ES2317277T3 - Nueva carbonil reductasa, gen que la codifica y metodo de uso de la misma. - Google Patents
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Abstract
Un DNA del punto (a) o (b) siguiente: (a) un DNA que comprende la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1, (b) un DNA que se hibrida con un DNA que consiste en una secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1 bajo condiciones rigurosas, y que codifica un polipéptido que tiene una actividad para reducir asimétricamente (3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona, representada por la fórmula (1) siguiente: ** ver fórmula** para producir (2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol, representado por la fórmula (2) siguiente:** ver fórmula**
Description
Nueva carbonil reductasa, gen que la codifica y
método de uso de la misma.
El presente invento se refiere a un polipéptido
(carbonil reductasa) que tiene una actividad para reducir
asimétricamente
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona,
representada por la fórmula (1) siguiente:
para producir
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
representado por la fórmula (2)
siguiente:
que es aislado de un microorganismo
que tiene la actividad, un DNA que codifica el polipéptido, un
vector que contiene el DNA, y una célula transformada con el
vector.
El presente invento también se refiere a un
método para la producción de un alcohol ópticamente activo,
particularmente
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonil-amino-4-fenil-2-butanol,
representado por la fórmula (2) anteriormente mencionada, usando el
polipéptido o la célula transformada.
El
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol
es un compuesto útil como material de partida sintético para un
agente farmacéutico y similares.
En cuanto al método para la producción de
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
se conoce un método que comprende reducir químicamente un derivado
amino-protegido de
(3S)-1-halo-3-amino-4-fenil-2-butanona
con un agente reductor tal como borohidruro sódico y similares
(referencia 1 de patente, referencia 1 de no patente). Sin embargo,
este método requiere un agente reductor comparativamente caro, y la
estereoselectividad del mismo no es prácticamente suficiente.
Además, en cuanto a un método en que se utiliza
un microorganismo, se conocen un método que comprende dejar que un
microorganismo perteneciente al género Candida y similares
actúe sobre un derivado de
(3S)-1-halo-3-amino-4-fenil-2-butanona
para producir un derivado de
(2R,3S)-1-halo-3-amino-4-fenil-2-butanol
(referencia 2 de patente), y un método que comprende poner un
microorganismo perteneciente al género Rhodococcus y
similares en contacto con
(3S)-1-halo-2-oxo-3-amino
protegido-4-butano sustituido para
producir
(2R,3S)-1-halo-2-hidroxi-3-amino
protegido-4-butano sustituido
(referencia 3 de patente, referencia 2 de no patente). Sin embargo,
mediante estos métodos, puede que la concentración del producto que
se puede acumular en la mezcla de reacción no sea prácticamente
suficiente.
Referencia 1 de patente:
JP-A-2-42048.
Referencia 2 de patente:
JP-A-9-285.
Referencia 3 de patente: WO2002/014528.
Referencia 1 de no patente: Tetrahedron 50, 6333
(1994).
Referencia 2 de no patente:
Tetrahedron:Asymmetry 14, 3105 (2003).
\vskip1.000000\baselineskip
A la vista de lo anterior, el presente invento
pretende proporcionar un polipéptido útil para la producción de
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
un DNA que codifica el polipéptido, un vector que contiene el DNA,
y una célula transformada con el vector.
Además, el presente invento pretende
proporcionar un método para la producción eficaz de diversos
alcoholes ópticamente activos, incluyendo
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
utilizando el polipéptido o la célula transformada.
Los presentes inventores han aislado un
polipéptido que tiene una actividad para reducir asimétricamente
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona,
para producir
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
de un microorganismo que tiene la actividad. Además, han tenido
éxito a la hora de aclarar la secuencia de bases de un DNA que
codifica el polipéptido y generar una célula transformada que
produce el polipéptido en grandes cantidades utilizando la
secuencia. Además, han hallado que diversos alcoholes ópticamente
activos útiles, tal como
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
pueden ser eficazmente producidos al utilizar el polipéptido o la
célula transformada, lo que dio lugar a la compleción del presente
invento.
Es decir, el presente invento se dirige a un
polipéptido que tiene una actividad para reducir asimétricamente
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
para producir
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol.
Además, el presente invento proporciona un DNA
que codifica el polipéptido. Más aún, el presente invento
proporciona un vector que contiene el DNA. Además, el presente
invento proporciona una célula transformada que contiene el vector.
Además, el presente invento proporciona un método para la producción
de alcoholes ópticamente activos, incluyendo
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
utilizando el polipéptido o la célula transformada.
De acuerdo con el presente invento, se puede
proporcionar un método práctico para la producción de alcoholes
ópticamente activos útiles, incluyendo
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol.
La Figura 1 muestra un método de producción y
una estructura de un vector recombinante pNTOM4G1.
A continuación, se explica el presente invento
con detalle.
La
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
descrita en la presente memoria descriptiva puede ser preparada,
por ejemplo, mediante el método descrito en el documento
JP-A-62-126158 o
JP-A-2-42048.
Además, a menos que se especifique otra cosa, el aislamiento del
DNA, la preparación del vector y la manipulación génica, tal como
la transformación descrita en la presente memoria descriptiva, se
pueden llevar a cabo mediante métodos descritos en libros tales
como "Molecular Cloning", 2ª edición (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989) y similares. Además, el "%" utilizado
en la descripción de la presente memoria descriptiva significa "%
(peso/volumen)" a menos que se especifique otra cosa.
El polipéptido del presente invento es un
polipéptido que tiene una actividad para reducir asimétricamente
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
para producir
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol.
Dicho polipéptido puede ser aislado de un microorganismo que tiene
la actividad.
Aunque el microorganismo que va a ser el origen
del polipéptido del presente invento no está particularmente
limitado, se puede utilizar, por ejemplo, una levadura perteneciente
al género Ogataea. Se prefiere particularmente la cepa
NBRC0975 de Ogataea minuta var. minuta. El
microorganismo se puede obtener del organismo administrativo
incorporado "National Institute of Technology and Evaluation,
Biological Resource Center" (NBRC:
2-5-8 Kazusakamatari,
Kisarazu-shi 292-0818 Chiba,
Japón).
En cuanto al medio para cultivar el
microorganismo que va a ser el origen del polipéptido del presente
invento, se pueden utilizar medios nutritivos líquidos generales
que incluyan fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales
inorgánicas, nutrientes orgánicos y similares, con tal de que el
microorganismo crezca.
El polipéptido del presente invento puede ser
aislado del microorganismo que va a ser el origen del polipéptido
combinando apropiadamente métodos para purificación de proteínas
generalmente conocidos. Por ejemplo, el aislamiento puede ser
llevado a cabo del modo siguiente.
En primer lugar, se cultiva el microorganismo en
un medio adecuado y se recogen las células del medio de cultivo
mediante centrifugación o filtración. Las células obtenidas son
rotas mediante un medio físico usando un disgregador ultrasónico,
glóbulos de vidrio y similares, y los fragmentos celulares son
separados por centrifugación para obtener un extracto exento de
células. A continuación, el polipéptido del presente invento es
aislado del extracto exento de células mediante métodos tales como
precipitación salina (precipitación con sulfato amónico,
precipitación con fosfato sódico, y similares), precipitación con
disolvente (precipitación y fraccionamiento de proteínas mediante
acetona, etanol y similares), diálisis, cromatografía de filtración
en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en fase
inversa, ultrafiltración o similares, solos o en combinación.
La actividad para reducir
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
se puede determinar, por ejemplo, añadiendo un sustrato 0,2 mM,
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona,
una coenzima 0,25 mM, NADPH, y una enzima cruda a un tampón de
fosfato 100 mM (pH de 6,5) que contiene dimetilsulfóxido al 0,33%
(volumen/volumen), dejando reaccionar la mezcla a 30ºC durante 1
minuto y calculando la actividad a partir del índice de disminución
de la absorbancia a la longitud de onda de 340 nm después de la
reacción.
Además, la determinación de la configuración
absoluta y la medición del exceso diastereomérico del
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol
producido mediante la reacción anteriormente mencionada se pueden
llevar a cabo mediante cromatografía de alta eficacia en fase
líquida (HPLC; del inglés, high performance liquid chromatography)
[columna: COSMOSIL 5C8-MS (4,6 mm de diámetro x 250
mm; fabricada por Nacalai Tesque); eluyente: disolución acuosa de
ácido fosfórico 10 mM/acetonitrilo = 1/1 (volumen/volumen); caudal:
1 ml/min; detección: 210 nm].
El DNA del presente invento es un DNA que
codifica el susodicho polipéptido del presente invento, y puede ser
cualquiera con tal de que pueda hacer que se exprese el polipéptido
en una célula huésped transformada de acuerdo con el método
mencionado más adelante, y puede contener cualquier región no
traducida. Una vez que se puede conseguir el polipéptido, quienes
tienen una experiencia normal en la técnica pueden obtener dicho
DNA mediante un método conocido a partir del microorganismo que va a
ser el origen del polipéptido. Por ejemplo, puede obtenerse
mediante el método siguiente.
En primer lugar, se somete un polipéptido
aislado del presente invento a digestión con una endopeptidasa
adecuada y se fraccionan los fragmentos peptídicos resultantes
mediante HPLC en fase inversa. A continuación, por ejemplo,
utilizando un secuenciador de proteínas ABI492 (fabricado por
Applied Biosystems), se determina una parte de la secuencia
completa de aminoácidos de los fragmentos peptídicos.
Basándose en la información sobre la secuencia
de aminoácidos obtenida de esta manera, se sintetizan cebadores de
PCR (reacción en cadena de la polimerasa; del inglés,
polymerase chain reaction) para multiplicar una
parte de un DNA que codifica el polipéptido. A continuación, se
prepara DNA cromosómico del microorganismo que va a ser el origen
del polipéptido mediante un método general para aislamiento de DNA,
tal como, por ejemplo, el método de Visser y otros [Appl.
Microbiol. Biotechnol. 53, 415 (2000)]. Utilizando el DNA
cromosómico como molde y los cebadores de PCR anteriormente
mencionados, se lleva a cabo una PCR para multiplicar una parte del
DNA que codifica el polipéptido y determinar la secuencia de bases
del mismo. La secuencia de bases puede ser determinada, por
ejemplo, utilizando el secuenciador de DNA ABI373A (fabricado por
Applied Biosystems) y similares.
Una vez que se ha aclarado una parte de la
secuencia de bases del DNA que codifica el polipéptido, se puede
determinar la secuencia de longitud completa mediante, por ejemplo,
i-PCR [Nucl. Acids Res. 16, 8186 (1988)].
Los ejemplos del DNA del presente invento,
obtenido de esta manera, incluyen un DNA que contiene la secuencia
de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1 y un DNA que contiene la
secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 2. Además, el DNA del
presente invento también abarca un DNA que se hibrida con un DNA que
consiste en una secuencia de bases complementaria de la secuencia
de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 bajo
condiciones rigurosas, que codifica un polipéptido que tiene una
actividad para reducir asimétricamente
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
para producir
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol.
El DNA que se hibrida con un DNA que consiste en
una secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases
mostrada en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 bajo condiciones
rigurosas se refiere a un DNA que forma específicamente un híbrido
con un DNA que tiene una secuencia de bases complementaria de la
secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2,
cuando se lleva a cabo un método de hibridación de colonias, un
método de hibridación de placas, un método de hibridación Southern o
similar.
Cómo se usan aquí, las condiciones rigurosas se
refieren a, por ejemplo, las condiciones bajo las cuales se lleva a
cabo una hibridación en una disolución acuosa con una composición de
citrato trisódico 75 mM, cloruro sódico 750 mM, dodecilsulfato
sódico al 0,5%, albúmina sérica bovina al 0,1%, polivinilpirrolidona
al 0,1% y Ficoll 400 al 0,1% (fabricado por Amersham Biosciences) a
65ºC, seguida de un lavado con una disolución acuosa con una
composición de citrato trisódico 15 mM, cloruro sódico 150 mM y
dodecilsulfato sódico al 0,1% a 60ºC. Preferiblemente, se refieren
a las condiciones bajo las cuales se lleva a cabo el lavado con una
disolución acuosa con una composición de citrato trisódico 15 mM,
cloruro sódico 150 mM y dodecilsulfato sódico al 0,1% a 65ºC,
después de la hibridación, bajo las condiciones anteriormente
mencionadas. Más preferiblemente, se refieren a las condiciones
bajo las cuales se lleva a cabo el lavado con una disolución acuosa
con una composición de citrato trisódico 1,5 mM, cloruro sódico 15
mM y dodecilsulfato sódico al 0,1% a 65ºC, después de la
hibridación, de la misma manera que antes.
Los ejemplos del polipéptido del presente
invento incluyen un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, codificado por la
secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1, y un polipéptido
que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4,
codificado por la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO:
2.
Además, un polipéptido que muestre al menos un
cierto nivel de homología con respecto a cualquiera de estas dos
clases de polipéptidos y que tenga una actividad para reducir
asimétricamente
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
para producir
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol
es funcionalmente equivalente a estas dos clases de polipéptidos y
está incluido en el presente invento.
Cómo se usa aquí, la homología de la secuencia
se expresa, por ejemplo, mediante el valor de identidad con
respecto a la secuencia completa cuando dos secuencias de
aminoácidos son comparativamente analizadas utilizando un programa
FASTA para búsqueda de homologías [W. R. Pearson y D. J. Lipman,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988)].
Los ejemplos del polipéptido equivalente al polipéptido mostrado en
la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4 incluyen un polipéptido que
muestra no menos de 78% (la homología entre el polipéptido mostrado
en la SEQ ID NO: 3 y el polipéptido mostrado en la SEQ ID NO: 4 es
78%), preferiblemente no menos de 80%, más preferiblemente no menos
de 85%, aún más preferiblemente no menos de 90%, de homología con
respecto a cualquiera de estas dos clases de polipéptidos.
Dicho polipéptido puede ser obtenido, por
ejemplo, ligando un DNA que se puede hibridar con un DNA que
consiste en una secuencia de bases complementaria de la secuencia
de bases mostrada mediante la susodicha SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
bajo condiciones rigurosas, en un vector adecuado e introduciendo el
vector en una célula huésped adecuada para permitir la expresión.
Además, dicho polipéptido puede ser obtenido, por ejemplo, causando
una sustitución, inserción, supresión o adición de aminoácido en un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4, de acuerdo con un conocido método
descrito en "Current Protocols in Molecular Biology" (John
Wiley and Sons, Inc., 1989) y similares.
Los ejemplos del polipéptido obtenido mediante
el último método incluyen un polipéptido obtenido al sustituir la
42ª alanina por glicocola, el 43º ácido glutámico por alanina, la
46ª lisina por ácido glutámico y/o la 49ª asparagina por lisina en
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4. En la SEQ
ID NO: 16 se muestra un polipéptido que tiene estas cuatro
mutaciones (polipéptido mutante 1) y, en la SEQ ID NO: 15, se
muestra un DNA que codifica el polipéptido (DNA mutante 1).
El vector que se va a utilizar para introducir
el DNA del presente invento en un microorganismo huésped para
permitir la expresión del DNA en el microorganismo huésped no está
particularmente limitado con tal de que el DNA pueda expresar el
gen codificado en un microorganismo huésped adecuado. Los ejemplos
del vector incluyen un vector de plásmido, un vector de fago, un
vector de cósmido y similares. Además, también se puede usar un
vector lanzadera capaz de intercambio génico con otras células
huésped.
Dicho vector contiene generalmente un regulador
tal como el promotor lacUV5, el promotor trp, el promotor trc, el
promotor tac, el promotor lpp, el promotor tufB, el promotor recA,
el promotor pL y similares, y se puede utilizar preferiblemente
como un vector de expresión que contiene una unidad de expresión
operativamente unida al DNA del presente invento. Por ejemplo, se
puede utilizar preferiblemente pUCNT (documento WO94/03613).
El término "regulador" usado en la presente
memoria descriptiva se refiere a una secuencia de bases que tiene
un promotor funcional y cualquier elemento transcripcional
relacionado (por ejemplo, potenciador, caja CCAAT, caja TATA, grupo
SPI y similares).
El término "operativamente unido" usado en
la presente memoria descriptiva significa que diversos elementos
reguladores tales como un promotor, un potenciador y similares, que
controlan la expresión génica, y un gen están conectados en un
estado operativo en una célula huésped. Es un asunto bien conocido
por quienes tienen una experiencia normal en la técnica que el tipo
y la clase de regulador pueden variar dependiendo del huésped.
Los ejemplos del vector de expresión del
presente invento incluyen pNTOM3, en el que el DNA mostrado en la
SEQ ID NO: 1 ha sido introducido en pUCNT, pNTOM4, en el que el DNA
mostrado en la SEQ ID NO: 2 ha sido introducido en pUCNT, pNTOM5,
en el que el DNA mostrado en la SEQ ID NO: 15 ha sido introducido en
pUCNT, los cuales se mencionan más adelante, y similares.
En cuanto a la célula huésped en que se
introduce un vector que contiene el DNA del presente invento, se
puede utilizar una bacteria, una levadura, una bacteria
filamentosa, una célula vegetal, una célula animal o similar.
Puesto que la introducción y/o el cultivo son fáciles, es preferible
una bacteria y es particularmente preferible Escherichia
coli. El vector que contiene el DNA del presente invento puede
ser introducido en una célula huésped mediante un método conocido.
Cuando se utiliza Escherichia coli como célula huésped, se
puede usar, por ejemplo, una célula competente de E. coli
HB101 comercialmente asequible (fabricada por TAKARA BIO) para
introducir el vector en la célula huésped.
Los ejemplos de la célula transformada del
presente invento incluyen E.coli HB101 (pNTOM3) FERM
BP-10368, en que el susodicho pNTOM3 ha sido
introducido en E.coli HB101, E.coli HB101 (pNTOM4)
FERM BP-10369, en que el susodicho pNTOM4 ha sido
introducido en E.coli HB101, E.coli HB101 (pNTOM5)
FERM BP-10370, en que el susodicho pNTOM5 ha sido
introducido en E.coli HB101, las cuales se mencionan más
adelante, y similares. Estas células transformadas han sido
respectivamente depositadas bajo los susodichos números de acceso
en el National Institute of Advanced Industrial Science and
Technology, International Patent Organism Depositary (IPOD; Central
6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki,
305-8566, Japón) (fecha del depósito original en
Japón: 3 de Junio de 2004; las cepas nacionales depositadas fueron
transferidas al depósito internacional basándose en el Tratado de
Budapest del 6 de Julio de 2005).
Cuando un compuesto que tiene un grupo carbonilo
es asimétricamente reducido para producir un alcohol ópticamente
activo utilizando el polipéptido del presente invento, se hace
necesaria una coenzima tal como NADH, NADPH o similar. Sin embargo,
la cantidad de la costosa coenzima que se va a utilizar puede ser
drásticamente reducida llevando a cabo la reacción en la presencia
conjunta de un polipéptido capaz de convertir la coenzima oxidada
en una forma reducida (a lo que se hace más adelante referencia como
"capacidad para regenerar la coenzima"), un compuesto que va a
ser el sustrato del polipéptido, y el polipéptido del presente
invento.
En cuanto al polipéptido que tiene la capacidad
para regenerar la coenzima, se puede utilizar, por ejemplo,
hidrogenasa, ácido fórmico deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa,
aldehído deshidrogenasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
glucosa deshidrogenasa o similar. Se utiliza preferiblemente glucosa
deshidrogenasa.
El alcohol ópticamente activo puede ser
producido utilizando el polipéptido del presente invento del modo
siguiente. En primer lugar, se añaden un compuesto que tiene un
grupo carbonilo que va a ser el sustrato, una coenzima tal como
NADPH o similar, y el polipéptido a un disolvente adecuado y se
agita la mezcla bajo un pH ajustado para que se lleve la reacción a
cabo. Cuando la reacción se lleva a cabo utilizando una combinación
del polipéptido del presente invento y de un polipéptido que tiene
capacidad para regenerar la coenzima, a la composición de reacción
anteriormente mencionada se añaden además un polipéptido que tiene
capacidad para regenerar la coenzima (por ejemplo, glucosa
deshidrogenasa) y un compuesto (por ejemplo, glucosa) que va a ser
su sustrato.
Se puede utilizar un disolvente acuoso para la
reacción o se puede utilizar una mezcla de un disolvente acuoso y
un disolvente orgánico para la reacción. Los ejemplos del disolvente
orgánico incluyen tolueno, acetato de etilo, acetato de
n-butilo, hexano, isopropanol, éter diisopropílico,
metanol, acetona, dimetilsulfóxido y similares. La reacción se
lleva a cabo a una temperatura de 10ºC - 70ºC, y el pH de la mezcla
de reacción se mantiene en un valor de 4 - 10. La reacción puede
ser llevada a cabo mediante un proceso discontinuo o un proceso
continuo. Para un proceso discontinuo, el sustrato de reacción se
añade en una concentración de carga de 0,1% a 70% (peso/volumen).
Los ejemplos del compuesto que tiene un grupo carbonilo que va a ser
el sustrato incluyen
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona.
Sin embargo, el compuesto no está particularmente limitado con tal
de que pueda ser reducido bajo las condiciones de reacción
anteriormente mencionadas y pueda ser convertido en un alcohol
ópticamente activo.
La reacción puede ser llevada similarmente a
cabo incluso cuando, en lugar del polipéptido del presente invento,
se utiliza una célula transformada que contiene un DNA que codifica
el polipéptido, o un producto tratado de la misma. Además, la
reacción puede ser llevada similarmente a cabo incluso cuando se
utiliza una célula transformada que contiene tanto un DNA que
codifica el polipéptido del presente invento como un DNA que
codifica un polipéptido que tiene capacidad para regenerar la
coenzima, o un producto tratado de la misma. El "producto tratado
de célula transformada" significa, por ejemplo, una célula
tratada con un agente tensioactivo o un disolvente orgánico, una
célula secada, una célula rota, un extracto crudo de una célula y
similares, así como los productos fijados mediante un medio
conocido.
Particularmente, cuando se utiliza una célula
transformada que contiene tanto un DNA que codifica el polipéptido
del presente invento como un DNA que codifica un polipéptido que
tiene capacidad para regenerar la coenzima, o un producto tratado
de la misma, no es necesario preparar ni añadir separadamente una
enzima para regenerar la coenzima, y se puede producir eficazmente
un alcohol ópticamente activo.
Al incorporar tanto el DNA que codifica el
polipéptido del presente invento como el DNA que codifica un
polipéptido que tiene capacidad para regenerar la coenzima en un
único vector e introducir el vector en una célula huésped, o
incorporar respectivamente estas dos clases de DNA en dos clases de
vector pertenecientes a grupos incompatibles diferentes e
introducir las dos clases de vector en una única célula huésped, se
puede obtener una célula transformada que contenga tanto un DNA que
codifica el polipéptido del presente invento como un DNA que
codifica un polipéptido que tiene capacidad para regenerar la
coenzima.
Los ejemplos del vector que lleva incorporados
tanto un DNA que codifica el polipéptido del presente invento como
un DNA que codifica un polipéptido que tiene capacidad para
regenerar la coenzima incluyen pNTOM3G1, pNTOM4G1 y pNTOM5G1,
vectores obtenidos al introducir un gen de glucosa deshidrogenasa
procedente de Bacillus megaterium en cada uno de los
vectores de expresión pNTOM3, pNTOM4 y pNTOM5 anteriormente
mencionados, y similares. Los ejemplos de la célula transformada
que contiene tanto el DNA que codifica el polipéptido del presente
invento como el DNA que codifica un polipéptido que tiene capacidad
para regenerar la coenzima incluyen E. coli HB101
(pNTOM3G1), E. coli HB101 (pNTOM4G1) y E. coli HB101
(pNTOM5G1), células obtenidas al transformar E. coli HB101
con estos vectores, y similares.
La actividad del polipéptido que tiene capacidad
para regenerar la coenzima en una célula transformada se puede
determinar mediante un método convencional. Por ejemplo, se puede
calcular la actividad de la glucosa deshidrogenasa a partir del
índice de aumento de la absorbancia a una longitud de onda de 340 nm
cuando se añaden glucosa 100 mM, coenzima NADP o NAD 2 mM y la
enzima a un tampón de Tris-HCl 1 M (pH de 8,0) y se
deja reaccionar la mezcla a 25ºC durante 1 minuto.
La célula transformada que contiene un DNA que
codifica el polipéptido del presente invento puede ser cultivada en
un medio nutritivo líquido convencional que contenga fuentes de
carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, nutrientes
orgánicos y similares, con tal de que crezca.
El alcohol ópticamente activo que resulta de la
reacción puede ser purificado mediante un método convencional. Por
ejemplo, cuando el alcohol ópticamente activo que resulta de la
reacción es
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
se somete la mezcla de reacción a extracción con un disolvente
orgánico tal como acetato de etilo, tolueno o similar, y se evapora
el disolvente orgánico bajo presión reducida. Además puede ser
purificado mediante un tratamiento tal como precipitación de
cristales, cromatografía o similar.
Para la cuantificación de la
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
y el
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
así como para la medición del exceso diastereomérico de
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
se puede usar una cromatografía de alta eficacia en fase líquida
[columna: COSMOSIL 5C8-MS (4,6 mm de diámetro x 250
mm; fabricada por Nacalai Tesque); eluyente: disolución acuosa de
ácido fosfórico 10 mM/acetonitrilo = 1/1; caudal: 1 ml/min;
detección: 210 nm].
Como se mencionó anteriormente, de acuerdo con
el presente invento, se puede producir eficazmente el polipéptido
del presente invento y, utilizando el polipéptido, se puede obtener
un método de producción superior para diversos alcoholes
ópticamente activos útiles, incluyendo el
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol.
El presente invento se explica con detalle en
los Ejemplos siguientes, los cuales no han de ser considerados
restrictivos. El método operativo detallado y demás, relativos a la
técnica de DNA recombinante usada en los Ejemplos siguientes, se
describe en los libros siguientes: "Molecular Cloning", 2ª
edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), y "Current
Protocols in Molecular Biology" (Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience).
De acuerdo con el método siguiente, de la cepa
NBRC0975 de Ogataea minuta var. minuta se aisló y
purificó un polipéptido que tenía una actividad para reducir
asimétricamente
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
para producir
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol.
A menos que se especifique otra cosa, la purificación fue llevada a
cabo a 4ºC.
Se determinó la actividad reductora sobre la
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
disolviendo el sustrato
[(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonil-amino-4-fenil-2-butanona]
hasta una concentración final de 0,2 mM y la coenzima NADPH hasta
una concentración final de 0,25 mM en un tampón de fosfato 100 mM
(pH de 6,5) que contenía dimetilsulfóxido al 0,33%
(volumen/volumen), añadiendo luego una disolución de la enzima
cruda, dejando transcurrir la reacción a 30ºC durante 1 minuto y
calculando el índice de disminución de la absorbancia de la mezcla
de reacción a una longitud de onda de 340 nm. 1 unidad era definida
como la actividad para oxidar 1 micromol de NADPH hasta NADP en 1
minuto bajo las citadas condiciones de reacción.
Se preparó un medio líquido (18 l, pH de 6,5)
que contenía 5% de glucosa, 0,5% de polipeptona, 0,1% de extracto
de levadura, 0,1% de hidrogenofosfato dipotásico, 0,2% de
dihidrogenofosfato potásico y 0,02% de sulfato magnésico
heptahidratado en un fermentador de recipiente agitado de 30 l de
capacidad (fabricado por B. E. Marubishi Co., Ltd.) y se esterilizó
con vapor a 120ºC durante 20 minutos.
En este medio se inocularon 180 ml de un medio
de cultivo de la cepa NBRC0975 de Ogataea minuta var.
minuta, precultivada en el mismo medio con antelación, y se
cultivó la mezcla bajo las condiciones de agitación a 250 rpm,
caudal de aire de 5,0 l normales/min y 28ºC durante 48 horas.
Las células fueron recogidas del medio de
cultivo anteriormente mencionado mediante centrifugación y fueron
lavadas con 2000 ml de tampón de Tris-HCl 10 mM (pH
de 7,5) para obtener 907 g de las células de la cepa. Las células
fueron suspendidas en 1800 ml de tampón de Tris-HCl
10 mM (pH de 7,5) que contenía ditiotreitol (DTT) 0,1 mM y fueron
rotas usando una máquina UH-600 para dispersión por
ultrasonicación (fabricada por SMT). Los fragmentos celulares
fueron separados por centrifugación del producto de ruptura para
obtener un extracto exento de células.
Se ajustó el pH del extracto exento de células
anteriormente obtenido a 7,5 con amoníaco acuoso, se añadió sulfato
amónico y se disolvió hasta un 40% de saturación mientras se
mantenía el pH, y se separó el precipitado resultante por
centrifugación. Se añadió más sulfato amónico al sobrenadante y se
disolvió hasta un 60% de saturación mientras se mantenía el pH en
7,5 del mismo modo que antes, y se recogió el precipitado resultante
por centrifugación. Se disolvió el precipitado en un tampón de
Tris-HCl 10 mM (pH de 7,5) que contenía DTT 0,1 mM
y se dializó la disolución frente al mismo tampón durante la noche
para obtener una fracción activa.
La fracción activa obtenida por fraccionamiento
con sulfato amónico fue aplicada a una columna de
DEAE-Sephacel (diámetro de 29 mm x 290 mm;
fabricada por Amersham Biosciences), equilibrada de antemano con
tampón de Tris-HCl 10 mM (pH de 7,5) que contenía
DTT 0,1 mM, para permitir la adsorción de la fracción activa.
Después del lavado de la columna con el mismo tampón, la fracción
activa fue eluida con un gradiente lineal de cloruro sódico (de 0 M
a 1 M). La fracción activa fue recogida y fue dializada durante la
noche frente al mismo tampón.
La fracción activa obtenida mediante
cromatografía en columna de DEAE-Sephacel fue
aplicada a una columna de MonoQ HR 10/10 (fabricada por Amersham
Biosciences) equilibrada de antemano con tampón de
Tris-HCl 10 mM (pH de 7,5) que contenía DTT 0,1 mM,
para permitir la adsorción de la fracción activa. Después del lavado
de la columna con el mismo tampón, la fracción activa fue eluida
con un gradiente lineal de cloruro sódico (de 0 M a 1 M). La
fracción activa fue recogida y fue dializada durante la noche frente
al mismo tampón.
Se disolvió cloruro sódico en la fracción activa
obtenida mediante la cromatografía en columna de MonoQ HR hasta una
concentración final de 4 M y se aplicó la disolución a una columna
de Phenyl-Superose HR 10/10 (fabricada por Amersham
Biosciences) equilibrada de antemano con tampón de
Tris-HCl 10 mM (pH de 7,5) que contenía cloruro
sódico 4 M y DTT 0,1 mM, para permitir la adsorción de la fracción
activa. Después del lavado de la columna con el mismo tampón, la
fracción activa se eluyó con un gradiente lineal de cloruro sódico
(de 4 M a 0 M). Se recogió la fracción activa y se dializó durante
la noche frente a un tampón de Tris-HCl 10 mM (pH de
7,5) que contenía DTT
0,1 mM.
0,1 mM.
La fracción activa obtenida mediante la
cromatografía en columna de Phenyl-Superose fue
aplicada a una columna de MonoQ HR 5/5 (fabricada por Amersham
Biosciences) equilibrada de antemano con tampón de
Tris-HCl 10 mM (pH de 7,5) que contenía DTT 0,1 mM,
para permitir la adsorción de la fracción activa. Después del lavado
de la columna con el mismo tampón, la fracción activa fue eluida
con un gradiente lineal de cloruro sódico (de 0 M a 1 M). La
fracción activa fue recogida y fue concentrada utilizando Centricon
YM-10 (fabricado por Millipore).
La fracción activa obtenida mediante la
susodicha cromatografía en columna de MonoQ HR fue aplicada a una
columna de Superdex 200 HR 10/30 (fabricada por Amersham
Biosciences) equilibrada de antemano con tampón de
Tris-HCl 10 mM (pH de 7,5) que contenía cloruro
sódico 0,2 M y DTT 0,1 mM, y se eluyó la fracción activa utilizando
el mismo tampón con un caudal de 0,5 ml/min. La fracción activa fue
recogida y fue concentrada utilizando Centricon
YM-10 (fabricado por Millipore). El producto de
concentración fue aplicado a una columna de Superdex 200 HR 10/30
(fabricada por Amersham Biosciences) equilibrada de antemano con el
mismo tampón, y la fracción activa fue eluida utilizando el mismo
tampón con un caudal de 0,5 ml/min. La fracción activa fue recogida
y fue usada como una muestra estándar purificada del
polipéptido.
El polipéptido purificado obtenido en el Ejemplo
1 fue desnaturalizado en presencia de urea 8 M y fue sometido a
digestión con una lisil endopeptidasa procedente de
Achromobacter (fabricada por Wako Pure Chemical Industries,
Ltd.). A continuación, se determinó la secuencia de aminoácidos del
fragmento peptídico obtenido mediante el secuenciador de proteínas
ABI492 (fabricado por Perkin Elmer). Basándose en la secuencia de
DNA prevista a partir de la secuencia de aminoácidos, se
sintetizaron el cebador 1:
5'-acngtntayttyathgcngg-3' (SEQ ID
NO: 5) y el cebador 2:
5'-atnggdatrtcraaytgrtc-3' (SEQ ID
NO: 6) para multiplicar por PCR una parte del gen que codifica el
polipéptido.
Se extrajo el DNA cromosómico de las células de
la cepa NBRC0975 de Ogataea minuta var. minuta,
cultivadas de la misma manera que en el Ejemplo 1 de acuerdo con el
método de Visser [Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 415 (2000)] y
similares. Utilizando los cebadores 1 y 2 de DNA anteriormente
preparados y el DNA cromosómico obtenido como molde, se llevó a
cabo la PCR. Como resultado, se multiplicó un fragmento de DNA de
aproximadamente 700 pares de bases, considerado una parte del gen
objetivo. La PCR fue llevada a cabo utilizando TaKaRa Ex Taq
(fabricada por TAKARA BIO) como DNA polimerasa, siguiendo las
condiciones de reacción del manual de instrucciones para la misma.
Se clonó el fragmento de DNA en un plásmido pT7Blue
T-Vector (fabricado por Novagen) y se analizó la
secuencia de bases del mismo utilizando el kit ABI PRISM Dye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (fabricado por Perkin
Elmer) y el secuenciador de DNA ABI 373A (fabricado por Perkin
Elmer). Como resultado de la PCR, se ha aclarado que se
multiplicaron dos clases de fragmentos de DNA que tenían diferentes
secuencias de bases. Las secuencias de bases de los mismos se
muestran en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8.
El DNA cromosómico de la cepa NBRC0975 de
Ogataea minuta var. minuta anteriormente preparado fue
completamente sometido a digestión con la enzima de restricción
XbaI, y una mezcla de los fragmentos de DNA obtenidos fue sometida
a ciclación intramolecular con ligasa de T4. Utilizando esto como
molde, se determinó por i-PCR [Nucl. Acids Res. 16,
8186 (1988)] la secuencia de bases de longitud completa del gen que
contiene la susodicha secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO:
7. Los resultados se muestran en la SEQ ID NO: 1. La
i-PCR fue llevada a cabo usando TaKaRa LA Taq
(fabricada por TAKARA BIO) como DNA polimerasa, siguiendo las
condiciones de reacción del manual de instrucciones para la misma.
También se determinó la secuencia de bases de longitud completa del
gen que contiene la susodicha secuencia de bases mostrada en la SEQ
ID NO: 8 mediante una operación similar, y los resultados de la
misma se muestran en la SEQ ID NO: 2. Además, en la SEQ ID NO: 3 se
muestra la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de
bases mostrada en la SEQ ID NO: 1 y, en la SEQ ID NO: 4, se muestra
la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de bases
mostrada en la SEQ ID NO: 2.
Se llevó a cabo una PCR utilizando el cebador 3:
5'-gtgcatatgaccaagactgtttatttca-3'
(SEQ ID NO: 9) y el cebador 4:
5'-gtcgaattcttattaaaatggaatgtcgaa-3'
(SEQ ID NO: 10), y el DNA cromosómico de la cepa NBRC0975 de
Ogataea minuta var. minuta obtenido en el Ejemplo 2
como molde. Como resultado, se obtuvo un DNA de doble cadena en el
que se había añadido un sitio de reconocimiento para NdeI al codón
de iniciación y se había añadido un sitio de reconocimiento para
EcoRI inmediatamente detrás del codón de terminación de un gen que
tiene la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 2. La PCR se
llevó a cabo utilizando TaKaRa LA Taq (fabricada por TAKARA BIO)
como DNA polimerasa, siguiendo las condiciones de reacción del
manual de instrucciones para la misma. Se sometió el DNA a
digestión con NdeI y EcoRI y se insertó entre el sitio de
reconocimiento para NdeI y el sitio de reconocimiento para EcoRI,
cadena abajo del promotor lac del plásmido pUCNT (Documento
WO94/03613), para construir el vector recombinante pNTOM4.
Similarmente, usando el cebador 5:
5'-gtgcatatggctaagactgtctatttca-3'
(SEQ ID NO: 11) y el cebador 6: 5'-gtc
gaattcttactagaatggaatgtcaaa-3' (SEQ ID NO: 12), se obtuvo un DNA de doble cadena en el que se había añadido un sitio de reconocimiento para NdeI al codón de iniciación y se había añadido un sitio de reconocimiento para EcoRI inmediatamente detrás del codón de terminación de un gen que tiene la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1. El DNA se insertó en el plásmido pUCNT de la misma forma que antes para construir el vector recombinante pNTOM3.
gaattcttactagaatggaatgtcaaa-3' (SEQ ID NO: 12), se obtuvo un DNA de doble cadena en el que se había añadido un sitio de reconocimiento para NdeI al codón de iniciación y se había añadido un sitio de reconocimiento para EcoRI inmediatamente detrás del codón de terminación de un gen que tiene la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1. El DNA se insertó en el plásmido pUCNT de la misma forma que antes para construir el vector recombinante pNTOM3.
Utilizando Mutan-SuperExpress Km
(fabricado por TAKARA BIO) y siguiendo el método operativo descrito
en el manual de instrucciones del mismo, se preparó un gen mutante
al sustituir la 125ª C por G, sustituir la 128ª A por C, sustituir
la 136ª A por G y sustituir la 147ª C por G en el gen que tiene la
secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 2. El gen mutante
codifica un polipéptido en el que la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEQ ID NO: 4 tiene la 42ª alanina sustituida por
glicocola, el 43º ácido glutámico sustituido por alanina, la 46ª
lisina sustituida por ácido glutámico y la 49ª asparagina sustituida
por lisina. La secuencia de bases del gen mutante se muestra en la
SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos del polipéptido mutante
codificado por el gen se muestra en la SEQ ID NO: 16. El gen
mutante se insertó en un vector pUCNT de la misma manera que en el
Ejemplo 3 para construir el vector recombinante pNTOM5.
Utilizando el cebador 7:
5'-gccgaattctaaggaggttaacaatgtataaa-3'
(SEQ ID NO: 13) y el cebador 8: 5'-gcggtcgact
tatccgcgtcctgcttgg-3' (SEQ ID NO: 14), y el plásmido pGDK1 [Eur. J. Biochem. 186, 389 (1989)] como molde, se llevó a cabo una PCR para obtener un DNA de doble cadena en el que, en un gen de glucosa deshidrogenasa (al que más adelante se hace referencia como GDH) procedente de la cepa IAM1030 de Bacillus megaterium, se había añadido una secuencia de unión al ribosoma de Escherichia coli 5 bases cadena arriba del codón de iniciación, se había añadido un punto de escisión para EcoRI inmediatamente antes de la secuencia de unión al ribosoma y se había añadido un punto de escisión para SalI inmediatamente detrás del codón de parada.
tatccgcgtcctgcttgg-3' (SEQ ID NO: 14), y el plásmido pGDK1 [Eur. J. Biochem. 186, 389 (1989)] como molde, se llevó a cabo una PCR para obtener un DNA de doble cadena en el que, en un gen de glucosa deshidrogenasa (al que más adelante se hace referencia como GDH) procedente de la cepa IAM1030 de Bacillus megaterium, se había añadido una secuencia de unión al ribosoma de Escherichia coli 5 bases cadena arriba del codón de iniciación, se había añadido un punto de escisión para EcoRI inmediatamente antes de la secuencia de unión al ribosoma y se había añadido un punto de escisión para SalI inmediatamente detrás del codón de parada.
El fragmento de DNA obtenido fue sometido a
digestión con EcoRI y SalI y fue insertado en los sitios EcoRI y
SalI de pNTOM3, pNTOM4 y pNTOM5, construidos en los Ejemplos 3 y 4,
para construir los plásmidos recombinantes pNTOM3G1, pNTOM4G1 y
pNTOM5G1. Como un ejemplo, el método de producción y la estructura
de pNTOM4G1 se muestran en la Figura 1.
Utilizando los vectores recombinantes pNTOM3,
pNTOM4 y pNTOM5 construidos en los Ejemplos 3 y 4, se transformó la
célula competente E. coli HB101 (fabricada por TAKARA BIO)
para obtener E. coli HB101 (pNTOM3), E. coli HB101
(pNTOM4) y E. coli HB101 (pNTOM5). Estas células
transformadas se han depositado bajo los números de acceso FERM
BP-10368, FERM BP-10369 y FERM
BP-10370, respectivamente, en el National Institute
of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent
Organism Depositary (IPOD).
Similarmente, utilizando los vectores
recombinantes pNTOM3G1, pNTOM4G1 y pNTOM5G1 construidos en el
Ejemplo 5, se transformó la célula competente E. coli HB101
(fabricada por TAKARA BIO) para obtener E. coli HB101
(pNTOM3G1), E. coli HB101 (pNTOM4G1) y E. coli HB101
(pNTOM5G1).
Se inocularon seis clases de células
transformadas obtenidas en el Ejemplo 6 y E. coli HB101
(pUCNT), que es una célula transformada que contiene un vector
plasmídico pUCNT, en 50 ml de medio YT 2x (1,6% de triptona, 1,0%
de extracto de levadura, 0,5% de NaCl, pH de 7,0) que contenía 200
\mug/ml de ampicilina, y se realizó un cultivo con sacudimiento a
37ºC durante 24 horas. Las células fueron recogidas por
centrifugación y fueron suspendidas en 50 ml de tampón de fosfato
100 mM (pH de 6,5). Se rompieron las células con un homogeneizador
UH-50 por ultrasonicación (fabricado por SMT) y se
separaron los fragmentos celulares por centrifugación para obtener
un extracto exento de células. Se midieron la actividad reductora de
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
y la actividad GDH del extracto exento de células, valores que se
expresan en la Tabla 1 como actividad específica. Se observó
expresión de actividad reductora de
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
en las 6 clases de células transformadas obtenidas en el Ejemplo 6.
En E. coli HB101 (pNTOM3G1), E. coli HB101 (pNTOM4G1)
y E. coli HB101 (pNTOM5G1), que contienen un gen GDH, también
se observó expresión de la actividad GDH. La actividad reductora de
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
fue medida mediante el método descrito en el Ejemplo 1. La
actividad GDH se calculó a partir del índice de aumento de la
absorbancia a una longitud de onda de 340 nm cuando se añaden
glucosa 0,1 M, coenzima NADP 2 mM y una disolución de enzima cruda
a un tampón de Tris-HCl 1 M (pH de 8,0) y se deja
reaccionar la mezcla a 25ºC durante 1 minuto. 1 unidad era definida
como la actividad enzimática para reducir 1 micromol de NADP hasta
NADPH en 1 minuto bajo las citadas condiciones de reacción. Además,
se midió la concentración de proteína en el extracto exento de
células utilizando un kit para ensayo de proteínas (fabricado por
BIO-RAD).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 2000 U de glucosa deshidrogenasa
(fabricada por Amano Enzyme), 2 g de glucosa, 6 mg de NADP y 2,5 g
de
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
a 50 ml de un extracto de E. coli HB101 (pNTOM3) exento de
células, preparado en el Ejemplo 7, y se agitó la mezcla a 30ºC
durante 22 horas mientras se ajustaba el pH a 6,5 mediante la
adición, gota a gota, de una disolución 5 M de hidróxido sódico.
Tras la compleción de la reacción, se sometió la mezcla de reacción
a extracción con tolueno, se eliminó el disolvente y se analizó el
extracto. Como resultado, se obtuvo
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol
(86,3% de rendimiento, 96,4% de exceso diastereomérico).
Para la cuantificación de la
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
y el
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
así como para la medición del exceso diastereomérico de
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
se utilizó una cromatografía de alta eficacia en fase líquida
[columna: COSMOSIL 5C8-MS (4,6 mm de diámetro x 250
mm; fabricada por Nacalai Tesque); eluyente: disolución acuosa de
ácido fosfórico 10 mM/acetonitrilo = 1/1; caudal: 1 ml/min;
detección: 210 nm].
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 1250 U de glucosa deshidrogenasa
(fabricada por Amano Enzyme), 3 g de glucosa, 4 mg de NADP y 0,25 g
de
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
a 22,5 ml de un extracto de E. coli HB101 (pNTOM4) exento de
células, preparado en el Ejemplo 7, y se agitó la mezcla a 30ºC
mientras se ajustaba el pH a 6,5 mediante la adición, gota a gota,
de una disolución 5 M de hidróxido sódico. Se añadió
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
(0,25 g) a las 2 h, 4 h y 6 h del inicio de la reacción, y se
añadieron 1,25 g de la misma a las 8 h del inicio de la reacción, y
se dejó reaccionar la mezcla durante 31 horas. Tras la compleción de
la reacción, se sometió la mezcla de reacción a extracción con
tolueno, se eliminó el disolvente y se analizó el extracto de la
misma manera que en el Ejemplo 8. Como resultado, se obtuvo
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol
(99,0% de rendimiento, 99,8% de exceso diastereomérico).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 3 g de glucosa, 3 mg de NADP, 0,25
ml de tolueno y 2,5 g de
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
a 25 ml de un medio de cultivo de E. coli HB101 (pNTOM4G1)
preparado de la misma manera que en el Ejemplo 7, y se agitó la
mezcla a 30ºC durante 40 horas mientras se ajustaba el pH a 6,5
mediante la adición, gota a gota, de una disolución 5 M de
hidróxido sódico. Tras la compleción de la reacción, se sometió la
mezcla de reacción a extracción con tolueno, se eliminó el
disolvente y se analizó el extracto de la misma forma que en el
Ejemplo 8. Como resultado, se obtuvo
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol
(99,1% de rendimiento, 99,8% de exceso diastereomérico).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 6 g de glucosa, 1,4 mg de NADP,
0,25 ml de tolueno y 2,5 g de
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
a 50 ml de un medio de cultivo de E. coli HB101 (pNTOM5G1)
preparado de la misma manera que en el Ejemplo 7, y se agitó la
mezcla a 30ºC mientras se ajustaba el pH a 6,5 mediante la adición,
gota a gota, de una disolución 5 M de hidróxido sódico. Una hora
después del inicio de la reacción, se añadieron 2,5 g de
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona
y se dejó reaccionar la mezcla durante 20 h. Tras la compleción de
la reacción, se sometió la mezcla de reacción a extracción con
tolueno, se eliminó el disolvente y se analizó el extracto de la
misma forma que en el Ejemplo 8. Como resultado, se obtuvo
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol
(99,6% de rendimiento, 99,8% de exceso diastereo-
mérico).
mérico).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron un compuesto carbonílico, que iba
a ser el sustrato, en una concentración final de 1 mM y la coenzima
NADPH en una concentración final de 0,25 mM, respectivamente, en un
tampón de fosfato 100 mM (pH de 6,5) que contenía dimetilsulfóxido
al 0,33% (volumen/volumen). Se añadió un extracto de E. coli
HB101 (pNTOM4) o E. coli HB101 (pNTOM3) exento de células,
preparado en el Ejemplo 7, a la disolución y se dejó reaccionar la
mezcla a 30ºC durante 1 minuto. La actividad reductora sobre cada
compuesto carbonílico se calculó a partir del índice de disminución
de la absorbancia de la mezcla de reacción a una longitud de onda de
340 nm, mostrándose en la Tabla 2 como un valor relativo a la
actividad sobre la
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona,
que es 100%. Los dos polipéptidos que consisten en las secuencias
de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, que
fueron producidos por las células transformadas, mostraron actividad
reductora sobre una gran variedad de compuestos carbonílicos.
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Kaneka Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVA CARBONIL REDUCTASA, GEN DE LA
MISMA Y MÉTODO PARA USAR LA MISMA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B040342W001-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2004-231226
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-08-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn, versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 756
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ogataea minuta var.
minuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 756
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ogataea minuta var.
minuta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ogataea minuta var.
minuta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ogataea minuta var.
minuta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica varia
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica varia
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica varia
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica varia
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 703
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ogataea minuta var.
minuta
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 703
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ogataea minuta var.
minuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 756
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA mutante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido mutante 1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
Claims (17)
1. Un DNA del punto (a) o (b) siguiente:
- (a)
- un DNA que comprende la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1,
- (b)
- un DNA que se hibrida con un DNA que consiste en una secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1 bajo condiciones rigurosas, y que codifica un polipéptido que tiene una actividad para reducir asimétricamente (3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona, representada por la fórmula (1) siguiente:
para producir
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
representado por la fórmula (2)
siguiente:
2. Un DNA del punto (a) o (b) siguiente:
- (a)
- un DNA que comprende la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 2,
- (b)
- un DNA que se hibrida con un DNA que consiste en una secuencia de bases complementaria de la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 2 bajo condiciones rigurosas, y que codifica un polipéptido que tiene una actividad para reducir asimétricamente (3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona, representada por la susodicha fórmula (1), para producir (2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol, representado por la susodicha fórmula (2).
3. El polipéptido codificado por el DNA de la
reivindicación 1 ó 2 y que tiene una actividad para reducir
asimétricamente
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona,
representada por la susodicha fórmula (1), para producir
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
representado por la susodicha fórmula (2).
4. Un polipéptido del punto (a) o (b)
siguiente:
- (a)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3,
- (b)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra no menos de 78% de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 y que tiene una actividad para reducir asimétricamente (3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona, representada por la susodicha fórmula (1), para producir (2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol, representado por la susodicha fórmula (2).
5. Un polipéptido del punto (a) o (b)
siguiente:
- (a)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4,
- (b)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra no menos de 78% de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 y que tiene una actividad para reducir asimétricamente (3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona, representada por la susodicha fórmula (1), para producir (2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol, representado por la susodicha fórmula (2).
6. Un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 salvo por al menos una
mutación de los puntos 1) a 4) siguientes:
1) la 42ª alanina está sustituida por
glicocola,
2) el 43º ácido glutámico está sustituido por
alanina,
3) la 46ª lisina está sustituida por ácido
glutámico,
4) la 49ª asparagina está sustituida por
lisina.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El polipéptido de la reivindicación 6, que
comprende todas las mutaciones 1) a 4).
\vskip1.000000\baselineskip
8. Un DNA que codifica el polipéptido de
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un vector que comprende el DNA de la
reivindicación 1, 2 u 8.
10. El vector de la reivindicación 9, en el que
dicho vector es un plásmido, plásmido que es seleccionado del grupo
que consiste en:
- (a)
- el plásmido pNTOM3, que es obtenible de E.coli HB101 (pNTOM3) FERM BP-10368;
- (b)
- el plásmido pNTOM4, que es obtenible de E.coli HB101 (pNTOM4) FERM BP-10369; y
- (c)
- el plásmido pNTOM5, que es obtenible de E.coli HB101 (pNTOM5) FERM BP-10370.
11. El vector de la reivindicación 9, que
comprende además un DNA que codifica un polipéptido que tiene una
actividad glucosa deshidrogenasa.
12. El vector de la reivindicación 11, en el que
el polipéptido que tiene una actividad glucosa deshidrogenasa es
una glucosa deshidrogenasa procedente de Bacillus
megaterium.
13. Una célula transformada obtenida al
transformar una célula huésped con el vector de cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12.
14. La célula transformada de la reivindicación
13, en que la célula huésped es Escherichia coli.
15. La célula transformada de la reivindicación
14, en que dicha E. coli es seleccionada del grupo que
consiste en:
(a) E.coli HB101 (pNTOM3) FERM
BP-10368;
(b) E.coli HB101 (pNTOM4) FERM
BP-10369; y
(c) E.coli HB101 (pNTOM5) FERM
BP-10370.
16. Un método para producir un alcohol
ópticamente activo, que comprende hacer reaccionar el polipéptido de
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 o la célula transformada
de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, o un producto
tratado de la misma, con un compuesto que tiene un grupo
carbonilo.
17. El método de la reivindicación 16, en el que
el compuesto que tiene un grupo carbonilo es
(3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanona,
representada por la susodicha fórmula (1), y el alcohol ópticamente
activo es
(2R,3S)-1-cloro-3-terc-butoxicarbonilamino-4-fenil-2-butanol,
representado por la susodicha fórmula (2).
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