PL175610B1 - Sposób wytwarzania proteiny wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) nadającej się do stosowania w szczepionce lub w próbie immunologicznej - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania proteiny wirusa zapalenia watroby typu C (HCV) nadajacej sie do stosowania w szczepionce lub w próbie immunologicznej, obejmujacy hodowanie komór- ki gospodarza stransformowanej genem strukturalnym kodujacym proteine HCV w odpo- wiedniej pozywce hodowlanej, doprowadzenie do ekspresji tego genu strukturalnego i izolowanie tej proteiny HCV z hodowli komórkowej, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania proteiny HCV proteine ta stanowi asialoglikoproteina bedaca wynikiem eks- presji regionu E1 genomu HCV, asialoglikoproteina bedaca wynikiem ekspresji regionu E2 genomu HCV i ich agregaty, przy czym ekspresje prowadzi sie w warunkach hamujacych si alacje a izolacje prowadzi sie, kontrolujac hodowle komórkowa z bialkiem wiazacym mannoze, specyficznym dla glikoprotein z przylaczona na koncu mannoza. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania proteiny wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) nadającej się do stosowania w szczepionce lub w próbie immunologicznej. Asialoglikoproteiny, należące do glikeprotein, nadają się do stosowania w diagnozowaniu, leczeniu i profilaktyce infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV).

Wirusowe zapalenie wątroby typu nie-A i nie-B (NANBH) stanowi chorobę zakaźną lub grupę chorób, o których wiadomo, że wywołują je wirusy, i że można je odróżnić od innych wirusowych chorób wątroby obejmujących choroby spowodowane przez wirusa zapalenia

175 610 wątroby typu A (HAV), wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), wirusa zapalenia wątroby typu delta (HDV), a także od zapalenia wątroby wywołanego pracz cytomegalowirusa (CMV) lub przez wirusa Epsteina-Barra (EBV).

Dane epidemiologie--e sugerują, że istnieją trzy typy NANBH: typ epidemiczny rozprzestrzeniający się drogą wodną, typ rozprzestrzeniający się przez krew lub igłę i rzadko występujący typ nabyty w grupie. Liczba czynników, które mogą powodować NANBH jest nieznana.

Ostatnio zidentyfikowano jako główną przyczynę (jeśli nie jedyną) zapalenia wątroby typu nie-A i nie-B (NANBH) nowy gatunek wirusa, wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) rozprzestrzeniającego się przez krew (BB-NANBH). Patrz na przykład: międzynarodowa publikacja nr WO89/046699. W wielu krajach lub regionach obejmujących Stany Zjednoczone Ameryki, Europę i Japonię, zapalenie wątroby typu C stanowi główną postać potransfuzyjnego zapalenia wątroby. Są także dowody sugerujące udział HCV w wywoływaniu raka komórek wątroby. Tak więc istnieje potrzeba dysponowania skutecznym sposobem zapobiegania i leczenia infekcji wirusem HCV.

Istnieje poważne zapotrzebowanie na czułe, specyficzne sposoby skriningu i identyfikacji nośników HCV i krwi zakażonej HCV lub produktów z takiej krwi. Potransfuzyjne zapalenie wątroby (PTH) występujące u około 10% pacjentów poddanych transfuzji, a HCV stanowi przyczynę do 90% tych przypadków. Głównym problemem tej choroby jest często występujący rozwój chronicznego uszkodzenia wątroby (25 - 55%).

Leczenie jak również zapobieganie przenoszeniu HCV przez krew i jej produkty lub przez bliski kontakt osobisty wymaga możliwości wykrywania kwasów nukleinowych, antygenów i przeciwciał związanych z HCV, które to wykrywanie stanowiłoby środek niezawodnego diagnozowania i prognozowania. Ponadto istnieje zapotrzebowanie na skuteczne szczepionki i immunoterapeutyczne środki lecznicze zapobiegające i leczące tę chorobę.

Okazuje się, że wirus HCV występuje we krwi zakażonych osobników w bardzo niskich stężeniach w porównaniu z innymi wirusami zakażającymi, co czyni go bardzo trudnym do wykrycia. Niskie stężenie wirusa stanowi prawdopodobnie główną przyczynę tego, że czynnik powodujący zapalenie wątroby typu nie-A i nie-B (NANBH) pozostawał tak długo nieznany. Nawet, jeśli ostatnio został on sklonowany, w dalszym ciągu występują trudności w jego hodowaniu i namnażaniu. Dlatego też istnieje silne zapotrzebowanie na rekombinacyjne sposoby wytwarzania diagnostycznych/leczniczych/profilaktycznych białek HCV.

Ponadto istnieje zapotrzebowanie na szczepionkę przeciwko HCV. Jednakże, wyhodowanie HCV w liniach komórkowych jest wyjątkowo trudne. Tak więc, nie jest obecnie możliwe wytwarzanie atenuowanych szczepów wirusowych przez kolejne pasażowanie w hodowli tkankowej/komórkowej.

Obecnie odkryto, że dwa białka HCV, E1 i E2 są związanymi z błoną komórkową asialoglikoproteinami jeśli ulegająekspresji w rekombinowanych układach. Jest to zadziwiające, ponieważ zwykle u ssaków glikoproteiny nie pozostają w postaci z przyłączoną na końcu mannozą, stanowi na ogół jedynie postać przejściową. W przypadku białek E1i E2 (ulegających ekspresji w sposobie według wynalazku), asialoglikoproteina wydaje się stanowić postać końcową. E1 (białko otoczki 1) jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej wynoszącej około 35000, powstającą w wyniku translacji przypuszczalnego regionu E1 genomu HCV. E2 (białko otoczki 2) jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej wynoszącej około 72000, powstającą w wyniku translacji przypuszczalnego regionu NS1 (nietrrakturalne białko 1) genomu HCV, co stwierdzono w oparciu o flawiwirusowy model HCV. Z uwagi na to, że glikoproteiny są często wysoce immunogenne, E1 i E2 będą głównymi kandydatami do stosowania w próbkach immunologicznych i jako lecznicze/profilaktyczne szczepionki.

Odkrycie, że E1 i E2 nie zawierają reszt kwasu sialowego, jest bardzo ważne. Szczególna postać białka często decyduje o tym, jakie komórki mogą służyć jako odpowiedni gospodarze ekspresji na drodze rekombinacji. Komórki prokariotyczne, takie jak E. coli, nie glikozylują białek i zwykle nie nadają się do wytwarzania glikoprotein przeznaczonych do stosowania jako antygeny, ponieważ często glikozylacja jest istotna dla pełnej antygenowości, rozpuszczalności i trwałości białka. Niższe eukarionty, takie jak drożdże i grzyby, glikozylują białka, lecz zwykle nie są zdolne do przyłączania końcowych reszt kwasu sialowego do kompleksów z węglowoda4

175 610 nami. Zatem białka pochodzenia drożdżowego mogą różnić się pod względem antygenowości od ich odpowiedników występujących naturalnie (nierekombinowanych). Jeśli istotna jest antygenowość produktu, preferuje się ekspresję w komórkach ssaczych, ponieważ w takim przypadku glikozylacja mogłaby bardzo upodobnić rekombinowane białko do wirusowych białek dzikiego typu.

Najnowsze dowody wskazują na to, że podczas zakażenia wirus HCV może z powodzeniem wtargnąć do komórek gospodarza poprzez receptor asialoglikoproteinowy znaleziony na hepatocytach, albo poprzez receptor mannozowy znaleziony na komórkach śródbłonkowych wątroby i makrofagach (zwłaszcza na komórkach Kupffera). Nieoczekiwanie okazało się, że większość naturalnych białek E1 i E2 nie zawiera końcowych reszt kwasu sialowego, białka te są glikozylowane jedynie w części rdzeniowej. Mała część zawiera dodatkowo końcową N-acetyloglukozaminę. Zatem, celem wynalazku jest dostarczenie glikoprotein otoczki HCV pozbawionych wszystkich lub zasadniczo wszystkich końcowych reszt kwasu sialowego.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania proteiny wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) nadającej się do stosowania w szczepionce lub w próbie immunologicznej, obejmujący hodowanie komórki gospodarza stransformowanej genem strukturalnym kodującym proteinę HCV w odpowiedniej pożywce hodowlanej, doprowadzenie do ekspresji tego genu strukturalnego i izolowanie tej proteiny HCV z hodowli komórkowej, polegający na tym, że w przypadku wytwarzania proteiny HCV proteinę tą stanowi asialoglikoproteina będąca wynikiem ekspresji regionu E1 genomu HCV, asialoglikoproteina będąca wynikiem ekspresji regionu E2 genomu HCV i ich agregaty, przy czym ekspresję prowadzi się w warunkach hamujących sjalację a izolację prowadzi się, kontaktując hodowlę komórkową z białkiem wiążącym mannozę, specyficznym dla glikoprotein z przyłączoną na końcu mannozą.

Korzystnie w sposobie według wynalazku jako komórki gospodarza stosuje się komórki pochodzenia ssaczego.

Stosowane w sposobie według wynalazku warunki hamujące sialację korzystnie obejmują obecność wystarczających ilości modulatora wapnia do spowodowania uwalniania białek w retikulum endoplazmatycznym.

Również korzystnie warunki hamujące sjalację obejmują ekspresję asialoglikoprotein na poziomie wystarczającym do hamowania transportu glikoprotein z retikulum endoplazmatycznego do aparatu Golgiego.

W sposobie według wynalazku korzystnie jako białko wiążące mannozę stosuje się lektynę wybraną z ConA i GNA. Jeszcze bardziej korzystne warunki są zapewnione, gdy białko wiążące mannozę jest unieruchomione na podłożu.

Jako modulator wapnia korzystnie stosuje się modulator wybrany z grupy zawierającej thapsigargin albo EGTA (kwas etylenoglikolo-bis[eter beta-amin<ratylowy]N,N,N’ ,N’-tet.raoctowy).

W sposobie według wynalazku ekspresję asialoglikoproteiny korzystnie prowadzi się z regionu El HCV lub z regionu E2 HCV. Również korzystnie asialoglikoproteinę może stanowić agregat E1/E2.

W korzystnym wykonaniu tego sposobu według wynalazku, kontaktowanie prowadzi się, inkubując hodowlę komórkową zawierającą asialoglikoproteinę HCV w kolumnie zawierającej unieruchomioną na podłożu lektynę wiążącą mannozę, w ciągu co najmniej 1 godziny i izoluje się tą związaną część asialoglikoproteiny przez eluowanie mannozą.

Termin asialoglikoproteina oznacza glikozylowaną proteinę zasadniczo pozbawioną reszt kwasu sialowego. Asialoglikoproteiny można wytworzyć na drodze rekombinacji lub przez oczyszczanie z hodowli komórkowej lub ze źródeł naturalnych. Asialoglikoproteiny otrzymywane w sposobie według wynalazku pochodzą od wirusa hCv, korzystnie są to białka El i E2, najkorzystniej rekombinowane białka El i E2 (rEl i rE2). Według powyższej definicji, proteina zasadniczo pozbawiona jest kwasu sialowego, jeśli liczba reszt kwasu sialowego zasadniczo nie przeszkadza w wiązaniu się glikoproteiny z białkami wiążącymi mannozę, takimi jak GNA. Taki stopień sialacji ma zwykle miejsce w przypadku, gdy kwas sialowy stanowi mniej niż około 40% wszystkich węglowodanów związanych poprzez wiązanie N-glikozydowe, korzystnie mniej niż około 30%, korzystniej mniej niż około 20%, a jeszcze korzystniej mniej niż około 10%, jeszcze korzystniej mniej niż około 5%, a najkorzystniej mniej niż około 2%.

175 610

Stosowane tu określenie E1 oznacza proteinę lub polipeptyd eksprymowany w obrębie pierwszych 400 aminokwasów poliproteiny HCV, czasami określany jako proteina E lub S. W swojej naturalnej postaci jest to glikoproteina o masie 35000, silnie związana z błoną komórkową. W większości naturalnych szczepów HCV proteina E1 kodowana jest po białku C (rdzeniowym) wirusowej poliproteiny. Proteina E1 rozciąga się od aminokwasu około 192 do aminokwasu około 383 poliproteiny o pełnej długości. Określenie Έ1 obejmuje także analogi i skrócone mutanty reaktywne w krzyżowej reakcji immunologicznej wobec naturalnej proteiny E1.

Stosowane tu określenie E2” oznacza proteinę lub polipeptyd eksprymowany w obrębie pierwszych 900 aminokwasów poliproteiny HCV, czasami określanyjak proteina NS1. W swojej naturalnej postaci jest to glikoproteina o masie 72000, silnie związana z błoną komórkową. W większości naturalnych szczepów HCV proteina E2 następuje po proteinie E1. Proteina E2 rozciąga się od aminokwasu około 384 do aminokwasu około 820. Określenie E2 obejmuje także analogi i skrócone mutanty reaktywne w krzyżowej reakcji immunologicznej wobec naturalnej proteiny E2. .

Stosowane tu określenie agregat oznacza kompleks E1 i/lub E2 zawierający więcej niż jeden monomer E1 lub E2. W kontekście tej definicji, agregatami są dimery E1:E1, E2:E2 oraz heterodimery E1:E2. Kompozycje glikoprotein mogą także obejmować większe agregaty, których masy cząsteczkowe przewyższają 800 kDa.

Stosowane tu określenie cząstka oznacza agregat E1, E2 lub E1/E2 widziany pod mikroskopem elektronowym i o średnicy wynoszącej co najmniej 20 Tm. Cząstki mają w przybliżeniu kulisty kształt i średnicę wynoszącą około 40 nm pod mikroskopem elektronowym.

Określenie oczyszczony stosowane tu do protein dotyczy takiej kompozycji protein, w której pożądana proteina stanowi co najmniej 35% wszystkich składników białkowych danej kompozycji. Pożądana proteina stanowi co najmniej 40%, lub co najmniej około 50%, lub co najmniej około 60%, lub około 70%, lub 80%, lub 90%, a najlepiej gdy co najmniej około 95% wszystkich składników białka. Kompozycja może zawierać inne związki, takie jak węglowodany, sole, lipidy, rozpuszczalniki i podobne, które nie zmieniają czystości wyrażonej w niniejszym opisie w procentach. Określenie wyizolowana” asialoglikoproteina HCV odnosi się do takiej asialoglikoproteiny HCV, której czystość określa się jako wynoszącą co najmniej 35%.

Stosowane tu określenie białko wiążące mannozę oznacza lektynę lub inne białko, które specyficznie wiąże białka zakończone w wyniku glikozylacji mannozą (na przykład asialoglikoproteiny), przykładowo lektyny wiążące mannozę, przeciwciała swoiste dla końcowej glikozylacji mannozowej, białko receptora mannozowego (R. A. B. Ezekwoitz i wsp., J. Exp. Med. (1990), 176: 1785 - 94), białka receptora asialoglikoproteinowego (H. Kurata i wsp., J. Biol. Chem. (1990), 265: 11295 - 98), surowicze białko wiążące mannozę (J. Schuffenecker i wsp., Cytogenet. Cell Genet. (1981), 56: 99 - 102; K. Sastry i wsp., J. Immunol. (1991), 147: 692 - 97), surowicze białko wiążące asialoglikoproteinę i podobne. Lektyny wiążące mannozę obejmują przykładowo GNA, konkanawalinę A (ConA) i inne lektyny o takich samych własnościach wiążących.

Określenie lektyna GNA” oznacza aglutyninę Galanthus nivalus, lektynę dostępną w handlu, wiążącą glikoproteiny z przyłączoną na końcu mannozą.

Stosowane tu określenie rekombinowana glikoproteina oznacza glikoproteinę eksprymowaną przez rckombinowany polinukleotyd, w którym gen strukturalny kodujący glikoproteinę ulega ekspresji pod kontrolą sekwencji regulatorowych, które naturalnie nie sąsiadują z tym genem strukturalnym, lub polinukleotyd, w którym gen strukturalny jest w postaci zmodyfikowanej . Przykładowo, można utworzyć wektor, w którym gen strukturalny białka E1 znajduje się pod kontrolą działającego fragmentu promotora drożdżowej dehydrogenazy gliceraldehydo3-fosforanowej (GAPDH). Właściwym promotorem do stosowania w drożdżach jest promotor hybrydowy ADH2/GAP, ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4,880,734, w którym zastosowano fragment promotora GAPDH w połączeniu z sekwencją aktywacji dehydrogenazy alkoholowej 2, umieszczoną w kierunku w górę (od strony 5') fragmentu GAPDH. Modyfikacje genu struktundr^cgo mogą obejmować podstawienia różnych

175 610 kodonów kodonami równoważnymi (przykładowo, aby zastosować kodony preferowane przez gospodarza, wyeliminować lub utworzyć miejsca restrykcyjne cięcia enzymatycznego, lub w celu kontrolowania budowy spinki do włosów'·, itd.), oraz podstawienie, insercję lub delecję ograniczonej liczby kodonów kodujących różne aminokwasy (można zmienić nie więcej niż około 10%, lub mniej niż około 5% liczby naturalnych aminokwasów w sekwencji), i podobne. Podobnie, ^c^l^<^im^iin^’wany receptor oznacza białko receptorowe eksprymowane przez rekombinowany polinukleotyd, w którym gen strukturalny kodujący receptor ulega ekspresji pod kontrolą sekwencji regulatorowych, które naturalnie nie sąsiadują z tym genem strukturalnym, lub przez polinukleotyd, w którym gen strukturalny jest w postaci zmodyfikowanej.

Określenie wyizolowany polipeptyd oznacza polipeptyd zasadniczo nie posiadający innych składników wirusa HCV, zwłaszcza polinukleotydów. Polipeptyd zasadniczo nie posiada innych składników, jeśli w skład polipeptydu wraz z połączonymi z nim komponentami wchodzi co najmniej 70% wag. polipeptydu, lub co najmniej około 80%, lub około 90%, lub ewentualnie 95% lub więcej. Na przykład, wyizolowanym polipeptydem według powyżej podanej definicji jest polipeptyd zawierający 1θ0 Tg/ml E1 i tylko 3 Tg/ml innych składników HCV (przykładowo DNA, lipidów i podobnych); polipeptyd taki zasadniczo nie posiada innych składników wirusa HCV.

Wyrażenie lider sekrecji oznacza polipeptyd, który jeśli jest zakodowany na N-końcu białka, po translacji powoduje sekrecję białka do środowiska hodowli komórki gospodarza. Na przykład, odpowiedni liderzy sekrecji stosowani w drożdżach obejmują sekwencję liderową czynnika I Saccharomyces cerevisiae (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4,870,008).

Określenie niższe eukarionty oznacza komórki takich gospodarzy jak drożdże, grzyby i podobne. Na ogół niższe eukarionty są jednokomórkowcami (ale nie koniecznie). Korzystne niższe eukarionty obejmują drożdże, zwłaszcza gatunki spośród Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hansenula i podobne. Najczęściej stosowanymi gospodarzami drożdżowymi są Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis i K. lactis, są one jednocześnie odpowiednimi gospodarzami grzybowymi.

Określenie wyższe eukarionty oznacza komórki pochodzące od wyższych zwierząt, takich jak ssaki, gady, owady i podobne. Sposób według wynalazku prowadzi się w komórkach gospodarzy wyższych eukariontów pochodzących od chomika chińskiego (na przykład CHO), małpy (na przykład komórki COS), ludzi i owadów (na przykład Spodoptera frugiperda). Komórki gospodarza można dostarczać w zawiesinie lub w hodowlach w kolbie, hodowlach tkankowych, hodowlach narządów i podobnych.

Określenie modulator wapnia oznacza związek zdolny do maskowania lub wiązania jonów wapnia w retikulum endoplazmatycznym lub zdolny do oddziaływania na stężenie jonów wapnia w retikulum endoplazmatycznym (ER) poprzez działanie na białka regulatorowe wapnia (na przykład białka kanalików wapniowych, pompy wapniowe, i podobne). Odpowiednie modulatory wapnia obejmują na przykład tapsigargin, EGTA (kwas bis/9-aminoetoksy/etylenoN,N,N’N’-czterooctowy). Obecnie preferowanym modulatorem jest tapsigargin (patrz na przykład O. Thastrup i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990), 87: 246(5 - 70).

Określenie immunogenny oznacza zdolność substancji do wywoływania humoralnej i/lub komórkowej odpowiedzi immunologicznej, przy czym chodzi o substancję jako taką lub w połączeniu z nośnikiem, w obecności lub pod nieobecność adiuwanta. Neutralizacja oznacza odpowiedź immunologiczną, która blokuje częściowo lub całkowicie zakażalność czynnika zakażającego.

Szczepionka oznacza kompozycję immunogenną zdolną do wywoływania częściowej lub pełnej obrony przeciwko HCV i nadającą się do podawania pacjentowi.

Określenie płyn biologiczny oznacza płyn pochodzący z organizmu, taki jak surowica, osocze, ślina, wydzieliny żołądkowe, śluz i podobne. Zwykle płyn biologiczny bada się pod kątem obecności cząstek HCV. Niektóre płyny biologiczne stosuje się jako źródło innych produktów, takich jak czynniki krzepnięcia (na przykład Czynnik VIII-C), albumina surowicza, hormon wzrostu i podobne. W takich przypadkach ważne jest, aby źródło w postaci płynu biologicznego było wolne od zanieczyszczeń takim wirusem jak HCV.

175 610

B. Ogólny sposób

Region E1 genomu HCV ujawniono w europejskim opisie patentowym nr EP 388 232jako region E, a region E2 jako NS1. Region E1 zawiera aminokwasy około 192-383 wirusowej poliproteiny o pełnej długości. Region E2 zawiera aminokwasy około 384 - 820. Pełna sekwencja prototypów tych protein (szczep HCV-1) są znane (patrz EP 388 232), jak również znane są ogólne sposoby klonowania i uzyskiwania ekspresji tych białek. Zarówno białko E1 jak i E2 mogą być eksprymowane przez polinukleotyd kodujący pierwsze aminokwasy 850 - 9C0) poliproteiny HCV: w wyniku potranslacyjnego procesowania w większości eukariotycznych komórek gospodarzy następuje rozszczepienie powstałej poliproteiny na białka C, E1 i E2. Można skrócić koniec 5’ regionu kodującego zmniejszając ilości wytwarzanego białka C.

Ekspresję asialoglikoprotein można osiągnąć kilkoma metodami. Przykładowo, ekspresję można uzyskać w niższych eukariontach (takich jak drożdże), które zwykle nie przyłączają reszt kwasu sialowego do glikozylowanych białek. W drożdżowych układach ekspresyjnych korzystnie stosuje się taki lider sekrecji jak lider czynnika I S. cerevisiae, w wyniku czego białko ulega ekspresji do środowiska hodowli po trca^.slacji. Korzystnie stosuje się mutanty z defektem glikozylacji, takie jak pmrl, ponieważ w przypadku takich mutantów zachodzi jedynie glikozylacja rdzenia, a ponadto często uzyskuje się wyższą wydajność sekrecji heterologicznych białek (H. K. Rudolph i wsp., Cell (1989), 58: 1^23 - 45). Alternatywnie, można stosować inne gatunki drożdży, takie jak Pichia pastoris, które eksprymują glikoproteiny zawierające 8-9 reszt mannosowych ułożonych podobnie, jak w przypadku glikozylacji rdzenia obserwowanej u ssaków i S. cerevisiae.

Alternatywnie, można stosować ekspresję w komórkach ssaczych i blokować glikozylację końcową (przyłączanie kwasu sialowego). Rekombinowane konstrukcje zawierają sygnał sekrecji zapewniający kierowanie białka do retikulum endoplazmatycznego. Uważa się, że transport do układu Golgi’ego blokują białka E1 i E2; okazuje się, że wysoki poziom ekspresji E1 i E2 w komórkach ssaczych wstrzymuje sekrecję wszystkich białek komórkowych do retikulum endoplazmatycznego lub układu Golgi’ego cis. Dodatkowo można stosować mutanty z defektem glikozylacji. Patrz na przykład: P. Stanley, Ann. Rev. Genet. (1984), 18: 525 - 52. W przypadku, gdy mutant glikozylacji lub transportu eksprymuje E1i E2 z resztami kwasu sialowego, końcowe reszty kwasu sialowego można usunąć działając neuramimidazą.

Dalsze zwiększenie wydajności osiąga się przy użyciu modulatora wapnia uzyskując uwalnianie białka poza retikulum endoplazmatyczne. Odpowiednie modulatory obejmują tapsigargin, EGTA oraz A23817 (patrz przykładowo: O. Thastrup i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990), 87: 24(6(5 - 70). Przykładowo, można osiągnąć wewnątrzkomórkową ekspresję dużych ilości E1 i E2 w komórkach ssaczych (na przykład CHO, COS, komórkach HeLa i podobnych) przez transfekcję przy użyciu jako wektora rekombinowanego wirusa krowianki. Po upływie czasu, w którym następuje ekspresja proteiny i akumulacja w retikulum endoplazmatycznym, komórki poddaje się działaniu modulatora wapnia w stężeniu wystarczająco dużym, aby spowodować uwolnienie zawartości retikulum endoplazmatycznego (ER). Następnie białko odzyskuje się z pożywki, którą wymienia się do następnego cyklu.

Ponadto, może być korzystne eksprymowanie skróconej postaci białka otoczki. Zarówno E1 jak i E2 posiadają wysoce hydrofobowe domeny, które najwyraźniej zatrzymują białko w retikulum endoplazmatycznym i zapobiegają wydajnemu uwalnianiu. Zatem, można zastosować delecję części sekwencji występujących w jednym lub w większej liczbie następujących regionów białka E1: aminokwasy 170 - 190, 260 - 290 i 330 - 380 (numeracja od początku poliproteiny) oraz w regionie białka E2: aminokwasy 660 - 830 (patrz na przykład Figura 20-1 w EP 388 232). Prawdopodobnie co najmniej jedna z tych hydrofobowych domen tworzy region transblonowy, który nie jest istotny z punktu widzenia ^^tt/g^^owości białka, z uwagi na co region taki można bez szkody wydeletować. Najlepszy region do delecji można określić przeprowadzając doświadczenia z małą liczbą delecji, co leży w zakresie możliwości fachowca. Wynikiem delecji hydrofobowego końca 3’ białka E2 jest sekrecja części eksprymowanego białka E2 wraz z sialacją wydzielanego białka.

W celu uzyskania ekspresji można stosować szereg różnych wektorów. Niższe eukarionty takie jak drożdże, na ogół transformuje się plazmidami z zastosowaniem metody precypitacji

175 610 fosforanem wapniowym, albo transfekuje się je rekombinowanym wirusem. Wektory ulegają replikacji w komórce gospodarza niezależnie, .albo integrują się w genomie komórki gospodarza. Wyższe eukarionty można transferować plazmidami, ale zwykle dokonuje się zakażenia rekombinowanym wirusem, na przykład rekombinowanym wirusem krowianki. Szczególnie preferuje się wirusa krowianki, ponieważ zakażenie krowianką wstrzymuje ekspresję białek komórki gospodarza.

Komórki gospodarza stosowane w sposobie według wynalazku mogą obejmować linie komórkowe HeLa i szpiczaka. W obecnym układzie oznacza to, że E1 i E2 akumulują się jako główne glikozylowane substancje w retikulum endoplazmatycznym (ER) gospodarza. Ponieważ E1 i E2 będą przeważającymi glikoproteinami zakończonymi mannozą, łatwo je oczyścić od komórek przy użyciu lektyn, które wiążą końcowe reszty mannozowe, takich jak aglutynina Galanthus nivalus (GNA).

Białka eksprymowane naturalnie jako glikoproteiny z przyłączoną na końcu mannozą występują w fizjologii ssaków stosunkowo rzadko. W większości przypadków ssacza glikoproteina zakończona mannoząjest tylko chwilowym produktem przejściowym procesu glikozylacji. Fakt, że białka otoczki HCV eksprymowane na drodze rekombinacji charakteryzują się końcową glikozylacją nannozową lub (w mniejszym stopniu) N-acetyloglukazalminową oznacza, że białka HCV i całe wiriony można oddzielić i częściowo oczyścić od endogennych białek przy użyciu lektyn specyficznych wobec końcowej mannozy lub N-acetyloglukazaminy. Rekom^nowane białka wyglądają jak autentyczne i uważa się, że są one zasadniczo identyczne jak białka otoczki występujące w dojrzałym, wolnym wirionie, albo identyczne jak związana z komórką postać białka otoczki. Zatem, w przypadku protein z przyłączoną na końcu mannozą stosuje się takie lektyny jak GNA, a w przypadku białek z przyłączoną na końcu N-acetyloglukozaminą stosuje się WGa (aglutynina zarodków pszennych). Do oddzielania E1 i E2 od supernatantów hodowli komórkowej i od innych płynów, przykładowo do oczyszczania przy wytwarzaniu antygenów do szczepionki lub do próby immunologicznej, można stosować lektyny związane z fazą stałą, (na przykład kolumnę lektyna-Sepharose®).

Alternatywnie, odpowiednią lektynę można zastosować w celu wyizolowania E1, E2 lub wirionów HCV z próbek płynu lub z tkanek pochodzących od osobników podejrzanych o zakażenie wirusem HCV. Ponieważ glikoproteiny z przyłączoną na końcu mannozą występują stosunkowo rzadko, taka procedura służyłaby oczyszczaniu białek obecnych w próbce przy zasadniczej redukcji tła. Po związaniu z lektyną, białko HCV można wykryć przy użyciu przeciwciał anty-HCV.· Jeśli obecne są całe wiriony, alternatywnie można wykryć kwasy nukleinowe HCV stosując techniki PCR lub inne metody amplifikacji kwasu nukleinowego konserwatywnych regionów genomu HCV (na przykład niekodujący region 5’). Sposób ten pozwala na wyizolowanie i scharakteryzowanie różnych szczepów HCV bez względu na dryfowanie antygenowe lub na odmiany antygenowości, na przykład w przypadkach, gdy nowy szczep nie reaguje w immunologicznej reakcji krzyżowej ze szczepem zastosowanym do wytworzenia przeciwciał. Istnieje cały szereg innych dróg wykorzystania specyficznego rozpoznawania glikoprotein z przyłączoną na końcu mannozą przez poszczególne lektyny. Przykładowo, można inkubować próbki podejrzane o zawieranie wirionów lub białek HCV z biotyną lub z lektynami znakowanymi awidyną i wytrącać kompleks białko - lektyna przy użyciu awidyny lub biotyny. Można także wykorzystać powinowactwo lektyny do białek HCV do kierowania związków leczniczych do wirionów, na przykład przez sprzężenie związku przeciwwirusowego z GNA. Alternatywnie, można zastosować odpowiednie lektyny do usuwania glikoprotein z przyłączoną na końcu mannozą z frakcji surowicy lub osocza, zmniejszając lub eliminując ryzyko zanieczyszczenia HCV.

Asialoglikoproteiny E1 i/lub E2 izoluje się z nieoczyszczeoych lizatów komórkowych przez inkubowanie z unieruchomionym białkiem wiążącym mannozę, zwłaszcza z lektyną, taką jak ConA lub GNA. Komórki poddaje się lizie, przykładowo przez mechaniczne rozrywanie w buforze hipoton^nym, a następnie przez odwirowanie w celu wytworzenia pozajądrowego lizatu i przez dalsze odwirowanie w celu otrzymania surowej mikrosomalnej frakcji błonowej. Następnie surową frakcję błonową rozpuszcza się w buforze zawierającym taki detergent jak Triton Χ-100, NP40 lub podobne. Ten detergentowy ekstrakt klaruje się następnie z cząstek

175 610 nierozpuszczalnych przez odwirowanie, a uzyskany klarowny lizat inkubuje się na kolumnie chromatograficznej zawierającej unieruchomione białko wiążące mannozę, korzystnie GNA związaną ze stałym podłożem, takim jak agaroza lub Sepharose®, w ciągu okresu czasu wystarczającego na związanie, zwykle w ciągu 16 do 20 godzin. Następnie zawiesinę podaje się na kolumnę do chwili, aż E1/E2 nie zacznie pojawiać się w eluacie, po czym inkubuje się w kolumnie w ciągu okresu czasu wystarczającego na związanie, zwykle w ciągu około 12 do 24 godzin. Następnie związaną substancję przemywa się dodatkowym buforem zawierającym detergent (na przykład Triton Χ-100, NP40 i podobne) i eluuje mannozą w celu uzyskania oczyszczonej asialoglikoproteiny. Najlepiej jest, gdy elucję prowadzi się tylko do chwili, aż białko zacznie pokazywać się w eluacie, w tym momencie elucję zatrzymuje się i pozwala się na zrównoważenie kolumny w ciągu 2-3 godzin przed elucją białka. Uważa się, że takie postępowanie zapewnia wystarczająco dużo czasu na powolny wypływ dużych agregatów białkowych. W przypadkach, gdy E1 i E2 ulegają ekspresji razem w postaci natywnej (to znaczy, z nieskróconą domeną wiążącą się z błoną), zasadnicza frakcja asialoglikoprotein pojawia się w postaci agregatów E1:E2. Pod mikroskopem elektronowym znaczna część tych agregatów widoczna jest jako w przybliżeniu kuliste cząstki o średnicy wynoszącej około 40 nm, którą to wielkość przypisuje się nieuszkodzonemu wirusowi. Cząstki te wydają się być samoistnie składającymi się subwirusowymi cząstkami. Te agregaty prawdopodobnie wykazują strukturę czwartorzędową bardzo podobną do struktury autentycznych cząstek wirionu HCV i dlatego uważa się, że mogą służyć jako wysoce immunogenne szczepionki.

Kompleksy E1/E2 można dalej oczyszczać metodą chromatografii żelowej na zasadowym medium, takim jak Fractogel-DEAE lub DEAE-Sepharose®. Stosując chromatografię żelową na Fractogel-DEAE można osiągnąć czystość kompleksów E1/E2 wynoszącą w przybliżeniu 6θ 80%. Białko E1 można dalej oczyszczać przez traktowanie proteazą lizynową, ponieważ E1 posiada 0-1 reszt lizynowych. Traktowanie kompleksu proteazą lizynową powoduje zniszczenie białka E2 i pozwala na łatwe oddzielenie białka E1.

Swoistość wirusa HCV w stosunku do tkanki, jak również obserwacja, że glikoproteiny otoczki HCV mają przyłączoną na końcu mannozę sugerują, że wirus wykorzystuje receptor mannozowy lub receptor asialoglikoproteinowy (ASGR) do wtargnięcia do komórek gospodarza. Receptory mannozowe znaleziono na makrofagach i na wątrobowych komórkach zatokowych, podczas gdy ASGR znaleziono na hepatocytach miąższowych. Zatem powinno być możliwe hodowanie HCV z zastosowaniem komórek gospodarza eksprymujących jeden lub oba te receptory. Można stosować pierwotne hodowle komórkowe eksprymujące receptor w sposób naturalny przy zastosowaniu warunków, w których receptor jest zachowany, albo też transfekować inną linię komórkową taką jak HeDa, CHO, COS i podobne wektorem zapewniającym ekspresję receptora. Klonowanie receptora mannozowego oraz transfekcję i jego ekspresję w fibroklastach ujawnili M. E. Taylor i wsp., J. Biol. Chem. (1990), 265: 12156 - 62. Klonowanie i sekwencjonowanie ASGR opisali H. Drickarner i wsp., J. Biol. Chem. (1984), 259: 770 - 78 oraz M. Spiess i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 82: 6465 - 69 i transfekcję i ekspresję działającego ASGR w szczurzych komórkach HTC opisali M. McPhaul i P. Berg, Mol. Cell. Biol. (1987), 7:1841-47. Zatem, możliwe jest dokonanie transfekcji jednego lub większej liczby receptorów do odpowiednich linii komórkowych i zastosowanie otrzymanych komórek jako gospodarzy do namnażania HCV w hodowli. W wyniku następujących po sobie pasażowań HCV, w takich hodowlach powinny rozwinąć się atenuowane szczepy odpowiednie do stosowania jako żywe szczepionki. Można stosować pierwotne hodowle komórkowe eksprymujące receptor w sposób naturahry w warunkach, w których receptor jest zachowywany, lub transfekować inną linię komórkową jak HeLa, CHO, COS i podobne wektorem zapewniającym ekspresję receptora. Klonowanie receptora mannozowego oraz transfekcję i jego ekspresję w fibroblastach ujawnili Taylor i wsp., powyżej, a transfekcję i ekspresję działającego ASGR w szczurzych komórkach hTc opisali McPhaul i wsp., powyżej. Obecnie preferuje się stosowanie immortalizowanej linii komórkowej transfekowanej jednym lub dwoma rekombinowanymi receptorami.

Kompozycje immunogenne można wytwarzać znanymi sposobami.

175 610

Kompozycje takie zawierają immunogenną ilość polipeptydu, na przykład mieszaniny cząstek E1, E2 lub E1/E2, zwykle połączonego z farmakologicznie dopuszczalnym nośnikiem, przy czym kompozycje te zawierają ponadto adiuwant. Jeśli pożądany jest koktail, można zmieszać ze sobą polipeptydy HCV, takie jak na przykład antygeny E1 plus E2 w celu podwyższenia skuteczności. Należy się spodziewać, że wirusopodobne agregaty cząstek E1/E2 zapewnią szczególnie użyteczny antygen szczepionki. Kompozycje immunogenne można podawać zwierzętom w celu wywołania wytwarzania przeciwciał - albo dla uzyskania źródła przeciwciał, bądź też w celu wywołania w zwierzęciu odporności ochronnej.

Jako fanma^dogicznie dopuszczalny nośnik, który jako taki nie wywołuje wytwarzania przeciwciał szkodliwych dla osobnika przyjmującego kompozycję. Odpowiednimi nośnikami są zwykle duże, powoli metabolizowane makrocząsteczki, takiejak białka, polisacharydy, kwasy polimlekowe, kwasy poliglikolowe, spolimeryzowane aminokwasy i kopolimery aminokwasów, jak również nieaktywne cząstki wirusa. Takie nośniki są znane fachowcom.

Jako właściwe adiuwanty wzmacniające skuteczność kompozycji stosuje się wodorotlenek glinu (alum), N-acetylomuramylo-L-treomylo-D-izoglutaminę (thr-MDP), jak ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4,606,918, N-acetylo-normuramylo-Lalanylo-D-izoglutaminę (nor-MDP),N-acetylomuraim^'ll>-L-alai^n^'lo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2-( 1 ’^’ -dipalnitoHo-snlglicero-3-hydroksyfosforyloksy)telyloaminę (MpP-PEoraz RIBI zawierający trzy składniki wyekstrahowane z bakterii, monofosforylolipid A, dimykolan trehalozy i budulec ściany komórkowej (MPL + TDM -CWS) w 2% emulsji skvalen/Tween®80. Ponadto można stosować takie adiuwanty jak Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA). W przypadku stosowania w celach badawczych i z wyłączeniem człowieka stosuje się kompletny adiuwant Freunda (CPA) i niekompletny adiuwant Freunda (IFA).

Kompozycje immunogenne będą zwykle zawierać farmakologicznie dopuszczalne nośniki, takie jak woda, sól fizjologiczna, glicerol, etanol i podobne. Do takich nośników można również dodać substancje pomocnicze, takie jak środki zwilżające i emulgujące, bufory pH i podobne.

Kompozycje immunogenne zwykle wytwarza się jako środki do iniekcji w postaci płynnych roztworów lub zawiesin lub w postaci ciał stałych nadających się do rozpuszczenia lub zawieszenia w płynach nośnikowych przed iniekcją. Preparaty te można również emulgować lub kapsułkować w liposomach w celu wzmocnienia działania wspomagającego.

Kompozycje immunogenne stosowane jako szczepionki zawierają immunologicznie skuteczną ilość polipeptydu HCV, jak również inne wyżej wymienione składniki, jeśli są one potrzebne. Wyrażenie immunologicznie skuteczna ilość oznacza taką ilość, która podana pacjentowi jednorazowo lub jako część serii podań, powoduje skutek w leczeniu, jak określono wyżej. Ta ilość różni się w zależności od stanu zdrowia i fizycznej kondycji leczonego pacjenta, grupy taksonomicznej leczonego pacjenta (na przykład naczelne z wyłączeniem człowieka, naczelne i podobne), zdolności układu immunologicznego pacjenta do wytwarzania przeciwciał, pożądanego stopnia ochrony, postaci szczepionki, oceny stanu leczenia przez lekarza leczącego, zakażającego szczepu HCV i innych czynników. Należy się spodziewać, że ilość ta może wahać się w stosunkowo szerokim zakresie i można ją określić drogą rutynowych prób.

Samoistnie powstające agregaty E1/E2 mogą także służyć jako nośniki szczepionek dla heterologicznych haptenów (nie-HCV) w taki sam sposób, jak powierzchniowy antygen zapalenia wątroby typu B (patrz Europejskie Zgłoszenie Patentowe nr 174,444). W tym zastosowaniu, agregaty E1/E2 stanowią immunogenny nośnik zdolny do stymulowania odpowiedzi immunologicznej na hapteny lub na antygeny sprzężone z agregatem. Antygen sprzęga się przy użyciu znanych sposobów chemicznych, lub klonuje się w genie kodującym E1 i/lub E2 w miejscu odpowiadającym hydrofilowemu regionowi białka.

Kompozycje immunogenne na ogół podaje się pozajelitowo, zwykle przez iniekcję, na przykład podskórną lub domięśniową. Inne postacie nadaj ące się do innych sposobów podawania obejmują postacie do podawania doustnego i czopki. W leczeniu można stosować dawki pojedyncze lub wielokrotne. Szczepionkę można podawać w połączeniu z innymi czynnikami immunoreguluj ący mi.

175 610

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek.

Przykład I. (Klonowanie i ekspresja) (A) Wektoryskonstruowano z plozmidówzawiezających część c’ genomu HCV Hedług opisów patentowych Europejskiego Urzędu Patentowego nr nr EP 318 216 i EP 388 232. Kasetka HCV/S/B zawiera fragment DNA StuI-8glII kodujący koniec 5’ poliproteiny od Met1 do Luu906, rozpoczynający się nukleotydec -63 w stosunku do Metr Fragment ten obejmuje białko rdzeniowe (C), białko E1 (czasami określane JóSo S), białko E2 (również określane JóSo NS1) oraz część 5 ’ regionu NS2a. Po ekspresji tej konstrukcji, poszczególne białka C, E1 i e2 powstają na drodze procesowania proteolitycznego.

Kasetka HCV (A/B) zawiera fragment DNA ApaLI-BglII kodujący koniec 5’ poliproteiny od Met1 do Luu906, rozpoczynający się nukleotydem -6 w stosunku do Met. Fragment ten obejmuje białko rdzeniowe (C), białko E1 (czasami określane JóSo S), białko E2 (również określane jako NS1) oraz część 5’ regionu NS2ó. Po ekspresji tej konstrukcji, poszczególne biółkó C, E1 i E2 powstają na drodze procesowania proteolitycznego.

Kasetka C-E1 (S/B) (fragment StuI-BócHI) zawiera koniec 5’ od Met1 do Ile340 (miejsce BócHI w genie). W wyniku ekspresji tej kasetki powstaje białko C i nieco skrócone E1 (E1’). Część skrócona od końcó 3’ stanowi region hydrofobowy, o którym uważa się, że służy jako sygnał translokacji.

Kasetka NS1 (B/B) (frógment BamHI-BglII) zawiera małą część 3’ białka E1 (od Met364), całość białka E2 oróz część NS2a (od Luu906). W tej konstrukcji fragment E1 służy jako sygnał translokacji.

W kasetce TPA-NS1 jako sygnał translokacji wykorzystuje się lidera ludzkiego aktywatora plózcinogenu tkankowego (tPA), zamióst fragmentu 3’ białka E1. Kósetka zawiera skróconą postać E2, od od Gly406 do od Glu661, w której wydeletowano hydrofobowy koniec 3’.

Dokonano innercji każdej kasetki od wektora pGEM3Z (Promega) z i bez niekodującego końca 5’ syntetycznej sekwencji Θ-globiny w celu transkrypcji i translacji przy użyciu ekspresji in vitro T7 w króliczych retykulocytach. Wektory w postaci rekombinowanych wirusów krowianki wytworzono przez insercję kasetek do plazmidu pSC11 (otrzymanego od Dr B. Moss’a, NTH) i rekombinację z wirusem ltrowianki, JóS opisali Córkrabarty i wsp., Mol. Cell. Biol. (1985), 5: 3403 - 09.

(B) Alternatywny wektor ekspresyjny skonstruowano przez insercję HCV (A/B) pomiędzy miejscami StuI i SpeI plazmidu pSC59 (otrzymanego od Dr B. Moss’a, NIH) i rekombinację z wirusem Srowianki, jók opisali Charkrabarty i wsp., Mol. Cell. Biol. (1985), 5: 3403 - 09.

(C) Komórki HeLó S3 zebrano przez odwirowanie z prędkością 2000 obrotów/minutę, w ciągu 7 minut, w temperaturze pokojowej, w sterylnych butelkach do wirowónia o pojemności 500 ml (JA-10 rotor). Osad zawieszono ponownie w dodatkowej pożywce hodowlanej (pożywka Spinner’ó MEM zmodyfikowana przez. JokliUa - 5% surowica końska i Gentamycyna) (spinner medium) do końcowego stężenia wynoszącego 2 x 10⁷ SomóreS/ml. Dodano surowy szczep muzeólny vv/S059-HCV poddóny dziółaniu ultradźwięków w dawce infekcyjnej wynoszącej 8 jednostek łysinkowych wirusa/komórkę (pfu/kocórkę) i mieszaninę wytrząsano w ciągu 30 minut w temperaturze 73°C. Następnie zakażone komórki przeniesiono do kolby do wirowania zówierójącej 8 litrów pożywki spinner medium i inkubowano w ciągu 3 dni w temperaturze 37°C.

Nóstępnie wyhodowane komórki zebrano przez odwirowanie, a osad zawieszono ponownie w buforze (10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 152 ml). Następnie komórki poddano homogenizacji w urządzeniu Dounce Homogenizer o pojemności 40 ml (50 uderzeń) i jądra komórkowe przeprowadzono w postać peletek przez odwirowanie (5 minut, 1600 obrotów/minutę), 4°C, wirnik JA-20). Osad jądrowy zawieszono ponownie w buforze Tris (24 d), poddano ponownie homogenizacji, wytworzono osad, zbierając wszystkie supernatanty.

Zebrany lizat podzielono na próbki o objętości 10 ml i poddano działaniu ultradźwięków 3 razy po 30 minut w sonifikatorze stosując średnią moc. Lizat poddany dziółaniu ultradźwięków (15 ml) wylóno na 17 ml podłoża sachórozowego (36%) tworząc wórstwę w probówkach do wirowónia SW28 i wirowóno z szybkością 135^000 obrotów/minutę w ciągu 80 minut w temperaturze 4°C uzyskując osad wirusa. Osad wirusa zawieszono ponownie w 1 ml buforu Tris (1 cM Tris-HCl, pH 9,0) i zamrożono w temperaturze -80°C.

175 610

Przykład II. (Porównanie produktów wytworzonych in vitro in vivo) (A) E1 i E2 znakowane o-Met eksprymowano zarówno in vitro jak i in vivo przy użyciu wektorów opisanych w powyższym przykładzie I. Komórki BSC-40 i HeLa zakażono wektorami rVV w celu uzyskania ekspresji in vivo. Zarówno pożywkę jak i lizaty komórek badano pod kątem rekombinowanych białek. Stosowano immunoprecypitację produktów przy użyciu ludzkiej surowicy odpornościowej HCV, a proteiny powstałe in vitro analizowano bezpośrednio. Otrzymane proteiny analizowano· metodą SDS-PAGE.

Układ ekspresyjny w postaci nciiki^ili^^.cytów (pGEM3Z z HCV /S/B/ lub z HCV /A/B/) wytwarzał proteiny C, E1 i E2 o masach cząsteczkowych wynoszących w przybliżeniu 18 kDa, 35 kDa i 72 kDa, odpowiednio. W lizatach komórek BSC-40 i HeLa stransfekowanych wektorem rVV zawierającym HCV /S/B/, HCV /A/B/ lub C-E1 /S/B/ znaleziono te same proteiny. Z uwagi na to, że retikulocyty nie zapewniają sprawnego procesowania w układzie Golgi’ego, a zatem nie dostarczają kwasu sialowego, fakt, że produkty wytworzone zarówno in vivo jak i in vitro wykazywały identyczne ruchliwości sugeruje, że białka nie ulegają sialacji in vivo. ZewnątrzkoHórkową sekrecję białka E2 o innej ruchliwości, odpowiadającej sialacji, uzyskano jedynie w przypadku wektora rVV zawierającego TPA-NS1.

(B) Spowodowano ekspresję HCV (S/B) in vitro i inkubowano z biotymylowanymi lektykami: GNA, SNA, PNA, wGa i ConA. Po inkubacji, kompleksy zebrano na perełkach avidyno-akrylowych, przemyto, eluowano buforem Laemmli’ego i analizowano metodą SDS-PAGE. Wyniki wykazały, że E1 i E2 związały się z GNA i ConA, co wskazuje na obecność mannozy. GNA wiąże się z końcowymi grupami mannozowymi, a ConA wiąże się z każdą grupą mannozową przyłączoną w pozycji I. Brak wiązania z SNA, PNA i WGA wskazuje na to, że żadne z '-n-dek nie zawierało kwasu sialowego, N-acetylogalaktozaminy ani N-acetyloglukozaniny.

(C) Białka E1 i E2 znakowane radiologicznie wytworzono w komórkach BSC-40 przez zakażenie ich rVV zawierającym HCV/S/B/vv SC11-HCV/ i dokonano immunoprecypitacji ludzką surowicą odpornościową HCV+. Połowę tale wtrąconej substancji traktowano w ciągu nocy neuraminidazą w celu usunięcia kwasu sialowego. Po tej obróbce, białka poddane i nie poddane działaniu neuraminidazy analizowano metodą SDS-PAGE. Nie zaobserwowano żadnych znaczących różnic w ruchllwości białek, co wskazuje na brak sinlncji in vivo.

(D) Białka E1 i E2 znakowane radiologicznie wytworzono w komórkach BSC-40 przez zakażenie ich rVV zawierającym HCV /A/B/vv/SC59-HCV/ i albo dokonano imnunoprecypitacji ludzką surowicą HCV+, albo wytrącono przy użyciu biotynylowanej lektyny GNA przyłączonej do akrylowych perełek, stosując jako kontrolę vv/SC11 bez HCV. Precypitaty analizowano metodą SDS-PAGE. Wyniki dowodzą, że E1 i E2 stanowiły główne białka z przyłączoną na końcu mannozą w komórkach zakażonych vv/SC59-HCV. GNA była tak samo skuteczna jak ludzka antysurowica w wytrącaniu E1 i E2 z pożywki hodowlanej. Zaobserwowano obecność składnika o masie 25 kDa, lecz wydaje się, że jest to specyficzny składnik komórek zakażonych krowianką.

Przykład HI. (Stosowanie lektyny do oczyszczania) (A) KomórldHeLa S3mok3lowano oczyszczonym szcmpsm meznalnym vn/SC 55-HCV o wysokim mianie, dawką infekcyjną wynoszącą 5 pfu/komórkę i mieszaninę mieszano w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C. Następnie zakażone komórki przeniesiono do kolby do wirowania zawierającej 8 l pożywki spinner medium i inkubowano w ciągu 3 dni w temperaturze 37°C. Komórki zebrano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w buforze hipotonicznym (20 hM HEPES, 10 hM NaCl, 1 mM MgCh, 120 ml) na lodzie. Następnie komórki poddano homogenizacji w urządzeniu Dounce Homogenizer (50 uderzeń) i jądra komórkowe przeprowadzono do osadu przez odwirowanie (5 minut, 1600 obrotów/minutę, 4°C, rotor JA-20). Osad zebrano, zawieszono ponownie w 48 nl buforu hiρotoyiczyego, ponownie poddano homogenizacji, ponownie odwirowano, zebrano i zamrożono w temperaturze -80°C.

Następnie zamrożone supe^atanty rozmrożono, a Hikrosonalną frakcję błony lizatu po-jądrowego wyizolowano przez odwirowanie w ciągu 20 minut z szybkością 13500 obrotów/ninutę, w temperaturze 4°C, przy użyciu rotora JA-20. kupematnyt usunięto przez zasysanie.

Następnie osad roztworzono w 96 ml buforu z detergentem (20 mM Tris-HCl,

100 mM NaCl, 1 hM EDTA, 1 mM DDT. 0,5% Triton Χ-100, pH 7,5) i poddano homogenizacji

175 610 (50 uderzeń). Produkt sklarowano przez odwirowanie w ciągu 20 minut, z szybkością 13500 obrotów/minutę w temperaturze 4°C i zebrano supernatanty.

Kolumnę z GNA-agarozą (1 cm x 3 cm, 3 mg GNA/ml perełek, objętość wypełnienia 6 ml, Vector Labs, Burlingame, CA) zrównoważono wstępnie buforem z detergentem. Próbkę supernatantu naniesiono na kolumnę z zaworem, z szybkością przepływu wynoszącą 1 ml/minutę, w ciągu 16-20 godzin, w temperaturze 4°C. Następnie kolumnę przemyto buforem z detergentem.

Oczyszczone białka E1/E2 eluowano za pomocą I-D-mannozydu (0,9 M w buforze z detergentem) z szybkością przepływu wynoszącą 0,5 ml/minutę. Eluowanie zatrzymano w momencie, gdy E1/E2 pojawiły się w eluacie i kolumnę ponownie zrównoważono w ciągu

2-3 godzin. Frakcje analizowano metodą blottingu Western i barwienia srebrem. Frakcje pików zebrano i naświetlano UV w celu inaktywacji jakichkolwiek pozostałości wirusa krowianki.

(B) Asiałoglikoproteiny E1 i E2 oczyszczone na GNA-agarozie poddano sedymentacji w gradientach 20 - 60% glicerolu. Gradienty zmieniano skokowo, a białka analizowano metodą SDS-PAGE i blottingu Western. W celu identyfikacji E1 i E2 bioty (bibuły) badano za pomocą GNA. Wyniki wskazują na obecność heterodimeru E1:E2, który sedymentuje przy spodziewanej szybkości (to znaczy, w miejscu charaktery stycznym dla białka o masie 110 kDa). Widoczne są również większe agregaty białek otoczki HCV. Widoczne są też homodimery E2:E2. E2 wydawało się występować w nadmiarze w stosunku do E1 w większych cząstkach, chociaż wykryto również mało widoczne cząstki E1:E2. Większe agregaty sedymentowały znacznie szybciej niż marker w postaci tyroglobuliny.

(C) E1 i E2 oczyszczone na GNA-agarozie poddano sedymentacji w gradientach 20 - 60% glicerolu zawierającego 1 mM EDTA. Frakcje analizowano metodą SDS-PAGE z θ-merkaptoetanolem albo bez θ-merkaptoetanolu (θΜΒ). Obserwowano małe różnice lub nie obserwowano żadnych różnic w widocznej ilości E1 i E2 w obecności θME lub pod nieobecność θME, co wskazuje na brak wiązań disiarczkowych pomiędzy heterodimerami.

(D) Kompleksy E1/E2 (o czystości wynoszącej około 40%) analizowano w urządzeniu do badania cząstek o wielkości mniejszej niż mikron DM-4. Wykryto substancje o wielkości w zakresie 20 - 60 nm.

(E) Kompleksy E1/E2 (o czystości wynoszącej około 40%) analizowano pod mikroskopem elektronowym stosując barwienie negatywowe kwasem fosforowowOlframowym. Obraz w mikroskopie elektronowym ujawnił obecność cząstek o kształcie kulistym o średnicy wynoszącej około 40 nm. Kompleksy E1/E2 inkubowano z ludzką surowicą odpornościową HCV+, a następnie analizowano pod mikroskopem elektronowym stosując barwienie negatywne. Obserwowano kompleksy przeciwciał z dużymi agregatami i z mniejszymi cząstkami.

Przykład IV. Oczyszczanie chromatograficzne (A) Substancję wytworzoną jak opisano w przykładzie III (0,5 - 0,8 ml) oczyszczoną za pomocą lektyny gNa rozcieńczono 10-krotnie buforem A (20 mM buforu Tris-Cl; 1 mM EDTA, pH 8,0) i naniesiono na kolumnę o wymiarach 1,8 x 1,5 cm Fractogel EMD DEAE-650 (EM Separations, Gibbstown, New Jersey, nr katalogowy 16883), zrównoważoną buforem A. Frakcję białkową zawierającą E1/E2 eluowano tym samym buforem z szybkością przepływu wynoszącą 0,2 ml/minutę i zebrano 1 ml frakcji. Frakcje zawierające E1 i E2 (oznaczono metodą SDS-PAGE) zebrano i przechowywano w temperaturze -80°C.

(B) Oczyszczona substancja z części (A) powyżej ma czystość 60 - 80%, co oznaczono metodą SDS-PAGE. Identyfikację przypuszczalnych pasm E1 i E2 potwierdzono analizując N-końcową sekwencję po zastosowaniu techniki przenoszenia. W tym celu, substancję E1/E2 oczyszczoną na kolumnie fractogel-DEAE zredukowano przez dodanie buforu Laemmli’ego (pH 6,8; 0,06 M Tris-Cl; 2,3% SDS, 10% glicerol, 0,72 M θ-merkaptoetanol) i gotowano w ciągu 3 minut. Następnie próbkę naniesiono na 10% żel poliakryloamidowy. Po analizie metodą SDS-PAGE, białko przeniesiono na 0,2 Tm błonę z polidwufluorku winylidenu (PVDF) (BioRad Laboratories, Richmond, CA). Odpowiednie przepuszczalne pasma białek E1 i E2 wycięto z błony i poddano analizie N-końcowych aminokwasów, aczkolwiek nie zwracano specjalnej uwagi na zapobieganie blokowania aminokońców podczas przygotowywania. Pierwsze 15 cykli wykazało, że próbka E1 ma sekwencję: Tyr-Ghl-Val-Atg-X-Ser-Thr-Gly-X-Tyt-His-Val-XAsn-Asp, a próbka E2 ma sekwencję: Thr-His-Yal-Thr-Gty-N-N-Ala-Gly-His^-yal^-Gly-Phe.

17ί5610

Te sekwencje aminokwasowe są zgodne z tymi, których spodziewano się na podstawie odpowiadających im sekwencji DNA.

Uważa się, że produkt E1/E2 oczyszczony chromatograficznie jak opisano wyżej na kolumnie fractogel-DEAEjest agregatem, czego dowodzi fakt, że duża ilość E1i E2 eluuje razem w obszarze wolnej objętości kolumny do chromatografii żelowopermeacyjnej Bio-Sil TSK4000SW. Dowodzi to, że w natywnych warunkach znaczna ilość kompleksu E1/E2 ma masę cząsteczkową wynoszącą co najmniej 800 000. Obserwowano także E1/E2 o masie cząsteczkowej wynoszącej około 650 000.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 4,00 zł

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania proteiny wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) nadającej się do stosowania w szczepionce lub w próbie immunologicznej, obejmujący hodowanie komórki gospodarza stransformowanej genem strukturalnym kodującym proteinę HCV w odpowiedniej pożywce hodowlanej, doprowadzenie do ekspresji tego' genu strukturalnego i izolowanie tej proteiny HCV z hodowli komórkowej, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania proteiny HCV pr^ot<einę tą stanowi asialoglikoproteina będąca wynikiem ekspresji regionu E1 genomu HCV, asialoglikoproteina będąca wynikiem ekspresji regionu E2 genomu HCV i ich agregaty, przy czym ekspresję prowadzi się w warunkach hamujących sjalację a izolację prowadzi się, kontrolując hodowlę komórkową z białkiem wiążącym mannozę, specyficznym dla glikoprotein z przyłączoną na końcu mannozą.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się komórki pochodzenia ssaczego.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że warunki hamujące sialację obejmują obecność wystarczających ilości modulatora wapnia do spowodowania uwalniania białek w retikulum endoplazmatycznym.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że warunki hamujące sjalację obejmują ekspresję asialoglikoprotein na poziomie wystarczającym do hamowania transportu glikoprotein z retikulum endoplazmatycznego do aparatu Golgiego.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako białko wiążące mannozę stosuje się lektynę wybraną z ConA i GNA.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że białko wiążące mannozę jest unieruchomione na podłożu.
7. 7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako modulator wapnia stosuje się modulator wybrany z grupy zawierającej thapsigargin albo EGTA (kwas etylenoglikolo-bis[eter beta-aminoetylowy]N, N, N’,N’-tetraoctowy).
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresję asialoglikoproteiny prowadzi się z regionu E1 HCV.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresję asialoglikoproteiny prowadzi się z regionu E2 HCV.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że asialoglikoproteinę stanowi agregat E1/E2.
11. 11. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że kontaktowanie prowadzi się, inkubując hodowlę komórkową zawierającą asialoglikoproteinę HCV w kolumnie zawierającej unieruchomioną na podłożu lektynę wiążącą mannozę, w ciągu co najmniej 1 godziny i izoluje się tą związaną część asialoglikopreteioy przez eluowanie mannozą.