E1 y E2 de los sobrenadantes del cultivo celular y otros fluidos, por ejemplo, para la purificación durante la producción de antígenos para uso en vacunas o inmunoensayo.

Alternativamente, puede proporcionarse una lectina adecuada para aislar E1, E2 o viriones del VHC de muestras de fluido o tejido de sujetos sospechosos de infección por el VHC. Como las glicoproteínas terminadas en manosa son relativamente raras, un procedimiento tal debería servir para purificar las proteínas presentes en una muestra, reduciéndose sustancialmente el fondo. Tras la unión a lectina, la proteína del VHC puede detectarse usando anticuerpos anti-VHC. Si están presentes viriones completos, alternativamente pueden detectarse ácidos nucleicos del VHC usando técnicas de PCR u otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos dirigidos hacia regiones conservadas del genoma del VHC (por ejemplo, la región no codificante en 5'). Este procedimiento permite el aislamiento y la caracterización de cepas diferentes del VHC sin considerar desplazamiento o variación antigénica, por ejemplo, en casos en los que una nueva cepa no sea inmunológicamente reactiva de forma cruzada con la cepa usada para preparar anticuerpos. Hay muchos otros modos de aprovechar el único reconocimiento de glicoproteínas terminadas en manosa por lectinas particulares. Por ejemplo, pueden incubarse muestras sospechosas de contener viriones o proteínas del VHC con lectinas marcadas con biotina o avidina, y precipitar el complejo proteína-lectina usando avidina o biotina. También puede usarse la afinidad de lectinas por proteínas del VHC para elegir como diana compuestos respecto a viriones para uso terapéutico, por ejemplo, conjugando un compuesto antivírico a GNA. Alternativamente, pueden usarse lectinas adecuadas para eliminar glicoproteínas terminadas en manosa de fracciones de suero o plasma reduciéndose o eliminándose así el riesgo de contaminación por el VHC.

Actualmente se prefiere aislar asialoglicoproteínas E1 y/o E2 de lisados celulares brutos mediante incubación con una proteína de unión a la manosa inmovilizada, particularmente una lectina tal como ConA o GNA. Las células se lisan, por ejemplo, mediante destrucción mecánica en un tampón hipotónico seguido de centrifugación para preparar un lisado posnuclear, y se centrifugan adicionalmente para obtener una fracción de membrana microsomal bruta. La fracción de membrana bruta se solubiliza posteriormente en un tampón que contiene un detergente, tal como Triton X-100, NP40 o similares. Este extracto de detergente se clarifica adicionalmente de partículas insolubles mediante centrifugación y el lisado clarificado resultante se incuba en una columna de cromatografía que comprende una proteína de unión a la manosa inmovilizada, preferentemente GNA, unida a un soporte sólido tal como agarosa o Sepharose® durante un periodo de tiempo suficiente para la unión, normalmente 16 a 20 horas. Entonces, la suspensión se aplica a la columna hasta que empieza a aparecer E1/E2 en el eluyente, luego se incuba en la columna durante un periodo de tiempo suficiente para la unión, normalmente aproximadamente 12-24 horas. Entonces, el material unido se lava con tampón adicional que contiene detergente (por ejemplo, Triton X-100, NP40 o similares) y se eluye con manosa para proporcionar asialoglicoproteína purificada. En la elución se prefiere eluir sólo hasta que la proteína empiece a aparecer en el eluato, momento en el que la elución se detiene y la columna se deja equilibrar durante 2-3 horas antes de continuar con la elución de la proteína. Se cree para esto deja tiempo suficiente para la lenta disociación esperada de grandes conjuntos de proteínas. En los casos en los que E1 y E2 se expresan juntas en forma nativa (es decir, sin truncar el dominio de unión a membrana), una fracción sustancial de las asialoglicoproteínas aparece como conjuntos E1:E2. Cuando se examinan mediante microscopía electrónica, una porción significativa de estos conjuntos aparecen como partículas aproximadamente esféricas que tienen un diámetro de aproximadamente 40 nm, que es el tamaño esperado para virus intactos. Parece que estas partículas son partículas subvirales de autoensamblado. Se espera que estos conjuntos presenten una estructura cuaternaria muy similar a la estructura de partículas de viriones del VHC auténticos y, por tanto, se espera que sirvan de vacunas sumamente inmunogénicas.

Los complejos E1/E2 pueden purificarse adicionalmente mediante cromatografía en gel sobre un medio básico, por ejemplo, Fractogel-DEAE o DEAE-Sepharose®. Usando cromatografía en gel de Fractogel-DEAE pueden obtenerse complejos E1/E2 de aproximadamente el 60-80% de pureza. E1 puede purificarse adicionalmente mediante tratamiento con lisina proteasa porque E1 tiene 0-1 residuos Lys. El tratamiento del complejo con lisina proteasa destruye E2 y permite la fácil separación de E1.

La especificidad por tejido del VHC, en combinación con la observación de que las glicoproteínas de la envuelta del VHC terminan en manosa, sugiere que el virus emplea el receptor de manosa o el receptor de asialoglicoproteína (ASGR) con el fin de conseguir la entrada en células huésped. Los receptores de manosa se encuentran en macrófagos y células sinusoidales hepáticas, mientras que el ASGR se encuentra en hepatocitos parenquimatosos. Por tanto, debe ser posible cultivar el VHC empleando células huésped que expresan uno o ambos de estos receptores. O pueden emplearse cultivos celulares primarios que expresan naturalmente el receptor usando condiciones bajo las que se mantiene el receptor, o puede transfectarse otra línea celular tal como HeLa, CHO, COS y similares con un vector que proporciona la expresión del receptor. La clonación del receptor de manosa y su transfección y expresión en fibroblastos se ha demostrado por M.E. Taylor y col., J Biol Chem (1990) 265:12156-62. La clonación y la secuenciación del ASGR se describió por K. Drickamer y col., J Biol Chem (1984) 259:770-78 y M. Spiess y col., Proc Nat Acad Sci USA (1985) 82:6465-69; la transfección y la expresión del ASGR funcional en células HTC de rata se describió por M. McPhaul y P. Berg, Proc Nat Acad Sci USA (1986) 83:8863-67 y M. McPhaul y P. Berg, Mol Cell Biol (1987) 7:1841-47. Por tanto, es posible transfectar uno o ambos receptores en líneas celulares adecuadas y usar las células resultantes como huéspedes para la propagación del VHC en cultivo. El pase seriado del VHC en tales cultivos debe dar como resultado el desarrollo de cepas atenuadas adecuadas para uso como vacunas vivas. O pueden emplearse cultivos celulares primarios que expresan naturalmente el receptor usando condiciones bajo las que se mantiene el receptor, o puede transfectarse otra línea celular tal como HeLa, CHO, COS y similares con un vector que proporciona la expresión del receptor. La clonación del receptor de manosa y su transfección y expresión en fibroblastos se ha demostrado por Taylor y col., anteriormente, mientras que la transfección y la expresión del ASGR funcional en células HTC de rata se describió por McPhaul y col., anteriormente. Actualmente se prefiere emplear una línea celular inmortalizada transfectada con uno o varios receptores recombinantes.

Las composiciones inmunogénicas pueden prepararse según procedimientos conocidos en la técnica. Las presentes composiciones comprenden una cantidad inmunogénica de un polipéptido, por ejemplo, E1, E2, o composiciones de partículas E1/E2, normalmente combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable que preferentemente comprende además un adyuvante. Si se desea una "mezcla", puede mezclarse junta una combinación de polipéptidos del VHC tales como, por ejemplo, antígenos de E1 más E2, para aumentar la eficacia. Se espera que las partículas similares a virus de conjuntos E1/E2 proporcionen un antígeno de vacuna particularmente útil. Las composiciones inmunogénicas pueden administrarse a animales para inducir la producción de anticuerpos, o para proporcionar una fuente de anticuerpos o para inducir inmunidad protectora en el animal.

Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Vehículos adecuados son normalmente macromoléculas grandes lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos; y partículas de virus inactivos. Tales vehículos son muy conocidos para aquellos expertos en la materia.

Adyuvantes preferidos para potenciar la eficacia de la composición incluyen, pero no se limitan a: hidróxido de aluminio (alumbre), N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) como se encuentra en la patente de EE.UU. nº 4.606.918, N-acetilnormuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno al 2%/Tween® 80. Adicionalmente pueden usarse adyuvantes tales como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA). Además, puede usarse adyuvante completo de Freund (ACF) y adyuvante incompleto de Freund (AIF) para aplicaciones a no seres no humanos y fines de investigación.

Las composiciones inmunogénicas contendrán normalmente vehículos farmacéuticamente aceptables tales como agua, solución salina, glicerina, etanol, etc. Adicionalmente, en tales vehículos pueden incluirse sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento del pH y similares.

Normalmente, las composiciones inmunogénicas se preparan como inyectables, bien como disoluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para potenciar el efecto adyuvante.

Composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz del polipéptido del VHC, además de cualquier otro de los componentes anteriormente mencionados, si se necesitan. "Cantidad inmunológicamente eficaz" significa que la administración de esa cantidad a un individuo, bien en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento, como se define anteriormente. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y la condición física del individuo que va a tratarse, el grupo taxonómico de individuos que va a tratarse (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico de cabecera de la situación médica, la cepa de VHC infectante y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad entre dentro de un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse mediante ensayos rutinarios.

Los conjuntos E1/E2 de autoensamblado también pueden servir de vehículos de vacuna para presentar haptenos heterólogos (sin VHC) del mismo modo que el antígeno de superficie de la hepatitis B (véase la solicitud de patente europea 174.444). En este uso, los conjuntos E1/E2 proporcionan un vehículo inmunogénico que puede estimular una respuesta inmunitaria a haptenos o antígenos conjugados al conjunto. El antígeno puede conjugarse o mediante procedimientos químicos convencionales, o puede clonarse dentro del gen que codifica E1 y/o E2 en una localización correspondiente a una región hidrófila de la proteína.

Las composiciones inmunogénicas se administran convencionalmente parenteralmente, normalmente mediante inyección, por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente. Formulaciones adicionales adecuadas para otras vías de administración incluyen formulaciones orales y supositorios. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis únicas o un programa de dosis múltiples. La vacuna puede administrarse conjuntamente con otros agentes inmunoreguladores.

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C. Ejemplos

Los ejemplos presentados a continuación se proporcionan como una guía adicional para el médico general experto en la materia y de ningún modo deben interpretarse como limitantes de la invención.

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Ejemplo 1 Clonación y expresión

(A)

Los vectores se construyeron a partir de plásmidos que contenían la porción 5' del genoma del VHC como se describe en los documentos EP 318.216 y EP 388.232. El casete VHC(S/B) contiene un fragmento de ADN StuI-BgIII que codifica el extremo 5' de la poliproteína desde Met_{1} hasta Leu_{906} empezando en el nucleótido -63 con respecto a Met_{1}. Éste incluye la proteína del núcleo (C), la proteína E1 (también se denomina algunas veces en lo sucesivo S), la proteína E2 (también se denomina en lo sucesivo NS1) y una porción 5' de la región NS2a. Con la expresión del constructo, las proteínas C, E1 y E2 individuales se producen mediante procesamiento proteolítico.

El casete VHC(A/B) contiene un fragmento de ADN ApaLI-BgIII que codifica el extremo 5' de la poliproteína desde Met_{1} hasta Leu_{906} empezando en el nucleótido -6 con respecto a Met_{1}. Éste incluye la proteína del núcleo (C), la proteína E1 (también se denomina algunas veces en lo sucesivo S), la proteína E2 (también se denomina en lo sucesivo NS1) y una porción 5' de la región NS2a. Con la expresión del constructo, las proteínas C, E1 y E2 individuales se producen mediante procesamiento proteolítico.

El casete C-E1(S/B) (una porción de StuI-BamHI) contiene el extremo 5' desde Met_{1} hasta Ile_{340} (un sitio BamHI en el gen). La expresión de este casete da como resultado la expresión de C y una E1 algo truncada (E1'). La porción truncada desde el extremo 3' es una región hidrófoba que se cree sirve de señal de translocación.

El casete NS1(B/B) (una porción de BamHI-BgIII) contiene una pequeña porción 3' de E1 (desde Met_{364}), toda la E2 y una porción de NS2a (hasta Leu_{906}). En este constructo, el fragmento de E1 sirve de señal de translocación.

El casete TPA-NS1 emplea un líder del activador de plasminógeno de tejido humano (tPA) como señal de translocación en lugar de la porción 3' de E1. El casete contiene una forma truncada de E2, desde Gly_{406} hasta Glu_{661}, en la que se elimina el extremo 3' hidrófobo.

Cada casete se introdujo dentro del vector pGEM3Z (Promega) con y sin una secuencia no codificante en 5' de \beta-globina sintética para la transcripción y traducción usando T7 y expresión de reticulocitos de conejo in vitro. Los vectores del virus de la variolovacuna recombinante (VVr) se prepararon introduciendo los casetes dentro del plásmido pSC11 (obtenido del Dr. B. Moss, NIH) seguido de recombinación con virus de la variolovacuna, como se describe por Charkrabarty y col. Mol Cell Biol (1985) 5:3403-09.

(B)

Se construyó un vector de expresión alterno introduciendo VHC(A/B) entre los sitios StuI y SpeI de pSC59 (obtenidos del Dr. B. Moss, NIH) seguido de recombinación con virus de la variolovacuna, como se describe por Charkrabarty y col., Mol Cell Biol (1985) 5:3403-09.

(C)

Se recogieron células HeLa S3 por centrifugación durante 7 minutos a 2000 rpm a temperatura ambiente en botellas de centrífuga de 500 ml estériles (rotor JA-10). Las suspensiones se volvieron a suspender a una concentración final de 2 x 10^{7} células/ml en medio de cultivo adicional (medio para centrífuga MEM modificado con Joklik + 5% de suero de caballo y gentamicina) ("medio para centrífuga"). Se añadió caldo del virus vv/SC59-VHC bruto sonicado a una multiplicidad de infección de 8 ufp/célula y la mezcla se agitó a 37ºC durante 30 minutos. Entonces, las células infectadas se transfirieron a un matraz para centrífuga que contenía 8 l de medio para centrífuga y se incubaron durante 3 días a 37ºC. Entonces, las células cultivadas se recogieron por centrifugación y las suspensiones se volvieron a suspender en tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, 152 ml). Entonces, las células se homogeneizaron usando un homogeneizador Dounce de 40 ml (50 golpes) y los núcleos se suspendieron por centrifugación (5 minutos, 1600 rpm, 4ºC, rotor JA-20). Las suspensiones nucleares se volvieron a suspender en tampón Tris (24 ml), se volvieron a homogeneizar y se suspendieron de nuevo, recogiéndose todos los sobrenadantes.

El lisado reunido se dividió en alícuotas de 10 ml y se sonicaron 3 x 30 minutos en un sonicador de copa de cuerno a potencia media. El lisado sonicado (15 ml) se aplicó en capas sobre colchones de sacarosa de 17 ml (36%) en tubos de centrífuga SW28 y se centrifugó a 13.500 rpm durante 80 minutos a 4ºC para suspender el virus. La suspensión de virus se volvió a suspender en 1 ml de tampón Tris (Tris HCl 1 mM, pH 9,0) y se congeló a -80ºC.

Ejemplo 2 Comparación de productos in vitro e in vivo

(A)

E1 y E2 se expresaron tanto in vitro como in vivo y se marcaron con ^{35}S-Met usando los vectores descritos en el ejemplo 1 anterior. Las células BSC-40 y HeLa se infectaron con los vectores del VVr para la expresión in vivo. Tanto el medio como los lisados celulares se examinaron para proteínas recombinantes. Los productos se inmunoprecipitaron usando suero inmune del VHC humano, mientras que las proteínas in vitro se analizaron directamente. Las proteínas resultantes se analizaron mediante SDS-PAGE.

El sistema de expresión en reticulocito (pGEM3Z con VHC(S/B) o VHC(A/B)) produjo proteínas C, E1 y E2 que tenían pesos moleculares de aproximadamente 18 kD, 35 kD, y 72 kD, respectivamente. Los lisados de células BSC-40 y HeLa transfectados con el VVr que contenía VHC(S/B), VHC(A/B) o C-E1(S/B) presentaron las mismas proteínas. Debido a que el sistema de reticulocito no proporciona procesamiento de golgi eficaz y, por tanto, no proporciona ácido siálico, el hecho de que tanto los productos in vitro como in vivo presenten movilidades idénticas sugiere que las proteínas no se sialilan in vivo. Sólo el vector del VVr que contiene TPA-NS1 dio como resultado secreción extracelular de E2, que presentó una movilidad alterada consistente con la sialilación.

(B)

Se expresó VHC(S/B) in vitro y se incubó con un panel de lectinas biotiniladas: GNA, SNA, PNA, WGA y ConA. Tras la incubación, los complejos se recogieron sobre perlas acrílicas de avidina, se lavaron, se eluyeron con tampón de muestra Laemmli y se analizaron por SDS-PAGE. Los resultados mostraron que E1 y E2 se unieron a GNA y ConA, que indica la presencia de manosa. GNA se une a los grupos de manosa terminal, mientras que ConA se une a cualquier manosa ligada en \alpha. La falta de unión a SNA, PNA y WGA indica que ninguna de las proteínas contenía ácido siálico, galactosa-N-acetilgalactosamina o N-acetilglucosamina.

(C)

Se produjeron E1 y E2 radiomarcadas en células BSC-40 mediante infección con el VVr que contenía VHC(S/B) (w/SC11-VHC) y se inmunoprecipitaron con suero inmune del VHC^{+} humano. La mitad del material inmunoprecipitado se trató durante la noche con neuraminidasa para eliminar cualquier ácido siálico. Tras el tratamiento, las proteínas tratadas y sin tratar se analizaron por SDS-PAGE. No se observó diferencia significativa en la movilidad, que indica falta de sialilación in vivo.

(D)

Se produjeron E1 y E2 radiomarcadas en células BSC-40 mediante infección con el VVr que contenía VHC(A/B) (vv/SC59-VHC) y o se inmunoprecipitaron con suero del VHC^{+} humano o se precipitaron usando lectina GNA biotinilada unida a perlas acrílicas usando w/SC11 libre de secuencias del VHC como control. Los precipitados se analizaron por SDS-PAGE. Los datos demostraron que E1 y E2 eran las especies principales de proteínas terminadas en manosa en células infectadas con vv/SC59-VHC. GNA era tan eficaz como los antisueros humanos en la precipitación de E1 y E2 del medio de cultivo celular. Se observó un componente de 25 kD, pero parece ser específico para células infectadas por variolovacuna.

Ejemplo 3 Purificación usando lectina

(A)

Se inocularon células HeLa S3 con caldo del virus vv/SC59-VHC de alto título purificado a una multiplicidad de infección de 5 ufp/célula y la mezcla se agitó a 37ºC durante 30 minutos. Entonces, las células infectadas se transfirieron a un matraz para centrífuga que contenía 8 l de medio para centrífuga y se incubaron durante 3 días a 37ºC. Las células se recogieron de nuevo por centrifugación y se volvieron a suspender en tampón hipotónico (HEPES 20 mM, NaCl 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, 120 ml) sobre hielo. Entonces, las células se homogeneizaron usando un homogeneizador Dounce (50 golpes) y los núcleos se suspendieron por centrifugación (5 minutos, 1600 rpm, 4ºC, rotor JA-20). Las suspensiones se reunieron, se volvieron a suspender en 48 ml de tampón hipotónico, se volvieron a homogeneizar, se volvieron a centrifugar, se reunieron de nuevo y se congelaron a -80ºC.

Entonces, los sobrenadantes congelados se descongelaron y la fracción de membrana microsomal del lisado posnuclear se aisló mediante centrifugación durante 20 minutos en un rotor JA-20 a 13.500 rpm a 4ºC. El sobrenadante se eliminó por aspiración.

Las suspensiones se recogieron en 96 ml de tampón de detergente (Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, DDT 1 mM, 0,5% de Triton X-100, pH 7,5) y se homogeneizaron (50 golpes). El producto se clarificó por centrifugación durante 20 minutos a 13.500 rpm, 4ºC, y los sobrenadantes se recogieron.

Una columna de GNA-agarosa (1 cm x 3 cm, 3 mg de GNA/ml de perlas, volumen del lecho de 6 ml, Vector Labs, Burlingame, CA) se equilibró previamente con tampón de detergente. La muestra de sobrenadante se aplicó a la columna con recirculación a una velocidad de flujo de 1 ml/min durante 16-20 horas a 4ºC. Entonces, la columna se lavó con tampón de detergente.

Las proteínas E1/E2 purificadas se eluyeron con \alpha-D-manósido (0,9 M en tampón de detergente) a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto. La elución se detuvo con la aparición de E1/E2 en el eluyente, y la columna se dejó volver a equilibrar durante 2-3 horas. Las fracciones se analizaron por transferencia de Western y tinción con plata. Las fracciones de pico se reunieron y se irradiaron con UV para inactivar cualquier virus residual de la variolovacuna.

(B)

Las asialoglicoproteínas E1 y E2 purificadas con GNA-agarosa se sedimentaron mediante gradientes de glicerina al 20-60%. Los gradientes se fraccionaron y las proteínas se analizaron por SDS-PAGE y transferencia de Western. Las transferencias se probaron con GNA para la identificación de E1 y E2. Los resultados indican la presencia de un heterodímero E1:E2 que sedimenta a la velocidad esperada (es decir, una posición característica de una proteína de 110 kD). También son evidentes conjuntos más grandes de proteínas de la envuelta del VHC. También eran evidentes homodímeros E2:E2. E2 pareció estar sobrerrepresentada en las especies más grandes con respecto a E1, aunque también se detectaron especies E1:E2 diferenciadas. Los conjuntos más grandes sedimentaron significativamente más rápido que el marcador de tiroglobulina.

(C)

Se sedimentaron E1 y E2 purificadas con GNA-agarosa mediante gradientes de glicerina al 20-60% que contenían EDTA 1 mM. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE con y sin \beta-mercaptoetanol (\betaME). Se observó poca o ninguna diferencia en la abundancia aparente de E1 y E2 en presencia o ausencia de \betaME, que indica la ausencia de enlaces disulfuro entre heterodímeros.

(D)

Los complejos E1/E2 (aproximadamente el 40% de pureza) se analizaron en un analizador de partículas de submicrómetros Coulter DM-4. El material se detectó en el intervalo de 20-60 nm.

(E)

Los complejos E1/E2 (aproximadamente el 40% de pureza) se analizaron mediante microscopía electrónica usando tinción negativa con ácido fosfotúngstico. La micrografía electrónica reveló la presencia de partículas que tenían un aspecto esférico y un diámetro de aproximadamente 40 nm. Los complejos E1/E2 se incubaron con suero inmune humano del VHC^{+}, luego se analizaron por EM con tinción negativa. Se observaron complejos de anticuerpos que contenían grandes conjuntos y partículas más pequeñas.

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Ejemplo 4 Purificación cromatográfica

(A)

El material purificado con lectina GNA preparado como se describe en el ejemplo 3 (0,5-0,8 ml) se diluyó 10x con tampón A (tampón Tris-Cl 20 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) y se aplicó a una columna de 1,8 x 1,5 cm de Fractogel EMD DEAE-650 (EM Separations, Gibbstown, Nueva Yérsey, nº de cat. 16883) equilibrada en tampón A. La fracción de proteína que contenía E1/E2 se eluyó con el mismo tampón a una velocidad de flujo de 0,2 ml/minuto y se recogieron fracciones de 1 ml. Las fracciones que contenían E1 y E2 (determinadas por SDS-PAGE) se reunieron y se almacenaron a -80ºC.

(B)

El material purificado en la parte (A) anterior tiene una pureza del 60-80% como se estima por SDS-PAGE. La identificación de las bandas de E1 y E2 putativas se confirmó mediante el análisis de la secuencia del extremo N después de usar una técnica de transferencia. Para el fin, el material de E1/E2 purificado en Fractogel-DEAE se redujo mediante la adición de tampón Laemmli (pH 6,8, Tris-Cl 0,06 M, 2,3% de SDS, 10% de glicerina, \beta-mercaptoetanol 0,72 M) y se llevó a ebullición durante 3 minutos. Entonces, la muestra se cargó en un gel de poliacrilamida al 10%. Después de SDS-PAGE, la proteína se transfirió a una membrana de 0,2 \mum de difluoruro un polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Las bandas de las proteínas E1 y E2 putativas respectivas se suprimieron de la transferencia y se sometieron a análisis de aminoácidos del extremo N, aunque no se tomó ningún cuidado especial para evitar el bloqueo del extremo amino durante la preparación del material. Los 15 primeros ciclos revelaron que la muestra de E1 tenía una secuencia Tyr-Gln-Val-Arg-X-Ser-Thr-Gly-X-Tyr-His-Val-X-Asn-Asp, mientras que la secuencia de E2 era Thr-His-Val-Thr-Gly-X-X-Ala-Gly-His-X-Val-X-Gly-Phe. Estos datos de la secuencia de aminoácidos concuerdan con los esperados de las secuencias de ADN correspondientes.

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Se cree que el producto de E1/E2 purificado anteriormente por cromatografía en Fractogel-DEAE está agregado como se demuestra por el hecho de que una gran cantidad de E1 y E2 se coeluye en la región de volumen vacío de una columna Bio-Sil TSK-4000 SW cromatográfica de exclusión molecular. Esto indica que en condiciones nativas una cantidad significativa del complejo E1/E2 tiene un peso molecular de al menos 800 kD. También se observó material de E1/E2 que tenía un peso molecular de aproximadamente 650 kD.

Claims (6)

1. Una asialoglicoproteína del virus de la hepatitis C (VHC) seleccionada de una glicoproteína truncada expresada a partir de la región E1 del VHC que comprende una deleción en una porción de la secuencia encontrada en una región que abarca los aminoácidos 330-380 de la región E1, numerados desde el principio de las poliproteínas del VHC, y una glicoproteína expresada a partir de la región E2 del VHC que comprende una deleción en una porción de la secuencia encontrada en una región que abarca los aminoácidos 660-830 de la región E2, numerados desde el principio de la poliproteína del VHC.

2. Una asialoglicoproteína según la reivindicación 1, en la que dicha glicoproteína truncada se expresa a partir de la región E1 del VHC y comprende una deleción en una porción de la secuencia encontrada en una región que abarca los aminoácidos 330-380 de la región E1, numerados desde el principio de la poliproteína del VHC.

3. Una asialoglicoproteína según la reivindicación 1, en la que dicha glicoproteína truncada se expresa a partir de la región E2 del VHC y comprende una deleción en una porción de la secuencia encontrada en una región que abarca los aminoácidos 660-830 de la región E2, numerados desde el principio de la poliproteína del VHC.

4. Una composición que comprende una asialoglicoproteína del VHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una composición según la reivindicación 4 que comprende una cantidad eficaz de una asialoglicoproteína del VHC en un vehículo farmacéuticamente aceptable para uso en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria en un animal.

6. Un procedimiento de inmunoensayo que comprende poner en contacto una muestra biológica con una asialoglicoproteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que dicha asialoglicoproteína lleva un marcador detectable.