ES2316163T3

ES2316163T3 - Ensayo de union magneticamente asistida utilizando un reactivo con respuesta magnetica.

Info

Publication number: ES2316163T3
Application number: ES98921225T
Authority: ES
Inventors: Thomas E. Rohr; Tuan A. Elstrom; Lawrence V. Howard; Eric B. Shain
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1998-05-15
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2018-05-15
Also published as: JP2009204617A; JP4237267B2; ATE412898T1; JP2002504993A; ES2378782T3; US5998224A; EP0981749B1; DE69840166D1; EP1881325B1; CA2290018C; JP4806457B2; WO1998052043A1; CA2290018A1; JP4324212B2; EP0981749A1; JP2008003083A; JP2011257413A; EP1881325A1

Abstract

Un método para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de ensayo, dicho método comprendiendo las etapas de: (1) poner en contacto dicha muestra de ensayo con un reactivo de partículas en fase sólida móvil y con un reactivo magnéticamente sensible para formar una mezcla de reacción, dicho analito siendo capaz de unirse específicamente a dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil y a dicho reactivo magnéticamente sensible para formar un complejo constando de dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil, una pluralidad de dichos reactivos magnéticamente sensibles y dicho analito; (2) someter dicha mezcla de reacción a un campo magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética sobre dicho complejo si dicho complejo está presente en dicha mezcla de reacción, la influencia de dicha fuerza magnética estando manifestada por el movimiento o captura de dicho complejo a una velocidad más rápida que la de dicho reactivo magnéticamente sensible solo, o que la de dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil solo; y (3) medir directa o indirectamente el grado de dicha manifestación midiendo (i) un cambio aparente en la fuerza que actúa sobre dichos reactivos, (ii) la separación de reactivos no unidos de los complejos utilizando un dispositivo visual, (iii) la captura magnética de dicho complejo utilizando un dispositivo visual o un dispositivo óptico, en donde el reactivo magnéticamente sensible no unido y/o el reactivo de partículas en fase sólida móvil son separados del complejo por movimiento en un canal capilar, (iv) las perturbaciones de un campo magnético, (v) la variación en la densidad óptica de la mezcla de reacción, (vi) ópticamente, el cambio en la reflexividad de una superficie ópticamente reflectante sobre la que dichos complejos han sido capturados magnéticamente, (viii) un cambio en el peso aparente, (ix) un cambio en la masa aparente, (x) un movimiento, o (xi) un cambio en la cantidad de esfuerzo, para proporcionar una medida de la presencia o cantidad de dicho analito en dicha muestra de ensayo.

Description

Ensayo de unión magnéticamente asistida utilizando un reactivo con respuesta mágnetica.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método para determinar la presencia o cantidad de analito en una muestra de ensayo, utilizando materiales magnéticamente reactivos. Más concretamente, la invención tiene que ver con el empleo de materiales magnéticamente reactivos para cambiar las propiedades de componentes en ensayos de unión.

2. Discusión de la técnica

Las ensayos diagnósticos han llegado a ser un medio indispensable para detectar analitos en muestras de ensayo, utilizando la reacción mutua entre el analito y un miembro de unión específica para el analito, tal como la inmunorreacción entre un antígeno y un anticuerpo que se une a ese antígeno. Típicamente, en tales ensayos diagnósticos se emplean etiquetas o marcadores detectables unidos a anticuerpos, los cuales, a su vez, se unen al analito de interés, en donde la detección del complejo analito-anticuerpo marcado resultante, o la detección del anticuerpo marcado que no se une al analito para formar un complejo, es utilizada para indicar la presencia o cantidad de analito en la muestra de ensayo.

Dos técnicas de ensayo diagnóstico comúnmente utilizadas, que emplean miembros de unión específica, son el radioinmunoensayo (RIA) y el inmunoensayo enzimático (EIA), ambos cuales emplean un miembro de unión específica marcado. El RIA utiliza un isótopo radioactivo como etiqueta o marcador detectable unido a un miembro de unión específica. Debido a que el isótopo radiactivo puede ser detectado en cantidades muy pequeñas, puede ser utilizado para detectar o cuantificar cantidades pequeñas de analito. Sin embargo, las desventajas sustanciales asociadas con el RIA incluyen las instalaciones especiales y la extrema cautela que se requieren al manipular materiales radioactivos, el alto coste de tales reactivos, y sus especiales requerimientos de evacuación.

El EIA utiliza una enzima como etiqueta o marcador detectable unido a un miembro de unión específica, en donde se utiliza la actividad enzimática de la enzima para detectar la inmunorreacción. Mientras que el EIA no tiene alguna de las mismas desventajas del RIA, las técnicas EIA necesitan típicamente la adición de materiales sustrato para provocar la reacción enzimática detectable. Además, los sustratos enzimáticos son frecuentemente inestables y tienen que ser preparados justo antes de su uso, o ser almacenados bajo refrigeración. Además, los marcadores enzimáticos pueden ser difíciles de purificar y conjugar con miembros de unión, y pueden ser inestables durante el almacenamiento a temperatura ambiente o incluso bajo condiciones refrigeradas. Los inmunoensayos enzimáticos son también insatisfactorios porque los métodos requieren típicamente incubaciones complejas, múltiples adiciones de líquidos, y múltiples etapas de lavado.

Más recientemente, se han desarrollado técnicas de ensayo que utilizan partículas de sol metálicas como marcadores visuales. En estas técnicas, se utiliza un metal (por ejemplo, oro, plata, platino), un compuesto metálico o una sustancia no metálica recubierta con un metal o compuesto metálico, para formar una dispersión acuosa de partículas. Generalmente, el miembro de unión específica a marcar es absorbido sobre las partículas de sol metálicas, y las partículas son capturadas o agregadas en presencia de analito. Aunque las partículas de sol metálicas tienen la ventaja de producir una señal que es visualmente detectable así como medible por un instrumento, son difíciles de medir cuantitativamente. Las partículas de sol metálicas tienen también una intensidad de color limitada, y por consiguiente, una limitada sensibilidad en algunos ensayos. Además, las superficies de las partículas de sol metálicas inorgánicas, tales como oro, pueden no aceptar fácilmente la unión covalente de miembros de unión específica. De este modo, durante su uso en un ensayo de unión, se tiene que tener cuidado para que los miembros de unión específica adsorbidos no sean extraídos de las partículas inorgánicas mediante la combinación del desplazamiento por otras proteínas o agentes tensoactivos y de las fuerzas de corte que acompañan a las etapas de lavado empleadas para eliminar el material unido no específicamente. Las partículas de sol metálicas pueden ser difíciles de recubrir sin inducir agregación; pueden agregarse en el almacenamiento o pueden agregarse con la adición de tampones o sales. Además, tales marcadores particulados son difíciles de concentrar y pueden ser difíciles de dispersar.

Otros materiales para marcadores incluyen sustancias quimioluminiscentes y fluorescentes. Sin embargo, estas sustancias pueden ser inestables, y los materiales fluorescentes pueden experimentar atenuación. Como marcadores visuales, también se han utilizado partículas no metálicas, tales como partículas de látex teñidas o coloreadas.

Los dispositivos para inmunoensayos autoejecutables han demostrado ser de gran beneficio en el campo de la diagnóstica. Un dispositivo para inmunoensayos autoejecutables es un kit conteniendo inmunorreactivos al que se puede añadir primeramente una muestra biológica por el paciente o el técnico de laboratorio, después se realiza el ensayo diagnóstico sin la necesidad de complejos instrumentos de laboratorio. Los dispositivos para inmunoensayos autoejecutables disponibles comercialmente, tales como el dispositivo de ensayo por tiras teniendo la marca registrada "TESTPACK PLUS", distribuido por Abbott Laboratories, permite que los inmunoensayos sean realizados rápida y fiablemente.

Típicamente, los dispositivos para inmunoensayos autoejecutables implican tiras de ensayo cromatográficas. Por ejemplo, la Patente U.S. Nº 4.960.691 revela una tira de ensayo para análisis, de un analito en una muestra, por medio de una serie secuencial de reacciones. La tira de ensayo consta de un tramo de material cromatográfico teniendo capilaridad y de la capacidad de transporte, mediante un disolvente cromatográfico, de reactivos no inmovilizados y componentes reactivos de una muestra por medio de un disolvente cromatográfico seleccionado. La tira de ensayo incluye (1) un primer extremo en el que empieza el transporte mediante un disolvente cromatográfico, (2) un segundo extremo en el que termina el transporte median un disolvente cromatográfico, y (3) una pluralidad de zonas dispuestas entre el primer y segundo extremos. Estas zonas incluyen (1) una primera zona impregnada con un primer reactivo que es móvil en el disolvente y capaz de una reacción de unión específica con el analito, (2) una segunda zona para recibir la muestra, y (3) una tercera zona, corriente abajo de la segunda zona, impregnada con un segundo reactivo que está inmovilizado frente el transporte mediante un disolvente, y es capaz de una reacción de unión específica con el analito, para inmovilizar el analito en la tercera zona. La tira de ensayo está diseñada para que el primer reactivo pueda ser detectado en la tercera zona como medida del analito.

Una característica común de las tiras de ensayo cromatográficas implica el flujo de fluido o de una mezcla de fluido y partículas a través de una matriz porosa. La tira de ensayo incluye típicamente una zona de reacción donde pueden ocurrir reacciones de unión. Para que en las tiras de ensayo cromatográficas sucedan reacciones de unión adecuadas, el fluido o mezcla tiene que fluir sustancial y uniformemente a través de la zona de reacción.

Un problema con los dispositivos de ensayo de este tipo es la inherente variabilidad en el material de que está formada la matriz porosa. Esta variabilidad (por ejemplo, en porosidad) afecta directamente al flujo de fluido a través de la matriz, y puede afectar adversamente a la precisión del dispositivo de ensayo. Además, la matriz a menudo se unirá no específicamente a las partículas o reactivos en sitios en la zona de reacción pretendida o en otra parte, necesitando de ese modo el uso de procedimientos de pasivación complicados después de que se haya aplicado el reactivo inmovilizado. Por consiguiente, existe el deseo de desarrollar un rápido y sencillo dispositivo para ensayos autoejecutables, que no requiera que un fluido fluya a través de una matriz porosa.

Otro problema con los dispositivos para inmunoensayos autoejecutables es la necesidad de inmovilizar un reactivo de unión específica sobre la tira de ensayo, a fin de que los reactivos involucrados en el ensayo puedan ser capturados en la zona de reacción. El proceso para inmovilizar los reactivos de unión específica sobre la tira de ensayo puede ser difícil de controlar, conduciendo a variaciones lote a lote en la capacidad de unión de la zona de reacción. Además, los reactivos de unión inmovilizados pueden ser inestables, originando que la capacidad de unión de la zona de reacción cambie después del transporte o almacenamiento. Debido a que el reactivo de unión específica inmovilizado es específico para el ensayo de un analito concreto, las tiras de ensayo tienen que ser dedicadas a un ensayo concreto. Un problema adicional con los dispositivos para inmunoensayos autoejecutables es la variación lote a lote resultante de los procesos de fabricación, especialmente la variación de la actividad de los reactivos biológicos, tales como las moléculas de unión. Por ejemplo, las variaciones lote a lote en la capacidad de unión del reactivo de unión, en la zona de captura de una tira de ensayo, pueden afectar a los resultados. Aunque los ajustes en las actividades o concentraciones de los otros reactivos pueden compensar, el hacer tales ajustes supone el introducir una complejidad excesiva a los procesos de fabricación, y se necesita casar cada lote de tiras de ensayo con lotes concretos de reactivos. La capacidad de utilizar una tira de ensayo uniforme, completamente estable, en ensayos para varios analitos diferentes simplificaría sumamente la producción y control de ensayos autoejecutables basados en tiras. Alternativamente, sería ventajosa la capacidad de adaptar fácilmente una tira de ensayo durante su fabricación, para satisfacer los requerimientos de un conjunto de reactivos.

En varias aplicaciones es conveniente utilizar un ensayo autoejecutable que dé un resultado positivo por encima de una cierta concentración de analito y un resultado negativo por debajo de esa concentración, con un intervalo muy estrecho de concentraciones de transición. Con tiras de ensayo convencionales, ha sido difícil lograr este resultado.

Las micropartículas superparamagnéticas también son utilizadas ampliamente en la realización de inmunoensayos. Las micropartículas superparamagnéticas son magnéticamente reactivas porque un campo magnético aplicado originará una fuerza que actúe sobre ellas en la dirección del generador del campo magnético. Sin embargo, no retendrán ningún magnetismo residual después de que se quite el campo magnético aplicado. Típicamente, las partículas se unen a un miembro de unión específica para formar un conjugado, siendo capaz el miembro de unión específica de unirse al analito de interés. El conjugado de miembro de unión específica-partículas es dispersado en un líquido, el cual se mezcla después con la muestra para formar una mezcla de ensayo, permitiendo de ese modo que el conjugado de miembro de unión específica-partículas se una al analito, si el analito estuviese presente. El complejo de conjugado-analito es atraído después hacia una superficie sólida mediante la aplicación de un campo magnético, y se elimina el material no unido al conjugado (comúnmente conocido como separación unido/libre), como se describió en los N^{os} de Patente U.S. 4.745.077, 4.070.246 y 3.985.649. Por regla general, se necesitan etapas de lavado, adiciones de reactivos y separaciones unido/libre adicionales antes de que se produzca una señal medible. Los métodos analíticos de este tipo emplean típicamente emisión de luz (quimioluminiscencia o fluorescencia), absorción de luz después de la producción enzimática de un cromóforo, o emisión radioactiva como señal indicadora de la cantidad de analito de interés. Típicamente, la reactividad magnética de las partículas superparamagnéticas se utiliza únicamente como una ayuda en las etapas de separación unido/libre, con el resto del procedimiento de ensayo implicando reactivos y protocolos convencionales. Por consiguiente, los análisis convencionales que utilizan partículas superparamagnéticas están limitados a cualquier instrumentación automatizada compleja (por ejemplo, el ACS 180 de Ciba Corning Diagnostics) o a una serie prolongada de etapas de ensayo manuales.

El tamaño y composición de las partículas superparamagnéticas y la intensidad y gradiente del campo magnético aplicado determinarán la magnitud de la fuerza magnética ejercida sobre ellas. Cuando se aplica un campo magnético a una suspensión líquida de tales partículas, la magnitud de la fuerza ejercida en cada partícula, y la resistencia hidrodinámica de cada partícula, determinarán su velocidad de movimiento a través del líquido hacia el generador del campo magnético. Para partículas magnéticamente reactivas de composición similar, la fuerza ejercida sobre una partícula individual mediante un campo magnético aplicado, y por lo tanto su velocidad de movimiento a través del líquido, depende de su volumen, mientras que la resistencia está determinada por su área transversal. Las partículas magnéticamente reactivas más pequeñas se moverán más lentamente en un campo magnético aplicado debido a la fuerza más débil ejercida en cada partícula con respecto a su área transversal, y las partículas superparamagnéticas muy pequeñas, tales como ferrofluidos, se moverán muy lentamente debido a que la fuerza ejercida sobre ellas es comparable a la de las fuerzas aleatorias de las moléculas que las rodean. Estas fuerzas aleatorias proceden del movimiento térmico (browniano). A medida que las partículas aumentan de tamaño, su volumen aumenta más rápidamente de lo que lo hace su área transversal, con el resultado de que la fuerza magnética aumenta más rápidamente de lo que lo hace la resistencia. La reunión de varias partículas pequeñas de movimiento lento en agregados producirá que la suma de las fuerzas que actúan sobre las partículas individuales sea ejercida sobre los agregados, con el resultado de que los agregados se moverán más rápidamente a través del líquido, hacia la fuente del campo magnético, que las partículas individuales. También se pueden seleccionar la intensidad y gradiente del campo magnético aplicado para favorecer el movimiento o captura de tipos o formas concretas de reactivos magnéticamente sensibles.

La Patente U.S. Nº 5.108.933 revela un método por el que se pueden utilizar partículas coloidales magnéticamente reactivas para la separación de alguna de las diversas sustancias diana, a partir de un medio de ensayo sospechoso de contener la sustancia de interés, mediante la transformación de partículas en microaglomerados que incluyen la sustancia diana, vía manipulación de su o sus propiedades coloidales. Los aglomerados resultantes pueden ser posteriormente extraídos del medio utilizando imanes de laboratorio corrientes, ya que las partículas están compuestas de suficiente material magnético, por encima de un umbral empírico, para efectuar tal extracción. El método se lleva a cabo añadiendo al medio de ensayo partículas coloidales aglomerables y resuspendibles, las cuales son capaces de una suspensión estable en el medio de ensayo, formando un aglomerado magnético comprendiendo las partículas coloidales y cualquier sustancia diana presente en el medio de ensayo, y separando del medio los aglomerados magnéticos resultantes. Este método de análisis, sin embargo, utiliza solamente un único tipo de partícula, presentando de ese modo dificultades en la detección. La presencia o ausencia de partículas magnéticas agregadas en la proximidad del imán no está ni fácilmente ni precisamente determinada por medios visuales. Sería conveniente utilizar partículas de indicador que se pudiesen detectar fácilmente y exactamente por medios visuales.

El empleo de partículas de indicador no magnéticas está descrito por la Patente U.S. Nº 5.374.531, la cual revela el empleo simultáneo de partículas magnéticas y partículas fluorescentes no magnéticas en la cuantificación de fenotipos leucocitarios u otros analitos particulados. Las partículas magnéticas y las partículas fluorescentes no magnéticas contienen sustancias de unión que ocasionan la formación de rosetas constando de partículas magnéticas, partículas fluorescentes no magnéticas, y las células deseadas. Las rosetas son separadas de los componentes no magnéticos de la muestra de ensayo mediante la aplicación de un campo magnético, después de lo cual se puede medir el número de células por la cantidad de fluorescencia emitida los las partículas fluorescentes no magnéticas. La formación de rosetas es aplicable solamente a la detección de analitos particulados (tales como células), ya que esto acarrea unir partículas magnéticas y partículas de indicador alrededor de las células diana, las cuales células tienen que ser de un tamaño similar o mayor que las partículas magnéticas y las partículas de indicador. Las rosetas descritas en esta patente no se pueden formar con analitos de escala molecular, ya que tales analitos son mucho más pequeños que las partículas magnéticas y las partículas de indicador.

En la Patente U.S. Nº 5.145.784 se describe la agregación de partículas de indicador magnéticas y no magnéticas, en función de la presencia de analitos de escala molecular. En esta patente, las partículas magnéticas y las partículas detectables no magnéticas que tengan antígeno y/o anticuerpo pegado a sus superficies son combinadas con la muestra a analizar, anticuerpo libre si se requiere, y cualquier tampón, sal y otros reactivos necesarios. Después de la incubación durante un tiempo específico y bajo condiciones apropiadas para que se unan el antígeno y el anticuerpo específico, las partículas magnéticas se extraen mediante atracción hacia un imán. Posteriormente, se determina la presencia o ausencia y/o cantidad de partículas detectables no magnéticas, y se determina la presencia o ausencia y/o cantidad de antígeno o anticuerpo de interés en la muestra. En este proceso, la presencia de analito no es detectada observando directamente los complejos de partículas magnéticas/no magnéticas separados cerca de la ubicación del imán.

Los N^{os} de Patente U.S. 5.445.970 y 5.445.917, WO 93/19370 y WO 93/19371 describen el empleo de un material magnéticamente atraíble, como marcador detectable en ensayos de unión. El marcador magnético es sometido a un campo magnético, y el marcador, a su vez, muestra una fuerza o movimiento resultante a consecuencia de la aplicación del campo magnético. El alcance de la fuerza o movimiento es modulado por un analito que pueda estar presente en una muestra de ensayo. Debido a que la presencia o cantidad de analito en una muestra de ensayo es responsable de la magnitud de la fuerza ejercida o de la cantidad de movimiento mostrada por el material magnéticamente atraíble, el efecto del campo magnético sobre el marcador magnéticamente atraíble se puede utilizar como medida de la presencia o cantidad de analito en una muestra de ensayo. Este enfoque requiere que la presencia de un analito origine un cambio en el grado de unión del material magnéticamente atraíble a una fase sólida, de manera que el material magnéticamente atraíble unido esté impedido para moverse en el campo magnético aplicado. La aplicación de un campo magnético origina después un fraccionamiento del material magnéticamente atraíble libre y del material magnéticamente atraíble unido a la fase sólida. La medición de la fuerza ejercida sobre el material magnéticamente atraíble unido a la fase sólida, o sobre el material magnéticamente atraíble libre, refleja entonces la cantidad de analito presente en la mezcla de ensayo. Aunque los formatos de ensayo autoejecutables sean posibles utilizando este enfoque, se necesita la captura específica en algún formato de fase sólida no móvil.

La Patente U.S. Nº 5.236.824 describe un método de inmunoensayo magnético por láser, que utiliza un aparato de magnetoforesis.

Para algunas aplicaciones, un formato de ensayo que utilice únicamente fases sólidas móviles, tal como micropartículas, tendría diferentes ventajas, como las tendrían los formatos que no requieran la medición de la fuerza magnética para determinar la concentración de analito. También sería provechoso utilizar reactivos que no decanten de la suspensión. Se pueden producir partículas de látex que formen suspensiones estables, pero las partículas superparamagnéticas lo suficientemente pequeñas para formar suspensiones estables, llamadas ferrofluidos, son solamente atraídas débilmente hacia la fuente de un campo magnético y, por lo tanto, no pueden ser fácilmente capturadas magnéticamente. Los ferrofluidos son también no compatibles, en general, con las soluciones acuosas. Sería ventajoso desarrollar formatos de inmunoensayos autoejecutables que no necesiten un material cromatográfico. Sería también ventajoso desarrollar un medio para un inmunoensayo autoejecutable que pudiese ser utilizado para una multiplicidad de inmunoensayos y fácilmente adaptado a las variaciones de reactivos resultantes de los procesos de fabricación.

Sumario de la invención

La presente invención implica un método para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de ensayo. En una forma de realización, el método comprende las etapas de:

(1) poner en contacto dicha muestra de ensayo con un reactivo de partículas en fase sólida móvil y con un reactivo magnéticamente sensible para formar una mezcla de reacción, dicho analito siendo capaz de unirse específicamente a dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil y a dicho reactivo magnéticamente sensible para formar un complejo constando de dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil, una pluralidad de dichos reactivos magnéticamente sensibles y dicho analito;

(2) someter dicha mezcla de reacción a un campo magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética sobre dicho complejo si dicho complejo está presente en dicha mezcla de reacción, la influencia de dicha fuerza magnética estando manifestada por el movimiento o captura de dicho complejo a una velocidad más rápida que la de dicho reactivo magnéticamente sensible solo, o que la de dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil solo; y

(3) medir directa o indirectamente el grado de dicha manifestación midiendo (i) un cambio aparente en la fuerza que actúa sobre dichos reactivos, (ii) la separación de reactivos no unidos de los complejos utilizando un dispositivo visual, (iii) la captura magnética de dicho complejo utilizando un dispositivo visual o un dispositivo óptico, en donde el reactivo magnéticamente sensible no unido y/o el reactivo de partículas en fase sólida móvil son separados del complejo por movimiento en un canal capilar, (iv) las perturbaciones de un campo magnético, (v) la variación en la densidad óptica de la mezcla de reacción, (vi) ópticamente, el cambio en la reflexividad de una superficie ópticamente reflectante sobre la que dichos complejos han sido capturados magnéticamente, (viii) un cambio en el peso aparente, (ix) un cambio en la masa aparente, (x) un movimiento, o (xi) un cambio en la cantidad de esfuerzo, para proporcionar una medida de la presencia o cantidad de dicho analito en dicha muestra de ensayo.

En una segunda forma de realización, el método comprende las etapas de:

(1) poner en contacto dicha muestra de ensayo con un reactivo magnéticamente sensible y un reactivo de partículas en fase sólida móvil para formar una mezcla de reacción, dicho analito siendo capaz de unirse específicamente a dicho reactivo magnéticamente sensible para formar un primer complejo constando de dicho analito y de dicho reactivo magnéticamente sensible, y dicho reactivo magnéticamente sensible siendo capaz de unirse específicamente a dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil para formar un segundo complejo constando de una pluralidad de dichos reactivos magnéticamente sensibles y de dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil;

(2) someter dicha mezcla de reacción a un campo magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética sobre dichos complejos si cualquiera de dichos complejos está presente en dicha mezcla de reacción, la influencia de dicha fuerza magnética estando manifestada por el movimiento o captura de dicho segundo complejo a una velocidad más rápida que la de dicho reactivo magnéticamente sensible solo, o que la de dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil solo o dicho primer complejo; y

(3) medir directa o indirectamente el grado de dicha manifestación midiendo (i) un cambio aparente en la fuerza que actúa sobre dichos reactivos, (ii) la separación de reactivos no unidos de los complejos utilizando un dispositivo visual, (iii) la captura magnética de dicho segundo complejo utilizando un dispositivo visual o un dispositivo óptico, en donde el reactivo magnéticamente sensible no unido y/o el reactivo de partículas en fase sólida móvil son separados del complejo por movimiento en un canal capilar, (iv) las perturbaciones de un campo magnético, (v) la variación en la densidad óptica de la mezcla de reacción, (vi) ópticamente, el cambio en la reflexividad de una superficie ópticamente reflectante sobre la que dichos complejos han sido capturados magnéticamente, (viii) un cambio en el peso aparente, (ix) un cambio en la masa aparente, (x) un movimiento, o (xi) un cambio en la cantidad de esfuerzo, para proporcionar una medida de la presencia o cantidad de dicho analito en dicha muestra de ensayo.

En una alternativa de la segunda forma de realización, el método comprende las etapas de:

(1) poner en contacto dicha muestra de ensayo con un reactivo magnéticamente sensible y un reactivo de partículas en fase sólida móvil para formar una mezcla de reacción, dicho analito siendo capaz de unirse específicamente a dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil para formar un primer complejo constando de dicho analito y de dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil, y dicho reactivo magnéticamente sensible siendo capaz de unirse específicamente a dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil para formar un segundo complejo constando de una pluralidad de dichos reactivos magnéticamente sensibles y de dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil;

(3) medir directa o indirectamente el grado de dicha manifestación midiendo (i) un cambio aparente en la fuerza que actúa sobre dichos reactivos, (ii) la separación de reactivos no unidos de los complejos utilizando un dispositivo visual, (iii) la captura magnética de dicho complejo utilizando un dispositivo visual o un dispositivo óptico, en donde el reactivo magnéticamente sensible no unido y/o el reactivo de partículas en fase sólida móvil son separados del segundo complejo por movimiento en un canal capilar, (iv) las perturbaciones de un campo magnético, (v) la variación en la densidad óptica de la mezcla de reacción, (vi) ópticamente, el cambio en la reflexividad de una superficie ópticamente reflectante sobre la que dichos complejos han sido capturados magnéticamente, (viii) un cambio en el peso aparente, (ix) un cambio en la masa aparente, (x) un movimiento, o (xi) un cambio en la cantidad de esfuerzo, para proporcionar una medida de la presencia o cantidad de dicho analito en dicha muestra de ensayo.

El reactivo magnéticamente sensible consta de un miembro de unión específica unido a un material magnéticamente reactivo. El reactivo magnéticamente sensible consta, preferentemente, de un primer miembro de unión específica unido a una micropartícula superparamagnética o a un ferrofluido.

El reactivo de partículas en fase sólida móvil consta de un segundo miembro de unión específica unido a una partícula en fase sólida, tal como una micropartícula polimérica o látex.

En la primera forma de realización, comúnmente conocida como formato sándwich, el primer miembro de unión específica es seleccionado para que se una específicamente al analito, y el segundo miembro de unión específica es seleccionado para que también se una específicamente al analito, de manera que ambos miembros de unión específica se puedan unir simultáneamente al analito. En presencia del analito, o cuando la concentración de analito sea superior a un umbral especificado, el primer y segundo miembros de unión específica se unen específicamente al analito para formar una cantidad detectable de complejo comprendiendo el analito, el primer y segundo miembros de unión específica, y el reactivo magnéticamente sensible y el reactivo en fase sólida móvil a los que están unidos, respectivamente, el primer y segundo miembros de unión específica. En ausencia de analito, o cuando la concentración de analito sea inferior a un umbral especificado, la cantidad de complejo formado conteniendo ambos miembros de unión específica estará por debajo del umbral del ensayo.

En una variación de esta primera forma de realización, el reactivo en fase sólida móvil puede ser reemplazado por un reactivo magnéticamente sensible. En esta variación, en presencia de analito, o cuando la concentración de analito sea superior a un umbral especificado, el primer y segundo miembros de unión específica se unen específicamente al analito para formar una cantidad detectable de complejo comprendiendo el analito, el primer y segundo miembros de unión específica, y los reactivos magnéticamente sensibles a los que están unidos, respectivamente, el primer y segundo miembros de unión específica. En ausencia de analito, o cuando la concentración de analito sea inferior a un umbral especificado, la cantidad de complejo formado conteniendo ambos miembros de unión específica estará por debajo del umbral del ensayo.

En la segunda forma de realización, comúnmente conocida como formato competitivo, uno de los miembros de unión específica exhibe un epítopo manifestado por el analito. Uno de los miembros de unión específica es seleccionado para unirse a ese epítopo, el cual epítopo está también manifestado por el otro miembro de unión específica. En ausencia de analito, o cuando la concentración de analito sea inferior a un umbral especificado, los miembros de unión específica se unen entre sí para formar un complejo comprendiendo los miembros de unión específica y el reactivo magnéticamente sensible y el reactivo en fase sólida móvil a los que los miembros de unión específica están unidos. En presencia de analito, o cuando la concentración de analito sea superior a un umbral especificado, uno de los miembros de unión específica se une al analito, inhibiendo de ese modo la unión del mismo al otro miembro de unión específica, y evitando la formación del complejo conteniendo el reactivo magnéticamente sensible y el reactivo en fase sólida móvil.

El método de la presente invención utiliza ventajosamente la presencia de analito para modular la unión de las partículas de reactivo magnéticamente sensible a las partículas de reactivo en fase sólida móvil para formar complejos. En un campo magnético aplicado, los complejos mostrarán respuestas magnéticas que son diferentes de las respuestas magnéticas de las partículas individuales del reactivo magnéticamente sensible y de aquellas respuestas magnéticas de las partículas individuales del reactivo en fase sólida móvil. Tal formación de complejos modulada por el analito puede tener lugar entre partículas que exhiban grados muy diferentes de reactividad magnética, por ejemplo, entre partículas superparamagnéticas y diamagnéticas. Los complejos resultantes, debido a la presencia de partículas superparamagnéticas, serán atraídos hacia la fuente de un campo magnético. Las respuestas de los complejos que contengan una pluralidad de partículas paramagnéticas, superparamagnéticas, o de ferrofluidos, u otros, resultantes de la formación de complejos, pueden servir como una medida de la presencia o cantidad de un analito presente en una muestra de ensayo. El cambio en la respuesta magnética de las partículas de reactivo magnéticamente sensible y las partículas de reactivo en fase sólida móvil resultante de la formación de complejos conteniendo estas partículas se puede manifestar como una velocidad alterada del movimiento de cualquier tipo de partícula en el campo aplicado, o como una velocidad alterada de acumulación de cualquier tipo de partícula en una ubicación cerca de la fuente de un campo magnético aplicado, o como una acumulación detectable de complejos conteniendo partículas en una ubicación cerca de la fuente de un campo magnético aplicado.

El método de la presente invención emplea dispositivos para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de ensayo. Uno de tales dispositivos consta de (i) un recipiente de reacción donde el reactivo magnéticamente sensible no unido y el reactivo magnéticamente sensible unido a un reactivo en fase sólida móvil en forma de complejo son producidos en relación a la cantidad de analito en la muestra de ensayo; (ii) un generador del campo magnético para la aplicación de un campo magnético a la mezcla de ensayo; y (iii) un medio de medición para valorar la reactividad alterada del reactivo magnéticamente sensible o del reactivo en fase sólida móvil, o de ambos, como medida de la presencia o cantidad de analito en la muestra de ensayo. Los generadores de campo magnético apropiados para esta invención incluyen imanes permanentes y electroimanes. Los medios de medición preferidos para los dispositivos constan de uno o más de los elementos siguientes:

(1) un dispositivo balanza para medir el alcance de la formación de complejos, midiendo la variación en la fuerza ejercida sobre los reactivos por un campo magnético aplicado, o la variación en la fuerza ejercida sobre la fuente del campo magnético por los reactivos durante o después de la separación magnética de los complejos;

(2) un dispositivo visual para medir el alcance de la formación de complejos mediante la separación magnética de los reactivos no unidos de los reactivos en los complejos;

(3) un dispositivo visual, o un dispositivo óptico, para medir (a) el alcance de la formación de complejos mediante la captura magnética del reactivo magnéticamente sensible unido a un reactivo en fase sólida móvil y la separación de reactivo magnéticamente sensible no unido o de reactivo en fase sólida móvil, o (b) ambos reactivos por movimiento en un canal capilar;

(4) un transductor de efecto Hall, u otro dispositivo, para medir el alcance de la formación de complejos, midiendo la perturbación de un campo magnético causada por cambios en la distribución de los complejos durante o después de la separación magnética de los complejos;

(5) un dispositivo óptico para medir el alcance de la formación de complejos, midiendo la variación en la densidad óptica de la mezcla de reacción durante o después de la separación magnética de los complejos;

(6) un dispositivo óptico para medir el alcance de la formación de complejos, midiendo el cambio en la reflexividad de una superficie ópticamente reflexiva debido a la fuerza ejercida sobre ella por los complejos capturados magnéticamente durante o después de la separación magnética de los complejos.

En una forma de realización de un dispositivo para inmunoensayos autoejecutables que se puede utilizar para reemplazar un dispositivo de tira convencional para realizar inmunoensayos, los miembros de unión específica similares a aquellos fijados en la matriz porosa de un dispositivo convencional para inmunoensayos autoejecutables están fijados a partículas de material magnéticamente reactivo, por ejemplo partículas superparamagnéticas, y el reactivo magnéticamente sensible resultante está incluido en una mezcla de reactivos. Se deja que la muestra de ensayo contacte con la mezcla de reactivos para formar una mezcla de ensayo, la cual se deja que fluya a través de un canal antes que a través de una matriz porosa. La unión que normalmente ocurriría entre las partículas visibles de indicador y los miembros de unión específica unidos no difusivamente a la matriz porosa en la zona de reacción de un dispositivo convencional puede ocurrir, en lugar de eso, entre el reactivo magnéticamente sensible y el reactivo indicador diamagnético visible. La colocación de un imán en una ubicación especificada a lo largo del canal atrae al reactivo magnéticamente sensible unido al reactivo indicador diamagnético. La presencia de reactivo indicador diamagnético unido, atraído hacia el imán, puede ser detectada visualmente o mediante un dispositivo óptico, e indica la presencia o cantidad de analito en la muestra. Se debería observar que los ensayos que utilizan los principios de esta invención también pueden ser convenientemente realizados en recipientes de reacción convencionales, por ejemplo cubetas, pocillos, tubos y otros. Se debería observar además que el reactivo magnéticamente sensible puede ser visible y el reactivo diamagnético puede ser transparente, esto es, no visible, por lo que la presencia o cantidad de analito puede ser detectada visualmente o mediante un dispositivo óptico viendo solamente el reactivo magnéticamente sensible acumulado. Además, el reactivo magnéticamente sensible puede ser visible y el reactivo diamagnético puede ser visible, por lo que la presencia o cantidad de analito puede ser detectada visualmente o mediante un dispositivo óptico viendo el reactivo magnéticamente sensible y el reactivo diamagnético acumulados.

Una ventaja concreta de esta invención es la facilidad con la que se puede realizar un inmunoensayo por medio de un dispositivo portátil autónomo. El campo magnético de una cinta grabadora magnética o bandas magnéticas de las tarjetas de crédito normales es suficiente para originar la separación de complejos, conteniendo reactivo magnéticamente sensible, del reactivo en fase sólida móvil diamagnético. La presencia de estos complejos puede ser fácil y fidedignamente observada visualmente debido a la presencia del material en fase sólida diamagnético dentro de los complejos. Otra ventaja concreta de esta invención es la capacidad de crear una zona de captura magnética que hará juego con los reactivos magnéticamente sensibles y los reactivos en fase sólida móvil empleados. Se pueden definir el campo magnético y su gradiente para que proporcionen una atracción óptima del reactivo magnéticamente sensible. En ensayos autoejecutables, el sitio(s) de captura magnética se puede utilizar para proporcionar lecturas semicuantitativas por medios visuales. Se puede controlar el sitio(s) de captura magnética para proporcionar medios para compensar las variaciones lote a lote en los reactivos de ensayo. Como se dijo previamente, los reactivos utilizados en ensayos de unión convencionales son generalmente mezclas biológicas complejas, y tienden a variar de un lote a otro lote debido a los procesos de fabricación. Para formatos de ensayo sándwich, donde las partículas del reactivo magnéticamente sensible pueden ser muy pequeñas con respecto a las partículas del reactivo en fase sólida móvil, es posible controlar el comportamiento magnético del reactivo magnéticamente sensible, controlando la intensidad y el gradiente del campo magnético. También es posible controlar la captura de las partículas de reactivo en fase sólida móvil que pueden ser grandes con respecto a las partículas del reactivo magnéticamente sensible. Para capturar muy eficazmente los complejos que consten de partículas de reactivo en fase sólida móvil y de partículas de reactivo magnéticamente sensible sin capturar las partículas no unidas de reactivo magnéticamente sensible, es posible proporcionar un gradiente de campo que cambie con la distancia comparable a la dimensión de las partículas de reactivo en fase sólida móvil. Tal campo puede ser codificado, durante la fabricación, en un material magnéticamente susceptible.

Breve descripción de los dibujos

La Fig 1 es una vista esquemática de una reacción de unión específica que se utiliza en esta invención.

La Fig 2 es una vista esquemática de un aparato que utiliza una balanza para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 3 es una vista esquemática del aparato de la Fig 2 en operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 4 es una vista esquemática de un aparato que utiliza una balanza para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 5 es una vista esquemática del aparato de la Fig 4 en operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 6 es vista esquemática de un aparato que utiliza un transductor de efecto Hall para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 7 es una vista esquemática del aparato de la Fig 6 en operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 8 es una vista esquemática de un aparato que utiliza un sensor óptico para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 9 es una vista esquemática del aparato de la Fig 8 en operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 10 es una vista esquemática de un aparato que utiliza una balanza para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 11 es una vista esquemática del dispositivo de la Fig 10 en operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 12 es una vista esquemática de un aparato que utiliza una microbalanza para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 13 es una vista esquemática de una parte del aparato de la Fig 12 en operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 14A es una vista esquemática de un tipo de dispositivo para inmunoensayos autoejecutables, en operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible. La figura representa el inmunoensayo antes de que el complejo sea capturado.

La Fig 14B es una vista esquemática del dispositivo para inmunoensayos autoejecutables de la Fig 14A, en operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible. La figura representa el inmunoensayo después de que el complejo es capturado.

La Fig 15A es una vista esquemática de otro tipo de dispositivo para inmunoensayos autoejecutables para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible. La figura representa el inmunoensayo antes de que el complejo sea capturado.

La Fig 15B es una vista esquemática del dispositivo para inmunoensayos autoejecutables de la Fig 15A, en operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible. La figura representa el inmunoensayo después de que el complejo es capturado.

La Fig 16A es una vista esquemática de un dispositivo de detección de la densidad óptica, en operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible, antes de que se hayan acumulado un gran número de complejos en el fondo del recipiente de reacción.

La Fig 16B es una vista esquemática del dispositivo de la Fig 16A en operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible, después de que se hayan acumulado un gran número de complejos en el fondo del recipiente de reacción.

La Fig 17 es una vista esquemática de un aparato que utiliza una microbalanza y un dispositivo de colocación de la mezcla de ensayo, para la detección magnéticamente asistida de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 18 es un gráfico que ilustra la señal generada por el dispositivo ilustrado en la Fig 17, durante el análisis de tres muestras de micropartículas superparamagnéticas.

La Fig 19 es un gráfico que ilustra la medición de la fuerza de atracción de partículas magnéticamente reactivas, sin unir o libres, en función del tiempo.

La Fig 20A es un gráfico que ilustra la separación de ferrofluido en una columna de medio para filtración en gel "SEPHACRYL® S-500".

La Fig 20B es un gráfico que ilustra la separación de ferrofluido en una columna de medio para filtración en gel "SEPHACRYL® S-1000".

La Fig 21 es un gráfico que ilustra los resultados de la separación magnética, detectada en el aparato mostrado en las Figs 4, 5 y 17, después de la incubación de polipirrol recubierto con anti-biotina con diferentes cantidades de ferrofluido recubierto con biotina-albúmina de suero bovino.

Las Figs 22A, 22B, 22C y 22D son vistas esquemáticas que ilustran los aspectos observables de ferrofluido uniéndose a partículas de látex en un campo magnético.

La Fig 23 es un gráfico que ilustra la velocidad y alcance del cambio de peso aparente de un imán, resultante de la operación del aparato de la Fig 17, para medir el efecto de variar la concentración de soluciones diluidas de ferrofluido recubierto con BSA biotinilada.

La Fig 24 es un gráfico que ilustra el cambio de peso aparente de un imán, resultante de la captura de complejos de polipirrol y reactivo magnéticamente sensible, durante un ensayo para albúmina de suero bovino biotinilada libre.

La Fig 25A es una vista en perspectiva de un dispositivo para inmunoensayos autoejecutables para la detección, magnéticamente asistida, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.

La Fig 25B es una vista en perspectiva despiezada del dispositivo para inmunoensayos autoejecutables de la Fig 25A.

La Fig 25C es una vista lateral en elevación del dispositivo para inmunoensayos autoejecutables de la Fig 25A.

La Fig 26 es un gráfico que ilustra los resultados obtenidos al utilizar un dispositivo del tipo mostrado en las Figs 25A, 25B y 25C, por medio de un lector de reflectancia.

La Fig 27 es un gráfico que ilustra los resultados obtenidos al utilizar un dispositivo para inmunoensayos autoejecutables para fibrina soluble, por medio de un lector de densidad óptica.

Descripción detallada de la invención

Las definiciones siguientes son aplicables a la invención:

La expresión "muestra de ensayo", como se utiliza aquí, se refiere a una materia sospechosa de contener el analito. La muestra de ensayo se puede utilizar directamente como se obtiene de la fuente, o siguiendo un pretratamiento para modificar el carácter de la muestra. La muestra de ensayo puede ser obtenida a partir de cualquier fuente biológica, tal como un fluido fisiológico incluyendo, pero no se pretende que esté limitado a, sangre, saliva, fluido de los cristalinos oculares, fluido cerebroespinal, sudor, orina, leche, líquido ascítico, mucosidad, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido amniótico y otros; caldos de fermentación; cultivos celulares; mezclas de reacciones químicas y otros. La muestra de ensayo se puede pretratar antes de su uso, tal como preparar plasma de la sangre, diluir fluidos viscosos, y otros. Los métodos de tratamiento pueden implicar filtración, destilación, concentración, inactivación de componentes interferentes, y la adición de reactivos. Además de los fluidos biológicos o fisiológicos, se pueden utilizar otras muestras líquidas tales como agua, productos alimentarios y otros para la realización de ensayos medioambientales o de producción de alimentos. Además, como muestra de ensayo se puede utilizar una materia sólida sospechosa de contener el analito. En algunos casos, puede ser beneficioso modificar una muestra de ensayo sólida para formar un medio líquido o para liberar el analito.

La expresión "miembro de unión específica", como se utiliza aquí, se refiere a un miembro de un par de unión, esto es, dos moléculas diferentes en donde una de las moléculas se une específicamente a la segunda molécula por medios químicos o físicos. Además de los bien conocidos miembros de pares de unión de antígeno y anticuerpo, otros pares de unión abarcan, pero no se pretende que estén limitados a, biotina y avidina, carbohidratos y lectinas, secuencias nucleotídicas complementarias, secuencias peptídicas complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores enzimáticos y enzimas, inhibidores enzimáticos y enzimas, una secuencia peptídica y un anticuerpo específico para la secuencia o la proteína entera, ácidos y bases poliméricos, colorantes y aglutinantes proteicos, péptidos y aglutinantes proteicos específicos (por ejemplo, ribonucleasa, péptido S y ribonucleasa proteína S), azúcar y ácido borónico, y moléculas similares teniendo una afinidad que permita su asociación en un ensayo de unión. Además, Los pares de unión pueden incluir miembros que sean análogos del miembro de unión original, por ejemplo un análogo de analito o un miembro de unión fabricado mediante técnicas recombinantes o ingeniería molecular. Si el miembro de unión es un inmunorreactante, puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, antígeno, hapteno, o complejo de los mismos, y si se utiliza un anticuerpo, puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína o anticuerpo recombinantes, un anticuerpo quimérico, una mezcla(s) o fragmento(s) de los mismos, así como una mezcla de un anticuerpo y otros miembros de unión. Los detalles de la preparación de tales anticuerpos, péptidos y nucleótidos y su idoneidad para uso como miembros de unión en un ensayo de unión son bien conocidos por aquellos especializados en la técnica.

El término "analito" o "analito de interés", como se utiliza aquí, se refiere al compuesto o composición a detectar o medir, y que tiene al menos un epítopo o sitio de unión. El analito puede ser cualquier sustancia para la que existe un miembro de unión de origen natural, o para la que se puede preparar un miembro de unión. Los analitos incluyen, pero no se pretende que estén limitados a, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, fármacos (incluyendo aquellos administrados con fines terapéuticos así como aquellos administrados con fines ilícitos), partículas de virus y metabolitos de o anticuerpos para cualquiera de las sustancias anteriores. Por ejemplo, tales analitos incluye, pero no se pretende que estén limitados a, ferritina; creatinina quinasa MIB (CK-MB); digoxina; fenitoína; fenobarbitol; carbamazepina; vancomicina; gentamicina; teofilina; ácido valproico; quinidina; hormona luteinizante (LH); hormona foliculoestimulante (FSH); estradiol; progesterona; anticuerpos IgE; vitamina B2-microglobulina; hemoglobina glucosilada (GHb); cortisol; digitoxina; N-acetilprocainamida (NAPA); procainamida; anticuerpos para rubéola, tales como rubéola-IgG y rubéola-IgM; anticuerpos para toxoplasmosis, tales como toxoplasmosis IgG (Toxo IgG) y toxoplasmosis IgM (Toxo IgM); testosterona, salicilatos; paracetamol; antígenos de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg); anticuerpos para el antígeno del núcleo de la hepatitis B, tales como IgG e IgM anti-antígeno del núcleo de la hepatitis B (Anti-HBC); virus 1 y 2 de la inmunodeficiencia humana (VIH), antígeno e de la hepatitis B (HBeAg); anticuerpos para el antígeno e de la hepatitis B (Anti-HBe); hormona estimulante del tiroides (TSH); tiroxina (T4); triyodotironina total (T3 total); triyodotironina libre (T3 libre); antígeno carcinoembriónico (CEA); y alfa fetoproteína (AFP); y drogas ilícitas y sustancias controladas, incluyendo, pero no se pretende que estén limitadas a, anfetamina, metanfetamina; barbituratos tales como amobarbital, secobarbital, pentobarbital, fenobarbital, y barbital; benzodiazepinas tales como librium y valium; cannabinoides tales como hachís y marihuana; cocaína; fentanilo; LSD; metacualona; opiatos tales como heroína, morfina, codeína, hidromorfona, hidrocodona, metadona, oxicodona, oximorfona y opio; fenciclidina; y propoxifeno. El término "analito" también incluye cualquier sustancias antigénicas, haptenos, anticuerpos, macromoléculas y combinaciones de los mismos.

El término "análogo de analito", como se utiliza aquí, se refiere a una sustancia que reaccione cruzadamente con un miembro de unión específico para el analito, aunque lo puede hacer hasta un grado mayor o menor del que lo hace el analito mismo. El análogo de analito puede incluir un analito modificado así como una porción fragmentada o sintética de la molécula de analito, siempre que el análogo de analito tenga al menos un sitio epitópico en común con el analito de interés. Un ejemplo de un análogo de analito es una secuencia peptídica sintética que duplique al menos un epítopo del analito molécula entera, a fin de que el análogo de analito pueda unirse a un miembro de unión específica para el analito.

El término "magnético", como se utiliza aquí, tiene que ver con una sustancia que tenga la capacidad de llegar a ser magnetizada cuando está en un campo magnético.

El término "paramagnético", como se utiliza aquí, tiene que ver con una sustancia en la que un campo magnético inducido está en la misma dirección al campo magnetizante, pero mucho más débil que en materiales ferromagnéticos. Los materiales ferromagnéticos, tales como hierro, níquel, o cobalto, exhiben una alta permeabilidad magnética, la capacidad de adquirir una alta magnetización en campos magnéticos relativamente débiles, un punto de saturación característico, e histéresis magnética. El término "paramagnético" tiene que ver con una sustancia para la que la susceptibilidad magnética es positiva.

El término "diamagnético", como se utiliza aquí, tiene que ver con una sustancia en la que un campo magnético inducido está en la dirección opuesta al campo magnetizante. El término "diamagnético" tiene que ver con una sustancia para la que la susceptibilidad magnética es negativa.

El magnetismo en una material proviene de los espines intrínsecos de los electrones de los átomos que lo componen. Los espines de electrones desapareados en elementos tales como el hierro comunican un espín al átomo completo. Cuando se aplica un campo magnético a tal material, los espines de los átomos individuales tenderán a alinearse con el campo para minimizar su energía, creando un momento magnético neto. Si los átomos reactivos están compactos entre sí, como en los materiales ferromagnéticos, influyen entre sí para formar un orden magnético de largo alcance. A medida que aumenta la intensidad del campo aplicado, la magnetización de un material ferromagnético aumentará hasta que prácticamente todos los átomos reactivos estén alineados, después de lo cual no se observará aumento adicional en la magnetización y se dice que el material está saturado. Durante una disminución posterior en la intensidad del campo aplicado, los materiales ferromagnéticos mostrarán una notable histéresis, y después de la eliminación total del campo aplicado el material conservará algo de su orden magnético de largo alcance y estará magnetizado permanentemente.

En algunos materiales, los cuales son mencionados como paramagnéticos, los átomos individuales que manifiestan una alta sensibilidad magnética están rodeados por átomos de otros elementos que manifiestan baja sensibilidad magnética. Cuando son sometidos a un campo magnético aplicado, los átomos que exhiban una alta sensibilidad magnética se alinearán con el campo, pero no se influirán entre sí y serán capaces de formar un orden magnético de largo alcance. No se observará una saturación pronunciada, y cuando se elimine el campo magnético, no se mostrará histéresis ya que los espines de los átomos individuales revierten a orientaciones aleatorias y se pierde todo el campo magnético residual.

Los materiales superparamagnéticos manifiestan características de paramagnetismo y ferromagnetismo. Si las pequeñas partículas de material ferromagnético están dispersadas en una matriz que exhiba baja reactividad magnética, los átomos dentro de una partícula individual se alinean e influyen entre sí cuando están en un campo. Sin embargo, no influyen en los átomos de una partícula vecina, con el resultado de que no se forma un orden magnético de largo alcance. Aunque los materiales superparamagnéticos son capaces de llegar a estar más sumamente magnetizados que los materiales paramagnéticos cuando son sometidos a un campo magnético, las partículas superparamagnéticas también muestran un pequeño magnetismo residual después de que se elimine el campo magnético.

En Jiles, Introduction to Magnetism and Magnetic Materials, Chapman & Hall (Londres, 1991), incorporada aquí como referencia, se pueden encontrar detalles adicionales acerca del magnetismo, ferromagnetismo, paramagnetismo, superparamagnetismo y diamagnetismo.

La expresión "reactivo magnéticamente sensible", como se utiliza aquí, se refiere a una sustancia que implica un material magnéticamente reactivo unido a un miembro de unión específica. La unión se puede llevar a cabo por medios de unión covalentes o no covalentes, brazos conectores, y otros. Sin embargo, para la presente invención no es crítico el método de unión. Como se utiliza aquí, un "material magnéticamente reactivo" es una sustancia que, en la aplicación de un campo magnético, permite que el reactivo magnéticamente sensible produzca una respuesta detectable que estará directa o indirectamente relacionada con la cantidad de analito en la muestra de ensayo. El componente miembro de unión específica del reactivo puede ser seleccionado para que se una directamente al analito, o se una indirectamente al analito por medio de un miembro de unión específica auxiliar, lo cual se describe en mayor detalle a continuación. Los reactivos magnéticamente sensibles se pueden unir a miembros de unión específica auxiliares antes, durante o después de poner en contacto el reactivo magnéticamente sensible con la muestra de ensayo y/u otros reactivos de ensayo. Las expresiones "miembro de unión específica unido a una partícula magnéticamente reactiva", "miembro de unión específica unido a un material magnéticamente reactivo", "miembro de unión específica unido a un reactivo magnéticamente sensible" y términos similares son utilizadas para referirse a la característica principal de los reactivos magnéticamente sensibles de la presente invención, esto es, el reactivo produce una respuesta detectable cuando es sometido a un campo magnético.

La expresión "fase sólida", como se utiliza aquí, se refiere a cualquier material al que se llegan a unir el analito, complejos de analito, o reactivos de ensayo, y del que se pueden separar los reactivos de ensayo sin reaccionar, muestra de ensayo, o soluciones de ensayo. La fase sólida tiene generalmente un miembro de unión específica unido a su superficie para formar un "reactivo en fase sólida", que permite la unión del analito, el reactivo magnéticamente sensible, u otro reactivo de ensayo. Los miembros de unión específica que están unidos a la fase sólida se pueden seleccionar para que se unan directamente al analito o se unan indirectamente al analito por medio de un miembro de unión específica auxiliar, el cual se puede unir al reactivo en fase sólida antes, durante, o después de poner en contacto el reactivo en fase sólida con la muestra de ensayo y/u otros reactivos de ensayo. La expresión "reactivo en fase sólida móvil", como se utiliza aquí, se refiere a un reactivo en el que la fase sólida es una partícula.

El término "complejo", como se utiliza aquí, se refiere a la sustancia formada mediante la unión de uno o más materiales a otro material mediante una o más reacciones de unión específica. Los ejemplos representativos de complejos abarcan, pero no se limitan a, (a) complejos formados mediante la reacción de unión específica de un reactivo magnéticamente sensible con un reactivo en fase sólida móvil, (b) complejos formados mediante la reacción de unión específica de un analito con un reactivo magnéticamente sensible y un reactivo en fase sólida móvil, (c) complejos formados mediante la reacción de unión específica de un analito con un reactivo magnéticamente sensible, y (d) complejos formados mediante la reacción de unión específica de un analito con un reactivo en fase sólida móvil.

La expresión "miembro de unión auxiliar", como se utiliza aquí, se refiere a cualquier miembro de un par de unión que se utilice en el ensayo además de los miembros de unión específica del reactivo magnéticamente sensible o reactivo en fase sólida móvil. Por ejemplo, en ejemplos donde el analito mismo no se puede unir directamente al reactivo magnéticamente sensible, un miembro de unión auxiliar puede ser capaz de unir el reactivo magnéticamente sensible al analito de interés. Como se comprenderá, por supuesto, en un ensayo se puede utilizar uno o más miembros de unión auxiliares, y tal miembro(s) de unión auxiliar se puede unir al reactivo magnéticamente sensible o reactivo en fase sólida móvil antes, durante, o después de que el reactivo magnéticamente sensible o reactivo en fase sólida móvil sea puesto en contacto con una muestra de ensayo u otro reactivo de ensayo. El miembro de unión auxiliar puede ser incor-
porado en el dispositivo de ensaño o puede ser añadido al dispositivo como una solución de reactivo independiente.

Descripción de la invención

El campo de aplicación de la invención es como se define en el sumario anterior de la invención y la reivindicaciones adjuntadas.

Cuando un material es puesto bajo la influencia de un campo magnético, actuará una fuerza sobre él, la cual fuerza está dirigida hacia o lejos de la fuente del campo magnético. Por ejemplo, la fuerza que actúa sobre un material ferromagnético fuertemente sensible magnéticamente, tal como la magnetita, estará dirigida hacia la fuente del campo magnético. En el mismo campo, cuanto mucho más débil sea la fuerza que actúa sobre un material diamagnético, tal como el poliestireno, estará dirigida lejos de la fuente del campo magnético. El alcance de la respuesta de los materiales magnéticamente sensibles se puede utilizar como medida de la cantidad de material magnéticamente sensible presente. La presente invención resulta del inesperado y sorprendente descubrimiento de que, cuando se utiliza un material magnéticamente reactivo como componente de un reactivo magnéticamente sensible en un ensayo de unión, es posible detectar la presencia o cantidad de cualquiera o ambos del material magnéticamente reactivo libre o material magnéticamente reactivo incorporados en un complejo, midiendo el alcance de la respuesta resultante de la interacción del reactivo magnéticamente sensible con un campo magnético aplicado. La respuesta del reactivo magnéticamente sensible a un campo magnético puede manifestarse ella misma de maneras tales como, por ejemplo, un movimiento detectable del material magnéticamente reactivo o una fuerza resultante detectable ejercida por o sobre el material magnéticamente reactivo. Además, la intensidad de la fuerza o el alcance del movimiento producen una relación clara para la cantidad de material magnéticamente reactivo unido a un material en fase sólida, permitiendo de ese modo la determinación de la presencia o cantidad de un analito en una muestra de ensayo. Por ejemplo, la fuerza ejercida por un campo magnético sobre partículas individuales de un material ferromagnético suspendido en un fluido (por ejemplo, un ferrofluido) es relativamente pequeña y, por consiguiente, difícil de detectar. Sin embargo, cuando una pluralidad o multiplicidad de estas partículas ferromagnéticas individuales se llegan a unir a un material en fase sólida diamagnético, por ejemplo, mediante la unión específica directamente vía miembros de unión específica o indirectamente mediante la unión simultánea y específica a un analito vía miembros de unión específica, la fuerza ejercida por un campo magnético sobre los complejos individuales suspendidos en el fluido es relativamente alta y, por consiguiente, mucho más fácilmente detectable. La separación de las partículas individuales de los complejos y el movimiento de los complejos en un campo magnético forman la base para el método y aparato de esta invención.

Reactivos de Ensayo

La selección de una composición concreta de material magnéticamente reactivo no es crítica para la presente invención. Preferentemente, el material magnéticamente reactivo puede ser unido a, o puede ser modificado, para que sea capaz de ser unido a un miembro de unión específica que, a su vez, se unirá a otro reactivo de ensayo o a un componente presente en una muestra de ensayo. También se prefiere que el material magnéticamente reactivo sea magnéticamente sensible hasta el punto de que permita el fraccionamiento del reactivo magnéticamente sensible unido y el reactivo magnéticamente sensible no unido, y la producción de una respuesta detectable al ser sometido a un campo magnético. Con el propósito de la presente invención, un material es magnéticamente reactivo si está influenciado por la aplicación de un campo magnético tal como, por ejemplo, si es atraído hacia la fuente del campo magnético o tiene una susceptibilidad magnética detectable. Se pueden formar diversos reactivos magnéticamente sensibles diferentes variando el componente magnéticamente reactivo o el componente miembro de unión específica del reactivo. Se comprenderá, por supuesto que la elección implica la consideración del analito a detectar y la optimización deseada de la técnica de ensayo.

Está disponible comercialmente una amplia variedad de materiales magnéticamente reactivos que son apropiados para su uso en reactivos magnéticamente sensibles, o en la técnica se conocen bien las técnicas de producción para ello. Las características preferidas de los materiales magnéticamente reactivos se pueden conseguir mediante una amplia variedad de materiales magnéticos. Los materiales magnéticamente reactivos apropiados para su uso en esta invención abarcan, pero no se limitan a, materiales ferromagnéticos, ferrimagnéticos, paramagnéticos, superparamagnéticos, y otros. El término "ferromagnético" se utiliza generalmente para describir materiales que son atraídos hacia un imán y que típicamente llegan a ser magnetizados permanentemente en su exposición a un campo magnético. Los materiales ferromagnéticos también se pueden reducir en tamaño de partícula, de manera que cada una de las partículas sea un dominio magnético individual. Estas partículas se pueden dispersar en una matriz para crear una micropartícula o una partícula de ferrofluido. En este estado de subdivisión, el material puede ser llamado como "superparamagnético", y se caracteriza por la ausencia de cualquier magnetización permanente medible importante. Los materiales apropiados para su uso como matriz en esta invención incluyen, pero no se limitan a, materiales tales como, por ejemplo, polímeros orgánicos incluyendo el poliestireno y otros.

Los materiales ferromagnéticos, ferrimagnéticos, paramagnéticos, y superparamagnéticos apropiados abarcan, pero no se limitan a, metales tales como hierro, níquel, cobalto, cromo, manganeso, y otros; elementos de la serie de los lantánidos tales como neodimio, erbio, y otros; aleaciones tales como aleaciones magnéticas de aluminio, níquel, cobalto, cobre, y otras; óxidos tales como óxido férrico (Fe_{3}O_{4}), óxido ferroso férrico, óxido de cromo (CrO_{2}), óxido de cobalto (CoO), óxido de níquel (NiO_{2}), óxido de manganeso (Mn_{2}O_{3}),y otros; materiales compuestos tales como ferritas y otros; y soluciones sólidas tales como magnetita con óxido férrico y otras. Los materiales magnéticamente reactivos preferidos para su uso en esta invención son la magnetita, el óxido férrico (Fe_{3}O_{4}), y el óxido ferroso (Fe_{2}O_{3}).

Las partículas sólidas se pueden fabricar de hierro, óxido de hierro, un núcleo de material magnéticamente reactivo recubierto con un óxido metálico, o una partícula magnética coloidal conteniendo magnetita o hematita. Las partículas sólidas tienen típicamente un peso específico de hasta 8 y un tamaño medio, por ejemplo diámetro, de hasta 800 nanómetros.

Las partículas estratificadas pueden constar de un núcleo de material magnéticamente reactivo teniendo un recubrimiento magnéticamente no reactivo. Por ejemplo, una partícula estratificada puede constar de un núcleo de óxido metálico magnético que está generalmente rodeado por un recubrimiento polimérico de silano; una partícula estratificada puede constar de un sustrato metálico insoluble en agua recubierto con un producto de condensación de un ácido aminobenzoico con un aldehído, apropiado para acoplarse a un compuesto que tenga afinidad biológica. Una partícula estratificada puede constar de un núcleo formado de una partícula individual de un material magnéticamente reactivo teniendo un recubrimiento de material polímero reticulado insoluble en agua que tiene grupos reactivos en la superficie del mismo. Una partícula estratificada puede constar de un núcleo de un material no magnético teniendo un recubrimiento de un material magnéticamente reactivo. Una partícula estratificada puede constar de una partícula polimérica orgánica teniendo un recubrimiento de ferrita; una partícula estratificada puede constar de un núcleo de material termoplástico teniendo un recubrimiento de material magnéticamente reactivo (en al menos una porción de la superficie del núcleo); una partícula estratificada puede constar de una microesfera de polialdehído recubierta con un metal; una partícula estratificada puede constar de un núcleo de una partícula polimérica (por ejemplo, poliestireno) teniendo un recubrimiento polimérico/óxido metálico magnéticamente reactivo cubriendo uniformemente el núcleo. Una partícula estratificada puede constar de un núcleo de material magnéticamente no reactivo teniendo una capa de un material magnéticamente reactivo y un recubrimiento magnéticamente no reactivo. Por ejemplo, una partícula estratificada puede constar de una microesfera de polialdehído recubierta con metal encapsulado con agarosa, una cuenta de resina termoplástica (por ejemplo, poliestireno, cloruro de polivinilo, poliacrilato, nylon, etc.) teniendo desde el 1-25% en peso de un polvo magnéticamente reactivo unido a la superficie de la cuenta, y un polímero recubierto en eso, el polímero recubierto teniendo grupos funcionales para unirse a un componente biológicamente activo.

Las partículas de material compuesto pueden constar de un material magnéticamente reactivo incrustado dentro de un material magnéticamente no reactivo. Los ejemplos representativos de partículas de material compuesto incluyen: (a) cristales magnéticos conteniendo hierro (<1.000 \ring{A}) incorporados dentro de una estructura de vidrio y/o cristal; (b) una matriz de copolímero formada a partir de al menos un monómero monoetilénico (30-99% en peso) que no se coordine con un complejo metálico, al menos un monómero polietilénico reticulable (0'5-50% en peso) que no se coordine con un complejo metálico, y al menos un monómero nucleófilo (0'5-30% en peso) que se pueda coordinar con un complejo metálico, con cristalitas encapsuladas de un metal; (c) partículas magnetizables teniendo un tamaño medio (por ejemplo, diámetro) menor de 300 \ring{A}, encapsuladas en una matriz de organopolisiloxano; (d) un producto de reacción particulado de una forma hidrosoluble de hierro y un polímero hidrosoluble teniendo sitios de coordinación disponibles (par de electrones libres para un enlace de coordinación con un átomo de metal de transición); (e) una matriz polimérica orgánica, inorgánica o sintética conteniendo un material magnéticamente reactivo; (f) una fase continua de una matriz polimérica insoluble en agua teniendo dispersada (embebida) allí dentro: un material magnéticamente reactivo y un material absorbente particulado (seleccionado de carbón vegetal, talco, resinas de intercambio iónico, tierra de Fuller, dióxido de silicio, óxidos de zirconio o aluminio o titanio, vidrio poroso, zeolitas, polímeros naturales o sintéticos, primer o segundo anticuerpos polimerizados o enzimas polimerizadas, antígenos o receptores de la superficie celular en forma particulada, partículas subcelulares y células bacterianas); (g) partículas fabricadas polimerizando uno o más monómeros, en presencia de sólidos magnéticamente reactivos, para formar directamente una matriz polimérica sintética insoluble en agua teniendo los sólidos uniformemente incrustados allí dentro; (h) partículas de proteína o polipéptido reticulados y un material magnéticamente reactivo fabricado combinando: una solución en disolvente orgánico de un polímero de alto peso molecular (por ejemplo poliestireno), un material magnéticamente reactivo particulado, y un agente reticulante polifuncional (por ejemplo, polialdehído); (i) partículas poliméricas vinílicas aromáticas hidrófobas teniendo un diámetro medio de 0'03 a 5 micrómetros y un material magnéticamente reactivo en una cantidad del 0'5 al 50% en peso con respecto a la porción polimérica de las partículas, el material magnéticamente reactivo estando dispersado dentro de las partículas poliméricas; (j) un rellenante seleccionado del grupo que se compone de un metal, aleación de metal, óxido de metal, sal de metal, sulfuro de metal, pigmento y compuesto quelato metálico, y una capa superficial oleófila sobre el rellenante, y una capa de material polímero sobre la superficie oleófila que cubre el rellenante.

Los reactivos magnéticamente sensibles formados como matriz o partículas de material compuesto pueden incluir, opcionalmente, recubrimientos o capas adicionales de materiales magnéticamente reactivos o materiales magnéticamente no reactivos, o mezclas de los mismos. Las composiciones para matrices se pueden fabricar mediante cualquier método, abarcando, pero no se limitan a, (1) polimerización del material magnéticamente reactivo con el monómero seleccionado, (2) hinchamiento del material de la matriz con la introducción de material magnéticamente reactivo dentro de los poros de la matriz, y otros. La matriz puede incluir materiales orgánicos e inorgánicos tales como, por ejemplo, vidrio, celulosa, materiales poliméricos sintéticos, agarosa, y otros. Los materiales poliméricos apropiados para esta invención abarcan, pero no se limitan a, polímeros de estireno; poliestirenos sustituidos; derivados de polinaftaleno; ácidos poliacrílicos y polimetacrílicos; poliacrilamida y polimetacrilamida; policarbonato; poliésteres; poliamidas; polipirrol; poliaminoácidos aromáticos; polialdehídos; materiales proteínicos tales como gelatina, albúmina y otros; polisacáridos tales como el almidón, dextrano y otros; y copolímeros de materiales poliméricos. El polímero puede ser también utilizado en una mezcla con un rellenante inerte o puede incluir un material absorbente.

Preferentemente, las partículas de material magnéticamente reactivo apropiadas para su uso en la presente invención son sustancialmente de forma esférica, aunque son adecuadas otras formas y pueden ser ventajosas en algunas circunstancias. Otras posibles formas incluyen, pero no se limitan a, placas, varillas, barras, y formas irregulares. El diámetro de las partículas de material magnéticamente reactivo oscilan, preferentemente, desde aproximadamente 0'01 micrones (\mum) hasta aproximadamente 1.000 \mum, más preferentemente desde unos 0'01 \mum hasta unos 100 \mum, y muy preferentemente desde unos 0'01 \mum hasta unos 10 \mum. Como se apreciará por aquellos especializados en la técnica, la composición, forma, tamaño y densidad del material magnéticamente reactivo pueden variar ampliamente, y un material magnéticamente reactivo se puede seleccionar basado en factores tales como el analito de interés y el protocolo de ensayo deseado.

Conforme a una forma de realización de la presente invención, las partículas de material magnéticamente reactivo se pueden seleccionar para que tengan un peso específico a fin de que se mantengan suspendidas dentro de la mezcla de reacción, intensificando de ese modo la reactividad del miembro de unión específica. Generalmente, las partículas pequeñas magnéticamente reactivas que tengan un diámetro medio de menos de unos 0'03 \mum (300 \ring{A}) pueden permanecer suspendidas en solución mediante agitación térmica, sin decantación espontánea. En formas de realización alternativas, las partículas de material magnéticamente reactivo se pueden seleccionar para que tengan un peso específico a fin de que no decanten en la mezcla de reacción, intensificando de ese modo la reactividad del miembro de unión específica con un reactivo inmovilizado en una fase sólida. Generalmente, las partículas grandes de material magnéticamente reactivo, por ejemplo aquellas que tengan un diámetro medio mayor de unos 10 \mum, pueden responder a campos magnéticos débiles. Aunque se pueden utilizar partículas grandes o densas de material magnéticamente reactivo, tales partículas pueden necesitar que la mezcla de reacción sea agitada durante las etapas de incubación, para impedir la decantación de las partículas. En otra forma de realización, las partículas de material magnéticamente reactivo se pueden seleccionar para que permanezcan dispersas en la mezcla de reacción durante un tiempo suficiente para permitir las reacciones de unión requeridas, sin la necesidad de agitar o mezclar.

Al formar el reactivo magnéticamente sensible, la unión del miembro de unión al material magnéticamente reactivo puede ser lograda mediante cualquier mecanismo de unión o acoplamiento apropiado, incluyendo, pero no se limitan a, adsorción, enlace covalente, reticulación (químicamente o mediante miembros de unión), una combinación de tales mecanismos de unión, y otros. Típicamente, los grupos de acoplamiento y los agentes de acoplamiento o conectores son seleccionados para que la actividad de la unión del miembro de unión específica no sea sustancialmente modificada o destruida en la unión al material magnéticamente reactivo. La cantidad de miembro de unión que se puede unir al material magnéticamente reactivo depende en gran parte de su concentración, de las condiciones utilizadas, y de la cantidad y naturaleza de los grupos funcionales disponibles en el material magnéticamente reactivo o agente de acoplamiento.

Preferentemente, el miembro de unión específica se une covalentemente al material magnéticamente reactivo, y el enlace covalente se puede formar entre un componente y una forma químicamente activa del otro componente. Por ejemplo, un éster activo tal como N-hidroxisuccinimida puede ser introducido en un componente y dejar que reaccione con una amina libre en el otro componente, para formar un acoplamiento covalente de los dos. Otros ejemplos abarcan, pero no se limitan a, la introducción de maleimida en un componente, al cual se deja que reaccione con porciones sulfhidrilo endógenas o introducidas en el otro componente; la oxidación de grupos carbohidrato endógenos o introducidos en un componente para formar aldehídos, los cuales pueden reaccionar con aminas libres o hidrazidas en el otro componente. Donde el marcador atraíble magnéticamente incluya un recubrimiento o matriz poliméricos, el polímero se puede seleccionar para que lo contenga, o se puede proporcionar con grupos reactivos adecuados tales como, por ejemplo, azida, bromoacetilo, amino, hidroxilo, sulfhidrilo, epóxido, carboxílico u otros grupos, para facilitar la unión del miembro de unión específica. Los reactivos apropiados, así como las técnicas de conjugación para sintetizar el reactivo magnéticamente sensible, son bien conocidos por aquellos de habilidad normal en la técnica. Se comprenderá, por supuesto, que los métodos para sintetizar un reactivo magnéticamente sensible no pretenden limitar la invención.

Los reactivos de partículas en fase sólida móvil pueden constar generalmente de materiales que abarcan, pero no se limitan a, polímeros tales como, por ejemplo, polímeros de estireno; poliestireno sustituido; derivados de polinaftaleno; ácidos poliacrílicos y polimetacrílicos; poliacrilamida y polimetacrilamida; policarbonato; poliésteres; poliamidas; polipirrol; polipropileno; látex; politetrafluoroetileno; poliacrilonitrilo; vidrio u otros materiales vítreos; poliaminoácidos aromáticos; polialdehídos; materiales proteínicos tales como gelatina, albúmina y otros; polisacáridos tales como el almidón, dextrano y otros; y copolímeros de materiales poliméricos.

El método para unir un miembro de unión específica a una fase sólida para, de ese modo, formar un reactivo en fase sólida móvil, abarca la unión covalente y la unión no covalente, las cuales han sido perfiladas anteriormente con respecto a sintetizar un reactivo magnéticamente sensible. Generalmente, se prefiere que el miembro de unión específica sea unido a la fase sólida mediante unión covalente.

Métodos de Ensayo y Dispositivos

Los métodos y dispositivos revelados aquí se pueden aplicar a cualquier formato de ensayo apropiado que implique miembros de un par de unión específica, incluyendo, pero no se limitan a, aquellos miembros de un par de unión previamente descritos. Los métodos de ensayo de la presente invención utilizan la respuesta de un reactivo magnéticamente sensible, a la influencia de un campo magnético, para medir cuantitativa o cuantitativamente la unión entre miembros de un par de unión específica. Conforme a la presente invención, la presencia de un analito media la extensión a la que el reactivo magnéticamente sensible se une a un reactivo en fase sólida móvil. La extensión de la unión modulará la respuesta del reactivo magnéticamente sensible o la del reactivo en fase sólida móvil, o la de ambos, a la influencia de un campo magnético. Por lo tanto, midiendo la respuesta del reactivo magnéticamente sensible, o la del reactivo en fase sólida móvil, o la de ambos, hacia el campo magnético, se puede determinar exactamente la presencia o cantidad de analito contenido en una muestra de ensayo.

Los reactivos magnéticamente sensibles y dispositivos de la presente invención se pueden utilizar en diversos formatos de inmunoensayo. Sin embargo, la presente invención no se limita a inmunoensayos. En general, se puede realizar cualquier configuración de ensayo, conforme a las reivindicaciones adjuntadas, que utilice miembros de un par de unión específica y un reactivo magnéticamente sensible tal como, por ejemplo, las micropartículas superparamagnéticas utilizadas en la presente invención. Los formatos de inmunoensayo son bien conocidos por aquellos de habilidad normal en la técnica y están descritos, por ejemplo, en la Patente U.S. Nº 5.252.459.

Los formatos de inmunoensayo están particularmente bien descritos en la columna 5, línea 55, hasta la columna 9, línea 62, de la Patente U.S. Nº 5.252.459.

La presente invención es aplicable a diversos formatos de ensayo competitivo y formatos de ensayo sándwich que son bien conocidos en la técnica. Se han descrito numerosos formatos de ensayo competitivo, de inhibición, y sándwich, por los que se reparte un reactivo marcado entre una fase líquida y una fase sólida respecto a la presencia del analito en la muestra de ensayo.

Según un formato de ensayo competitivo, un reactivo magnéticamente sensible puede constar de un primer miembro de unión (por ejemplo, un análogo de analito) unido a un material magnéticamente reactivo para, de ese modo, formar un reactivo magnéticamente sensible. Un reactivo en fase sólida móvil puede constar de un material en fase sólida móvil, tal como látex o micropartícula poliméricos, al que se une un segundo miembro de unión, el cual segundo miembro de unión se une específicamente al analito y al primer miembro de unión, el cual está unido al reactivo magnéticamente sensible. Durante el transcurso del ensayo, un analito en la muestra de ensayo y el reactivo magnéticamente sensible compiten por los sitios de unión en el reactivo en fase sólida móvil. Alternativamente, el miembro de unión específica unido a la fase sólida puede ser un análogo de analito seleccionado para competir con el analito por unirse a un miembro de un par de unión específica unido a un material magnéticamente reactivo. Por lo tanto, la cantidad de reactivo magnéticamente sensible que se llega a unir a la fase sólida es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra de ensayo.

Según un formato de ensayo sándwich, un primer miembro de unión específica se une a un material magnéticamente reactivo para formar un reactivo magnéticamente sensible, y un segundo miembro de unión específica se une a una fase sólida móvil para formar un reactivo en fase sólida móvil. Los miembros de unión específica son seleccionados para unirse directa o indirectamente al analito de interés. Durante el transcurso del ensayo, el reactivo magnéticamente sensible y el reactivo en fase sólida móvil se unen al analito para formar un complejo. De este modo, la cantidad de reactivo magnéticamente sensible que forme un complejo con el reactivo en fase sólida móvil para unirse al analito es proporcional a la cantidad de analito en la muestra de ensayo.

Según la presente invención, lo protocolos de ensayo pueden comprender opcionalmente el empleo de miembros de unión auxiliares para unir indirectamente al analito o análogo de analito al reactivo magnéticamente sensible o al reactivo en fase sólida móvil. El miembro de unión auxiliar puede ser unido a un reactivo en fase sólida móvil o a un reactivo magnéticamente sensible antes, durante, o después de poner en contacto el reactivo en fase sólida móvil o el reactivo magnéticamente sensible con la muestra de ensayo u otros reactivos de ensayo.

Además, los protocolos de ensayo pueden comprender, por ejemplo, el poner en contacto simultáneamente los reactivos de ensayo y la muestra de ensayo para formar una mezcla de reacción, o los reactivos de ensayo y la muestra de ensayo pueden ser puestos secuencialmente en contacto, y durante un periodo de tiempo apropiado para la unión, para formar múltiples mezclas de reacción. Según tales protocolos de ensayo, después de un periodo apropiado para la unión para formar complejos, el reactivo magnéticamente sensible que no haya experimentado una reacción de unión específica para formar un complejo (esto es, el reactivo magnéticamente sensible no unido) puede ser separado del reactivo magnéticamente sensible que haya experimentado una reacción de unión específica para formar un complejo (esto es, el reactivo magnéticamente sensible unido), debido a su diferente comportamiento en un campo magnético aplicado. Se comprenderá, por supuesto, que la separación del reactivo magnéticamente sensible unido y el reactivo magnéticamente sensible no unido pueda implicar la completa eliminación del reactivo magnéticamente sensible no unido de la mezcla de reacción y/o del reactivo magnéticamente sensible unido.

La separación del reactivo magnéticamente sensible unido y el reactivo magnéticamente sensible no unido también puede implicar la segregación del reactivo magnéticamente sensible no unido del reactivo magnéticamente sensible unido, de manera que el reactivo magnéticamente sensible no unido permanezca en la mezcla de reacción pero no afecte adversamente la respuesta detectable cuando el material magnéticamente reactivo unido sea puesto en la proximidad de un campo magnético. Alternativamente, el reactivo magnéticamente sensible no unido, el reactivo magnéticamente sensible unido, o el reactivo en fase sólida móvil pueden ser observados por una respuesta a un campo magnético. Además, el reactivo magnéticamente sensible no unido, el reactivo magnéticamente sensible unido, o el reactivo en fase sólida móvil pueden ser observados por una respuesta a un campo magnético, por lo que se puede observar una proporción del reparto.

Generalmente, los dispositivos comprenden componentes para ejecutar ensayos de unión asistidos magnéticamente como se pensó aquí. Por consiguiente, tales dispositivos constan preferentemente de (i) un recipiente de reacción; (ii) un generador de campo magnético para la aplicación de un campo magnético al reactivo magnéticamente sensible; y (iii) un medio de medición para valorar el efecto del campo magnético generado por el generador del campo magnético sobre el reactivo magnéticamente sensible o el reactivo en fase sólida móvil, o ambos, como medida de la presencia o cantidad de analito en la muestra de ensayo.

El recipiente de reacción puede ser cualquier dispositivo capaz de contener los reactivos de ensayo revelados aquí, y donde se puedan producir el reactivo magnéticamente sensible no unido y el reactivo magnéticamente sensible unido en relación a la cantidad de analito en una muestra de ensayo.

El separar el reactivo magnéticamente sensible unido del reactivo magnéticamente sensible no unido se puede llevar a cabo mediante cualquier método apropiado para fraccionar el reactivo magnéticamente sensible no unido y el reactivo magnéticamente sensible unido, tal como, por ejemplo, la aplicación de un campo magnético.

El generador del campo magnético puede ser cualquier medio para generar un campo magnético que provoque una respuesta del reactivo magnéticamente sensible. Los generadores de campo magnético preferidos para esta invención incluyen imanes permanentes y electroimanes. También se comprenderá, por supuesto, que el generador de campo magnético también se puede utilizar para separar el reactivo magnéticamente sensible no unido del libre, o del reactivo magnéticamente sensible unido o acomplejado.

La respuesta de un reactivo magnéticamente sensible a un campo magnético se puede manifestar de muchas formas medibles, incluyendo la fuerza o movimiento resultante del reactivo tal como, por ejemplo, un cambio aparente en la fuerza que actúa sobre el reactivo en el recipiente de reacción, un desplazamiento del reactivo, y otras. Se comprenderá, por supuesto, que estas manifestaciones pueden ser medidas directamente detectando y midiendo las manifestaciones del reactivo magnéticamente sensible, o las manifestaciones pueden ser medidas indirectamente detectando y midiendo el efecto del reactivo magnéticamente sensible sobre, por ejemplo, el reactivo en fase sólida móvil o el generador del campo magnético. La influencia del campo magnético sobre un reactivo magnéticamente sensible puede ser observada o detectada y medida mediante cualquier medio apropiado para medir, directa o indirectamente, la respuesta del reactivo magnéticamente sensible al campo magnético. Por ejemplo, (a) se puede detectar y medir un cambio en el peso aparente mediante una balanza; (b) se puede detectar y medir un cambio en la masa aparente mediante una balanza, o un cambio resultante en la frecuencia de un oscilador, tal como un cristal de cuarzo; (c) se puede detectar y medir un desplazamiento, mediante un sensor óptico, para valorar la magnitud de un cambio desde la posición inicial hasta una posición posterior adoptada por el reactivo magnéticamente sensible, el reactivo en fase sólida móvil, o el complejo constando de un reactivo en fase sólida móvil y un reactivo magnéticamente sensible; (d) se puede detectar y medir un movimiento mediante un detector de movimiento para valorar el movimiento, tal como, por ejemplo, una película piezoeléctrica, o una bobina tal como, por ejemplo, un susceptómetro que puedan crear un campo que sea interrumpido mediblemente por la presencia y/o movimiento de material magnético; y (e) se puede detectar un cambio en la cantidad de esfuerzo incorporando materiales, sensibles al esfuerzo, dentro de un recipiente o material en fase sólida de manera que, en la aplicación de un campo magnético, sea detectable el cambio en el esfuerzo. Se comprenderá, por supuesto, que dependiendo del ensayo concreto, puede ser preferible detectar, directa o indirectamente, la respuesta del reactivo magnéticamente sensible no unido, la respuesta del reactivo magnéticamente sensible unido, o ambas respuestas del reactivo magnéticamente sensible unido y del reactivo magnéticamente sensible no unido hacia el campo magnético. También se comprenderá, por supuesto, que se puede utilizar una amplia variedad de instrumentos para detectar cambios de masa, cambios de posición, movimientos, cambios de peso, cambios de fuerzas, susceptibilidad magnética, inducción, cambios ópticos y otros, todos los cuales resultan de la interacción entre un campo magnético y el reactivo magnéticamente sensible.

La presente invención resuelve los problemas de los ensayos heterogéneos y de aglutinación convencionales, permitiendo que el reactivo magnéticamente sensible se asocie con reactivos semejantes o con otras partículas no reactivas magnéticamente, aplicando después un campo magnético, y midiendo las consecuencias de la fuerza magnética ejercida sobre el reactivo magnéticamente sensible para proporcionar resultados cualitativos o cuantitativos del ensayo. Los niveles pequeños de fuerza se pueden determinar fácilmente utilizando detectores los cuales abarcan, pero no se limitan a, balanzas electrónicas; sensores ópticos, dispositivos sensores de presión piezoeléctricos tales como, por ejemplo, dispositivos micromecánicos de silicio o chips electrónicos; dispositivos vibradores de fibra; bobinas que produzcan un campo que sea interrumpido por la presencia de un reactivo magnéticamente sensible, tales como, por ejemplo, bobinas de inducción y otras; y dispositivos de viga en voladizo que incluyen, pero no se limitan a, aquellos utilizados para percibir los cambios en las fuerzas en un microscopio de fuerza atómica; y otros. Estos detectores permiten la ejecución de ensayos muy sensibles y obvian la necesidad de amplificación del marcador, como se requiere en muchos ensayos convencionales.

Los ensayos de unión heterogéneos convencionales requieren un lavado vigoroso de la fase sólida para separar el reactivo marcado unido y el reactivo marcado no unido, y para suprimir la unión no específica de materiales a la fase sólida. Tales etapas de lavado complican el protocolo de ensayo y restringen el ensayo para el uso de miembros de un par de unión específica teniendo alta afinidad, esto es, una fuerza de unión que resistirá tal manipulación física. En ensayos convencionales de aglutinación de partículas, se pueden utilizar miembros de unión baja afinidad debido a que los diversos sitios de unión en cada miembro pueden cooperar para dar altas avideces, y la ausencia de etapas de lavado permite mantener asociaciones débiles, simplificando mientras el formato de ensayo. Los resultados de amplificación de señales debidos a la interacción de unos pocos sitios de unión pueden originar la agregación de complejos varios órdenes de magnitud mayores en tamaño y masa que los miembros de unión originales, y de ese modo, proporcionar un cambio macroscópico que puede ser interpretado visualmente. Sin embargo, los ensayos de aglutinación de partículas son a menudo difíciles de interpretar, no producen resultados cuantitativos, y no son fácilmente flexibles para su automatización.

Conforme a la presente invención, se puede manipular exactamente la intensidad del campo magnético, por ejemplo, por medio de un electroimán, un imán permanente móvil, o codificando campos magnéticos de intensidades o gradientes específicos, o ambos, sobre materiales magnéticamente reactivos. Se puede elegir una intensidad o gradiente del campo, o ambos, que sean óptimos para un ensayo concreto y reactivos de ensayo concretos, permitiendo de ese modo la corrección de la variabilidad lote a lote en otros reactivos, o en la unión selectiva de ciertos subconjuntos de reactivos o complejos a fin de obtener resultados de ensayo más precisos. Se comprenderá que las ventajas mencionadas permiten que los ensayos sean más fácilmente adaptados para controlar mediante ordenador.

Los protocolos siguientes representan ejemplos de un formato de ensayo sándwich y un formato de ensayo competitivo indirecto utilizando la detección asistida magnéticamente de un reactivo magnéticamente sensible. Con respecto a esto, los protocolos siguientes, y los protocolos contemplados por la presente invención, pueden ser ejecutados en cualquier orden de etapas o, alternativamente, de una manera simultánea.

Protocolo A

(1) Un primer miembro de unión específica, que tiene un sitio de unión capaz de unirse a un primer sitio de unión en el analito de interés, es unido a un material magnéticamente reactivo para formar un reactivo magnéticamente sensible;

(2) un segundo miembro de unión específica, que tiene un sitio de unión capaz de unirse a un segundo sitio de unión en el analito de interés, es unido a una fase sólida móvil para formar un reactivo en fase sólida móvil;

(3) se pone una muestra de ensayo en contacto con el reactivo en fase sólida móvil para formar una primera mezcla de reacción, por lo que el analito de interés se llega a unir al reactivo en fase sólida móvil;

(4) se pone la primera mezcla de reacción en contacto con el reactivo magnéticamente sensible para formar una segunda mezcla de reacción, por lo que el reactivo magnéticamente sensible forma un complejo con el reactivo en fase sólida móvil y el analito, uniéndose al analito unido (la proporción de reactivo magnéticamente sensible que forma un complejo con el reactivo en fase sólida móvil y el analito está directamente relacionada con la cantidad de analito en la muestra de ensayo);

(5) la segunda mezcla de reacción es sometida a un detector;

(6) la segunda mezcla de reacción es expuesta a un campo magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética sobre el complejo de reactivo magnéticamente sensible, reactivo en fase sólida móvil y analito, la influencia de esta fuerza estado manifestada por el movimiento o captura de los complejos de reactivo magnéticamente sensible-analito-reactivo en fase sólida móvil a una velocidad diferente de la del reactivo magnéticamente sensible sin acomplejar o la del reactivo en fase sólida móvil sin acomplejar, y se determina el grado de manifestación mediante el detector; y

(7) el grado medible de la manifestación proporciona una medida de la cantidad de reactivo magnéticamente sensible que se ha incorporado en los complejos.

\vskip1.000000\baselineskip

Protocolo B

(1) Un primer miembro de unión específica, que tiene un sitio de unión (primer sitio de unión) capaz de unirse a un sitio de unión en el analito de interés (segundo sitio de unión), es unido a un material magnéticamente reactivo para formar un reactivo magnéticamente sensible;

(2) un segundo miembro de unión específica, que tiene un sitio de unión (tercer sitio de unión) capaz de unirse al primer sitio de unión, es unido a un material en fase sólida móvil para formar un reactivo en fase sólida móvil;

(3) se pone una muestra de ensayo en contacto con el reactivo magnéticamente sensible para formar una primera mezcla de reacción, por lo que el analito de interés se llega a unir al reactivo magnéticamente sensible;

(4) se pone la primera mezcla de reacción en contacto con el reactivo en fase sólida móvil para formar una segunda mezcla de reacción, por lo que el reactivo magnéticamente sensible se llega a unir al reactivo en fase sólida móvil uniéndose al segundo miembro de unión específica (la proporción de reactivo magnéticamente sensible que se llega a unir al reactivo en fase sólida móvil está inversamente relacionada con la cantidad de analito en la muestra de ensayo);

(5) la segunda mezcla de reacción es sometida a un detector;

(6) la segunda mezcla de reacción es expuesta a un campo magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética sobre el complejo de reactivo magnéticamente sensible unido a la fase sólida, la influencia de esta fuerza estado manifestada por el movimiento o captura de los complejos, conteniendo el reactivo magnéticamente sensible y el reactivo en fase sólida móvil, a una velocidad diferente de la del reactivo magnéticamente sensible sin acomplejar o la del reactivo en fase sólida móvil sin acomplejar, y se determina el grado de manifestación mediante el detector; y

(7) el grado de la manifestación proporciona una medida de la cantidad de reactivo magnéticamente sensible que se ha incorporado en los complejos.

La Fig 1 ilustra las reacciones de unión del Protocolo B. La Fig 1 ilustra esquemáticamente la unión de un reactivo magnéticamente sensible 2 (por ejemplo, ferrofluido) a un reactivo en fase sólida móvil 4 (por ejemplo, látex-polipirrol) para producir un complejo 6 con propiedades magnéticas alteradas. Una partícula de ferrofluido, que no sea un complejo, no respondería tan rápidamente a un campo magnético aplicado como lo haría un complejo conteniendo una multiplicidad de partículas de ferrofluido.

En el Protocolo A o el Protocolo B, se puede invertir el orden de las etapas 5 y 6.

Las siguientes formas de realización ejemplifican cómo se debe utilizar el método de la presente invención para realizar inmunoensayos.

\vskip1.000000\baselineskip

Forma de Realización 1

Las Figs 2 y 3 ilustran esquemáticamente la medición magnéticamente asistida de la unión de un reactivo magnéticamente sensible a un reactivo en fase sólida móvil (por medio del analito), y sigue sustancialmente el Protocolo A después de que la reacción haya sido sometida a un detector (etapa 6 del Protocolo A).

Como se muestra en la Fig 2, el recipiente de reacción 10 contiene una mezcla de reacción 12, la cual comprende el analito 14, una suspensión de partículas de reactivo en fase sólida móvil 16, y partículas de reactivo magnéticamente sensible 18. La mezcla de reacción 12 es sometida al detector 20, poniendo el recipiente de reacción 10 sobre, o fijando el recipiente de reacción 10 a, un soporte 22. El soporte 22 descansa sobre el detector 20. El detector 20 puede ser una típica microbalanza de carga superior, teniendo una cazoleta 26 que recibirá el soporte 22. Una vez que la cazoleta 26 reciba el soporte 22, y el soporte 22 reciba el recipiente de reacción 10, se puede tarar el detector 20 o ajustar al equilibrio (puesto a cero).

Como se muestra en la Fig 3, está puesto un imán 28 cerca del fondo del recipiente de reacción 10, por lo que el campo magnético ejerce una fuerza sobre el reactivo magnéticamente sensible en la mezcla de reacción 12. Generalmente, el imán 28 está fijado a un brazo 30, lo que permite ajustes precisos del movimiento del imán 28 hacia y lejos del recipiente de reacción 10. El campo magnético puede ser suministrado mediante un imán permanente o un electroimán, y puede ser aplicado intermitente o continuamente. Se puede utilizar un electroimán a fin de que se pueda cambiar el campo magnético, siendo desconectado y encendido antes de mover el imán 28 o el recipiente de reacción 10. También se puede controlar el electroimán mediante un ordenador, proporcionando de ese modo los ajustes finos de la intensidad del campo magnético. Además, se puede utilizar un electroimán para generar un campo magnético alterno, el cual puede proporcionar la ventaja adicional de provocar la mezcla del reactivo magnéticamente sensible en la mezcla de reacción 12, si se desea tal mezcla.

La fuerza ejercida sobre el reactivo magnéticamente sensible en el recipiente de reacción 10 se manifiesta como un cambio aparente en el peso del recipiente de reacción, el cual es registrado en la pantalla 32 del detector 20. La fuerza magnética que se ejerce sobre una partícula del reactivo en fase sólida móvil, que tiene más de una partícula de reactivo magnéticamente sensible unido a ella (por medio del analito), es mayor que la fuerza ejercida sobre una partícula de reactivo en fase sólida móvil solo o sobre una partícula de reactivo magnéticamente sensible solo. Por consiguiente, los complejos 34 comprendiendo el reactivo en fase sólida móvil, el analito, y el reactivo magnéticamente sensible se mueven más rápidamente en el campo que lo hacen las partículas individuales de reactivo magnéticamente sensible. La fuerza de atracción entre los complejos 34 y el imán 28 origina una fuerza a ejercer sobre el recipiente de reacción 10 y, de este modo, sobre el soporte 22 en la misma dirección debido a la gravedad, la cual es registrada en la pantalla 32 del detector 20 como un aumento del peso aparente. A medida que los complejos 34 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible migran hacia el fondo del recipiente de reacción 10, y por lo tanto se mueven más cerca del imán 28, aumenta la fuerza entre los complejos 34 y el imán 28, acelerando además el movimiento de los complejos 34. A medida que los complejos 34 alcanzan el fondo del recipiente de reacción 10 y se acumulan allí, ejercen su máxima fuerza sobre el recipiente de reacción 10 y su soporte 22 debido a su proximidad al imán. Este fenómeno aumenta además el peso aparente del recipiente de reacción 10, como es indicado por la lectura de la pantalla. La velocidad a la que los complejos 34 llegan al fondo del recipiente de reacción 10, y por lo tanto la velocidad de cambio del peso aparente registrada por el detector 20, es una medida del grado de unión entre el reactivo en fase sólida móvil, el analito, y el reactivo magnéticamente sensible, y por lo tanto, de la cantidad de analito presente en la mezcla de reacción. Esta velocidad puede ser registrada, como un cambio del peso aparente en función del tiempo, en un dispositivo registrador convencional. El cambio de peso aparente es una medida de la cantidad de analito en la mezcla de ensayo.

\vskip1.000000\baselineskip

Forma de Realización 2

Las Figs 4 y 5 son vistas esquemáticas de un método alternativo para la medición de la unión de un reactivo magnéticamente sensible a un reactivo en fase sólida móvil (por medio del analito), y sigue sustancialmente el Protocolo A después de que la mezcla de reacción haya sido colocada sobre un detector (etapa 6 del Protocolo A).

Como se muestra en la Fig 4, el recipiente de reacción 100 contiene una mezcla de reacción 102, la cual consta del analito 104, una suspensión de partículas de un reactivo en fase sólida móvil 106, y partículas de un reactivo magnéticamente sensible 108. En la Fig 4, la mezcla de reacción es sometida a un detector 110, poniendo el recipiente de reacción 100 sobre, o fijando el recipiente de reacción 100 a, un soporte 112. El soporte 112 posiciona el recipiente de reacción 100 encima del detector 110. Como detector 110 se puede utilizar una típica microbalanza de carga superior, con una cazoleta sensible al peso 116. En la cazoleta 116 está situado el imán 118, por debajo de la posición del recipiente de reacción 100. Antes de que el recipiente de reacción 100 sea colocado en el soporte 112, o antes o justo después de que se coloque la mezcla de reacción en el recipiente de reacción 100, se puede tarar el detector 110 o ajustar al equilibrio (puesto a cero).

La Fig 4 muestra el procedimiento justo después de que el recipiente de reacción 100 haya sido colocado sobre en el soporte 112. El campo magnético producido por el imán 118 ejerce una fuerza sobre el reactivo magnéticamente sensible en la mezcla de reacción 102, en la dirección del imán, y una fuerza correspondiente es ejercida sobre el imán en la dirección del reactivo magnéticamente sensible. La fuerza ejercida sobre el imán tiende a contrarrestar la fuerza ejercida sobre él debido a la gravedad, produciendo un cambio en la respuesta del detector 110. Esta respuesta inicial del detector es debida a la fuerza entre el imán y el reactivo magnéticamente sensible en sus posiciones iniciales. Si en este momento la balanza está puesta a cero, esta respuesta inicial se convertirá en parte del peso de la tara de la balanza, y el detector 110 mostrará la lectura cero. En la pantalla 120 se puede observar la respuesta del detector 110.

El campo magnético producido por el imán 118 ejerce una fuerza sobre el reactivo magnéticamente sensible en la mezcla de reacción 102. La fuerza magnética que se ejerce sobre una partícula del reactivo en fase sólida móvil, que tiene más de una partícula del reactivo magnéticamente sensible unido a ella (por medio del analito), es mayor que la fuerza ejercida sobre una partícula de reactivo en fase sólida móvil solo o sobre una partícula de reactivo magnéticamente sensible solo. Por consiguiente, los complejos 122 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible se mueven más rápidamente en el campo magnético que lo hacen las partículas individuales de reactivo magnéticamente sensible. A medida que los complejos 122 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible migran hacia el fondo del recipiente de reacción 100, y por lo tanto se mueven más cerca del imán 118, aumenta la fuerza entre los complejos 122 y el imán 118, acelerando además el movimiento de los complejos. Como se muestra en la Fig 5, a medida que los complejos 122 alcanzan el fondo del recipiente de reacción 100 y se acumulan allí, ejercen su máxima fuerza sobre el imán 118, disminuyendo además el peso aparente del imán 118, como se indica por un cambio en la lectura del detector. La velocidad a la que los complejos 122 llegan al fondo del recipiente de reacción 100, y por lo tanto la velocidad de cambio del peso aparente registrada por el detector 110, es una medida del grado de unión entre el reactivo en fase sólida móvil, el analito, y el reactivo magnéticamente sensible, y por lo tanto, de la cantidad de analito presente en la mezcla de reacción. Esta velocidad puede ser registrada, como un cambio del peso aparente en función del tiempo, en un dispositivo registrador convencional. Cualquier cambio final en la respuesta del detector después de que todos los complejos hayan migrado hacia el fondo del recipiente de reacción 100, o la velocidad de cambio de la respuesta del detector durante la migración de los complejos, puede ser utilizado para medir la cantidad de analito presente en la mezcla de reacción y, de este modo, en la mezcla de ensayo original. En la Fig 5, las flechas dentro de la figura representan la fuerza entre los complejos y el imán.

\vskip1.000000\baselineskip

Forma de Realización 3

La Fig 6 y Fig 7 son vistas esquemáticas de un método alternativo para la medición de la unión de un reactivo magnéticamente sensible a un reactivo en fase sólida móvil (por medio del analito), y sigue sustancialmente el Protocolo A después de que la mezcla de reacción haya sido colocada sobre un detector (etapa 6 del Protocolo A).

Como se muestra en la Fig 6, el recipiente de reacción 200 contiene una mezcla de reacción 202, la cual consta del analito 204, una suspensión de partículas de un reactivo en fase sólida móvil 206, y partículas de un reactivo magnéticamente sensible 208. La mezcla de reacción es sometida a un detector 210, poniendo el recipiente de reacción 200 sobre, o fijando el recipiente de reacción 200 a, un soporte 212. El soporte 112 posiciona el recipiente de reacción 200 encima de un sensor 214, el cual consta de un diafragma de material flexible 216 que tiene un imán 218 unido en él. El diafragma de material flexible 216 está apoyado sobre una base 220. El detector 210 consta de un transductor de efecto Hall 222, que está colocado debajo del diafragma de material flexible 216. La detección se lleva a cabo monitorizando la salida de un circuito electrónico conectado al transductor de efecto Hall 222. Los cambios en la fuerza sobres el imán 218 producen cambios en su posición con respecto al transductor de efecto Hall 222, debido a la flexión del diafragma 216. Este, a su vez, produce un cambio en el campo magnético percibido por el transductor de efecto Hall 222, el cual se manifiesta por un cambio en la salida del circuito electrónico. La Fig 6 muestra el procedimiento justo después de que el recipiente de reacción 200 haya sido colocado sobre el soporte 212 y puesto a cero el detector.

El imán 218, unido al diafragma 216, está situado cerca del recipiente de reacción 200, por lo que el campo magnético ejerce allí dentro una fuerza sobre el reactivo magnéticamente sensible. Por consiguiente, los complejos 224 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible se mueven más rápidamente en el campo magnético que lo hacen las partículas individuales de reactivo magnéticamente sensible. A medida que los complejos 224 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible migran hacia el fondo del recipiente de reacción 200, y por lo tanto se mueven más cerca del imán 218, aumenta la fuerza entre los complejos 224 y el imán 218, acelerando además el movimiento de los complejos 224. Como se muestra en la Fig 7, a medida que los complejos 224 alcanzan el fondo del recipiente de reacción 200 y se acumulan allí, ejercen su máxima fuerza de atracción sobre el imán 218. Esta fuerza es, a su vez, ejercida sobre el diafragma 216, causando que se flexione y desplace el imán 218 lejos del transductor 222. El grado de desplazamiento desde la posición original del imán 218 depende de la cantidad de reactivo magnéticamente sensible unido al reactivo en fase sólida móvil (por medio del analito), y se manifestará como una alteración en la señal producida por el circuito electrónico. La velocidad a la que los complejos 224 llegan al fondo del recipiente 200, y por lo tanto la velocidad de cambio de la señal registrada por el circuito del transductor, es una medida del grado de unión entre el reactivo en fase sólida móvil, el analito, y el reactivo magnéticamente sensible, y por lo tanto de la cantidad de analito presente en la mezcla de reacción. Esta velocidad puede ser registrada, como un cambio del peso aparente en función del tiempo, en un dispositivo registrador. En la pantalla 226 se puede ver la velocidad de cambio de la señal. Cualquier cambio final en la respuesta del detector después de que todos los complejos hayan migrado hacia el fondo del recipiente de reacción 200, o la velocidad de cambio de la respuesta del detector durante la migración de los complejos, puede ser utilizado para medir la cantidad de analito presente en la mezcla de reacción y, de este modo, en la mezcla de ensayo original. E dispositivo de esta forma de realización se puede fabricar para que funcione en cualquier orientación espacial.

Además del transductor de efecto Hall 222, se pueden utilizar otros dispositivos de medición por proximidad. Los ejemplos representativos de tales dispositivos abarcan dispositivos ópticos donde un haz de luz es reflejado desde el fondo del diafragma 216 sobre un detector, un desplazamiento del diafragma causando una alteración en la intensidad de la luz que choca contra el detector. También se pueden utilizar dispositivos ópticos que midan el cambio en modelos de interferencia de luz reflejada a partir del diafragma, en función de la distancia o distorsión de la posición. También se pueden utilizar métodos no ópticos para determinar los cambios en la posición o forma del diafragma, tales como los sensores capacitivos comúnmente empleados como detectores de proximidad. En lugar del diafragma, se pueden utilizar otros elementos flexibles tales como bandas, muelles, brazos en voladizo, y otros. En la Fig 7, las flechas dentro de la figura representan la fuerza entre los complejos y el imán.

\vskip1.000000\baselineskip

Forma de Realización 4

La Fig 8 y Fig 9 son vistas esquemáticas de un método alternativo para la medición de la unión de un reactivo magnéticamente sensible a un reactivo en fase sólida móvil (por medio del analito), y sigue sustancialmente el Protocolo A después de que la mezcla de reacción haya sido colocada sobre un detector (etapa 6 del Protocolo A).

Como se muestra en la Fig 8, el recipiente de reacción 300 contiene una mezcla de reacción 302, la cual consta del analito 304, una suspensión de partículas de un reactivo en fase sólida móvil 306, y partículas de un reactivo magnéticamente sensible 308. En la Fig 8, la mezcla de reacción es sometida a un detector 310, poniendo el recipiente de reacción 300 sobre, o fijando el recipiente de reacción 300 a, un sensor 312. El sensor 312 consta de un diafragma de material flexible 314. El diafragma de material flexible 314 está apoyado sobre una base 316. La detección se lleva a cabo por medio de una fuente de luz 318 y un sensor óptico 320. La luz procedente de la fuente de luz 318 es reflejada, desde un sitio reflexivo 321 en el diafragma 314, sobre el sensor óptico 320. Cualquier derivación en la posición del diafragma 314 produce un desplazamiento de posición o deflexión de la luz reflejada que choca contra el sensor óptico 320, de ese modo causando un cambio en la salida del sensor óptico 320. Se comprende que el diafragma mismo 314 puede servir como medio para percibir la posición, siendo reflejada la luz directamente fuera de la superficie inferior del diafragma 314.

Como se muestra en la Fig 9, está puesto un imán 322 cerca del diafragma 314, por lo que el campo magnético ejerce una fuerza sobre el reactivo magnéticamente sensible en la mezcla de reacción. Por consiguiente, los complejos 326 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible se mueven más rápidamente en el campo magnético que lo hacen las partículas individuales de reactivo magnéticamente sensible. A medida que los complejos 326 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible migran hacia el fondo del recipiente de reacción 300, y por lo tanto se mueven más cerca del imán 322, aumenta la fuerza entre los complejos 326 y el imán 322, acelerando además el movimiento de los complejos 326. A medida que los complejos 326 alcanzan el fondo del recipiente de reacción 300 y se acumulan allí, ejercen su máxima fuerza de atracción sobre el imán 322. Esta fuerza es, a su vez, ejercida sobre el diafragma 314, causando que se flexione. El grado de desplazamiento o distorsión desde la posición original del diafragma 314 depende, en gran parte, del grado de unión entre el reactivo magnéticamente sensible, el analito, y el reactivo en fase sólida móvil, y por lo tanto de la cantidad de analito presente en la mezcla de reacción. El grado de unión se puede medir por el detector 310. Se comprenderá que el recipiente de reacción 300 puede estar permanentemente fijado al diafragma flexible 314, y reutilizado sacando y reemplazando la mezcla de reacción 302. También se comprenderá que el recipiente de reacción 300 o el diafragma flexible 314 puedan se desechables. También se comprenderá que el soporte flexible necesite estar en forma de diafragma. Se puede utilizar cualquier soporte flexible o desplazable tal como, por ejemplo, brazos en voladizo, tirantes elásticos, muelles o dispositivos que floten.

Se comprenderá que el mismo material flexible pueda servir como recipiente de reacción, siendo la mezcla de reacción colocada directamente en él. Se comprenderá adicionalmente que el material flexible pueda ser de una configuración tal que forme sitios en los que se pudiese contener la mezcla de reacción. También se comprenderá que el material flexible puede ser una red que se pueda mover a lo largo del sensor. En la Fig 9, las flechas dentro de la figura representan la fuerza entre los complejos y el imán.

\vskip1.000000\baselineskip

Forma de Realización 5

La Fig 10 y Fig 11 son vistas esquemáticas de otros métodos para la medición de la unión de un reactivo magnéticamente sensible a un reactivo en fase sólida móvil (por medio del analito), y sigue sustancialmente el Protocolo A después de que la mezcla de reacción haya sido colocada sobre un detector (etapa 6 del Protocolo A).

Como se muestra en la Fig 10, el recipiente de reacción 400 consta de un pocillo 402 que tiene una tapa 404. El pocillo 402 contiene una mezcla de reacción 406. Si está presente el analito 408, una porción del reactivo magnéticamente sensible 410 se une al reactivo en fase sólida móvil 412 para formar complejos 414 (por medio del analito). El pocillo 402 está colocado sobre o fijado a un dispositivo sensor de fuerzas, tal como una balanza 416 que tiene una cazoleta 418, el cual recibe el pocillo 402. Una vez que la balanza 416 recibe el pocillo 402, la balanza 416 puede ser puesta a cero.

Como se muestra en la Fig 11, está puesto un imán 420 cerca de la tapa 404, por lo que el campo magnético ejerce una fuerza sobre el reactivo magnéticamente sensible dentro del pocillo 402. Bajo la influencia de esta fuerza, los complejos 414 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible migran hacia la cara inferior de la tapa 404, donde la fuerza magnética es más intensa debido a la más cercana proximidad al imán 420. El reactivo magnéticamente sensible no unido 410 se mueve más lentamente bajo este nivel de intensidad del campo magnético que lo hacen los complejos 414, y tarda más tiempo en alcanzar la cara inferior de la tapa 404. A medida que los complejos 414 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible se acumulan en la cara inferior de la tapa 404, producen una fuerza hacia arriba contra ella, contrarrestando la fuerza de gravedad y causando una disminución en el peso aparente del pocillo 402, el cual es registrado en la pantalla 422 de la balanza 416. La velocidad a la que los complejos 414 llegan a la cara inferior de la tapa 404, y por lo tanto la velocidad del cambio de peso aparente registrado por la balanza 416, es también una medida del grado de unión entre el reactivo en fase sólida móvil, el analito, y el reactivo magnéticamente sensible, y por lo tanto también es una medida de la cantidad de analito presente en la mezcla de reacción. Esta velocidad puede ser registrada, como un cambio del peso aparente en función del tiempo, en un medio registrador. Este método también se puede aplicar utilizando recipientes de reacción con la parte superior abierta, la tensión superficial de la mezcla de reacción sirviendo para el mismo propósito que la tapa. La velocidad aparente de cambio del peso del pocillo 402 será rápida a lo primero, pero diminuirá a medida que sean capturados todos los complejos. El cambio total en el peso en este momento puede ser utilizado para medir la cantidad de analito en la mezcla de reacción. En la Fig 11, las flechas dentro de la figura representan la fuerza entre los complejos y el imán. Alternativamente, se podría sujetar el imán 420 a una balanza de manera que se podrían medir los cambios en la fuerza ejercida por los complejos sobre el imán.

\vskip1.000000\baselineskip

Forma de Realización 6

Las Figs 12 y 13 ilustran un detector alternativo para la medición de la unión de un reactivo magnéticamente sensible a un reactivo en fase sólida móvil (por medio del analito), y sigue sustancialmente el Protocolo A después de que la mezcla de reacción haya sido colocada sobre un detector (etapa 6 del Protocolo A).

Como se muestra en la Fig 12, y más detalladamente en la Fig 13, el recipiente de reacción 500 consta de un pocillo 502 que contiene una mezcla de reacción 503 constando de partículas de un reactivo magnéticamente sensible 504, de un reactivo en fase sólida móvil 506 y, si estuviese presente, de un analito 508. Como mínimo, una porción del reactivo magnéticamente sensible 504 se une a las partículas del reactivo en fase sólida móvil 506 (por medio del analito 508). La mezcla de reacción 503 es sometida a un detector 510, poniendo el recipiente de reacción 500 dentro de, o fijando el recipiente de reacción 500 a, un primer soporte 512. El soporte 512 sirve para colocar el recipiente de reacción 500 cerca de un imán 514, el cual está sujeto a un segundo soporte 516. El segundo soporte 516 tiene un filo de cuchilla 518 que descansa sobre una superficie sólida 520, y un brazo lateral 522 que sobrevuela la cazoleta 524 de una balanza 526. El segundo soporte 516 está situado de tal forma que está libre para pivotar sobre el filo de cuchilla 518, y está mantenido únicamente en su posición vertical por el apoyo del brazo lateral 522, sobre la cazoleta 524 de la balanza 526 mediante un tornillo de ajuste 527. Una vez que los soportes 512 y 516 están colocados, la balanza 526 se puede tarar o ajustar a equilibrio (puesta a cero).

Después, se coloca el pocillo 512 dentro de, o se fija al, soporte 512, de ese modo poniéndolo cerca del imán 514, por lo que el campo magnético ejerce una fuerza sobre el reactivo magnéticamente sensible dentro del pocillo 502. Bajo la influencia de esta fuerza, los complejos 528 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible migran hacia el lateral del pocillo 502 donde la atracción magnética es más intensa, debido a la más cercana proximidad al imán 514. El reactivo magnéticamente sensible 504 no unido se mueve más lentamente bajo este nivel de intensidad del campo magnético, y tarda más tiempo en alcanzar el lateral del pocillo 502.

Los complejos 528 de reactivo magnéticamente sensible, analito, y reactivo en fase sólida móvil producen una fuerza sobre el imán 514 dirigida lateralmente hacia el pocillo 502. Esta fuerza contrarresta la fuerza del brazo lateral 522 del apoyo del segundo soporte 516 sobre la cazoleta 524 de la balanza 526, produciendo una disminución en el peso aparente del brazo lateral 522 reportada por la balanza 526. La fuerza ejercida sobre el imán no es suficiente para mover sustancialmente el segundo soporte 516, pero suficiente solamente para disminuir su apoyo sobre la cazoleta 524 de la balanza. Están también disponibles dispositivos balanza que mantienen la posición de la cazoleta sin hacer caso del apoyo sobre ella. También se comprenderá que el concepto de esta forma de realización no está restringido al empleo de balanzas. Se puede utilizar cualquier dispositivo medidor de fuerzas, incluyendo aquellos descritos anteriormente, esto es, aquellos que utilizan soportes flexibles y sensores ópticos y otros de posicionamiento. La velocidad a la que los complejos 528 llegan al lateral del pocillo 502, y por lo tanto la velocidad de cambio del peso aparente registrado por la balanza 526, es una medida del grado de unión entre el reactivo en fase sólida móvil, el analito, y el reactivo magnéticamente sensible, y por lo tanto de la cantidad de analito presente en la mezcla de reacción. Esta velocidad puede ser registrada, como un cambio del peso aparente en función del tiempo, en un medio registrador.

\vskip1.000000\baselineskip

Forma de Realización 7

Como forma de realización adicional de la presente invención, las Figs 14A y 14B ilustran un dispositivo de inmunoensayo autoejecutable para realizar ensayos analíticos. El dispositivo 600 consta de un canal capilar 602 que tiene uno o más sitios magnéticos 604. La mezcla de reacción 606 es atraída por el canal 602 mediante capilaridad. La mezcla de reacción contiene un reactivo magnéticamente sensible 610, el analito 612, y un reactivo en fase sólida móvil 614. A medida que la mezcla de reacción 606 fluye por el canal 602, pasa sobre el sitio o sitios magnéticos 604, en las cuales posiciones el complejo 616 de reactivo en fase sólida móvil 614, analito 612, y reactivo magnéticamente sensible 610 se acumulan preferentemente contra la pared del canal 602. En algunas aplicaciones, puede ser ventajoso elegir la intensidad o gradiente del campo magnético en el sitio(s) magnético, o el tamaño y composición del reactivo magnéticamente sensible, a fin de que el reactivo magnéticamente sensible se acumule si no está unido o forme un complejo con el reactivo en fase sólida móvil. La presencia o amplitud de esta acumulación de reactivo en fase sólida móvil se puede medir de diversas formas.

En una forma de realización preferida de esta invención, se fabrican partículas de reactivo en fase sólida móvil 614 o partículas de reactivo magnéticamente sensible 610 para que la acumulación de los complejos 616 de reactivo en fase sólida móvil 614, analito 612, y reactivo magnéticamente sensible 610, en el sitio o sitios magnéticos 604, origine que se establezcan resultados visibles. Sin embargo, se comprenderá que la acumulación de los complejos 616 se pueda detectar o medir por emisión de la fluorescencia, reflexividad, densitometría, actividad enzimática o cualquiera de los otros métodos de las otras formas de realización descritas aquí, o por otros medios.

En una forma de realización particularmente preferida, el sitio magnético 604 puede ser una cinta grabadora magnética o una banda magnética similar a la encontrada en una tarjeta de crédito convencional. El sitio magnético 604 también sirve como superficie interior del canal capilar 602. sitio(s) magnético 604 puede ser individual o múltiple, de formas diversas, y de intensidades o gradientes de campo que difieran para que los complejos de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible, que tengan diferentes proporciones de reactivo en fase sólida móvil y reactivo magnéticamente sensible, sean capturados en un sitio(s) 604 diferente, como indicación de la concentración de analito en la muestra de ensayo.

Se pueden elegir las intensidades, gradientes, tamaños y formas del campo del sitio(s) magnético, así como el tamaño, forma y composición del reactivo magnéticamente sensible para optimizar los resultados cualitativos, por ejemplo positivo/negativo, o los resultados más cuantitativos, por ejemplo semicuantitativos. Por ejemplo, a lo largo del fondo del canal capilar ilustrado en las Figs 14A y 14B se podrían codificar una serie de sitios de captura magnéticos idénticos. Cada sitio podría ser codificado a fin de que tuviese una capacidad limitada para unirse a los complejos constando de reactivo magnéticamente sensible y de reactivo en fase sólida móvil. A medida que la mezcla de reacción progrese corriente abajo a través del canal, los complejos encontrarían primeramente, corriente arriba, la mayor parte de los sitios de captura magnéticos de la serie y se acumularían allí. En una mezcla de reacción conteniendo pocos complejos, únicamente la mayor parte de los sitios de captura magnéticos corriente arriba mostraría acumulación de complejos. Sin embargo, si hubiese suficientes complejos para saturar la mayor parte de los sitios de captura magnéticos corriente arriba, los complejos adicionales fluirían mas allá del sitio, para ser acumulados en la siguiente mayor parte corriente arriba de los sitios de captura magnéticos, y así sucesivamente. Entonces, el número de sitios de captura magnéticos que muestren acumulación de complejos serviría como medida del alcance de la formación de complejos en la mezcla de reacción, y por lo tanto de la concentración de analito en la muestra de ensayo.

Alternativamente, en ciertos formatos de ensayo, la concentración de analito en la mezcla de reacción se puede manifestar por el número de partículas de reactivo magnéticamente sensible unidas a cada partícula de reactivo en fase sólida móvil, antes que por el alcance de la formación de complejos. En estos casos, en el fondo del canal capilar se pueden codificar múltiples sitios de captura magnéticos que difieran en la intensidad o gradiente del campo magnético, o en ambos. Cada combinación de intensidad/gradiente del campo mostraría una preferencia para atraer complejos con una proporción concreta de reactivo magnéticamente sensible a reactivo en fase sólida móvil. Por ejemplo, a medida que progresase la mezcla de reacción corriente abajo a lo largo del canal, los complejos podrían encontrar en primer lugar el sitio de captura magnético que tuviese la intensidad de campo más débil. Este sitio capturaría solamente aquellos complejos que tuvieran una alta proporción de reactivo magnéticamente sensible a reactivo en fase sólida móvil. Los sitios de captura magnéticos posteriores incrementarían progresivamente en intensidad del campo, de ese modo siendo capaces de capturar complejos que tuviesen menores y menores proporciones de reactivo magnéticamente sensible a reactivo en fase sólida móvil. En este caso, qué sitios de captura magnéticos de la serie muestren acumulación de complejos será una indicación de cómo de extensa ha sido la acumulación de reactivo magnéticamente sensible, y por consiguiente, cuanto analito estaba presente en la muestra de ensayo. Se comprenderá que la acumulación de los complejos se puede detectar o medir visualmente o por emisión de la fluorescencia, reflexividad, densitometría, actividad enzimática, o cualquiera de los métodos de las otras formas de realización descritas aquí, o por otros medios. Esta forma de realización proporciona un pequeño dispositivo analítico portátil, potencialmente desechable, que no necesita energía eléctrica.

En otra forma de realización de la presente invención, la cual emplea un dispositivo como el ilustrado en las Figs 14A y 14B, el piso del canal capilar está fabricado de material ópticamente absorbente. El reactivo en fase sólida móvil muestra propiedades ópticas (reflectancia, color, fluorescencia, quimioluminiscencia, u otras) que proporcionan contraste al canal capilar ópticamente absorbente en proporción al alcance de la acumulación del reactivo en fase sólida móvil. De esta manera, se pueden enmascaran las propiedades ópticas del reactivo en fase sólida móvil, lo cual es una propiedad especialmente útil en formatos donde el reactivo magnéticamente sensible sea siempre capturado en el sitio de captura magnético.

\vskip1.000000\baselineskip

Forma de Realización 8

En otra forma de realización de la presente invención, las Figs 15A y 15B ilustran un dispositivo para inmunoensayos autoejecutables para realizar ensayos analíticos. El dispositivo 700 consta de un elemento 702 que tiene una superficie plana 704 conteniendo uno o más sitios magnéticos 706. Se pone una mezcla de reacción 708 en contacto con la superficie 704 o con una capa de material cubriendo la superficie 704. La mezcla de reacción 708 contiene un reactivo magnéticamente sensible 710, el analito 712, y un reactivo en fase sólida móvil 714. Los complejos 716 de reactivo en fase sólida móvil 714, analito 712 y reactivo magnéticamente sensible 710 migran de manera preferente y se acumulan en los sitios magnéticos 706. En algunas aplicaciones, puede ser ventajoso elegir la intensidad o gradiente del campo magnético en el sitio(s) de captura magnético, o el tamaño y composición del reactivo magnéticamente sensible, a fin de que el reactivo magnéticamente sensible se acumule si no está unido o formado en un complejo el reactivo en fase sólida móvil. La presencia o alcance de esta acumulación de reactivo en fase sólida móvil se puede medir de diversas formas.

En una forma de realización preferida de esta invención, se fabrican partículas de reactivo en fase sólida móvil 714 o partículas de reactivo magnéticamente sensible 710 para que, cuando los complejos 716 de reactivo en fase sólida móvil 714, analito 712 y reactivo magnéticamente sensible 710 se acumulen en el sitio magnético 706, se forme un resultado visible. La forma, color, densidad, alcance, posición, etc., sirven como medida de la presencia o cantidad de analito en la mezcla de ensayo. Los sitios magnéticos 706 pueden ser individuales o múltiples, de formas diversas, y de intensidades o gradientes de campo diferentes, a fin de que los complejos de reactivo en fase sólida móvil, analito y reactivo magnéticamente sensible, que tengan diferentes proporciones de reactivo en fase sólida móvil y reactivo magnéticamente sensible, sean capturadas en sitios 706 diferentes como indicación de la concentración de analito en la muestra de ensayo. Se comprenderá que la acumulación de complejos se pueda detectar o medir por emisión de la fluorescencia, reflexividad, densitometría, actividad enzimática o cualquiera de los otros métodos de las otras formas de realización descritas aquí, o por otros medios.

En una forma de realización particularmente preferida, el sitio magnético 706 puede ser una cinta grabadora magnética o una banda magnética similar a la encontrada en una tarjeta de crédito convencional. Esta forma de realización proporciona un pequeño dispositivo analítico portátil, potencialmente desechable, que no necesita energía eléctrica.

\vskip1.000000\baselineskip

Forma de Realización 9

En otra forma de realización de esta invención, los procedimientos descritos aquí se pueden utilizar para determinar las propiedades de materiales magnéticamente reactivos. El tamaño, forma, contenido de magnetita, estado de agregación, y otros factores influirán en la velocidad a la que las partículas de reactivo magnéticamente sensible se moverán en un fluido en respuesta a un campo magnético aplicado. La aplicación de las técnicas de esta invención a muestras de materiales magnéticamente reactivos puede servir como medio para controlar la calidad de estos materiales, así como determinar la cantidad de estos materiales en una muestra desconocida o una muestra de concentración desconocida.

\newpage

Forma de Realización 10

En otra forma de realización de la presente invención, las Figs 16A y 16B ilustran un dispositivo para inmunoensayos autoejecutables para realizar ensayos analíticos. El dispositivo 800 consta de un recipiente de reacción 802 soportado encima de un imán 804. El recipiente de reacción 802 contiene una mezcla de reacción 808, la cual consta de partículas de un reactivo magnéticamente sensible 810, un analito 812, si hubiese, y partículas de un reactivo en fase sólida móvil 814. Si está presente el analito, una porción del reactivo magnéticamente sensible 810 se une al reactivo en fase sólida móvil 814 (por medio del analito) para formar complejos 816. Debido a que la fuerza magnética que es ejercida sobre una partícula de reactivo en fase sólida móvil, que tiene más de una partícula de reactivo magnéticamente sensible unidas a ella (por medio del analito), es mayor que la fuerza ejercida sobre una partícula de reactivo magnéticamente sensible solo, los complejos 816 de reactivo en fase sólida móvil 814, analito 812 y reactivo magnéticamente sensible 810 se moverán más rápidamente en el campo magnético que lo hagan las partículas de un reactivo magnéticamente sensible solo, y son desalojadas de la suspensión.

En una forma de realización preferida de esta invención, se fabrican partículas de reactivo en fase sólida móvil o partículas de reactivo magnéticamente sensible, o ambas, a fin de que cualquiera, o ambas, puedan ser detectadas cuando estén en suspensión. La eliminación de los complejos de la suspensión puede ser detectada visualmente o medida utilizando un dispositivo óptico tal como el mostrado en la Fig 16. A partir de una fuente de luz 820, un haz de luz pasa a través del recipiente de reacción 802 y la mezcla de reacción 808, para alcanzar un detector óptico 822. En la pantalla 824, se pueden ver los resultados de las mediciones de densidad óptica. La cantidad de reactivo en fase sólida móvil 814 o de reactivo magnéticamente sensible 819, o ambos, se determina observando cambios en la densidad óptica, emisión de la fluorescencia, dispersión de luz o cualquier otro método de las otras formas de realización descritas aquí, o por otros medios.

Se comprenderá que, puesto que la presente invención implica la valoración de la fuerza, movimiento, o acumulación manifestados por los complejos de reactivo en fase sólida móvil y reactivo magnéticamente sensible, los diversos métodos de detección y reactivos descritos aquí sean fácilmente adaptados a una operación o sistema automatizado. Sin embargo, tal operación o sistema automatizado no significa excluir la posibilidad de que algunas operaciones del ensayo, en un sistema automatizado, puedan ser realizadas manualmente.

La presente invención será ilustrada ahora mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1 Microbalanza Electrónica Modificada para la Medición de la Fuerza Magnética

Se diseñó y construyó un dispositivo para medir y registrar automáticamente las fuerzas ejercidas sobre un material magnéticamente reactivo por los campos magnéticos aplicados. Se obtuvo una microbalanza electrónica 900, modelo UMT-2, de Mettler-Toledo Inc., Hightstown, N. J. Refiriéndonos ahora a la Fig 17, esta balanza 900 fue modificada en la fábrica para admitir pesos superiores a su intervalo normal. Se produjo un pie de aluminio 902 para reemplazar la cazoleta corriente de la balanza. Se trabajó a máquina un rebaje circular 904 en la parte superior del pie 902, para recibir un imán cilíndrico 906 de neodimio-hierro-boro de 0'25 pulgadas (6'35 mm) de diámetro, obtenido de Cookston Magnets. Se redondeó un extremo del imán cilíndrico de 0'25 pulgadas (6'35 mm) de largo, para darle una ligera forma de bóveda y modificar la forma del campo magnético producido, a fin de que la región de máxima fuerza sobre las partículas magnéticamente reactivas estuviese en el centro de la cara del imán. Se fabricó una tapa de aluminio 908 para la cámara de pesada de la microbalanza, para reemplazar la tapa de vidrio normalmente suministrada. La tapa 908 constaba de un anillo exterior de aluminio 910 teniendo un gran agujero central, el cual soportaba un disco de aluminio 912 que tenía un diámetro más pequeño que el diámetro de la cámara de pesada. El disco 912 estaba penetrado por dos agujeros no roscados 914 y 916, cerca del extremo, y un agujero roscado 920 más grande en el centro. El disco 912 estaba situado en el anillo de fijación 910, de manera que los tornillos de fijación 924 y 926 pasaban a través de cada agujero no roscado 914 y 916, y atornillados sobre los agujeros roscados 928 y 929 en el anillo de fijación 910. El agujero roscado central 920 en el disco 912 acogía una pieza intercalada cilíndrica roscada 930 de aluminio en la que se había taladrado un agujero central 932 de fondo plano, desde la parte superior hacia dentro, a 0'01 pulgadas de la base dejando una delgada "ventana" de aluminio para formar el piso 934 del agujero 932. El agujero central 932 de la pieza intercalada 930 acogía adaptadores cilíndricos de aluminio 936 con agujeros taladrados a través de sus centros 937, para alojar recipientes de ensayo 938 de formas y tamaños diversos. El dispositivo de medición de las fuerzas se ensambló quitando la cazoleta de la balanza y reemplazándola con el pie de aluminio 902. El imán moldeado 906 fue colocado en el rebajo 904 de la parte superior del pie 902, con el extremo redondeado más alto. La tapa de vidrio de la cámara de pesada de la microbalanza fue reemplazada con el anillo exterior de aluminio 910, con el disco de aluminio 912 centrado sobre él. La pieza intercalada roscada de aluminio 930 fue atornillada en el agujero central roscado 920 en el disco 912, y en ella se insertó un adaptador 936 para recipientes de ensayo. La balanza misma, y todas las piezas añadidas estaban conectadas a tierra para evitar cualquier aumento de carga estática.

\vskip1.000000\baselineskip

Interfaz Microbalanza-Ordenador para la Recogida Automatizada de Datos

El dispositivo microbalanza modificada fue conectado con el programa de captación de datos LabVIEIN® de National Instruments Inc., Austin TX, residiendo en un ordenador Macintosh por medio de un cable suministrado por Mettler-Toledo Inc. El programa fue instalado para captar, registrar y mostrar continuamente las lecturas de peso enviadas desde la microbalanza a una velocidad de una lectura cada 0'3 segundos.

Ordenación y Ensayo

El aparato microbalanza 900 fue puesto a cero y se empezó la recogida de datos en el ordenador acoplado. Mediante una pipeta, se transfirió una alícuota de 20 \mul de una suspensión diluida de micropartículas superparamagnéticas, obtenidas de Nippon Paint, a un microtubo de polipropileno, el cual fue colocado después en el soporte de aluminio para recipientes de ensayo sobre la microbalanza, a fin de que la parte inferior del tubo descansase sobre el fondo plano de la pieza intercalada roscada de aluminio 930. Después, la pieza intercalada 930 fue girada en sentido de las agujas del reloj para que provocase que la parte inferior de la pieza intercalada 930 se aproximase a la parte superior del imán 906. Se monitorizó el peso aparente del imán 906 reportado por la balanza 900, y se descubrió que disminuía a medida que la pieza intercalada 930 se aproximaba al imán. Este cambio aparente de peso resultó de la fuerza ejercida por el imán 906 sobre las micropartículas superparamagnéticas en el microtubo, las cuales contrarrestaban la fuerza gravitacional sobre el imán 906. A medida que se continuaba girando la pieza intercalada 930, se alcanzó una posición en la que la parte inferior de la pieza intercalada 930 hizo contacto con la parte superior del imán 906. En este momento, el peso aparente del imán 906 aumentó drásticamente ya que la pieza intercalada 930 ejercía una fuerza descendente sobre él. Después, se invirtió el sentido de rotación de la pieza intercalada 930 hasta que se restituyese el peso aparente del imán 906 observado justo antes de que se hiciese contacto. Luego, la pieza intercalada 930 fue girada diez grados adicionales en el sentido contrario a las agujas del reloj, dejando una separación muy pequeña entre la parte inferior de la pieza intercalada 930 y la parte superior del imán 906. Se aflojaron los tornillos de fijación 924 y 926 que retienen el disco de aluminio 912 conteniendo la pieza intercalada roscada 930 contra el anillo de aluminio 910, y se ajustó horizontalmente el disco 912 hasta que se reportó el mínimo peso aparente por la balanza 900; después, se volvieron a apretar los tornillos de fijación 924 y 926. Después, se repitió el ajuste vertical de la pieza intercalada roscada 930 descrito anteriormente, y se fijó su posición mediante la aplicación de una gota de cemento de goma a las roscas. El resultado de estos ajustes fue posicionar las micropartículas superparamagnéticas en la región de máxima fuerza de atracción vertical a partir del imán 906 siendo pesado por la balanza 900.

Se comprobó la sensibilidad y reproducibilidad del dispositivo balanza utilizando una suspensión al 0'01% (peso/volumen) de micropartículas superparamagnéticas teniendo un diámetro de 0'8 \mum y conteniendo un 30% de magnetita en peso de partícula. Se transfirieron alícuotas, de 20 \mul cada una, a tubos de polipropileno de microcentrífuga de 0'5 cm x 3 cm (Robbins Scientific). El dispositivo balanza fue puesto a cero y se empezó la recogida de datos. Después de 10 segundos, se insertó el primer tubo en el dispositivo. Inmediatamente después de la introducción del tubo, el peso aparente reportado del imán empezó a caer rápidamente (ver Fig 18). Unos 10 segundos después de la introducción, empezó a disminuir la velocidad de cambio de peso hasta que el cambio estuvo casi parado después de unos 30 segundos, siendo el cambio final de peso de 2'4 mg. Al sacar el tubo de microcentrífuga, el peso aparente se restituyó rápidamente a cero. Repitiendo el proceso con dos muestras adicionales, dio resultados sustancialmente idénticos (ver Fig 18).

Ejemplo 2 Preparación de Reactivo Magnéticamente Sensible a partir de Ferrofluido Dispersable Acuoso y un Miembro de Unión Específica Propiedades del Ferrofluido

De Xerox Specialty Materials, Pittsford, NY, se obtuvo un ferrofluido capaz de formar dispersiones acuosas estables. Este material está descrito en los N^{os} de Patente U.S. 5.322.756 y 5.358.659, incorporadas aquí como referencia. El ferrofluido fue suministrado como suspensión acuosa al 60% (peso/volumen). Las partículas de ferrofluido eran superparamagnéticas y comprendían una matriz polimérica en la que estaban incrustados nanocristales monodominio de Fe_{2}O_{3}, los cuales constituían el 27% del peso de la partícula. El tamaño de partícula variaba de partícula a partícula. El diámetro medio de las partículas era de aproximadamente 20 nm. Se reportó que la magnetización de las partículas era de 12'2 emu/g a 6 kilogauss.

El ferrofluido concentrado fue diluido 100 veces con agua, produciendo una suspensión marrón transparente. Se transfirió una alícuota de 5 \mul de ferrofluido diluido a un microtubo de polipropileno, y fue puesto en el dispositivo balanza descrito en el Ejemplo 1. Se observó un cambio rápido de peso de 5'2 mg, equivalente a 104 mg/\mul de ferrofluido no diluido. El ferrofluido diluido fue diluido 16 veces adicionales (1.600 veces en total) en agua, y se analizó una alícuota de 100 \mul en el dispositivo balanza como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Se observó un cambio inmediato de peso de 0'5 mg, seguido por un cambio de peso muy lento hasta un cambio de peso total de 8 mg durante un periodo de 20 horas (ver Fig 19). Este resultado indicó la fuerza muy débil ejercida sobre cada partícula individual de ferrofluido por el campo aplicado. Aunque la fuerza de atracción de los agregados de todas las partículas en el campo es percibida inmediatamente por la balanza, la migración de las partículas a la región de campo y gradiente máximos fue muy lenta, como se indica por el cambio posterior muy lento en peso.

El ferrofluido concentrado fue diluido 100 veces con salino tamponado con fosfato (PBS) conteniendo 0'1% albúmina de suero bovino (BSA), y se aplicó a una columna cromatográfica de 1 cm x 40 cm rellena con medio para filtración en gel "SEPHAROSE® S-300" (Pharmacia Bioteck, límite de exclusión de 1x10^{6} daltons), equilibrada previamente con BSA al 0'1% en PBS, y eluida con el mismo tampón. El ferrofluido eluyó como banda marrón en el volumen excluido de la columna. La separación en una columna de medio para filtración en gel "SEPHACRYL® S-500" (límite de exclusión de 2x10^{7} daltons) produjo que estuviese parcialmente incluido el ferrofluido (ver Fig 20A), mientras que la separación en una columna de medio para filtración en gel "SEPHACRYL® S-1000" (límite de exclusión >10^{8} daltons) produjo que estuviesen incluidas la mayor parte de las partículas, eluyendo como banda ancha más tarde que las micropartículas de 30 \mum de referencia (ver Fig 20B). En la Fig 20B, la curva A representa el reactivo magnéticamente sensible y la curva B representa el reactivo en fase sólida móvil. De esta manera, se pudo subfraccionar el ferrofluido partiendo de la base del tamaño de partícula.

Recubrimiento del Ferrofluido con BSA Biotinilada

Para evaluar la utilidad del ferrofluido en ensayos de unión, el ferrofluido fue recubierto con BSA biotinilada (albúmina bovina marcada con biotinamidocaproílo, Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO). Se mezcló una alícuota de 100 \mul, de una solución de 10 mg/ml de BSA biotinilada en PBS, con 850 \mul de tampón de bicarbonato al 1% (pH 9'0) y 50 \mul del ferrofluido concentrado. La mezcla fue incubada a una temperatura de 37ºC durante una hora, después se añadió 200 \mul de BSA al 1% en PBS, y se continuó la incubación durante 45 minutos adicionales. Después, se aplicó la mezcla a una columna cromatográfica de 1 cm x 40 cm rellena con medio para filtración en gel "SEPHAROSE® S-300", equilibrada previamente con BSA al 0'1% en PBS, y se eluyó con el mismo medio. Las fracciones conteniendo el ferrofluido, como se notó por su color marrón, eluyeron en el volumen vacío. Una alícuota de 5 \mul de las fracciones combinadas dio una lectura de 5 mg en el dispositivo balanza. El material combinado fue diluido 50 veces con PBS para su uso en ensayos de unión (ver Ejemplos 3, 4, 5, 6, 7, y 8 a continuación).

Recubrimiento del Ferrofluido con Anti-hCG

De Abbott Laboratories se obtuvo un anticuerpo con actividad de unión frente a la gonadotropina coriónica humana subunidad beta, y se marcó con tritio mediante oxidación con peryodato, seguido por reducción con NaCNBH_{3}(^{3}H). Después de la aplicación a una columna de 1 cm x 40 cm de medio para filtración en gel "SEPHAROSE® S-300" (Pharmacia Bioteck), el marcador eluyó en tres picos en el volumen excluido, el volumen parcialmente incluido, y el volumen incluido totalmente, representando agregados de anticuerpo marcado, anticuerpo marcado libre y marcador libre, respectivamente. Se mezcló una alícuota de 10 \mul del anticuerpo marcado no separado (340.000 dpm) con una alícuota de 20 \mul de ferrofluido en 220 \mul de tampón de carbonato sódico al 1%, pH 9'0. Después de la incubación durante dos horas a una temperatura de 37ºC, se añadió 800 \mul de BSA al 0'1% en PBS y se continuó la incubación durante 45 minutos a una temperatura de 37ºC. Después, la mezcla fue aplicada a la columna de medio para filtración en gel "SEPHAROSE® S-300" como se describió antes. El marcador eluyó como dos picos, uno eluyendo con el ferrofluido en el volumen excluido y el otro en el volumen incluido totalmente. Se repitió el procedimiento de recubrimiento con anticuerpo anti-hCG no marcado. Se recogió el material que eluía en el volumen excluido, y se diluyó cincuenta veces con PBS para su uso en inmunoensayos.

Preparación de Partículas de Látex-Polipirrol recubiertas con Anticuerpos

Se preparó una muestra de partículas de látex-polipirrol recubiertas con un anticuerpo con afinidad de unión para biotina, como se describe en la Patente U.S. Nº 5.252.459, incorporada aquí como referencia. Estas partículas eran de 0'3 a 0'7 \mum de diámetro, y las suspensiones de ellas son de color negro intenso.

Ejemplo 3 Efecto de la Unión de Ferrofluido a Partículas de Látex en el Comportamiento en un Campo Magnético

A viales de vidrio teniendo una capacidad de 4 ml se transfirieron cinco alícuotas (un ml cada una) del ferrofluido diluido cincuenta veces, recubierto con BSA biotinilada, de la columna conteniendo medio para filtración en gel "SEPHAROSE® S-300" (ver Ejemplo 2). A cada vial conteniendo el ferrofluido recubierto con BSA biotinilada se transfirieron alícuotas de 0, 2, 5, 10 y 20 \mul de una suspensión al 0'1% del látex-polipirrol recubierto con anti-biotina, y el contenido de cada vial se incubó a una temperatura de 37ºC durante 30 minutos. Luego, de cada vial se transfirió una alícuota (100 \mul) a un microtubo de polipropileno, se puso el microtubo en el aparato microbalanza descrito en el Ejemplo 1, y se registró el peso aparente del imán en función del tiempo.

La velocidad y el alcance de la respuesta del aparato reflejaron la cantidad de látex-polipirrol recubierto con anti-biotina presente (ver Fig 21). Se puso la balanza a cero y la recogida de datos empezó a los 0 segundos (ver Fig 21). El microtubo de polipropileno conteniendo la alícuota de la mezcla incubada sin látex-polipirrol recubierto con anti-biotina añadido (la muestra de cero microlitros) fue insertado en el aparato después de 45 segundos. El peso reportado del imán disminuyó rápidamente desde 0 mg hasta -0'06 mg, después disminuyó además, a una velocidad estable, a -0'10 mg por encima de un periodo de tres minutos, reflejando la velocidad de migración del ferrofluido hacia el fondo del microtubo (ver segmento A de la curva, Fig 21). Luego, el se extrajo el microtubo del aparato y el peso reportado del imán volvió rápidamente a cero.

El microtubo de polipropileno conteniendo la alícuota de mezcla incubada, que tiene dos microlitros añadidos de látex-polipirrol recubierto con anti-biotina, fue insertado en el aparato después de 30 segundos adicionales. El peso reportado del imán cayó rápidamente desde 0 a -0'06 mg, después disminuyó además hasta -0'12 mg por encima de un periodo de tres minutos (ver segmento B de la curva, Fig 21), después de lo cual fue extraído. Los análisis de los microtubos conteniendo alícuotas de las mezclas incubadas, que tenían 5, 10 y 20 microlitros añadidos de látex-polipirrol recubierto con anti-biotina (ver segmentos C, D y E de la curva, Fig 21), mostraron velocidades de disminución en el peso reportado del imán cada vez más grandes, reflejando la mayor velocidad de migración del ferrofluido en complejos de látex-polipirrol-ferrofluido que la del ferrofluido solo (ver Tabla 1).

TABLA 1

1

La velocidad lineal de los cambios de peso por encima de los periodos de tres minutos de observación indicó que la captura de los complejos no fue completada en ese tiempo. Por encima de periodos de observación más largos, el cambio de peso más rápido de las muestras conteniendo concentraciones mayores de látex-polipirrol retardó el de la muestra cero, indicando que todos los complejos habían migrado hacia el fondo del microtubo. La lenta velocidad de cambio de peso vista con la muestra cero fue debida a la agregación de las partículas de ferrofluido durante el procedimiento de recubrimiento con la albúmina de suero bovino biotinilada, y se puede reducir mediante sonicación previa.

El efecto fue también observable visualmente, advirtiendo la velocidad y alcance de la eliminación del látex-polipirrol de la muestra de ensayo (ver Figs 22A, 22B, 22C y 22D). En todas las muestras conteniendo látex-polipirrol, todas las de látex fueron eliminadas de la muestra de ensayo, indicando la presencia de un exceso de ferrofluido en todas las muestras. En la serie de Figs 22A, 22B, 22C y 22D, la Fig 22A precede a la Fig 22B, la Fig 22B precede a la Fig 22C, y la Fig 22C precede a la Fig 22D.

Para determinar la concentración óptima de ferrofluido necesaria para otorgar reactividad magnética al látex-polipirrol, el ferrofluido recubierto con BSA biotinilada de la columna conteniendo medio para filtración en gel "SEPHAROSE® S-300" fue diluido 50 veces, 100 veces, 200 veces, 400 veces y 800 veces con PBS. Todas las soluciones diluidas eran transparentes, siendo la dilución de 50 veces de color pajizo, siendo la dilución de 100 veces de color amarillo claro, siendo la solución diluida 200 veces de color amarillo muy claro, y siendo incoloras las soluciones diluidas 400 veces y 800 veces. Para cada solución diluida, se transfirió una alícuota (1 ml) a un vial de 4 ml, y después se añadieron 20 \mul de la suspensión de polipirrol recubierto con anti-biotina a cada vial. Después de la incubación durante 30 minutos a una temperatura de 37ºC, se transfirió una alícuota de 100 \mul de cada mezcla de ensayo a un microtubo, y se insertó el microtubo en el aparato microbalanza descrito en el Ejemplo 1. En todas las muestras de ensayo conteniendo ferrofluido, todas las de látex-polipirrol migraron con el tiempo hacia el fondo del microtubo, como se determinó visualmente. La velocidad y alcance del cambio de peso aparente del imán reportados por el aparato variaron con la concentración de ferrofluido (ver Fig 23). Estos resultados indican que, aunque las suspensiones de ferrofluido más sumamente diluidas fueron capaces de unir un número suficiente de partículas de ferrofluido a partículas de látex-polipirrol para permitir que los complejos fuesen capturados magnéticamente, el empleo de suspensiones de ferrofluido más concentradas produjo una superior carga de ferrofluido en el látex-polipirrol.

Ejemplo 4 Ensayo de Inhibición para BSA Biotinilada Libre

Se fabricaron soluciones diluidas de BSA biotinilada libre con un diluyente de ensayo obtenido de Abbott Laboratories, para dar concentraciones de 0 \mug/ml, 2 \mug/ml, 10 \mug/ml y 40 \mug/ml. Para cada solución diluida, se puso una alícuota (20 \mul) en un microtubo y se mezcló con 20 \mul del látex-polipirrol recubierto con anti-biotina. Después de que cada solución fuese incubada durante una hora a una temperatura de 37ºC, a cada solución se añadió 40 \mul del ferrofluido recubierto con BSA biotinilada, se continuó la incubación durante 30 minutos adicionales, luego se puso cada tubo en el aparato microbalanza descrito en el Ejemplo 1 para su análisis. Se advirtió el cambio de peso aparente observado del imán con los tubos en el sitio con respecto al peso aparente del imán cuando estaba en el sitio un microtubo conteniendo 40 \mul de diluyente en lugar del ferrofluido. Como se muestra en la Fig 24, concentraciones crecientes de albúmina de suero bovino biotinilada libre inhiben la captura del ferrofluido por el látex-polipirrol, con el resultado de que se forman menos complejos y se acumula menos ferrofluido en el fondo del microtubo, donde puede ejercer su máxima fuerza de atracción sobre el imán. La muestra de 40 \mug/ml (10 \mug/ml en la mezcla incubada) mostró un cambio de peso de 0'2 mg, indicando que la máxima inhibición bajo estas condiciones fue obtenida a concentraciones de albúmina de suero bovino biotinilada de 4-5 \mug/ml en la mezcla incubada.

Estos resultados demuestran que el ferrofluido y el látex-polipirrol se unen entre sí debido a los miembros de unión específica con los que están recubiertos. El alcance de la unión origina un cambio predecible en el efecto de un campo magnético aplicado sobre la muestra de ensayo.

Ejemplo 5 Fabricación de un Dispositivo teniendo Canales Capilares para Inmunoensayos Autoejecutables

Refiriéndonos ahora a las Figs 25A, 25B y 25C, se laminaron conjuntamente tres láminas 1000, 1002 y 1004 de película polimérica para crear un material laminar 1006 para canales capilares. Uno o más agujeros de apertura 1008 en la lámina superior 1000 sirvieron como sitio(s) de aplicación para la muestra de ensayo, permitiendo el acceso al extremo(s) terminal 1010 del canal(s) 1012 cortado en la lámina del medio 1002. La parte inferior 1014 de la lámina del fondo 1004 estaba recubierta con adhesivo para que se adhiriese a una placa base magnética 1016, la cual se describe a continuación. La muestra de ensayo fue atraída hacia abajo del canal 1012, por capilaridad, hasta que alcanzó el extremo(s) 1018 del canal(s) 1012, en el cual punto cesaría el movimiento del líquido hacia abajo del canal. A veces, se puso un material capilar (no mostrado) situado en el extremo(s) 1018 del canal(s) 1012, para continuar atrayendo la muestra de ensayo hacia abajo del canal después de que se haya alcanzado el extremo del canal.

Aunque el dispositivo en este ejemplo está fabricado adhiriendo tres capas de material polímero conjuntamente, está dentro del campo de aplicación de esta invención fabricar dispositivos que tengan canales capilares con una única capa, dos capas, o cuatro o más capas de material polímero o equivalente tal como, por ejemplo, vidrio o láminas de metal. En la técnica son bien conocidos, por los de habilidad normal, métodos para adherir dos o más capas de material polímero o equivalente, tales como, por ejemplo, adhesivos, termoselladores, fijadores y otros.

Fabricación de una Placa Base Magnética para Soportar los Canales Capilares

Se trabajó a máquina una placa base de 20 cm x 20 cm a partir de una placa de aluminio 1016 de ½ pulgada (12'7 mm). Se trabajó a máquina un canal 1020 [½ pulgada (12'7 mm) de ancho y ¼ de pulgada (6'35 mm) de profundidad] a lo largo de la cara de la placa, el cual canal fue rellenado con una pieza intercalada 1022 "DELRIN". Se cortó longitudinalmente un canal de 1/8 de pulgada (3'18 mm) de profundidad por 1/32 de pulgada (0'79 mm) de ancho, a lo largo del centro de la pieza intercalada 1022, y se rellenó con una tira 1024 de 1/8 de pulgada (3'18 mm) x 1/32 de pulgada (0'79 mm) x 6 pulgadas (15'24 mm) de material magnético flexible.

Ejemplo 6 Captura de Látex-Polipirrol en un Sitio Magnético en un Canal Capilar a consecuencia de la Formación de Complejos con Ferrofluido

Para determinar la concentración óptima de ferrofluido necesaria para otorgar reactividad magnética sobre látex-polipirrol, para su uso en un formato de ensayo que emplee un dispositivo que tenga canales capilares, el ferrofluido recubierto con BSA biotinilada de la columna conteniendo medio para filtración en gel "SEPHAROSE® S-300" fue diluido 50 veces, 100 veces, 200 veces, 400 veces y 800 veces con PBS. Para cada solución diluida, se transfirió una alícuota (1 ml) a un vial de 4 ml, y a cada vial se añadió 20 \mul de la suspensión de polipirrol recubierto con anti-biotina. Después de la incubación durante 30 minutos a una temperatura de 37ºC, se aplicó después una alícuota de 7 \mul de cada vial al sitio de aplicación del material laminar de los canales capilares, el cual había sido unido a la placa base magnética de manera que el eje longitudinal de la tira magnética estuviese orientado 90º desde el eje longitudinal de los canales, y fue colocado debajo de los canales 0'5 cm distal a la abertura proximal de los canales (ver Figs 25A y 25B). Todos los canales correspondientes a las muestras de ensayo que contenían las soluciones diluidas de ferrofluido mostraron una banda negra de látex-polipirrol capturado en la posición de la tira magnética, la intensidad de la banda aumentando a medida que aumentaba la concentración de ferrofluido en la muestra de ensayo. Las muestras de ensayo que no contenían ferrofluido no mostraron ninguna banda de látex-polipirrol.

Ejemplo 7 Ensayo de Inhibición Cualitativo para BSA Biotinilada Libre, realizado utilizando un Dispositivo teniendo Canales Capilares

Se prepararon cuatro soluciones independientes conteniendo 0 \mug, 5 \mug, 20 \mug y 80 \mug de BSA biotinilada, descrita en el Ejemplo 4, en 1 ml de PBS. A cada mezcla se añadió una alícuota (20 \mul) del látex-polipirrol recubierto con anti-biotina descrito en el Ejemplo 2, seguido por incubación a una temperatura de 37ºC durante una hora, después de lo cual se añadió una alícuota de 20 \mul del ferrofluido recubierto con BSA biotinilada del Ejemplo 2. Después de incubación a una temperatura de 37ºC durante 5 minutos o 25 minutos, se aplicaron alícuotas al dispositivo de canales capilares descrito en el Ejemplo 5. La presencia de BSA biotinilada libre, a una concentración de 5 \mug/ml o más, inhibió la captura del látex-polipirrol en el sitio magnético de los canales.

Ejemplo 8 Ensayo de Inhibición Cuantitativo para Biotina Libre, realizado utilizando un Dispositivo teniendo Canales Capilares

Se fabricaron soluciones diluidas, en diluyente de ensayo, de BSA biotinilada descrita en el Ejemplo 4, a concentraciones de 0 \mug/ml, 5 \mug/ml, 10 \mug/ml, 20 \mug/ml y 80 \mug/ml. Una alícuota de 20 \mul de cada solución de BSA biotinilada diluida fue mezcla adicionalmente con 60 \mul de diluyente y 10 \mul del látex-polipirrol recubierto con anti-biotina descrito en el Ejemplo 2. Después de que dejase estar la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente, a eso se añadió una alícuota de 10 \mul del ferrofluido recubierto con BSA biotinilada del Ejemplo 2. Después de incubación adicional a una temperatura de 20ºC durante 15 minutos, se aplicaron alícuotas (7 \mul) de la mezcla resultante al dispositivo de canales capilares descrito en el Ejemplo 5. La presencia de BSA biotinilada libre, a una concentración de 5 \mug/ml o más, inhibió la captura del látex-polipirrol en el sitio magnético de los canales.

Para este tipo de ensayo, se pudieron obtener resultados cuantitativos midiendo el cambio en reflectancia del sitio de captura magnético debido a la presencia de látex-polipirrol capturado. Se repitió el ensayo como antes, excepto que se utilizaron concentraciones de BSA biotinilada de 0'125 \mug/ml, 1'0 \mug/ml, 5'0 \mug/ml y 80 \mug/ml. Después de las aplicaciones de alícuotas (7 \mul) de las mezclas de reacción a los canales capilares, se escanearon los canales utilizando un lector de reflectancia de barrido fabricado por Abbott Laboratories. La reflectancia en el sitio de captura magnético fue comparada con la reflectancia de los sitios, en cualquier lado del sitio de captura magnético, y se calculó la reflectancia neta como la diferencia entre la reflectancia en el sitio de captura magnético y la media de los dos sitios vecinos. La diferencia entre la reflectancia en el sitio de captura magnético y en los sitios vecinos no magnéticos disminuyó a medida que aumentaba la concentración de BSA biotinilada libre, debido a que la BSA biotinilada libre inhibía la unión entre el látex-polipirrol y el ferrofluido (ver Fig 26). La respuesta del ensayo muestra el estrecho margen deseable para un formato de ensayo positivo/negativo.

Ejemplo 9 Inmunoensayo Autoejecutable para Deportes para Gonadotropina Coriónica Humana Recubrimiento de Ferrofluido con Anticuerpo

Se diluyó el ferrofluido en ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) 20 mM, el cual había sido ajustado a pH 7'0 con ClH, hasta una concentración de 1% en sólidos. Todas las etapas posteriores con el ferrofluido hasta el ensayo final fueron realizadas en este tampón. De la preparación de ferrofluido se eliminaron el material soluble y las partículas sin hierro unido, aplicando una capa de 3'3 ml de la suspensión al 1% en 10 ml de sacarosa al 20%, en un tubo de centrífuga de 15 ml. Se centrifugó la preparación durante dos horas en un rotor de cubetas giratorias a 170.000xg, a una temperatura de 4ºC. El gránulo resultante de ahí fue lavado dos veces en 10 ml de tampón, después de lo cual, se centrifugó el gránulo a 170.000xg durante una hora. El gránulo final fue suspendido en tampón MOPS para proporcionar una concentración del 1% en sólidos, y almacenado luego a una temperatura de 4ºC.

Se ajustó un anticuerpo monoclonal murino, que estaba unido a la subunidad alfa de \beta-hCG, a una concentración de 4 mg/ml; cinco ml de esta solución se añadieron a un volumen igual de la suspensión de partículas superparamagnéticas lavadas. Esta suspensión se agitó, a temperatura ambiente, en un agitador de plataforma a 160 rpm durante una hora. Las partículas recubiertas fueron lavadas dos veces mediante centrifugación a 170.000xg durante 30 minutos, a una temperatura de 4ºC, suspendidas para formar una suspensión conteniendo 1% en sólidos, y sonicada en un baño de hielo/agua durante 15 segundos. Se añadió azida sódica para proporcionar una concentración final del 0'01%; las partículas fueron almacenadas a una temperatura de 4ºC. Para su uso como control en algunos experimentos, las partículas superparamagnéticas fueron recubiertas, de manera similar, con albúmina de suero bovino (BSA).

Recubrimiento de Partículas de Látex con Anticuerpo

De Polysciences Inc., Warrington, PA, se obtuvieron partículas de látex azul de 3 \mum de diámetro. Las partículas fueron diluidas, hasta el 0'1% en sólidos, en tampón MOPS 20mM conteniendo ClNa 0'1M (MOPS-ClNa). Se lavaron las partículas una vez por centrifugación a 17.000xg durante 30 minutos, a una temperatura de 4ºC, y se suspendieron en tampón hasta una concentración del 0'4% en sólidos. Se ajustó IgG de cabra purificado por afinidad, reactivo con la subunidad beta de hCG, a una concentración de 250 \mug/ml en tampón MOPS-ClNa. Se mezclaron volúmenes iguales de partículas de látex y solución de anticuerpo, y se agitaron en un agitador de plataforma a 160 rpm durante una hora, a temperatura ambiente. Las partículas de látex recubiertas fueron lavadas dos veces y suspendidas en tampón hasta una concentración del 0'4% en sólidos, en tampón MOPS-ClNa conteniendo azida sódica. Para su uso como control, las partículas de látex fueron recubiertas con BSA mediante el mismo procedimiento. Todas las partículas recubiertas se almacenaron a 4ºC.

Ensayo con Muestras Clínicas

Se aplicó un ensayo con 10 muestras de orina de mujeres embarazadas, y con 10 muestras de mujeres que no estaban embarazadas. Las muestras codificadas fueron aplicadas en un experimento ciego. Junto con las muestras clínicas, se ensayaron controles positivos conteniendo \beta-hCG a una concentración de 64 ng/ml y controles negativos. Independientemente, todas las muestras se evaluaron en el ensayo Abbott Test-Pack Plus para confirmar la presencia o ausencia de b-hCG en cantidades coherentes con el embarazo.

Se realizó el ensayo mezclando: (a) 30 \mul de partículas de látex azul de 3 \mum recubiertas con IgG, las cuales habían sido diluidas al 0'2% en sólidos en tampón MOPS-ClNa conteniendo 1'0 mg de albúmina de suero bovino por ml (MOPS-ClNa-BSA); (b) 10 \mul de partículas magnéticas recubiertas con anticuerpo monoclonal al 0'0066% en sólidos en MOPS-ClNa-BSA; y (c) 40 \mul de muestra de orina no diluida. Se dejó que la mezcla permaneciese a temperatura ambiente durante 15 minutos, después del cual periodo se salpicaron 15 \mul sobre cinta de Teflón cubriendo la tira magnética de la placa base magnética descrita en el Ejemplo 5 y representada en la Fig 25. Se puso un cubreobjetos de vidrio sobre dos soportes de 0'5 mm de espesor en cualquiera de los lados de la cinta de Teflón® para crear una cámara de reacción teniendo una superficie de inspección ópticamente plana (ver Fig 15A y 15B). Se registraron los resultados después de 5 minutos y 10 minutos. Cuando se realizó el ensayo con las 10 muestras positivas y el control positivo, se observó una colección de partículas azules ajustándose en forma al campo magnético. Por contraste, las partículas azules permanecieron dispersadas homogéneamente cuando se ensayaron las muestras negativas y el control negativo. Los resultados obtenidos con el ensayo Test-Pack Plus eran conformes con los del ensayo de la invención.

Ejemplo 10 Ensayo Autoejecutable para Fibrina Soluble utilizando Mediciones de Densidad Óptica

Se desarrolló un ensayo autoejecutable para fibrina soluble en plasma humano. El ensayo estaba basado en la velocidad de cambio de la densidad óptica de una suspensión de látex-polipirrol recubierto con un miembro de unión específica y ferrofluido recubierto con un miembro de unión específica, bajo la influencia de un campo magnético aplicado. En Abbott Laboratories se produjo látex-polipirrol (0'2 \mum de diámetro, 2% en sólidos) (ver Ejemplo 2). De American Biogenetic Sciences (Boston, MA) se obtuvieron un primer anticuerpo teniendo afinidad de unión para un epítopo en fibrina soluble humana, y un segundo anticuerpo teniendo afinidad de unión por un epítopo diferente en fibrina soluble humana. Se mezcló una alícuota del primer anticuerpo (125 \mul, 5'58 mg/ml) con tampón borato 0'1M (187 \mul, pH 10'0), surfactante "BRIJ® 35" al 1% (375 \mul), látex-polipirrol (1'87 ml) y agua (1'2 ml). Después de que la mezcla hubiese sido incubada con balanceo durante dos horas a temperatura ambiente, se añadieron 1'25 ml de albúmina de suero bovino al 4% en tampón Bis-Tris 0'25M (pH 7'0) y 555 \mul de ácido periódico 0'3M en trietanolamina 0'5M, y la mezcla resultante se incubó durante dos horas adicionales a temperatura ambiente. Después, la mezcla circuló a través de un aparato de diafiltración "MICROGON®" para intercambiar la porción líquida de la muestra con tampón MOPS-etanolamina 25mM (pH 7'2) conteniendo 0'5% de albúmina de suero bovino y 0'1% de surfactante "BRIJ® 35". El látex-polipirrol recubierto con anticuerpo se almacenó en esta solución. Para diluir el estándar de fibrina soluble y la solución madre de polipirrol se utilizó una solución diluyente conteniendo 0'5% de albúmina de suero bovino, 5% de sacarosa, 0'1% de surfactante "Tween 20®" y 0'05% de conservante "PROCLIN" en salino tampo-
nado con fosfato. Para su uso en el ensayo, la suspensión madre de polipirrol fue diluida veinte veces con diluyente.

Se diluyó una alícuota (250 \mul) del ferrofluido, descrito en el Ejemplo 2, hasta una concentración del 3% en sólidos en carbonato sódico 0'05M (pH 9'1), y se mezcló con una solución del segundo anticuerpo (2 \mul, 14'7 \mug/ml). Después de que la mezcla se incubase a 37ºC durante una hora, se añadió 1% de albúmina de suero bovino (110 \mul), y se incubó la mezcla resultante durante 45 minutos adicionales a 37ºC. Luego, se aplicó la mezcla a una columna de 1 cm x 40 cm, rellena con medio de permeación en gel "SEPHACRYL® S-300", y equilibrada con salino tamponado con fosfato conteniendo 0'1% de albúmina de suero bovino. La columna fue eluida con el mismo tampón, y se recuperó el material excluido en 3 ml.

Se preparó la mezcla de reactivo de ensayo mezclando 1 ml de la suspensión diluida de polipirrol recubierto con anticuerpo con 100 \mul de la suspensión de ferrofluido recubierto con anticuerpo.

Se prepararon estándares de ensayo a partir de fibrina soluble humana (obtenida de American Biogenetic Sciences) diluida a diferentes concentraciones con la solución diluyente.

Para determinar la densidad óptica de la mezcla de ensayo, se utilizó un espectrofotómetro Cary 3. De Wilmad Glass Inc., se obtuvo una cubeta para fluorómetro de 5 mm de diámetro interior x 30 mm. Dentro del agujero roscado en el fondo del soporte para cubetas del espectrofotómetro se atornilló un tornillo de cabeza hexagonal y, en la parte superior de él, se puso un imán de neodimio-hierro-boro de 0'25 pulgadas (6'35 mm) x 0'25 (6'35 mm). Después, se ajustó la posición del imán en el soporte para cubetas, girando la cabeza del tornillo hasta que el imán empezase a bloquear la porción inferior del haz de luz a través del soporte para cubetas (como se juzgó por una disminución en la densidad óptica aparente reportada por el instrumento). La porción superior e inferior del haz de luz fue bloqueada por tiras horizontales de cinta eléctrica hasta que quedó una abertura vertical de 3 mm, la parte inferior de la cual se alineó con el piso interior de la celda del fluorómetro cuando se insertó en el soporte para cubetas hasta que descansase sobre la parte superior del imán. El soporte para cubetas de referencia fue bloqueado de manera similar. Se puso el instrumento a cero antes de que empezase el ensayo.

El ensayo se realizó mezclando en primer lugar 50 \mul de la mezcla de reactivo de ensayo con 50 \mul de la mezcla de ensayo, y transfiriendo después la mezcla resultante a la cubeta. Después, se insertó la cubeta dentro del soporte para cubetas hasta que su parte inferior descansase sobre el imán, y empezó inmediatamente la recogida continua de datos de densidad óptica por el espectrofotómetro. La velocidad de eliminación del látex-polipirrol de la solución mediante captura magnética se reflejó en la velocidad de cambio de la densidad óptica de la suspensión. El diagrama de la velocidad de cambio de la densidad óptica en la mezcla de ensayo, en función de la concentración de fibrina soluble en la muestra de ensayo, muestra una relación lineal (ver Fig 27).

Claims

1. Un método para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de ensayo, dicho método comprendiendo las etapas de:

2. Un método para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de ensayo, dicho método comprendiendo las etapas de:

3. Un método para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de ensayo, dicho método comprendiendo las etapas de:

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha muestra de ensayo es puesta secuencialmente en contacto con dicha partícula en fase sólida móvil y dicho reactivo magnéticamente sensible.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha muestra de ensayo es puesta simultáneamente en contacto con dicha partícula en fase sólida móvil y dicho reactivo magnéticamente sensible.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la partícula en fase sólida móvil es un reactivo magnéticamente sensible.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde se utiliza una balanza para detectar dicho cambio de peso aparente.