ES2316780T3 - Vacunas contra alergia. - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un polipéptido y un compuesto de aluminio, en la que dicho polipéptido es un polipéptido de IgE quimérico que comprende una secuencia de polipéptido de IgE propio, y en la que la administración de dicha composición a un mamífero reduce el nivel de IgE libre detectable en dicho mamífero.

Description

Vacunas contra alergia.

Técnica anterior 1. Campo técnico

La invención se refiere a métodos y materiales implicados en el uso de vacunas que contienen un polipéptido (por ejemplo, polipéptido de IgE quimérico) y un coadyuvante. Tales vacunas pueden usarse para obtener una anti-respuesta propia (por ejemplo, una anti-respuesta propia de IgE).

2. Información fundamental

Durante las últimas décadas, varias enfermedades causadas por malfuncionamientos del sistema inmune se han convertido en los mayores retos de la medicina moderna de la época. Dos de tales áreas son las enfermedades alérgicas y autoinmunes. Las alergias se han hecho casi epidémicas durante los pasados 20-30 años. Las estimaciones sobre la población total afectada varían del 20 al 30 por ciento. Las alergias atópicas o las alergias mediadas por IgE son la forma dominante.

Los tipos comunes de alergias atópicas incluyen fiebre del heno, alergias de piel, alergias de ácaros del polvo, alergias de venenos de insectos, asma extrínseco y muchos tipos de alergias de alimentos. Una cuestión interesante es si pueden desarrollarse vacunas contra estos tipos de enfermedades. Se ha usado terapia de hiposensibilización para tratar alergias desde comienzos del siglo veinte (Noon, Lancet, 1:1572 (1911); y Freeman, Lancet, 1:1178 (1914)). Ésta es una estrategia de tratamiento dependiente de alergenos, que implica el uso de extractos de alergenos para tratar pacientes por inyección. La terapia de hiposensibilización se ha cuestionado sin embargo debido a la frecuente baja eficacia y a veces efectos secundarios graves. Además, deben usarse diferentes extractos para cada forma individual de alergia. Se están evaluando así actualmente nuevas estrategias para tratar alergias.

Las vacunas se administran típicamente con un coadyuvante tal como alumbre. El alumbre, sin embargo, es un potenciador relativamente débil de respuestas inmunes mediadas por células (Krishnan et al., Infect. Immun., 68:54-63 (2000) y Gupta et al., Adjuvant properties of aluminum and calcium compounds, págs. 229-248. En M.F. Powell y M.J. Newman (red.), Vaccine design: the subunit and adjuvant approach. Plenum Press, Nueva York, NY (1995)). Además, se ha informado de que el hidróxido de aluminio atrae eosinófilos al lugar de inyección y aumenta los niveles de anticuerpos de IgE específicos para antígenos y totales que pueden promover reacciones alérgicas mediadas por IgE (Baylor et al., Vaccine, 20:S18-S23 (2002); Walls, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 156:431-435 (1977); y Nagel et al., J. Immunol. 118:334-341 (1977)). El documento WO-A-0025722 se refiere a la vacunación contra alergia reduciendo los efectos de anticuerpos de IgE quiméricos. No se añade compuesto de aluminio a polipéptidos de IgE del documento WO-A-0025722.

Sumario

La invención proporciona materiales y métodos relacionados con una vacuna contra polipéptidos propios. Por ejemplo, la invención proporciona composiciones que contienen un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de IgE quimérico) y un coadyuvante como se define en las presentes reivindicaciones. El polipéptido contiene típicamente componentes propios y no propios, que pueden producir respuestas inmunes anti-propias y anti-no propias cuando se administra a un mamífero. Por ejemplo, cuando se administran a un mamífero, los polipéptidos de IgE quiméricos proporcionados aquí pueden reducir los efectos de anticuerpos de IgE de enfermedades relacionadas con IgE tales como asma, alergias y eczema. El coadyuvante se selecciona típicamente para dar una respuesta anti-propia relativamente alta, en comparación con composiciones que contienen otros coadyuvantes.

La invención se basa en el descubrimiento de que polipéptidos de IgE quiméricos en combinación con un coadyuvante pueden usarse para reducir el nivel de anticuerpos de IgE libres detectables en un mamífero. Por ejemplo, la administración de polipéptidos de IgE quiméricos en combinación con compuestos de aluminio produjo inesperadamente una reducción de los niveles de anticuerpos de IgE libres detectables a pesar de informes previos de que los compuestos de aluminio aumentan los niveles de IgE totales.

En general, un aspecto de la invención resalta una composición que contiene un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido ORO o un polipéptido OSO) y alumbre, en la que el polipéptido contiene una secuencia de polipéptido de IgE propia, y en la que la administración de la composición a un mamífero produce una respuesta de anticuerpo anti-IgE propia con un valor de dilución_{50} de título mayor que 100. La composición puede contener entre alrededor de diez microgramos y aproximadamente un gramo del polipéptido. La composición puede contener aproximadamente 280 microgramos del polipéptido. La composición puede contener entre alrededor de diez microlitros y aproximadamente un mililitro de alumbre. La composición puede contener aproximadamente 50 microlitros de alumbre. El valor de dilución_{50} de título puede ser mayor que 150, mayor que 200 o mayor que 400.

Otra realización de la invención resalta una composición que contiene alumbre y aproximadamente 280 microgramos de un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido ORO o un polipéptido OSO).

En otro aspecto, la invención resalta una composición para inducir una respuesta de anticuerpo anti-IgE propia en un mamífero, en la que la composición es para administrar al mamífero una composición en condiciones en las que el mamífero produce una respuesta de anticuerpo anti-IgE propia con un valor de dilución_{50} de título mayor que 100, en la que la composición contiene un polipéptido y alumbre, y en la que el polipéptido contiene una secuencia de polipéptido propio de un polipéptido de IgE.

Otra realización de la invención resalta una composición que contiene un polipéptido y un compuesto de aluminio como se define en las presentes reivindicaciones, en la que el polipéptido contiene una secuencia de polipéptido de IgE propio, y en la que la administración de la composición a un mamífero reduce el nivel de IgE libre detectable en el mamífero. El polipéptido puede ser un polipéptido de IgE quimérico. El polipéptido puede contener una secuencia indicada en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 21. La composición puede contener entre alrededor de 10 microgramos y aproximadamente un gramo del polipéptido. La composición puede contener aproximadamente 280 microgramos del polipéptido. El compuesto de aluminio puede ser un compuesto de hidrogel de aluminio. El compuesto de aluminio puede ser alumbre. La composición puede contener entre alrededor de diez microlitros y aproximadamente un mililitro del alumbre. La composición puede contener aproximadamente 50 microlitros del alumbre. La reducción puede ser al menos aproximadamente una reducción del 10 por ciento (por ejemplo, al menos una reducción de aproximadamente el 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 95 por ciento). La reducción puede ser una reducción de alrededor del 10 por ciento a aproximadamente el 95 por ciento (por ejemplo, de alrededor del 20 por ciento a aproximadamente el 95 por ciento, de alrededor del 25 por ciento a aproximadamente el 95 por ciento, de alrededor del 50 por ciento a aproximadamente el 95 por ciento, de alrededor del 75 por ciento a aproximadamente el 95 por ciento, de alrededor del 85 por ciento a aproximadamente el 95 por ciento, de alrededor del 25 por ciento a aproximadamente el 80 por ciento o de alrededor del 50 por ciento a aproximadamente el 80 por ciento). La reducción puede ser detectable en un ELISA. Puede usarse en el ELISA una secuencia de polipéptido de receptor de IgE. La administración de la composición al mamífero puede producir una respuesta de anticuerpo anti IgE propia con un valor de dilución_{50} de título mayor que 100 (por ejemplo, mayor que 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400 o 1.500).

Otra realización de la invención resalta una composición que contiene un compuesto de aluminio y aproximadamente 30 a 300 microgramos de un polipéptido de IgE quimérico.

Otra realización de la invención resalta una composición para inducir una respuesta de anticuerpo anti IgE propia en un mamífero, en la que la administración al mamífero reduce el nivel de IgE libre detectable en el mamífero, en la que la composición contiene un polipéptido y un compuesto de aluminio, y en la que el polipéptido contiene una secuencia de polipéptido propio. El polipéptido puede contener una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 21.

Salvo indicación en contrario, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse para practicar la invención métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, se describen después métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas aquí se incorporan como referencia en su integridad. En caso de conflicto, regulará la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos, y no pretenden ser limitativos.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se indican en los dibujos que se acompañan y en la siguiente descripción. Otros aspectos, objetos y ventajas de la invención se evidenciarán de la descripción y dibujos, y de las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 es un vector de ácidos nucleicos denominado pRES-ORO.

La Figura 2 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos del vector pRES-ORO (SEQ ID NO: 1).

La Figura 3 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de inserto que codifica un polipéptido ORO (SEQ ID NO: 2). El polipéptido ORO contiene un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 de rata seguido por un dominio de IgE CH4 de zarigüeya.

La Figura 4 es un listado de secuencias de aminoácidos de un polipéptido ORO (SEQ ID NO: 3).

La Figura 5 es un diagrama del vector de ácidos nucleicos denominado pRES-ORO.

La Figura 6 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos del vector pRES-ORO (SEQ ID NO: 4).

La Figura 7 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de inserto que codifica un polipéptido OSO (SEQ ID NO: 5). El polipéptido OSO contiene un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 humano seguido por un dominio de IgE CH4 de zarigüeya.

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La Figura 8 es un listado de secuencias de aminoácidos de un polipéptido OSO (SEQ ID NO: 6).

La Figura 9 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de inserto que codifica un polipéptido ORORO (SEQ ID NO: 7). El polipéptido ORORO contiene un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 de rata seguido por un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 de rata seguido por un dominio de IgE CH4 de zarigüeya.

La Figura 10 es un listado de secuencias de aminoácidos de un polipéptido ORORO (SEQ ID NO: 8).

La Figura 11 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de inserto que codifica un polipéptido modOSOSO-H (SEQ ID NO: 9). El polipéptido modOSOSO-H contiene un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 humano seguido por un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 humano seguido por un dominio de IgE CH4 de zarigüeya. El polipéptido modOSOSO-H contiene también mutaciones puntuales en los dominios CH3 humanos que suprimen la unión a receptores de células cebada y una etiqueta de polihistidina C-terminal.

La Figura 12 es un listado de secuencias de aminoácidos de un polipéptido modOSOSO-H (SEQ ID NO: 10).

La Figura 13 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de inserto que codifica un polipéptido modOSOSO (SEQ ID NO: 11). El polipéptido modOSOSO contiene un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 humano seguido por un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 humano seguido por un dominio de IgE CH4 de zarigüeya. El polipéptido modOSOSO contiene también mutaciones puntuales en los dominios CH3 humanos que suprimen la unión a receptores de células cebada.

La Figura 14 es un listado de secuencias de aminoácidos de un polipéptido modOSOSO (SEQ ID NO: 12).

La Figura 15 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de inserto que codifica un polipéptido OSO-H (SEQ ID NO: 13). El polipéptido OSO-H contiene un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 humano seguido por un dominio de IgE CH4 de zarigüeya. El polipéptido OSO-H contiene también una etiqueta de polihistidina C-terminal.

La Figura 16 es un listado de secuencias de aminoácidos de un polipéptido OSO-H (SEQ ID NO: 14).

La Figura 17 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de inserto que codifica un polipéptido OSOSO (SEQ ID NO: 15). El polipéptido OSOSO contiene un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 humano seguido por un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 humano seguido por un dominio de IgE CH4 de zarigüeya.

La Figura 18 es un listado de secuencias de aminoácidos de un polipéptido OSOSO (SEQ ID NO: 16).

La Figura 19 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de inserto que codifica un polipéptido OSOSO-H (SEQ ID NO: 17). El polipéptido OSOSO-H contiene un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 humano seguido por un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 humano seguido por un dominio de IgE CH4 de zarigüeya. El polipéptido OSOSO-H contiene también una etiqueta de polihistidina C-terminal.

La Figura 20 es un listado de secuencias de aminoácidos de un polipéptido OSOSO-H (SEQ ID NO: 18).

La Figura 21 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de inserto que codifica un polipéptido CCC-H (SEQ ID NO: 19). El polipéptido CCC-H contiene un dominio de IgE CH2 de mono seguido por un dominio de IgE CH3 de mono seguido por un dominio de IgE CH4 de mono, seguido por una etiqueta de polihistidina.

La Figura 22 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de inserto que codifica un polipéptido H-OCO-H (SEQ ID NO: 20). El polipéptido H-OCO-H contiene un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 de mono seguido por un dominio de IgE CH4 de zarigüeya. El polipéptido H-OCO-H contiene también etiquetas de polihistidina N- y C-terminales.

La Figura 23 es un listado de secuencias de aminoácidos de un polipéptido H-OCO-H (SEQ ID NO: 21).

La Figura 24 es un listado de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de inserto que codifica un polipéptido H-OCOCO-H (SEQ ID NO: 22). El polipéptido H-OCOCO-H contiene un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 de mono seguido por un dominio de IgE CH2 de zarigüeya seguido por un dominio de IgE CH3 de mono seguido por un dominio de IgE CH4 de zarigüeya. El polipéptido H-OCOCO-H contiene también etiquetas de polihistidina N- y C-terminales.

La Figura 25 es un esquema de una respuesta inmune.

La Figura 26 es un esquema de una molécula de IgE.

La Figura 27 es un esquema de una vacuna que tiene secuencias de IgE humana y de zarigüeya.

La Figura 28 es un esquema de espacio libre de IgE.

La Figura 29A es un esquema de una construcción de ADN de H-ORO marcando las posiciones de las secuencias de codificación de IgE de rata y zarigüeya. La Figura 29B es un esquema que muestra la estructura de un polipéptido H-ORO recombinante.

La Figura 30A es un gráfico de barras que muestra los títulos relativos de anticuerpos anti-IgE de rata (anti-IgE propia) en ratas vacunadas con H-ORO mezclado con coadyuvante de Freund, alumbre o ISCOM. La Figura 30B es un gráfico de barras que muestra los títulos relativos de anticuerpos anti-zarigüeya (anti no-propia) en las mismas ratas.

La Figura 31A es un gráfico de barras que muestra los títulos relativos de anticuerpos anti-IgE de rata en ratas vacunadas con H-ORO mezclado con coadyuvante de Freund, MONTANIDE® ISA 51 (MN51) o MONTANIDE® ISA 720 (MN720). La Figura 31B es un gráfico de barras que muestra los títulos relativos de anticuerpos anti-zarigüeya en las mismas ratas.

La Figura 32A es un gráfico de barras que muestra los títulos relativos de anticuerpos anti-IgE de rata en ratas vacunadas con H-ORO mezclado con MN51, con o sin adición de muramildipéptido (MDP), monofosforil lípido A (MPL) y/o un tripéptido que contiene formil-metionina (FM). La Figura 32B es un gráfico de barras que muestra los títulos relativos de anticuerpos anti-zarigüeya en las mismas ratas.

La Figura 33A es un gráfico de barras que muestra los títulos relativos de anticuerpos anti-IgE de rata en ratas vacunadas con H-ORO mezclado con MN720, con o sin adición de muramildipéptido (MDP) y/o monofosforil lípido A (MPL). La Figura 33B es un gráfico de barras que muestra los títulos relativos de anticuerpos anti-zarigüeya en las mismas ratas.

La Figura 34 es un gráfico de líneas que muestra los niveles de IgE libre en sueros de ratas inmunizadas con vehículo mezclado con alumbre o H-ORO mezclado con alumbre.

La Figura 35A es un gráfico de líneas que muestra la curva de dilución de título para anticuerpos anti-IgE de rata en muestras de suero de ratas inmunizadas con H-ORO mezclado con MN51. La Figura 35B es un gráfico de líneas que muestra la curva de dilución de título para anticuerpos anti-IgE de rata en muestras de suero de ratas inmunizadas con H-ORO mezclado con alumbre. Las líneas de puntos representan el intervalo de confianza del 95% de la respuesta anti-IgE (n = 9-10).

La Figura 36 es un gráfico de líneas que muestra los niveles de IgE libre en sueros de ratas inmunizadas con vehículo u ORO-H mezclado con Montanide ISA51.

La Figura 37 es un gráfico de líneas que muestra los niveles de IgE libre en sueros de ratas inmunizadas con vehículo u ORORO-H mezclado con Montanide ISA51.

Las Figuras 38A-C muestran la configuración de un diseño de estudio (A), títulos anti-IgE (B) y niveles de IgE circulante libre (C) en sueros de ratas inmunizadas con vehículo, vehículo mezclado con MN51 o cantidades crecientes de H-ORO mezclado con MN51.

La Figura 39 es una tabla que lista un método de vacunación de ratas para un polipéptido ORO no etiquetado con histidina altamente purificado (> 98% de pureza).

La Figura 40 es un gráfico que representa la cantidad de IgE de rata (ng/ml) medida en ratas que reciben el tratamiento indicado.

La Figura 41 es un gráfico que representa la reducción porcentual de IgE circulante libre medida en ratas que reciben el tratamiento indicado.

La Figura 42 es un esquema de un método de vacunación de mono.

La Figura 43 es un esquema de un ELISA usado para detectar anticuerpos anti-IgE de mono.

La Figura 44 es un gráfico de líneas que muestra los valores de dilución_{50} de título en muestras de suero de monos cynomolgus inmunizados con vehículo mezclado con MN51, H-OCO-H mezclado con MN51 o H-OCOCO-H mezclado con MN5.

La Figura 45 es un gráfico de barras que representa los recuentos de plaquetas para los puntos de tiempo indicados.

La Figura 46 es un listado de las mediciones hematológicas que se encontraron normales.

La Figura 47 es un método esquemático de un método de vacunación de mono usando como coadyuvante
Alhydrogel^{TM}.

La Figura 48 es un gráfico que representa el título de anticuerpos anti-IgE de mono para los puntos de tiempo indicados usando diferentes dosis de H-OCO-H mezclado con Alhydrogel^{TM}.

Descripción detallada

La invención proporciona métodos y materiales relacionados con vacunas contra polipéptidos propios. Por ejemplo, la invención proporciona composiciones que contienen un polipéptido y un coadyuvante. El polipéptido contiene típicamente componentes propios y no propios, que pueden producir respuestas inmunes anti propias y anti no propias cuando se administran a un mamífero. El coadyuvante se selecciona típicamente para dar una respuesta anti-propia relativamente alta, en comparación con composiciones que contienen otros coadyuvantes.

El término "polipéptido" según se usa aquí se refiere a una cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o modificación post-traducción (por ejemplo, fosforilación o glicosilación). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el polipéptido puede ser no modificado, de tal modo que carezca de modificaciones tales como fosforilación o glicosilación. El polipéptido puede contener parte o la totalidad de un polipéptido de origen natural simple, o puede ser un polipéptido quimérico que contenga secuencias de aminoácidos de dos o más polipéptidos de origen natural. Un "coadyuvante" es un compuesto inmunológico que puede aumentar una respuesta inmune contra un antígeno particular tal como un polipéptido. Típicamente, las composiciones de la invención se administran a un mamífero de tal modo que el mamífero produce anticuerpos contra el componente polipéptido de la composición administrada. El mamífero puede ser un ratón, rata, perro, gato, caballo, vaca o un primate tal como un primate humano o no humano (por ejemplo, un mono cynomolgus).

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención pueden obtener una respuesta de anticuerpo anti-polipéptido propio en un mamífero. Por ejemplo, un polipéptido puede contener uno o más segmentos de polipéptidos propios (por ejemplo, una secuencia de polipéptido propio) con o sin uno o más segmentos de polipéptidos no propios (por ejemplo, una secuencia de polipéptido no propio). El término "propio" según se usa aquí con referencia a una secuencia de polipéptido y un mamífero particular se refiere a una secuencia que se ve como propia desde la perspectiva de ese sistema inmune del animal. Típicamente, un segmento de polipéptido propio es una secuencia de aminoácidos que es idéntica o similar a una secuencia de un polipéptido que es nativo de la especie de mamífero al que ha de administrarse la composición. La expresión "no propia" según se usa aquí con referencia a una secuencia de polipéptido y a un mamífero particular se refiere a una secuencia que se ve como extraña desde la perspectiva de ese sistema inmune del mamífero. Típicamente, un segmento de polipéptido no propio es una secuencia de aminoácidos que no es nativa de la especie de mamífero al que ha de administrarse la composición. Un polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido ORO que contiene secuencias de las moléculas de IgE de rata y zarigüeya, y puede administrarse a una rata como se describe aquí.

Los polipéptidos proporcionados aquí pueden contener más de una copia del segmento propio (por ejemplo, un polipéptido ORORO que contiene dos copias de un segmento de la secuencia de aminoácidos de IgE de rata). Pueden incluirse en los polipéptidos proporcionados aquí segmentos de polipéptidos de cualquier tipo de mamífero (por ejemplo, ratón, rata, perro, gato, caballo, vaca, un primate no humano tal como un mono cynomolgus o un ser humano). Por ejemplo, puede usarse cualquiera de los polipéptidos descritos en la Solicitud PCT Nº de Serie PCT/SE99/01896. Alternativamente, los polipéptidos pueden contener una etiqueta (por ejemplo, una etiqueta His, una etiqueta myc o una etiqueta FLAG®). Tales etiquetas están situadas típicamente en el término amino o el término carboxilo del polipéptido, pero pueden estar situadas en cualquier lugar dentro del polipéptido. Estas etiquetas pueden servir como componente no propio mientras ayudan en la detección y/o purificación de los polipéptidos.

El segmento o segmentos propios, así como el segmento o segmentos no propios, pueden tener cualquier longitud, y típicamente tienen al menos 5 aminoácidos de longitud (por ejemplo, al menos aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 150, 175, 200, 500, 750, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000 o más aminoácidos de longitud). Por ejemplo, el segmento o segmentos propios, así como el segmento o segmentos no propios, pueden tener una longitud variable desde aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70 u 80 aminoácidos hasta aproximadamente 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250 o 500 aminoácidos. Típicamente, el segmento (o segmentos) propios de un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 (por ejemplo, 85, 90, 95 o 99) por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido que es nativo del mamífero al que ha de administrarse la composición. Por ejemplo, cuando se vacuna un ser humano, un segmento de IgE propio de un polipéptido de IgE quimérico puede tener aproximadamente 110 aminoácidos de longitud con aproximadamente 95 por ciento de identidad con secuencias de IgE humana en esa longitud de 110 aminoácidos.

Una longitud y porcentaje de identidad sobre esa longitud para cualquier secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos se determina como sigue. Primero, se compara una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos con la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos identificada usando el programa BLAST 2 Sequences (Bl2seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene BLASTN versión 2.0.14 y BLASTP versión 2.0.14. Esta versión independiente de BLASTZ puede obtenerse en el sitio web de Fish & Richardson (www.fr.com/blast; World Wide Web en "fr" punto "com" barra "blast") o en el sitio web del National Center for Biotechnology Information del gobierno de los EE.UU. (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables; World Wide Web en "ncbi" punto "nlm" punto "nih" punto "gov" barra "blast" barra "executables"). Pueden encontrarse instrucciones que explican cómo usar el programa Bl2seq en el archivo léame que acompaña a BLASTZ.

El Bl2seq realiza una comparación entre dos secuencias usando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se usa para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. Para comparar dos secuencias de ácidos nucleicos, las opciones se destinan como sigue: -i se destina a un archivo que contiene la primera secuencia de ácidos nucleicos a comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se destina a un archivo que contiene la segunda secuencia de ácidos nucleicos a comparar (por ejemplo, C:\seq2.xt); -p se destina a blastn; -o se destina a cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); -q se destina a -1; -r se destina a 2; y se dejan todas las otras opciones en su ajuste por defecto. Por ejemplo, puede usarse el siguiente comando para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Para comparar dos secuencias de aminoácidos, las opciones de Bl2seq se destinan como sigue: -i se destina a un archivo que contiene la primera secuencia de aminoácidos a comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se destina a un archivo que contiene la segunda secuencia de aminoácidos a comparar (por ejemplo, C:\seq2.xt); -p se destina a blastp; -o se destina a cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); y se dejan todas las otras opciones en su ajuste por defecto. Por ejemplo, puede usarse el siguiente comando para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias de aminoácidos: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2txt -p blastp -o c\output.txt. Si la secuencia objetivo comparte homología con cualquier porción de la secuencia identificada, el archivo de salida designado presentará esas regiones de homología como secuencias alineadas. Si las secuencias objetivo no comparten homología con ninguna porción de la secuencia identificada, el archivo de salida designado no presentará secuencias alineadas. Una vez alineada, una longitud se determina contando el número de nucleótidos o residuos de aminoácidos consecutivos de la secuencia objetivo presentados en alineamiento con la secuencia desde el comienzo de la secuencia identificada con cualquier posición coincidente y terminando con cualquier otra posición coincidente. Una posición coincidente es cualquier posición en la que se presenta un nucleótido o residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias objetivo e identificada. Las aberturas presentadas en la secuencia objetivo no se cuentan porque las aberturas no son nucleótidos o residuos de aminoácidos. De igual modo, las aberturas presentadas en la secuencia identificada no se cuentan porque se cuentan nucleótidos o residuos de aminoácidos de la secuencia objetivo, no nucleótidos o residuos de aminoácidos de la secuencia identificada.

El porcentaje de identidad sobre una longitud determinada se determina contando el número de posiciones coincidentes sobre esa longitud y dividiendo ese número por la longitud y multiplicando el valor resultante por 100. Por ejemplo, si (1) se compara una secuencia objetivo de 1.000 aminoácidos con una secuencia de ensayo de 200 aminoácidos, (2) el programa Bl2seq presenta 200 aminoácidos de la secuencia objetivo alineados con una región de la secuencia de ensayo en la que los primero y último nucleótidos de esa región de 200 nucleótidos son coincidentes y (3) el número de coincidencias sobre esos 200 nucleótidos alineados es 180, la secuencia objetivo de 1.000 nucleótidos contiene una longitud de 200 y un porcentaje de identidad sobre esa longitud de 90 (es decir, 180/200 x 100 = 90).

Se apreciará que una secuencia objetivo de ácidos nucleicos o aminoácidos simple que se alinea con una secuencia identificada puede tener muchas longitudes diferentes teniendo cada longitud su propio porcentaje de identidad. Por ejemplo, una secuencia objetivo que contenga una región de 20 nucleótidos que se alinea con una secuencia identificada como sigue tiene muchas longitudes diferentes, incluyendo las listadas en la Tabla I.

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TABLA I

2

Se indica que el valor del porcentaje de identidad se redondea a la décima más próxima. Por ejemplo, 78,11, 78,12, 78,13 y 78,14 se redondean a 78,1, mientras que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 y 78,19 se redondean a 78,2. Se indica también que el valor de longitud será siempre un número entero.

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Puede usarse cualquier método para obtener un polipéptido. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de clonación molecular para preparar una construcción de ácidos nucleicos que codifique un polipéptido que contenga segmentos propios y no propios (por ejemplo, ORO). Tal construcción puede expresarse en un organismo tal como E. coli o S. cerevisiae, o en un linaje celular, por ejemplo, y puede purificarse después de extractos celulares o de sobrenadantes de cultivo. Alternativamente, puede sintetizarse un polipéptido químicamente.

En particular, pueden diseñarse vectores de ácidos nucleicos para expresar polipéptidos de IgE quiméricos. Los ejemplos de tales vectores de ácidos nucleicos incluyen, sin limitación, los indicados en las Figuras 1, 2, 5 y 6. Además, los vectores de ácidos nucleicos pueden contener una secuencia inerte. La expresión "secuencia de inserto" según se usa aquí se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que se inserta en un vector de ácidos nucleicos de tal modo que pueda expresarse una secuencia de ácidos nucleicos insertada. Una secuencia de inserto puede ser una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de IgE quimérico tal como un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos indicada en las Figuras 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o 23. Tales secuencias de ácidos nucleicos pueden ser como se indica en las Figuras 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 22 o 24. La expresión "polipéptido de IgE quimérico" según se usa aquí se refiere a un polipéptido que tiene una combinación de secuencias de IgE (por ejemplo, dominios completos, medios dominios o cuartos de dominios) de diferentes especies. Un polipéptido de IgE quimérico contiene típicamente dominios de cadena pesada constante (CH) de IgE (por ejemplo, CH1, CH2, CH3 o CH4). Por ejemplo, una secuencia de inserto que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 2 puede codificar un polipéptido de IgE quimérico CH2 de zarigüeya-CH3 de rata-CH4 de zarigüeya (ORO) (SEQ ID NO: 3). Otros ejemplos de secuencias de inserto incluyen, sin limitación, (1) una secuencia de inserto que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 5 que codifica un polipéptido de IgE quimérico CH2 de zarigüeya-CH3 humano-CH4 de zarigüeya (OSO) (SEQ ID NO: 6), (2) una secuencia de inserto que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 7 que codifica un polipéptido de IgE quimérico CH2 de zarigüeya-CH3 de rata-CH2 de zarigüeya-CH3 de rata-CH4 de zarigüeya (ORORO) (SEQ ID NO: 8) y (3) una secuencia de inserto que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 15 que codifica un polipéptido de IgE quimérico CH2 de zarigüeya-CH3 humano-CH2 de zarigüeya-CH3 humano-CH4 de zarigüeya (OSOSO) (SEQ ID NO: 16). Además, una secuencia de inserto puede tener una secuencia que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos en la Solicitud de Patente Internacional Nº de Serie PCT/SE99/01896. Además de rata y humana, pueden usarse secuencias de IgE (por ejemplo, dominios) de otras especies en secuencias de inserto quiméricas. Tales especies incluyen, sin limitación, perro, gato, caballo, cerdo, vaca y mono. Por ejemplo, una secuencia de inserto que incluye dominios de IgE de zarigüeya y mono (por ejemplo, cynomolgus) puede codificar un polipéptido de IgE quimérico CH2 de zarigüeya-CH3 de cynomolgus-CH4 de zarigüeya (OCO). Otras secuencias de inserto que tienen secuencias de IgE (por ejemplo, dominios) de zarigüeya y mono incluyen, sin limitación, secuencias que codifican CH2 de zarigüeya-CH3 de cynomolgus-CH4 de zarigüeya (OCO-H), en las que la secuencia contiene una etiqueta de histidina C-terminal; secuencias que codifican CH2 de zarigüeya-CH3 de cynomolgus-CH2 de zarigüeya-CH3 de cynomolgus-CH4 de zarigüeya (OCOCO); y secuencias que codifican CH2 de zarigüeya-CH3 de cynomolgus-CH2 de zarigüeya-CH3 de cynomolgus-CH4 de zarigüeya, en las que la secuencia contiene una etiqueta de histidina C-terminal (OCOCO-H).

Una secuencia de inserto puede modificarse. Tales modificaciones pueden incluir, sin limitación, adiciones, supresiones, sustituciones, mutaciones puntuales y combinaciones de ellas. Una secuencia de inserto puede modificarse para incluir una secuencia de polihistidina C-terminal para ayudar en la purificación del polipéptido codificado por la secuencia de inserto. Se han descrito en otra parte secuencias de polihistidina usados para este fin (Ford et al., Protein Expr. Purif., 2(2-3):95-107, 1991). Por ejemplo, una secuencia de inserto que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 13 puede codificar un polipéptido de IgE quimérico OSO incluyendo una secuencia de polihistidina C-terminal (OSO-H; SEQ ID NO: 14). Una secuencia de inserto puede modificarse para contener mutaciones puntuales. Por ejemplo, una secuencia de inserto que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 11 puede codificar un polipéptido de IgE quimérico OSOSO que contiene mutaciones puntuales en los dominios CH3 humanos que suprimen la unión de receptores de células cebada (modOSOSO; SEQ ID NO: 12). Otros ejemplos de secuencias de inserto modificadas incluyen, sin limitación, una secuencia de inserto que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 17 que codifica un polipéptido de IgE quimérico OSOSO que incluye una secuencia de polihistidina C-terminal (OSOSO-H; SEQ ID NO: 18) y una secuencia de inserto que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO: 9 que codifica un polipéptido de IgE quimérico OSOSO que incluye una secuencia de polihistidina C-terminal y que contiene mutaciones puntuales en los dominios CH3 humanos que suprimen la unión de receptores de células cebada (modOSOSO-H; SEQ ID NO: 10).

Un vector de ácido nucleico puede contener también componentes que afectan a la expresión de la secuencia de inserto. Los ejemplos de tales componentes incluyen, sin limitación, secuencias de promotor, aumentador, líder y de poliadenilación. Tales componentes pueden estar enlazados operativamente a la secuencia de inserto. La expresión "enlazado operativamente" según se usa aquí se refiere a una disposición en la que los componentes descritos así se configuran para realizar su función usual. Por ejemplo, un vector de ácido nucleico con una secuencia de inserto que codifique un polipéptido de IgE quimérico OSOSO puede contener también una secuencia de promotor de citomegalovirus (CMV) (véase, por ejemplo, Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81(3):659-663, 1984), una secuencia líder de inmunoglobulina (Ig) (véase, por ejemplo, Neuberger et al., EMBO J., 2(8):1373-1378, 1983) y una secuencia de poliadenilación de hormona del crecimiento de bovino (bGH) (véase, por ejemplo, Goodwin et al., J. Biol. Chem., 267:16330-16334, 1992). En este caso, los componentes pueden enlazarse operativamente a la secuencia de inserto de tal modo que el promotor de CMV pueda dirigir la expresión de la secuencia de inserto, incluyendo la secuencia líder de Ig y la secuencia de poliadenilación de bGH, la secuencia líder de Ig pueda dirigir la secuencia de inserto expresada en el interior del retículo endoplásmico en la preparación para secreción, y la secuencia de poliadenilación de bGH pueda estabilizar el transcripto de la secuencia de inserto.

Además, un vector de ácido nucleico puede contener componentes que ayudan al crecimiento, mantenimiento o selección de una célula hospedante que contenga el vector de ácido nucleico. Tales componentes incluyen, sin limitación, orígenes de replicación y marcadores de selección de antibióticos. Por ejemplo, un vector de ácido nucleico con una secuencia de promotor de CMV, una secuencia líder de Ig, una secuencia de poliadenilación tardía de SV40 y una secuencia de inserto que codifique un polipéptido de IgE quimérico OSOSO puede contener también una secuencia de origen de replicación f1, una secuencia que confiere resistencia a ampicilina en una célula hospedante bacteriana cuando se expresa y una secuencia que confiere resistencia a neomicina en una célula hospedante de mamífero cuando se expresa. Otros ejemplos de marcadores de selección antibiótica incluyen, sin limitación, secuencias que confieren resistencia a higromicina B, puromicina, canamicina, tetraciclina, blasticidina S, Geneticin® y zeocina en una célula hospedante cuando se expresan. Pueden obtenerse comercialmente vectores de ácidos nucleicos que contienen uno o más de un componente descrito aquí de, por ejemplo, Invitrogen (Carlsbad, CA) y Promega (Madison, WI).

Puede obtenerse un polipéptido que contiene secuencias de IgE propias usando células hospedantes que contengan un vector de ácido nucleico (por ejemplo, el vector pCI-neo de Promega, número de catálogo E1841) con al menos una de las secuencias de inserto proporcionadas aquí (por ejemplo, ORO, OSO, ORORO, modORORO-H, modOSOSO, OSO-H, OSOSO y OSOSO-H). Tales células pueden ser células procariotas (por ejemplo, células JM109 o DH5\alpha). Las células hospedantes que contienen el vector de ácido nucleico pueden o no expresar el polipéptido codificado. Por ejemplo, una célula hospedante puede funcionar simplemente para propagar el vector de ácido nucleico para uso en otras células hospedantes. Además, el vector de ácido nucleico puede integrarse en el genoma del hospedante o mantenerse en un estado episómico. Así, una célula hospedante puede transfectarse estable o transitoriamente con el vector de ácido nucleico.

Una célula hospedante puede contener un vector de ácido nucleico con una secuencia de inserto que codifique un polipéptido de IgE quimérico. Por ejemplo, una célula hospedante puede contener un vector de ácido nucleico con una secuencia de inserto que codifique un polipéptido de IgE quimérico OSO o cualquiera de los polipéptidos de IgE quiméricos proporcionados aquí. Además, una célula hospedante puede expresar el polipéptido codificado por la secuencia de inserto.

Pueden usarse diversos métodos para introducir un vector de ácido nucleico en una célula hospedante in vivo o in vitro. Por ejemplo, precipitación con fosfato cálcico, electroporación, choque térmico, lipofección, microinyección y transferencia de ácido nucleico mediada por virus son métodos comunes que pueden usarse para introducir un vector de ácido nucleico en una célula hospedante. Además, ADN desprotegido puede suministrarse directamente a células in vivo como se describe en otro lugar (Patentes de los EE.UU. números 5.580.859 y 5.589.466). Además, un vector de ácido nucleico puede introducirse en células para generar animales transgénicos.

Los animales transgénicos pueden ser animales acuáticos (tales como peces, tiburones, delfines y similares), animales de granja (tales como cerdos, cabras, ovejas, vacas, caballos, conejos y similares), roedores (tales como ratas, cobayas y ratones), primates no humanos (tales como mandriles, monos y chimpancés) y animales domésticos (tales como perros y gatos). Pueden usarse varios métodos conocidos en la técnica para introducir un vector de ácido nucleico en animales para producir los linajes fundadores de animales transgénicos. Tales métodos incluyen, sin limitación, microinyección pronuclear (Patente de los EE.UU. Nº 4.873.191); transferencia de genes mediada por retrovirus a linajes germinales (Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6148 (1985)); transfección de genes a células estaminales embriónicas (Gossler A et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:9065-9069 (1986)); fijación de objetivo de genes a células estaminales embriónicas (Thompson et al., Cell, 56:313 (1989)); transferencia nuclear de núcleos somáticos (Schnieke AE et al., Science 278:2130-2133 (1997)); y electroporación de embriones (Lo CW, Mol. Cell. Biol., 3:1803-1814 (1983)). Una vez obtenidos, los animales transgénicos pueden replicarse usando cría tradicional o clonación de animales.

Pueden usarse diversos métodos para identificar una célula hospedante que contenga un vector de ácido nucleico proporcionado aquí. Tales métodos incluyen, sin limitación, PCR, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos tales como análisis de Northern y Southern e hibridación in situ de ácidos nucleicos. En algunos casos, pueden usarse técnicas de inmunohistoquímica y bioquímicas para determinar si una célula contiene un vector de ácido nucleico con una secuencia de inserto particular detectando la expresión de un polipéptido codificado por esa secuencia de inserto particular.

Puede usarse cualquier método para producir polipéptidos de IgE quiméricos recombinantes. Tales métodos implican cultivar una célula hospedante que exprese un polipéptido de IgE quimérico y recuperar los polipéptidos de IgE quiméricos expresados. Puede usarse cualquier método para recuperar un polipéptido de IgE quimérico recombinante. Por ejemplo, pueden recuperarse polipéptidos de IgE quiméricos recombinantes que están presentes en un homogenado de células hospedantes usando cromatografía de intercambio iónico. En otro ejemplo, pueden recuperarse polipéptidos de IgE quiméricos recombinantes con secuencias de polihistidina de un homogenado de células hospedantes haciendo pasar el homogenado sobre una columna de níquel y eluyendo con imidazol los polipéptidos que contienen polihistidina. Un polipéptido de IgE quimérico recombinante particular con una secuencia líder que dirige la secreción del polipéptido puede recuperarse del medio de crecimiento de una célula hospedante que expresa ese polipéptido. Por ejemplo, puede recogerse el medio de crecimiento de un cultivo de células hospedantes de mamífero que expresan y segregan polipéptidos ORO u OSO, y pueden recuperarse los polipéptidos ORO u OSO usando cromatografía. Se entiende que una secuencia líder que dirige la secreción de un polipéptido se separa típicamente de ese polipéptido en la célula hospedante por proteólisis. Así, el polipéptido segregado recuperado, en muchos casos, está exento de cualquier secuencia líder traducida.

En una realización, el medio de células de un linaje de células CHO clonal que expresan y segregan polipéptidos ORO u OSO se recoge y centrifuga para separar residuos de células. Después de centrifugar, se dializa el sobrenadante y se hace pasar sobre una columna de intercambio iónico permitiendo unirse los polipéptidos ORO u OSO. Los polipéptidos ORO u OSO unidos se eluyen usando un gradiente de cloruro sódico/acetato sódico, y se examinan en las fracciones eluídas polipéptidos ORO u OSO recombinantes usando una técnica ELISA. Las fracciones eluídas con alta reactividad ELISA pueden agruparse y dializarse de nuevo, y las fracciones agrupadas dializadas pueden hacerse pasar sobre una columna de interacción hidrófoba permitiendo unirse los polipéptidos ORO u OSO. Los polipéptidos ORO u OSO unidos se eluyen usando un gradiente de fosfato sódico, y se examinan de nuevo en las fracciones eluídas polipéptidos ORO u OSO recombinantes usando una técnica ELISA. Las fracciones eluídas con alta reactividad ELISA pueden analizarse adicionalmente por SDS-PAGE coloreada con plata para estimar la pureza de los polipéptidos ORO u OSO.

Como se ha descrito aquí, pueden combinarse alumbre así como otros compuestos basados en aluminio (por ejemplo, Al_{2}O_{3}) con un polipéptido que contenga un segmento de polipéptido propio (por ejemplo, una secuencia de IgE propia) para formar una composición que obtenga una respuesta anti-propia cuando se administra a un mamífero. Pueden obtenerse compuestos basados en aluminio de diversos suministradores comerciales. Por ejemplo, pueden obtenerse coadyuvantes REHYDRAGEL® de Reheis Inc. (Berkeley Heights, NJ). Los coadyuvantes REHYDRAGEL® se basan en oxihidróxido de aluminio cristalino, y son geles hidratados que contienen partículas cristalinas con una gran superficie específica (aproximadamente 525 m^{2}/g). Su contenido de Al_{2}O_{3} varía típicamente de alrededor del 2 por ciento a aproximadamente el 10 por ciento. Rehydragel LG, por ejemplo, tiene un contenido de Al_{2}O_{3} de aproximadamente el 6 por ciento, y fluye fácilmente por agitación ligera. Rehydragel LG tiene también una capacidad de unión de proteína de 1,58 (es decir, 1,58 mg de albúmina de suero de bovino unida por 1 mg de Al_{2}O_{3}), un contenido de sodio del 0,02 por ciento, un contenido de cloruro del 0,28 por ciento, sulfato indetectable, un nivel de arsénico menor de 3 ppm, un contenido de metales pesados menor de 15 ppm, un pH de 6,5 y una viscosidad de 1.090 cp. Rehydragel LG puede combinarse con una solución de polipéptido (por ejemplo, un polipéptido en PBS) para producir Al(OH)_{3}. Además, puede usarse ALHYDROGEL^{TM}, un coadyuvante gel de hidróxido de aluminio (Alhydrogel 1,3%, Alhydrogel 2,0% o Alhydrogel "85") obtenido de Brenntag Stinnes Logistics.

Además, puede combinarse MN51 con un polipéptido que contenga un segmento de polipéptido propio (por ejemplo, una secuencia de IgE propia) para formar una composición que obtenga una respuesta anti-propia cuando se administre a un mamífero. MN51 (Coadyuvante SEPPIC incompleto de MONTANIDE® (ISA) 51) así como MN720 están disponibles de Seppic (París, Francia). MN51 contiene oleato de manida (MONTANIDE® 80, también conocido como octadecenoato de manitol anhidro) en solución de aceite mineral (Drakeol 6 VR). MONTANIDE® 80 es un líquido transparente con un contenido de ácido libre máximo de 1, un índice de saponificación de 164-172, un índice de hidroxilo de 89-100, un índice de yodo de 67-75, un índice de peróxido máximo de 2, un índice de metales pesados menor de 20 ppm, un contenido de agua máximo del 0,35%, un índice de color máximo de 9 y una viscosidad a 25ºC de aproximadamente 300 mPas. MONTANIDE® asociado con un aceite (por ejemplo, aceite mineral, aceite vegetal, escualano, escualeno o ésteres) es conocido como MONTANIDE® ISA. Drakeol 6 VR es un aceite mineral de calidad farmacéutica. Drakeol 6 VR no contiene hidrocarburos insaturados o aromáticos y tiene una gravedad A.P.I. de 36,2-36,8, un peso específico a 25ºC de 0,834-0,838, una viscosidad a 37,8ºC de 10,0-10,6 centistokes, un índice de refracción a 25ºC de 1,458-1,463, una prueba de ácido mejor que la mínima, es negativo en fluorescencia a 360 nm, es negativo en materia suspendida visible, tiene un valor de prueba de fluidez ASTM de -17,8 a -9,4ºC, tiene un punto de inflamación ASTM mínimo de 146,1ºC y se ajusta a todos los requisitos RN para aceite mineral ligero y absorción ultravioleta. MN51 contiene alrededor del 8 a 12 por ciento de octadecenoato de manitol anhidro y aproximadamente 88 a 92 por ciento de aceite mineral. MN51 es un líquido amarillo claro que tiene un contenido de ácido libre máximo de 0,5, un índice de saponificación de 16-20, un índice de hidroxilo de 9-13, un índice de peróxido máximo de 2, un índice de yodo de 5-9, un contenido de agua máximo del 0,5%, un índice de refracción a 25ºC entre 1,455 y 1,465, una densidad a 20ºC de aproximadamente 0,85 y una viscosidad a 20ºC de aproximadamente 50 mPas. La conductividad de una mezcla 50:50 de MN51 y solución salina es menor de 10 \muScm^{-1}.

Otros coadyuvantes incluyen complejos inmuno-estimulantes (ISCOMs) que pueden contener componentes tales como colesterol y saponinas. Las matrices de ISCOM pueden prepararse y conjugarse a Cu^{2+} usando métodos tales como los descritos aquí. Coadyuvantes tales como FCA, FIA, MN51, MN720 y Al(OH)_{3} están disponibles comercialmente de compañías tales como Seppic, Difco Laboratories (Detroit, MI) y Superfos Biosector A/S (Vedbeak, Dinamarca).

En algunas realizaciones, una composición puede contener también uno o más componentes inmunoestimuladores adicionales. Estos incluyen, sin limitación, muramildipéptido (por ejemplo, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina; MDP), monofosforil-lípido A (MPL) y tripéptidos que contienen formil-metionina tales como N-formil-Met-Leu-Phe. Tales compuestos están disponibles comercialmente de Sigma Chemical Co. (St Louis, MO) y RIBI ImmunoChem Research, Inc. (Hamilton, MT), por ejemplo.

Una "dosis unitaria" de una composición se refiere a la cantidad de una composición administrada a un mamífero de una vez. Una dosis unitaria de las composiciones proporcionadas aquí puede contener cualquier cantidad de polipéptido. Por ejemplo, una dosis unitaria de una composición puede contener entre alrededor de 10 \mug y aproximadamente 1 g (por ejemplo, 10 \mug, 15 \mug, 25 \mug, 30 \mug, 50 \mug, 100 \mug, 250 \mug, 280 \mug, 300 \mug, 500 \mug, 750 \mug, 1 mg, 10 mg, 15 mg, 25 mg, 30 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg, 280 mg, 300 mg, 500 mg, 750 mg o más) de un polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido puede disolverse o suspenderse en un tampón fisiológico tal como, por ejemplo, agua o solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,0. La solución de polipéptido puede combinarse después con el coadyuvante y cualesquiera otros componentes de la composición.

De modo similar, una dosis unitaria de una composición puede contener cualquier cantidad de un coadyuvante. Por ejemplo, una dosis unitaria puede contener entre alrededor de 10 \mul y aproximadamente 1 ml (por ejemplo, 10 \mul, 25 \mul, 50 \mul, 100 \mul, 250 \mul, 500 \mul, 750 \mul, 800 \mul, 900 \mul o 1 ml).de uno o más coadyuvantes. Además, una dosis unitaria de una composición puede contener cualquier cantidad de otro componente inmunoestimulador. Por ejemplo, una composición proporcionada aquí puede contener entre alrededor de 10 \mug y aproximadamente 1 g (por ejemplo, 10 \mug, 15 \mug, 25 \mug, 30 \mug, 50 \mug, 100 \mug, 250 \mug, 280 \mug, 300 \mug, 500 \mug, 750 \mug, 1 mg, 10 mg, 15 mg, 25 mg, 30 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg, 280 mg, 300 mg, 500 mg, 750 mg o más) de un componente inmunoestimulador.

Las composiciones proporcionadas aquí pueden contener cualquier relación de coadyuvante a polipéptido. La relación coadyuvante:antígeno puede ser, por ejemplo, 50:50 (v:v). Alternativamente, la relación coadyuvante:antígeno puede ser, sin limitación, 90:10, 80:20, 70:30, 64:36, 60:40, 55:45, 40:60, 30:70, 20:80 o 90:10.

La invención proporciona también métodos para preparar las composiciones proporcionadas aquí. Tales métodos pueden implicar suspender una cantidad de un polipéptido (por ejemplo, 100 \mug de ORO) en una cantidad adecuada de un tampón fisiológico (por ejemplo, 50 \mul de PBS pH 7,0), y combinar después el antígeno suspendido o disuelto con una cantidad adecuada de un coadyuvante (por ejemplo, 50 \mul de MN51 o 100 \mul de REHYDRAGEL®). La etapa de combinación puede conseguirse por cualquier método, incluyendo agitación, sacudidas, formación de vórtice o paso atrás y alante a través de una aguja incorporada a una jeringa, por ejemplo. Se indica que la composición puede prepararse en discontinuo, de tal modo que se obtengan suficientes dosis unitarias para inyecciones múltiples (por ejemplo, inyecciones en animales múltiples o múltiples inyecciones en el mismo animal).

La invención proporciona también métodos para inducir una respuesta anti-propia en un mamífero (por ejemplo, un ratón, una rata, un gato, un perro, un caballo, una vaca, un primate no humano tal como un mono cynomolgus, o un ser humano). Tales métodos pueden implicar administrar a un mamífero una composición proporcionada aquí, en los que la composición contiene un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos de un polipéptido propio (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos del dominio CH3 de un polipéptido de IgE encontrado en esa especie particular de mamífero). El polipéptido puede contener al menos una secuencia de aminoácidos de otra especie (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos del dominio CH2 o CH4 de un polipéptido de IgE encontrado en una especie diferente).

En general, las composiciones que contienen un polipéptido proporcionadas aquí pueden usarse como una vacuna de alergia para abrogar la cascada alérgica eliminando IgE circulante (Figuras 25-28). Las composiciones pueden inducir una respuesta de anticuerpo contra IgE propia en el receptor. Aunque sin limitarse a ningún modo particular de acción, se cree que la administración de composiciones que contienen un polipéptido con secuencias de IgE propia en un contexto que permite romper la tolerancia del mamífero a IgE conduce a la producción de anticuerpos anti-IgE propia, que disminuye a su vez el nivel de anticuerpos de IgE propia circulantes.

Las composiciones proporcionadas aquí pueden proporcionarse mediante un cierto número de métodos. La administración puede ser, por ejemplo, tópica (por ejemplo, transdérmica, oftálmica o intranasal); pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles); oral; o parenteral (por ejemplo, por inyección subcutánea, intratecal, intraventicular, intramuscular o intraperironeal, o por goteo intravenoso). La administración puede ser rápida (por ejemplo, por inyección) o puede tener lugar durante un período de tiempo (por ejemplo, por infusión lenta o administración de formulaciones de liberación lenta).

Puede administrarse cualquier dosis a un mamífero. Las dosificaciones pueden variar dependiendo de la eficacia relativa de composiciones individuales, y pueden estimarse generalmente en base a datos obtenidos de modelos de animales in vitro e in vivo. Típicamente, la dosificación es de alrededor de 0,01 \mug a aproximadamente 100 g por kg de peso corporal, y puede darse una vez o más diariamente, semanalmente o incluso menos a menudo. Tras una administración con éxito, puede ser deseable que el sujeto experimente administraciones de refuerzo adicionales para mantener un nivel adecuado de la respuesta anti-propia.

La respuesta anti-propia (por ejemplo, respuesta de anticuerpo anti-IgE propia) a una composición en un mamífero puede valorarse usando cualquier método. Por ejemplo, puede medirse el título anti-IgE propia. Alternativamente, puede determinarse un "valor de dilución_{50} de título" usando un ELISA y midiendo la densidad óptica (OD) de diluciones (por ejemplo, diluciones en serie) de las muestras de suero. Se considera que el factor de dilución que produce una reducción del 50 por ciento de la OD máxima es el valor de dilución_{50} de título. Este valor puede calcularse por ajuste de curva usando, por ejemplo, el programa de software SOFTmax® Pro 4.0 que está disponible de Molecular Devices, Inc. (Sunnyvale, CA). Usando una regresión no lineal de cuatro parámetros para ajuste de curva, este programa puede usarse para ajustar puntos de datos a una curva y determinar el valor de dilución_{50} de título.

La invención proporciona también métodos para medir niveles de IgE libre en el suero de un sujeto (por ejemplo, un mamífero) tratado con un polipéptido que contiene uno o más segmentos de IgE propia (por ejemplo, ORO). Tales métodos pueden implicar proporcionar una muestra de suero de un sujeto tratado con, por ejemplo, ORO, e incubar la muestra con un polipéptido de receptor de IgE, tal como la cadena alfa de receptor de IgE humano (por ejemplo, el polipéptido que tiene GenBank Nº de admisión NM_002001) para formar complejos IgE/receptor de IgE. Puede usarse cualquier secuencia de receptor de IgE (o una porción de ella). Por ejemplo, puede usarse una cadena alfa de receptor de IgE humana para medir IgE libre en seres humanos u otros primates tales como monos. Después de incubar el polipéptido de receptor de IgE con la muestra que contiene IgE libre, pueden medirse los complejos IgE/receptor de IgE formados. Puede usarse cualquier método para medir complejos IgE/receptor de IgE. Por ejemplo, pueden usarse ensayos inmunológicos tales como ELISAs y procedimientos tipo ELISA para medir complejos IgE/receptor de
IgE.

La invención proporciona también juegos para valorar la cantidad de IgE libre presente en un mamífero tratado con una composición que contiene polipéptido anti-IgE propia. Tales juegos pueden contener una secuencia de receptor de IgE y un anticuerpo capaz de unirse a un complejo IgE/receptor de IgE. Los juegos proporcionados aquí pueden contener también una composición descrita aquí tal como una composición que contiene ORO. Tales juegos pueden usarse para valorar niveles de IgE libre en un mamífero y, si se necesita, para proporcionar un refuerzo adicional de la composición que contiene polipéptido propio. Los juegos proporcionados aquí pueden contener reactivos adicionales tales como patrones de IgE, testigos negativos, preparaciones de enzimas y sustratos de enzimas.

La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

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Ejemplos Ejemplo 1 Evaluación de coadyuvantes de vacunas Producción del componente de vacuna activo, H-ORO

El componente activo de la vacuna, H-ORO, se codificó por una construcción recombinante que contenía 1.41 pb del dominio C3 de \varepsilon-cadena pesada de rata (Hellman et al., Nucl. Acids Res., 10:6041 (1982)) flanqueado por los dominios C2 y C4 de la \varepsilon-cadena pesada de zarigüeya (Aveskogh y Hellman, Eur. J. Immunol., 28:2738 (1998)). Esta construcción (Figura 29) se expresó en células 293-EBNA y se purificó en Ni-NTA Agarosa (QIAGEN GmbH, Alemania) como se ha descrito previamente (Vernersson et al., FASEB J., 16:875 (2002)). El componente H-ORO se obtuvo con una concentración de 1,5 mg/ml en PBS pH 7,0.

Estudio 1

Veinte ratas Wistar hembras de 8-10 semanas de edad (Benton y Kingman, Sollentuna, Suecia) se sensibilizaron contra ovalbúmina (OVA). Los animales recibieron una inyección intraperironeal (i.p.) inicial de 10 \mug de OVA (Sigma Chemical Co., MO) en pBS pH 7,0, seguida por inyecciones i.p. semanales de 3 \mug de OVA en PBS pH 7,0 durante 5 semanas antes de la vacunación inicial, y continuando durante todo el programa de vacunación.

Cinco grupos de cuatro animales recibieron una vacunación i.p. inicial de H-ORO mezclado con uno de los siguientes coadyuvantes: FCA (Difco Laboratories, Detroit, MI), Al(OH)_{3} (Superfos Biosector A/S, Vedbeak, Dinamarca) o matriz de ISCOM conjugada a Cu^{2+} (Andersson et al. (2001) J. Immunol. Methods 255:135). Los animales 1-4 recibieron 100 \mug de H-ORO en 50 \mul de PBS pH 7,0, mezclado 50:50 con FCA: Los animales 5-8 recibieron 100 \mug de H-ORO y suspensión de Al(OH)_{3} del 10% en volumen en 100 \mul de PBS pH 7,0. Los animales 9-12 recibieron 100 \mug de H-ORO en 50 \mul de PBS pH 7,0 mezclado 50:50 con matriz de ISCOM conjugada a Cu^{2+}. Los animales 13-16 recibieron 25 \mug de H-ORO en 50 \mul de PBS pH 7,0 mezclado 50:50 con matriz de ISCOM conjugada a Cu^{2+}. Se administraron vacunaciones de refuerzo en la semana tres del programa de tratamiento. Las vacunaciones de refuerzo fueron idénticas a las vacunaciones iniciales, con la excepción de que se usó FIA (Difco Laboratories) en lugar de FCA en los animales 1-4.

Se recogieron de la vena de la cola muestras de sangre de 1 ml antes de iniciar la sensibilización, tres días antes de la vacunación y dos semanas después de la vacunación de refuerzo. Se permitió coagularse la sangre durante la noche a 4ºC y se centrifugó durante 10 minutos a 10.000 rpm (EBA12R, Hettich Zentrifugen, Alemania). Los sueros se transfirieron a tubos Eppendorf y se congelaron hasta evaluación por ELISA.

Las preparaciones de vacuna que contenían Al(OH)_{3} se mezclaron hasta una suspensión de Al(OH)_{3} del 10% en volumen con 100 \mug de proteína H-ORO en PBS pH 7,0 un día antes de la vacunación y se guardaron a 4ºC durante la noche. La matriz de ISCOM se preparó como sigue: La matriz de IDA con Cu^{2+} tenía un contenido de QA estimado de 1,7 mg/ml y un contenido de colesterol estimado de 0,5 mg/ml (Prep. 990823 B). La matriz sin Cu^{2+} tenía un contenido de QA de 2,6 mg/ml y se estimó que el colesterol era 0,8 mg/ml (Prep. 990320). Para cargar la matriz con Cu^{2+}, se preparó una solución madre de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O 1 M en agua. Esta solución se añadió a la preparación de matriz hasta una concentración final de Cu^{2+} 0,1 M. La mezcla se incubó en un sacudidor a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido por diálisis frente a PBS durante la noche a 4ºC. Se añadió antígeno de proteína en una relación de 1:1 al contenido de colesterol y se incubó a 4ºC durante la noche.

Estudio 2

Un total de cuarenta ratas Wistar hembras de 8-10 semanas de edad divididas en diez grupos de cuatro animales recibieron una inyección i.p. inicial de 200 \mul de 100 \mug de H-ORO en PBS pH 7,0, junto con un coadyuvante y, en algunos grupos, inmunoestimuladores adicionales. Los animales 1-4 recibieron FCA mezclado en una relación 50:50 con antígeno. Los animales 5-8 recibieron MN51 (Seppic, Paris Cedex 07, Francia) en una relación 50:50 con antígeno. Se inyectó a los animales 9-12 MN51:antígeno (50:50) y 200 \mug de MDP (Sigma Chemical Co.) por animal (se disolvieron 25 \mug de MDP en PBS estéril hasta una concentración final de 10 mg/ml). El grupo 4, los animales 13-16, recibió MN51:antígeno (50:50) y 200 \mug de MPL. Se dividió en partes alícuotas una solución de 10 mg/ml de MPL (RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) en metanol/cloroformo (1:4) en volúmenes correspondientes a dosis de 0,2 mg y 0,1 mg de MPL por animal y se evaporaron. Se dio a los animales 17-20 MN51:antígeno (50:50), 200 \mug de MDP y 100 \mug de MPL. Los animales 21-24 recibieron MN51:antígeno (50:50), 200 \mug de MDP, 100 \mug de MPL y 100 \mug de fMLP (Sigma Chemical Co.). Diez mg de fMLP se disolvieron en 1 ml de PBS estéril y 1 ml de etanol del 95%. Los animales 25-28 recibieron MN720 (Seppic) en una relación 70:30 con H-ORO. Se inyectó a los animales 29-32 MN720:antígeno (64:36) y 200 \mug de MDP por animal. Se inyectó a los animales 33-36 MN720:antígeno (70:30) y 200 \mug de MPL. Se dio al grupo 10, animales 37-40, MN720:antígeno (64:36) con adición de 200 \mug de MDP y 100 \mug de MPL.

La dosis de refuerzo contenía la mitad de la cantidad de H-ORO (50 \mug) dada en la vacunación inicial, y se usó FIA en lugar de FCA. Se sacó sangre de la vena de la cola diez días antes de la vacunación y dos semanas después del refuerzo. La sangre se trató como se ha descrito en el Estudio 1.

ELISA anti-IgE de rata

El ELISA anti-IgE de rata se ha descrito previamente (Vernersson et al., supra). Las muestras se ensayaron en sueros simples y de caballo servidos como el ensayo en blanco. Con el fin de correlacionar los valores, se ensayaron en cada placa diluciones en serie de dos de las muestras.

ELISA anti C2-C3-C4 de zarigüeya

Se usó el mismo procedimiento que antes (Vernersson et al., supra), excepto para el antígeno de revestimiento, que fue en este caso C2C3C4 de zarigüeya con una concentración de 5 \mug/ml en tampón de carbonato pH 9,6.

El componente H-ORO

Para aplicarse a la cuestión de la diferencia de respuesta inmune contra componentes propios y no propios, se diseñó una molécula híbrida que contenía regiones propias y no propias y se produjo como una proteína recombinante. Una vacuna que contenía el tercer dominio constante de la \varepsilon-cadena pesada de rata (la especie objetivo) flanqueada por el segundo y cuarto dominios constantes de la cadena pesada de IgE de zarigüeya americana (CH2 de zarigüeya-CH3 de rata-CH4 de zarigüeya; H-ORO, Figura 29) se expresó en células de riñón embriónico humano 293-EBNA. La producción media fue aproximadamente 1 mg de proteína H-ORO por litro de medio acondicionado. En base a SDS-PAGE, se estimó que la pureza de H-ORO era al menos el 90%, y se identificó el contaminante principal como BSA derivado del medio de cultivo de células suplementado con FBS (Vernersson et al., supra). Las secuencias de zarigüeya diferían en secuencia en casi el 60% de la IgE de rata, y servían por ello como componente no propio. Los dominios de zarigüeya tenían dos funciones adicionales, actuando ambos como soporte estructural para el componente propio (el dominio C3) y para romper tolerancia de células T al componente propio proporcionando epítopes de células T extraños.

Como reactivo para medir respuestas anti zarigüeya por ELISA, se produjo una IgE C2C3C4 de zarigüeya recombinante (OOO) por el mismo procedimiento descrito antes. La IgE de rata completa purificada se usó para mediciones de las respuestas anti C3 de IgE de rata.

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Resultados

Se estudiaron tres coadyuvantes: coadyuvante de Freund, alumbre (Al(OH)_{3}) y una preparación de ISCOMs. Los diversos coadyuvantes se administraron por inyección i.p. junto con el componente vacuna H-ORO. Los animales se dividieron en cuatro grupos: se dio a 4 animales 100 \mug de H-ORO en CFA, cuatro animales recibieron la misma cantidad de proteína absorbida en alumbre (una suspensión de Al(OH)_{3} del 10% en volumen) de una preparación disponible comercialmente, cuatro animales recibieron 100 \mug de H-ORO absorbido en la superficie de 100 \mug de ISCOMs, y se administró a los cuatro últimos animales la misma cantidad de ISCOMs, pero sólo 25 \mug de H-ORO. La razón detrás de los niveles reducidos de antígeno fue estudiar el efecto de una densidad de carga menor en los ISCOMs, que puede influir en la disponibilidad para que el sistema inmune reconozca los epítopes superficiales.

Se administraron vacunaciones de refuerzo en la semana tres del programa de tratamiento. Las vacunaciones de refuerzo fueron idénticas a las vacunaciones iniciales, con la excepción de que se usó IFA en lugar de FCA en los animales 1-4. Se recogieron muestras de sangre de 1 ml de la vena de la cola tres días antes de la vacunación y dos semanas después de la vacunación de refuerzo.

Se realizaron análisis ELISA comparativos en sueros de la semana 5 del programa de tratamiento. Las placas de ELISA se revistieron con IgE de rata completa con el fin de medir respuestas inmunes anti C3 de rata (la respuesta anti-propia) o con proteína recombinante C2C3C4 de zarigüeya (OOO) para medir respuestas anti-no propias. Sorprendentemente, sólo se detectaron respuestas anti-propias sustanciales con coadyuvante de Freund (Figura 30A). No se detectó respuesta con alumbre en este experimento, y se observó sólo respuesta en uno de los cuatro animales que recibieron la dosis de 25 \mug de H-ORO absorbido en ISCOMs. Sin embargo, cuando se miden las respuestas anti-no propias, los ISCOMs eran comparables con Freund, y no podía detectarse una diferencia significativa de magnitud entre estos dos coadyuvantes. Sin embargo, el alumbre mostró ser un coadyuvante menos eficaz. El alumbre dio una respuesta de aproximadamente el 20% de los niveles vistos con Freund y los ISCOMs (Figura 30B).

Se estimó también la diferencia relativa entre las respuestas propia y no propia realizando un ensayo ELISA en el que diferentes pocillos de la misma placa se revistieron con IgE de rata u con OOO. Se encontró que las relaciones entre respuesta anti-no propia y la respuesta anti-propia en los animales tratados con Freund era 150, 175, 150 y 750 para los cuatro animales, dando un valor medio de una diferencia de título de aproximadamente 300 veces. Aunque se observó una inducción sustancial de anticuerpos anti-propios, esto sugiere que los títulos de anticuerpos contra secuencias de IgE propias eran sustancialmente más bajos que los títulos de anticuerpos contra las secuencias de IgE no propias.

Aunque la inducción de respuestas inmunes anti-no propias con la preparación de ISCOM era comparable en magnitud con los niveles obtenidos en los animales a los que se dio coadyuvante de Freund, los títulos anti-IgE propia eran indetectables o muy bajos. Además, no se detectó anti-IgE propia detectable con la preparación de alumbre. El único coadyuvante que produjo niveles significativos de anticuerpos anti-IgE propia fue coadyuvante de Freund, un coadyuvante basado en aceite mineral.

Ejemplo 2 Un análisis comparativo de MN51 y MN720

Se ensayaron un coadyuvante de aceite mineral disponible comercialmente (MN51) y un coadyuvante (MN720) que se basa en aceite de plantas pero que tiene el mismo emulsionante (monooleato de manida) que MN51 para comparar sus efectos con los efectos de coadyuvante de Freund.

Como en el primer experimento, se ensayó en cuatro animales de cada grupo la inducción de respuestas anti-propia y anti-no propia. Las cantidades de antígeno y coadyuvante fueron 100 \mul de coadyuvante y 100 \mug de H-ORO. Se realizaron análisis ELISA comparativos usando sueros obtenidos en la semana 5 del programa de tratamiento. Se detectó en todos los animales una respuesta anti-IgE propia sustancial. No obstante, la respuesta más prominente se vio con MN51, que era realmente más alta (130%) que la respuesta observada con coadyuvante de Freund (Figura 31A). MN720 produjo una respuesta correspondiente a sólo aproximadamente el 15% de la respuesta vista con Freund. En contraste con la observación para la respuesta anti propia, sin embargo, los tres coadyuvantes eran casi igualmente eficaces en sus capacidades para inducir una respuesta anti-no propia (Figura 31B).

Se determinaron también las magnitudes relativas de las respuestas anti-no propia y anti-propia. La relación entre la respuesta anti-no propia y la respuesta anti-propia en los animales tratados con Freund fue 50, 65 y 75 para tres de los cuatro animales, dando un valor medio de una diferencia de título de aproximadamente 63 veces. La cantidad de sueros obtenidos del cuarto animal fue insuficiente para realizar este análisis. Para MN51, las relaciones fueron 200, 30, 40 y 26 para los cuatro animales, dando un valor medio de diferencia de título de 74 veces.

Ejemplo 3 Un análisis de efectos aditivos potenciales con polipéptidos de MDP, Lípido A y formil-Met

En base a los resultados de los dos experimentos previos, se concluyó que los coadyuvantes basados en aceite mineral son los más eficaces para inducir respuestas anti-IgE propia. La diferencia entre respuestas anti-propia y anti-no propia puede ser aún bastante sustancial, sin embargo, y excede con frecuencia probablemente una diferencia de 50 veces. Se ensayaron así sustancias inmunoestimuladoras bacterianas con el fin de determinar si podía conseguirse un efecto aditivo. Se realizó una serie de experimentos en los que se inmunizaron ratas en grupos de cuatro con 100 \mug de H-ORO en MN51 o MN720, con adición de 200 \mug de MDP, 200 \mug de MPL, 200 \mug de MDP y 100 \mug de MPL, o 200 \mug de MDP, 100 \mug de MPL y 100 \mug de fMLP.

Se realizaron análisis ELISA comparativos en sueros de la semana 5 del grupo de tratamiento. Se midieron las absorbancias y se compararon los valores con una absorbancia relativa con Freund's fijada en 100%. La adición de MLP, MPL, fMLP o una combinación de dos o tres de éstos no tuvo ningún efecto positivo significativo en la respuesta contra los epítopes propio o no propio cuando se administran junto con MN51 (Figuras 32A y B). Se observó un ligero efecto negativo en las respuesta anti-propia con varias de estas adiciones (Figura 32A). En el experimento con MN720, se vio un pequeño aumento de la respuesta anti-propia con MPL (Figura 33A). Todas las adiciones tenían sin embargo un pequeño efecto negativo en la respuesta anti-no propia (Figura 33B).

Ejemplo 4 Un análisis de ORO con alumbre

La eficacia de alumbre se ensayó adicionalmente en otro estudio, en el que se preparó el alumbre a partir de
Rehydragel LG. Después de cuatro semanas de sensibilización con OVA, se inmunizaron subcutáneamente grupos de 9 o 10 ratas Wistar hembras con composiciones que contenían vehículo (PBS) con alumbre, 100 \mug de H-ORO con MN51 o 280 \mug de H-ORO con alumbre. Las inmunizaciones de refuerzo se dieron las semanas 3 y 7. Se obtuvieron muestras de suero las semanas -4, -1, 9, 12 y 15. Se analizó en las muestras de la semana 12 la dilución de título, mientras que se analizaron en todas las muestras las concentraciones de IgE usando métodos estándares. La concentración de IgE libre disminuyó a lo largo del tiempo en los sueros de animales inyectados con vehículo más alumbre o H-ORO más alumbre (Figura 34). Sin embargo, la disminución fue mayor en los animales tratados con H-ORO más alumbre, y las concentraciones de IgE libre después de 9 semanas fueron significativamente diferentes entre los dos grupos (p < 0,01). La inmunización con 280 \mug de de H-ORO y alumbre produjo una curva de dilución que era muy similar a la presentada por sueros de animales inmunizados con 100 \mug de H-ORO y MN51 (Figuras 35A y 35B). De hecho, se calculó que los valores de dilución_{50} de título eran 400 veces para ORO con alumbre y 204 veces para H-ORO con MN51. Estos resultados demuestran que una composición que contenga más de 100 \mug de H-ORO en combinación con alumbre puede inducir respuestas anti-IgE propia sustanciales cuando se administran a un mamífero.

Ejemplo 5 Análisis de ORO-H y ORORO-H

Se realizaron estudios similares para evaluar los efectos de composiciones que contienen ORO y ORORO enlazados a una etiqueta His. El polipéptido ORORO-H contiene los siguientes dominios de IgE: CH2 de zarigüeya-CH3 de rata-CH2 de zarigüeya-CH3 de rata-CH4 de zarigüeya. Después de cuatro semanas de sensibilización con OVA, se inmunizaron subcutáneamente grupos de 6 ratas Wistar F machos con composiciones que contenían vehículo (PBS), 20 \mug de ORO-H o 100 \mug de ORO-H. Se dieron inmunizaciones de refuerzo las semanas 3 y 7. En cada caso, se usó como coadyuvante Montanide ISA 51. Se obtuvieron muestras de suero las semanas -4, -1, 5, 7, 9, 11 y 14, y se analizó en ellas las concentraciones de IgE libre. Como se muestra en la Figura 36, la inmunización con 20 \mug de ORO-H o 100 \mug de ORO-H fue igualmente eficaz para reducir la concentración de IgE libre, mientras que el vehículo produjo un aumento de los niveles de IgE libre.

En otro experimento, grupos de 6 o 7 ratas Wistar machos recibieron vehículo PBS, 20 \mug de ORORO-H o 100 \mug de ORORO-H mediante inyección subcutánea. Las inmunizaciones de refuerzo se dieron las semanas 3 y 7 y se obtuvieron muestras de suero las semanas -4, -1, 5, 7, 9, 11 y 14. En cada caso, se usó como coadyuvante Montanide ISA 51. Como en el experimento descrito en el párrafo inmediatamente anterior, la inmunización con 20 o 100 \mug de ORORO-H fue altamente eficaz para reducir la concentración de IgE libre, mientras que el vehículo produjo un aumento de los niveles de IgE libre (Figura 37).

Ejemplo 6 Estudios de dosis y toxicidad en rata

Se inmunizaron subcutáneamente grupos de 10 ratas Wister Hanover machos con vehículo (PBS), vehículo con MN51, 30 \mug de H-ORO con MN51, 100 \mug de H-ORO con MN51 o 300 \mug de H-ORO con MN51. Todas las mezclas con MN51 fueron en una relación 1:1. Las inmunizaciones de refuerzo se dieron las semanas 1, 3 y 5, y se obtuvieron muestras de sangre las semanas 0, 4 y 7 (Figura 38A). Los valores de dilución_{50} de título medios la semana 7 aumentaron a medida que aumentaba la dosis de H-ORO (Figura 38B). Así, mayores dosis de H-ORO administrado con MN51 pueden producir mayor efecto anti-IgE propia. Además, se redujeron los niveles de anticuerpos de IgE libre en animales que recibieron 100 o 300 \mug de H-ORO en MN51 (Figura 38C).

Se realizaron también estudios de toxicidad y salud general usando estos animales. Se evaluaron en muestras de sangre albúmina, ASAT y ALAT, bilirrubina, creatinina, electrólitos tales como Ca^{2+}, K^{+} y Na^{+}, lactato deshidrogenasa, \gamma-glutamil transpeptidasa y glucosa, así como hemoglobina, leucocitos, hematocrito y recuento de plaquetas. Además, se comprobó en los animales dos veces por semana el peso corporal, una vez al día cambios de la admisión de alimentos, y actividad física general, comportamiento y apariencia. Además, se realizaron estudios de histopatología en cerebro, pulmones, íleo, hígado, corazón, bazo, riñones y testículos. En todos estos experimentos, no se observaron signos de efectos tóxicos o indeseados.

En otro experimento, se inmunizaron subcutáneamente grupos de 10 ratas Wister F hembras con vehículo (PBS) u ORO carente de una etiqueta de histidina (Figura 39). El coadyuvante fue MN51 o 1,3% de Alhydrogel^{TM} (un coadyuvante gel de hidróxido de aluminio; Brenntag Stinnes Logistics). Se dieron inmunizaciones de refuerzo las semanas 3, 5 y 7, y se obtuvieron muestras de sangre las semanas -1, 3, 5, 7, 10 y 12. La cantidad de anticuerpos de IgE de rata medida en ratas que recibieron el polipéptido ORO se redujo significativamente en comparación con las cantidades medidas en ratas testigo (Figura 40). De hecho, ratas que recibieron el polipéptido ORO con alumbre o MN51 presentaron reducciones del 90-100 por cien en la cantidad de IgE de rata libre (Figura 41). Estos resultados demuestran que polipéptidos de IgE quiméricos en combinación con alumbre o MN51 pueden reducir los niveles de IgE libre presente en un mamífero.

Ejemplo 7 Estudios en monos cynomolgus

Se examinó también en monos cynomolgus la capacidad de las composiciones proporcionadas aquí para obtener una respuesta de anticuerpos anti-IgE propia. Se prepararon polipéptidos H-OCO-H y H-OCOCO-H que eran similares a los polipéptidos ORO y ORORO descritos aquí, con la excepción de que se sustituyeron los segmentos de IgE de rata con segmentos de IgE de mono cynomolgus. Se inmunizaron subcutáneamente grupos de 5 o 6 animales con vehículo (PBS) más MN51, 500 \mug de H-OCO-H más MN51 o 500 \mug de H-OCOCO-H más MN51 (Figura 42). Se dieron inmunizaciones de refuerzo (300 \mug) las semanas 3 y 7, mientras que se dieron nuevos refuerzos (300 \mug) las semanas 29 y 32. Se obtuvieron muestras de sangre las semanas -1, 5, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 32 y 35. Las respuestas anti-IgE se midieron contra una parte recombinante del dominio constante (C\epsilon2-C\epsilon3-C\epsilon4) de IgE de mono cynomolgus (Figura 43). Se midieron los valores de dilución_{50} de título cada semana que se obtuvieron muestras.

La inmunización con H-OCO-H o H-OCOCO-H produjo un aumento de la dilución_{50} de título que alcanzó un nivel máximo en 9 o 10 semanas y disminuyó después (Figura 44). H-OCOCO-H indujo un efecto ligeramente mayor que H-OCO-H, aunque la diferencia no era significativa (Figura 44). El estudio usando el grupo de H-OCOCO-H se terminó en la semana 18.

La respuesta anti-IgE a H-OCO-H disminuyó a lo largo del tiempo, demostrando que el efecto es reversible (Figura 44). Para determinar si la respuesta anti-IgE es repetible, los animales vacunados previamente se probaron con H-OCO-H en las semanas 29 y 32. Los animales que presentaban previamente una respuesta anti-IgE presentaron una segunda respuesta anti-IgE (Figura 44). Las vacunas de H-OCO-H y H-OCOCO-H no produjeron efectos hematológicos indeseados en recuentos de trombocitos (Figura 45) u otras células sanguíneas (Figura 46). Este experimento demostró que las composiciones que contienen un polipéptido tal como H-OCO-H o H-OCOCO-H pueden usarse en combinación con MN51 para estimular una respuesta de anticuerpos anti-IgE propia en primates, y que podrían desarrollarse composiciones similares para uso en seres humanos.

En otro experimento, se inmunizaron subcutáneamente grupos de monos cynomolgus con H-OCO-H en combinación con 1,3% de Alhydrogel^{TM} (un coadyuvante gel de hidróxido de aluminio; Brenntag Stinnes Logistics) o MN51 (Figura 47). Se inmunizaron monos testigo con solución salina en combinación con 1,3% de Alhydrogel^{TM}. Se dieron inmunizaciones de refuerzo las semanas 3, 5 y 7, y se obtuvieron muestras de sangre las semanas -1, 3, 5, 7, 9, 12, 15 y 18. La cantidad de anticuerpos anti-IgE de mono medida en monos que recibieron el polipéptido H-OCO-H aumentó significativamente en comparación con las cantidades medidas en monos testigo (Figura 48). Además, monos que recibieron el polipéptido H-OCO-H en combinación con alumbre produjeron una respuesta de anticuerpos anti-IgE más fuerte que la respuesta producida por monos tratados con el polipéptido H-OCO-H en combinación con MN51 (Figura 48).

Estos resultados demuestran que polipéptidos de IgE quiméricos con alumbre o MN51 pueden romper una tolerancia propia de primate a IgE. Estos resultados demuestran también que las respuestas anti-IgE son reversibles y repetibles. Además, primates tratados con polipéptidos de IgE quiméricos con alumbre o MN51 no presentaban signos de trombocitopenia u otros efectos hematológicos indeseados.

Claims (17)

1. Una composición que comprende un polipéptido y un compuesto de aluminio, en la que dicho polipéptido es un polipéptido de IgE quimérico que comprende una secuencia de polipéptido de IgE propio, y en la que la administración de dicha composición a un mamífero reduce el nivel de IgE libre detectable en dicho mamífero.

2. La composición de la reivindicación 1ª, en la que dicho polipéptido comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 21.

3. La composición de la reivindicación 1ª, en la que dicha composición comprende entre alrededor de diez microgramos y aproximadamente un gramo de dicho polipéptido por dosis unitaria.

4. La composición de la reivindicación 1ª, en la que dicha composición comprende aproximadamente 280 microgramos de dicho polipéptido por dosis unitaria.

5. La composición de la reivindicación 1ª, en la que dicho compuesto de aluminio es un compuesto hidrogel de aluminio.

6. La composición de la reivindicación 1ª, en la que dicho compuesto de aluminio es alumbre.

7. La composición de la reivindicación 6ª, en la que dicha composición comprende entre alrededor de diez microlitros y aproximadamente un militro de dicho alumbre por dosis unitaria.

8. La composición de la reivindicación 6ª, en la que dicha composición comprende aproximadamente 50 microlitros de dicho alumbre por dosis unitaria.

9. La composición de la reivindicación 1ª, en la que dicha reducción es al menos aproximadamente una reducción del 10 por ciento.

10. La composición de la reivindicación 1ª, en la que dicha reducción es al menos aproximadamente una reducción del 30 por ciento.

11. La composición de la reivindicación 1ª, en la que dicha reducción es una reducción de alrededor del 10 por ciento a aproximadamente el 95 por ciento.

12. La composición de la reivindicación 1ª, en la que dicha reducción es una reducción de alrededor del 20 por ciento a aproximadamente el 95 por ciento.

13. La composición de la reivindicación 1ª, en la que dicha reducción es detectable en un ELISA.

14. La composición de la reivindicación 13ª, en la que se usa en dicho ELISA una secuencia de polipéptido de receptor de IgE.

15. La composición de la reivindicación 1ª, en la que dicha administración de dicha composición a dicho mamífero produce una respuesta de anticuerpos de IgE propia con un valor de dilución_{50} de título mayor que 100.

16. La composición de la reivindicación 15ª, en la que dicho valor de dilución_{50} de título es mayor que 200.

17. La composición de la reivindicación 15ª, en la que dicho valor de dilución_{50} de título es mayor que 400.