ES2315434T3 - Procedimiento para la deteccion temprana de la seroconversion de un anticuerpo contra el virus de la hepatitis c. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la detección temprana de la seroconversión en la detección de un anticuerpo dirigido contra el virus de la hepatitis C en un líquido de muestra, en donde el líquido de muestra se incuba por lo menos con un polipéptido, el cual contiene la secuencia del virus de la hepatitis C, en particular de la región NS3 del virus de la hepatitis C, y el anticuerpo se detecta mediante una unión con el polipéptido, caracterizado porque se emplea un polipéptido de una región, la cual contiene por lo menos un radical cisteína, y la determinación del anticuerpo se efectúa en condiciones reductoras.
Description
Procedimiento para la detección temprana de la
seroconversion de un anticuerpo contra el virus de la hepatitis
C.
La invención se refiere a un procedimiento para
la detección temprana de la seroconversión de un anticuerpo
dirigido contra el virus de la hepatitis C (HCV), en un líquido de
muestra.
La enfermedad designada con el nombre de
hepatitis "no A - no B" está provocada en muchos casos por el
virus de la hepatitis C. (HCV). En el caso del HCV se trata de un
virus de ARN encapsulado monocatenario, cuyo genoma se compone
aproximadamente de 9 a 10.000 bases. A partir de este genoma se
codifican proteínas estructurales (proteínas del núcleo y de la
envoltura) así como proteínas no estructurales. La región 3 de
proteínas no estructurales (NS3) del HCV contiene una proteasa y una
helicasa. La actividad proteasa está localizada en el tercio amino
terminal de la región NS3.
En la solicitud de patente europea
EP-A-0 318 216 se da a conocer una
secuencia parcial de nucleótidos del HCV. Se reivindica el empleo
de fragmentos de ácidos nucleicos o partes de polipéptidos del HCV
para la comprobación del diagnóstico así como para el tratamiento
terapéutico.
La patente
EP-A-0 450 931 da a conocer la
secuencia completa de nucleótidos y aminoácidos del HCV. Además se
describe una combinación de antígenos sintéticos del HCV, los cuales
comprenden un primer antígeno del HCV a partir del dominio C, y por
lo menos otro antígeno del HCV a partir de uno de los dominios no
estructurales NS3, NS4 ó NS5 y del dominio S de la envoltura. Un
antígeno preferido del dominio NS3 es un antígeno denominado C33c,
el cual comprende los aminoácidos 1192 a 1457 del genoma del HCV
representado en la figura 1 de la patente
EP-A-0 450 931.
La solicitud de patente internacional WO
92/11370 se refiere a la clonación y secuenciación de diferentes
polipéptidos a partir del genoma del HCV, y al empleo de estos
polipéptidos sin ningún componente de proteínas extrañas en kits de
ensayo, y como vacuna. Un clon NS-3, en conexión con
esta solicitud, depositado en la Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124
Braunschweig, BRD (DSM) con el número 6847, contiene la información
genética para un polipéptido de 527 aminoácidos de la región NS3
del HCV.
Mori et al. (Jpn. J. Cancer Res. 83
(1992), 264, 268) describen la comprobación del diagnóstico de una
infección por HCV, mediante la determinación del anticuerpo vírico
en sangre mediante el empleo de proteínas víricas como antígenos.
Estas proteínas del HCV se expresan como proteínas de fusión con
\beta-galactosidasa, en E. colil. A partir
de la región NS3, una proteína, la cual contiene los aminoácidos
1295 a 1541 del genoma del HCV, muestra la más alta sensibilidad.
Sin embargo es desventajoso para este tipo de proteínas de fusión,
que puedan tener lugar reacciones cruzadas con el componente de
proteínas ya fusionadas, las cuales disminuyen la especificidad de
la reacción de detección.
La patente JP 06074956 da a conocer un reactivo
para la determinación de anticuerpos contra el virus de la
hepatitis C (HCV) los cuales detectan específicamente un antígeno
del HCV, y en particular un antígeno de la región NS3 del virus
HCV. El reactivo contiene un reductor, como por ejemplo, el
ditiotreitol, ditioeritritol y/o ácido tioglicólico. El empleo de
este reactivo permite la exacta determinación del antígeno con una
muy alta sensibilidad.
Mediante la detección del HCV en sangre, se
logra una alta especificidad y sensibilidad del ensayo. Además, el
antígeno empleado para el ensayo debe poderse expresar con un alto
rendimiento y ser estable. Hasta el momento los antígenos conocidos
del genoma del HCV presentan el inconveniente de que no cumplen una
o varias de las exigencias anteriores.
Uno de los objetivos en que se fundamenta la
presente invención consiste por lo tanto en la puesta a punto de un
polipéptido del genoma del HCV para un procedimiento para la
detección temprana de la seroconversión de un anticuerpo dirigido
contra el virus de la hepatitis C, en el cual estas desventajas del
estado actual de la técnica estén solventadas, por lo menos
parcialmente, y que en particular en comparación con los antígenos
conocidos posea una especificidad y sensibilidad mayores así como
que pueda expresarse con un alto rendimiento y sea estable.
Este objetivo se consigue mediante un
polipéptido el cual contiene la región de la secuencia del virus de
la hepatitis C, en particular, la región NS3.
Objetivo de la presente solicitud es por lo
tanto un procedimiento para la detección temprana de la
seroconversión en la detección de un anticuerpo dirigido contra el
virus de la hepatitis C, en un líquido de muestra, en donde el
líquido de muestra se incuba por lo menos con un polipéptido, el
cual contiene la región de la secuencia del virus de la hepatitis
C, en particular de la región NS3 del virus de la hepatitis C, y
detecta el anticuerpo mediante una unión con el polipéptido,
empleando un polipéptido de una región la cual por lo menos contiene
un radical de cisteína, y se efectúa la determinación del
anticuerpo en condiciones reductoras.
Eventualmente puede también modificarse
covalentemente uno o varios radicales cisteína, o/y substituirse uno
o varios radicales cisteína por otros aminoácidos.
Al contrario de otras regiones antígenas del
HCV, la región NS3 contiene una acumulación particularmente grande
de radicales cisteína. Aunque en el transcurso de la multiplicación
de los virus la proteína NS3 sintetizada intracelularmente es
estable, se demuestra que el empleo de los antígenos NS3 en las
condiciones fisiológicas del tampón, por ejemplo en procedimientos
de ensayos inmunológicos, es extremadamente problemático puesto que
en estas condiciones los grupos sulfhidrilo libres del radical
cisteína se oxidan fácilmente. Esto conduce a lesiones tanto intra-
como también intermoleculares del antígeno, por lo cual su
reactividad inmunológica queda claramente disminuida.
Mediante un formato de ensayo en el cual están
presentes uno o varios antígenos NS3 en condiciones suavemente
reductoras, por ejemplo mediante la adición de un reactivo
sulfhidrilo, pudo mejorarse sorprendentemente la reactividad
inmunológica de estos antígenos NS3. De esta manera se logra tanto
una detección temprana de la seroconversión como también un claro
reforzamiento de la señal de medición.
Un polipéptido empleado de preferencia en el
procedimiento según la invención es por ejemplo un polipéptido que
consta de los aminoácidos 1207 \pm 10 hasta 1488 \pm 10 de un
virus de la hepatitis C y menos de 20, de preferencia menos de 15,
aminoácidos extraños. De preferencia el polipéptido contiene los
aminoácidos 1207 \pm 5 hasta 1488 \pm 5, con particular
preferencia 1207 \pm 2 hasta 1488 \pm 2, y con la mayor
preferencia, de 1207 hasta 1488 de un virus de la hepatitis C, en
donde la numeración de los radicales aminoácidos se refiere a la
figura 1 de la patente EP-A-0 450
931.
El polipéptido empleado en el procedimiento
según la invención puede proceder de un aislado de HCV cualquiera,
por ejemplo de un aislado de HCV con una secuencia de nucleótidos
como se describe en la patente
EP-A-0 450 931. De preferencia sin
embargo, el polipéptido procede del aislado de HCV, del cual procede
el clon NS3 descrito en la patente WO 92/11370, el cual fue
depositado en la Colección Alemana de
Micro-organismos y Cultivos Celulares GmbH (DSM),
Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, con el número DSM 6847.
Particularmente preferido es el polipéptido empleado en el
procedimiento según la invención, que puede obtenerse mediante la
expresión recombinante del vector pUC-D26.
En la SEQ ID NO. 1 se muestra la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido empleado de preferencia en el
procedimiento según la invención. Los aminoácidos
1-13 son aminoácidos extraños. Los aminoácidos
14-295 proceden del HCV. Con particular preferencia
el polipéptido de la presente invención contiene los aminoácidos
14-295 de la secuencia de aminoácidos representada
en SEQ ID NO. 1 y 2, ó una secuencia de aminoácidos homóloga a la
misma por lo menos en un 90%.
Además, el polipéptido empleado en el
procedimiento según la invención puede ser un polipéptido como se ha
definido más arriba, el cual lleva por lo menos un grupo de
marcado. Como grupo de marcado entran en cuestión todos los grupos
de marcado conocidos, que puedan ser detectados en un sistema de
ensayo, es decir grupos de marcado detectables directa o
indirectamente. A este respecto, se entiende por grupo de marcado
directamente detectable, aquel grupo que produce directamente una
señal detectable, por ejemplo un grupo radioactivo, un grupo
enzimático, un grupo de luminiscencia, un complejo metálico, etc..
Por otra parte el grupo de marcado puede ser también un grupo
indirectamente detectable por ejemplo un grupo biotina o un grupo
hapteno, el cual es detectable mediante la reacción con un socio de
unión apropiado (estreptavidina, avidina, o respectivamente un
anticuerpo antihapteno), el cual lleva de nuevo un grupo que produce
una señal. El grupo de marcado puede copularse con el antígeno de
una manera ya conocida, por ejemplo mediante una espaciador
bifuncional. Este tipo de procedimientos para la copulación de
grupos de marcado en antígenos péptidos son ya conocidos por el
experto en el terreno de la inmunología, y no es necesario
describirlos aquí con más detalle.
El polipéptido empleado en el procedimiento
según la invención contiene de preferencia de 1 a 12 y en particular
de preferencia, de 3 a 7 grupos de marcado.
Además, el polipéptido empleado en el
procedimiento según la invención puede ser un polipéptido como se ha
definido más arriba, en el cual existen uno o varios grupos
sulfhidrilo procedentes de radicales cisteína, en forma
covalentemente modificada. Ejemplos de grupos covalentemente
modificados apropiados son la maleimidodioxaoctilamina (MADOO), la
N-metil-maleinimida (NMM), el ácido
yodoacético y la yodoacetamida. Mediante la modificación covalente
de la cisteína se logra una reactividad inmunológica específica
particularmente alta, lo cual pudo ser demostrado por ejemplo para
la modificación de NS3 y DTT.
Con particular preferencia tiene lugar la
copulación covalente de grupos de marcado directa o indirectamente
detectables, en los grupos sulfhidrilo del polipéptido. Ejemplos de
empalmes bifuncionales SH-reactivos para el
acoplamiento en grupos sulfhidrilo son la maleimidopropilamina (MP),
maleimidoetilamina (MEA) y maleimidodioxaoctilamina (MADOO).
Además, en el procedimiento según la invención,
puede preferirse emplear un polipéptido en el cual uno o varios
radicales cisteína están substituidos por otros aminoácidos
naturales o artificiales. De preferencia los radicales cisteína se
sustituyen mediante \alpha-aminoácidos
estructurales análogos, como por ejemplo la serina, o los ácidos
\alpha-amino-butíricos. Mediante
substituciones de cisteína se obtiene una estabilidad
particularmente alta. Esto puede demostrarse en particular para la
NS3 + DTT.
El polipéptido empleado de preferencia en el
procedimiento según la invención presenta frente a los polipéptidos
ya conocidos, ventajas sorprendentes. Frente al antígeno C33
descrito en la patente EP-A-0 450
931, el cual contiene los radicales aminoácidos 1192 hasta 1457 de
la secuencia de HCV, muestra este polipéptido una especificidad
claramente mayor, lo cual se muestra en un número estadísticamente
significativamente pequeño de resultados falsamente positivos en
sueros negativos. Frente al antígeno NS3 descrito en la patente WO
92/11370, el cual contiene la región de los aminoácidos 1007 hasta
1534 de la secuencia de HCV, este polipéptido muestra una
estabilidad claramente mayor en las condiciones del ensayo. Frente a
un polipéptido, el cual contiene los aminoácidos 1227 hasta 1528 de
la región NS3 del HCV, este polipéptido tiene la ventaja de una
mejor eficiencia en la expresión y una mayor sensibilidad. Debido
a estas ventajas el polipéptido empleado de preferencia en el
procedimiento según la invención, se muestra claramente superior a
todos los antígenos HCV de la región NS3 conocidos hasta el
momento.
El polipéptido empleado en el procedimiento
según la invención está codificado por un ácido nucleico. Un ejemplo
preferido de este ácido nucleico es la inserción de ADN extraño en
el vector pUC-D26.
En la SEQ ID NO. 1 se muestra también la
secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que codifica el
polipéptido empleado de preferencia en el procedimiento según la
invención, el cual codifica el polipéptido de SEQ ID NO. 1 y 2. Los
nucleótidos 40-885 codifican la región del
polipéptido que procede del HCV. El ácido nucleico que codifica el
polipéptido empleado de preferencia en el procedimiento según la
invención contiene de preferencia (a) los nucleótidos
40-885 de la secuencia de nucleótidos representada
en SEQ ID NO. 1, ó (b) una de las secuencias de (a) en el marco de
la degeneración del código genético correspondiente a la secuencia
de nucleótidos.
Además, el ácido nucleico que codifica el
polipéptido empleado de preferencia en el procedimiento según la
invención, puede estar presente en un vector, en donde dicho vector
contiene por lo menos una copia de dicho ácido nucleico. El vector
es de preferencia un vector procariótico, es decir un vector
apropiado para la propagación en una célula anfitriona
procariótica. Ejemplos de dichos vectores están representados en
Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual
("Clonación molecular. Un manual de laboratorio"), segunda
edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), en particular
en los capítulos 1 al 4 y 17. Con particular preferencia, el vector
es un plásmido circular. El ácido nucleico que codifica el
polipéptido empleado de preferencia en el procedimiento según la
invención, se encuentra en el vector de preferencia bajo el control
de una secuencia promotora, la cual permite la expresión del
polipéptido empleado de preferencia en el procedimiento según la
invención. Un ejemplo preferido de un vector de este tipo es el
pUC-D26.
Un ácido nucleico descrito más arriba o un
vector descrito más arriba puede estar presente en una célula, en
donde dicha célula se transforma por lo menos con una copia de dicho
ácido nucleico o de dicho vector. De preferencia, la célula es una
célula procariótica, con particular preferencia una célula
procariótica gram-negativa, y con la mayor
preferencia, una célula E. colil.
El polipéptido empleado en el procedimiento
según la invención, se emplea de preferencia como antígeno en un
procedimiento de ensayo inmunológico. Por otro lado puede emplearse
el polipéptido también como proteína helicasa y debido a su
sobresaliente efecto antígeno puede emplearse para la obtención de
una vacuna contra una infección por HCV.
El procedimiento según la invención sirve para
la determinación inmunológica de un anticuerpo dirigido contra el
virus de la hepatitis C en un líquido de muestra y se caracteriza
porque el líquido de muestra se incuba por lo menos con un
polipéptido según la invención, y dicho anti-cuerpo
se detecta mediante la unión con el polipéptido. Este procedimiento
inmunológico de determinación puede efectuarse mediante cualquier
formato de ensayo conocido, por ejemplo, en un inmunoensayo
homogéneo con una sola fase de reacción o en un inmunoensayo
heterogéneo con más de una fase de reacción. De preferencia, se
emplea un formato de ensayo heterogéneo, en el cual se detecta la
existencia del anticuerpo en presencia de una fase sólida
reactiva.
Una versión de este formato de ensayo es el
llamado método de ensayo puente con doble antígeno. En un
procedimiento de esta clase, se incuba el líquido de muestra con
por lo menos dos polipéptidos P_{1} y P_{2} empleados en el
procedimiento según la invención, en donde el polipéptido P_{1}
(a) está unido a una fase sólida o (b) está presente en una forma
capaz de unirse a una fase sólida, y el polipéptido P_{2} lleva un
grupo de marcado. El anticuerpo en el líquido de muestra se detecta
mediante la determinación del marcado en la fase sólida o/y en la
fase líquida, de preferencia en la fase sólida, mediante un complejo
inmovilizado, es decir unido a la fase sólida.
La realización del ensayo comprende de
preferencia la mezcla del líquido de muestra con el antígeno P_{2}
marcado purificado, así como con el antígeno P_{1} unido a la
fase sólida, purificado, para obtener un complejo inmovilizado
marcado a partir del antígeno marcado, el anticuerpo y el antígeno
unido a la fase sólida. Frente a otros formatos de ensayo para la
detección de anticuerpos, los formatos de ensayo puente conducen
tanto a una mejora de la sensibilidad es decir, se detectan clases
adicionales de inmunoglobulina como por ejemplo la IgM, como
también la especificidad, es decir, las reactividades no específicas
disminuyen con el conjugado anti-IgG.
El antígeno marcado P_{2}, lleva un grupo de
marcado detectable directa o indirectamente como se ha descrito más
arriba. El antígeno unido a la fase sólida P_{1} puede estar por
ejemplo, directamente unido a la fase sólida mediante un espaciador
bifuncional. Sin embargo, de preferencia, P_{1} es un conjugado
presente en la fase líquida, de un polipéptido utilizable en el
procedimiento según la invención y un socio de reacción de un
sistema de unión específico. El otro socio de reacción del sistema
de unión específico está presente unido a la fase sólida. Ejemplos
de dichos sistemas de unión específicos son los biotina/avidina,
biotina/estreptavidina, biotina/antibiotina, hapteno/antihapteno,
hidrato de carbono/lectina, y un anticuerpo o respectivamente un
fragmento de anticuerpo y un anticuerpo, contra este anticuerpo o
respectivamente contra el fragmento de anticuerpo. De preferencia
el antígeno P_{1} está presente en forma de un conjugado de
biotina.
El antígeno polipéptido se emplea en un ensayo
puente con doble antígeno de este tipo, de preferencia en forma
soluble para evitar aumentos del valor en vacío y una relación
señal/ruido desfavorable debida a las agregaciones del antígeno.
Para ello el antígeno se expresa o bien en sistemas de expresión
adecuados ya disuelto, o se renaturaliza después de la expresión en
forma disuelta y en vitro de manera ya conocida. Además, para
evitar la formación de agregados moléculares reticulados
covalentemente, el ensayo inmunológico puede efectuarse en
condiciones suavemente reductoras (adición de reactivos suavemente
reductores, de preferencia reactivos de sulfhidrilo, de preferencia
DTT (ditiotreitol) ó DTE (ditioeritritol) en un margen de
concentración de 1 mmol/litro hasta 25 mmoles/litro), o/y emplearse
de preferencia un antígeno modificado covalentemente en los grupos
sulfhidrilo o/y de preferencia un antígeno con radicales cisteína
por lo menos parcialmente substituidos. Una detallada descripción
del formato del ensayo en puente, se encuentra en la patente
EP-A-0 280 211. Esta publicación se
toma como referencia. Las condiciones reductoras son ante todo
esenciales para la mejor sensibilidad (detección conversa) y la
mejor estabilidad del antígeno NS3.
El polipéptido que se emplea en el procedimiento
según la inversión, puede emplearse sin embargo también en otros
formatos de ensayo. Un ejemplo de ello es un inmunoensayo indirecto
para la detección de una inmunoglobulina especifica mediante la
unión a un antígeno específico de unión, y la detección indirecta
mediante un conjugado con un segundo anticuerpo. En esta versión
del procedimiento según la invención se incuba el líquido de muestra
con un polipéptido P_{1}, el cual (a) está unido a una fase
sólida, ó (b) está presente en una forma capaz de unirse a una fase
sólida, y con otro anticuerpo dirigido contra P_{1}, el cual lleva
un grupo de marcado. El anticuerpo que hay que determinar se
detecta indirectamente por determinación del marcado en la fase
sólida o/y en la fase líquida, de preferencia en la fase sólida. En
este procedimiento, la señal producida en la fase sólida por un
complejo inmovilizado del anticuerpo marcado y del antígeno unido a
la fase sólida, es indirectamente proporcional a la concentración
de los anticuerpos que hay que determinar en el líquido de
muestra.
El polipéptido empleado en el procedimiento
según la invención puede estar presente en un reactivo para la
determinación inmunológica de un anticuerpo dirigido contra el virus
de la hepatitis C, en donde el reactivo contiene por lo menos un
polipéptido empleable en el procedimiento según la invención. Si se
emplea el reactivo en un ensayo puente con doble antígeno, entonces
contiene de preferencia por lo menos dos polipéptidos P_{1} y
P_{2}, en donde el polipéptido P_{1} (a) está unido a una fase
sólida, ó (b) está presente en una forma capaz de unirse a una fase
sólida, y el polipéptido P_{2} lleva un grupo de marcado. La unión
del polipéptido P_{1} en la fase sólida puede tener lugar o bien
mediante una unión directa o bien mediante un par de unión
específico, de preferencia estreptavidina/avidina y biotina. Con
particular preferencia el polipéptido P_{1} está presente en
forma biotinilada.
El reactivo que se emplea en un ensayo
inmunológico indirecto contiene de preferencia un polipéptido
P_{1}, el cual (a) está unido a una fase sólida, ó (b) está
presente en una forma capaz de unirse a una fase sólida, y un
anticuerpo dirigido contra el P_{1}, el cual lleva un grupo de
marcado. La obtención de los anticuerpos dirigidos contra el
polipéptido empleado tiene lugar de manera ya conocida mediante la
inmunización de animales de ensayo con el correspondiente antígeno
y obtención de los antisueros policlonales del animal de ensayo.
Alternativamente, se puede obtener según el procedimiento de Köhler
y Milstein, o bien según otro desarrollo de este procedimiento, un
anticuerpo monoclonal contra el antígeno. En lugar de un anticuerpo
completo pueden emplearse también fragmentos de anticuerpo o
derivados de anticuerpo.
Otro campo de aplicación del polipéptido
empleado en el procedimiento según la invención, es por ejemplo la
obtención de vacunas. Para ello se obtienen los polipéptidos de
preferencia en forma purificada y a continuación se preparan en
forma de líquidos inyectables, los cuales pueden tratarse o bien de
soluciones o bien de suspensiones del polipéptido. Los polipéptidos
pueden estar también ocluidos en liposomas. Otros componentes de las
vacunas son por ejemplo, el agua, soluciones salinas, glucosa o
glicerina. Además, las vacunas contienen pequeñas cantidades de
sustancias auxiliares, como emulsionantes, substancias tampón,
eventualmente adyuvantes, los cuales potencian la respuesta
inmunológica. Las vacunas se aplican habitualmente parenteralmente
mediante inyección, de preferencia subcutánea o intramuscular.
Además, la presente invención se describe
mediante los siguientes ejemplos y protocolos de secuencias.
Se muestran:
SEQ ID NO. 1: secuencia de nucleótidos de un
polipéptido empleado de preferencia en el procedimiento según la
invención, codificada por un ácido nucleico,
SEQ ID NO. 2: secuencia de aminoácidos de un
polipéptido empleado de preferencia en el procedimiento según la
invención,
SEQ ID NO. 3: secuencia de nucleótidos del
cebador (1),
SEQ ID NO. 4: secuencia de nucleótidos del
cebador (2),
SEQ ID NO. 5: secuencia de nucleótidos del
cebador (3),
SEQ ID NO. 6: secuencia de nucleótidos del
cebador (4),
SEQ ID NO. 7: secuencia de nucleótidos del
cebador (5), y
SEQ ID NO. 8: secuencia de nucleótidos del
cebador (6).
Ejemplo
1
Mediante una PCR se amplificó un fragmento de
ADN a partir del clon NS3 (DSM 6847) mediante el empleo de los
cebadores (1) y (2), cuyo secuencia de nucleótidos está mostrada en
SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4. En el extremo 5' de este fragmento de
ADN se encuentran secuencias para la clonación (puntos de escisión
de restricción de BamHI-, BspHI-, EcoRI) así como un codon de ATG y
un codon de AAA(Lys), para potenciar la expresión. En el
extremo 3' se encuentran los puntos de escisión de restricción para
HindIII y EcoRI así como un codon de interrupción (TTA). La región
homóloga al HCV, empieza en los cebadores (1) y (2), cada vez
mediante el nucleótido número 19.
El fragmento de ADN obtenido de esta manera se
empleó en un vector pUC8 escindido con BamHI y HindIII. El plásmido
resultante recibió el nombre de pUC-D26.
Una cepa JM 109 de E. coli transformada
con el plásmido pUC-D26
(Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103),
se incubó durante la noche en 100 ml de medio (caldo L/ampicilina).
A la mañana siguiente se diluyó el cultivo con 900 ml de caldo L 2x
(10 g de Trypton, 10 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl por
litro)/ampicilina en un matraz de 3 litros. Después de la adición
de 2 ml de glicerina y de 1 a 2 gotas de emulsión antiespuma de
silicona (firma Serva), se agitó el cultivo a aproximadamente 185
rpm y 37ºC durante 2 horas. La inducción y producción de antígeno
tuvo lugar mediante la adición de 2 mmoles/litro del inductor
isopropiltio-\beta-D-galactósido
(IPTG), agitando de nuevo durante 3 a 4 horas. A continuación se
sedimentaron las bacterias por centrifugación y siguieron
procesándose.
El sedimento de bacterias de dos cultivos de 1
litro, se resuspendió en 200 ml de Tris HCl 50 mmoles/litro, pH
8,5, 0,2 mg/ml de lisozima y 2 mmoles/litro de ditioeritritol (DTE).
A continuación se añadieron EDTA (concentración final: 15
mmoles/litros) fluoruro de fenilmetilsulfonilo (concentración final:
1 mmol/litro) y 4 mg de DNasa. La suspensión se mezcló durante
algunos minutos con un agitador magnético y a continuación se incubó
durante 45 minutos a 37ºC en un baño María.
A continuación se efectuó una adición de
Triton-X100 (concentración final: 1%) y se agitó
durante 30 minutos en un agitador magnético. Después de congelar a
-20ºC durante la noche y descongelar, se agitaron las células por
lo menos durante una hora a 37ºC y eventualmente se trataron con
ultrasonidos. La incubación a 37ºC y/o el tratamiento con
ultrasonidos se prolongaron el tiempo necesario para que la
viscosidad de la suspensión con las células lisadas, disminuyera
claramente.
A continuación se centrifugó a 35000 g y 4ºC
durante 20 minutos. El sedimento resultante se resuspendió en 30 ml
de 50 mmoles/litro de Tris-HCl, pH 8,5, 2
mmoles/litro de DTE, 150 mmoles/litro de EDTA, y 1,5% de OGP
(octil-\beta-D-glucopiranósido,
de la firma Biomol). Esta suspensión se agitó a temperatura ambiente
en el agitador magnético intensamente durante por lo menos 3 horas,
y a continuación se centrifugó a 35000 g y 4ºC durante 20
minutos.
El sedimento se disolvió en 100 ml de 8 moles/
litro de urea, 20 mmoles/litro de Tris-HCl, pH 8,5,
2 mmoles/litro de DTE, y se agitó. El antígeno disuelto se guardó
congelado a -20ºC hasta un procesado posterior.
La purificación de la proteína se efectuó
mediante el siguiente paso descrito de cromatografía, el cual se
efectuó a temperatura ambiente. El almacenamiento del antígeno entre
los pasos de cromatografía tuvo lugar cada vez a -20ºC.
El primer paso de cromatografía se efectuó con
una columna Q-sefarosa Fast Flow (Pharmacia) con un
tampón de 20 mmoles/litro de Tris-HCl, pH 8,5, 8
moles/litro de urea, 2 mmoles/litro de DTE. La elución tuvo lugar
con un gradiente de NaCl (0 a 0,7 moles/litro). El traspaso y las
fracciones se ensayaron mediante SDS-PAGE. El
polipéptido empleado en el procedimiento según la inversión estaba
contenido en el primer pico principal. Las fracciones positivas se
reunieron y se dializaron durante la noche frente a un volumen 10
veces mayor de 4 moles/litro de urea, 2 mmoles/litro de DTE, 20
mmoles/litro de Tris-HCl, pH 7,3.
Para el segundo paso de cromatografía se empleó
la misma columna. El tampón de columna fue el tampón de diálisis
empleado después del primer paso de cromatografía. La elución tuvo
lugar con un gradiente de NaCl (0 a 0,5 moles/litro) y a
continuación con 1 mol/litro de NaCl, NaOH pH 13, 4 moles/litro de
urea.
Las fracciones positivas se reunieron y se
dializaron durante la noche frente al mismo tampón de más
arriba.
Finalmente tuvo lugar una cromatografía con una
columna S-Sefarosa Fast Flow (Pharmacia). El tampón
y las condiciones de elución fueron las mismas que en el paso de
cromatografía precedente.
El antígeno presenta en el gel de
SDS-poliacrilamida, un tamaño de aproximadamente 41
kDa. El rendimiento es de aproximadamente 10 mg de antígeno por
litro de medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se expresaron los siguientes antígenos:
a) antígeno D26, empleado de preferencia
(aminoácidos 1207 a 1488)
b) antígeno C33 (aminoácidos 1192 a 1457
correspondientes a la patente EP-A-0
450 931)
c) antígeno D-27 (aminoácidos
1227 a 1528)
d) antígeno NS-3 (aminoácidos
1007 a 1534)
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión del antígeno NS-3
tuvo lugar mediante el empleo del clon depositado
NS-3 (DSM 6847). La clonación y expresión del
antígeno C33 y D27 tuvo lugar en correspondencia al método descrito
en el ejemplo 1. La región codificadora de los aminoácidos 1192 a
1457 para el C33 y los aminoácidos 1227 a 1528 para el D27, fueron
amplificados mediante una PCR a partir del plásmido pUC- N3 a partir
del clon NS-3 según los métodos estándar. Para el
C33 se emplearon los cebadores (3) y (4), cuyas secuencias de
nucleótidos vienen dadas en SEQ ID NO. 5 ó respectivamente SEQ ID
NO. 6. Para el D27 se emplearon los cebadores (5) y (6), cuyas
secuencias de nucleótidos vienen dadas en SEQ ID NO. 7 ó
respectivamente SEQ ID NO. 8. La región homóloga al HCV empieza en
los cebadores (3) y (5) con el nucleótido número 19, y en los
cebadores (4) y (6), con el nucleótido número 13.
Los fragmentos de ADN amplificados fueron
insertados, después del tratamiento con las enzimas de restricción
BamHI y HinDIII y purificación posterior mediante electroforesis con
gel de agarosa, en el vector pUC8 escindido con BamHI y HindIII.
Los dos antígenos expresados a partir de los vectores pUC, muestran
en los extremos N-terminales una región de 13
aminoácidos extraños no codificados en el HCV
(Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Ile-Met-Lys).
A continuación se transformaron los plásmido en
E. colil JM109. En los clones que contienen un fragmento de
ADN que codifica el antígeno C33, se expresa un antígeno con un peso
molecular de aproximadamente 34 kDa (SDS-PAGE). En
los clones con un fragmento de ADN, el cual codifica el antígeno
D27, se ha encontrado una banda con
48 kDa.
48 kDa.
La proporción de proteína total en el caso del
C33 es aproximadamente del 10% y es casi tan grande como en el
polipéptido D26. Para el D27 se ha encontrado una expresión
considerablemente más débil, en el margen del 5% ó menos.
Los lisados de los clones que expresan el D26,
D27, y C33, se separaron entre sí en gel de SDS, y se transfirieron
sobre nitrocelulosa. Después de la incubación durante la noche con
diferentes sueros positivos de HCV en una dilución de 1:100, tuvo
lugar una detección del anticuerpo unido mediante un conjugado de
anticuerpo IgG antihumano - peroxidasa, y reacción coloreada con
3,3'-diaminobencidin-tetracloruro
(DAB)/ peróxido de hidrógeno.
En sueros fuertemente positivos se encuentra en
todos los segmentos de antígeno HCV una buena reactividad. En el
caso de sueros NS3-HCV débilmente positivos, el
antígeno C33 muestra en comparación con el antígeno D26, en algunos
casos la misma reactividad, y en otros casos una reactividad algo
más baja. En el caso del D27 se encuentra sin embargo una reacción
coloreada claramente disminuida con los sueros NS3 débilmente
positivos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Con el método de ensayo indirecto se valoró
comparativamente la reactividad de diferentes antígenos a partir de
la región NS3, con un total de 960 sueros negativos. En esta
evaluación se encontró una especificidad claramente superior del
antígeno D26 frente al antígeno de comparación C33, lo cual se
exteriorizó en una cantidad considerablemente menor de resultados
falsamente positivos.
Además, se evaluó con el método de ensayo
indirecto la reactividad de diferentes constructos NS3 con 20 sueros
comparando con el status de HCV seguro. En el caso de la
sensibilidad de los constructos NS3 (aminoácidos 1007 hasta 1534),
C33, D26 y D27, se encontró una menor sensibilidad del antígeno
D27.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Con el método de ensayo indirecto, se evaluó
comparativamente la estabilidad de los antígenos NS3 y D26. Se
encontró una estabilidad claramente peor del antígeno NS3 respecto
al antígeno D26 empleado de preferencia en el procedimiento según
la invención. La estabilidad de los antígenos se investigó después
de 72 horas de incubación a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se ensayó el momento de la seroconversión a la
vista de la reactividad de las muestras de suero extraídas en
diferentes momentos, con antígeno
HCV-NS3-helicasa en condiciones
fisiológicas con, o respectivamente sin, 20 mmoles/ litro de DTT.
El método de ensayo fue un ensayo puente con doble antígeno para la
detección independientemente de las clases de todas las
inmunoglobulinas, en el que se empleó un antígeno provisto de un
grupo de marcado electroquímico (complejo ruteniometal), y un
antígeno capaz de unirse a la fase sólida (antígeno
biotinilado).
El resultado de este ensayo se muestra en la
siguiente tabla. Hay que hacer notar, que en presencia de 20
mmoles/litro de DTT fué posible una temprana detección de la
seroconversión, alrededor de los 38 días. Además, se encuentra, en
presencia de DTT, una señal más potente.
(1) INFORMACION GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Boehringer Mannheim GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Sandhofer Str. 112-132
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Mannheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL: 68305
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO SOLICITADO: Antígeno recombinante de la región NS3 del virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR EL COMPUTADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.25 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 885 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLECULA: cDNS
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICION EN EL GENOMA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- CROMOSOMA/SEGMENTO: NS3
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACION: 1..885
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 295 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLECULA: cDNS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGGGATCCA TCATGAAATC CCCGGTGTTC ACGGATAACT
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLECULA: cDNS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGAAGCCTT AATTCTTACC GTCGTTGAGT GCGGGAGAC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLECULA: cDNS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGGGATCCA TCATGAAAGC GGTGGACTTT ATCCCTGTG
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLECULA: cDNS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGAAGCTTT TAACACGTGT TGCAGTCTAT CAC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEC ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLECULA: cDNS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGGGATCCA TCATGAAACA CCTGCATGCT CCCACCGGC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLASE: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- CLASE DE MOLECULA: cDNS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGAAGCTTT TAATACCAAG CACAGCCTGC GTC
\hfill33
Claims (5)
1. Procedimiento para la detección temprana de
la seroconversión en la detección de un anticuerpo dirigido contra
el virus de la hepatitis C en un líquido de muestra, en donde el
líquido de muestra se incuba por lo menos con un polipéptido, el
cual contiene la secuencia del virus de la hepatitis C, en
particular de la región NS3 del virus de la hepatitis C, y el
anticuerpo se detecta mediante una unión con el polipéptido,
caracterizado porque
se emplea un polipéptido de una región, la cual
contiene por lo menos un radical cisteína, y la determinación del
anticuerpo se efectúa en condiciones reductoras.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque,
se efectúa según un inmunoensayo homogéneo con
una sola fase de reacción o según un inmunoensayo heterogéneo, con
más de una fase de reacción.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 2,
caracterizado porque,
se incuba el líquido de muestra con dos
polipéptidos P_{1} y P_{2}, en donde el polipéptido P_{1} (a)
está unido a una fase sólida, ó (b) está presente en una forma capaz
de unirse a una fase sólida, y el polipéptido P_{2} lleva un
grupo de marcado,
y el anticuerpo se detecta por determinación de
la marca en la fase sólida o/y en la fase líquida.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 al 3,
caracterizado porque,
el líquido de muestra se incuba con un
polipéptido P_{1}, el cual (a) está unido a una fase sólida, ó (b)
está presente en una forma capaz de unirse a una fase sólida, y con
otro anticuerpo dirigido contra P_{1}, el cual lleva un grupo de
marcado, y el cual detecta el anticuerpo a determinar mediante la
determinación del marcado en la fase sólida o/y en la fase
líquida.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque,
el líquido de muestra es suero humano.
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|---|---|---|---|
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